Vi sinh vật học Phần 2 - Nguyễn Lân Dũng

NGUYỄN LÂ N D ŨNG , BÙI THỊ VIỆT HÀ, NGUYEN đ ì n h q u y ế n PH Ạ M V Ă N TY, PH ẠM THÀNH H ổ, LÊ V Ă N HIỆP CHUNG CHÍ TH ÀNH, LÊ THỊ HÒA

SINH LY HỌC' SINH HOA HỌC DI TRUYỀN HỌC • MIEN dịch học VÀ SINH THẢI HOC VI SINH VÂT

VỴ~7 NHÀ XUẤT BẢN KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT

Nguyễn Lân Dũng, Bùi Thi Việt Hà, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Phạm Thành Hổ, Lê Văn Hiệp, Chung Chí Thành, Lê Thị Hòa

VI SINH VẬT HỌC Phần II Sinh lỹ học, Sinh hóa họCy Đi truyền học, Miễn dịch học và Sinh thái học vi sinh vật • * • •

NHÀ XUẤT BẢN KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT HÀ NỘI

Nguyễn Lân Dũng, Bùi Thị Việt Hà, Nguyễn Dinh Quyến, Phạm Văn Ty, Phạm Thành Hổ, Lê Vãn Hiệp, Chung Chí Thành, Lề Thị Hòa

VI SINH VẬT HỌC tt ■ P hần II

Sinh lý học, Sinh hóa học, Di truyền học, Miễn dich hoc và Sinh thái hoc I « » vi sinh vật *

Chịu trách nhiệm xuất bản:

ĐỒNG KHÁC SỦNG

Biên tập:

TS. NGUYỄN HUY TIÊN

Trình bây bìa:

NGỌC TUẤN

NHÀ XUẤT BẢN KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT 70 Trần Hưng Đạo, Hà Nội In 400 bản khổ 19 X 27cm, tại Công ty TNHH In Thanh Bình Số đăng ký kế hoạch XB: 149 - 2011/CXB/290 * 11/KHKT, ngày 14/2/2011. Quyết định XB số: 233/QĐXB - NXBKHKT, ký ngày 09/12/2011 In xong và nộp lưu chiểu Quý I năm 2012.

Lời giới thiệu Vi sinh vật (microorganisms) ỉà những sinh vật nhỏ bé đến mức chi có thế thấy được chúnẹ dưới kính hiển vi quang học hay kính hiển vì điện từ. Vi sinh vật gây ra rất nhiều bệnh hiểm nghèo cho người, cho gia súc, gia cầm, Tuy nhiên số vi sinh vật gây bệnh chi chiêm một phần rat nhỏ trong thế giới vi sinh vật. Từ xa xưa người ta đã biết ímg đụng các vi sinh vật có ích (ỉuy chưa hề biết tới sự tồn tại của chúng) để chế biển thực phẩm (như nấu rượu, làm tĩiưng, mắm, nước mắm, giam, sữa chua, chao, muối dưa, muối cà, ủ phân, ngâm vó cây ỉẩy sợi, xếp ải đất, trồng luân canh với cây họ Đậu...; hoặc sử dụng các biện pháp để ngân chộn tác hợi của vi sinh vật (như ướp muéi thịt, cá, làm múi, phơi khô cù cải, tôm, cá..). Sau việc phát hiện ra vỉ sinh vật của Leeuwenhoek và việc phát hiện cùa Louis Pasteur về bản chắt của các vi sinh vật, íừ đỏ khai sinh ra ngành Vi sinh vật học (Microbiology), thì nhân loại bắt đầu quan tâm rẩt nhiều đến lĩnh vực khoa học mới mè này. Vi sinh vợt học (rở thành nền (áng cho sự phát triển của Công nghệ sinh học(CNSH). Ngtỉời ta chia sự phát triển cùa CNSH ra thành 3 giai đoợn: CNSH truyền thống là các quá trình dân dã nhằm chế biến , bào quản các loại thực phẩm, *«■ ỉỷ đất đai, phân bón để phục vụ nông nghiệp...CNSH cận đại là quá trình sử dụng các nồi lên men công nghiệp để sản xuất ở quy mô lởn các sản phẩm sinh học như mỳ chinh, ỉizin và C2C acìd amin khác, các acid hữu cơ, các dung mói hữu cơ, chấí kháng sinh, một số vitamin (như vitamin B2, B I2, c...), nhiều ỉoọi enzym... CNSH hiện đại chìa ra các ỉĩnh vực như CN di truyền (genetic engineering), công nghệ tế bào (cell engineering), công nghệ ertzym và protein (enzyme/protein engineering), CN vi sinh vật/ CN ỉên men (mìcrọbìaỉ engineering / fermentation), CN môi trtỉờng (environmental engineering). CNSH hiện đại thường gắn liền với các cơ thể mang gen tái tồ hợp (recombination gene). Vi sinh vệư học ỉà khoa học nghiên cícu về các cơ thể hoặc các nhân tố quá nhỏ đến mức không thấy được bằng mắt thường, tức ìà các vi sinh vật (Microbiology often has been defined as the study o f organisms and agents too small to be seen clearly by the unaided eyethat is, the study a f microorganisms; L.M.Prescott et ai, 2009). Vi sinh vật học đang đitợc giảng dạy trong râí nhiều trường Đại học, Cao đang, Trung học chuyên nghiệp và cũng được đề cập đền ừ nhiều ở bậc phổ thông. Vi sinh vật học là những kiến thức lièn quan đến cuộc sổng cùa mọi người. Bùn cạnh giáo trình Vi sinh vật học đa được biên soạn từ lâu và đã được lái bán nhiều lần, các tác giả muon cung cap thêm cho

đóng đảo bạn đọc, nhất là các thầy cô giáo đang giảng dạy về Vi sinh vật học tập tài liệu khá chi tiết vò có nhiều tranh ảnh này. Có thể nói đáy là phan (ham khảo để thiết kế các bài giàng nhằm mục tiêu cập nhật được với các tiến bộ khoa học. Để giúp các bạn trẻ tiếp cận được vói sách báo nước ngoài, nhất ỉà cập nhật kiên thức qua Internet các tác già đã cố gắng viết thềm tiếng Anh sau các thuật ngữ khoa học và để nguyên các chú thích tiêng Anh trong hình vẽ. Việc giáo viên hướng dẫn sinh viên điển tiếng Việt vào các hình vẽ sẽ giúp ích rat nhiều cho quá trình tự học của sinh viên. Vì mục đích phi lợi nhuận nên các tác giả xin phép được sử dụng các hình ảnh thu nhận từ mạng Internet vào trong giảo trình này. Vì chất ỉượng tốt của cuốn sách này và vi nhu cầu của đóng đảo sình viên và những cán bộ hoạt động trong các ỉĩnh vực liên quan đến Vi sinh vật học, tôi vui lòng được viết lời giới thiệu n à y. Mong nhận được những ý kiến đóng góp của đông đảo bạn đọc để các lần (ái bản sau sẽ có chất Ittợng tốt hơn nữa.

GS.TSKH. Hoàng Thủy Nguyên Chủ tịch H ội Vi sinh vật học Việt Nam

Chương 13

DINH DƯỠNG CỦA VI SINH VẬT

13.1. YÊU CẦU DINH DƯỠNG CỦA VI SINH VẬT 13.1.1. Thành phần hoá học của tế bào vi sinh vật Cơ sở vật chất cấu tạo nên tế bào vi sinh vật là các nguyên tố hoá học. Căn cứ vào mức độ yêu cầu của vi sinh vật đối với các nguyên tố này mà người ta chia ra thành các nguyên tố đa lượng và các nguyên tố vi lượng. Các nguyên tố chủ yểu bao gồm: c , H, 0 , N, p, s, K, Mg, Ca và Fe. Trong sổ này cỏ 6 loại chủ yếu (chiếm đến 97% trọng lượng khô của tế bào vi sinh vật), đó lả c , H, o , N, p và s. Các nguyên tố vi lượng thường là Zn, Mn, Na, Cl, Mo, Se, Co, Cu, w , Br và B. Tỷ lệ các nguyên tố hoá học tham gia cấu tạo tế bào vi sinh vật là không giống nhau ở các nhóm vi sinh vật khác nhau. Ví dụ nấm men, nấm sợi và vi khuẩn cỏ lượng chứa trung bình của 6 nguyên tố chủ yếu là không giống nhau (bâng 13.1): Bảng 13.1: Lượng chứa trung bình các loại nguyên tố chủ yểu trong tế bào một sổ nhóm vi sinh vật (% trọng lượng khô) Nguyên tố

Vỉ khuẩn

Nấm men

Nấm sợi

c

-50

-50

-48

H

~8

7

~7

0

-20

~31

-40

N

-15

-12

~5

p

~3

-

-

s

-1

-

-

Theo các tài liệu của Tempest (1969), Pirt (1975) và Herbert (1976) thì thành phần trung bình cùa các nguyên tố tạo nên tế bào vi sinh vật nói chung là như sau:

5

___

r

>

*

r

e

Bảng 13.2: Thành DỈĩãìĩ các nguyên tô câu tạo nên sinh khôi tê bào

Trung bỉnh

Biên độ

Các nguồn dinh dưõng điển hình được sử dung cho sinh trưỏng v s v trong môi trường

c

50

0

21

N

12

45-58 18-31 5-17

COj, bợp chất hữu cơ H20, 0 2, các hợp chất hữu cơ NH3, NO3-, các họp chất hữu cơ chứa N

H p

8

3

6-8 1.2-10

Nước, các họp chất hữu cơ. Photphat và các hợp chất chứa p.

s

1

0.3-1.3

S04'2, H2S, và các hợp chất chứa s.

K Mg Ca Cl Fe Na Những nguyên tố khác,Mo, Ni, Co, Mn, Zn,..

1 1

0.2-5 0 . 1- 1.1 0 .02 -2.0

0.5 0.5

0.01-5.0

K+(có thể thay thể bằng Rb+) Mgỉ+ Ca2+ ClFe3+, Fe2+và phức chất của Fe Na+ Lay từ các ion vô cơ khác

% trọng lượng khô* Nguyên tố

0.5

1

0.5

*Cảc tể bào bao gồm 70% trọng lượng ỉà nước và 30% là các ngnyêtt liệu khô khác. Mức trung bình này đuợc tỉnh theo sình trường của vi khuân Gr(~) trong điều kiện dư thừa chất dinh dưỡng ờ nuôi cấy theo mẻ. Vi khuẩn sulfua (sulfur bacteria), vi khuẩn sắt (iron bacteria) và ví khuẩn đại dương (marine bacteria) có lượng chửa các nguyên to s, Fe, Na, C1 nhiều hơn so với các nhóm vi khuẩn khác. Tảo Si lie (diatom) cỏ chứa lượng S1O2 khá cao trong thành tế bào. Thành phần các nguyên tổ hoá học còn thay đổi trong một phạm vi nhất định tuỳ thuộc vào tuổi nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy. Khi nuôi cấy trên các môi trường có nguồn N phong phú thì lượng chứa N trong tế bảo sẽ cao hơn so với khi nuôi cấy trên các môi trường nghèo nguồn N. Các nguyên tố hoá học chủ yếu tồn tại trong tế bào vi sinh vật dưới dạng chất hữu cơ, chất vô cơ và nước. Chất hữu cơ thường bao gồm protein, cacbon hydrat, lipit, axit nucleic, vitamin và các sản phẩm phân giải của chúng cùng như các chẩí trao đổi chất. Đe phân tích các thành phân hữu cơ trong tê bào thường sử dụng hai phương pháp: một là, đùng phương pháp hoá học để trực tiếp chiết rút từng thành phần hữu cơ trong tế bào, sau

6

đó tiến hành phân tích định tính và định lượng. Hai là, phá thành tế bào, thu nhận các thành phần kết cấu hiển vi rồi phân tích thành phần hoá học của từng kết cấu đó. Chất vô cơ thường đứng riêng rẽ dưới dạng muối vô cơ hoặc kết hợp với chất hữu cơ. Khi phân tích thành phần vô cơ trong tế bào người ta thường phân tích tro sau khi đã nung tế bào ở nhiệt độ 550° c, chất vô cơ thu được dưới dạng các oxit vô cơ được gọi là thành phần tro. Dùng phương pháp phân tích vô cơ có thề định tính hay định lượng từng nguyên tố vô cơ. Bảng l3.3:Thảnh phần hóa học của tế bào vi khuẩn (theo F.C.Neidhardt et aL,1996) Phân tử khô (1) / tế bào - Nước

% khối lượng

số phân tử

Số loại phân tử 1

-

- Các đại phân tử

96

24 609 802

khoảng 2500

+Protein

55

2 350 000

khoảng 1850

+Polyxacarit

5

4 300

2 (2 )

+Lipit

9,1

22 000 000

4(3)

+ADN

3,1 20,5

2,1

1

255 500

khoảng 660

+ARN - Các đon phân tử +Axit amin và tiền thể +Đường và tiền thể +Nucleotit và tiền thể - Các ion vô cơ Tổng cộng

3,0

khoảng 350

0,5

khoảng 100

2

khoảng 50

0,5

khoảng 200

1

khoảng 18

100

Chủ thích: (1) -Khối lượng khô của tể bào vi khuần Escherichia coli đang sinh trưởng là khoảng 2.8 X 10~l3g. (2) - Giả thiết Peptydoglycan và Glycogen là 2 thành phần chù yếu. (3) - Tế bào chứa vài loại photpholipit, do tính đa dạng của thảnh phần axit béo giữa các chi vi khuẩn khảc nhau và do ảnh hường của điều kiện sinh trưởng mà có nhiều hình thức tồn tại của mỗi loại photpholipit. Nước là thành phần không thể thiếu để duy trì hoạt động sống bỉnh thường của tế bào. Nước thường chiếm đến 70-90% trọng lượng tế bào. Độ chênh lệch giữa trọng lượng tươi và trọng lượng khô chỉnh lả lượng nước trong tế bào, thường biểu thị bàng tỷ lệ % tính theo công thức sau đây: (Trọng lượng tươi - Trọng lượng khô) / Trọng lượng tươi

X

100%.

7

Đơn vị trọng lượng tế bào trong dịch nuôi cấy thường được biểu thị bằng đơn vị g/] hay mg/ml. Phương pháp nung khô tế bào ở nhiệt độ 550°c thường làm phân giải một số hợp chất của tế bào vì vậy khi tính trọng lượng khô của tế bào nên dùng phương pháp sấy khô ở 105°c hay làm khô ở nhiệt độ không cao trong chân không, hoặc làm khô nhanh nhờ tia hồng ngoại... 13.1.2. Các chất dinh dưỡng và chức năng sinh lý Vi sinh vật chủ yếu thu nhận được chất dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài. Căn cứ vào chức năng sinh lý khác nhau trong tế bào mà' người ta thường chia các chất dinh dưỡng thành 5 nhóm lớn: 1) Nguồn cacbon (source of cacbon) Là nguồn vật chất cung cấp c ừong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật. Trong tế bào nguồn c trải qua một loạt quá trình biến hoá hoá học phức tạp sẽ biến thành vật chất của bản thân tể bào và các sàn phẩm ừao đổi chất, c có thể chiếm đến khoảng một nửa trọng lượng khô của tế bào. Đồng thời hầu hết các nguồn c trong các quá trình phản ứng sinh hoá còn sinh ra trong tế bảo nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống của vi sinh vật. Một số vi sinh vật dùng C 0 2 làm nguồn c duy nhất hay chủ yếu để sinh trưởng, khi đó nguồn c không phải là nguồn sinh năng lượng. Vi sinh vật sử dụng một cách chọn lọc các nguồn c . Đường nói chung là nguồn c và nguồn năng lượng tổt cho vi sinh vật, Nhưng tuỳ từng loại đường mà vi sinh vật có những khả năng sử dụng khác nhau. Ví dụ trong môi trường chứa glucoz và galactoz thl vi khuẩn Escherichia coli sử đụng trước glucoz (gọi là nguồn c tốc hiệu) còn galactoz được sử dụng sau (gọi lả nguồn c trì hiệu). Hiện nay trong các cơ sở lên men công nghiệp người ta sừ dụng nguồn c chủ yếu là glucoz, xacaroz, ri đường (phụ phẩm của nhà máy đường) tinh bột (bột ngô, bột khoai sắn...), cám gạo, các nguồn xenluloz tự nhiên hay dịch thuỷ phân xenluloz. Năng lực đồng hoá các nguồn c ở các vi sinh vật khác nhau là không giống nhau. Có loài có khả năng sử dụng rộng rãi nhiều nguồn c khác nhau, nhưng có loài khả năng này rất chọn lọc. Chẳng hạn vi khuẩn Pseudomonas có thể đồng hoá được tới ừên 90 loại hợp chất c , nhưng các vi khuẩn thuộc nhóm dinh dưỡng metyl (metylotrophs) thi chì đồng hoá được các hợp chất 1C như metanol, metan... Nguôn c chủ yeu được vi sinh vật sử dụng gồm cố đường, axit hữu cơ, rượu, lipit, hydrocacbon, CƠ2, cacbonat... (Bảng 13.4)

8

Bảng 13.4: Nguồn

c đươc vi sinh

vột sử dụng

Nguồn c

Các dạng họp chất

Đường

glucoz, fructoz, mantoz, xacaroz, tinh bột, galactoz, lactoz, mannit, xenlobioz, xenluloz, hemixenluloz, kitin...

Axit hữu cơ

axit lactic, axit xitric, axit fumaric, axit béo bậc cao, axit béo bậc thấp, axit amin...

Rượu

etanol

Lipit

lipit, photphoiipit

Hydrocacbon

khí thiên nhiên, đầu thô, dầu paraíĩn

Cacbonat

NaHC03, CaCOj, đá phấn

Các nguồn c khác

Hợp chất nhóm thơm, cyanit, protein, pepton, axit nucleic...

1.8 JS u 'ọ

bỉ)

<0

wo D ẹoJ*D u D 4D A •3 CJD

I

CA

1.4 1.0

0.6 0.2 ----- }•

2

T "•

6

10

14

18

22

Nriiig lnợiig sinh ra (kcnl g cơ chat C) Hình 13.1: Sàn lượng sinh trưởng tổi ICUkhi vi sinh vật dị dircmg sừ dụng các nguồn

c khác nhau.

Nguồn cacbon thường được sử đụng trong công nghiệp lên men là ri đường (molasses). Sự khác nhau giữa ri đường mía và rỉ đường củ cải được thấy rõ trong bàng 13.5.

9

Bảng 13.5: Thành phần hóa hoc của rỉ đuờtig củ cái và rỉ đường mía Thành phần

Tỷ lệ

Rỉ dường củ cải

Rỉ đường mía

Đường tổng sé

%

48-52

48-56

Chất hữu cơ khác đường

%

2-17

9-12

Protein (N X 6,25)

%

6-10

2-4

K

%

2-7

1,5-5,0

Ca

%

0,1-0,5

0,4-0,8

Mg

%

khoảng 0,09

khoảng 0,06

p

%

0,02-0,07

0 ,6*2,0

mg/kg

0,02-0,15

1,0-3,0

Axit pantoteic

mg/kg

50-110

15-55

Inositol

mg/kg

5000-8000

2500-6000

Tiamin

mg/kg

khoảng 1,3

khoảng 1,8

Biotin

Tỷ lệ các nguyên tố trong các hợp chất cao phân từ ở vi sinh vật có thể thấy rõ trong bảng sau đây: Bảng 13.6: Tỷ lệ các nguyên tấ trong các cao phân tử ở tế bào vi sinh vật % trọng lượng khô

10

Thảnh pbần

Trung binh

Biền độ dao động

%c

%H

%o

%N

%s

%p

Protein

55

15c-75

53

7

23

16

1

-

ARNđ

21

5C-30e

36

4

34

17

-

10

ADN*

3

lc-5 f

36

4

34

17

-

10

Peptidoglycan

3

0g- 20”

47

6

40

7

-

-

Photpholipit

9

0-15

67

7

19

2

-

5

Lipopolyxacarit

3

0h^tj

55

10

30

2

-

3

Lipit trung tính

-

0-45k

77

Ỉ2

11

-

-

-

Axit Teichoic

-

0-5 d

28

5

52

-

-

15

Glycogen

3

0-50k

28

6

49

-

-

-

PHB

-

0-80k

45

7

37

-

-

-

PHA (C8)m

-

0-60k

56

9

23

-

-

-

Polyphotphatđ

-

0-20 "

68

*

61

-

-

39

Cyanophycin1’

-

0-10

■

15

25

27

-

-

a. Theo Herbert (1976). Các thông số được thu nhận từ các vi sinh vật khác nhau, không điển hình cho một nhóm nào. b. Ở E. coỉi (trong pha sinh trưởng log). Theo Neidhárdt et al. (1990). c. Các tế bào cỏ nguồn dự trừ c. d. Bao gồm các cao phân từ như ARN, ADN, polyphotphat hoặc một số thành phần cùa thành tể bào. e. Tại mức độ có tỳ lệ sinh trường cao. f. Các tế bào sinh trường chậm. g. Các loài ký sinh không có thành tế bào. h. Vi khuẩn Gram(+). i. Các chủng thay thế nguồn photpholipit bằng các chẩt tương tự chứa p tự do, trong điều kiện hạn chế nguồn p j. Vi khuẩn Gram(-) k. Các tế bào trong điều kiện hạn chế nguồn N. ]. Hạn chế nguồn p. m. PHA (polyhydroxyaldehit) chứa 3-hydroxyoctanoic axit. n. Một số nấm men và vi khuẩn. 0 . Một số vi khuẩn lam có nguồn dự trữ N cyanophycin [(asp-arg)].n *PHB- Poly-13- hydroxy butyrat 2) Nguồn N (source of niter) Nguồn N là nguồn cung cấp N cho vi sinh vật để tổng hợp nên các hợp chất chứa N trong tể bào. Thường không là nguồn năng lượng, chỉ một số ít vi sinh vật tự dưỡng (thuộc nhóm amoni hoá - amoniiíícation, nhỏm nitrat hoá- nitrification) dùng muối amoni, muối nitrat làm nguồn năng lượng. Trong điều kiện thiếu nguồn c một số vi sinh vật kỵ khí trong điều kiện không có oxy cỏ thể sử dụng một số axit amiĩi làm nguồn năng lượng. Nguồn N thường được vi sinh vật sử dụng lả protein và các sản phẩm phân huý của protein . ( pepton, peptit, axit amin...), muổi amoni, nitrat, N phân tử (N2X purin, pyrimidin, ure, amin, amit, cyanit...(bảng 13-7) Bảng 13.7.* Nguồn N được vi sinh vật sử dụng Nguồn N Protein vả các sàn phẩm phân giải của protein Amoni và muối amoni Nitrat N phân tử Các nguồn N khác

Các dạng hợp chất pepton, peptit, axit amín... (iìiột số vi sinh vật tiết tnen proteinaz phân giải protein thành các hợp chất phân từ nhỏ hơn rồi mới hấp thu ổựợc vào tế bào) NHj, (NHO2SO4,.. (dễ được hấp thu) KNO3 (đễ được hấp thu) N2(với vi sinh vật cố định N) purin, pyrimidin, ure, amin, amit, cyanit (chi một số nhóm vi sinh vật mớỉ có thể đồng hoá được) lí

Nguồn N thường được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật gồm có pepton, bột cá, bột nhộng tằm, bột đậu tưcmg, bột khô lạc, cao ngô, cao thịt, cao nấm men... Vi sinh vật sử dụng chọn lọc đối với nguồn N. Chẳng hạn xạ khuẩn sản sinh terramycin sử dụng cao ngô với tốc độ nhanh hơn so với sử dụng khô đậu tương hay khô lạc, bải vì nguồn N trong cao ngô là các sản phẳm phân giải dễ hấp thu của protein. Cao ngô được coi là nguồn N tốc hiệu, còn khô dầu được coi là nguồn N trì hiệu. Loại N tốc hiệu là có lợi cho sự sinh trưởng của vi sinh vật, còn loại trì hiệu lại có lợi cho sự hình thành các sản phẩm trao đổi chất. Khí sản xuất terramycin chẳng hạn, người ta phối hợp sử dụng cao ngô và khô dầu theo một tỷ lệ nhất định để phối hợp giũa giai đoạn sinh trường tạo sinh khối và giai đoạn sinh tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất, nhằm mục tiêu là nâng cao sản lượng terramycin. Năng lực hấp thu muối amoni và nitrat ở vi sinh vật là khá mạnh. Ion NH4+ sau khi được tể bào hấp thu có thể được trực tiếp sử dụng, do đó các nguồn muối amoni được coi là nguồn N tốc hiệu. Còn niưat sau khi được hấp thụ cần khử thành NỈỈ4+ rồi mới được vi sinh vật sử dụng. Đa số các vi khuẩn hoại sinh (saprophyte), vi khuẩn đường ruột, vi sinh vật gây bệnh ở người, động vật, thực vật...đều có thể dùng muổi amoni, muối nitrat làm nguồn N. Chẳng hạn các vi khuẩn Escherichia coỉỉ, Enterobacter aerogens, Bacillus subtilm, Pseudomonas aeruginosa...âều có thể sử dụng nguồn (NH4)2S 04 và NH4NO3 làm nguồn N; xạ khuẩn có thể sử dụng KNO 3 làm nguồn N; nấm sợi có thể sử dụng KNO3 làm nguồn N. Lúc dùng các muối như (NH4)2SƠ4 để làm nguồn N nuôi cấy vi sinh vật cần chú ý là sau khi vi sinh vật hấp thu NH 4+ thì sẽ làm hạ thấp pH của môi trường. Người ta gọi đó là những muối cỏ tính sinh lý axit. Ngược lại khi dừng các muối nitrat (như KNOj) sau khi vi sinh vật hấp thu N (V thì sẽ làm nâng cao pH của môi trường. Người ta gọi đỏ là các muối có tính sinh lý kiềm. Đẻ làm cho pH trong các môi trường nuôi cấy vi sinh vật ít bị biến động người ta bổ sung thêm các chất có tính đệm (buffer substance). 3) Nguồn muối vô CO' (source of inorganic salt)

Các muối vô cơ là nguồn chat dinh dưỡng không thể thiếu đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật. Chúng có các chức năng sinh lý chủ yếu là: tham gia vào thành phần cùa các trung tâm hoạt tính ở các enzym của vi sinh vật, duy trì tính ổn định của kết cấu các đại phân từ và tế bào, điều tiết và duy trì cân bàng áp suất thẩm thấu của tế bào, khống chế điện thế oxy hoá khử của tế bào và là nguồn vật chất sinh năng lượng đối với một số loài vi sinh vật (bảng 13.8).

12

r

Bảng 13.8: Muôi vô cơ và chức năng sinh lý của chúng Nguyên tố p

s

Mg

Ca

Na

K

Fe

Họp chất sử dụng

Chức năng sinh lý

k h 2po4, k 2h p o 4

Là thành phần của axit nucleic, nucleoprotein, pbotpholipit, coenzym, ATP... Làm nên hệ thống đệm giúp điều chỉnh pH môi trường.

(NH4)2S04, MgS04

Là thành phần cùa các axit amin chứa s, một số vitamin; glutation có tác dụng điều chinh điện thế oxy hoá khử trong tế bào.

MgSƠ4

Là thành phần trung tâm hoạt tính của enzym photphoryl hoá hexoz, dehitrogenaz của axit isoxitric, polymeaz của axit nucleic, thành phần của chlorophyl và bacterio-chlorophyl.

CaCl2í Ca{N0 3)2

Tạo tính ổn định cùa một số cofactor, enzym duy trì, cần cho sự dựng trạng thái cảm thụ của tế bào.

NaCl

Thảnh phần của hệ thống chuyển vận của tế bào, duy trì áp suất thẩm thấu, duy trì tính ổn định của một số enzym.

k h 2p o 4! k h 2po 4

Là cofactor cùa một số enzym, duy trì áp suất thẩm thấu của tế bào, là nhân tố ổn định cửa riboxom ở một số vi khuẩn ưa mặn.

FeS04

Thành phần của sắc tổ vi khuẩn và một số enzym, là vật chất nguồn năng lượng cùa một so vi lchuẩn sắt, cần thiết để tổng hợp chlorophyl và độc tố vi khuẩn bạch hầu.

Trong quá trinh sinh trưởng vi sinh vật còn cần tới một số nguyên tổ vi lượng. Những nguyên tố này cũng có vai trò quan trọng mặc dầu chi cần với số lượng rất nhỏ, khoảng 10'8-10'6 mol/ L môi trường nuôi cấy. Nguyên tố vi lượng tham gia vào'thành phần enzym và làm hoạt ho á enzym. (Bảng 13.9).

13

Bảng 13.9: Tác dụng sinh ỉý của nguyên lể vi lượng Nguyên tố

Tác dụng sinh lý

Zn

Có mặt trong alcohol dehitrogenaz, lactodehitrogenaz, photphataz kiềm, ARNpolymeaz, ADNpolymeaz...

Mn

Có mặt trong peroxit dismutaz, carboxylaz xitric syntetaz

Mo

Có mặt trong reductaz nitrat, nitoaz, dehitrogenaz fomic.

Se

Có mặt trong reductaz glycin, reductaz fomic.

Co

Có mặt trong mutaz glutamic.

Cu

Có mặt trong cytocrom oxydaz.

w

Có mặt trong dehitrogenaz fomic.

Br

Có mặt trong urez, cần cho sự sinh trường cùa vi khuẩn hyđro.

Nếu thiếu nguyên tố vi lượng trong quá trình sinh trưởng thì hoạt tính sinh lý cùa vi sinh vật bị giảm sút, thậm chí ngừng sinh trưởng. Do nhu cầu dinh dưỡng của vi sinh vật là không giống nhau cho nên khái niệm về nguyên tố vi lượng chì có ý nghĩa tương đối. Vi sinh vật thường tiếp nhận nguyên tố vi lượng từ các chất dinh dưỡng hữu cơ thiên nhiên, các hoá chất vô cơ, nước máy hay ngay từ trong các dụng cụ nuôi cấy bàng thuý tinh. Chỉ trong những trường hợp đặc biệt mới cần bổ sung nguyên tố vi lượng vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Vì nhiều nguyên tổ vi lượng là kim loại nặng cho nên nếu dư thừa sẽ gây hại cho vi sinh vật. Khi cần bổ sung thệm nguyên tố vị lượng vào môi trường cần lưu ý khống chế chính xác liều lượng. 4) Nhãn tô sinh trưởng Nhân tố sinh trưỏng (growth factor) là những hợp chất hữu cơ mà có nhừng vi sinh vật cần thiết để sinh truởng tuy với số lượng rất nhò và không tự tồng hợp đù so với nhu cầu. Các vi sinh vật khác nhaụ có những yêu cầu không giống nhau về chủng loại và liều lượng của cảc nhân tổ sirủi truởng. Sau đây là một sổ ví dụ (bảng 13.10): Vi sinh vật tự đudng và một số vi sinh vật dị dưỡng (như Escherichia coii) thậm chí có thể sinh trựởng mà không cần bất kỳ nhân tố sinh trưởng nào. Mặt khác, cùng một loài vi sinh vật nhưng nhu cầu đối với nhân tố sinh trưởng cũng thay đổi tuỳ theo điều kiện môi trường. Ví dụ Mucor rouxii khi sinh trưởng trong điều kiện kỵ khí thi cần thiamin (B I) và biotin (H), nhưng trong điều kiện hiếu khí thì lại tự tổng hợp được các vitamin này. Có trường hợp chưa giải thích được bàn chất của nhu cầu về nhân tố sinh trường ờ một sổ loài vi sinh vật. Thông thường bô sung vào môi trường các chất hừu cơ như cạo nấm men cao

14

thịt, dịch đun động thực vật (nhộng, giá đ ỗ ...) là có thể đáp ứng được nhu cầu về nhân tố sinh trưởng. Bảng 13.10: Các nhân tố sinh trưởng cần thiết đối với mội số loài vỉ sinh vật Ví sinh vật

Chất sinh trưởng

Nhu cầu / ml

Acetobacter suboxydans

APAB, Axit nicotinic APAB colin pyridoxal thiamin p-alanin uracil axit nicotinic axit pantothenic metionin axit folic arginin tyrozin thymonucleozit biotin ephedrin

0-10 ng

Clostridium acetobutyỉicum Streptococcus pneumonia Leuconostoc mesenteroides Staphylococcus aureus Corynebacterium diphtheria Clostridium tetani Lactobacillus arabinosus

Streptococcus faecahs

Lactobacillus delbruckii Lactobacillus cazi

3 Mg 0,15 ng 6 Rg

0,025 fig 0,5ng 1.5 ng 0-4 ng 0,1 0,02 ng 1,0 ng 0,02 fig

50 Hg 8 Mg

0-2 Jig 1 ng

Chú thích: 1 fjg = ỉ ơ 6g; ỉng = Ỉ0 9g. Căn cứ vào sự khác nhau về cấu trúc hoá học và chức năng sinh lý của các nhân tố sinh trưởng người ta chia nhân tố sinh trưởng thành các nhóm vitamin, axií amin, purin và pyrimidin. Vitamin là nhân tố sinh trưởng được tìm thấy bản chất hoá học sớm nhất. Hiện nay người ta đã phát hiện được nhiều loại vitamin có tác dụng là nhân tố sinh trường. Một số vi sinh vật có thể tự tổng hợp được vitamin, nhưng nhiều loại khác lại cần được cung cấp vitamin trong môi trường dinh dưỡng thì mới sinh trưởng được. Vitamin chù yếu là coenzym hay cofactor của các enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất. Một số vi sinh vật không tự tổng hợp được những axit amin nào đó, cần bổ sung vào môi trường các axit amin đỏ hay bổ sung peptií chuồi ngấn. Chẳng hạn vi khuẩn Leuconostoc mesenteroides cần tới 17 loại axit amin mới sinh trưởng đươc. Một số vi khuẩn cần cung cấp D-alanin đe tổng hợp thành tế bào. Purin và pyrimidin chủ yếu được dùng làm coenzym hay cofactor của các enzym cần thiết cho quá trinh tong hợp nucleozit, nucleotit và axit nucleic.

Bảng 13.11: Chức năng của một sổ vitamin thông thường đối với vi sình vật Vitamin

Chức năng

Ví dụ về các vi sinh vật cần cung cấp

Biotin (H)

-Carboxyl hóa (cố định CO2) -Trao đổi chất một cacbon

Leuconostoc mesenteroìdes (B) Saccharomyces cerevịsiae (F) Ochromonas maỉhamensis (A) Acanthammoeba castelịaniỉ (P)

Vitamin B ]2

-Sắp xếp lại phân tử -Nhóm mang metyl trong trao đổi chất một cacbon

Lactobacillus spp. (B) Euglena gracilis (A) Tảo silic và nhiều vi tảo khác (A) Acanthammoeba castelỉanỉi (P)

Axit folic

-Trao đổi chất một cacbon

Enterococcus faecalis (B) Tetrahymena pyriformis (P)

Axit lipoic

-Chuyển nhóm acyl

Lactobacillus cazi (B) Tetrahymena spp. (P)

Axit pantotenic

-Tiền thể của CoA (oxy hỏa pyruvat, trao đổi axit béo)

Proteus morganiỉ (B) Hansenỉaspora spp. (F) Paramecium spp. (P)

Pyridoxin (B6)

-Trao đổi axit amin

Lactobacillus spp. (B) Tetrahymena pyriformis (P)

-Tiền thể cùa NAD, NADP

Bruceỉla abortus (B) Haemophilus influenza (B) Blastocladia pringsheimìi (F) Crỉthidia fasciculata (p)

“Tiền thể của FAD, FMN

Cauỉobacter vìbrioides (B) Dicíyostelium spp. (F) Tetrahymena pyriformis (P) Bacillus anthracis (B)

-Chuyển nhóm aldehit (khử carboxyl pyruvat, oxy hóa axit ce-keto)

Phycomyces bỉakesleeanus (F) Ochromonas maỉhamensis (A) Colpidium campylum (P)

Niacin

Riboflavin (B2)

Thiamin (Bl)

Chú thích: B-Vi khuân; F-VỈ nãm; A-Vi tảo; P-Động vật nguyên sinh. 5) Nước Nước là thành phần không thể thiếu để vi sinh vật có thể sinh trường. Chức năng sinh lý của nước trong tế bào là:

16

- Hoà tan và chuyển vận các chất, hỗ trợ cho việc hấp thu chất dinh dưỡng, giải phóng các sàn phẩm trao đổi chất. - Tham gia vào hàng loạt các phản ứng hóa học trong tế bào. - Duy trì cấu hình thiên nhiên ổn định của các đại phân tử như protein, axit nucleic... - Là thể dẫn nhiệt tổt, hấp thu tốt nhiệt luợng sinh ra trong quá trình trao đổi chất và khuếch tán kịp thời ra bên ngoài để duy trì sự ổn định của nhiệt độ bên ừong tế bào. - Duy trì hình thái bình thường của tế bào. - Thông qua quá trình thuỷ phân hay khử nước để khống chế kết cấu của tế bào (enzym, vi ống, tiên mao...) và sự tháo lắp ở virút. Tính hữu hiệu của nước đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật thường được biểu thị bằng độ hoạt động (hoạt độ) của nước (water activity, aw). Đó là tý lệ giữa áp lực hơi nước của dung dịch ừong những điều kiện nhiệt độ và áp lực nhất định vói áp lực của hơi nước thuần khiết trong cùng những điều kiện như vậy: 3w = p w I Pw

Ở đây p w là áp lực hơi nước của dung dịch, còn aw° là áp lực của hơi nước thuần khiết. p w° của nước thuần khiết là 1.0. Dung dịch càng chứa nhiều dung chất (chất hoà tan) thì aw càng nhỏ. Vi sinh vật thường sinh trưởng trong điều kiện có aw trong khoảng 0,6' 0,99. Đối với một số loài vi sinh vật khi aw quá thấp thì tốc độ sinh trưởng và tổng sinh khối giảm. Các vi sinh vật khác nhau có awthích hợp không giống nhau (bảng 13.12) Bảng 13.12: ữw thich hợp nhẩt cho sinh trưởng ở một sổ nhòm vi sinh vật Vi sinh vật Vi khuẩn nói chung Nấm men Nấm sợi Vi khuẩn ưa mặn Vi nấm ưa mặn Nấm men ưa áp suất thẩm thấu cao

aw 0,91 0,88

0,80 0,76 0,65 0,60

Nhìn chung aw thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của vi khuẩn cao hơn của nấm men và nấm sợi. Vi sinh vật ưa mặn có aw thích hợp nhẩt cho sự sinh trường là khá thấp, Phần nước cỏ thể tham gia vào các quá trình trao đổi chất của vi sinh vật được gọi là nước tự do. Phần lớn nước tồn tại trong tế bào vi sinh vật là nước tự do. Phần nước liên kết với các hợp chất hữu cơ cao phân tử trong té bào được gọi là nước liên kết. Nước liên kết mất đi khả năng hoà tan và lưu động. 17

13.1.3. K hái niệm về sự sinh trưởng trong điều kiện hạn chế các chất dinh dưỡng Ở môi trường nuôi cấy lắc trong phòng thí nghiệm, khi tất cả các chất dinh dưỡng được cung cấp cho sự sinh trường của vi sinh vật đã được thiết kế tồi ưu thì sự dư thừa xảy ra vào lúc đầu vả các tế bào sinh trưởng theo logarit với tốc độ sinh trưởng là lớn nhất. Tuy nhiên, trong mỗi hệ thống môi trường và kỹ thuật nuôi cấy, sự sinh trường của vi sình vật không thể tiếp diễn mãi mà không bị giới hạn trong một khoảng thời gian dài. Một tính toán đơn giản để chứng minh nhận định này là: sau 2 ngày sinh trưởng theo ìogarit, một tế bào vi sinh vật cứ 20 phút lại nhân đôi một lần sẽ tạo ra xấp xi 2 X 1043 tế bào. Giả sử khối lượng trung bình của mồi tế bào lả 10'12 g thì toàn sinh khối tế bào trên sẽ có khối lượng gấp gần 400 lẩn khối lượng của quả đất. Vì vậy, trong mỗi một thể tích nuôi cấy, sự sinh trưởng luôn luôn sớm bị giới hạn do sự cạn kiệt của một hoặc vài chất dinh dưỡng. Thuật ngữ “các chất dinh dường hạn chế” được sử đụng với rất nhiều ý nghĩa, và thường vẫn bị nhầm lẫn. Các chất dinh dưỡng hạn chế có khả năng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng trong các môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo hai cách riêng biệt: hỏa học và động học. Sự hạn chể hóa học được định nghĩa là khối lượng lớn nhất sinh khối có thể được tạo ra trong điều kiện giới hạn các chất dinh dưỡng. “Nguyên lý Liebig” bắt nguồn từ các nghiên cứu về sự màu mỡ trong nông nghiệp của Justus von Liebig vào năm 1840. Trong nghiên cứu này ông tim ra rằng hàm lượng của một chất dinh dưỡng nào đó sẽ quyết định đến năng suất mùa màng, miễn lả tẩt cả các chất dinh dưõng khác đã có mặt một cách dư thừa (phương trình 1). Giới hạn động học xuất hiện khi nồng độ các chất dinh dưỡng là thấp (trong phạm vi từ miligram tới microgram trong mỗi lit), sự hạn chế các chất dinh dưỡng sẽ điều khiển tốc độ sinh trưởng riêng của tế bào (fì). Điều khiển động học về tổc độ sinh trưởng thường kéo theo các động lực bão hòa và phương trinh Monod (phương trình 2 ) được sử dụng để mô tả mối quan hệ giữa nồng độ của các chất dinh dường đối với tốc độ sinh trưởng riêng của tế bào (ịị). X = X 0 +(S 0 - 5 ) x y víi. ( 1) ^ = ^ x x s / ( K s +s)

(2 )

Trong đó: So là nông độ ban đầu và s là nồng độ cuối cùng của các chất dinh dường bị hạn chê S; X(Xo) là nồng độ sinh khối (ban đầu); Yx/S là sản lượng sình khối thu được đôi với châí đinh dường s , Mmax là tôc độ sinh trường riêng lớn nhất, và Ks là hàng số ái lực cơ chất Monod. Điều này thể hiện rõ trong hỉnh 13.2 đối với sự sinh trưởng trong hệ thống nuôi cấy kín. Các tê bào ban đâu sinh trưởng không giới hạn cho đến khi sự tiêu thụ các chất dinh dưỡng hạn chê bị hêt dân, đan đên tôc độ sinh trưởng suy giảm dần, sau đó tổc độ sinh trưởng ngừng hăn. Đó là lúc đạt đên nông độ cuôi cùng của sinh khối. Trong nuôi cấy liên 18

tục, người ta bổ sung môi trường một cách liên tục và một lượng môi trường dư thừa được loại bỏ. Tôc độ bổ sung thêm vào của các chất dinh dưỡng bị hạn chế sẽ điều khiển đồng thời cả n và nồng độ sinh khối trong môi trường nuôi cấy (Pirt, 1975; Kovarova và Egli, 1998).

Hình ỉ 3.2: Động học cùa sự giới hạn sinh trưởng của vi sình vật trong m ôi cấy đóng do giới họn nồng độ cùa chất dinh dương (cơ chất) s. So là nồng độ cơ chất ban đầu, s là nồng độ thực cùa cơ chắt, X là nồng độ sinh khối; x0: nồng độ sinh khối ban đầu; Y: sàn htọng sinh khối thu được đối với cơ chất s. Trong thực nghiệm, người ta có thể nuôi cấy các tế bào trong các điều kiện đã được biết rõ, nhờ đó các chất đinh dưỡng hạn chế sẽ được xác định. Đối với việc nuôi cấy các vi sinh vật dị dưỡng để nghiên cứu và tạo ra các sản phẩm sinh khối, môi trường được thiết kế phổ biển với nguồn cacbon và năng lượng giới hạn, tất cà các chất dinh dường khác được cung cấp dư thừa. Tuy nhiên, trong quá trinh công nghệ sinh học, sự giới hạn bởi các chất dinh dưõng chứ không phải nguồn cacbon giữ chức năng điều khiển các trạng thái sinh lý và quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Sự hạn chế cảc chất dinh dưỡng nào đó thường kích thích hoặc tăng cường sự tạo thành rất nhiều các sản phẩm trao đổi chất và các enzym của vi sinh vật. Ví đụ, năng suất sẽ được tăng lên trong quả trình lên men tạo chất kháng sinh đo sinh trưởng trong môi trường hạn chế photphat, sự sản xuất axit xitric trong môi trường có sự hạn chế Fe-, Mn-, hoặc Zn. Còn sự sinh tổng hợp cùa NAD là được thực biện trong điều kiện hạn chế Zn-Mn. Việc tích lũy các nguyên liệu dự trừ nội bào PHB hoặc PHA (chất dẻo sinh học-bioplastic) sẽ bị giới hạn bởi nguồn cung cấp hợp chất giàu nitơ.

19

Rõ ràng là sự sinh trưởng của vi sinh vật được điều khiển thường xuyên không phải chi bởi một chất dinh dường mà bởi sự kết hợp của hai hay nhiều chẩt dinh dưỡng đồng thời (Kovarova vàE gli, 1998). 13.1.4. T hiết kế và phân tích m ôi trường sinh trưởng tốl thiểu Để sinh trưởng và tổng họp các nguyên liệu tế bào cho bàn thân mình, vi sinh vật phài thu nhận các thành phần cấu trúc (hay các tiền chất cùa chúng) và năng lượng cần thiết từ môi trường sống. Do đó, để nuôi cấy vi sinh vật ừong phòng thí nghiệm thi các chất dinh dưỡng phải đuợc cung cấp đầy đủ vào môi trường và các chất dinh dưởng phải ở dạng mà các vi sinh vật này có thể sủ dụng được. Do có sự đa dạng sính lý của thể giới vi sinh vật mà có vô số các môi trường với thành phần dinh dưõng khác nhau đã được đưa ra, với mục đích hoặc là làm giàu một cách chọn lọc hoặc là để nuôi cấy một nhóm ví sinh vật đặc thù nào đó (LaPage và cs, 1970; Balows và cs 1992; Atlas, 1997). Tất cả các môi trường này đều chứa các thành phần với các chức năng dinh dưỡng rõ ràng, đặc biệt là cân nhắc về chức năng cấu trúc hoặc sinh năng lượng. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu về chất dinh dưỡng được tiến hành định tính chứ không phải định lượng và các chất dinh dưỡng khác nhau được thêm vào nhiều hcm hay ít hơn một cách tùy ý. Ngoài ra, Tất nhiều các môi trường nuôi cấy có chứa các thành phần không được biết rõ ràng bởi vỉ sử dụng các nguyên liệu hữu cơ như ngô, khoai tây,... Trong cùng những điều kiện như: nhiệt độ hoặc pH, tốc độ sinh trưởng riêng lớn nhất của vi sinh vật bị ảnh hường bời sự đa dạng của các chất dinh dưỡng trong môi trường. Điều này được minh họa một cách cụ thể đổi với sự sinh trưởng của Salmonella typhimurium (thí nghiệm bởi Schaechter và cs, 1958). Họ đã sử dụng 22 môi trường có thành phần khác nhau và nhận thấy các tốc độ sinh trưởng khác nhau ở các môi trường trong các điều kiện dư thừa các chất dinh dưỡng. Kết quả cho thấy chất lượng các tiền chất đưa vào môi trường khoáng cho phép điều chỉnh tốc độ sinh truởng một cách rõ ràng nhất.

A. Thiét kế môi trường và kiểm tra các chất dinh dưỡng giới hạn 1. Thỉết kế môi trường sinh trưởng Trong thiết kế môi trường sinh trưởng, quyết định đầu tiên được đưa ra là chọn lựa nồng độ cao nhất cho phép tạo ra sinh khối (Xmax), và xác định cảc chất dinh dưỡng giới hạn (theo nguyên lý Liebig). Điển hình, môi trường sinh trưởng cho các vi sinh vật dị dưỡng được thiết kế với nguồn năng lượng - cacbon riêng biệt sẽ giới hạn lượng sinh khối được tạo ra, nhưng ngược lại tất cả các chất dinh dưồng khác (được thêm vào dưới dạng các hợp chất đơn) được cung cấp dư thừa. Dựa vào giá trị X maXí có thể tính toán được nồng độ tối thiểu của các nguyên tố khác nhau cần thiết trong môi trường nuôi cấy. Để

20

đảm bảo sự dư thừa của tất cả chất dinh dưỡng không giới hạn ừong môi trường thì nồng độ của chúng được nhân với nhân tố dư (Fe). Bằng cách này, nồng độ cùa chất dinh đường đòi hỏi trong môi trường tăng trưởng (Ereq) gấp X lần theo lý thuyết đối với nguồn cacbon. E rcq = x max / Y...C r y\ỉ£ x F E

(3) x'

Y x/e (the individual average elemental growth yield) là sản lượng tăng trưởng trung bình đựa ưên từng nguyên tố. Một ví dụ cho việc thiết kế môi trường khi giới hạn nguồn cacbon, cho phép tạo sàn lượng sinh khối khô đạt 10g/l sinh khối (bảng 13.13). cần chú ý rằng, trong môi trường này các thành phần được lựa chọn sao cho có thể thay đổi nồng độ cùa mỗi nguyên tố (ví dụ có thể thay thể MgCU và NaHS0 4 bằng MgSOẠ Hơn nữa, môi trường này chỉ có tính chất đệm yếu (weakly buffered), do đó càn thiết phải khống chế pH trong suốt quá trình sinh trường. Bảng 13.13: Thìểtkế môi trường tối thiểu bị giới hạn bồi nguồn sản lương sinh khối khô đạt 10g/Ia,b

Thành phần môi trường

Nguồn

Glucoz

c, năng lượng

NH4C1

N . p K

NaH2P0 4 KC1

Năng suất sinh trirông (g sinh khối khô/g nguyên tố)

Các nhân tố dư thừa vói nguồn cacbon tương ứng

Khổỉ lượng các nguyên tá(g/í)

Khối lượng các thành phần cấu tao m

1

1

10

25.0

8

3 5 5 5 5 10

3.75 1.52

14.33 5.88 0.95 1.87

33 100

NaH2SƠ4 MgCl2

Na Mg

CaƠ 2 FeCl2

Ca Fe

MnƠ 2

Mn 2n

200 104 104

Cu Co

ZnCl2 CuCỈ2 CoC12

c cho phép

100 200

0.5 0.5 0.25

0.98 2.77 1.13

10

1.0 0.5

20

0.02

20

0.02

105

20

0.002

0.046 0.042 0.0042

to5

20

0.002

0.0044

100

r~

a. Dựa vào sản lư ợ ng tăng trưởng của các nguyên tố trong sinh khổi khô. b. Theo Pirt (1975), Egli và Fiechter (1981). Sản lượng tăng trường của c và các nguyên tố vết Zn. Cu, Mo, Mn. 21

'

Cách thức này được sử dụng cho việc thiết kế môi trường nuôi cấy các vi sinh vật hiếu khí với mật độ sinh khối thấp và trung bình. Phức tạp hcm là thiết kế của môi trường cho nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí, trong đó rất nhiều thành phần của môi trường dễ dàng kết tủa tại thế oxy hỏa khử cần thiết, hoặc mật độ tế bào cao trong đó có chứa các chất hòa tan hoặc vấn đề độc tính của một số môi trường. Nhân tố Y jí/e được phân tích từ sinh khối khô khi nuôi cấy trong điều kiện không giới hạn tăng trưởng của hệ thống đóng. Đối với cacbon, oxy, và hyđro, Yx/E không thể được tính toán chính xác trực tiếp từ các thành phần cơ bàn của tế bào do những thành phần này không chỉ tạo nên sinh khối, mà còn có cảc chức năng trao đổi chất khác .Ngoài ra, trong bảng không nói đến một số lượng lớn các chất nhận điện tử cần thiết phải được đảm bảo cho quá trinh sinh trưởng. Tính chẩt hóa học của các thành phần trong môi trường sinh trưởng phải được tính đến khi chọn F e. v í dụ, phần lớn các nguyên tố vi lượng dễ dàng kết tủa trong môi trường sinh trưởng ở pH trung tính hoặc kiềm và do đó giảm bớt khả năng hấp thụ sinh học (khó khăn để xác định). Do đó, chúng được thêm vào nhiều gấp 10 tới 20 lần (Bridson và Brecker, 1970). Bảng 13.14: Các nhân tố tăng trưởng sản lượng của các chất cho và nhận điện tử Cảc chất cho điện tử

Yx/H2= 12g/mol

S2O3

YX7S2034g/ mo1

Fe2+

Yx/Fe2+ - 0 .3 5 g / m o I

n h 4+- n o 3-

Ỵx/NH4= 1.3-2.6/mol

t+\ z

Yx/N02 =0.9-1.8g/mo1

1 1r-1

L...............

h2

Chất nhận diện tử 0,

Yx/02= 10a-42bg/mol

NCV - n 2

YX/N03- 27g/ĩĩiole

NCV - N2

YX/N02- 17g/molc

n 20 ' - n 2

Yx/N2o=9g/moIc

a. Đối vởi các cơ chất khử là metan hoặc n-alkanes. b. Đối với các chất oxy hóa là glucoz. c. Đối với Paracocciis denitrificans với nguồn cacbon là glutamat.

22

Trong công nghệ sinh học, quá trình nuôi cấy theo mẻ (batch) và nuôi cấy theo mẻ có bô sung (fed-batch) được nghiên cứu từ lâu vì rât có lợi khi thiết kế các môi trường chứa tất cả nguyên tổ với lượng chính xác lượng càn thiết, sao cho tất cả các nguyên tố phải được tiêu thụ hết tại cuối kì tăng trường. Tuy nhiên, rất khó khăn có thể đạt được điều này do tính đa dạng của các nguyên tố và sự phụ thuộc của chúng vào điều kiện nuôi cấy .Tất nhiên, trong công nghệ sinh học, việc tối ưu hóa môi trường là rất quan trọng để tính toán sự tiêu thụ chất dinh dưỡng và để hạn chế tối đa sự hao phí nguyên liệu, hóa chất. 13.2. CÁC LOẠI HÌNH DINH DƯỜNG CỦA VI SINH VẬT Vi sinh vật có tính đa dạng rất cao cho nên các loại hình dinh dưỡng (nutritional typs) là khá phức tạp. Căn cứ vào nguồn

c, nguồn nàng lượng, nguồn điện tử, có thể chia

thành các loại sau đây (bảng 13.15). Bảng 13.15: Các loại hình đỉnh dưỡng của vi sình vật (I) - Nguồn c (Cacbon sources) +Tự dưỡng (autotroph) +DỊ dưỡng (heterotroph)

COì là nguồn c duy nhất hay chủ yếu Nguồn c là chất hữu cơ

- Nguồn năng lượng (Energy sources) +Dinh dưỡng quang năng

Nguồn năng lượng là ánh sáng

(phototroph) +Dinh dưỡng hoá năng (chemotroph)

Nguồn năng lượng lả năng lượng hỏa học giải phòng ra từ sự oxy hoá họp

- Nguồn điện tử (Electron sources) + Dinh dưỡng vô cơ (lithotroph) + Dinh dưỡng hữu cơ (organotroph)

Dùng các phân tử vô cơ dạng khử để cung cấp điện tử Dùng các phân tử hữu cơ để cung cấp điện tử

Có thể mô hỉnh hóa chức năng sinh lý cùa các chất dinh dưỡng đổi với sự sinh trưởng của vi sinh vật qua hình 13.3 sau đây:

23

Hình 73.5: Mô hình sơ lược về chức năng sinh lý cùa các chất dinh dưỡng đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật. Cỏ thể đem phần lớn vi sinh vật phân thành bốn nhóm chính (bàng 13.16) Bảng 13.16: Các loại hình dinh dưỡng cửa vi sinh vật (ỉỉ) Loại hình dinh dưỡng

Nguồn năng lưụmg; Hydro; điện tử; Cacbon

Đại diện

-Tự dưỡng quang năng vô cơ (photolithoautotrophy)

Quang năng; H2, H2S, s hoặc H20; COị

Vi khuẩn sulfua, màu tía,màu lục; Vi khuẩn lam.

-Dị dưỡng quang năng hữu cơ (photoorganoheterotrophy)

Quang năng;

Chất hữu cơ

Vi khuẩn phi lưu huỳmh màu tía, màu lục.

-Tự dưỡng hoá năng vô cơ (chemoiithoautotrophy)

Hoá năng (vô cơ); H2, H2S, Fe2\ NHì, hoặc N 02\ C0 2

Vi khuẩn oxy hoá s, vi khuẩn hydro, vi khuẩn nitrát hoá, vi khuẩn oxy hoá sất.

-Dị dưỡng hoá năng hữu cơ (chemoorganoheterotrophy)

Hoá năng (hữu cơ); Chất hữu cơ

Động vật nguyên sinh, nấm, phần lớn các ví khuẩn không quang hợp (bao gồm cả các vi khuẩn gây bệnh).

24

Loại Tự dưỡng quang năng vô cơ còn được gọi là Photolithotrophic autotrophy; loại DỊ dưỡng quang năng hữu cơ còn được gọi là Photoorganotrophic heterotrophy; loại Tự dưỡng hóa nàng vô cơ còn được gọi là Chemolithotrophic autotrophy; loại Dị dưỡng hóa năng hữu cơ còn được gọi là Chemoorganotrophic heterotrophy. Chúng ta sẽ xem xét kỹ hcm các quá trình trao đổi chất của từng nhóm vi sinh vật này trong chương Trao đổi chất. Các vi sinh vật thuộc loại hình Tự dưỡng quang năng vô cơ và Dị dưỡng quang năng vô cơ có thể lợi dụng ánh sáng để sinh trường. Chúng có vai ừò quan trọng trong quá trình diễn biến của môi trường sinh thái trong giai đoạn cồ xưa QÙa Trái đất. Vi sinh vật Tự dưỡng hoá năng vô cơ phân bố rộng rãi trong đất và ừong nước, chúng tham gia tích cực vảo các vòng tuần hoàn vật chất trên Trái đất. Vi sinh vật Dị dưỡng hoá năng hữu cơ dùng chất hữu cơ vừa làm nguồn cacbon vừa làm nguồn năng lượng. Hầu hết các loài vi khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh đà biết đều thuộc loại hình Dị dưỡng hoá năng hữu cơ. Tất cả các vi sinh vật gây bệnh đã biết đều thuộc loại này. Trong loại hình dị dưỡng hoá năng hữu cơ lại chia thành hai nhỏm: Nhóm Hoại sinh (metatrophy) dùng chất hữu cơ chết (xác động thực vật) để làm nguồn cacbon. Nhóm Ký sinh (paratrophy) ký sinh trên cơ thể thực vật, người và động vật để hấp thu chất dinh dưỡng. Chúng không thể sống được khi tách rời khỏi vật chủ. Tuy nhiên giữa hai nhóm này còn có những loại hình trung gian Là Hoại sinh không bắt buộc (facultive metatrophy) và Ký sinh không bất buộc (facultive paratrophy). Một số chùng vi sinh vật phát sinh đột biến (đột biến tự nhiên hay đột biến nhân tạo) mất đi năng lực tổng hợp một (hoặc một số) chat cần thiết cho sinh trường (thường là nhân tố sinh trưởng như axit amin, vitamin), chúng chỉ sinh trường được khi bổ sung vào môi trường các chất này. Người ta gọi chúng lả loại hình Khuyết dưỡng (auxotroph). Các chủng hoang dại tương ứng được gọi là loại hỉnh Nguyên dưỡng (prototroph). Người ta thường sử dụng các chùng vi sinh vật khuyết dưỡng trong nghiên cứu Di truyền học vi sinh vật. Không có ranh giới tuyệt đối giừa các loại hình dinh dưỡng của vi sinh vật. Vi sinh vật dị dưỡng không phải tuyệt đổi không sử dụng được CƠ2 mà chỉ là không thể dùng CO2 làm nguồn cacbon duy nhất hay chủ yểu để sinh trường. Trong điều kiện tồn tại chất hữu cơ chúng vẫn cỏ thể đồng hóa CO2 để tạo ra tế bào chất. Tương tự như vậy, vi sinh vật tự dưỡng không phải là không có thể sử dụng chất hữu cơ để sinh trường. Ngoài ra, một số vi sinh vật cỏ thể thay đổi loại hình dinh dưỡng khi sinh trưởng trong những điều kiện khác nhau. Ví dụ vi khuẩn phi sulfua màu tỉa (purple nonsulfua bacteria) khi không có chất hữu cơ có thể đồng hóa CO2 và thuộc loại vi sinh vật tự dưỡng; nhung khi cỏ chất hữu cơ tồn tại thì chúng lại cỏ thể sử dụng chất hữu cơ để sinh trường và lúc đó chúng là các vi sinh 25

vật dị dưỡng. Hơn nừa, vi khuẩn phi sulfua màu tía trong điều kiện kỵ khí và có chiếu sáng có thể sinh trưởng nhờ năng lượng của ánh sáng và thuộc loại dinh dưỡng quang năng; nhưng trong điều kiện hiếu khí và không chiếu sáng thì chúng lại sinh trưởng nhờ năng lượng sinh ra từ quá trình oxy hóa chất hữu cơ và thuộc loại đinh dưỡng hóa năng. Tính biến đổi loại hình dinh dường ờ vi sinh vật rõ ràng là có lợi cho việc nâng cao năng lực thích ứng của chúng đối với sự biến đổi của điểu kiện môi trường. 13.3. MÔI TRƯỜNG NUÔI CÁY (Culture medium) Môi trường nuôi cấy là các cơ chất dinh dưỡng được pha chế nhân tạo nhằm đáp ứng cho yêu cầu sinh trưởng, phát triển vả sản sinh các sản phẩm trao đổi chất cùa vi sinh vật. Môi trường dinh dường dùng trong nghiên cứu vi sinh vật và trong quá trình sản xuất các sản phẩm của vi sinh vật. Môi trường dinh dưỡng là yểu tố quan trọng trong công nghiệp lên men, công nghiệp sinh tổng hợp nhờ vi sinh vật. 13.3.1. Nguyên tắc pha chế môi trường nuôi cấy 1) Chọn các chất dinh dưỡng thích hợp: Nói chung môi trường dinh dưỡng cần đáp ứng các nhu cầu của vi sinh vật về nguồn c , nguồn N, nguồn muối khoáng, nguồn nhân tố sinh trưởng và nước. Vì loại hình dinh dưỡng của vi sinh vật là phức tạp, các vi sinh vật khác nhau có những yêu cầu không giống nhau về các chất dinh dưỡng cho nên cỏ rất nhiều công thức pha chế môi trường nuôi cấy. “Sách Danh lục môi trường nuôi cấy” (A Compilation of Culture Media) xuất bản từ năm 1930 cũng đã ghi tới ưên 2500 loại môi trường nuôi cấy khác nhau. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tự dưỡng hoàn toàn pha chế từ các hợp chất vô cơ. Ví dụ để nuôi cấy vi khuẩn Thiobaciỉỉus thiooxìtans gồm cỏ các thành phần như sau (g/1): (NH4) 2S04 -0.4; M gS0 4.7H20 - 0,5; FeS0 4 - 0 ,01 ; KH2P 0 4 - 4; CaCl2 - 0,25; S- 10 ; pH: 7,0, khử trùng ở 121° c trong 20 phút. Các vi khuẩn này sử dụng CƠ2 trong không khí (hay hòa tan trong nước) để cung cấp nguồn cacbon. Với các vi sinh vật íự dưỡng quang năng ngoài việc cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết còn cần chiếu sáng để cung cấp năng lượng cho chúng. Đối với vi sinh vật dị dưỡng cần cung cấp chất hữu cơ và nhu cầu dinh dưõng của các nhóm khác nhau là rẩt khác nhau. Để nuôi cấy vi khuẩn Escherichia coỉi có thể đùng môi trường khá đom giản sau đây (g/1): Glucoz - 5; NH 4H 2PO4- 1; MgSƠ 4.7 H 20 - 0 , 2 ; K 2HPO 4 - 1; NaCl - 5; pH: 7,0-7,2, khử trùng ở 112° c trong 30 phút. Nhưng cũng cỏ những vi khuẩn dị dưỡng yêu cầu những môi trường nuôi cấy rất phức tạp. Ví dụ vi khuẩn Lactobacillus bifidus cần môi trường sau đây (trong 1 lít môi trường đậm đặc gẩp đôi) : K 2HPO4 - 5g; Na-Axetat - 50g; NZ Caz Pepton- lOg; Lactoz- 70g; Alanin , Cystin, Tryptophan- mỗi loại 0,4g; Asparagin- 0,2g; Xantin, Adenin, Guanin, Ưracin - mỗi loại 0,02g; Dung dịch Muối B- 10ml; Pyridoxin-HCl - 2,4mg; Tiamin-HCl - 0 4mg-

26

Riboflavin- 0,4mg; Axit nicotinic- l,2mg; Ca-Pentoztenat - 0 , 8mg ; Biotin- 8,0 meg (microgram); Axit folic- 20 meg; Axit p-aminobenzoic- 20 meg; Tween 80 - lg. Điều chinh pH đến 6 ,8 . Thêm bang thao tác vô trùng 100ml dung dịch Axit ascorbic 1% đã lọc qua nến lọc vi khuẩn. Điểu chình đến pH 6,5. Lại thêm bang thao tác vô trùng Sữa người đã loại crem sao cho nồng độ đạt được là 2%. Dung địch Muối B có thành phần nhu sau (g/1): M gS0 4.7H20-10; FeS0 4.7H20-0,5; NaC-0,5; M nS0 4.2H20 - 0,337. Thông thường để thay cho các nhân tố sinh trưởng người ta thường đùng Pepton (thay cho từng axit amin) và cao nấm men (thay cho các nhân tố sinh trưởng). Môi trường thường dùng để nuôi cấy các vi khuẩn dị dưỡng là Môi trường Cao thịt-Pepton với thành phần như sau (g/1): Cao thịt (Beef exừact) - 5; Pepton- 10; NaCl- 5; pH: 7,0-7,2; khử trung ở 121° c trong 20 phút. Môi trường để nuôi cấy vi khuẩn Brevibacterium spp. cỏ thành phần như sau (g/1): Cao nấm men (Yeast extract)-10; Glucoz- 20; CaC0 3 - 20. Người ta chia môi trường nuôi cấy thành nhiều loại khác nhau. - Căn cứ vào thành phần môi trường ta có: môi trường thiên nhiên, môi trường tổng hop. Môi trường thiên nhiên (complex medium): đây là loại môi trường chứa các chất hữu cơ thiên nhiên không biết rõ thành phần hóa học hoặc thành phần hóa học không ổn định, vì vậy còn được gọi là môi trường không xác định về hóa học (chemically undefined medium). Các môi trường Cao thịt-Pepton, môi trường Mạch nha, môi trường LB (LuriaBertani) là các ví dụ của loại môi trưcmg này. Thành phần của môi trường LB là như sau (g/]): Pepton - 10; Cao nấm men - 5; NaCl -10; pH: 7,0; khử trùng ở

121°c trong 21

phút.

Cao thịt là nước chiết thịt được cô đặc lại. Cao thịt chứa các chất đạm hữu cơ, đường, vitamin, muối khoáng- tất cả đều dễ tan trong nước. Pepton là dạng thủy phân bằng proteaz hay bằng axit đổi với thịt, cazin, gelatin sau đó làm khô lại thành dạng bột. Pepton chứa phong phú các chất đạm hữu cơ, cũng có một số vitamin và đường. Cao nấm men là dịch tự phân (autolysate) tế bào nấm men được cô đặc lại. Cao nấm men chứa phong phú vitamin nhóm B, cũng có chứa các chất đạm hữu cơ và đường. Ngoài các loại nói trên môi trường thiên nhiên còn được chế tạo từ các nguyên liệu khác như nước chiết khoai tây, nước chiết giá đậu, nước chiết đất, nuớc chiết rơm rạ, nước chiết lông vũ, bột ngô, cám gạo, sữa, huyết thanh, nước ép cà rốt, nước dừa. Vi sinh vật ưa phân (coprophilous microorganisms) có thể dùng nước phân làm chất dinh dưỡng. Giá thành của môi trường thiên nhiên thường thấp, cho nên không chỉ được sử dụng trong phòng thí nghiệm mà còn có thể được sử dụng trong các xí nghiệp lên men công nghiệp.

27

Bảng 13.17: Thành phần m ột sổ loại pepton và dịch thủy phân protein Chế phẩm(CP)

Phản ứng Biure

Các thành phần (% tron ị protein) ( 1)

(2)

(3)

Pepton Pharmacon

+

63.5

9.7

27.8

Pepton Vitte

+

44.1

26.7

29.2

Pepton Canbaum

+

40.2

27.4

32.4

44.5

23.2

32.3

Pepton Gee Pepton Roche

+

25.3

11.7

63.0

CP thủy phân nhờ pepsin

+

42.1

25.2

32.7

CP thủy phân nhờ trypsin

+

2.0

14.9

82.1

Dịch thủy phân gluten

-

0

0

100

Dịch thùy phàn gelatin

-

0

0

100

Chủ thích: (1)- Các polypeptit cao phân tử được kết tủa bằng tannin khi cỏ mặt 2% H2S04. (2)- Các polypeptit được kết tùa bẳng tannin khi môi trường có phản ứng trung tính. (3)- Các axit amin tự do và các peptid không bị kết tủa bởi tannin. Môi trường tổng hợp (synthetic medium): đây là loại môi trường có thành phần hóa học được biết rõ cho nên còn được gọi là môi trường xác định về hóa học (chemically defined medium). Ví dụ môi trường Gause thích hợp cho Xạ khuẩn với thành phần như sau (g/1): Tinh bột tan - 20; K N 0 3 - 1; NaCl - 0,5; K 2H P0 4.3H20 - 0,5; K 2HPO 4.3 H 2O - 0,5; FeS 0 4 .7ỈỈ 2 0 - 0,01, pH: 7,2-7,4; khử trùng ở 121°c ừong 21 phút. Môi trường tổng hợp có giá thành cao và trên loại môi trường này vi sinh vật phát triển tương đối chậm, nói chung thích hợp sử dụng trong phạm vi phòng thí nghiệm. Có những vi khuẩn đòi hỏi các môi trường tổng hợp khá đơn giản, chẳng hạn như vi khuẩn Escherichia coli với môi trường sau đây: K 2HPO 4-7,0g; KH 2PỌ 4-2>0g; (NH4)2S 0 4-I,0g; M gS0 4'0 ,lg ; CaCỈ2-0 ,02 g; Glucoz-4-10g; Nguyên tổ vi ỉượng (Fe,Co,Mn,Zn,Cu,Ni,Mo)mỗi loại 2-10/ig; Nước cất- 1000ml.

C \r \

Escherichia coli.

28

Có những vi sinh vật đòi hỏi các môi trường tổng hợp rất phức tạp (và đắt tiền). Sau đây là vỉ dụ về môi trường tổng hợp dùng để nuôi cấy vi tảo Euglena: axit glutamic-6 g; axit aspartic-4g; Glycine-5g; Xaccaroz-30g; Axit malic-l,04g; Axit boric-1,14mg; Thiamin HCl-12mg; KH2PO4- 0,6g; M gS0 4-0,8g; CaC03-0,16g; (N H ^C O í- 0,72g; FeCl3-60mg; ZnS04- 40mg; M nS0 4-6mg; CuS04- 0,62mg; C0 SO4- 5mg ; (N H ^M oC V *2 l,34mg; Nước 1000ml. Một ví đụ khác về môi trường tổng họp để nuôi cấy vi khuẩn Leuconostoc mesenteroides: K 2HPO40 ,6 g; KH2P 0 4- 0 ,6 g; NH 4CI- 3g; M gS04- 0,lg; Glucoz- 25g; Natri axetat- 20g; Các axit amin - mỗi loại 100 ~200 ^g (gồm có alanin , arginin, asparagin, aspatat, cystein, glutamat, glutamin, glyxin, histidin, isoleuxin , leuxin , lysin, metionỉn, phenylalanin , prolin, serin, threonin, tryptophan, tyrozin, valin); Purinvaf Pyrimiđin - mỗi loại lOmg (gồm có adenin, guanin, uràcil, xanthin); Vitamin- mỗi loại 0,01-lmg (gồm có biotin, folat, nicotinic axit, pyridoxal, pyridoxamin, pyridoxin, ribolavin, thiamin, pantothenat, para-aminobenzoic axit). Nguyên tố vi lượng - mỗi loại 2-10/Ltg; Nước cất1000 ml.

Căn cứ vào trạng thái của môi trường người ta chia ra thành môi trường đặc, môi trường bán đặc và môi trường dịch thể.

Môi trường đặc (solid medium): đây là loại môi trường được làm đông đặc lại nhờ cỏ bổ sung thêm thạch (agar-agar), gelatin hay silica gel. Môi trường đặc phải đảm bảo được các yêu cầu sau đây: . - Không bị vi sinh vật nuôi cấy sử dụng. 29

Rau câu chì vàng. - Giữ được trạng thái đặc trong nhiệt độ nuôi cấy vi sinh vật. Dễ hòa tan khi đun nóng (thường được điều chinh bàng lượng chứa chất làm đặc trong môi trường). - Nhiệt độ để làm đặc môi trường không quá thấp. - Chất làm đặc môi trường không có hại đối với vi sinh vật. - Chất làm đặc không bị phá hủy khi khử trùng môi trường. - Giữ được ưạng thái trong suốt của môi trường. - Giá thành không quá cao, pha chế môi trường đễ dàng. Thạch là sản phẩm chế tạo từ Rau câu chỉ vàng (Graciỉaria verucosa) hay các tảo biển khác thuộc chi Gracilaria hay Geỉidium. Thạch có chứa khoảng 70% agaroz và khoảng 30% agaropectin. Để làm tan thạch cần đun môi trường đến 100° c và để làm giữ môi trường thạch ở trạng thái lỏng cần giữ ở nhiệt độ khoảng 50-60°C (trong nồi cách thủy). Để làm cho môi tnràmg đặc lại cần hạ nhiệt độ xuống 40-45°C. Tùy chất lượng của thạch mà khi làm môi trường người ta cho vào với tỷ lệ 15-20g/l. Khi cần nuôi cấy vi sinh vật trên các môi trường thạch có pH từ 6 trở xuống thì cần điều chỉnh môi trường tới pH trung tính trước khi khử trùng, sau đó mới điều chỉnh lại đến pH thích hợp (nếu không thạch có bị thủy phân ưong điều kiện pH thấp và ở nhiệt độ cao). Người đầu tiên nghĩ đến sử dụng môi trường đặc ừong nghiên cứu vi sinh vật là Robert Koch khi tình cờ thấy các khuẩn lạc của vi khuẩn trên củ khoai tây và ông đã dùng các lát khoai tây để làm môi trường phân lập vi khuẩn vào năm 1881. Người đầu tiên dùng gelatin để chế tạo môi ừường đặc cũng vào năm này là một ừợ lý của Koch, ông Frederick Loeffler. Việc dùng thạch để làm chất đông đặc là do cô Minora Tarazemon phát hiện; khi nấu thức ăn với tảo biển và khi để nguội cô thấy thức ăn đông đặc lại (1882). Người đầu tiên dùng thạch thay the gelatin ừong môi trường nuôi cấy là vợ của Walther Hess (một trợ lý khác cùa Koch) - bà Fannie Eilshemius Hess.

30

Hình ỉ 3.4: Robert Koch (Ỉ843-Ỉ9Ỉ0).

Hĩnh ỉ 3.5: Fannie Eỉỉshemỉus (Ị850-I934) và Walther Hesse (1846-1911).

Sau đây là vài đặc điểm chủ yểu của Thạch và Gelatin Thạch

Gelatin

1,5-2,0

5-12

Nhiệt độ hòa tan f c )

96

25

Nhiệt độ đông (°C)

40

20

Hơi axit

Axit

16

14-15

CaO (%)

1,15

0

MgO (%)

0,77

0

N(%)

0,4

18,3

Tuyệt đại đa số không sử dụng

Nhiều vi sinh vật có thể sừ dụng

Đậc điểm Nồng độ thường dùng (%)

pH Chất khoáng (%)

Vi sinh vật có thể sir dụng làm chất dinh dưỡng

* Môi trường bán đặc (semỉsolỉd medium): Môi trường bán đặc là môi trường chi chứa 0,2-0,7% thạch và thường được sừ dụng để quan sát khả năng di động của ví sinh vật, quan sát hiệu giá thực khuẩn thể (phage)... * Môi trường dịch thể (liquid medium): Môi trường dịch thể hay môi trường lỏng là các môi trường không bổ sung các chất làm đông đặc môi trường. Để thông khí phải dùng tới máy lắc hay các nồi lên men có hệ thống thổi khí vô trùng (vô khuẩn) và hệ thống khuấy đảo làm tan đều bọt khí. Môi trường dịch thể ngoài việc sử dụng trong nghiên cứu tại phòng thí nghiệm còn được sử đụng rộng rãi trong sản xuất lớn tại các nhà máy lên men công nghiệp. 31

-

Căn cứ vào mục đícii sử dụng người ta chia môi trường nuôi cây thành nhiêu loại

khác nhau. * Môi trư ờng cơ sở (minimum medium): Các vi sinh vật tuy có yêu cầu dinh dưỡng không giống nhau nhưng nói chung về cơ bản thì các chất dinh dưỡng -là giống nhau. Môi trường cơ sở là môi trường có chứa các chất dinh dưỡng cơ bản cần thiết cho sự sinh trưởng, phát triển của đa số vi sinh vật. Môi trường cơ sở thông đụng là Môi trường cao thịt - pepton. Môi trường cơ sở được dùng làm thành phần cơ bản cho những môi trường đặc biệt, tùy theo yêu cầu của từng nhóm vi sinh vật mà bổ sung thêm các chất đinh dưỡng càn thiết. Môi trường làm giàu hay còn gọi là môi trường gia phú (enrichment medium): Trên môi trường cơ sở cho thêm một số chất dinh dưỡng đặc biệt để thích hợp với việc nuôi cấy một số nhóm vi sinh vật. Các chất bổ sung thêm cỏ thể là máu, huyết thanh, cao nấm men, mô động vật hay thực vật. Ví dụ để nuôi cấy vi khuẩn Bordetella pertussis người ta dùng môi trường cơ sở Difco 0048 nhưng bổ sung bằng thao tác vô trùng máu thò (đã lọc qua nến lọc) sau khi đã khử trùng môi trường 15 phút ở 121°c, sao cho nồng độ cuối là 15%.

Bordetelia pertussis. * Môi trường giám biệt (differential medium) Môi trường giám biệt dùng trong việc giám định các loài vi sinh vật khác nhau để xác định vị trí phân loại của chúng. Các môi trường giám biệt và phương pháp sử dụng đã được trình bày trong Tập I (Thế giới vi sinh vật). Chẳng hạn khi xác định khả năng sinh proteaz thì bổ sung cazin hay gelatin, khả năng sinh amylaz thi thêm tinh bột tan, khả năng sinh lipaz thì thêm dầu ăn và chỉ thị màu, khả năng sinh H2S thì thêm Pb axetat,..Người ta thường dùng môi trường EMB (Eosin Metylene Blue) để giám biệt vi khuẩn đường ruột. Môi trường nảy có thành phần như sau: Pepton-10g; Lactoz-5g; Xacaroz-5g K2HPO4- 2g; EosinY-0,4g; Metylene B!ue~0,065g; Nước cât-lOOOml; pH—7,2. Môi trường này ức chế vi

32

khuẩn Gram (+) và một số vi khuẩn Gram (-). Từ môi trường này kiêm tra thêm một vài thí nghiệm với các khuẩn lạc xuất hiện có thể phân lập đuợc nhiều loại vi khuân đuờng ruột Gram {-) theo sơ đồ sau đây: a- Lẽn men lactic, sinh axit.

^ ,

b- Sinh axit mạnh,khuẩn lạc chiếu sáng thấy có màu tía, phản quang có màu lục ánh kim...Escherichia coli. bb-Sinh axit yếu, khuẩn lạc có màu nâu gụ... Enterobacter, Serratia, Klebsiella, Hafhia. aa- Không lên men lactic, không sinh axit, khuẩn lạc trong vô màu... Proteus, Salmonella, Shigella. * Môi trường chọn lọc (Selective medium) Dùng môi trường chọn lọc để phân lập từng nhóm vi sinh vật riêng biệt từ một quần thể vi sinh vật trong tự nhiên. Dựa vào yêu cầu dinh dưỡng đặc biệt của từng nhóm vi sinh vật hoặc tính mẫn cảm khác nhau đối với hóa chất, với chất kháng sinh mà đưa thêm vào môi trường những chất tương thích, nhằm ức chế sự sinh trưởng của các nhóm vi sinh vật khác và giúp cho phân lập được nhóm vi sinh vật cần nghiên cứu. Có những môi trường chọn lọc được thiết kế dựa trên nhu cầu dinh đưỡng đặc biệt cùa từng nhóm vi sinh vật nhất định. Ví dụ dùng xenluloz hay dầu parafin làm nguồn cacbon duy nhất khi phân lập nhóm vi sinh vật phân hủy celluoz hay phân hủy parafin, dùng protein làm nguồn nitơ duy nhất để phân lập vi sinh vật sản sinh proteinaz, dùng môi trường không chứa nitơ để phân lập vi sinh vật cổ định nitơ. Ví dụ môi trường vô đạm Ashby dùng để phân lập vi khuẩn Azotobacter có thành phần như sau: Mannit-1%; KH2P04-0,025%, MgSC>4.7 H2 0 -0 ,02 %; NaCl-0,02%; CaS04.2H20-0,01 %; C aC 03-0,5%. Cũng cỏ loại môi trường chọn lọc thêm 10% phenol sẽ làm ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn và vi nấm nhưng lại có thể phân lập được xạ khuẩn. Neu thêm vào môi trường Bi sulphat thi có thể ức chế được các vi khuẩn Gram (+)và phần lớn các vi khuẩn Gram (-), nhưng lại phân lập được vi khuẩn thương hàn (Salmonella typhi). Thêm vào môi trường Brilliant green hay Crystal violet thì ức chế được vi khuẩn Gram (+) nhưng lại phân lập được vi khuẩn Gram (-). Thêm vào môi trường Streptomycin thì có thể ức chế được nhiều loại vi khuẩn nhưng Ịậi phân lập được vi nấm. Thêm vào môi trường Na propionat ecrthể ức chế được nấm sợi nhưng lại phân lập được nấm men. Trong Kỹ thuật di truyền (Gentic engineering) người ta thường xuyên sử dụng các môi trường chọn lọc chứa các kháng sinh xác định để tách ra các chủng mang gen tái tổ hợp.

33

Trong thực tế có nhừng môi trường vừa là môi trường chọn lọc, vừa là môi trường giám biệt. Ví dụ để phân lập tụ cẩu khuẩn vàng (Staphylococcus aureus) người ta thêm vào môi trường 7,5% NaCl, Mannit và chỉ thị màu axit-kiềm. Vi khuẩn này vừa chịu được nồng độ NaCl cao , vừa chuyển hóa mannit thành axit. Sau đây là một số chất được bổ sung vào môi trường (MT) chọn lọc khi cần thiết để phân lập một so nhóm ví sinh vật nhất định: Potassium tellurite (MT Mueller tellurite) để phân lập Corynebacterium diphtheriae\ Tellurite và Crystal violet (MT Mitis-salivaríus) để phân lập Streptococcus', Na azide (MTAzide glucoz) để phản lộp Streptococcus; Phenyletanol (MT Phenyletanol) để phân lập Staphylococcus và Streptococcus; Nước ép cà chua (MT nước ép cà chua) để phân lập vi khuẩn lactic từ nước bọt; Desoxycholate, xitrat (MT Desoxycholate xitrat) để phân lập vi khuẩn đường ruột Gram(-); Mật(bile)s xitrat, brilliant green (MT SS) để phân lập Salmonella và Shigella', Malachite green dye (MT Lowenstein-Jensen) để phân lập Mycobacterium-, Chloramphenicol (MT Emmơn) để phân lập nấm; Roz Bengal và Streptomycin (MT Martin) để phân lập nẩm...

Corynebacterium diphtheriae. Ngoài các loại môi trường kể trên còn có các loại môi trường đặc biệt khác. Đó là Môi trường phân tích (assay medium) dùng để định lượng vitamin, chất kháng sinh... Đó ]à

34

Môi trường khử (reduced medium) dùng để nuôi cấy các vi sinh vật kỵ khí. Đó là Môi trường nuôi cấy mô (Tissue-culture medium) chuyên phục vụ cho việc nuôi cấy tế bào và mô động, thực vật, hoặc dùng để nuôi cấy trên tế bào các nhóm vi sinh vật chuyên ký sinh như virút, Chỉamvdìa, Rickettsia, Spirochete. Một số virút và Rickettsia không phát triển được trẽn các môi trường nhân tạo mà phải nuôi cấy trên phôi gà, trên tế bào thận khi, trên cơ thể động vật thực nghiệm. Dưới đây là một vài gợi ý quan trọng khi chuẩn bị môi trường nuôi cẩy. Rất nhiều đường dễ bị phân giải trong quá trình khử trùng ở pH kiềm (đặc biệt với sự có mặt của photsphate vả pepton), làm cho màu môi trường chuyển thành màu nâu và các sản phẩm tạo thành có thể ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật. Để tránh tình trạng đó, người ta khử trùng ở môi trường pH axit nhẹ hoặc khử trùng riêng biệt đối với đường. Tất cả các kim loại vi lượng dề dàng tạo nên muối photphat không tan và kết tủa trong môi trường nuôi cấy. Điều nảy có thể được tránh bàng cách bổ sung thêm các nhân tố có ái lực với kim loại (metal-chelating agents) như là EDTA (Etylen Diamin Tetraaxetic Axit) hay NTA (Nitrilotriaxetic axit) hay đôi khi là các axit cacboxylic như xitrat hay tartrat. Việc thêm các nhân tố này có hiệu quả hai mặt. Một mặt, nỏ ngăn chặn sự kết tủa của các kim loại vi lượng, mặt khác nó hoạt động giống như một bể chứa các kim loại đó, bằng cách này có thể làm giảm tính độc nhờ giảm nồng độ tự do của chúng (tới mức mà các vi sinh vật có thể sử dụng được). Ở môi trường pH >7, các kim loại kiềm thổ Ca và Mg (dưới dạng vi lượng) dễ dàng kết tủa với sự hiện diện của photphat (hay sự có mặt của ion Cacbonat khi sử dụng môi trường đệm là bicacbonat, hay có sẵn trong nước cứng) tạo nên hảm lượng muối không tan cao. Những kết tủa này đôi khi khó thấy bằng mắt thường, đặc biệt trong các bỉnh nuôi cấy lắc do thể tích nhỏ của môi trường. Để tránh điều này, môi trường cỏ thể được khừ trùng ở pH hơi axit (pH đuợc điều chỉnh sau), hay muối photphat được khử trùng riêng rẽ với môi trường và kết hợp sau khi đã làm nguội. Cần chú ý rằng đa số các môi trường cổ điển sừ dụng trước những năm 60 của thế kỷ trước thường không bao gồm các nguyên tố vi lượng. Sự thêm vào thường là không cần thiết bởi vì các nguyên tố vi lượng đã có chứa sẵn trong các muối không tinh sạch được sử dụng để chuẩn bị cho môi trường. Môi trường hiện nay được chuẩn bị với các muối tinh sạch cao nên không đáng ngạc nhiên là sẽ thất bại trong việc tạo ra nhiều sinh khối sản phẩm nếu không được bổ sung các nguyên tố vi lượng vào trong môi trường. Một ví dụ điển hình lả môi trường cổ điển M9 được sử dụng rất rộng rãi cho sự sinh trưởng của E.coỉi ừong các nghiên cứu đi truyền. Môi trường này không cung cấp thuận lợi các nguyên tố vi lựợng cho sự phát triển của E.colì trong một vài thế hệ, sau đó chúng sinh truởng chậm lại và cuổi cùng ià ngừng lại. 35

13.4. S ự HẨP THƯ CÁC CHÁT DINH DƯỠNG Ở VI SINH VẬT Để tồn tại, sinh trưởng và phát triển, tế bào vi sinh vật phải thường xuyên trao đôi vật chất và năng lượng với môi trường bên ngoài. Một mặt chúng tiếp nhận các chât dinh dưỡng từ môi trường, mặt khác chúng thải ra môi trường một số sản phẩm trao đổi chất. Te bào vi sinh vật sử dụng các chất đinh dưỡng bẳt đầu từ việc hấp thu chúng. Cơ chế của sự hấp thu này có tính chuyên hóa, nói cách khác chúng chỉ hấp thũ các chất cần thiết, việc hấp thu các chất không sử dụng được là bất lợi đối với tế bào. Vi sinh vật thường sống trong các môi trường nghèo chất dinh dưỡng, đo đó chúng phải có năng lực vận chuyển chất dinh dưỡng từ môi trường có nồng độ thấp vào môi trường có nồng độ cao bên trong tế bào, tức là ngược lại với gradien nồng độ. Như thế là giữa trong và ngoài tế bào có một hảng rào thẩm thấu, đó là màng sính chất có tính thẩm thấu chọn lọc' Chúng cho phép các chất dinh dưỡng xâm nhập vào tế bào và cản trở các chất khác. Do tính đa dạng và phức tạp của các chất dinh dưõng nên vi sinh vật có nhiều phương thức khác nhau để vận chuyển các chất dinh dưỡng. Quan ừọng nhất là cách Khuếch tán xúc tiến (Facilitatd diffusion), cách Vận chuyển chủ động (Active transport) và cách Chuyển vị nhóm (Group translocation). Ở các vi sinh vật có nhân thật không thấy có cách Chuyển vị nhóm nhưng cỏ cách sử đụng quá trình Nhập bào (Endocytosis).Cấu tạo của màng sinh chất được biểu thị qua hình 13.6 sau đây:

Hình 13.6: Cấu trúc cùa màng sinh chất (Theo sách của Prescott, Harley và Klein). 13.4.1. Sự khuếch tán xúc tiến (Facilitatd Diffusion)

36

Một số ít các chất, như glyxerol, có thể đi qua màng tế bào chất theo phương thức Khuếch tán bị động (Passive diffusion). Khuếch tán bị động còn được gọi tắt là Khuyếch tán, đỏ là việc các chất dinh đường chuyển tù chỗ có nồng độ cao đến chỗ có nồng độ thấp. Khuếch tán bị động muốn làm cho tế bào hấp thụ có hiệu quả một số chất dinh dưỡng cần có nồng độ chất này bên ngoài tế bào cao hơn bên trong. Tốc độ hấp thu tùy theo lúc tế bào tăng lượng hấp thu chất này mà giảm xuống. Trừ phi loại chất dinh dưỡng này sau khi xâm nhập tế bào lập tức được sử dụng và không làm nâng cao nồng độ chất đó trong tế bào. Chỉ có nước (H 2O), O 2 và CO2, là nhừng phân tử rất nhò mới thường được vận chuyển qua màng bằng phương thức khuếch tán bị động. Các phân tử tương đổi lớn hơn, các ion và các chất có tính cực (polar substances) khó có thể đi qua màng sinh chất bằng phương thức khuếch tán bị động.

Hình 13.7: Khuểch tản bị động (đường thằng) và khuếch tán xúc tiến (đường cong) (Theo sách cùa Prescott, Harley và Klein). Protein mang (carrier protein) còn gọi là enzym permez là một loại protein gắn ưên màng. Với sự hỗ trự của permez có thể nâng cao rất nhiều tốc độ khuếch tán qua màng có tính thẩm thấu chọn lọc. Phương thức vận chuyển qua màng với sự hỗ ừợ của permez được gọi là sự khuếch tán xúc tiến (facilitatd diffusion). Tốc độ của quá trình khuếch tán xúc tiển tăng lên khi sự chênh lệch nồng độ chất dinh dưỡng giữa trong và ngoài tế bào tăng lên. Khi nồng độ các chất dinh dưỡng tương đối thấp thì khuôn khổ tảng lên cao hơn so với phương thức khuếch tán bị động. Lúc gradien nồng độ đạt tới một trị số nhất định thì dẫn đến hiệu ứng bão hòa. Sự tham gia của Permez đã làm dẫn đến hiệu ứng bào hòa (hình 13.7). 37

Đáng chú ý là, lúc permez bị bão hòa, sự khuểch tán xúc tiến không tăng iên đo sự tăng mức chênh lệch chất dinú dưỡng trong và ngoài tế bào. Quan hệ giữa tốc độ khuếch tán xúc tiến và gradien nòng độ chất dinh dưỡng tưong tự-như mối quan hệ giữa enzym và cơ chất, và khác hẳn với đường biểu diễn thẳng phàn ánh sự khuếch tán bị động. Ngoài ra sự giống nhau giừa permez và enzym còn ờ chỗ có tính chuyên nhât đôi với chât vận chuyến, mỗi loại permez chi có thể vận chuyển một cách chọn lọc đối với một sô chất tương thích. Dù có sự tham gia cùa permez nhưng khuếch tán xúc tiến vẫn đúng ỉà phương thức vận chuyển khuếch tán. Việc vận chuyển vẫn phải dựa vào sự chênh lệch nông độ chất dinh dưỡng giữa trong và ngoài màng. Khi mất đi sự chênh lệch nồng độ sự vận chuyển sẽ đừng lại. Quá trình này không cần tới năng lượng trao đổi chất (metabolic energy) của tế bào. Gradien nồng độ có thể duy trì khi tế bào chuyển biến chất dính dưõng được vận chuyển thành một hợp chất khác hoặc chuyển chất dinh dường đó tới một vị trí khác của màng {ở sinh vật có nhân thật). Thật thú vị khi thấy một so permez này liên quan đến protein chủ chốt của thau kính mắt ở động vật có vú, đó là các protein thuộc họ MIP. Trong vi khuẩn 2 loại kênh MIP phân bố rộng rãi nhất là aquaporin vận chuyển nước và các nhân tố xúc tiến glyxerol (glyxerol facilitators) vận chuyển glyxerol. Mặc đầu đã có rất nhiều nghiên cứu đổi với cơ chế khuếch tản xúc tiến nhưng quá trình này vẫn chưa được hiểu biết một cách đầy đủ. Hỉnh như phức hợp permez xuyên ngang qua màng tế bào. Sau khi chất đinh dưỡng được kết gắn bên ngoài màng, cấu hình cùa permez phát sinh biến hóa để phỏng thích được chất đinh dưõng vào bên trong màng. Permez sau đó lại hồi phục lại cấu hình ban đàu và sẵn sàng để đón nhận phân tử dinh dưỡng khác bên ngoài màng. Kết quả của quá trình này là một phân tử không tan trong lipit có thể đi vào tế bào đáp lại gradien nồng độ của nó. Nên nhớ ràng, cơ chế này có thể đảo ngược bởi gradien nồng độ, nếu nồng độ một số vật chất trong tế bào cao hơn bên ngoài thì cũng có thể thông qua phương thức này mà chuyển vận ra ngoài tế bào. Vì thông qua hoạt động ừao đổi chất mà tế bào tiêu hao rất nhanh các chất đinh dưỡng đưa vào tế bào nên không cỏ chuyện chất đinh dưỡng bị đưa ngược ra ngoài (hình 13.8). Ở các sinh vật nhân nguyên thủy quá trình khuếch tán xúc tiến không phải lả phương thức vận chuyển chủ yếu vì nồng độ chất dinh đưomg bên ngoài tế bào thường rất thấp cho nên không thể thực hiện được quá trình khuếch tán xúc tiến để hấp thụ chất dinh dưỡng. Glyxerol được vận chuyển bời quá trình khuếch tán xúc tiến ở E.coli, Salmonella typhimumm, Pseudomonas, Bacillus và nhiều vi khuẩn khác. Sự khuếch tán xúc tiến thường gặp ờ tê bào sinh vật nhân thực, chúng đung phương thức vận chuyển này để chuyển vận các loại đường và axit amin vào tế bào.

! Bèn ngoài tế bao

M ànệsiiih chất

Bên trong tế bào

Hình 13.8. Một kiểu khuếch tản xúc tiến (Theo sách cùa Prescott, Harley và Klein). 13.4.2. Sự vận chuyển chủ động (Active Transport) Mặc dầu sự khuếch tán xúc tiến giúp chuyển vận có hiệu quả chất dinh dường vào bên trong tế bào khi nồng độ chất hòa tan bên ngoài cao hơn bên trong tế bào, nhưng không thể vận chuyển được chất dinh dưỡng khi nồng độ chất hòa tan trong tế bào cao hom bên ngoài. Vi sinh vật thường sống ừong các môi trưởng có nồng độ chất dinh dưỡng rất thấp, để có thể sinh trưởng và phát triển chúng phải có thể vận chuyển và hấp thu được từ môi trường các chất đinh dường có nồng độ thấp. Khi đó khuếch tán xúc tiến không còn là phương thức vận chuyển hữu hiệu nữa mà phải cỏ những phương thức vận chuyển khác, trong đó quan ưọng nhất là phương thức vận chuyển chủ động (active transpore) và phương thức chuyển vị nhóm (group Ưanslocation); cà hai phương thức này đều cần tới năng lượng. Sự vận chuyển chủ động là loại phương thức vận chuyển các phân tử chất hòa tan tới nơi có nồng độ cao hơn, tức Jà ngược lại với gradien nồng độ và cần phải tiêu hao năng lượng. Vì sự vận chuyển chủ động cần tới các protein mang (permez) nên tương tự với sự khuếch tán xúc tiến trong một sổ phương diện. Permez có tính chuyên nhất cao đối với các phân tử được vận chuyển. Các phân tử chất hòa tan có tính chất tương tự cỏ thể lên kết với permez trong cả hai trường hợp - khuếch tán xúc tiến và vận chuyển chủ động. Trong trường hợp nồng độ các chất dinh dưỡng khá cao sự vận chuyển chủ động cũng có hiệu ứng bão hòa (hình ỉ 3.9). Tuy nhiên, sự khác nhau lớn nhất giữa hai loại này là vận chuyến chủ động có thể vận chuyển ngược nồng độ nhưng cần tiêu hao năng lượng trao đổi chất. Các chất ức chế trao đổi chất có thể làm trở ngại việc sản sinh năng lượng do đỏ làm ức 19

chế sự vận chuyên chủ động, nhưng không ìàm ảnh hướng đên quá trình khuêch tán xúc tiến (ngay cả trong thời gian ngắn). Vi khuẩn, cổ khuẩn và các vi sinh vật nhân thật có các hệ thông vận chuyên protein kết hợp (Binding protein transport systems) hoặc protein vận chuyển hinh hộp kết họp với ATP (ATP-binding cassette transporters) hay còn gọi là protein vận chuyển ABC (ABC transporter). Loại protein vận chuyển nàv thường được tạo thành một phức thể nhờ sự kêt hợp giữa hai vùng xuyên màng ưa nước (hydrophobic membrane - spanning domain) trên bề mặt tế bào chất và hai vùng gắn với nucleotit (hình 13.9).

Hình ỉ 3.9: Công năng của protein vận chuyển hình hộp có khả năng kết hợp với ATP (Theo sách cùa Prescott, Harley và Klein) (1)=Protein mang chất hòa tan được gắn với cơ chất vận chuyển và hướng đển phức chất protein vận chuyển ABC. (2)=Protein mang chất hòa tan gẳn vào protein vận chuyển và phóng thích cơ chất, chuyển qua màng nhờ năng lượng của sự thủy phân ATP. Vùng xuyên màng hình thành một lỗ nhỏ trong màng và vùng kết hợp nucleotit sẽ gán với ATP Tồi thủy phân ATP để hấp thụ chất hòa tan. Protein vận chuyển ABC tận dụng protein liên kết cơ chất chuyên biệt nằm trên khe chu chất của vi khuẩn Gram âm hoặc bám ưên màng lipit tại mặt ngoài của màng sinh chất ở vi khuẩn Gram dương. Các protein liên kêt này (cũng tham gia vào quá trình hóa hướng động-chemotaxis) sẽ gắn với phân tử được vận chuyên, roi tương tác với protein vận chuyển màng để chuyển phân tử hòa tan vào trong tê bào. Vi khuan E.coỉi đã dùng cơ chế này để vận chuyển nhiều loại đường (arabinoz, mantoz, galactoz, riboz) và axit amin (glutamat, histidin, leuxin).

Các chất đưa vào vi khuẩn Gram (+) phải đi qua màng ngoài truớc khi phát huy tác dụng của protein vận chuyển ABC và các hệ thống vận chuyển chủ động khác. Các phân tử nhỏ có thể sử dụng một protein lỗ phổ biến như OmpF. Các phân tử lớn hơn phải dùng tới các protein lỗ màng chuyên biệt. Trong một số trường hợp, ví dụ việc hấp thu sắt và vitamin B 12 phải dùng tới các protein vận chuyển và protein tiếp nhận màng ngoài có ái lực cao chuyên biệt. Đáng chú ý là protein vận chuyển ABC ở sinh vật nhân thật nhiều khi có tẩm quan trọng lớn trong y học. Một số tế bảo ung thư sử dụng các protein vận chuyển này để bơm thuốc ra. Việc xơ hóa nang là kết quà của một đột biến làm bất hoạt một protein vận chuyển ABC đối với chuỗi chuyển ion clorit trong phổi. Vi khuẩn cũng dùng gradien proton phát sinh ra khi chuyển vận điện từ để thúc đẩy sự vận chuyển chủ động. Các protein vận chuyển màng chịu trách nhiệm đổi với quá trình này thiếu hụt các protein liên kết chu chẩt chuyên biệt để kết họp với các chất dinh dưỡng. Lactoz permez ở vi khuẩn E.coỉi là một ví dụ điển hình. Permez này là một protein đom có phân tử lượng khoảng 30 000. Nó vận chuyển phân tử lactoz khi có một proton xâm nhập tể bào (nồng độ proton cao bên ngoải tể bào là do hoạt động của chuỗi chuyển vận điện tử). Sự vận chuyển liên kết của hai cơ chất theo cùng một hướng được gọi là vận chuyển đồng hướng (symport). Trong quá trinh này năng lượng tích tụ trong gradien proton được huy động để vận chuyển vật chất. Mặc dầu cơ chế của phương thức vận chuyển này còn chua được hiểu biết đầy đủ nhưng nới chung được cho rằng proton và permez sau khi kết hợp sẽ cải biển hình dạng và ải lực hấp thụ chất đinh dưỡng. Vi khuẩn E.coỉi cũng dùng sự vận chuyển đồng hướng với proton để vận chuyển axit amin và các axit hữu cơ như xuccinat và malat. Một gradien proton cũng có thể thông qua việc hình thành một gradien ion natri đe gián tiếp tác động lên sụ vận chuyển chủ động {hình 13.10). Các chất vận chuyển được chuyển xuyên màng theo phương hướng tương phản như vậy được gọi là vận chuyên ngược hướng (antiport). Gradien natri sinh ra trong ngoài tế bào do hệ thống vận chuyển proton ngược hướng này sẽ có thể đẫn đến việc hấp thu đường và axit amin vào tể bào. Một ion natri có thể liên kết với một protein mang và gây ra sự biến đổi hình dạng. Protein mang sẽ kết hợp mật thiết với đường hay axit amirt và định hướng chúng chuyển vào bên trong tế bào. Do nồng độ natri trong tế bào thấp, ion natri có thể tách rời ra khỏi protein mang và chất dinh dưỡng được vận chuyển cũng được tách ra theo. Cùng với việc ion natri di động vào tế bào vi khuẩn E.coỉi thì protein mang cũng sẽ chuyển đường melibioz và axit amin glutamat vào tế bào này.

dì

Màng sinh chất Ngoại bào (hay khe chu. chất ờ vikhiiẫn) -----...... - «• 1

ị

Hình 13. ĨO: Tác dụng của gradien proton và natri trong vận chuyển chù động (Theo sách cùa Prescoti, Harley và Kìeinị. 1- Proton bơm ra ngoài màng sinh chất khi vận chuyển điện từ. 2- Gradien proton thông qua cơ chể vận chuyển ngược hướng (antrport mechanism) để đẩy ion natri ra ngoài. 3- lon natri liên kết với phửc hợp protein mang (carrier protein complex). 4- Điểm kết hợp với chẩt hòa tan (đung chẩt) biến đồi hình dạng và gắn với dung chất (đường hoặc axit amin). 5' Cẩu hình của protein mang (carrier) thay đổi, ÌOD natri được chuyển vào trong tế bào và sau đó dung chất cũng rời khỏi protein mang.

Sự vận chuyển đồng hướng (symport) hay vận chuyển hiệp đồng (cotransport) natri cũng là một quả trình quan Ưọng ở các tế bào nhân thật (eucaryotic) khi hấp thu đường và axit amin. Nhưng gradien ion natri thường sinh ra do việc thủy phân ATP chứ không phải do lực chuyển động của proton. Vi sinh vật thưcmg thông qua nhiều hệ thống vận chuyển để hấp thu một chất dinh dưỡng. Ví dụ như ở vi khuẩn E.coìỉ, ít nhất cũng có tới 5 hệ thống vận chuyển để hấp thu đường galactoz, 3 hệ thống vận chuyển để hấp thu glutamat và leuxin, 2 hệ thống vận chuyển để hấp thu ion kali. Khi có nhiều hệ thống vận chuyển như vậy đoi với cùng một cơ chất, các hệ thống cỏ sự khác nhau về nguồn năng lượng tiêu hao, về ái lực đối với chất dinh dưỡng và về phương thức điều tiết hệ thống vận chuyển. Tính đa dạng về các phương thức vận chuyển như vậy đã giúp cho vi sinh vật càng có ưu thể cạnh tranh mạnh mẽ trong điều kiện môi trường dễ biến đổi. 13.4.3. Sự chuyển vị nhóm (Group Translocation) Trong việc vận chuyển chủ động, các phân tử hòa tan vận chuyển qua màng mà không cần cải biến. Nhiều vi sinh vật nhân sơ còn có thể thông qua việc chuyển vị nhóm để hấp thu chất đinh dưõng. Trong quá trình này vật chất được vận chuyển sẽ có phát sinh biến hóa hóa học. Nhóm này có thể xểp vào loại vận chuyển phụ thuộc năng lượng vì cần sử dụng năng lượng trao đổi chất. Hệ thống chuyển vị nhóm quen biết nhất ỉà Photphoenolpyruvat: hệ thống photphotransferaz đường (PTS). Nhiều loại đường thông qua phương thức vận chuyển này để chuyển vào tế bào vi sinh vật nhân sơ khi bị photphoryl hỏa và sử dụng photphoenolpyruvat (PEP) làm thể cho photphat: PEP + Đường (ngoại bào) -*■ pyruvat + Đường + p (nội bào) PET rất phức tạp, ở vi khuẩn E.coli và Salmonella typhimurium PTS tạo thành bời 2 enzym (EI và Eli) và 1 protein ổn định nhiệt có phân tủ lượng thấp (HPr). HPr và Enzym EI là tồn tại trong tế bào chất. Enzym Eli có nhiều biến hóa trong cấu trúc, thường đo hợp thành bời 3 tiểu đơn vị (subunits) hay vùng kết cấu (domains), trong đó EIIA (trước đây gọi !à EIII) là protein tế bào chất có thể hòa tan, EIIB cùng là một protein ưa nước (hydrophilic), EIIC ỉà protein kỵ nước năm trên màng tế bảo, hai loại sau thuờng kết hợp lại với nhau. Trong quá trình vận chuyển, dưới tác dụng của EI và HPr một photphat cao năng từ PEP chuyển đến enzym Eli với sự giúp đõ của En2 ym I và HPr. Sau đó E lĩđ ư a 1 phân tử đường qua màng vào tế bào và được photphoryl hóa. Eli chỉ vận chuyển chuyên hóa từng loại đường và ừong các hệ thống PTS khác nhau có cảc Eli khác nhau, còn EI và HPr là giống nhau trong mọi hệ thống PTS.

43

Hình 13.11: Chuyển vị nhóm (Theo sách Microbiology cùa Prescott, Harley và Klein.) Hệ thống PTS phân bố rộng rãi ở các vi sinh vật nhân sơ. Các chi vi khuẩn Escherichia, Salmonella, Staphylococcus và các vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc (facultatively anaerobic) khác đều có hệ thống PTS. Một số vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, như thuộc chi Clostridium, cũng có hệ thống PTS. Một số vi khuẩn thuộc chi Bacillus có cả hai hệ thong Đường phân (Glycolyse) và PTS. Nhưng các vi khuẩn hiếu khí hầu như không cỏ hệ thống PTS. Nhiều cacbohydrat được vận chuyển bời hệ thống này. Vi khuẩn E.coli hấp thu glucoz, fructoz, mannitol, xacaroz, N-acetylglucozsamin, xenlobioz và nhiều cacbohydrat nằng phương thức chuyển vị nhóm. Ngoài vai trò dùng để vận chuyển, protein PTS còn là cơ quan cảm thụ hóa học - cảm thụ khí trong quá trình hóa hướng động. 13.4.4. Sự hấp thụ sắt (Iron Uptake) Hâu như tât cả vi sinh vật đều cần sử dụng sắt (Fe) để cấu tạo nên các Cytocrom và nhiêu enzym. Săt rất khó hấp thụ vì ion sắt (Fe3+) và các dẫn xuất của chúng rất khó hòa tan, trong môi trường thường có rất ít các hợp chất sắt dễ hòa tan để có thể vận chuyển vào tê bào. Việc hâp thu săt của vi sinh vật là hết sức khó khăn. Nhiều vi khuẩn và nấm phải khăc phục khó khăn này băng cách thông qua thể mang sất (siderophore). Đó là những 44

phân tử có phân tử lượng thấp lại liên kết với sắt và chuyến vận được vào tế bào, thường đó là các muối hydroxamat hoặc phenolat - catecholat. Ferrichrome là một loại hydroxamat được sinh ra bời nhiều nấm; enterobactin là loại catecholat được sinh ra bởi E.coli... Trong hình bên ta thấy 3 loại thể mang sắt dưới các dạng khác nhau.

Ferrichro fííC

Bitcic-baotỈPì

CHj

I c =

0

Vé3.

N

TOa I ( N H - C H j- CO)j P J H - C H - C 0)3

ÍCO-CH—C K j- 0 )a (lì)

(•1) B itc ro b a c tin -iro ri c o m p le x

0

Hình ỉ ĩ. 12. Sỉderophore. Khi môi trường cỏ chứa với hàm lượng thấp các sát có thể sử dụng vi sình vật sẽ tiết ra các thể mang sắt (siderophones) để kết hợp với sắt và chuyển đến màng tế bào. Lúc đỏ sẽ kết hợp tiếp với protein thụ thể (receptor-protein) để chuyển sắt vào trong tế bào, hoặc toàn bộ phức thể Sắt-siderophone được chuyển vào trong nhờ một protein vận chuyển ABC (ATP-binđing cassette transporter). Ở vi khuẩn E.coli thụ thể siđerophone nàm màng 45

ngoài (outer membrane), sau khi Fe3+ được chuyển đến khe chu chất (periplasmic space) thì với sự hỗ trợ cùa protein vận chuyển sắt sẽ được chuyển qua màng sinh chat (plasma membrane), sau đó Fe3+ sẽ được khử thành Fe2+. Vì sất rất cần cho quá trình sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật cho nên vi sinh vật cần sử dụng nhiều phưcmg thức hấp thu khác nhau để đáp ứng nhu cầu này.

46

Chương Ị4

SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT

Sinh trưởng là biểu thị sự tăng trưởng các thành phần cùa tế bào. Đối với các vi sinh vật có hình thức sinh sản bằng này chồi hay phân đôi thì sinh trường dẫn tới sự gia tăng số lượng tế bảo. Tế bào tăng trưởng đến một mức độ nhất định thì sẽ phân cất thành hai tế bào thế hệ con có kích thước hầu như bàng nhau. Đối với các vi sinh vật đa nhân thì sự phân cách nhân không đồng hành với sự phân cắt tế bào - sự sinh trưởng làm tăng kích thước tế bào mà không làm tăng số luợng tế bào. Vì vi sinh vật rất nhỏ bé cho nên là đối tượng rất không thuận tiện để nghiên cứu về sinh trưởng và phát triển. Chính vì vậy mà khi nghiên cứu về sinh trường, người ta thường xét đến sự biến đổi về số lượng của cả quần thể vi sinh vật. 14.1. ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG Sự sinh trưởng quần thể vi sinh vật được nghiên cứu bẳng cách phân tích đường cong sinh trưởng trong một môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo phương pháp nuôi cấy theo mẻ (batch culture) hoặc trong một hệ thống kín. Có nghĩa 1 I

Hình 14.1: Đường cong sinh trưởng trong hệ thong kín là vi sinh vật được (Theo sách cùa Prescott, Harley và Klein). nuôi cấy trong một thiết bị kín, trong quá trình nuôi cấy không thay đổi môi trường và thời gian nuôi cấy càng kéo dài thì nồng độ chẩt dinh dưỡng càng giảm sút, các chất phế thải của trao đổi chất càng 47

tãng lôn. Nếu lẩy thời gian nuôi cẩy là trục hoành và lây sô iogarit cùa sô lượng tê bào sống làm trục tung sẽ có thể vẽ được đường cong sinh trưởng của các ví sinh vật sinh sản bằng cách phân đôi. Đường cong này có 4 giai đoạn (phazs) khác nhau. 14.1.1. Giai đoạn Tiềm phát (Lag phaz) Khi cấy vi sinh vật vào một môi trưcmg mới số lượng thường không tăng lên ngay, đó là giai đoạn Tiềm phát hay pha Lag. Trong giai đoạn này tế bào chưa phân cắt nhưng thể tích và khối ỉượng tăng lên rõ rệt đo có sự íăng các thành phần mới của tế bào. Nguyên nhân là do tế bào ở trạng thái già, thiếu hụt ATP, các cofactor cần thiết và riboxom. Thành phần môi trường mới không giống môi trường cũ cho nên tế bào cần một thời gian nhất dịnh để tổng hợp các enzym mới nhằm sừ dụng được các chất dinh dưỡng mới. Các tế bào cũng có thể bị thương tổn và cần một thời gian để hồi phục. Bất kỳ vì nguyên nhân gì thì kết quả vẫn lả tể bào phải tự trang bị lại các thành phàn của mình, tái tạo ADN và bắt đầu tăng khổi lượng. Giai đoạn tiềm phát đài hay ngắn liên quan đển bản thân từng loại vi sinh vật và tính chất của môi trường. Nếu tỉnh chất hóa học của môi trường mới sai khác nhiều với môi trường cũ thỉ giai đoạn tiềm phát sẽ kéo dài. Ngược lại, nếu cấy từ giai đoạn logarit vào một môi trường có thành phần tương tự thì giai đoạn tiềm phát sẽ rút ngắn lại. Nếu cấy vi sinh vật từ giai đoạn tiềm phát hay từ giai đoạn tử vong thì giai đoạn tiềm phát sẽ kẻo dài. 14.1.2. Giai đoạn logarit (Log Phaz) hay Pha chỉ sổ (Exponential Phaz) Trong giai đoạn này vi sinh vật sinh trưởng và phân cắt với nhịp độ tối đa so với bàn tính di truyền của chúng nếu gặp môí trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp. Nhịp độ sinh trưởng của chúng là không thay đổi trong suốt giai đoạn này, các tế bào phân đôi một cách đều đặn. Do các tế bào sinh ra chỉ khác nhau rất ít cho nên đường cong sinh trưởng là một đường trơn nhẵn chứ không gấp khúc (kình 14.ỉ). Quần thể tế bào trong giai đoạn này có trạng thái hóa học và sinh lý học cơ bản là như nhau cho nên việc nuôi cấy ở giai đoạn này thường được sử dụng để nghiên cứu sinh hỏa học và sinh lý học vi sinh vật. Sinh trường logarit là sinh trưởng đồng đều, tức là các thành phần tế bào được tổng họp với tôc độ tương đôi ôn định. Nêu cân bằng dinh dưỡng hay các điều kiện môi trường thay đổi sẽ dẫn đến sự sinh trường không đồng đều. Sự sinh trường khi nhịp độ tổng hợp các thành phần của tế bào tương đổi biến hỏa sẽ biến đổi theo cho đến khi đạt tới một sự cân bằng mới. Phản ứng này rất dễ quan sát thấy khi làm thực nghiệm chuyển tế bào từ một môi trường nghèo dinh dưỡng sang một môi trường giàu hom. Tế bào trước hết phải tạo nên các riboxom mới cỏ thể nâng cao năng lực tổng hợp protein, sau đó là sự tăng cường tổng hợp protein và ADN. Cuối cùng tất yếu dẫn đến tốc độ phát triển nhanh chóng.

Lúc chuyển quần thể tế bào từ một môi trường giàu dinh dưỡng tới một môi trường nghèo thì cũng có kểt quả về sự sinh trưởng không đồng đều như vậy. Vi sinh vật trước đó có thể thu được từ môi trường nhiều thảnh phần của tế bào nhưng khi chuyển sang môi trường nghèo chúng cần có thời gian để tạo ra các enzym cần thiểt để sinh tổng hợp các thành phần không có sẵn trong môi trường. Sau đó tế bào mới có thể phân cat, ADN mới có thể tái tạo, nhưng việc tổng hợp protein và ARN là chậm cho nên tể bào nhỏ lại và tổ chức lại sự trao đổi chất của chúng cho đến khi chúng có thể sinh trưởng tiểp. Sau đó sự sinh trưởng càn bằng sẽ được hồi phục và trở về lại giai đoạn logarit. Các thí nghiệm trên đây cho thấy sự sinh trưởng cùa vi sinh vật được kiểm soát một cách chính xác, phổi hợp và phản ứng nhanh chóng với những sự biến đổi của môi trường. Khi sự sinh trưởng của vi sinh vật bị hạn chế bởi nồng độ thấp của các chất dinh dưỡng cần thiết thì sản lượng tế bảo cuối cùng sẽ tăng lên cùng với sự tăng lên cùa các chất dinh dưỡng bị hạn chế (hình Ỉ4.2Ò). Đây chính là cơ sở để sử dụng vi sinh vật trong việc định lượng vitamin vả các nhân tố sinh trưởng khác. Tốc độ sinh trưởng cũng tăng lền cùng với sự tăng nồng độ các chất dinh dưỡng (hình I4.2b). Hình dáng của đường cong hầu như phản ánh tốc độ hấp thu chất đinh dưỡng nhờ sự chuyển vận protein của vi sinh vật. Lúc nồng độ chẩt dinh dưỡng đủ cao thỉ hệ thống vận chuyển sẽ bão hòa và tốc độ sinh trưởng không tăng lên cùng với sự tăng lên cùa nồng độ chất dinh dưỡng.

(a )- Ảnh hưởng cùa sự hạn chế chất dinh dưỡng đối với sản ỉượng chung của vi sinh vật, Lúc nồng độ đủ cao thì sản lượng chung sẽ đạt tới ổn định. (b)- Ành hưởng của sự hạn chế chất dinh dưỡng tới tốc độ sinh trưởng.

49

14.1.3. Giai đoạn Ỏn định (Stationary Phaz) hay Pha Cân bằng °

Qua giai đoạn Logarìt sự sinh trưởng của quần thể cuối cùng sẽ đừng lại, đường cong sinh trưởng đi ngang (hình ỉ 4. Ị). Nồng độ vi khuẩn trong giai đoạn ôn định thường vào khoảng 109/ml. Với các vi sinh vật khác thuờng không đạt được đến nồng độ này. Với động vật nguyên sinh và vì tảo thường chi đạt đến nồng độ 106/ml. Đương nhiên, sô lượng tế bào cuối cùng quyết định bởi ảnh hưởng chung của điều kiện dinh đưỡng, chủng loại vi sinh vật và các nhân tố khác. Trong giai đoạn này số lượng tế bào sống là không thay đổi, có thể do số lượng tế bào mới sinh ra cân bằng với số lượng tế bào chết đi, hoặc là tể bào ngừng phân cắt mà vẫn giữ nguyên hoạt tính trao đổi chất. Cỏ nhiều nguyên nhân làm cho quần thể vi sinh vật chuyển sang giai đoạn ổn định. Trong đó nguyên nhân chủ yếu là sự hạn chế của chất dinh dưỡng. Nếu một chất dinh dưỡng thiết yếu bị thiếu hụt nghiêm trọng thì sự sinh trưởng sẽ chậm lại. Vi sinh vật hiếu khí thường bị hạn chế bởi nồng độ oxy. Oxy thường hòa tan ít trong nước, O 2 trong nội bộ môi trường rẩt nhanh chóng bị tiêu thụ hết, chỉ có các vi sinh vật sinh trưởng ở bề mặt môi trường mới có đù nồng độ O 2 để sinh trường. Vỉ vậy khi nuôi cấy vi sinh vật phải sử dụng tới máy lắc hay các biện pháp thông khí khác. Quần thể vi sinh vật cũng có thể bị đình chỉ sinh trưởng khi gặp sự tích lũy của các sản phẩm trao đổi chất có hại. Một số vi sinh vật kỵ khí (như Streptococcus) có thể lên men đường làm sản sinh một lượng lớn axit lactic hay các axit hữu cơ khác, làm axit hỏa môi trường và ức che sự sinh trưởng của vi sinh vật. Đồng thời sự tiêu hao hết đường cũng làm cho tể bào đi vào giai đoạn ổn định. Sau nữa là, một số chửng cứ cho thấy khi số lượng vi sinh vật đạt đến một giới hạn nhất định thì sự sinh trưởng có thể bị đình chỉ. Sự sinh trưởng của vi sinh vật chuyển sang giai đoạn ổn định có thể do kết quả chung của rẩt nhiều nhân tố khác nhau. Như chúng ta.đã thấy vi khuẩn khi nuôi cấy theo mẻ sẽ chuyển sang giai đoạn ổn định khi thiếu thức ăn. Trong tự nhiên, đo nhiều môi trường có nồng độ chất dinh dưỡng rất thấp nên vi sinh vật thường chuyển sang giai đoạn ổn định. Đổí với vi khuẩn việc chuyển sang giai đoạn ổn định có thể là một loại thích ứng tốt. Nhiều loại vi khuẩn không có sự biến hóa rõ rệt về hình thái (như hình thành bào tử nội sinh-endospore) nhưng chúng có thể thu nhỏ kích thước lại, thường đo chất nguyên sinh co lại và nhân giả (nucleoid) đậm đặc lại. Một biến đổi quan trọng hơn là, khi thiếu thức ăn vi khuẩn sẽ sinh ra một loại protein đoi (starvation proteins) lam cho te bào đê kháng nhiêu hơn với các thương tổn bàng nhiều con đường khác nhau. Chúng làm tãng các liên kểt peptidoglycan và sự bền vừng của thành tế bào. Chẩng hạn Dps (ADN-binding protein from starved cells), một ỉoại protein kết hợp với ADN lấy từ các tế bào đói, có thể bảo vệ cho ADN. Phân tử Chaperon cản trở sự biến tính của protein và hồi phục lại được các protein bị tổn thương. Vì những 50

việc đó và nhiều cơ chế khác mà các tế bào đói có thể khó bị chết đi và đề kháng được với tình trạng bị đói, với sự biến hỏa của nhiệt độ, sự tổn thương về oxy hỏa và sự thẩm thấu, cũng như tăng sức đề kháng với các hóa chất có hại (như clorit chẳng hạn). Những cải biến này rất có hiệu quà và làm cho một số vi khuẩn có thế sống lại sau vài năm bị đói. Rõ ràng việc hiểu rò những vấn đề này sẽ có tầm quan trọng thực tiễn to lớn đổi với y học và vi sinh vật học công nghiệp. Chúng còn có thể chứng minh vi khuẩn thương hàn (Salmonella typhimurỉum) và nhiều vi khuẩn gây bệnh khác cỏ thể có khả năng gây bệnh mạnh hơn khi bị đói. 14.1.4. Giai đoạn tử vong (Death Phaz) Việc tiêu hao chất dinh dưỡng và việc tích lũy các chất thài độc hại sẽ làm tổn thất đen môi trường sống cùa vi sinh vật, làm cho số lượng tế bào sống giảm xuống. Đó là đặc điểm của giai đoạn tử vong. Giống như giai đoạn logarit, sự tử vong của quần thể vi sinh vật cũng cỏ tính logarit (tỷ lệ tế bào chết trong mỗi giờ là không đổi). Tồng số tế bào sống và tế bào chết không thay đổi vì các tế bảo chết chưa bị phân hủy. Muốn xác định số lượng tế bào sống phải pha loãng ra rồi cay lẽn thạch đĩa và đưa vào điều kiện thích hợp để xác định số khuẩn lạc xuất hiện. Mặc dầu phần lớn vi sinh vật tử vong theo phương thức logarit nhưng sau khi số luợng tế bào đột nhiên giảm xuống thì tốc độ chết của tế bào chậm lại. Đỏ là do một số cá thể sống lại nhờ có tính đề kháng đặc biệt mạnh. Vì điều này và nhĩmg nguyên nhân khác làm cho đường cong của giai đoạn tử vong có thể khá phức tạp. 14.1.5. Tính toản về quá trình sinh trưởng Không ít các nhà vi sinh vật học đã tính toán về tốc độ sinh truờng của vi sinh vật ừong giai đoạn logarit. Tịnh toán nhịp độ sinh trưởng sẽ làm cơ sở cho các nghiên cứu về sinh lý học, sinh thải học vi sinh vật, và còn để giải quyết một số vấn đề ứng dụng trong sản xuất công nghiệp. Trong giai đoạn logarit mỗi cá thể vi sinh vật tiến hành phân cắt trong một thời gian hằng định, sổ lượng tế bào tăng theo phương thức 2n. Thời gian giữa hai lần phân chia liên tiếp hay thời gian cần cho sự tăng đôi sổ tế bào được gọi là thời Igian thế hệ (genration time hay doubling time). Ví dụ đưa một tế bào vào môi trường nuôi cấy, cứ 20 phút phân cát một lần thì sau 20 phút cỏ 2 tế bào, sau 40 phút có 4 tế bào và tiểp tục như vậy (bảng Ĩ4.Ị).

51

Thòi gian*

Số lần phân cắt

2"

số lượng (No X2")

IglD N,

0

0

2°-ỉ

1

0,000

20

1

2'=2

2

0,301

40

2

23=4

4

0,602

60

3

23-8

8

0,903

80

4

t* II Ch

16

1,204

100

5

25=32

32

1,505

120

6

K)oII

Bảng 14.1: Một ví dụ về sinh trưởng theo logarỉt

64

1,806

* Thời gian thế hệ là 20 phút, giả thiết là nuôi cấy từ ỉ tế bào Số lượng logarit tế bào là 2n, n là số thế hệ. Có thể biểu thị các số liệu trong bảng ỉ 4.1 bàng công thức sau đây: N, = N 0 X 2"

Trong đó: No là số lượng tế bào ban đầu; Nt là số lượng tế bào ở thời gian t; n là số thế hệ. Từ công thức trên có thể biến đổi như sau và số thế hệ n được tính bằng logarit thập phân: log

= log Nữ+n log 2

n - ĨQg Nĩ - Ịọg log 2

_ log

- ĩog N n 0,301

Khi nuôi cây phân mẻ (batch culture) tôc độ sinh trưởng trong giai đoạn logarit có thể biểu thị băng hảng sổ tổc độ sinh trưởng bình quân k (mean growth rat constant k). Đó là sô thế hệ sinh ra trong đơn vị thời gian, thường biểu thị băng số thế hệ trong 1 giờ: h _n t

log#, - logjyn 0,301 t

Thơi gian cân thiêt đê tăng gâp đôi tông sô tế bảo là thời gian thế hệbình quân (mean genration time) hay thời gian tãng gâp đôí bình quân(meandoubling time) và được biểu thị bằng g. Nếu t=g thì N,= 2N0. Thay vào công thức ữên ta có: k _ log (2N ồ) - log N0 0>30l£

52

lo g

2 + log Nữ - log Nn 0,301 g

1

Thời gian thể hệ bình quân là đảo sổ của hàng số tốc độ sinh trưởng bình quân: g

_Ị_

k

Thời gian thể hệ bình quân g có thể căn cứ trực tiếp vào đồ thị bán logarit (semilogarithmic plot) và hàng số tốc độ sinh truởng để tính ra (hình 14.4). Ví dụ ,số lượng vi khuẩn tại giờ thử 10 là từ 103 tăng lên đến 109 t h ì : k=

Log 10ọ - loglO3 (0,301)(10h)

_ 9 -3 3.01/1

= 2.0 (thế hệ/h)

g = — = 0.5 giờ/thế hệ hay 30 phút/thế hệ

(Theo sách của Prescott,Harley và Klein).

trưởng cùa vi sinh vật Lắỹ thời gian là trục hoành và lay so lượng tế bào làm trục tung. Thời gian tăng gấp đôi số lượng của quần thế (thời gian thế hệ) cỏ thể đọc trực tiếp trên đồ thị.

Thời gian thế hệ thay đổi tùy theo chủng loại vi sinh vật, điều kiện nuôi cấy. Một số vi khuẩn thời gian thế hệ không quá 10 phút (0,17h) trong khi ờ một sổ vi sinh vật nhân thực (eucaryotic) lại dài tới vài ngày (Bảng 14.2). Thời gian thế hệ trong tự nhiên thường là dài hơn so với khi nuôi cay.

53

Bảng 14.2: Thời gian thể hệ của một số loài vi sinh vật Vi sinh vật

Nhiệt độ (°C)

Thòi gian thế hệ (giờ)

Vi khuẩn và Vi khuẩn lam Beneckea natriegens

37

0,16

Escherichia coỉi

40

0,35

Bacillus subíỉlis

40

0,43

Staphylococcus aureus

37

0,47

Pseudomonas aeruginossa

37

0,58

Clostridium botuỉinum

37

0,58

Rhodospiriỉỉum rubrum

25

4,6-5,3

Anabaena cylindrica

25

10,6

Mycobacterium tuberculosis

37

Khoảng 12

Treponema paìỉidum

37

33

Tảo Scenedesmus quadricauda

25

5,9

Clolìa pyrenoidosa

25

7,75

Asterioneỉỉa formosa

20

9,6

Euglena gracilis

25

10,9

Ceratỉum tripos

20

82,8

Động vật nguyên sinh Tetrahymena geỉeiỉ

24

2,2-4,2

Leishmania donovani

26

10-12

Paramecium caudatum

26

10,4

Acanthamoeba castellaniì

30

11-12

Giardia lambỉia

37

18

Nấm Saccharomyces cerevisiae

30

2

Monilinia Jructicola

25

30

14.2. XÁC ĐỊNH s ự SINH TRƯỞNG CÙA VI SINH VẬT Có nhiêu cách thông qua việc xác định sự biến đổi số lượng và chất lượng vi sinh vật đe hieu được sự sinh trưởng của vi sinh vật, biêt được tốc độ sinh trưởng vả thời gian thế hẹ, Dươi đây sẽ giới thiệu các phương pháp thường dùng nhất cùng các ưu, khuyết điểm

cùa các phương pháp này. Không có phương pháp nào là tốt nhất, lựa chọn phương pháp nào còn phụ thuộc vào từng trường hợp cụ thể. 14.2.1. Xác định số lượng tế bào Phương pháp đơn giản nhát đê xác định số lượng tế bào là đếm trực tiếp dưới

.Lá kính

kính hiển vi. Dùng các phòng đếm để đếm vừa nhanh chóng, dễ dàng, lại rẻ tiền nhất, lại có thể quan sát thấy kích cõ và hình dáng tế bào. Thường dùng phòng đếm

Phòng đếrti chúa vi khuân

í*)

Petroff-Hausser để đếm tế bào động vật nguyên sinh. Dùng phòng đếm hồng càu cỏ thể đếm được các tế bảo nhân nguyên thủy cũng như tế bào nhân thật. Với tế bào nhân nguyên thủy cần nhuộm màu hoặc là dùng kỉnh hiển vi tương phản pha hay kính hiển vi

huỳnh

quang

(phaz-constrast

or

fluoresence microscope) để dễ quan sát hơn. Phòng đếm có cấu trúc để có một độ sâu nhất định lại có chia ra thành các ô nhỏ {hình ỉ 4.5). Khi đếm số lượng ta đưa dịch -

pha loãng vào phòng đếm, đậy lá kính i

(lamelle/ cover glass) lên trên, sau đó tiến hành đếm số lượng dưới kính hiển vi.

' “T sss Bpn —

1*

1

"T &

m

1 9Hầ

Khuyết điểm của phương pháp này là không xác định được với các mẫu có sổ lượng vi khuẩn quá nhỏ, độ chính xác cũng không cao vì không phân biệt được giữa tế bào sống và tế bảo chết.

í

r? pn n | “ j m u _L„ Mi mSỀ

r

imm

•

ỉ

1 -

1

ị

-

¥^ 1

•4

*

J_ Tj “tr 'i.

m WÊếm H* m a Ỉ1R I m rr ư u rr~ H ỉ 0 H Ị ị * T ị LillJ I ___ __i_>_ *1 '

Hình 14.5: Phòng đếm Petrojf-Hauser: (a)- Mặt nhìn nghiêng cùa phòng đếm- Phòng đếm chứa dịch huyền phù vi khuẩn là khoáng không gian bẽn dưới lá kính; (b)- Giữa phiển kính có phòng đếm với các ô nhò; (c) Ờ độ phóng đại khoảng X 400-500 tiến hành đém số htợvg vì khuân trong các ô nhỏ. Lay sô lượng bình quân để tinh ra mật độ vi khuân trong mâu vật. Trong phợm vi ỉmm có 225 ô nhỏ, do đó so lượng vi kỉiuấn 55

trên ỉmm2 lử (số vi khuẩn/mm) X 25; V ỉ' phòng đếm có chiều dầy là ọ,02mm cỉo đó nồng độ vi khuân trong phòng đếm là: (số vi khuàn)/m■X 25 (tông số ô nhò) X 50= sú vỉ khuân/mm3. Vi ỉ cm 3= l m m 3 X 103cho nên giả thử sổ lượng vi khuẩn bình quân trong mỗi ô nhỏ là 28 thì trong 1 cm 3 có nồng độ vi khuẩn là 28 X 25 X 50 x io 3— 3,5 X 107vi khuân. Nhân với độ pha loãng

ban đầu (nếu có) sẽ biết được nồng độ vi khuẳn trong mẫu kiểm tra. Với động vật nguyên sinh, vi tảo và nấm men có thể đùng máy đếm điện tử như loại máy Coulter Counter để xác định số lượng. Nguyên lý là hai bên mỗi lỗ nhỏ có điện cực và nối điện. Khi tế bào trong dịch huyền phù đi qua lỗ nhỏ thì cứ mỗi tế bào đi qua thì điện trở lại tăng lên (hoặc tính dẫn điện giảm xuống) và sinh ra một tín hiệu điện, máy đếm sẽ tự động ghi số. Kểt quả xác định của loại máy này khá chính xác, có thể ứng dụng rộng rãi để xác định số lượng hồng càu và bạch cầu, nhưng phương pháp này không thích hợp xác định số lượng vi khuẩn vì dễ bị can thiệp bởi các hạí nhỏ và các vật chất dạng sợi trong mẫu vật. Cả hai phương pháp nói trên đều không phân biệt được tể bào sống và tế bào chết. Đê xác định số lượng tể bào sống người ta thường dùng phương pháp cấy dịch pha loãng lên bề mặt môi trường thạch đĩa. Sau khi nuôi cấy mỗi vi khuẩn sẽ tạo thành 1 khuẩn lạc. Ví dụ ở độ pha loãng 1 X 10-6 đếm được 150 khuẩn lạc thì cỏ nghĩa là mật độ vi khuẩn trong mẫu là 1,5 X 108. Dùng dụng cụ đếm khuẩn lạc càng thêm thuận tiện. Phưcmg pháp này cho biết số lượng các tế bào sổng của vi sinh vật. Phương pháp này đơn giản, nhạy cảm và thích hợp ứng dụng rộng râi để xác định số lượng vi sinh vật sống khi phân tích các mẫu thực phẩm, nước, đất...Tuy nhiên kết quả cũng chịu ảnh hưởng của một sổ nhân tố. Nếu vi khuẩn dính thành khối không tách rời nhau ra thì kểt quả thu được là thẩp hơn thực tế, vì mỗi khuẩn lạc không phát triển từ một tế bào riêng rẽ. Vì vậy kết quả thu được từ phương pháp này được coi là sô đơn vị hình thanh khuẩn lạc (CFU-colony forming unit). CFƯ không hoàn toàn phù hợp với sô tê bào song trong mẫu vật. Trong quá trinh sử dụng phương pháp này nên sủ đụng độ pha loãng nào cho sô khuân lạc xuất hiện trên đĩa chỉ nằm trong phạm vi khoảng 30-300 mà thôi. Đương nhiên môi trường dinh dưỡng không thể đáp ứng chung cho mọi loại vi sinh vật, do đó kêt quả thu được bao giờ cũng thẩp hom thực tế. Khi trộn thạch VỚI dịch pha loãng thì thạch đã đủ nguội để không làm chết vi khuẩn hay làm thương tôn VỚI một sô loại mân cảm với nhiệt độ. Việc cấy dịch pha loãng trên bề mặt rồi dàn đều bang que gạt thuy tinh thường cho kêt quả cao hơn vê sô lượng vi sinh vật so với phương pháp trộn với môi trường thạch chưa đông.

Hình 14.6: Tách khuẩn lọc và phương pháp kiểm tra số lượng vi sinh vật thông qua đếm khuẩn ỉạc mọc trên mỏi trường thạch đĩa. (a (b)- Cách ria cạy đe tách khuẩn lạc riêng rẽ (không dùng để đếm sổ lượng) (c)(d)~ Cách pha loãng rồi trộn với mỏi tricờng thạch chưa đông. (e)(f)- Cách dàn dịch pha hãng bằng que gọt trên mật (hạch (cho sổ htựng khuẩn lạc nhiều hơn). Theo sách của K.P. Talơro,2005. Đe xác định sổ hrợng vi sinh vật còn có thể nuôi cấy giấy lọc đã lọc dịch pha loăng mẫu vật. Phương pháp này gọi là phương pháp màng lọc (membrane filter). Dùng một thiết bị lọc đậc biệt đặt vừa một giấy lọc hình tròn có các lỗ nhỏ hơn kích thước vi khuẩn và các vi sinh vật khác. Sau khi lọc đặt giấy lọc lên môi trường thạch thích hợp hoặc thấm ướt màng lọc băng dịch môi trường thích họp rồi để nuôi cấy 24 giờ. Đếm sổ khuần lạc mọc ưên giấy ìọc để tính ra mật độ vi khuẩn sổng có mặt trong mẫu vật (hình 14.7).

57

úynùị \

■

lọc ravẲ ÍỊÍ Ỹằữ ÍÍI c k íi

Hiôitiròng Đ ịittá n ịlọ c v ù

thiết ỵ lọc

/

Dịch r a il v ít b c qua

nuôi u y

(ÌÚđlltOỊI.

|* * & 2 > ì «à«lọc(0.45(il)

\ 'ì Hình 14.7: Phương pháp ỉọc màng để xác định sổ lượng vi sinh vật Phương pháp này thích hợp để sử dụng phân tích vi sinh vật trong nước. Có thể dùng các môi trường khác nhau thích hợp với các nhóm vi sinh vật khác nhau (hình ỉ 4.8).

U)

fl>)

(e)

(dì

Hỉnh Ị 4.8: Các loợi khuẩn ỉạc mọc trên màng lọc. Theo sách cùa Prescott,Harley và Klein (2005) (a)~ Tồng sể vi khuẩn mọc trên môi trường tiêu chuẩn, dùng chi thị màu để nhuộm đỏ khuẩn lạc cho dè điềm; (b)- Dụng môi trưởng thích hợp để kiểm tra nhóm vi khuẩn coliform có nguồn gốc từ phân (khuẩn ỉợc bắt màu xanh); (c)~ Dũng mói trường thạch m-Endo đế xác định vi khuẩn E.coỉi và các Coli/orm kháckhuẩn ỉạc cô màu lục; (á)- Nắm sợi và nẩm men mọc trên môi trường Thạch - Mạch nha. Phương pháp màrtg lọc còn dùng để đếm trực tiếp vi khuẩn. Dịch mẫu vật được lọc qua một màng polycacbonat màu đen. Vi khuẩn trên màng lọc được nhuộm màu huỳnh quang băng thuoc nhuộm acridin da cam hoặc DAPI (diamidino-2-phenylindole). Quan sát dưới kính hiên vi huỳnh quang có thể thẩy các tế bào vi sinh vật hiện lên màu da cam hay

58

màu lục trên một nền đen. Hiện đã có những kit thương mại cho phép phân biệt tể bào sống và tế bào chết khi kiểm tra. 14.2.2. Xác định khốỉ lượng tế bào Sự sinh trưởng của vi sinh vật không chỉ biểu hiện ở số lượng tể bào mà còn ờ cà sự tăng trưởng của tổng khối lượng tế bào. Phương pháp trực tiếp nhất là xác định trọng lượng khô của tể bào. Trước hết cần ly tâm để thu nhận sinh khối tể bào. Sau đó rừa tế bào rồi làm khô trong lò sấy rồi cân trọng lượng khô. Phương pháp này thích hợp để xác định sự sinh trường của nấm. Phương pháp này tốn thời gian và không thật mẫn câm. Đổi với vi khuẩn vì trọng lượng từng cá thể là rất nhỏ, thậm chí phải ly tâm tới vài trăm ml mới đù số lượng để xác định ừọng lượng sinh khối khô. Thang chĩa độ cùa quang phổ kế

U

p ỉ í

Đèo

ij

ống đựng địch huyền phù vi khuẩn

Tế tào quang điện hay bộ tách sóng

Hình Ỉ4.9: Đo sổ ỉượng vi sinh vợt bằng phương pháp đo độ đục. Phương pháp nhanh hơn, mẫn cảm hem là dùng phương pháp đo độ đục nhờ tán xạ ánh sáng. Mức độ tán xạ ảnh sáng tỷ lệ thuận với nồng độ tế bào. Lúc nồng độ vi khuẩn đạt đến 107 tế bào/ml thi địch nuôi cẩy sẽ vẩn đục, nồng độ càng tăng thì độ đục cùng tãng theo và làm cản trở ánh sáng đi qua địch nuôi. Có thể đo độ tán xạ ánh sáng bằng quang phổ kế (spectrophotometer). Ở một mức độ hấp thụ ánh sáng thẩp, giữa nồng độ tế bào và 59

giá trị hấp thụ ánh sáng có quan hệ tuyến tính {hình Ỉ4.9). Chi cần nồng độ vị sinh vật đạt tới nồng độ có thể đo được là đều có thể dùng phương pháp đo độ đục trên quang phô kê để xác định sự sinh trưởng của vi sinh vật. Nếu hàm lượng một số vật chất trong mỗi tể bào là giống nhau thì tổng lượng chất đó trong tế bào có tương quan trực tiêp với tông sinh khối vi sinh vật. Chẳng hạn, thu tế bào trong một thể tích nhất định của dịch nuôi cấy, rửa sạch đi rồi đo tổng lượng protein hay tổng lượng nitơ, có thể thấy sự tăng quần thể vi sinh vật là phù hợp với sự tăng tổng lượng protein (hay N). Cũng tương tự như vậy, việc xác định tổng lượng chlorophyl có thể dùng để đo sinh khối tảo; đo hàm lượng ATP có thể biết được sinh khối của các vi sinh vật sống. Thông qua việc đo độ hấp thụ ánh sáng có thể xác định được sinh khối vi sinh vật. Khí số luợng tế bào tăng lên sẽ dẫn đến việc tăng độ đục, mức độ tán xạ ánh sáng nhiều hơn và quang phổ kế sẽ đo được mức độ tăng lên của trị số hấp thụ ánh sáng. Trên quang phổ kế có hai thang chia độ: phía dưới là trị số hấp thụ ánh sáng, phía trên là mức độ thấu quang. Khi trị số hấp thụ ánh sáng tăng lên thì mức độ thấu quang hạ xuống. 14.3. NUÔI CÁY LIÊN TỤC VI SINH VẶT Trong các phần trên chúng ta xem xét việc nuôi cấy phân mẻ (batch cultures) trong các hệ thống kín, tức là không có chuyện bổ sung chất dinh dường, cũng không thải loại các sản phẩm có hại sinh ra trong quá trình sổng. Giai đoạn logarit chỉ duy trì qua vài thế hệ sau đó chuyển vào giai đoạn ổn định. Nếu nuôi cấy vi sinh vật trong một hệ thống hở, trong quá trình nuôi cấy thường xuyên bổ sung chất dinh dưỡng và thải loại các chất cặn bã thì có thể làm cho môi trường luôn giữ ả trạng thái ổn định. Đó là hệ thống nuôi cấy liên tục (continuous culture system). Trong hệ thống này sự sinh trưởng của vi sinh vật luôn giữ được ờ ừạng thái logarit, nồng độ sinh khối vi sinh vật luôn giữ được ồn định trong một thời gian tương đối dài. Giả thử ta có một bình nuôi cấy trong đó ví khuẩn đang sinh trường, phát triển. Ta cho chảy liên tục vào bình một môi trường mới có thành phần không thay đổi. Thể tích bình nuôi cây giữ ôn định. Dòng môi trường đi vào bù đáp cho dòng môi trường đi ra với cùng một tốc độ. Ta gọi thể tích của bình là V (lit), tốc độ dòng môi trường đi vào là f (lít/ giờ). Tốc độ (hay hệ số) pha loãng được gọi là D (f/v). Đại lượng D biểu thị sự thay đổi thể tích sau 1 giờ. Nêu vi khuân không sinh trưởng và phát triển thì chủng sẽ bị rút dàn ra khỏi bình nuôi cấy theo tốc độ: v = — = D .ỵ dt X là sinh khối tế bào. Người ta thường dùng hai loại thiết bị để nuôi cấy liên tục vi sinh vât. Đó là Chemostat và Turbiđostat.

60

14.3.1. Chem ostat Khi sử dụng Chemostat để nuôi cấy vi sinh vật người ta đưa môi trường vô khuẩn vào bình nuôi cấy với lượng tương đương với tốc độ đưa môi trường chửa vi khuẩn ra khỏi bỉnh nuôi cấy (xem hình Ì4.Ỉ0). Trong môi trưcmg một số chất dinh dường thiết yếu (như một vải axit amin ) cần khống chế nồng độ trong một phạm vi nhẩt định. Vì vậy tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật trong hệ thống quyết định bởi tốc độ môi trường mới được đưa vào hệ thống và nồng độ tế bào phụ thuộc vào nồng độ các chất dinh dưỡng được hạn chế. Nhịp độ đổi mới chất đinh dường biểu thị bởi nhịp độ pha loãng D (dilution rat). Tốc độ ỉưu thông của chất dinh dưỡng (ml/h) được biểu thị bằng/và thể tích bình nuôi cẩy là V (ml): D ^ f/V

.

Chẳng hạn n ế u /là 30ml/h và V là 100ml thì nhịp độ pha loãng D là 0,30h‘l. Cà số lượng vi sinh vật và thời gian thế hệ đều có liên quan đến nhịp độ pha loãng {hình Ị 4. ỉ ỉ). Trong một phạm vi nhịp độ pha loãng tương đối rộng thì mật độ vi sinh vật trong hệ thống là không thay đổi.. Khi nhịp độ pha loãng tăng lên, thời gian thế hệ hạ xuống (tốc độ sinh trưởng tăng lên), khi đó chất dinh dưỡng hạn chế bị tiêu hao hết. Neu nhịp độ pha loãng quá cao thì vi sinh vật bị loại ra khỏi bỉnh nuôi cấy trước khi kịp sinh sôi nẩy nở bởi vì lúc đó nhịp độ pha loăng cao hơn tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật. Nồng độ các chất dinh dường hạn chế tăng lên khi nhịp độ pha loãng tăng cao vì có ít vi sinh vật sử dụng chúng. Turbidoslal

Chemastat

■ "à Dụng cụ lọc

.Dõng mùi Iruủng vàõdữlỂ bảo quangđiện

Môi trường mớì

điều chình Ĩ T Ĩ I — Bình mỏi trucng

V an kiểm soát

Không khi vầo

==53------.. y Bỏ phận điều chinh 11 ' dòng mõi trường vào Không khí váo

Cụng cấp khí Cấu tạo íúl ách vi khuẩn

Không khi ra

Bĩnh nuôi

*■ iVlôi

trưđíig ra

-

\J X » —

n , I

■

Binh nuôi cáy

—

U j Té bão ] quang diện l__Biểu l __ Oil chinh -

Hình 14.10: Nuôi cấy Hên tục trong Chemostal và Turbidostat.

—

Bình tiếp n h ậ n !

Hình ỉ 4.1 ì: Hệ thống nuôi cấy liền tục (Chemostat).

61

Khi nhịp độ pha loãng rất thấp thì nếu tăng nhịp độ pha loãng sẽ làm cho cả mật độ tế bào và tốc độ sinh trưởng đều tăng lên. Đó là do hiệu ứng của nồng độ chất dinh đường đối với nhịp độ sinh trưởng (growth rat). Quan hệ này có ỉúc được gọi là quan hệ Monod (Monod relationship). Trong điều kiện nhịp độ pha loãng thấp , chỉ có ít ỏi chất dinh dưỡng được cung cấp thì tế bào phải đùng phần lớn năng lượng để duy tri sự sống chứ không dùng để sinh trường, phát triển. Lúc nhịp độ pha loãng tăng lên, chất dinh dưỡng tăng lên, tế bào có nhiều năng lượng được cung cấp, không những để duy trì sự sống mà còn có thể dùng để sinh trưởng, phát triển, làm tăng cao mật độ tể bào. Nói cách khác, khi tế bào có thể sử đụng nãng lượng vượt quá năng lượng duy trì (maintenance energy) thì nhịp độ sinh trưởng sẽ bát đầu tăng lên.

Nhịp độ pha loãng

Hình 14. Ị2: Tỳ lệ pha ỉoàng trong chemostat và sinh trưởng cùa Vỉ' sinh vật. 14.3.2. Turbỉdostat Turbidostat là loại hệ thống nuôi cấy liên tục thứ hai. Thông qua tế bào quang điện (photocell) để đo độ hấp thụ ảnh sáng hay độ đục trong bình nuôi cấy để tự động điểu chỉnh lưu lượng môi trường dinh dưỡng, làm cho độ đục hay mật độ tế bào giữ ở mức độ như dự kiến. Turbỉdostat và Chemostat có nhiều điểm khác nhau. Trong hệ thống Turbidostat môi trường không chửa các chất dinh dưỡng hạn chế, nhịp độ pha loãng không cổ định. Turbidostat hoạt động tổt nhất khi nhịp độ pha loẫng cao trong khi Chemostat lại ổn định nhất và hiệu quả nhất khi nhịp độ pha loãng tương đối thấp.

Hệ thống nuôi cấy liên tục là rất có lợi vi các tế bào luôn ở trạng thái sinh trưởng thuộc giai đoạn logarit. Hơn nữa có thể dùng làm mô hình để nghiên cứu sự sinh trưởng của vi sinh vật trong điều kiện nồng độ chất dinh dưỡng thấp tương tự như ở môi trường tự nhiên. Hệ thống nuôi cấy liên tục rất cỏ ích trong việc nghiên cứu nhiều ITnh vực khác. Chẳng hạn, để nghiên cứu tác dụng tương hồ giữa các loài vi sinh vật trong điều kiện môi trường tương tự như môi trường nước ao hồ nước ngọt. Hệ thống nuôi cấy liên tục đă được sử dụng trong các ngành vi sinh vật học công nghiệp và thực phẩm. 14.4. ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC NHÂN TỚ MỒI TRƯỜNG ĐÉN s ự SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẶT Như chúng ta đã biết ví sinh vật có khả năng đáp ứng với sự biến hóa của nồng độ chất dinh dưỡng, nhất là các chất dinh dư&ng hạn chế. Sự sinh trưởng của vi sinh vật chịu ảnh hưởng rẩt lớn đối với các nhân tố vật lý, hỏa học cùa môi trường sổng. Hiểu biết về ảnh hưởng của các nhân tố môi trường đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật giúp ích rất nhiều cho việc khổng chế vi sinh vật cũng như đổi với việc nghiên cứu sự phân bố sinh thái của vi sinh vật. Đáng chú ý là một số vi sinh vật có thể sống được trong những điều kiện cực đoan (extreme) và khó sống (inhospitable). Các vi sinh vật nhân nguyên thủy (Procaryotes) có thể sinh tồn tại ở mọi nợi có thể sinh sổng. Nhiều nơi các vi sinh vật khác không thể tồn tại được nhưng vi sinh vật nhân nguyên thủy vẫn có thể sinh truờng rất tốt. Chẳng hạn vi khuẩn Bacillus infernus có thể sống ở độ sâu 1,5 dặm dưới mặt đất, nơi không có ôxy và cỏ nhiệt độ cao đến 60°c. Những vi sinh vật có thể sinh trưởng được trong những hoàn cảnh hà khắc như vậy được gọi là các vi sinh vật ưa cực đoan. Trong phần này chúng ta sẽ xem xét ảnh hưởng của một số nhân tô chủ yếu của môi trường đổi với sự sinh trưởng của vi sinh vật {bảng ỉ 4.3). Bảng 14.3: Phản ứng cửa vi sinh vật với các nhân tố môi trường Thuậỉ ngữ

Vi sinh vật ưa áp (Osmotolerant)

Vi sink vậí ưa mạn ịtìaỉophiỉe)

Ưa axit (Axitophỉle) .

Định nghĩa Hoạt tính cùa nưởc và dung chất Có thể sinh trưởng trong một phạm vi rộng về hoạt tính cùa nước và nồng độ thẩm thấu. Cần sinh trường ở nồng độ NaCl cao, thưcmg là từ 0,2 mol/L trở lên. pH Sinh trường tốt nhất trong phạm vi pH 0-5,5

Vỉ sinh vật đại diện

Staphylococcus aureus, Saccharomyces

Haỉobacterium,Dunalielỉa, Ectothỉorhodospira

Sulfolobus.Picrofilus, Ferroplasma, Aconíium, Cyaniảum caldarium. 63

Thuật ngữ

Định nghía

Vi sinh vật dại điện

ưa trung tính (Neutrophile)

Sinh trưởng tốt nhất trong phạm vi pH 5,5- 8,0

Escherichia, Eugỉenu, Paramecium

ưa kiềm(Alkalophile)

Sinh trường tốt nhất trong phạm vi pH 8,5-11,5

Bacillus aỉcalophỉỉits, Naironobacterium

Nhiệt độ Sinh trưởng tốt nhất ờ 15°c hay thấp hơn.

Bacillus psychrophỉỉus, CMamydomonas nivalis

ưa ìạnhịPsychrophyỉe) Chịu ỉạnhịPsychrotroph)

Có thể sinh trưởng ở 0-7°C nhưng sinh trường tốt nhất ở 20-30°c, còn có thê sinh trường được ờ khoảng 35°c

Listeria monocytogens, Pseudomonas fluorescens

ưa ấm(Mesophile)

Sinh trường tốt nhất ờ 2545 c.

Escherichia coỉi, Neisseria, Gonorrhoeae, Trichomona vaginalis.

ưa nhiệt(Thermophiìe)

Có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 55°c hoặc cao hcm, nhiệt độ thích hợp nhất thường là giữa 55 và 65°c

ưa nhiệt cao (Hyperthermophile)

Thích hợp phát triển ở nhiệt độ giữa 80 và khoảng 113°c

Bacillus stearothermophilus, Thermus aquaticus, Cyanidium caldarium, Chaetomium thermophile Sitlfolobus. Pyrodictium, Pyrococcus,

Nồng độ Ôxy Hiểu khí bắt buộc (Obligate aerobe)

Hoàn toàn dựa vào 0 2 của không khỉ để sinh trưởng

Micrococcus luteus, Pseudomonas, Mycobacteriun, phần lớn Tào, Nấm và ĐV nguyền sinh

Kỵ khỉ không bất buộc (Facultative anaerobej

Không cần 0 2 để sinh trưởng nhưng sinh trưởng tôt hơn khi có mặt 0 2

Escherrichia, Enterococcus, Saccharomyces cerevìsiae

Kỵ khí chịu Oxy (Aetoỉerant anaerobe)

Sinh trưởng như nhau khi có mặt hay không có ôxy

Streptococcus pyogens

Kỵ khỉ bẳt buộc (Obligate anaerobe)

Bị chết khi có mật O'!

Vi hiểu khỉ (Microaerophũe)

Cần 0 2 ở mức độ thẩp hơn2- 10% đề sinh trưởng và bị tổn hại trong không khí (20 %) Ap suât Sinh trường nhanh hơn khi áp suất thủy tĩnh cao

Clostridium, Bacteroides, Metanobacterhm, Trepomonas agiỉis. Campylobacter, Spirillum voỉutans, Treponema pallidum

ưa áp (Barophile)

64

Photobacterium profindum, Shewanella benthica, Metanococcus jannaschii

14.4.1. Hoạt tính của niróc và dung chất Vỉ tế bào ví sinh vật tách với môi trường cùa chúng bằng loại màng sinh chất có tính thẩm thấu chọn lọc cho nên vi sinh vật chịu ảnh hường cùa sự biến đổi nồng độ thấm tháu trong môi trường. Neu một vi sinh vật được đưa vào dung dịch có nồng độ thẩm thấu thấp thi nước sẽ xâm nhập vào te bào, nếu không có sự khống chế hữu hiệu thì tế bào sẽ bị trương lên và vỡ ra. Nhờ có các thể nội hàm mà có thể giảm thấp nồng độ thẩm thấu của tể bảo chất. Lúc tính thẩm thấu của môi trường thấp hon tính thẩm thấu của tế bào chất, các vi sinh vật nhân nguyên thủy cũng có thể phá vỡ các kênh mẫn cảm với áp suất làm cho dung chất thấm ra. Phần lớn vi khuẩn, tảo và nấm thường có thành tế bào vừng chắc, có thể duy trì hình thái và tính hoàn chỉnh của tế bào. Lúc đua tế bào các vi sinh vật có thành tá bào vững chắc vào mồi trường ấp suất thẩm thấu cao thỉ nước sẽ thoát ra, màng sinh chất sẽ tách ra khỏi thành tế bào và tạo ra tình trạng co nguyên sinh. Sự mất nước này của tế bào sẽ tổn hại tới màng tế bào chất, tế bào sẽ mất khả năng trao đổi chất và ngừng sinh trường. Điều này liên quan đến việc bảo quàn thực phẩm nhờ muối mặn hoặc tẩm đường (làm mứt, ngâm mật ong...)' Nhiều vi sinh vật sử dụng dung chất hỗn hợp (compatible solute) để làm cho nồng độ thẩm thấu cùa nguyên sinh chất cao hơn môi trường chung quanh, làm cho màng sinh chất vẫn gắn được với thành tế bào. Sở dĩ gọi là dung chẩt hỗn hợp là vì dung chất đó có thể thích hợp để tế bào sinh trưởng và phát triền ngay khi cỏ nồng độ cao trong tế bào. Phần lớn vi sinh vật nhàn nguyên thủy có thể nàng cao nồng độ thẩm thấu trong tế bào ở môi trường áp suất thẩm thấu cao là nhờ tổng hợp hoặc hấp thu colin, betaine, proline, axit glutamic và các axit amin khác. Việc nâng cao nồng độ K+ cùng có thể ờ một mức độ nào đó giúp nâng cao nồng độ thẩm thấu trong tế bào. Tảo và nấm thì sử đụng xacaroz và các polyol, ví dụ như arabitol, glyxeroi, mannitol,... để đạt được mục đích như vậy. Polyol và axit amin là những đung chất lý tuởng để nâng cao nồng độ thẩm thấu trong tế bào bởi vì chúng không phá hủy cấu trúc và chức năng của enzym. Nhiều vi sinh vật nhân nguyên thủy như Haỉobacterium salỉanarium sử dụng K+ để nâng cao nồng độ thẩm thấu trong tể bào, Na+ cũng cỏ tác dụng này nhưng không sử dụng được cao như K+. Các enzym của Halobacterỉum cần nồng độ muối cao để đuy trì hoạt tính. Động vật nguyên sinh đo không có thành tế bào nên phải sử dụng các không bào (vacuoles) để bài xuất phần nước dư thừa khi sống trong m ô i trường có nồng độ thẩm thấu thấp. Tác dụng tương hỗ giữa phân tử nước và phân tử dung chất được gọi là hiệu ứng thẩm thấu (osmotic effect) còn hiệu ứng cơ chất (matric effect) là biểu thị các phần từ nước bị hấp phụ (adsorption) trên bề mặt các chất rắn. Hai hiệu ứng này dẫn đến việc giám sút phần hước có thể được vi sinh vật sử dụng. Vì nồng độ thẩm thấu trong môi trường có

ành hưởng sâu sắc đối với vi sinh vật cho nên để định iượng khả năng sử dụng nước các nhà vi sinh vật học thường dùng khái niệm hoạt độ nước aw (water activity aw) đê biêu thị tính hữu hiệu của nước. Cũng có thể dùng thế nàng nước (water potential) tương quan với awđể biểu thị tính hừu hiệu của nước. Hoạt độ nước của một dung dịch ]à 1/100 cùa độ âm tương đối của đung dịch này (tính theo %), cũng là tương đương vói tỷ lệ giữa áp suất bay hơi của dung dịch này (Psoin) và áp suất bay hơi của nước tinh khiết (Pwater):

Hoạt độ nước của một dung địch hay một chất rắn có thể xác định bằng cách đưa vào một vật chứa kín và đo độ ẩm tương đối sau khi hệ thống đạt tới trạng thái càn bàng (equilibrium). Ví dụ, một mẫu vật sau khi đạt tới trạng thái cân bàng trong hệ thống này mà không khí đạt tới 95% bão hòa, thì cũng tức là không khí chứa 95% độ ẩm khi đạt tới cân bàng ở cùng nhiệt độ với một mẫu nước thuần khiết, hoạt độ nước của mẫu vật này là 0,95%. Hoạt độ nước tỷ lệ nghịch với áp suất thẩm thấu, nếu áp suất thẩm thấu cao thì trị số awlà thấp. Các vi sinh vật khác nhau có năng lực thích ứng khác nhau rất lớn đối với môi trường có hoạt độ nước thấp (bảng 14.4). Bảng 14.4: Trị sỗ tương đối về hoạt độ nư&c (a„) thấp nhất đối với sự sinh trưởng của vi sình vệt (theo A.Đ. Brown, 1976) Hoại độ nước

Môi trường

Vi khuẩn, Nấm, Tảo

1,00

Nước thuần khiết

Phần lớn VK Gram (') không ưa mặn

0,95

Bảnh mỳ

Phần lớn trực khuẩn Gram (-) Basidiomycetes Fusarium Phần 1ỚĨ1Mucor,Rhìzopus, Bacillus.

0,90

Đùi gia súc

Phần lớn cầu khuẩn, nấm men cỏ bào tử túi.

0,85

Salami Ý

Staphylococcus

0M

Thực phẩm muối

Saccharomyces rouxii (trong muối), Penicillium

0,75

Hồ muổi Cả muối

Haỉobacterium,AspergiUus, Dunaỉìeỉla, Âctìnospora

0,70

Ngũ côc,kẹo, quả khô

Aspergillus

0,60

Sôcôla, mật ong, sữa bột

Saccharomyces rouxii (trong đường), Xeromyces bisporus

0,55

66

ADN bị phá hùy

Có thế kể thêm vài ví đụ khác về trị sổ aw: máu người- 0,995; quả tươi- 0,97-0,98; nước biển- 0,98; thịt gia súc tươi- 0,97; sirỏ- 0,90; giăm bông- 0,90; lạp xường- 0,85; mứt quả- 0,80; nước đường bão hòa- 0,76; bột mỳ- 0,65... Vi sinh vật muốn giữ lượng nước bằng cách duy trì dung chất nội bào ở nồng độ cao khi sinh trưởng trong môi trường có hoạt độ nước thấp sẽ gặp khó khăn khá lớn. Nhừng vi sinh vật có thể tồn tại trong những điều kiện như vậy được gọi là các vi sinh vật chịu áp (osmotolerant). Chúng có thể sinh trưởng được trong một phạm vi nồng độ thấm thấu hoặc hoạt độ nước khá rộng. Ví dụ , vi khuẩn Staphylococcus aureus có thể nuôi cấy trên môi truờng có nồng độ NaCl cao tới 3 mol/L. Chúng cũng có thể thích ứng sinh trường trên da người. Nấm men Saccharomyces rouxii có thể sinh trường trên dung dịch đường có hoạt độ nuớc thấp đến 0,6. Tảo lục Dunalieỉla viridỉs có thể chịu được nồng độ NaCl cao đến ỉ ,7mol/L hoặc nồng độ bão hòa. Mặc dầu một sổ ít vi sinh vật có thể thực sự chịu áp nhưng phần lớn vi sinh vật chỉ cỏ thể sinh trường tốt ở hoạt độ nước khoảng 0,98 (tương đương với aw của nước biển) hoặc cao hơn nữa. Lợi đụng điểu nảy người ta sử dụng phương pháp sấy khô hay dùng muối, đùng đường để bảo quản thực phẩm, phòng tạp nhiễm bởi vi sinh vật. Tuy nhiên nhiều nam chịu áp vẫn có thể làm hư hỏng các thực phẩm đã sấy khô hoặc ướp muối, tẩm đường. Vi sinh vật ưa mặn (Halophile) hoàn toàn thích ứng với môi trường cao áp (hypertonic), cần nồng độ NaCl cao để sinh trưởng. Phạm vi nồng độ muối cần thiết để sinh trường đối với nhóm vi khuẩn ưa mặn cực đoan (extreme halophilic bacteria) là 2 ,8 6,2 mol/L (nồng độ muối bão hòa). Tại Biển Chết (Dead Sea)- một hồ thấp nhất thế giới nằm giữa Israel và Jordan, và tại hồ Đại Diêm (Great Salt Lake) ở bang Utah (Hoa Kỳ) và tại các môi trường khác có nồng độ muối gần với bão hòa, có thể phân lập được các c ổ khuẩn (archeon) thuộc chi Haỉobacterium, Chúng cùng các vi khuẩn ưa mặn cục đoan khác không giống với phần lớn các vi sinh vật chịu áp (osmotolerant) ở chỗ không phải là đơn giản thông qua việc nâng cao nồng độ dung chất nội bào, mà chủ yếu là sửa đổi cấu trúc protein vả màng của mình để thích ứng vói nồng độ muối cao. Những vi khuẩn ưa mặn cực đoan này duy trì nồng độ kali nội bào sao cho áp suất thẩm thấu cao hơn môi trường sống; nồng độ K+ nội bào có thể tới 4-7 moỉ/L. Các enzym, riboxom và protein vận chuyển của các vi khuẩn này cần nồng độ K+ cao để duy tri tính ổn định và hoạt tính. Ngoài ra nồng độ Na+ cao cũng giúp cho sự ổn định cùa tế bảo và màng sinh chất cùa vi khuẩn Halobacterium. Nếu nồng độ Na+ quá thấp thì thành tế bào và màng sinh chất sẽ hoàn toàn bị phá hủy. Vi khuẩn ưa mặn cực đoan thích ứng thành công với điều kiện môi trường muối cao, nơi có thể tiêu diệí hầu hết các sinh vật khác. Tuy nhiên chúng cũng đã biệt hóa (specialized), mất đi tính linh hoạt (flexibility) sinh thái và chỉ có thể sinh trưởng trong một ít môi trường cực đoan.

67

14.4.2. pH pH là số đo hoạt tính ion hydro của một dung dịch và đó là số logarit âm của nồng độ ion hydro (biểu thị bàng nồng độ phân tử): pH = -log[H+] - !og (Ỉ/[H+J) Thang pH từ pH 0,0 (1,0 mol H+) đến pH 14,0 (1,0 X 10',4mol H+). Mỗi đon vị pH đại biểu cho sự biến đổi 10 lần về nồng độ ion hydro. Hình ỉ 4. ỉ 3 cho thấy nơi cư trú mà vi sinh vật có thể sinh trưởng là rất rộng, từ pH rất axit (pH 1-2) đến những hồ hay đất rất kiềm với pH giữa 2 và 10. pH có ảnh hưởng rõ rệt đối với sự sinh trường của vi sinh vật. Mỗi vi sinh vật đều có một phạm vi pH sinh trưởng nhất định và pH sinh trưởng tốt nhất. Vi sinh vật ưa axit (axitophile) có pH sính trưởng tốt nhất là pH 0-5,5 ; đối với vi sinh vật ưa trung tính là pH 5,5-8,0 ; đối với vi sinh vật ưa kiềm (alkalophile) là pH 8,5-11,5. Vi sinh vật ưa kiềm cực đoan có mức sinh trưởng tổi liu ở pH 10 hay cao hơn nữa. Nói chung, các nhóm vi sinh vật khác nhau đều có phạm vi sinh trưởng riêng của mình. Phần lớn vi khuẩn và động vật nguyên sinh là ưa trung tính. Phần lớn nấm là ưa hơi axit (pH 4-6). Cũng có nhiều trường hợp ngoại lệ. Vỉ dụ, tảo Cyanidium caỉdarium và cổ khuẩn Sulfolobus axiíocaỉdarius thường sống trong các suối nước nóng axit, chúng sinh trường tốt ở nhiệt độ cao và pH từ 1 đến 3. Cổ khuẩn Ferroplasma axitannanus và Picrophiỉus oshimae có thể sinh trưởng ở pH=0 hay rẩt gần với 0. Mặc dầu vi sinh vật thường có thể sinh trưởng trong một phạm vi pH khá rộng, và xa với pH tốt nhất cùa chúng, nhưng tính chịu đựng (tolerance) của chúng cũng có giới hạn nhất định. Khi pH trong tế bào chất có sự biến hóa đột ngột sẽ làm phá vỡ màng sinh chất hoặc làm ức chế hoạt tính của enzym hay proteinaz chuyển màng, do đó làm tổn thương đến vi sinh vật. Vi sinh vật nhân nguyên thủy bị chết khi pH nội bảo giảm xuống thấp hơn 5,0-5,5. Sự biến đổi pH của môi trường sẽ làm thay đổi trạng thái điện ly của phân tử các chất đinh dưỡng, làm hạ thấp khả năng sử dụng chúng của vi sinh vật. Khi pH trong m ô i trường có sự biến hóa tương đổi lớ n thỉ pH nội bào của phần lớn vi sinh vật vân gân trung tính. Nguyên nhân có thể là do tính thẩm của H+ qua màng sinh châl là tương đôi thâp. Vi sinh vật ưa trung tính thông qua hệ thống vận chuyển đã sử dụng K thay cho H . Vi sinh vật ưa kiềm cực đoan như Bacillus aỉcalophilus dùng Na+ nội bào thay thê cho H của môi trường bên ngoài, giữ cho pH nội bào gần với trung tính. Ngoài ra hệ thông chât đệm nội bào (intering buffering) cũng cỏ vai trò quan trọng trong việc duy trì pH ổn định.

68

Bảngl4.5: T h a n g p H pH

[H +] nồng đệ p h in từ

0

101(1 JŨ)

1

]
2

10"

V í đụ

vè m ô i tiircmặ

A c id n itric đ Ịm đặc

D ịc h dạ dày, suối nưóc nóng a x it

N iĩớ c ép ch aiủ i D ịc h a x it

3

10*

4

10“

5

10*

Ví đụ ve v i suửi vật Fefrữtfdiirứ Ptcrophiỉus tìífiííiM« Qjiiatefla actờc{itì)la

C r ó ỉ ĩ t đ i u m C ữ k ia e iu /r t

ỈAtoaxrdaní íiCrd0CáWjfỉul

T h to b ã C iih it ở

m ò

ũ iítứ la ò u t

G iảm , D ứ a Nước ép cà c h iâ , cam Đ ấ t r í t ax it

Pho mát, băp cH B ín h m ỳ T h ịt bò, th ịt g ì

6

10*

Nước m ưa Sữa

7

10"

a

10*

9

10“*

T n u ig t ín h

Nrócbọt Nwc tứửi khiết Min Nướcbiễn

P tìy ta n ím flữ ty c * p h a iu m A ữ a n th a m o tữ * C â tilN ữ n *

Loe !aỉh9Ci#uĩ a c i ờ c p h A i t £. coH, P**uctó(T50na* J«rotfino»4.

fijgiiflj ọracdrt. Pararmctumbtinãna Stopíiytocco*dtintu* N itr o to * tw \is V ữ .

Đ ì t r á i k iê m H ô rwớc k iê m

10

lo'*

Xà phòng

M tm c /tíig a em ự m o sa B b c M to tề c a to ọ h tiu a

11

10*

N u ó c a itu n o n ú gJA dạng

12

10"

D u n g dịch C à hydroxide bão h òa

13

10*

n

1
T h u ố c t i y trắng T h u ố c t i y ổ n g cống

Vi sinh vật phải có năng lực thích ứng với sự biến đổi pH của môi trường thì mới có thể sinh tồn. Đối với vi khuẩn, hệ thống vận chuyển ngược K+/H+ và Na+/H+có thể dùng để khấc phục những biển đổi nhỏ về pH. Nếu pH quá axit các cơ chế sẽ phát huy tác dụng. Lúc pH giảm xuống tới pH 5,5-6,0 vi khuẩn thương hàn (Salmonella typimurium) và Escherichia coli có thể tổng hợp ra một loạt các protein mới và được gọi là một phần của đáp ứng chống chịu axit. ATPaz chuyển vị proton được dùng để sản sinh ra nhiều ATP hoặc bơm proton ra ngoài té bào. Nếu pH bên ngoài giảm xuống còn 4,5 hay thấp hơn nữa vi khuẩn sẽ tổng hợp ra các phân tử đi kèm, chẳng hạn như các protein gây sốc axit (axit shock proteins) hay các protein gây sốc nhiệt (heat shock proteins). Chúng được đùng để

69

phòng ngừa sự biến tính axit cùa các protein khác và giúp sửa chữa lại các protein đã bị biến tính. Vi sinh vật thường sinh ra các chất thài trao đổi chất có tính axií hay kiêm đê làm thay đổi pH môi trường sống. Vi sinh vật lên men sử dụng nguồn cacbonhydrat để tạo ra các axit hữu cơ. Các vi sinh vật dinh dưỡng hóa năng vô cơ (chemolithotrophs) như Thiobaciỉỉus có thể ôxy hỏa các hợp chất sulfua dạng khử để sinh ra axit sulfuaic. Một số vi khuẩn khác thông qua việc phân giải các axií amin làm sinh ra NH3 và làm kiềm hóa môi trường. Người ta thường bổ sung các chất đệm (buffers) vào môi trường nuôi cấy để phòng ngừa sự ức chế quá trinh sinh trường của vi sinh vật khi pH biến hóa quá lớn. Photphat là chất đệm thường được sử dụng, điển hình là muối H 2PO4" axit yếu và muối HPO42’ kiềm yếu: H+ + H P042' O H' +

H2PO4' -

H 2P 0 4' HPO42' + HOH

Nếu bồ sung H+ vào hệ thống đệm nó sẽ kết hợp với HPO 42" để tạo ra axit yếu. Nếu bổ sung OH' vào hệ thống đệm nó sẽ kết hợp với H2PO4" để tạo thành nước. Như vậy là pH môi trường không bị biến hóa quá lớn. Trong các môi trường phức tạp thì peptid và các axit amin cũng có năng lực đệm {buffering effect) rất mạnh. 14.4.3. N hiệt độ Cũng giổng như các sinh vật khác, nhiệt độ của môi trường cũng có ảnh hưởng rất lớn đối với vi sinh vật. Trên thực tế, do vi sinh vật thường là các sinh vật đơn bào cho nên chúng rất mẫn cảm với sự biển hóa của nhiệt độ, và thường bị biến hóa cùng với sự biến hóa về nhiệt độ của môi trường xung quanh. Chính vì vậy, nhiệt độ của tế bào vi sinh vật cũng phản ánh trực tiểp nhiệt độ của môi trường xung quanh. Một nhân tố quyết định ảnh hưởng của nhiệt độ đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật đó là tính mẫn càm với nhiệt độ của các phản ứng xúc tác nhở enzym. Trong phạm vi nhiệt độ thấp, khi nhiệt độ tăng lên sẽ làm tăng tôc độ sinh trưởng của vi sinh vật, vì phản ứng xúc tác nhờ enzym cũng giống như các phản ứng hóa học nói chung, khi nhiệt độ tăng lên 10° c tốc độ phản ứng sẽ tăng gâp đôi. Vì các phản ứng trong tê bào đều tăng cho nên toàn bộ hoạt động trao đổi chất sẽ tăng lên khi nhiệt độ cao hơn, và vi sinh vật sẽ sinh trưởng nhanh hơn. Lúc nhiệt độ tăng lên đến một mức độ nhẩt định thì nhiệt độ càng tăng tốc độ sinh trưởng càng giảm. Khi nhiệt độ tăng quá cao vi sinh vật sẽ chết. Khi nhiệt độ quá cao sẽ gây ra sự biến tính của enzym, của các thể vận chuyển (transport earners) và các protein khác. Màng sinh chất sẽ bị ton thương vì hai lớp lipit sẽ bị hòa tan. Do đỏ mặc dầu ở nhiệt độ càng cao các phàn ửng xúc tác tiến hành càng nhanh nhưng do các nguyên nhân nói trên mà tế bào bị tổn

thuơng đến mức khó hồi phục và dẫn đến việc ức chế sinh trưởng. Tại điều kiện nhiệt độ rất thấp màng sinh chất bị kết đông lại, enzym cũng ngừng hoạt động. Nói chung, nếu vượt quá nhiệt độ tốt nhất đối với vi sinh vật, chức năng và kết cấu tế bào đều bị ảnh hướng. Nếu nhiệt độ rất thấp, tuy chức năng chịu ảnh hưởng nhưng thành phần hóa học và kết cấu không nhất thiết chịu ảnh hưởng. Do ảnh hưởng hai mặt, vừa có lợi vừa có hại của nhiệt độ đối với vi sinh vật mà có thể xác định các loại nhiệt độ cơ bản (cardinal temperaturre) đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật. Đó là nhiệt độ thấp nhất (minimum), nhiệt độ tốt nhất (optimum) và nhiệt độ cao nhất (maximum) đối với sự sinh trưởng.

Hĩnh 14.13: Ẩnh hướng cùa nhiệt độ đối với tốc độ sinh trirớng của vi sinh vật. (Theo sách cùa Prescott, Harley và Klein). Mặc dầu đường biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đổi với sinh trưởng cùa vi sinh vật là phụ thuộc vào từng vi sinh vật, từng điều kiện khác nhau nhưng nhiệt độ tốt nhất thường gần với nhiệt độ cao nhất hơn là so với nhiệt độ thấp nhất. Ba nhiệt độ cơ bản của cùng một loài ví sinh vật không phải là cố định mà thường phụ thuộc vào pH, thức ăn và các nhân tổ khác. Chẳng hạn, một loại động vật nguyên sinh có tiên mao là Crithidia fasciculate sống trong đường tiêu hóa của muỗi có thể sinh trưởng trên môi trường đơn giản ở nhiệt độ 22-27°C nhưng ở nhiệt độ 33-34°C thì lại không sinh trưởng được nếu không bổ sung vào môi trường ion kim loại, axit amin, vitamin và lipit. Nhiệt độ cơ bản của các vi sinh vật khác nhau là khác nhau rẩt nhiều. Nhiệt độ tốt nhất có thể thấp từ 0°c đển cao tới 75°c. Nhiệt độ thấp nhất để sinh trường có thể đến 2QỮC. Nhiệt độ cao nhất có thể vượt quá 100°c. Nhân tố chù yếu quyết định phạm vi sinh trưởng này cỏ thể là nước. Ngay trong điều kiện toi cực đoan thì vi sinh vật cũng cần có 71

nước ở trạng thái dịch thể mới có thể sinh trưởng. Đối với số đông vi sinh vật thì phạm vi nhiệt độ sinh trưởng thường trong khoảng 30°c. Một số vi sinh vật (như Câu khuân lậu Nesseria gonorrhoeae) có phạm vi nhiệt độ sinh trưởng rât hẹp. Trong khi đỏ cũng có những vi sinh vật (như Enterococcus facalis) lại có phạm vi nhiệt độ sinh trưởng rât rộng. Nhiệt độ sinh trưởng cao nhất là khác nhau giữa các nhóm lớn vi sinh vật. Nhiệt độ sinh trưởng cao nhất đối vói động vật nguyên sinh (protozoa) là 50°c. Một số tảo và nấm có thể sinh trưởng ở nhiệt độ cao tới 55-60°C. Một số vi sinh vật nhân nguyên thủy có thể sinh trường ở 100°c (nhiệt độ nước sôi) hay gần như vậy. Gần đây người ta còn phát hiện thấy có những ví sinh vật sinh trưởng được ở cà nhừng điều kiện nhiệt độ cao hơn 100°c. Đã có các thông báo cho biết đã phát hiện thấy các vi sinh vật nhân nguyên thủy tại dịch phun giàu sulphid (black smoker) ở vết nứt dưới đáy biển - nơi nhiệt độ nước cao tới 350°c. Những vi sinh vật này sinh trường, phát ừiển rất tốt ở nhiệt độ 113°c và còn có thể sinh trưởng, phát triển ở nhiệt độ cao hơn nữa. Áp suất cao ở miệng núi lửa dưới đáy biển làm cho nước ở nhiệt độ siêu cao vẫn tồn tại ở trạng thải dịch thể (ở áp suất 265 atm nước biển sẽ sôi ờ 460°C). Phát hiện này cho thấy protein, màng, axit nucleic của các vi sinh vật này có tính kháng nhiệt rất cao. Đây là những vật liệu rất tốt giúp cho việc nghiên cứu cơ chế ổn định cùa màng và các cao phân tử sinh học, Tương lai có thể nghĩ đến khả nảng thiết kế các enzym cỏ thể phát huy tác dụng trong những điều kiện rất cao. Những enzym bền nhiệt từ các vi sinh vật này sẽ có những ứng dụng rất quan trọng trong công nghiệp và trong nghiên cứu khoa học. Chẳng hạn men Taq polymeaz nhận được từ cổ khuẩn Thermus aquaticus đă được ứng dụng rộng rãi trong phản ứng chuỗi polymeaz. Rõ ràng là vi sinh vật nhân nguyên thủy có thể sinh trưởng được ở những nhiệt độ cao hơn vi sinh vật nhân thật. Đó là vì vi sinh vật nhân thật không có thể tạo ra được các màng cơ quan tử có chức năng tương ứng ở điều kiện nhiệt độ cao hơn 60°c. Ngoài ra các cơ quan quang hợp cũng hầu như không ổn đinh như vậy và do đó không phát hiện thấy có sự sinh trưởng của các vi sinh vậí quang hợp trong môi trường nhiệt độ rất cao. Căn cứ vào phạm vi nhiệt độ sinh trưởng có thể chia vi sinh vật thành 5 nhóm. Vi sinh vật ưa lạnh (P.sychrophile): Đó là các vi sinh vật có thể sinh trưởng ở 0°c, sinh trường tốt nhất ờ 15°c hay thấp hơn, nhiệt độ cao nhất chi là khoảng 20 °c. Tại Nam cực và Bắc cực dễ dàng phân lập các vi sinh vật thuộc nhóm này. Vỉ có tới 90% nước biển thấp hơn hay bằng 5°c nên tại đó cỏ lượng lớn các vi sinh vật ưa lạnh. Chỉamydomonas nivalis là một loài tảo ưa lạnh, chúng sinh bảo tử màu đỏ tươi làm cho khối băng tuyết có màu phấn hồng (pink). Phần lớn vi khuẩn ưa lạnh thuộc về các chi Pseudomonas, Vibrio, Aỉcaỉigens, Bacillus, Ảrthrobacter, Moritella, Photobacterium, và Shewanella. c ổ khuẩn Metanogenum ưa lạnh gần đây đã được phân lập tại hồ Ace ờ Châu Nam cực.Vi sinh vật ưa lạnh thông qua nhiều loại phương thức để thích ứng được với môi trường lạnh. Chúng phát huy cơ chế rất tốt để tổng hợp protein, enzym, các hệ thống vận chuyển. Màng tế bào

cúa vi sinh vật ưa lạnh có chứa nhiều các axit béo không bão hòa, có thề giữ được trạng thái chất bán lưu (semifluid) khi gặp lạnh. Tuy nhiên nhiều vi sinh vật ưa lạnh ở nhiệt độ cao hơn 20°c màng tế bào sẽ bị phá hại. Băng 14.6: Phạm vì nhiệt độ (NĐ) đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật Vi sinh vật

NĐ thấp nhất

NĐ tốt nhất

NĐ cao nhất

v s v không quang hợp Bacillus psychrophiỉus

-Ỉ0

23-34

28-30

Micrococcus cryophiỉus

-4

ỈO

24

Psedomonas fluorescens

4

25-30

40

Staphylococcus aureus

6,5

30-37

46

Enierococcusfaecahs

0

37

44

Escherichia coli

10

37

45

Neisseria gonorrhoeae

30

35-36

38

Thermoplasna axitophilum

45

59

62

Bacillus stearotkermophilus

30

60-65

75

Thermus aqualicus

40

70-72

79

Sulfolobus axtiocaldarius

60

80

85

Pyrococcus abyssi

67

96

102

Pyrodictium occultum

82

ỉ 05

ỈỈO

pyrolobus fumarii

90

ì 06

ỉ 13

Vi khuẩn quang hợp và vi khuẩn lam Rhodospirilỉum rubrum

-

30-35

-

Anabaena variabỉlis

-

35

-

Osilỉatoria tenuis

-

-

45-47

Synechococcus eximius

70

79

84

Tảo nhân thật Chỉamydomonas nivalis

-36

0

4

Fragilaria subỉinearis

-2

5-6

8-9

Cỉoìỉa pyrenoiảosa

-

25-26

29

Eugìena gracilis

-

23

-

Skeỉeionma costatum

6

16-26

>25

Cyanidium caldarium

30-34

45-50

56

73

NĐ tốt nhắt

ND cao nhất

0

4-15

15

1-3

28

40

2Ỉ-23

45-50

50-58

NĐ thấp nhất

Vi sinh vật

Nấm Candida scottii Saccharomyces cerevisiae Mucor pusỉỉlus

Động vật nguyên sinh Amoeba proteus

4-6

22

35

Naegỉeriơ fowteri

20-25

35

40

25

32-39

42

25

28-30

Trichomonas vaginalis Paramecium caudatum Tetrahymena pyriformis

6-7

20-25

33

Cyclidiutn citrullus

18

43

47

Nhiều vi sinh vật sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 20-30°c, nhiệt độ cao nhất là cao hơn 35°c, nhưng chúng vẫn có thể sinh trưởng trong điều kiện 0-7°C.Chúng thuộc về nhóm ưa lạnh không bắt buộc {Psychrotrophs hay Facultative psychrophiles). Những vi khuẩn và nấm thuộc nhóm này lả nguyên nhân chính làm hư hỏng thực phẩm giữ lạnh. Vi sinh vật ưa ẩm (Mesophile): Đó là các vi sinh vật sinh trường tốt nhất ở 20-45°C, nhiệt độ sinh trưởng thấp nhất là 15-20°c. Nhiệt độ sinh trưởng cao nhất là khoảng 45 °c hoặc thấp hơn. Phần lổm vi sinh vật là thuộc về nhóm này. Hầu như mọi vi khuẩn gây bệnh cho người đểu là vi sinh vật ưa ấm, bởi vì thân nhiệt của người là 37 °c.

vsv u» siêu HÓttg vsv 1*4ruing Ị Ị VSVuaim vsv tra lạnh í ^ khốngbít buộcỊ VSViji "i «■

í Ị

/

Y

\

Ị

Ị

/ / Ị

-- 1------- 1 A 1-----l_i_L_J—«— 1— Li— 1— 1— ị—Ầ 1 120

Nhiệt độ (°CJ Hình ì 4. ỉ 4: Phạm vi nhiệt độ sinh trưởng cùa vi sinh vật (Theo sách của Prescott, Harley và Klein).

Vỉ sinh vật ưa nhiệt (Thermophile): Đó ỉà các vi sinh vật sinh trưởng được ở nhiệt độ 55°c hay cao hơn nữa. Nhiệt độ sinh trường tốt nhất đổi với chúng là 33-65°C. Thành phần chủ yếu của nhỏm này là vi khuẩn (chù yếu là xạ khuẩn), một ít tảo và nấm (bàng ỉ 4.6). Chúng phát triển trong đống phân chuồng ù, dưới đáy các cột rơm rạ hay cỏ khô, trong dường dẫn nước nóng, trong các suối nước nóng...Vi sinh vật ưa nóng khác với vi sinh vật ưa ấm ờ chỗ chúng có hệ thong tổng hợp enzym và protein bền nhiệt (heat-stable) và có thể hoạt động ở nhiệt độ cao. Màng sinh học của chúng có lipit bão hòa ờ mức cao, có điểm sôi cao hơn và vì vậy vẫn giữ được nguyên vẹn ở nhiệt độ cao. Có một số ít các vi sinh vật ưa nhiệt có thể sinh trưởng ờ nhiệt độ 90° c hay cao hơn. Nhiệt độ sinh trưởng cao nhất là 100 °c. Người ta xếp các vi sinh vật có nhiệt độ sinh trưởng tổt nhất ở 80-113°c vào nhóm VI sinh vật ưa siêu nóng (Hyperthermophiles). Chúng thường không thể sinh trường bình thường ở nhiệt độ thấp hom 55°c. Vi khuẩn Pyrococcus abyssỉ và Pyrodiciium occuỉtum là ví dụ về những vi sinh vật ưa siêu nhiệt được tìm thấy ở những đáy biển nóng. 14.4.4. Nồng độ oxy Các vi sinh vật sinh trưởng trong điều kiện có oxy được gọi là vi sinh vật hiếu khỉ (aerobe), còn các vi sinh vật sinh trưởng ừong điều kiện không có oxy được họi là các vi sinh vật kỵ khí (anaerobe). Hầu hết các cơ thể đa bào đều phải cần sinh trưởng trong điều kiện có oxy, chúng ]ả các sinh vật hiếu khí bắt buộc (obligate aerobes). Oxy là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi vận chuyển điện tử khi hô hấp hiếu khí. Ngoài ra, các vi sinh vật nhân thật (eucaryotes) hiếu khí còn dùng oxy để tổng hợp sterol và các axit béo không bão hòa.

□S

□

ĩ

ỊS Ị

Hiếu khí bắt buộc

Kỵ khí tuỳnghi

Kỵ khí chịu đưoc hiếu khí

♦ SOD ♦ Catalase

♦ SOD -Caialaso

Ky khí bat buộc

Vi hiếu khí

Thành phần enãm ♦ SOD ♦ Cat al a se

-soo ‘Câtalaae

Hình 14.15: Oxy và sự sinh trường cùa vi khuẩn. Chủ thích: Các nhóm vi sinh vật xem trong bài

♦ SOĐ «/- Câtalase

Mỗi chàm biêu hiện khuẩn lạc cùa vi khuân trong hay trên bề mặt môi trường. SOD và catakiz là biếu thị vì khuẩn có tồn tại enzym superoxit dismutaz và catalaz hay không? ( Theo sách cùa Prescott, Harley

và

Klein).

Các vi sinh vật kỵ khí không bắt buộc (facultative anaerobes) không cần oxy để sinh trường nhưng khi có oxy thì sinh trưởng tốt hơn. Khi có oxy chúng sử dụng phương thức hô hấp hiếu khí. Các vi sinh vật kỵ khí chịu oxy (aerotolerant anaerobes) như vi khuẩn Enterococcus faecalis có thể sinh trưởng như nhau trong điều kiện có oxy cũng như không có oxy. Ngược khuẩn Bacíeroides, Fusobacterium, Clostridỉun pasteurianum, Meíanococcus.... sẽ bị chết khi có oxy. Vi sinh vật kỵ khí chịu oxy và vi sinh vật kỵ khí bắt buộc không sinh năng lượng thông qua quá trình hô hấp, chúng thu được năng lượng thông qua quá trình lên men hay hô hấp kỵ khí (anaerobic respiration). Sau cùng, phải kể đến nhóm vi sinh vật vi hiểu khí (microaerophiles), chúng không sinh trưởng được trong điều kiện không khí bình thường (20% O 2) và cần sinh trưởng trong điều kiện nồng độ O 2 khoảng 2-10% Quan hệ giữa vi sinh vật vả oxy có thể xác định bàng một thí nghiệm đơn giàn như sau: nuôi cấy vi sinh vật trong ống nghiệm chứa môi trường đặc hoặc môi trường đặc biệt như môi trường chứa thioglycolat (là chất khử làm giảm nồng độ oxy trong môi trường). Cùng một nhóm vi sinh vật có thể có nhiều loại quail hệ khác nhau với 0 2. Cà 5 loại hình đều có thể thấy ờ vi sinh vật nhân nguyên thủy (prpcaryotes) và động vật nguyên sinh. Nấm thường là hiếu khí, chỉ trừ một số loài đặc biệt, nhất là nấm men, thuộc loại kỵ khí không bắt buộc. Tảo hầu như đều thuộc loại hiếu khí bắt buộc. Đáng chú ý là năng lực có thể sinh trưởng cả trong môi trường hiếu khí lẫn môi trường kỵ khí làm cho vi sinh vật có tính linh hoạt cao và đó chinh là một loại ưu thế sinh thái học. Mặc dầu O2 có thể làm chểt các vi sinh vật kỵ khí bắt buộc, nhưng trong môi trường hiếu khí vẫn có thể phân lập đuợc chúng. Đó là do chúng thường sống chung với loại kỵ khí không băt buộc và họ này tiêu thụ hết O2 , tạo nên môi trường kỵ khí cục bộ giúp cho vi sinh vật kỵ khỉ băt buộc có thê sinh trường được. Ví dụ trong khoang miệng vi khuẩn kỵ khí băt buộc Bacteroides gỉngivaỉis có thể sinh trưởng được trong các khe kỵ khí quanh răng. Sự khác biệt trong quan hệ của vi sinh vật với O2 do nhiều nguyên nhân khác nhau, bao gôm việc bât hoạt của protein và tác dụng độc hại của O 2 trong điều kiện hiếu khí. Các enzym có thể bị bất hoạt khí các nhóm mẫn cảm như sulfuahydrit bị oxy hóa. Chẳng hạn như enzym cố định đạm nitoaz là loại rẩt mẫn cảm với O2 Vì hai điện từ bên ngoải cùa oxy không thành cặp do đó rất dề tiếp nhận điện tử và bị khử. Flavoprotein, một số thành phần té bào khác và sự bức xạ đểu có thể thúc đẩy việc

76

khử oxy, tạo thành các sản phẩm khư như gốc tự do superoxit, hydro peroxit, gốc hydroxyl. O 2 + e' -» O 2' (gốc tự do superoxit) O2 + e' + 2H+ -* H 2O2 (hydro peroxit) O2 + e' + H+ -* H2O + OH' (gốc hydroxyl) Các sản phẩm khử oxy này là cực kỳ có hại vì chúng là các chất oxy hóa mạnh và phá hủy nhanh chóng các thành phần tế bào. Vi sinh vật nào phải có năng lực tự chống lại được các sản phẩm khử này mới tránh khỏi bị tiêu diệt. Bạch cầu trung tính (neutrophils) và đại thực bào (macrophage) đâ lợi dụng các sản phẩm độc hại này để tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh xâm nhập cơ thể. Nhiều vi sinh vật sinh ra các enzym để chổng lại các sản phẩm khử độc hại này. Vi khuẩn hiếu khí bắt buộc và vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc thường chứa các enzym như superoxit dismutaz (SOD) vả catalaz, chủng phân biệt xúc tác việc phá hủy gốc superoxit và hydro peroxit. Peroxitaz cũng cỏ thể dùng để phá hủy hydro peroxit: 2 0 2 ' + 2H+ ^

superoxit dismutaz

2 H 2O 2 -> -» eatalaz

0 2 + JJ2Q

-* 2H20 + 0 2

H2O 2+ NADH + H+ - - pcroxitaz -* -* 2H20 + NAD+ Vi sinh vật kỵ khỉ chịu oxy có thể thiếu catalaz nhưng hầu hết luôn có superoxit dismutaz. Vi khuẩn kỵ khí chịu oxy Lactobacillus pỉantarum dùng ion Mn2+ thay thể SOD để phân giải gốc tự do của superoxit. Tất cả các vi sinh vật kỵ khỉ bắt buộc đều không có hai loại enzym nói trên hoặc có với nồng độ rất thấp và do đó không có năng lực chổng, chịu được với oxy. Vì vi sinh vật hiếu khí cần O2, trong khi vi sinh vật kỵ khí lại bị chết vì O2, cho nên việc nuôi cấy hai nhóm này phải bằng các phương pháp hoàn toàn khác nhau. Lúc nuôi cấy khối lượng lớn vi sinh vật hiếu khí phải nuối cấy trên máy lấc hay phải thổi không khí vô khuẩn vào bình (hay nồi) nuôi cấy. Còn khi nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí thì phải loại bỏ hết O 2. Có thể dùng các phương pháp sau đây: - Sử dụng môi trường kỵ khí đặc biệt, có chứa các chất khử như thioglycolat hay cystein. Khi chế tạo môi trường cần đun lên để làm tan các thành phần vả cũng đồng thời loại trừ hết O2 hòa tan trong môi trường. Khi đó vi sinh vật kỵ khí có thể mọc được lên trên bề mặt môi trường. - Nuôi cấy trong các tủ nuôi cấy kỵ khí (anaerobic work chamber) đã hút chân không và bổ sung băng khí nitơ. Thường còn cần bổ sung cả khí CO2 bời vì nhiều vi khuẩn kỵ khi sinh trưởng tốt khi có tồn tại một lượng nhỏ khí CO2. 77

Một phương pháp rất phổ biến khi nuôi cây một lượng nhò vi sinh vật kỵ khí là dùng bình kỵ khí (Gas Pak jar). Trong hệ thống này lợi dụng Hz và chât xúc tác palladium để làm cho 0 2kết hợp với H 2 tạo thành nước để không có 02 trong môi trường. Các chất

khử đưa vào môi trường thạch cũng có thể giúp loại bỏ Ơ 2.

Hình ỉ 4. Ị 7/ Nuôi cạy vỉ sinh vật kỵ khí trong các bình kỵ khí. (Theo sách cùa Prescott,Harley và Klein').

Chỗ chứa chắt xúc tác p&Uadium

Túi Gas Pak (khi cho HUÓCbào sẽ giải phóng ĩa H -2V ÌC 02)

Bịt miếng đệm cao su

CHất chi thị màu (khi líliôĩig còn 0 2 thi Methylene 'blue sẽ mất màu)

-

Có thể đùng túi nhựa để tạo ra các môi trường kỵ khí khi nuôi cấy một lượng nhỏ các vi sinh vật kỵ khí. Trong túi nhựa chứa CaC03 và chất xúc tác để tạo ra điệu kiện kỵ khí giàu CO2. Một dung dịch đặc biệt được đưa vào túi nhựa sau đỏ đưa hộp lồng (hộp Petri) hay các dụng cụ nuôi cấy khác vào và hàn kín túi nhựa lại. Tùy từng trường hợp cụ thê mà sử dụng các phương pháp nuôi cẩy kỵ khí khác nhau.

78

14.4.5 Áp suất (Pressure) Phần lớn vi sinh vật có thể sống trên lục địa hay trên bề mặt nước, là những nơi có áp suất không khí là 1 atm (atmosphere) và không chịu ảnh hưởng rõ rệt gì của áp suất này .Nhưng đáy biển (nơi có độ sâu 1000m trở lên) lại chiếm đến 75% thế tích đại dương. Ờ những nơi đỏ áp suất cao đến 600-1000atm, nhiệt độ lạnh tới 2-3°C. Trong môi trường cục đoan (extreme) như vậy vẫn có một số vi sinh vật thích ứng để tồn tại, Phần lớn thuộc về nhóm chịu áp (barotolerant). Tuy áp suất tãng lên cao sẽ có ảnh hưởng đến chúng, nhưng ảnh hưởng bất lợi này nhỏ hơn nhiều khi so với các vi sinh vật không chịu áp (nontolerant). Một số vi khuẩn sống ừong đường tiêu hóa cùa những động vật không xương sống ở dưới biển sâu (như am phi pods và holothurians) là những vi khuẩn ưa áp (barophilic). Chúng sinh trường càng nhanh trong điều kiện áp suất cao. Chúng có vai trò quan trọng trong vòng tuần hoàn các chất dinh dưỡng dưới đáy biển. Tại khe biển Mariana gần Philippine (sâu khoảng 10.500m) người ta đã phân lập được những vi khuẩn ưa áp có thể sinh trưởng trong điều liện 2°c với áp suất khoảng 400-500 atm. Nhừng vi khuẩn này hiện đã biết là thuộc về các chi Photobacterhim, Shewanella, Coiwellia..Mội số thuộc về Cổ khuẩn vừa ưa áp vừa ưa nhiệt (thermobarophiles), chẳng hạn như Pyrococcus spp., Metanococcus jannasschi... 14.4.6. Bức xạ (Radiation) Thế giới mà chúng ta đang sống đầy các loại bức xạ điện từ trường (electromagnetic radiation). Các bức xạ này hình thành như sóng trên mặt nước và lan truyền trong không khí. Cự ly giữa hai đỉnh sóng hay cuối sóng được gọi là độ dài sóng (wavelength). Khi độ dài sóng giảm đi thì thì năng lượng bức xạ tăng lên. Tia gamma hay tia X có năng lượng cao hơn bức xạ của ánh sáng nhìn thấy (ánh sáng khả kiến) hay tia hồng ngoại. Bức xạ điện từ trường còn giong như một dòng năng lượng hợp bởi các photon (quang từ). Mỗi photon đều cỏ năng lượng nhất định, năng lượng cao hay thấp quyết định bởi độ dài sóng của bức xạ. Ảnh sáng mặt trời là nguồn búc xạ chủ yểu trên trái đất, bao gồm ánh sảng khà kiến (visible light), tia tử ngoại (ultraviolet), tia hồng ngoại (infraded rays) và sóng radio (vô tuyến điện). Ánh sáng khả kiến là loại thường thấy và quan trọng nhất trong môi truờng chung quanh chúng ta: mọi sự sống đều phụ thuộc vào các cơ thể có khả năng quang hợp dựa vào năng lượng của mặt trời. Bức xạ mặt trời có 60% nàm ờ vùng tia hồng ngoại chứ không phải ở vùng ánh sáng khả kiến. Tia hồng ngoại là nguồn nhiệt lượng chủ yểu của trái đất. Ở tầm mặt biển chi thấy có rất ít bức xạ tử ngoại 290-300nm (nanometre). Tia tử ngoại có bước sóng thấp hơn 287nm hấp thụ bời oxy trong không khí và tạo ra tầng ozon (O3) ở độ cao cách mặt đẩt khoảng 25-50km. Tầng ozon hấp thụ các tia từ ngoại bước sóng tương đổi dài và giải phóng ra O2. Bởi vì tia tử ngoại rất cỏ hại cho sinh vật nên việc tầng 79

ozon tiêu trừ bớt tia tử ngoại là có tác dụng rất quan trọng đối với sự sông trên trái đât. Vỉ các loại bước sóng trong ánh sáng mặt trời phân bố đồng đều trong phạm vi ánh sáng khả kiến cho nền ta thấy ánh sáng mặt trời cơ bản có màu “trắng”. Nhiều bức xạ điện từ trường là rất có hại đối với vi sinh vật, nhất là các bức xạ có bước sóng ngắn, cao năng lượng là các bức xạ ion hóa (ionizing radiation), chúng làm nguyên tử mất đi điện tử (electron) hoặc ion hóa (ionize). Có hai loại bức xạ ion hóa. Một là, tia X tạo ra bởi con người, hai là,tia gamma ( tia y) sinh ra trong quá trình tan rã các đồng vị phóng xạ (radioisotope). Bức xạ ion hóa mức thấp sẽ làm sản sinh các đột biến (mutations) và gián tiếp làm chết vi sinh vật. Bức xạ ion hóa cao sẽ trực tiếp giết chết vi sinh vật. Mặc dầu vi sinh vật cỏ tính đề kháng cao hơn về các bức xạ ion hóa so với các sinh vật khác, nhưng với liều lượng đủ cao chúng sẽ giết hết vi sinh vật. Chính vì vậy có thể đùng bức xạ ion hỏa để diệt khuẩn. Tuy vậy, một số sinh vật nhân nguyên thủy (như vi khuẩn Deìnococcus radiodurans và các vi khuẩn sinh vật sinh bào tử) có thể vẫn tồn tại được ngay cả ở các mức bức xạ ion hóa khá cao. Bức xạ ion hóa gây cho tế bào rất nhiều biến hóa, có thể phá võ liên kết hudrogen, oxy hóa liên kết đôi, phá hủy cấu trúc vòng, cao phân tử hóa một sổ phân tử.Oxy có thể làm tăng các hiệu ứng này, có thể là do việc sản sinh gốc tự do hydroxyl (OH-)... Mặc dầu có rất nhiều thành phần tế bào chịu ảnh hưởng, nhung nguyên nhân quan trọng nhất gây chết là sự phá hủy ADN. Vì bước sóng ngắn (10-400nm) có năng lượng cao cho nên bức xạ từ ngoại (Ultraviolet radiation) có thể tiêu diệt các loại vi sinh vật. Bức xạ tử ngoại (UV) mạnh nhất ở bước sóng 260nm. Chủng dễ bị ADN hấp thụ, làm cho trên 1 sợi đơn ADN hình thành những song phân tử (dimers) thymine, chúng làm ức chế quá trình tái tạo (replication) và công năng của ADN. Thiệt hại này có thể được sửa chữa qua một số con đường. Theo con đường quang hoạt hóa một loại enzym quang hoạt hỏa sử dụng ánh sáng xanh lam để tách song phân tử thymine. Trong hoạt hóa tối một đoạn ngắn ADN có chứa các song phân tử thymine có thể bị cắt rời và đổi chỗ để thành một đoạn ADN bình thường. Thiệt hại này cũng có thê sửa chữa nhờ các protein recA trong quá trình tái tổ hợp (recombination) hoặc quả trình SOS. Thiệt hại không có thể được khác phục nếu như liều lượng u v quá lớn, tạo nên những tổn thất quá nặng. Mặc dau bức xạ ƯV quá nhỏ (thap hơn 290 và 300nrn) khó cỏ thể lọt xuống bề mặt trai đat, bưc xạ u v nhưng bước sóng 325-400nm cũng có thể gây hại cho vi sinh vật. Chúng phân cắt tryptophan thành những quang sản phẩm (photoproducts) độc hại. Những sản phẩm này tác đụng đồng thời với các bức xạ gần từ ngoại làm phá vỡ sợi ADN. Cơ chế cụ thể của tác đụng này không giống với cơ chế tác dụng của ƯV với bước sóng 260nm.

80

Tù gama -*------- — ---► Tia 7X ^ ......

, Sóng—vô tuyên điên ■< . — .....

■— » ■

Tia tữ ngoại

»

TU hồng ngoại

0.01

1.0

Buóc sóng (nm)

200

310

.100 101yio* /

400

500

I

i

I

-*--- 7--+■ '

I

Anil sing nhìn thẵy

To-‘

! I

!

10*

10*

\

600

700

800

900

Buớc sóng (rnn)

Hĩnh 14. ỉ 8: Phạm vi birớc sóng cùa các bức xạ điện từ trường- Phần ánh sáng khá kiến được trình bây phía dưêrị.Theo sách cùa Prescott,Harley và Klein). Ánh sáng khả kiến là nguồn năng lượng chủ yếu của quá trình quang họp (photosynthesis) vì vậy rất cần cho các sinh vật. Nhưng nếu ánh sáng khả kiến quá mạnh sẽ có thể gây hại hay làm chết vi sinh vật. Tham gia vào quá trình này có một loại sắc tố gọi là chất quang mẫn (photoznsitizers) và oxy. Các sắc tố ở vi sinh vật như chlorophyl, bacteriochlorophyl, cytocroms,và flavin có thể hấp thụ ánh sáng mặt trời và bị kích hoạt tạo ra các chất quang mẫn. Các chất quang mẫn (P) khi bị kích hoạt có thể chuyển năng lượng cho Ơ 2 để làm ra oxy đơn - singlet oxy ( O 2). Ánh sáng -

P—— — — —-* p (hoạt tính) p hoạt tỉnh + 0 2 — * p + 102 Oxy đơn là chất có hoạt tính rất mạnh, là chất oxy hóa mạnh có thể phá hủy nhanh chỏng tế bào, chúng cũng là nhân tố chủ yếu được các đại thực bào (phagocytes) dùng để diệt khuẩn. Nhiều vi sinh vật ừong không khí hoặc sống ưên bề mặt các vật tiếp súc với không khí sử dụng sắc tổ carotenoit để bảo vệ chống lại với quang oxy hóa (photooxitation). Carotenoit có thể làm phá hủy các oxy đơn, hấp thu năng lượng của oxy đơn và biến thành

81

trạng thái phi hoạt tinh. Cả các vi sinh vật quang hợp lẫn vi sinh vật không quang hợp đêu sử dụng sắc tố vào mực đích này. 14.5. S ự SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẶT TRONG MÔI TRƯỜNG T ự NHIÊN 14.5.1. Các nhân tố của môi trường làm hạn chế sự sinh trưởng Môi trường sinh sống của vi sinh vật là phức tạp và thường xuyên biển đổi.Vi sinh vật đặc trưng cho mỗi môi trường cụ thể bị bao bọc bởi sự biến đổi của các chất dinh dưỡng và các nhân tố môi trường khác. Đúng là vi sinh vật đã sinh trường trong một màng sinh học (biofilm), v i sinh vật sinh trưởng trong một “vi môi trường” (microenvironments) cho đến khi môi trường hay các nhân tố dinh dưỡng đạt tới sự sinh trưởng giới hạn. Nguyên tắc lượng tối thiểu của Liebig xác định ràng: tồng sinh khối của một cơ thể quyết định bời sự có mặt của chất dinh dưỡng với nồng độ thấp nhất theo nhu cầu của cơ thể. Nguyên tắc này có thể phù hợp cho điều kiện phòng thí nghiệm cũng như trong môi trường đất và nước. Sự tăng lẽn của một nhân tổ dinh dưỡng cần thiểt (chẳng hạn như photphat) sẽ làm tăng lên quần thể vi sinh vật cho đển khi một sổ nhân tổ dinh dường khác trở thành nhân tổ giới hạn. Nếu một chat dinh dưỡng nào đó là giới hạn thì tăng các nhân tổ dinh dưởng khác không có ích lợi gỉ. Tình hình thực tế còn phức tạp hơn thể nữa. Nhiều nhân tổ giới hạn cỏ thể ảnh hưởng thường xuyên lên quần thể vi sinh vật, chẳng hạn như nhiệt độ, pH, ánh sảng, nồng độ muối... Định luật chổng chịu của Shelford (Shelford’s law of tolerance) xác định: vi sinh vật có một yêu cầu nhất định đối với các nhân tố môi trường, Thấp hay cao hơn yêu cầu này thỉ vi sinh vật không thể tồn tại và sinh trưởng mặc dầu vẫn có đầy đủ các chất dinh dưỡng. Chẳng hạn mỗi vi sinh vật có một phạm vi nhiệt độ sinh trưởng nhất định. Cũng tương tự như vậy đối với pH, nồng độ oxy, nồng độ muối... Sự sinh Ưưởng của vi sinh vật phụ thuộc vào cả sự cung cấp chất dinh dưỡng lẫn khả năng chổng chịu với các điều kiện của môi trường. Khi vi sinh vật có đủ điều kiện dinh dưỡng để sinh trưởng mạnh mẽ thỉ cũng đồng thời sinh ra các chất thải có hại và làm hạn chế sự sinh trưởng của chúng. Đáp ứng với mức dinh dường thấp (môi trường nghèo - oligotrophic environments) và cỏ sụ cạnh tranh, nhiều vi sinh vật đã chiếm đoạt thức ăn và khai thác chúng để làm nguồn cạnh tranh. Vi sinh vật thường biến đổi hinh thái để làm tăng bề mặt và năng lực hấp thu chất đinh dưỡng. Các vi sinh vật nhân nguyên thủy hỉnh que biến thành dạng ‘mini hay “ultramini” (siêu nhỏ) hoặc mọc ra các cải cuổng (prosthecate) để đáp ứng với tinh trạng thiêu thức ãn. Sự thieu hụt chât dinh dưỡng sẽ dẫn đến nhiều biến đổi ở vi sinh vạt, chăng hạn chúng có thê từng bước khép lại hoạt động của các gen liên quan đến trao đôi chất, trừ việc duy trì “gen quản gia” (housekeeping gen).

Nhiều nhân tố có thể làm cải biến mức dinh dưỡng trong môi trường nghèo. Chảng hạn vi sinh vật có thể tách các chất dinh dưỡng hạn chế ra (như là sắt) khiến không còn sắt để cạnh tranh nữa. Không khí cũng có thê cung cấp chất dinh dường giúp cho sự sinh trưởng của vi sinh vật. Điều này có the thấy được trong phòng thí nghiệm cũng như ngoài thiên nhiên. Đã phát hiện thấy chất hữu cơ trong không khí có thể xúc tiển sụ sinh trưởng của ví sinh vật trên môi trường pha loãng (dilute media). Môi trường sinh trưởng được làm giàu bằng chất hữu cơ trong không khí cũng có thể làm tăng rõ rệt sự phát triển của quần thể vi sinh vật. Ngay trong nước cat- thường chứa dấu vết chất hữu cơ, cũng có thể hấp thu những hợp chất 1 cacbon từ không khí để giúp cho sự sinh trưởng vùa vi sinh vật. Sự tồn tại các chất dinh dường trong không khí và tình trạng sinh trường của vi sinh vật, nếu không xem xét đến sẽ có thể ảnh hưởng đến các thực nghiệm về sinh hóa học hay sinh học phân tử, cũng như các nghiên cứu về sự sinh trưởng của vi sinh vật trong các môi trường dinh dường nghèo (oligotrophic). Các chất tự nhiên (natural substances) cũng có thể ức chế trực tiếp tới sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật trong các môi trường đinh dưỡng thấp. Các chất đó bao gồm phenol, tannin, amoni, etyỉen, và các hợp chat sulfua bay hơi. Đây cỏ thể là một phương thức giúp vi sinh vật tránh tận dụng các năng lượng giới hạn trước khi được cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết. Các hóa chất này là rất quan trọng trong bệnh lý học thực vật và có thể giúp khống chế các bệnh vi sinh vật trong đất. 14.5.2. Kiểm tra số lượng vi sinh vật nhân nguyên thủy tuy sổng nhưng không nuôỉ cấy được Khi nghiên cứu sự sinh trưởng của quần thể vi sinh vật nhân nguyên thủy (procariotic) trong thiên nhiên bên ngoài phòng thí nghiệm cần phài xác định số lượng vi sinh vật sống. Trong lịch sử vi sinh vật học thuờng người ta định nghĩa vi sinh vật sống là có thể sinh trưởng, có thể hình thành khuẩn lạc (colony) hoặc tạo ra độ đục rõ rệt trên môi trường dịch thể. John R.Postgate ở Đại học Sussex (nước Anh) ỉà một trong những học giả đầu tiên xác định vi sinh vật chịu ức chế (stressed) khi sống trong môi trường thiên nhiên, hoặc trong nhiều môi trường phòng thí nghiệm đặc biệt, là đặc biệt mẫn cảm với các ức chế thứ sinh (secondary stresses). Các ức chế này làm cho vi sinh vật tuy sống nhưng không có thể tạo thành khuẩn lạc trên các môi trường đặc bình thường vẫn dùng để nuôi cấy chúng. Đe xác định được sự sinh trưởng của các vi sinh vật này Postgate đưa ra một phương pháp thực nghiệm gọi là thí nghiệm vi hoạt tính Postgate (Postgate Microviability Assay). Trong thí nghiệm này đem vi sinh vật nuôi cấy trên lóp mặt thạch mỏng dưới lá kính (coverslip), làm cho chúng không qua được giai đoạn sinh trưcmg đơn bào mà chì biến đổi hình thái tế bào, coi đó là biểu hiện tín hiệu sống (life signe). 83

Từ đó, nhiều nhà nghiên cứu phát triển các phương pháp hiển vi mẫn cảm và phương pháp chất đồng vị để xác định sự tồn tại và ý nghĩa của dạng vi khuân sông nhưng không nuôi cấy được. Chảng hạn dùng kháng thể huỳnh quang và thuốc nhuộm acridin orange để đánh giá mức độ số lượng; hoặc là dùng phương pháp sô lượng khả năng tôi đa (MPN-most probable number)...Việc sử đụng chỉ sổ giải phóng hoạt tính phóng xạ của vật chất tế bào cũng được dùng để xác định ảnh hưởng của hiệu ứng ức chế đối vói vi sinh vật. Các phương pháp do Postgate đề ra là rất quan trọng. Nhiều nghiên cứu cho thấy cỏ khi một số vi khuẩn như Escherichia coli, Vibrio cholerae, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogens, Enterococcus faecalis mất năng lực sinh trưởng trên các môi trường phòng thí nghiệm theo các kỹ thuật nuôi cấy tiêu chuẩn, nhưng chủng vẫn giữ vai trò gây bệnh truyền nhiễm. Tình trạng một quần thể hỗn hợp ừong môi trường thiên nhiên là rất phức tạp. Thông thường chỉ có khoảng 1-10% các tế bào là có thể hình thành khuẩn lạc. Trong tương lai cỏ thể phải tìm ra các môi trường nuôi cấy thích hợp hơn đối với các vi sinh vật còn chưa được biết đến. Hiện nay người ta đã sử dụng kỹ thuật PCR và phàn tích ARN cùa tiểu thể riboxom để đánh giá tính đa dạng của quần thể các vi sinh vật chưa nuôi cấy được. 14.5.3. Cảm ứng m ật độ và các quần thề vì sinh vật Từ nhiều thập kỷ nay, các nhà vi sinh vật học vẫn nghĩ ràng quần thể vi sinh vật là tập hợp của các cá thể riêng biệt, sinh trưởng và hoạt động độc lập với nhau. Tuy nhiên gần đây người ta đã phát hiện thấy nhiều vi khuẩn có khà năng giao tiếp và hoạt động hợp tác với nhau. Một trong những cách cơ bản để vi sinh vật hợp tác được với nhau đó là cảm ứng mật độ hay còn lại là sự tự cảm ứng. Đó là hiện tượng trong đó vi sinh vật tự điều chỉnh mật độ thông qua quá trình cảm nhận hàm lượng các phân tử tín hiệu, đôi khi gọi là các chất tự cảm ứng (autoinducer) bởi vì chúng có thể kích thích tế bào tiết ra chúng. Nồng độ các phân tử tín hiệu tăng lên cùng với sự tăng lên của sổ lượng vi khuẩn trong quần thể cho đên khi đạt đên ngưỡng đặc trưng (đôi với quần thể đó) và ra tín hiệu cho vi khuẩn rằng mật độ quần thể đã đến mức tới hạn hay còn gọi là ’’quorum”. Vi khuẩn lúc đó sẽ bắt đầu biểu hiện các gen phụ thuộc mật độ tế bào tới hạn nhằm điều chỉnh mật độ tế bào. Câm ứng mật độ đã được phát hiện ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương. Cam ứng mật độ cỏ ý nghĩa quan trọng với vi sinh vật. Có thể lấy ví dụ về sự sinh tông hợp và giải phóng các enzym ngoại bào. Nêu các enzym này chỉ được giải phóng nhờ một số ít vi khuẩn, chúng sẽ bị khuếch tán và không phát huy được tác dụng do bị pha loãng. Với cách điều khiển bàng cảm ứng mật độ, vi khuẩn sẽ đạt đến mật độ quần thể lớn trước khi chúng giải phóng enzym và kết quà là hàm lượng enzym đủ lớn để phát huy tác dụng. Đo chính là lợi thê của vi sinh vật trong cơ thể vật chủ cũng như trong các môi trường đât, nước. Nếu vi sính vật gây bệnh có thể đạt được đển nồng độ đủ lớn tại một

84

điểm nào đó trên cơ thể vật chủ trước khi sản sinh các nhân tố độc lực và xâm nhập được vào các mô vật chủ, chúng sẽ có cơ hội lớn hơn trong việc làm mất tác dụng khả năng tự vệ của vật chủ và do đó có thể lan ra toàn bộ cơ thể vật chủ. Điều này giải thích một kiểu khác của cám ửng mật độ. Dường như cảm ứng mật độ rất quan trọng đoi với nhiều vi sinh vật trong việc thiết lập mối quan hệ cộng sinh hay ký sinh đối với vật chủ.

H Chuỗi Acyl

Homosefin«

tactone fa) «i m

•

ỉ »

•

* ■ * HSLS

KSLS

ỉ

•

Ỵ

Acyl HSL

Ị

synthase

ả - v\

%

•

•

Các pioiíin phạ thuộc mật độ lá bào lới hạn

\\ / /

1 DNA-................ — flj)

N

1

mRNA

—_

.

Hình 14. ỉ 9; Cam ìmg mật độ ờ vi khuẩn Gram âm. ịTheo sách của Prescott,Harley vờ Klein), (a) Cẩu trúc chung cùa acyl homozrinee ỉacton, chất đuực biết đến như là tín hiệu cùm ứng một độ (điều chinh mật độ tế bào) hay còn gợi là chất tự càm ứttg. (b) Lược đồ mink họa cách hoợl động của cám ứng mật độ ờ nhiều vi khuấn gram âm. Các protein thụ thế hoại động với vai trò chất cảm ímg (inducer) được ký hiệu bằng chữ R. Đường kè gãy nét biêu thị acyl HSL synthaz không phái lúc nào cũng được tạo ra tương ímg với các chai tự cảm ứng. Cảm ứng mật độ được phát hiện đầu tiên và tìm hiểu rõ nhất ở vi khuẩn Gram âm. Các tín hiệu thường gặp nhất ở vi khuẩn Gram âm là acyl homozrinee lactons (HSLs). Đó là các phân tử nhỏ được cẩu tạo bởi chuỗi acyl từ 4 đến 14 c liên kết với homozrinee lacton (hình Ỉ4.Ỉ9). Chuỗi acyl này có thể có nhóm keto hay nhóm ở vị trí c thứ 3. Các

phân tử Acyl HSLs khuếch tán vào các tế bào đích {target cell) {hình ỉ 4.19). Khi đạt đôn hàm lượng đù lớn, các phàn từ Acyl HSLs sẽ bám vào các protein thụ thể đặc biệt (R) và gây ra sự thay đổi cấu trúc protein. Thông thường khi phức hệ HSLs-protein được hoạt hóa, chúng có tác dụng như chất cảm ứng, chúng bám vào các điểm đích trên ADN và kích thích sự phiên mà của các gen nhạy cảm với nồng độ tê bào tới hạn. Các gen cân thiêt đê tổng hợp HSL cũng được tạo ra thường xuyên, đo đó nhiều chất tự càm ứng được tổng hợp và giải phóng, Ỏ vi khuẩn Gram âm, rất nhiều quá trinh nhạy cảm với các tín hiệu acyl HSL và cảm ứng mật độ. Một số ví dụ đã được nghỉên cứu kỹ đó là (1) sự sản sinh chất phát quang sinh học (bioluminescence) bởi Vibrio fischeri, (2) Pseudomonas aeruginosa tổng hợp và giải phóng các yếu tố gây bệnh, (3) Sự chuyển các yếu tố di truyền nhờ quá trình tiếp hợp ở Agrobacterium tumefaciens, và (4) Sự sản xuất kháng sinh ở Erwinia carotovora và Pseudomonas aureofaciens. Vi khuẩn Gram dương cũng điều hòa hoạt động bằng cảm ứng mật độ, thông thường bằng tín hiệu là cảc oligopeptít. Các ví dụ điển hình đó là sự tiếp họp ờ Enterococcus faecalis, kích thích khả năng tải nạp ADN (competence induction) ở Streptococcus pneumoniae, sự kích thích tạo bào tử ở Bacillus snbtỉỉỉs, và sự sản sinh rất nhiều độc tố và các yếu tố gây bệnh ở Staphylococcus aureus. Cảm ứng mật độ thậm chí kích thích sự phát triển khuẩn ty khí sinh và tạo streptomycin ở Streptomyces griseus. Đối với trường họp của Streptomyces griseus thì có lẽ tín hiệu là y-butyrolaton chứ không phải là oligopeptit. Chức năng quan trọng nữa đáng quan tâm của cảm ứng mật độ đó là sự đẩy mạnh việc tạo màng sinh học (biofiim) bởi vi khuẩn gây bệnh Pseudomonas aeruginosa, và có thể nó đóng vai trò quan ừọng ừong bệnh xơ hóa u nang (crystic fibrosis). Sự tạo màng sinh học rất có ý nghĩa đối với vi sinh vật gây bệnh vì nó bảo vệ vi khuẩn khỏi sự tấn công của kháng sinh và các chất tẩy rửa. Sự điều chỉnh mật độ tể bào có thể rất hiệu quả bên trong màng sinh học do hàm lượng acyl HSL ít bị pha loãng và có thể tăng lên nhanh chỏng. Trong điều kiện này, hai loại vi khuẩn khác nhau có thể kích thích nhau bàng cách sàn xuất ra các tín hiệu tương tự nhau, đó là trường hợp màng sinh học có chứa các vi khuẩn gây bệnh p. aeruginosa và Burkhoderia cepacia. Cảm ứng mật độ là một ví dụ về sự hoạt động đa tế bào trong đó các cá thể giao tiếp và hợp tác hoạt động như là một đom vị thổng nhất. Các ví dụ khác về hoạt động phức hợp như ưên đó là sự hình thành các dạng khuẩn lạc và sự hình thành thể quả ở Niêm vi khuẩn {Myxobacteria).

Chương 15

ứ c CHÉ VI SINH VẬT BẰNG CÁC TÁC NHÂN VẬT LÝ VÀ HÓA HỌC

Mặc dầu đa số vi sinh vật là có ích và cần thiết cho nhân loại, nhưng hoạt động của vi sinh vật cũng có thể gây nên nhiều tác hại cho con người. Chẳng hạn như việc gây nên các bệnh tật cho người, gia súc, gia cầm, việc làm hư hỏng thực phẩm, nguyên vật liệu... Vì vậy chúng ta phải nắm vững các phương pháp để tiêu diệt hoặc ức chế các vi sinh vật có hại, làm giảm bớt các thiệt hại do chúng gây nên. Chủ yếu lả : (1) - Tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh và càn trở sự lan truyền của chúng. (2) - Giảm bớt hoặc hạn chế các vi sinh vật gây ô nhiễm nguồn nước, thực phẩm và phá hủy các nguyên vật liệu khác. Trong một thời kỳ rất dài, từ khi chưa biết đến sự tồn tại của vi sình vật thỉ tổ tiên chúng ta đã biết không ít các biện pháp để tiêu độc và diệt khuẩn. Người cổ Ai Cập đã biết dùng lửa để diệt khuẩn, dùng các chất tiêu độc để xử lý các vật thối rữa. Người c ổ Hy Lạp đã biết cách xông sulfiia để bảo quản các vật liệu kiến trúc. Người Hê-Brơ (Hebrews) đà có luật thiêu hủy toàn bộ quần áo của những người bị bệnh hủi. Hiện nay, việc nắm vững các kỹ thuật tiêu diệt vi sinh vật vẫn hết sức quan trọng, chẳng hạn như việc sử dụng kỹ thuật vô khuẩn trong nghiên cứu vi sinh vật, việc bảo quản lương thực, thực phẩm, việc phòng chống các bệnh truyền nhiễm... 15.1. ĐỊNH NGHĨA THUẬT NGỮ - Diệt khuẩn hay Khử trùng (sterilization): Từ gốc La Tinh sterilis là tuyệt dục, vô sinh. Cỏ nghĩa là tiêu điệí tất cả vi sinh vật, bào tử, virut, viroid. Để diệt khuẩn cỏ thể dùng các chất diệt khuẩn (sterilant) hoặc dùng các nhân tố vật lý khác. - Tiêu độc hay Khử độc (disinfection) là tiêu diệt, ức chế hoặc loại trừ các vi sinh vật gây bệnh... Mục tiêu chủ yếu là tiêu diệt mầm bệnh nhưng trên thực tể cũng là làm giảm số lượng chung của vi sinh vật. Để tiêu độc cần dùng các chất tiêu độc (disinfectant). Đỏ thường là các hóa chất và thường dùng để tiêu độc các vật liệu không phải là cơ thể người

87

và động thực vật. Các chất tiêu độc không diệt được bào tử và một sô vi sinh vật, vì vậy không thể dùng để diệt khuẩn. -Tiêu độc vệ sinh (sanitization) có liên quan mật thiết với tiêu độc. Trong quá trình tiêu độc vệ sinh số lượng vi sinh vật giảm xuông tới từ mức an toàn trở xuông đôi VỚI sức khỏe công cộng, tức là đạt đến tiêu chuẩn vệ sinh. Các chất tiêu độc vệ sinh (sanitizer) thường được dùng để làm sạch môi trường và các vật dụng không phải cơ thê người và động thực vật. - Phòng thối (antisepsis) là dùng hóa chất để khổng chế vi sinh vật sự sinh trưởng của vi sinh vật trên các tổ chức sinh vật (các mô). Gổc Hy Lạp , anti là đối kháng, sepsis là nhiễm trùng máu. Chất phòng thối (antiseptic) nhiều người gọi là chất sát trùng là chưa chính xác, đễ nhầm với chất diệt khuẩn (sterilant). Sử dụng chất phòng thối để phòng nhiễm khuẩn, mưng mủ nhờ tiêu diệt hay ức chế vi sinh vật gây bệnh, ngăn ngừa sự sinh trưởng cùa vi sinh vật trên các mô của sinh vật, giảm thiểu tổng số vi sinh vật. Độc tính của chất phòng thối thấp hơn chất tiêu độc là vì cần tránh việc làm chết quá nhiều tế bào của các mô. - Chất kháng vi sinh vật (antimicrobial agent) được chia thành nhiều loại. Chất diệt khuẩn (germicit), gốc La Tinh cide là giết chết, là chất có thể tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh (pathogens). Như vậy tiếng Việt có hai chừ Chất diệt khuẩn để chỉ cả germicit lẫn sterilant. Thực chất các chất nảy cũng gần giống nhau, sterilant có phạm vi diệt khuẩn rộng hơn germicit. Các chẩt diệt nấm (fungicide), chẩí diệt tảo (algicide), chất diệt virut (viricide) để chi các chất tiêu diệt từng đối tuợng riêng biệt. Có nhừng hóa chất không làm chết được vi sinh vật nhưng có thể ức chế sự sinh trưởng của chúng. Có thể thường gặp các chất úc chế vi khuẩn (bacteriostatic), chất ức chế nẩm (fungistatic), theo gốc Hy Lạp thì statikos là đình chỉ. Tất cả cảc chất nói trên thường định nghĩa dựa trên ảnh hường đối với các vi sinh vật gây hại. Có loại giết chết, có loại ức chế, nhung trong hầu hết các trường hợp đều làm giảm tổng sô vi sinh vật nói chung (không chỉ riêng đối với các vi sinh vật gây bệnh). 15.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP TIÊU DIỆT VI SINH VẬT Dưới tác dụng của một số nhân tổ gây chết quần thể vi sinh vật không chết ngay toàn bộ. Giông như sự sinh trưởng của quần thể , sự chết của quần thể vi sinh vật thường xảy ra theo phương thức chỉ số (exponential) hay phương thức logarit (logarithmic). Có nghĩa là quân thê vi sinh vật sẽ giảm xuông tương ứng với khoảng cách thời gian. Lay thời gian gây chết là trục hoành ta có đuợc đường biểu thị là một đường thẳng. Sau khi giảm đa số vi sinh vật sống thì tốc độ chết của vi sinh vật cũng giảm. Đó là vì tính đê kháng khá cao của các vi sinh vật sống sót. 88

Báng 15.1: Thí nghiệm giết vì sinh vật bằng nhiệt theo lý thuyết (Theo sách của Prescott, Harley và Klein) Phút

Số lurợng vi sinh vật theo số p h ú t

s ố lư y n g vi sinh v ậ t bị chết tro n g 1 p h ú t

L o g I0 c ủ a sổ lư ọìig vi sinh v ậ t sổng

1

106

9

X

105

5

2

105

9

X

10*

4

3

104

9 X 103

3

4

103

9

X

102

2

5

102

9

X

10

ỉ

6

10’

9

0

7

1

0,9

-1

Để nghiên cứu hiệu lực của nhân tố gây chết phải xác định khi nào thì vi sinh vật chết. Đó là chuyện rất khó, vi khó xác định được đối với từng tế bào.Sau khi đưa vi khuẩn vào môi trường nuôi cay trong điều kiện có thể sinh trưởng bình thường mà thấy chúng không sinh trưởng được thì chứng tỏ ỉà chúng đã chết. Với virut nếu không cảm nhiễm được nữa vào vật chủ binh thường thì cũng chửng tỏ là đã chết.

Thòi giw xừ lý(múi)

Hình 1S.Ỉ: Phương thức chểt cùa vi sinh vật. (Theo sách cùa Prescott, Harley và Klein). Xừ lý ờ 12ỉ°c, trong vi dụ D 12 ỉ là trong 1 phút.

89

15.3. CÁC ĐIỀU KIỆN ẢNH HƯỞNG ĐÉN HIỆU QUẢ CỦA CÁC NHÂN TỚ KHÁNG VI SINH VẶT Làm chết và ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật không đơn giản, bời vi nhân tô kháng vi sinh vật (nhân tố làm chết hoặc ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật) là chịu ảnh hưởng của ít ra là 6 yếu tố sau đây: 1. Số lượng quàn thể vi sinh vật: Vì trong mỗi khoảng cách thời gian số lượng vi sinh vật chết theo một cấp số bằng nhau, cho nên thời gian làm chết một lượng lớn vi sinh vật sẽ đài hem so với một lượng nhò vi sinh vật. Có thể tham khảo sổ liệu ở bảng 15.1 và hình 15.1. Cùng nguyên lý như vậy đỗi với các nhân tố hóa học kháng vi sinh vật. 2. Thành phàn quần thể vi sinh vật: các vi sinh vật khác nhau có tính mẫn cảm khác nhau với một nhân tố gây chết: Vì vậy cùng một nhân tổ gây chểt trong các tình huống khác nhau, với các loài vi sinh vật khác nhau thì hiệu quả tác dụng cũng rẩt khác nhau. Ví dụ, bào tử của vi sinh vật có tính đề kháng cao hơn rõ rệt so với các tế bào dinh dưỡng và các tế bào non. Một số loài vi sinh vật có tính chống chịu cao hơn so với các ảnh hưởng bất lợi của các loài khác. Ví dụ vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis gây bệnh lao có tính chống chịu với các nhân tố kháng vi sinh vật cao hơn so với các vi khuẩn khác. 3. Nồng độ và cường độ của một nhân tố kháng vi sinh vật: Thông thường (không phải mọi trường hợp) nồng độ càng cao của một nhân tố hóa học hay cường độ càng cao của một nhân to vật lý làm cho tốc độ vi sinh vật chết càng nhanh. Nhưng hiệu suất của các nhân tố không phụ thuộc trực tiếp vào nồng độ và cường độ. Trong một phạm vi tương đối nhò thì một sự tăng nhỏ về nồng độ và cường độ cỏ thể làm tăng hiệu ứng gây chết cùa nhân tổ kháng vi sinh vật. Vượt qua khoảng xa hon thì tiếp tục nâng cao nồng độ và cường độ không làm tăng tổc độ gây chết vi sinh vật. Có lúc, ở nồng độ thấp hơn lại có hiệu quả cao hem, ví dụ cồn 70% cỏ hiệu quả diệt khuẩn cao hơn cồn 95%, bởi vì hoạt tính của chúng được nâng cao khi có mặt của nước. Có tài liệu cho ràng với nồng độ cồn cao phần protein bên ngoài tế bào vi khuẩn sẽ ngưng tụ lại làm thành một vỏ bọc che chở cho vi khuẩn. 4. Thời gian tác đụng: Thời gian tác đụng của nhân tố kháng vi sinh vật càng dài thì sô lượng vi sinh vật chêt càng nhiêu {hình J5.1). Đẻ đạt đến mục đích diệt khuẩn thì thời gian tác dụng phải đủ để cho tỷ lệ sổng sót chỉ còn 10'6 hoặc thấp hơn nữa. 5. Nhiệt độ: Tăng nhiệt cỏ thể làm tăng hiệu quả hoạt tính của hóa chất. Thông thường với một nông độ thâp của chât tiêu độc (disinfectant) hay nhân tố diệt khuẩn cần xử lý ờ nhiệt độ cao hcm. 6. Môi trường bên ngoài vi sinh vật: Việc khống chế quần thể vi sinh vật không tách rơi ma găn von cac nhân tô môi trường, hoặc lam tăng hay làm giảm tác động gây chết. Ví đụ trong đieu kiện axit, nhiệt độ cỏ hiệu quả diệt khuân cao hơn, do đó đối với các đồ uống 90

có tính axit như nước quả, nước cà chua thì dễ diệt khuẩn theo kiểu Pasteur (pasteurise) hơn so với các thực phẩm có pH cao hơn như là sữa chẳng hạn. Nhân tố môi trường quan trọng thứ hai là một số chất hữu cơ có thể bảo vệ vi sinh vật đề kháng với tác dụng cùa nhiệt độ hay của các chất tiêu độc hóa học. Màng sinh học (biofilm) là một vi dụ rất rõ. Các chất hữu cơ trên bề mặt của màng sinh học sẽ bảo vệ các vi sinh vật tạo thành màng sinh học, cho nên màng sinh học và các vi sinh vật trong đó rất khỏ trừ khử. Vì vậy trước khi diệt khuẩn hay tiêu độc một sổ vật phẩm trước hết cần rửa sạch. Đối vói ống tiêm và các dụng cụ y khoa hay nha khoa trước khi diệt khuẩn cần phải rửa sạch để tránh sự có mặt quá nhiều chất hữu cơ giúp bảo vệ cho mầm bệnh và làm tăng nguy cơ nhiễm khuẩn. Khi chế tạo nước uống cũng cần chú ý là nguồn nước thành phố vẫn còn chứa khá nhiều chất hữu cơ cho nên cần dùng nhiều cỉorit mới đủ sức tiêu độc. 15.4. SỬ DỤNG CÁC PHƯƠNG PHÁP VẬT LÝ ĐẺ KHỐNG CHÉ VI SINH VẬT Tăng nhiệt vả việc đùng các phương pháp vật lý khác thường được dùng để diệt khuẩn. Các phòng thí nghiệm vi sinh vật đều dùng các nồi hấp áp suất cao (autoclave) để diệt khuẩn. Tăng nhiệt, qua lọc, chiếu tia tử ngoại, dùng bức xạ điện ly là 4 phương pháp vật lý thường được sử dụng. 15.4.1. Tăng nhiệt Người Cổ Hy Lạp đã biết dùng lửa hay đun nước sôi để diệt khuẩn hay tiêu độc. Tăng nhiệt đến nay vẫn là phương pháp thường dùng nhất để diệt khuẩn. Chù yếu có phương pháp dùng sức nóng ẩm và sức nóng khô. Sức nóng ẩm dễ dàng gây chết virut, vi khuẩn và nấm (bảng 15.2). Trong nước sôi sau 10 phút có thể làm chết các tế bào dinh dưỡng và bào tử của các vi sinh vật cỏ nhân thực. Nhưng nhiệt độ sôi (100°C) không đủ sức làm chết nội bào tử của vi khuẩn. Bào tử vi khuẩn có thể tồn tại vài giờ trong nước sôi. Do đó cách đun sôi chỉ đùng để đun nước uống hoặc đề tiêu độc các vật phẩm không bị phá hủy trong nước sôi, không thể đùng để diệt khuẩn. Vì tẫng nhiệt là biện pháp rất quan trọng để khống chế vi sinh vật cho nên cần có một tiêu chuẩn chính xác đổi với hiệu suất diệt khuẩn bàng sức nóng (heat-killing efficiency). Trước đây đùng điểm gây chết đo nhiệt (thermal death point, TDP). Đó là nhiệt độ thấp nhất đủ để diệt hết vi sinh vật trong dịch huyền phù (suspention) sau 10 phút. Nhưng vì vi sinh vật chết theo phương thức logarit, cho nên trên lý thuyết không có thể tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật ừong một mẫu vật, tức là phải kéo dài thời gian tăng nhiệt. Vì vậy có một phương thức biểu thị chính xác hơn và đã được tiếp nhận rộng rãi, đó là Thời gian giảm thiểu thập phân (decimal reduction time, D) hoặc gọi là Trị số D (D value). Trị so D là thời gian cần thiết để diệt hết 90% vi sinh vật hoặc bào tử trong một mẫu vật ờ một nhiệt độ 91

nhất định. Trên một đồ thị bán logarit (semilogarithmic plot) thấy rõ sô lượng vi sinh vật biến đổi theo thời gian tăng nhiệt {hình Ị5.2). Bảng 15.2: Điều kiện ước chừng để diệt khuẩn bằng sức nóng ẩm Vi sinh vật Nấm men Nấm sợi Vi khuẩn

Te bào đinh dưỡng 5 min., 50-60°C 30 min., 62°c 10min.,60-70°c

Virut

30 min., 60°c

Bào tử 5 min., 70-80°C 30 min., 80°c 2-trên 800 min., 100°c 0,5-12 min, 12ĩ°c

(Theo sách của Prescott,Harley và Klein) Trị số D là thời gian cần thiết để số lượng vi sinh vật giảm 10 lần. Trị số D liên quan đến tính đề kháng của vi sinh vật đối với các nhiệt độ khác nhau. Từ trị số D mà tính ra trị sổ z (Z value). Trị số z là nhiệt độ tăng lên đủ để làm giảm 1/10 trị số D. Một cách biểu thị khác là trị số F (F value) đó là thời gian cần thiết (tính bằng min.) đủ để diệt hết một quần thể tế bào hoặc bào tử ở một nhiệt độ nhất định (thường là 121°C).

Nhiệt độ (X} Hình 15.2: Tinh toán trị số z. 92

Trị số D và trị số z được ứng dụng rộng rãi trông công nghiệp chế biến thực phẩm. Khi sản xuất đồ hộp cần xử lý nhiệt sau khi đưa thực phẩm vào hộp và hàn hộp lại. cần xử lý nhiệt để đủ mức diệt được vi khuẩn gây ngộ độc thịt Clostridium botulinum. Vi khuẩn nảy gây ra độc tố botulism rất nguy hiểm. Xử lý nhiệt độ đủ dài để làm cho số lượng bào từ của vi khuẩn này nếu có từ 1012 giảm xuống chi còn 1 bào tử (10°). Trị số D đối với bào tử vi khuẩn này ờ 121°c là 0,204 min., vì vậy để tiêu diệt 1012 bào từ xuống còn 1 bào từ cần 12D hay 2,5 phút. Trị số z đối với Clostridium botuỉinum là 10°c - tức là tăng 10°c thì giảm được 10 lần trị số D. Nếu diệt khuẩn ở 11 l° c thì trị số D phải tăng 10 lần, tức là 2,04 phút và trị sổ 12D tăng lên đến 24,5 phút. Bảng ỉ 5.3 nêu lên trị so D và trị số z của một số vi khuẩn thường gặp trong thực phẩm. Cán cứ vào trị số D ở các nhiệt độ khác nhau để tính ra trị so z. Trị so z có thể dùng để tính toán mối quan hệ giữa nhiệt độ và thời gian sống sót của vi sinh vật. Trị số z là số nhiệt độ tăng đủ để làm giảm 10% trị số D. Trong đồ thị này trị sổ z là 10,5°c. Trị sổ D biểu thị bằng thang logarit. (Theo sách của Prescott, Harley và Klein). Bảng 15.3: Trị sổ D và trị sổ z của một sế vi khuẩn gây bệnh gặp trong thực phẩm Vi sinh vât

Ctf chất

D(°C),phút

Z(°C)

Clostridium boiuỉinum

Đệm photphat

D12l=0,204

10

Cl.perfringens (chủng kháng nhiệt)

MT nuôi cấy

Dọo=3-5

6-8

Salmonella

Sản phẩm gà

D6o=0,39-0,40

4,9-5,1

Sản phẩm gà SP gà tây Dung dịch NaCl 0,5%

0*0=5,17-5,37

5,2-5,8 6,8 5,6

Staphylococcus aureus

D«=15,4 060=2,0-2,5

(Theo sách cùa Prescoít.Harỉey và Kĩein) Có 3 số liệu đối vói tụ cầu vàng (S. aureus), cho thấy tốc độ làm chết vi khuẩn này thay đổi phụ thuộc vào môi trường vả hiệu quả bảo vệ của chất hữu cơ. Với sức nóng ẩm phải cần nhiệt độ cao hơn 100°c thì mới có thể diệt được nội bào tử (endospores) của vi khuẩn, và cần có áp suất cao trong điều kiện bão hòa hơi nước. Thiểt bị diệt khuẩn thường dùng được gọi là autoclave (hình ỉ 5.3) Hình ỉ 5.3: Hai loại autoclave nhỏ và lớn. 93

v ề cơ bản autoclave cùng tương tự như nồi hầm chịu áp lực vẫn thường dùng trong gia đỉnh. Tùy yêu cầu mà có cái dùng lửa, có cái dùng điện, có cái dùng hơi nước chuyên vào có cái nhỏ, cỏ cái vừa, cỏ cái lớn hoặc rât lớn. Autoclave do nhà khoa học Chamberlanđ phát minh ra vảo năm 1884 và phát minh nảy đã thúc đây sự phát triên của Vi sinh vật học. Autoclave phải có van để đầy hêt không khí ra và trong nôi chỉ còn có hơi nước bão hòa. Có thể đóng van ngay tù đầu đợi áp lực nâng lên một ít rồi mới mở van để loại hết không khí ra. Cũng có thể mờ van ngay từ đầu, khi thấy hơi nước bay ra nhiều mới đóng van lại. Thường diệt khuẩn ở 121°c (áp suất 15 pounds) trong 15 phút. Có thể diệt hết mọi tế bào vi sinh vật và bào từ. Diệt khuẩn bằng sức nóng ẩm thông qua việc phá hủy axit nucleic, làm biến tính enzym và các protein khác, đồng thời còn có thể phá vỡ màng tế bào mà làm chết vi sinh vật. Diệt khuẩn bằng sức nóng ẩm phải tiến hành triệt để mới có hiệu quả. Khi chưa loại bò hết không khí thì ở áp suất 15 pound nhiệt độ không thể đạt đến 121 °c. Các vật cần xử lý không nên xếp chật quá cân trở việc tiếp xúc với hơi nước nóng. Lúc diệt khuẩn một bình cỏ thể tích lớn thì phải giữ thòi gian dài hơn, để làm cho toàn bộ dịch thể phải đạt tới

121°c. Chẳng hạn khi diệt khuẩn ở bình 5 lít thì phải xử lý trong 70 phút. Để khắc phục các nhân tổ nói trên người ta thưởng xếp kèm với sinh vật chí thị khi diệt khuẩn các vật phẩm. Khi đó dùng ống (ampule) chứa môi trường dinh dường vô khuẩn có thêm mành giấy cỏ tẩm bào từ vi khuẩn Bacillus stearothermophilus hay Clostridium, sp PA3679. Diệt khuẩn xong phá vờ ống trong điều kiện vô khuẩn và nuôi cấy vài ngày. Nấu sinh vật chỉ thị không sinh trưởng thì là việc diệt khuẩn đă thành công. Người ta thường xử lý nhiệt ở độ sôi đối với sừa và nhiều chất khác. Phương pháp này gọi là phương pháp khử trùng Pasteur (Pasteurization) để kỳ niệm phát minh này của ông. Vào thập kỷ 60 của thế kỷ 19 do rượu vang bị nhiễm khuẩn, gây khó khăn cho việc bảo quàn và vận chuyên, gây khó khăn cho việc sản xuất rượu vang ở Pháp. Pasteur đã đùng kính hiển vi quan sát thấy các trong rượu bị ô nhiễm có mặt các vi khuẩn lên men lactic và axetic. Ong thây xử lý ở nhiệt độ 55-60°C có thể làm chết các vi sinh vật này và có thể bảo quản tương đối lâu dài rượu vang. Năm 1886 hai nhà hóa học Đức là V.H.Soxhlet và F.Soxhlet sử dụng kỹ thuật này đê bảo quản sữa và làm giảm việc sừa lây truyên mâm bệnh. Năm 1889 phương pháp tiêu độc Pasteur vói sữa được nhập vào Hoa Kỳ và người ta đã dùng phương pháp này đê xử lý sữa, bia, và nhiều loại đồ uổng khác. Phương pháp tiêu độc Pasteur không đạt tới mục đích diệt khuẩn nhưng đủ làm chết các vi khuãn gay bẹnh, giàm mạnh các vi khuân không gây bệnh nhưng ỉàm hư hỏng thực phẩm và lam chậm rõ rệt tôc độ biến chất của thực phẩm

Có thể có hai phương pháp khử trùng sữa. Phưcmg pháp tương đối cổ là xử lý ở 63 °c trong 30 phút. Còn phương pháp hiện thường được sử dụng là phương pháp khử trùng ngắn (flash Pasteurization), còn gọi là phương pháp khử trùng ngắn ở nhiệt độ cao (hightemperature short-term, HTST), tức là xử lý ờ 72°c chỉ trong 15 giây, sau đó nhanh chóng làm lạnh. Trong công nghiệp thực phẩm có lúc cũng còn dùng phương pháp khừ trùng siêu nhiệt (ultrrahigh temperature, UHT), tức là xừ lý sữa và các sàn phẩm sữa ở nhiệt độ 140150°c chi trong 1-3 giây. Sữa xử lý siêu nhiệt không cần bảo quản lạnh, có thể bảo quản hai tháng an toàn ở nhiệt độ phòng. Các gói cà phê kem (coffee creamer) cung cấp ở khách sạn thường được diệt khuẩn theo phương pháp này.

Hình ĩ 5.4: Tủ sấy nhiệt độ khô. Nhiều vật phẩm cỏ thể diệt khuẩn bằng sức nóng khô ídry heat sterilization). Đưa các vật phẩm này vào tủ sấy và giữ nhiệt độ 160-170°c trong 2-3 giờ. Vi sinh vật bị chết do bị oxy hóa các thành phần tế bào, và lảm biển tính protein. Mặc dầu diệt khuẩn băng sức nóng khô không có hiệu quả cao như bằng sửc nóng ẩm. Bào tử của vi khuẩn Clostridium botuỉinum bị chết ở 121°c sau 5 phút khi dùng sức nóng ẩm nhưng chỉ bị chết như vậy ở 160°c sau 2 giờ. Diệt khuẩn bằng sức nóng khô cỏ những ưu thế riêng vì không làm ăn mòn các vật liệu thủy tinh và kim loại như sức nóng ẩm, có thể dùng để xử lý các dạng bột, dầu và các chất tương tự. Hầu hết các phòng thí nghiệm xử lý hộp Petri và các pipét bằng sức nóng khô. Không thích hợp sử dụng phương pháp này để xử lý các vật phẩm bàng chất dẻo và cao su. 15.4.2. Nhiệt độ thấp Nhiệt độ thấp được sử dụng để ức chế sự sinh trường và phát triển cùa vi sinh vật. Đây là phương pháp quan trọng ngành vi sinh vật học thực phẩm. Ở nhiệt độ '20 c hay thấp hơn vật phẩm bị đông lạnh, vi sinh vật bị đình chỉ sinh trưởng. Một sổ vi sinh vật bị 95

chết vì các tinh thể băng là phá vờ màng tế bào, nhưng lạnh sâu không làm chêt phân lớn các vi sinh vật nhiễm trên vật phẩm. Trên thực tế nhiều phòng thí nghiệm dùng các tủ lạnh sâu -30°c hay -70°c để bảo quản vi sinh vật. Vì thực phẩm đông lạnh có thể chứa nhiều vi sinh vật, cho nên khi làm tan băng phải xử lý ngay để tiêu thụ, tránh để tổn hại và đê cho các vi sinh vật gây bệnh phát triển. Bảo quản lanh giúp làm chậm sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, nhưng không đủ làm ngừng hẳn sự sinh ừưởng. Đáng mừng là phần lớn các vi sinh vật gây bệnh là thuộc loại ưa ấm (mesophilic) và không sinh trưởng được ở nhiệt độ 4°c. Các vật giữ lạnh bị hư hỏng bời các vi khuẩn ưa lạnh (psychrophilic) và chịu lạnh (psychrotrophic) nhất là khi có tồn tại nước, các tủ lạnh chỉ dùng để bảo quản ngắn hạn thực phẩm và các vật phẩm khác. 15.4.3. Qua lọc Phương pháp qua ỉọc là phương pháp rất tốt để giảm thấp quàn thể vi sinh vật đối với các vật liệu mẫn cảm với nhiệt độ và nhiều khi có thể dùng để diệt khuẩn các đung dịch. Qua lọc chi đơn giản là loại vi sinh vật khỏi đung dịch chứ không phải là diệt khuẩn. Có hai loại lọc vi sinh vật. Thiết bị qua lọc tầng sâu (depth filter): đó là loại thiết bị cấu tạo bởi sợi hay các vật chất dạng hạt, tạo thành một bản lọc khá đầy với những lỗ rất nhỏ. Dưới sửc hút chân không dung dịch sẽ được lọc qua còn vi sinh vật bị giữ lại hay bị hấp phụ (adsorption) trên bề mặt bản lọc. Nguyên liệu để làm ra bản lọc này thường là đất Tảo silic (dímatomaceous earth) - đó là thiết bị lọc Berkeíìeld. Còn có thể đùng một loại sứ (unglazed porcelain) - đó là thiết bị lọc Chamberlain. Hoặc còn có thể dùng thạch miên (asbestos) hay các nguyên liệu khác. Gần đây người ta dùng thiết bị màng lọc (membrane filters) thay thể cho thiết bị qua lọc tầng sâu. Màng lọc hình tròn, dày khoảng 0,1 mm và được chế tạo bởi axetat xenluloz, nitrat xenluloz, polycacbonat, fluorit polyvinyliden hay các chất tổng hợp khác. Các màng lọc có lỗ với đường kính khoảng 0,2^m là cỏ thể đùng để lọc bò phần lớn các tế bào dinh dưỡng của vi sinh vật, trừ virut. Dịch lọc thường chỉ từ lml đến vài lít. Màng lọc được lấp cố định trên một giá đặc biệt {hình 15.5)

Hình 15.5: Thiết bị màng ỉọc: ỉ- Bình Erlenmeyer đựng dịch cần lọc. 2- Dịch lọc được đẩy sang thiết bị màng lọc nhờ mảy bơm. 3- Thiết bị màng lọc (với các loại hình các kích cờ khác nhau).

Dưới áp lực của máy hút chân không dịch lọc được chuyển sang một bình vô khuấn. Loại thiết bị màng lọc này được dùng trong ngành dược, lọc thuốc đau mắt, chuẩn bị các môi trường nuôi cấy, các loại dầu, chất kháng sính và nhiều vật chẩt kém chịu nhiệt khác. Phương pháp diệt khuẩn nhờ lọc còn dùng để lọc không khí. Hai ví dụ thường gặp là khẩu trang dùng trong ngoại khoa và nút bông dùng cho các ổng nghiệm hay các bình nuôi cấy vi sinh vật. Không khí đi qua được nhưng vi sinh vật thì bị giữ lại bên ngoài. Phòng cấy Laminar thoáng khí nhưng an toàn sinh học (Laminar flow biological safety cabinet) đã sử đụng màng lọc không khí bằng các hạt hiệu lục cao HEPA (high-effĩciency particulate filter). Nó có thể lọc được đến 99,97% các hạt có kích thước 0,3jUm và được coi là một hệ thống lọc rất quan trọng. Người nuôi cấy vi sinh vật có thể thao tác thoải mái trong một phòng cấy mở một phần cửa nhưng rất an toàn nhờ luôn có một luồng không khí vô khuẩn được thổi từ phía trong và lại thoát ra qua màng lọc HEPA đặt ở phía trên. Khi thao tác với các vi sinh vật nguy hiểm như vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis, virut gây ung thư, các ÀDN tái tổ hợp... nhất thiết cần sử dụng phòng cấy này. Thiết bị này được dùng trong các phòng thí nghiệm, trong công nghiệp, như là công nghiệp dược phẩm, để chuẩn bị môi trường, thao tác thí nghiêm, nuôi cấy m ô...

Hình ỉ 5.6: Phòng cấy Laminar.

15.4.4. Bức xạ (radiation) Bức xạ tử ngoại (Ultraviolet radiation-UV) với bước sóng 260nm có hiệu ứng diệt khuẩn rất mạnh, tuy nhiên không cỏ khả năng xuyên qua thủy tinh, các màng bẩn, nước và một số cơ chất khác. Vì vậy u v chì dùng để diệt khuẩn trong một số trường hợp, ví dụ diệt 97

khuẩn không khí trong tủ cấy, phòng nuôi cấy hoặc bền ngoài một số vật thê. u v có hại đối với da và mắt cho nên phải tắt đèn u v trước khi vào làm việc nơi có đèn này. u v cũng có thể dùng để diệt khuẩn nước, phải là một tầng nước mỏng đi qua đèn u v đê đủ sức diệt mầm bệnh và các vi sinh vật khác.. Bức xạ ion hóa (ionizing radiation) hay bức xạ điện ly có sức xuyên rẩt mạnh và được dùng rất tốt để diệt khuẩn. Nó cỏ thể diệt cả tế bào dinh dưỡng lẫn bào tử vi khuẩn, cả vi sinh vật nhân nguyên thủy (procaryotic) lẫn các vi sinh vật có nhân thật (eucaryotic). Tia gamma từ nguồn cobalt 60 được dùng để diệt khuẩn nguội đổi với chất kháng sinh, kích tố (hormones), chỉ khâu vết thương, các vật liệu y học bàng chất dẻo (plastic) như ống tiêm... Tia gamma còn được diệt khuẩn và tiêu độc (pasteurize) đổi với thịt và các thực phẩm khác. Bức xạ ion hóa có thể diệt các vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm như Escherichia coli 0157:H7, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni... Cả cơ quan quản lý thực phẩm và thuốc Hoa Kỳ (FDA) lẫn tổ chức Y tể thế giới (WHO) đều xác định tính an toàn của việc chiếu xạ này đối với thực phẩm. Đã có một nhà máy chiếu xạ thương phẩm ở gần Tampa (bang Florida). Tiếc ràng phương pháp này chưa được ứng dụng rộng rãi tại Hoa Kỳ, nguyên nhân là đo giá còn cao và nhiều người còn lo ngại các ảnh hưởng bất lợi của việc chiếu xạ lên thực phẩm. Gần đây, Chính phủ Mỹ đã phê chuẩn việc chiếu xạ lên thịt gia cầm, thịt bò, thịt lợn, thịt bê, thịt cừu non, hoa quà, rau củ và các chất điều vị. Việc chiếu xạ trong tương lai sẽ ngày càng được ứng dụng rộng rãi. 15.5. SỬ DỤNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC ĐẺ KHÓNG CHẾ VI SINH VẬT Mặc dầu người ta vẫn thường dùng các phương pháp vật lý để tiêu độc nhưng các tác nhân hóa học cũng thường được dùng để tiêu độc (disinfection) và phòng thối (antisepsis). Cỏ nhiều nhân tố ảnh hưởng đến hiệu quả tiêu độc và phòng thối bàng phương pháp hóa học. Chẳng hạn như loài vi sinh vật, nồng độ và bản chất của các chất tiêu độc và phòng thối, thời gian xử lý,... Trước khi sử dụng các chất tiêu độc hay phòng thối thì bề mặt vật thể phải được làm sạch, cần đàm bảo sự an toàn khi dùng hóa chất trong các phòng thí nghiệm hay trong bệnh viện. Hóa chất cũng được đùng để phòng chổng sự sinh trường của vi sinh vật trong thực phẩm. Có nhiều loại hóa chất được dùng làm chất tiêu độc, mỗi loại đêu có những ưu đi êm và nhược điểm riêng. Trước khi chọn sử dụng hỏa chất nào phải hìêu rõ đặc tính của chât đó. Trong trường hợp pha rất loãng và có mặt chất hữu cơ thì chất đó van có thê tác dụng có hiệu quả lên các nhân tổ truyền nhiễm (vi khuẩn Gram đương, Gram âm, vi khuân kháng axit, nội bào tử của vi khuẩn, các loại nẩm và virut...), mặt khác lại phài không cô hại đoi với cơ thể ngựờì, không làm ăn mòn các vật phẩm nói chung. Trong thực tiễn, rẩt khó đạt đến tiêu chuẩn vừa có hiệu lực vừa ít độc đổi vổri cơ thể. Một sổ hóa chẩt tuy hiệu lực thấp nhưng vì khá vô hại nên vẫn được sử đụng. Chẩt tiêu độc phải ôn định khi bảo quàn, không có mùi vị khó chịu, tan trong nước và trong dầu để đễ xâm 98

nhập vào vi sinh vật và phải có sức căng bề mặt thẩp để xâm nhập được vào các khe trên bề mặt. Nếu giá không cao càng tốt. Một vấn đề nghiêm trọng là việc sử dụng quá mức Triclosan và các chất diệt khuẩn (germícits) khác. Chất kháng khuẩn (antibacterial) này hiện thấy có mặt trong các sản phẩm như chất khử mùi (deodorant), nước súc miệng, xà phòng, thớt cắt rau, đồ chơi trẻ em... Triclosan hầu như đang có mặt khắp nơi, hậu quả là đã xuất hiện các vi khuẩn kháng Triclosan. Ví dụ trực khuẩn mủ xanh Pseudomonas aeruginosa đã có thể bài xuất chất này ra khỏi tế bào. Tương tự như trường hợp vi khuẩn phản ứng với việc dùng quá độ thuốc khảng sinh, vi khuẩn cũng sẽ có sự đáp ứng như vậy khi dùng quá mức các chất phòng thối. Hiện đã cỏ bằng chứng cho thấy việc sử dụng rộng rãi Trìclosan đã làm tăng tần sổ xuất hiện các vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh. Vì vậy việc dùng quá mức các chất phòng thối (antiseptic) cỏ khả năng sinh ra những hậu quà khó ỉường. Băng 15.4: Nồng độ sử dụng và mức độ hoạt tinh của các chất diệt khuẩn thông đụng Nồng độ sử dụng

Mức độ hoạt tính*

450-500mg/L

Cao

2%

Tương đối cao

8 + 70%

Cao

H20 2 ổn định

6-30%

Tương đối cao

Formaldehit dịch thể

6-8%

Tương đối cao

lodophors

750-5000mg/L

Tương đối cao

Iodophors

75-159mg/L

Tương đối thấp

lot + cồn

0,5 + 70%

Trung bình

Hợp chất của clo

0,1 -0,5%

Trung binh

0,5-3%

Tương đối thấp

1%

Trung bình

70%

Trung bình

0,1-0,2% trong nước

Thấp

0,75-4%

Thấp

1-3%

Thấp

0,1-0,2%

Thấp

Hóa chất Dạng khí: Etylen oxít Dọng lòng; Glutaraldehit dịch thể Formaldehit + cồn

Họp chất của phenol, dịch thể lot, dịch thể Cồn (etyl,isopropyl) Hợp chất amoni bậc 4 Chlorohexidin Hexachlorophen Hợp chất thủy ngân

99

♦Hoạt tính cao-có thể làm chết vi khuẩn kể cà vi khuẩn lao, bào tử, nâm, virut; Hoạt tính trung bình' làm chết mọi vi khuẩn, trừ bào từ; Hoạt tính thấp- làm chết tế bào dinh dirỡng của vi khuân, trừ VK. lao, làm chết nấm, virut có lượng lipit mức trung bình. Theo Symour s. Block, 1983.

P rt*nol

Hsxa <áiloroph eấ>«

Ak:oihots OH I

C H ,—CH, ~O H Brianol

teopropanot

//° H.c ---- cf

Akìetiyđea Ọ !! H C— H

H,c

Fof.-mktehyoe

Ọ JI

Ọ lĩ H

c

CHa CH,

C h,

c

h

Oularaktenyoe

ttolasMie

QuHl«ni.ftry a^n'n

C H ,„ W

° " M'

CHa

CH,

Gelylpyrkanfejm cMortđe

B« ilia Boữrtki m cM«fc*e

GaSèí. c H. “ c H,

V

CH ~CH

I I o— c

EUiytone OítO à Betac-roc+olaclùíie

ỉãnh 15.7: Câu trúc của một sổ chất tiêu độc và chất phòng thối thông dụng.

* Loại Phenol Phenol là chất phòng thối và tiêu độc được sử dụng rộng rãi đầu tiên. Năm 1867 Jozph Lister đã dùng phenol đê lam giam nguy hiêm cùa việc nhiễm vi sinh vật trong quá trình phẫu thuật. Hiện nay phenol và các dẫn xuất như các loại cresol, các loại xylenol và 100

orthophenylphenol đã được dùng để làm chất tiêu độc trong các phòng thí nghiệm và bệnh viện. Chất tiêu độc thương mại Lysol là một hợp chất loại phenol. Các chất loại phenol có thể làm biến tính protein và phá hủy màng tế bào. Chúng cỏ ưu điểm là có thể diệt vi khuẩn lao khi có mặt các chất hữu cơ. Sau khi sừ dụng có thể duy trì tác dụng khá lâu trên bề mặt vật thể. Nhưng chúng có mùi khó chịu và có thể làm kích thích da. Hexachlorophen là một chất phòng thối thường dùng vì có thể làm giảm số lượng vi khuẩn trên da và duy trì được khá lâu, nhưng nó lại có thể làm tổn thuơng não cho nên hiện chi dùng trong bệnh viện khi có sự bộc phát của tụ cầu khuẩn Staphylococcus.

*cồn Cồn là một trong những loại thuốc tiêu độc và thuốc phòng thối thường đùng, cồn có thể làm chết cả vi khuẩn và nấm nhưng không làm chết được bào tử. Một số virút chứa lipit cũng bị cồn làm chết. Etanol và Isopropanol là hai loại cồn thường dùng để diệt khuẩn, nồng độ thường dùng là 70-80%, nồng độ này làm biến tính protein, còn có thể làm hòa tan màng lipit. Để diệt khuẩn nhiệt kế và các dụng cụ nhỏ cần xử lý bằng cồn trong 10-15 phút.

* Các Haỉogen Halogen là một trong 5 nguyên tố thuôc nhóm VIIA của bàng tuần hoàn (Fluorin-F, Clorit-Cl, Bromine-Br, Iot-I và Astatine-). Ở trạng thái tự do các phân tử tồn tại dưới dạng 2 nguyên tử liên kết với nhau. Cũng có thể tạo thành muối với natri (Na) hay các kim loại khác. I và C1 là hai loại kháng vi sinh vật quan trọng. I thường được dùng làm thuốc phòng ' thối (antiseptic) ngoài da. Nó làm chết vi sinh vật do oxy hóa các thành phần tế bào, iod hóa (iodinating) các protein. Với nồng độ cao có thể làm chết bào tử, nói chung là sừ dụng tinture d’iode (tinture of iot) - tức là IK với nồng độ 2 % hay cao hơn iot trong đung dịch nước-etanol. Mặc dầu I là chất phòng thối có hiệu quà nhưng cũng có thể làm tổn thương đa, có thể làm biến màu da, còn có thể gây dị ứng (allergíe). Gần đây người ta sử dụng iodophore - hợp chất của I với một chất hữu cơ. Iodophor tan trong nước, không làm bẩn màu da, có thể giải phóng dần lot nên giảm tổn hại và giảm kích thích da. Loại tiêu độc da và dùng trong phòng thí nghiệm phổ biến là loại có nhàn hiệu là Wescodyne, còn loại tiêu độc vết thương thường dùng loại có nhãn hiệu là Betadin. lot thường được đùng để tiêu độc nước tiêu dùng tại thành thị và các bể bơi. Cũng được dùng trong công nghiệp sữa, công nghiệp thực phẩm. Có thể dùng khí clorit, natri hypoclorit hoặc canxi hypoclorit. Khi sử dụng chúng biến thành HCIO rồi giải phóng

101

nguyên tử ôxy: Sẽ xảy ra sự ôxy hóa các tê bào đinh dưỡng của VI khuân, nâm nhưng không có tác dụng với bào tử: CỈ2 +

H2O-* HC 1+ HCIO

Ca(OCl)2 + 2 H 2O -* Ca (OH)2 + 2 HCIO HC10-> HCl + O Dưới tác dụng của chúng hầu như tất cả vi sinh vật sẽ bị giết chết trong vòng 30 phút. Vì phản ứng của chất hữu cơ với tác động của Cỉ và các dẫn xuất của C1 nên đã can thiệp vào tác dụng diệt khuẩn của C1 cho nên người ta thường sử dụng quá lượng C1 để bảo đảm hiệu quả diệt khuẩn. Có một khả năng là C1 phản ứng với chất hữu cơ hình thành nên những hợp chất gây ung thư trihalometan, cho nên Ưong nước uống cần phải kiểm tra sự tồn tại của chất nảy. Tại Châu Ầu và Canada đôi khi người ta sử dụng thành công ozon để thay thế cho việc clorit hóa (chlorination). Cl là một chất tiêu độc tốt, khồng đẳt, lại đễ dàng sử đụng nên rất hay được sử dụng. Với một lượng nước uống nhỏ có thể tiêu độc bằng những viên halozon. Halozon (axit parasulfone dichloramidobenzoic) sau khi đưa vào nước sẽ từ từ giải phóng ra clorit, sau khoảng nửa giờ có thể đạt tới mục đích tiêu độc. Chất này thường được sừ dụng trong trường hợp thiếu nước sạch để uống. Dung dịch C1 là chất tiêu độc có hiệu quả trong gia đình và trong các phòng thí nghiệm. Cỏ thể dừng nồng độ pha loãng 100 lần dịch tẩy tráng gia dụng (household bleach) phối hợp với chất tẩy không ion hóa (non ionic detergent) sao cho nồng độ chất tẩy vào khoảng 0,8%. Hỗn hợp này vừa làm sạch vừa loại bỏ vi khuẩn

* Các Kim loọi nặng Trong nhiều năm các ion kim loại nặng như Hg, Ag, As, Zn và Cu thường được dùng để làm chất diệt khuẩn (germicits). Nhiều kim loại nặng có tác dụng ức chế vi sinh vật (bacteriostatic) hom là diệt khuẩn. Hiện các chẩt này đã được thay thể bàng các chất khác vì có độc tỉnh thâp hơn và có hiệu quả hơn. Nhưng cũng cỏ thường hợp ngoại lệ, ví dụ đung dịch 1% AgNOj thường được dùng làm thuốc nhỏ mắt để phòng bệnh lậu ở mắt (trong nhiều bệnh viện người ta đùng Erythromycin để thay thế hitrat bạc vì chất kháng sinh này có hiệu quả chống cả Chlamydia lẫn Neisseria). Bạc sulfadiazine thường được đùng trong điều trị bỏng. C11SO4 thường được dùng để diệt tào có hiệu quà trong ao hồ vả các bể bơi. Kim loại nặng kết hợp với protein , làm bất hoạt protein và cũng cỏ thể làm kết tủa protein cùa tế bào.

102

* Các muối amoni bậc bốn (QuateARNiy Amoniium Compounds) Các chất tẩy (Detergents - từ gốc La Tinh detergerecó nghĩa là loại trừ) là những phân tử hữu cơ được dùng làm các chất giữ ẩm (wetting agents) và nhũ hóa (emulsifiers) vì chúng vừa có cực thân nước (polar hydrophilic) vừa có những gốc phi cực kỵ nước (nonpolar hydrophobic ends). Chúng có thể làm tan các chất khỏ hòa tan bời các phương pháp khác, vì vậy dùng làm chất tẩy rửa, giặt giù rất có hiệu quả, nhưng cơ chế khác với các chất béo có trong xà phòng. Mặc dầu các chất tẩy dạng ion có chức năng kháng vi sinh vật nhất định nhưng chỉ có các chất tẩy rửa cationic (ion dương) mới cỏ tác dụng tiêu độc. Thường dùng nhất là các muối amoni bậc bốn, chúng làm phả vỡ mảng tế bào, cũng có thể làm biến tính protein. Các chất tẩy cationic như Benzalkonium clorit và Cetylpyridinium clorit có thể giết chết phần lớn vi khuẩn nhưng không giết được vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis và các nội bào tử. Chúng có ưu điểm là ổn định, không độc và không gây kích thích... nhưng lại bị mất tác dụng trong nước cứng (hard water) và nước xà phòng. Các chất tẩy cationic thường được dùng để làm chất tiêu độc đối với bát đĩa, các thiết bị nhỏ và để xử lý ngoài da. Zephiran có chứa benzalkonium clorit và Ceepryn cỏ chúa cetylpyridinium, clorit là các mặt hàng thường gặp trên thị trường.

* Các Aldehit Hai loại aldehit thường được sử dụng là Formaldehit và Glutaraldehií. Chúng cỏ phàn ứng rất mạnh, có thể kết hợp với axit nucleic và protein và làm bất hoạt chúng, còn có thể lảm bất hoạt thông qua việc liên kết chéo (crosslinking) và alkyl hóa (alkylating). Chúng có thề làm chết bào tử, có thể dùng làm chất diệt khuẩn hóa học. Formaldehit thuờng được dùng dưới dạng hòa tan trong nước hay trong cồn. Dung dịch đệm 2% glutaraldehit là một loại chất tiêu độc có hiệu quả và thường đuợc dùng để tiêu độc các phòng thí nghiệm và bệnh viện. Glutaraldehit trong 10 phút đã đủ để tiêu độc nhưng để giết chết bào tử cần tới 12 giờ.

* Các khi diệt khuẩn Có nhiều vật phẩm không chịu được nhiệt độ cao như các đĩa Petri bang chất dèo, các ống tiêm nhựa, các bộ phận của máy tim-phổi nhân tạo, các ổng dẫn, ống nói... cần diệt khuẩn bằng khí etylen oxìt (EtO). EtO có thể kết hợp với protein, có thể làm chết cả vi sinh vật lẫn bào tử. EtO nhanh chóng xuyên qua được các bao bì bằng chất dẻo nên là một loại chẩt tiêu độc đặc biệt hiệu quả.

103

Tiêu độc bàng EtO rất giông với tiêu độc trong nôi cao áp. Cân không chê nông độ Eto, nhiệt độ và độ ẩm. Với EtO thuần khiết thường dùng nồng độ 10-20% phối hợp với CƠ 2 hay dichlorodifiuorrometan. Với các vật dụng sạch cân xử lý ở 3&°c trong 5-8 giờ, nếu ở 54°c cần xử lý trong 3-4 giờ. Nồng độ EtO là là 700mg/lít.Vì EtO cỏ độc tính lcm cho nên sau khi tiêu độc cần thổi khí mạnh để loại trừ hết EíO đi. Betapropiolacton (BPL) củng là loại khí dùng để tiêu độc. Trong ừạng thái lỏng BPL dùng để tiêu độc vãcxin và huyết thanh. BPL sẽ bị phá hùy thành dạng vô hoạt tính sau vài giờ chứ không khó loại trừ như EtO. Năng lực diệt khuẩn tuy cao hem E to nhưng khả năng xuyên thấu qua vật liệu lại kém hơn so với EtO. Hơn nữa chất này cỏ thể gây ung thư cho nên không được ứng dụng rộng rãi như EtO. Gần đây hydro peroxit đạng bay hơi cũng được dùng để tiêu độc các phòng thao tác an toàn sinh học.

15.6. ĐẢNH GIÁ HIỆU L ự c CỦA CÁC TÁC NHÂN KHÁNG VI SINH VẬT Tại Hoa Kỳ việc đánh giá các tác nhân kháng vi sinh vật được thực hiện bời hai cơ quan khác nhau: Cơ quan quản lý các chất tiêu độc bảo vệ môi trường và Cơ quan quản lý Thực phẩm và dược phẩm, cần đánh giá các tác nhân này có hiệu quả kháng vi sinh vật hay không, có hiệu lực từ nồng độ nào. Sau đó tiến hành trên từng ứng dụng thực tiễn. Phổ biến nhất là thí nghiệm hệ số phenol (phenol coefficient test), tức là so sánh hiệu lực cùa một số chất tiêu độc với phenol. Đầu tiên pha loãng với các mức độ khác nhau, sau đó cấy vào các độ pha loãng này vi khuẩn thương hàn Salmonella typhi và tụ cầu vàng Staphylococcus aureus, để ở 20°c hay 37°c. Sau 5 phút lại cấy sang môi trường mới và nuôi cấy tiếp 2 ngày hay lâu hơn. Độ pha loãng cao nhất trong 10 phút có thể diệt hết vi khuẩn được dùng để tính toán Hệ sổ phenol. Lấy bội số pha loãng của chất thừ nghiệm chia cho bội số pha loãng phenol đạt hiệu quả như nhau thì thu được Hệ số phenol. Ví dụ bội số pha loãng của phenol là 90 mà bội số pha loãng của chất tiêu độc thử nghiệm là 450 thì Hệ sô phenol là 5. Hệ sô phenol càng cao thì biểu thị chất thử nghiêm có năng lực tiêu độc trong cùng điều kiện thí nghiệm càng cao. Hệ số phenol càng cao hơn 1 thi biểu thị năng lực tiêu độc càng cao hơn phenol (bảng ỉ 5.5). Hệ sô phenol là có ích để sơ bộ lựa chọn chất tiêu độc, nhưng trong quá trình ứng dụng thực tể không thể dùng để biểu thị hiệu lực cao thấp của chất tiêu độc. Bời vì hệ số phenol là sô liệu thu được ừong những điêu kiện thỉ nghiệm nhất định, với các vi sinh vật thuần chủng, còn ừong thực tế với một quần thể vi sinh vật phức tạp, có tồn tại các chất hữu cơ, chât vô cơ, với các pH, nhiệt độ khác nhau..., hiệu lực của chất tiêu độc chịu ảnh hưởng rất nhiều vào các nhân tố môi trường khi sử đụng.

104

f

t

r

Bảng 15.5: Hệ sô phenol của một sô chat tiêu độc Chất tiêu độc Phenol Cetylpyridinium clorit O-phenylphenol p-cresol Hexachlorophen Merthiolat Mercurocrom Lysol Isopropyl alcohol Etanol Dung dich 2%I2 trong cồn

Với s.typỉn* ì 228 5,6 (20°C) 2,0-2,3 5-15 600 2,7 1,9 0,6 0,04 4,1-5,2

Vói S.aureus* 1 337 4,0 2,3 15-40 62,5 5,3 3,5 0,5 0,04 4,1-5,2

*Nhĩmg chỗ không chú thích là xừ lý ở 37°c. Muốn đánh giá thực tế hơn hiệu lực của các chất tiêu độc có thể tiến hành các phương pháp thử nghiệm khác. Trên thực tế so sảnh các chất hóa học khác nhau để kiếm tra tốc độ diệt khuẩn. Có thể dùng Thử nghiệm pha loãng thực dụng (use dilution test) để tiến hành xác định. Tìm nồng độ nào của chất tiêu độc cỏ thể diệt được 95% vi sinh vật theo mức độ tin cậy. Còn có thể dùng phương pháp Thí nghiệm thực đụng (in-use test) trong các điều kiện thực tế cụ thể để xác định nồng độ bắt đầu có tác dụng của từng chất tiêu độc.

105

Chương 16

KHÁI NIỆM CHUNG VẺ TRAO ĐỎI CHẤT Ở VI SINH VẬT

16.1. NĂNG LƯỢNG 16.1.1. N ăng lượng và công Có thể định nghĩa một cách đơn giản nhất năng lượng là khả năng tạo nên công hoặc gây nên những biến đổi đặc biệt. Do đó, tất cả các quá trình lý, hoá là kết quả của việc sử dụng hoặc vận động của năng lượng, Tế bào sống thực hiện ba loại công chủ yếu, tất cả đều cần thiết cho các quá trình sống. Công hoá học, bao gồm việc tổng hợp các phân tử sinh học phức tạp từ các tiền chất đơn giản hơn. Năng lượng ở đây được dùng để nâng cao tính phức tạp phân từ của tế bào. Công vận chuyển, cần năng lượng để hấp thu các chất dinh duỡng, loại bỏ các chất thải và duy trì các cân bằng ion. Như ta biết, nhiều phân tử chất dinh dưỡng bên ngoài môi trường phải đi vào tế bào mặc dù nồng độ nội bào của các chất này thường cao hơn ngoại bào nghĩa là ngược với gradien điện hoá. Với các chất thải và các chất độc hại cần phải được loại bỏ khỏi tế bào, tình hình cũng diễn ra tương tự. Công cơ học, có lẽ là loại công quen thuộc nhất trong ba loại công. Năng lượng ở đây cần cho việc thay đổi vị trí vật lý của các cơ thể, các tế bào và các cấu trúc bên trong tế bào. Hầu hết năng lượng sinh học bát nguồn từ ánh sáng mặt trời khả kiến chiếu lên bề mặí trái đât. Quang năng được hấp thu bởi các sinh vật quang dường trong quá trình quang hợp nhờ chât điệp lục và các săc tô khác sau đó chuyển ỉhành hoá năng. Trái với sinh vật quang dưỡng, nhiêu vi khuân hoá tự dưỡng vô cơ (chemolithoautotrophs) lại thu được năng ỉượng nhờ oxy hoả các chât vô cơ. Hoá năng từ quang hợp và hoá dưỡng vô cơ sau đó có thể được các sinh vật quang tự dưỡng vô cơ và hoá tự dưỡng vô cơ sử dụng để chuyển CO 2 thành các phân tử sinh học như glucoz (Hình 16.1). 106

Quang năng

Hóa năng

Hĩnh 16. ỉ: Dòng cacbon và năng lượng trong một hệ sinh thái. (Theo: Prescott vò cs, 2005). Các phân tử phức tạp do các cơ thể tự dưỡng tổng hợp (cả thực vật và vi sinh vật) được dùng làm nguồn cacbon cho các sinh vật hoá dị đưỡng và các sinh vật tiêu thụ khác vốn sử dụng các phân tử hữu cơ phức tạp làm nguồn vật chất và năng lượng để xây dựng nên các cấu trúc tế bào của riêng mình (trên thực tế các sinh vật tự dường cũng sừ đụng các phân tử hữu cơ phức tạp). Các sinh vật hoá dị dưỡng thường sử dụng Ơ2 làm chất nhận electron khi oxy hoá glucoz và các phân từ hữu cơ khác thành CO2. Trong quá trình này được gọi là hô hấp hiếu khí - O2 đóng vai trò là chất nhận electron cuối cùng và bị khử’ thành nước. Quả trình trên giải phóng ra nhiều năng lượng. Do đó trong hệ sinh thái năng lượng được hấp thu bời các cơ thể quang tự dưỡng và hoá tự dưỡng vô cơ. Sau đỏ, một phần năng lượng này được chuyền cho các cơ thể hoá dị dưỡng khi chúng sử dụng các chất dinh dưỡng bắt nguồn từ bọn tự dưỡng (Hình 16.1). CO 2 tạo thành ừong hô hấp hiếu khí có thể lại được lắp vào các phân tử hữu cơ phức tạp trong quang hợp và hoá tự dường vô cơ. Rõ ràng, dòng cacbon và năng lượng trong hệ sinh thái có liên quan mật thiết với nhau. Các tế bào phải vận chuyển năng lượng một cách có hiệu quả từ bộ máy sản xuất năng lượng tới các hệ thống thực hiện công. Nghĩa là, chúng cần có một đồng tiền chung về năng lượng để tiêu dùng, đó là adenosin 5’- triphotphat tức ATP (hình ỉ 6.2). Khi ATP phân giải thành adenosin diphotphat (ADP) và ortophotphat (Pi) năng lượng giải phóng ra sẽ được dùng để thực hiện công hữu ích. Sau đỏ, năng lượng từ quang

107

hợp, hô hẩp hiếu khí, hô hấp kỵ khí và lên men lại được dùng để tái tổng hợp ATP từ ADP và Pi trong chu trình năng lượng của tế bào {Hình 16.3).

'o

— p - o

0'

■ p

I 0"

• p .

I 0' OH

OH

Adenosine

Adenosine diphosphate (ADP)

Adênosine triphosphate (ATP)

w

(b)

Hình ỉ 6.2: Adenosin triphoiphaí và adenosin diphotphat. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005). ADP + Pi Hô hấp hiếu khí Hô hấp kị khỉ Lẽn men Quang hợp

Công hóa học Công vận chuyển Công cơ học

ATP Hình ỉ 6.3: Chu trình nãng ỉượng cùa tế bào. 108

ATP được tạo thành từ năng lượng cung cẩp bởi hô hấp hiếu khí, hô hấp kị khí, lên men và quang hợp. Sự phân giải của ATP thành ADP và Photphat (Pj) giúp cho việc sản ra công hóa học, công vận chuyển và cổng cơ học. 16.1.2. C ác định luật về nhiệt động học Đe hiểu được năng lượng tạo thành ra sao và ATP hoạt động như thế nào với vai trò là đồng tiền năng lượng ta cần nẳm được một số nguyên lý cơ bản của nhiệt động học. Nhiệt động học phân tích những thay đổi về năng lượng trong một tổ họp vật thể (ví dụ: một tế bào hay một cây) được gọi là một hệ thống. Mọi vật thể khác trong tự nhiên được gọi là môi trường xung quanh. Nhiệt động học tập trung vào sự sai khác năng lượng giữa trạng thái ban đầu và trạng thái cuối cùng của một hệ thống mà không quan tâm đến tốc độ của quá trình. Chẳng hạn, nếu một xoong nước được đun đến sôi thì, về nhiệt động học, chỉ điều kiện nước lúc ban đầu và khi sôi là quan trọng, còn việc nước được đun nhanh chậm ra sao và được đun trên loại bếp lò nào thì không cần chú ý. Trong nhiệt động học không thể không đề cập đến hai định luật quan trọng sau đây. Theo định luật thứ nhất, năng lượng không thể được tạo ra hoặc mất đi. Tổng năng lượng trong tự nhiên là hằng số mặc đù có thể được phân bố lại. Chẳng hạn, trong các phản ứng hoá học, thường diễn ra sự trao đổi năng lượng (Ví dụ, nhiệt được thoát ra ở các phản ứng ngoại nhiệt và được hấp thu ừong các phản ứng nội nhiệt) nhưng những sự trao đổi nhiệt này không trái với định luật trên. Để xác định lượng nhiệt được sử đụng trong hoặc thoát ra từ một phản ứng nào đó người ta đùng hai loại đơn vị năng lượng: một calo (cal) là lượng nhiệt năng cần để tăng nhiệt độ của một gam nước từ 14,5 đến 15,5°c. Lượng nhiệt cũng có thể được biểu hiện, bằng jun (joule, J) là đơn vị của công. 1 cal của nhiệt tương đương với 4,1840 J của công. 1000 cal hay 1 kilocalo (kcaJ) là lượng nhiệt đủ đun sôi khoảng l,9ml nước. 1 kilojun (kj) là lượng nhiệt đủ đun sôi khoảng 0,44 ml nước hoặc giúp cho một người nặng 70 kg leo lên được 35 bậc. Jun thường được các nhà hoả học và vật lý học sử dụng, còn các nhà sinh học lại quen sử dụng calo khi nói về năng lượng. Vì vậy, calo cũng được sử dụng ở đây khi những sự thay đổi năng lượng được đề cập. Mặc đù năng lượng được bảo tồn trong tự nhiên nhưng định luật thứ nhất của nhiệt động học không giải thích được nhiều quá trình vật lý và hoá học. Hãy lấy một ví dụ đơn giản để làm sáng tỏ điều nói ưên. Giả dụ, ta nối một xylanh đầy khí với một xylanh rỗng khí bàng một ống chửa 1 van (hình 16.4). Nếu ta mờ van khỉ sẽ từ xylanh đầy tràn sang xylanh rồng cho đến khi khí áp cân bằng ở 2 xylanh. Năng lượng không chỉ được phân bố lại, nhưng cũng được bảo tồn. Sự bành trướng của khí được giải thích bằng định luật thứ hai của nhiệt động học vả một trạng thái vật chất được gọi là entropi. Có thể xem entropi là đại lượng đo tính hồn độn 109

hoặc mất trật tự của một hệ thốnp. Tính hỗn độn của một hệ thông càng lớn thì entropi của hệ thống củng càng lớn. Định luật thứ hai nói rằng các quá trình vật lý và hoá học dien ra theo cách sao cho tính hỗn độn hoặc mất trật tự của cả hệ thông và môi trường xung quanh tăng tới cực đại có thể. Khí bao giờ cũng sẽ bành trướng sang xylanh trông.

Final state (equilibrium)

Hình 16.4: Sự bành trưởng cùa khi từxyỉanh chứa đầy khỉ sang xylanh rỗng khí. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005). 16.1.3. Năng lượng tự do và các phản ứng Các định luật thử nhất và thứ hai có thể kết hợp trong một phương trình chung liên kết nhừng thay đổi trong năng lượng có thể diễn ra trong các phản ứng hoá học và các quá trinh khác: AG = AH - T.ồS AG là sụ thay đổi trong năng ỉượng tự do, AH là sự thay đổi trong entalpi (enthalpi). T là nhiệt độ Kenvin (°c + 273) và AS là sự thay đổi trong entropi (entropy) diễn ra trong phản ứng. Sự thay đổi trong entalpi là sự thay đổi trong nhiệt lượng. Các phân ứng trong tế bào diễn ra ở điều kiện áp suất và thể tích không thay đổi. Do đó sự thay đổi trong entalpi sẽ tương tự như sự thay đổi trong năng lượng tổng cộng trong phản ứng. Sự thay đổi năng lượng tự do là nhiệt lượng trong một hệ thống có khả năng sinh công ở nhiệt độ và áp suất không thay đổi. Vì vậy, sự thay đổi trong entropi là đại lượng đo tỉ lệ của sự thay đổi năng lượng tổng cộng mà hệ thống không thể sử dụng để thực hiện công. Sự thay đổi của năng lượng tự do và của entropi không phụ thuộc vào việc hệ thống diễn ra như thế nào từ lúc băt đâu tới khi kêt thúc, ơ nhiệt độ và áp suẩt không đổi một phản ứng sẽ xảy ra ngầu nhiên nếu năng lượng tự do của hệ thống giảm đi trong phản ứng, hay nói theo cách khác, nêu AG là âm. Từ phương trình trên suy ra là một phản ứng với sự thay đổi lớn, dương tính 110

trong entropi sẽ thường có xu hướng có giá trị AG âm và vì vậy xảy ra ngẫu nhiên. Một sự giảm trong entropi sẽ có xu hướng làm cho AG dương tính hơn và phản ứng ít thuận lợi. Các phản ứng ngoại năng A+B ^ C+D

'

Các phản ứng nội năng A + B■----- ^ C + D K

[A][B]

[C ][D ]< 1 0 ' [A][B] AG° là đương

AG° lả âm

Hỉnh 16.5: AG° và cân bằng. Quan hệ của AG° với sự cân bằng cùa các phàn ứng.

(Theo Prescott, Harỉey và Klein, 2005). Sự thay đổi ừong năng lượng tự đo có quan hệ xác định, cụ thể đối với hướng của các phản ứng hoá học. Ta hãy xét phản ứng đơn giản sau đây: A+B

C+ D

Nếu được hỗn hợp các phân tử A và B sẽ kết hợp với nhau tạo thành các sản phẩm c và D. Cuối cùng c và D sẽ ừờ nên đậm đặc đủ để kết hợp với nhau và tạo thành A và B với cùng tốc độ như khi chúng được tạo thành từ A và B. Phản ứng bây giờ ở trạng thái cân bằng: tốc độ theo hai hướng là như nhau và không có sự thay đổi rõ rệt nào diễn ra trong nồng độ của các chất phản ứng và các sản phẩm. Tình hình trên được mô tả là hằng số cân bằng (Keq) liên kết nồng độ cân bằng của các sản phẩm và cơ chất với nhau: K “*

[A][B]

Nấu hằng số cân bằng lớn hom 1 các sản phẩm sẽ có nồng độ lớn hơn các chất phản ứng và phản ứng có xu hướng điễn ra đến cùng (hình ỉ 6.5). Hằng số cân bàng của một phản ứng Hên quan trực tiếp với sự thay đổi trong năng lượng tự do của phản ứng. Khi được xác định ở các điều kiện tiêu chuẩn quy định chặt chẽ về nồng độ, áp suất, pH và nhiệt độ thi sự thay đổi năng lượng tự do cho một quá trình được gọi là sự thay đổi năng lượng tự do tiêu chuẩn (AG°). Nếu giữ ở pH 7,0 (gần với pH cùa tể bào sống) sự thay đổi năng lượng tự do tiêu chuẩn sẽ được chỉ bởi ký hiệu AG° . Sự thay đồi trong năng lượng tự do tiêu chuẩn có thể được xem là lượng năng lượng cực đại mà hệ thống có thể thực hiện công hữu ích ờ các điều kiện tiêu chuẩn. Việc sử dụng các giá trị AG° cho phép ta so sánh các phản ứng mà không cần quan tâm tới những thay đổi trong AG, do những sai khác trong các điều kiện môi trường. Quan hệ giữa AG° và Keq được thể hiện qua quá trình sau: AG° = -2,3037?71gẲTeq. Ill

R là hàng số khí (1,9872 cal/mol hoặc 8,3145 J/mol) và T là nhiệt độ tuyệt đối. Từ phương trình trên rút ra khi AG° âm hằng số cân bằng sẽ lớn hơn 1, phản ứng sẽ diên ra đến cùng và được gọi là phản ứng thoát nhiệt (hình 16.5). Trong một phản ứng thu nhiệt AG° là dưcmg và hàng số cân bàng nhò han 1. Điều đó có nghĩa là phàn ứng không thuận lợi và ít sản phẩm được tạo thành ở các điêu kiện tiêu chuân. Cân nhớ răng giá trị AG° chi cho ta biết phản ứng nằm ở đâu khi cân bàng chứ không nói lên phản ứng đạt được cân bàng nhanh chậm ra sao. 16.1.4. Vai trò của ATP trong trao đổi chất Nhiều phản ứng trong tế bào là thu nhiệt, khỏ diễn ra hoàn toàn nếu không có sự giúp đỡ từ bên ngoài. Một trong các vai trò cùa ATP là hướng các phản ứng nói trên xảy ra được triệt để hơn. ATP là một phân tử cao năng nghĩa là Ĩ1Ó có thể bị thuỷ phân hầu như hoàn toàn thành ADP và Pi với một AG° khoảng -7,3kcal/mol. ATP + H20

ADP + Pi

Với ATP thuật ngữ phân tử cao nàng không có nghĩa là một lượng lớn nàng lượng được dự trữ bên trong một liên kết đặc biệt của ATP mà chì đơn giản chì ra rằng việc loại bỏ nhánh Photphat tận cùng diễn ra với sự thay đổi năng lượng tự do chuẩn là âm, lớn hoặc phản ứng là thoát nhiệt mạnh. Nói cách khác ATP có thế mạnh chuyền nhóm Photphat và dễ đàng chuyền Photphat cho nước. Thế chuyền nhóm Photphat được quy định là âm của AG° đối với việc loại bỏ thuỷ phân Photphat. Một phân từ có thế chuyền nhóm cao hơn sẽ chuyển Photphat cho phân tử có thê thấp hơn, Như vậy ATP thích hợp khá lý tưởng đối với vai trò là đồng tiền năng lượng. ATP được tạo thành trong các quá trình hấp thu và sản sinh năng lượng như quang hợp, lên men và hô hấp hiếu khí. Đứng về kinh tế của tể bào sự phân giải ATP thải nhiệt liên kết với các phản ứng thu nhiệt khác nhau giúp cho các phản ứng này được hoàn thành (hình 16.6). Nói cách khác ATP liên kết các phản ứng sinh năng lượng vói các phản ứng sử dụng năng lượng. 16.1.5. Các phản ứng oxy hoá - khử và các chất mang electron Sự thay đổi năng lượng tự do không chỉ liên quan tới cân bàng của các phản ứng hoá học thông thường mà còn tới cân bằng của các phản ứng oxy hoá-khử. Việc giài phóng năng ỉượng thường bao gồm các phản ứng oxy hoá-khử là các phản ứng trong đó các electron được chuyển từ chất cho (hoặc chất khử) tới chất nhận elecừon (hoặc chất oxy hoá). Theo quy ước một phản ứng như vậy sẽ được viết với chất cho nẳm ở phía bên phải của chất nhận cùng với số (n) electron (e') được chuyển: Cặp chẩt nhận và chất cho được gọi là cặp redox (bảng 16.1). Khi một chất nhận nhạn các electron nó sẽ trở thanh chât cho của cặp. Hăng số cân bằng đối với phản ứng được gọi là thế khử chuẩn (Eo) và là đại lượng đo xu hướng mất electron của chất khử. Tiêu chuẩn tham khảo dùng cho các thế khử là hệ thống hydro với E ’ (thế khử ở pH 7 0) là -0,42V hoặc -420mV. 112

2H+ + 2e __ ^

H2

Trong phản ứng này mỗi nguyên tử hydro cung cấp một proton (H+) và một electron (e‘). Chất nhận + ne" — Chất cho Phản ứng nội năng đơn độc A + B ~------------------- - c + D

Phản ứng nội năng liên kết với sự phân giải ATP ATP

V

A + B -----

ADP + p

>

s c +D

Hình 16.6. ATP như một tác nhân liền kết. Việc sử dụng ATP để tạo thành các phản ứng nội năng ỉà thuận lợi hơn. ATP được tạo thành bởi các phản ứng ngoại năng, sau đó được dùng để hướng dan các phản ứng nội năng. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005). Bảng 16.1: Các cặp oxy hóa - k h ử chọn lọc quan trọng về sinh học (Theo: Prescott và cs, 2005) Cặp ôxi hóa khử 2H++ 2e'--------- > H2 Ferredoxin(Fe5 ) + e----- — > Ferredoxin (Fe2*) NAD(P)+ + H++ 2e' ---- -----> NADP(H) s + 2H++ 2e --------- > H2S Acetaldehit + 2H+ + 2e" --------- > etanol ■> Laetal Pyruvat + 2H + 2e -> FADH, FAD + 2Hf + 2ê Oxaloaxetat2' + 2H++ 2ẽ --------- > maiat Fumarat2’ + 2H++ 2e' - --------> xuccinat2' Cytocrom b (Fe3+) + e' ---------> Cytocrom b (Fe2‘) Ubiquinone + 2H + 2e ---------> Ubiquinone H2 Cytocrom c (Fe ) + e ■■- > Cytociom c (Fe ) N 02' + HiO N 03"+ 2H+ + 2e' -------N 02 + 8H+ + 6e' ■> NH4++ 2H20 Fe ++ e ^ Fe2 0 2+4Ht + 4e‘ --------- > 2HịO a/

E’o (Von)a -0,42 -0,42 -0,32 - 0,274 -0,197 -0,185 0,18b -0,166 0,031 0,075 0,10 0,254 0,421 0,44 0,771 0,815 -

là thể khứ chuẩn ở pH 7,0. 113

b/ Giá trị đối với FAD/FADH2 ứng dụng cho cofactor (ự do vì nó có íhể thay đối đáng kể khi liên kết với I apoenzym. cỉ Giả trị đối với Fe tự do không phải Fe gắn với protein (vỉ dụ các Cytocrom). Thế khử có ý nghĩa cụ thể. Các cặp redox với thế khử âm hem sẽ chuyền electron cho các cặp với thế khử dương hơn và ái lực lớn hơn đối với các elecừon. Do đó các electron sẽ có xu hướng di chuyển từ các chất khừ ở chóp của bảng 16.1 đến các chất oxy hoá ở đáy vì chúng cỏ thế dương hơn. Bằng mắt thường, điều này có thể được thể hiện ở dạng cùa một tháp elecừon ừong đó các thế khử âm nhất là ở chóp (hình 16.7). Các electron đi chuyển từ các chất cho tới các chất nhận xuôi theo gradien điện thế hoặc rơi xuống tháp đến các điện thế đương hơn. Ta hãy xem trường hợp của chất mang electron NAD+ (nicotinamit adenin - đinucleotit). Cặp NAD+/NADH có E rất âm, và vì vậy có thể cho electron tới nhiều chất nhận kể cả Ơ2-

Chất cho electron tốt han

fó (Volts) -0.5 -» 2HVHS[-0.42]

_0 4 _

NAD7MADH [-0.32] FAD/FADHj [-0.18]

ữJÌ -

0.2

-

2e-

- 0.1 -

Fumarate/succinate [0.031]

~

CoO/CoQHj [0.10]

+0.1 -

Cyt c (Fe3>ycyt c (Fe2*) [0.2543

+0.2-

NADH

— ► HjO + NAD*

+03N037N02~[p.421]

Fe3+/Ffl*+ FD.7711 VjO /H jO 0.815]

Chất nhận electron tốt hơn

Hình / 6.7. Sự di chuyển của electron và các thể khử. 114

v,0 2 2 1.14V)

Tháp electron thẳng đứng có các thế khử âm nhất ở đinh. Các electron chuyển dịch ngẫu nhiên từ các chất cho cao hơn trên tháp (các thế hiệu âm hơn) tới các chất nhận thấp hơn trên tháp (các thế hiệu dương hơn). Nghĩa là, chất cho trên tháp bao giờ cũng cao hơn chất nhận. Chẳng hạn NADH sẽ chuyền các electron tới oxy và tạo thành nước trong quá trình. Một số chất cho và chất nhận điển hình được ghi ở bên trái và thế oxy hóa khử của chúng được cho trong ngoặc đơn. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005). NAD+ + 2H+ + 2e' -O

2

NADH + H+

+ 2H+ + 2e"

H20

E 0 = -0,32V

E'ữ = +0,82V

Vì NAD+/NADH âm hơn —O 2/H 2O các electron sẽ di chưyển từ NADH (chất khử) tới O2 (chất oxy hoá) như ở hình 16,7. NADH + H+ + ì o 2 -> H20 + NAD+ 2 Khi các electron di chuyển từ một chất khử tới một chất nhận với một thế oxy hoá khử dương hơn năng lượng tự do sẽ được giâí phóng. AG° của phản ứng liên quan trực tiếp tới mức độ sai khác giữa thế khử của hai cặp (AE o). AE o càng lớn thì năng lượng tự do thoát ra cũng càng lớn như chỉ ra bởi phương trình sau: AG 0= -nFAE 0. Ở đây n là sổ electron được chuyển và F là hằng sổ Faraday (23,062 cal/mol-von hoặc 96,494 J/mol-von). Với mỗi thay đổi 0,1V trong AE^ sẽ có sự thay đổi 4,6 kcal tương ứng trong A G 0 và K«q trong các phản ừng hoá học khác nghĩa là hàng số cân bằng càng lớn thì AG^ cũng càng lớn. Sự khác nhau trong thế khử giữa NAD+/NADH và —O 2/H2O là 1,14V, một giả trị A E 0lớn. Trong hô hấp hiểu khí khí các elecừon di chuyển 2 từ NADH tới O 2 một lượng lớn năng lượng tự do được dùng để tổng hop ATP (hình ỉ 6,8) \

NADH + H++ - ơ 2 2

NAD+ + H20

AE' = 52,6 kcal.moĩ1 0

Khi các electron di chuyển từ các thế khử âm đến cảc thế khử dương năng lượng sẽ được giải phóng; trái lại, khi các electron di chuyển từ các điện thế dương hơn đến các điện thế âm hơn năng lượng sẽ cần để đẩy các electron theo hướng ngược lại như diễn ra trong quang hợp (hình 16.8), ờ đây quang năng được thu nhận và được dùng để đẩy các electron từ nước tới chất mang electron nicotinamit dinucleotit Photphat (NADP+). Như hình 16.7 đã chỉ đẫn các sinh vật quang hợp thu nhận và sử dụng quang năng để vận chuyển các electron từ nước (và các chất cho electron khác như H 2S) đến các chất nhận elecưon như NADP+ có các thế khử âm hơn. Sau đó các elecưon này cỏ thể di chuyển ưở lại tới các chất nhận dương hơn và cung cấp năng lượng để tạo thành ATP trong quang 115

hợp. Các cơ thể quang tự đưỡng sử dụng ATP và NADPH để tổng họp các phân tử phức tạp từ C 0 2. Các sinh vật hóa dị dưỡng cũng sử dụng năng lượng giải phóng ra trong sự vận chuyển cùa các electron nhờ sự oxy hoá các chất dinh dưỡng phức tạp trong hô hấp để tạo thành NADH. Sau đó NADH chuyền các electron cho O2 và năng lượng thoát ra trong sự vận chuyển electron được giữ lại ở dạng ATP. Năng lượng từ ánh sáng mặt trời được sử dụng bời tất cả các sinh vật chính vì mổi quan hệ này giữa đòng electron và năng lượng.

E 0 âm hơn NADH

NADP*

Năng lượng

Eodưvng I hơn

I

^ ■

I

ATP

anh sảng

Hình ỉ 6.8: Dòng năng luợng trong trao đổi chất. hấpđòng hiếu electron khí Quang oxytrao đổi chất. Những ví dụ của mối quanị hệHÔ giữa và năng hợp luợngthải trong Oxy và NADP+ được dùng I/Tlàm và nước. (Theo o . nchẩt i ____nhận » I electron J .. _ lần , lượt từl íNADH . Prescott, Harley và Klein, 2005).

H 0 I ìí Cơ chất Ftedu' ead ^»ửrI*

aubatran

R

híAD'

Oxidized

I Ft NAŨH

(a) Cấu trúc của NAD và NADP. NADP khác với NẢD ờ chỗ có thêm ì Photphat trên một trong các đitừng riboza; (b) NAD có thể nhận các electron và ỉ hydro tie cơ chất khừ (Stìý. Các electron và hydro này được mang trên vòng nicotinamỉt. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005).

Sự vận chuyển electron có ỷ nghĩa quan trọng trong hô hấp hiếu khí, hô hấp kỵ khí, hoá dường vô cơ và quang hạp. Sự vận chuyển electron trong tế bào cần sự tham gia của các chất mang như NAD+ và NADP+, cả hai chất này đều có thể vận chuyển electron giữa các vị trí khác nhau. Vòng nicotinamit của NAD+ và NADP+ (hình Ỉ6.9) tiếp nhận hai electron này và một proton từ một chất cho, còn proton thứ hai đuợc tách ra.

Vòng izoalloxazine

Isoalloxazine ring

Ribose H— c — QH

H~c —OH I

II

0 II

\

CH, —0 — p — o ~ p — 0 —CH.^o~v

I 0'

K

N

ỹ OH

OH

Ribose

Hình 16.10: cấu trúc và chức năng cùa FAD. Vitamin riboflavin bao gồm vòng izoalloxazin và đường riboza gắn vào. FMN là riboflavin Photphat. Phần cùa vòng trirc tiếp tham gia vào các phàn ứng oxy hóa khừ là phần có màu. (Theo Prescott, Harỉey và Klein, 2005).

Một số chất mang electron khác có vai ưò trong trao đổi chat cùa vi sinh vật cũng được nêu ưong bảng 16.1; các chất này mang electron theo các cách khác nhau. Flavin-

1i 7

adenin đinucleotit (NAD) và flavin-mononucleotit (FMN) mang 2 elecừon và 2 proton trên hệ thống vòng phức tạp {hình 16.10). Các protein chứa FAD và FMN thường được gọi là flavoprotein. Coenzym Q (CoQ) hoặc Ubiquinone là một quinon vận chuyển các elecừon và các H+ trong nhiều chuỗi vận chuyển electron hô hấp (hình Ì6.ỈĨ). Cảc cytocrom và một số chất mang khác sử dụng các nguyên tử sắt để vận chuyển electron qua các phản ứng oxy hoá - khử thuận nghịch: Fe3+ (sắt ferric)

—

Fe2+ (sắt ferrous)

Trong cytocrom các nguyên tử sẳt này là một phần của nhóm hem (hình ỉ 6.12) hoặc của các vòng sắt - porphyrin tương tự khác. oQ

ÒQ / V

0

0

Hình Ỉ6.ĨỈ. Cent trúc và chức năng của Coenzym Q hoặc Ubiquinone. Chiều dài của chuôi bên thay đổi tùy theo cơ thể với n ~ 6 đến n = 10. (Theo Prescott và cs, 2005). Các chuỗi vận chuyển electron hô hấp thường chứa cytocrom bao gồm một protein và một vòng sất - porphyrin. Một số protein mang electron chứa sát thiếu nhỏm hem và được gọi ỉà các protein sắt không - hem. Ferredoxin (Fd) là một protein sắt không-hem hoạt động trong việc vận chuyển electron quang họp và một số quá trình vận chuyển electron khác. Mặc dù nguyên tử sắt ở chúng không gắn với nhóm hem nhưng chúng vẫn thực hiện được các phản ứng oxy hoá. cần chú ý răng trong số các phân tử tham gia vào

118

chuỗi vận chuyển electron nói trên, ở mỗi thời điểm, một số mang hai electron (như NAD, FAD và CoQ), số khác (như các cytocrom và các protein sẳt không-hem) chỉ mang một electron. Sự khác nhau trong số lượng electron được vận chuyển có ý nghĩa rất quan trọng trong hoạt động của các chuỗi vận chuyển elecừon.

CH, p CH

^ CH,

H—C - O H

/ Á CHj

CH. I CH (CHj)3

(CHJj

H

CH3

Á I

o o

V

>c — CH — CHj

— c ỉ N ----

L

ỉ

I

I

T

H

CH,

!

c

H

\ - H

CH. CH. 1 COOH

CHj

c A I

C— N

H C - /

CH, I CH

T

CH, I COOH

Hình 16.12; cẩu trúc cùa Hem. Hem bao gồm 1 vòng porphyrin gán với 1 nguyên tử sắt. Đây là thành phần khôngprotein của nhiều Cytocrom. Nguyên tử sát luân phiên tiếp nhận và giải phóng 1 electron. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005). 16.2. ENZYM Như đã nói ở trên một phản ứng íhoát nhiệt là một phản ứng có AG° âm và hằng sổ cân bằng lớn hơn 1 và có thể diễn ra triệt để nghĩa là về phía bên phải của phương trinh. Tuy nhiên, người ta thường có thể hỗn hợp các chất phản ứng của một phản ứng thoát nhiệt mà không thấy kết quả rõ ràng mặc dù cảc sản phẩm có thể được tạo thành. Chính enzym đóng vai trò trong các phản ứng này.

119

16.2.1. Cấu trúc và phân loại các enzym Enzym là các chất xúc tác có bản chất protein, cỏ tính đậc hiệu cao đối với phản ứng xúc tác và với các phân từ chịu xúc tác. Chât xúc tác là một chât làm tăng tôc độ của một phản ứng hoá học mà bản thân không bị thay đổi. Do đó enzym thúc đẩy các phàn ứng của tế bào. Các phân tử phản ứng được gọi là cơ chất và các chất tạo thành được gọi là sàn phẩm. Nhiều enzym là các protein thuần khiết, nhưng cũng không ít enzym gồm hai thành phàn: thành phần protein (gọi là apoenzym) và phần không - protein (gọi là cofactor); cả hai cần cho hoạt tính xúc tác và enzym gồm cả hai thành phần trên được gọi là holoenzym. Cofactor được gọi là nhóm thêm (prosthetic group) riếu gẳn chặt vào apoenzym. Nhưng thường thì cofactor gắn lỏng lẻo với apoenzym, thậm chí có íhể phân li khỏi protein enzym sau khi các sản phẩm đã được tạo thành và mang một trong các sản phẩm này đến một enzym khác. Cofactor gắn lỏng lẻo nói ưên được gọi là coenzym. Chẳng hạn, NAD+ là một coenzym mang các elecừon bên trong tể bào. Nhiều vitamin mà con người cần đóng vai trò là các coenzym hoặc là tiền chất (precursor) của các coenzym. Niaxin được lắp vào NAD+ và riboflavin được lắp vào FAD. Các ỉon kim loại cũng có thể liên kểt với các apoenzym và tác dụng nhu các cofactor. Bảng 16.2. Phân loại enzytn (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005) Loại enzym

Phản ứng do enzym xúc tác

Oxydoreductaz

Các phản ứng oxy hóa khử

Lactat dehitrogenaz: Pyruvat + NADH + H Lactat + NAD+

Transferaz

Các phàn ứng chuyển nhóm giữa các phân tử

Aspatat e Carbamoyltransferaz: Aspatat e + CarbamoylPhotphat Carbamoylaspatat e + Photphat

Hydrolaz

Thủy phân các phân tử.

Lyaz

Loại bò các nhóm để tạo thành các nối đôi hoặc bổ sung các nhóm vào nối đôi.

Fumarat hydrataz: L-malat Fumarat + H20

Ixomraz

Các phản ứng xúc tác đồng phân hóa.

Alanin raxemaz: L-Alanin ĨI* D-Alanin

Ligaz

Nối 2 phân tử nhờ năng luợng cùa ATP (hay cùa các nucleozit triphotphat khác)

Glutamin syntetaz: Glutamat + N H 3 + ATP ATP + Pi

Ví dụ phản ứng

Glucoz-6-Photphataz: Glucoz-6-Photphat + H2O -* Glucoz + Pi

Glutamin +

Mặc dù tê bào chứa một sô lượng lớn và rất đa dạng các enzym nhưng chúng có thể được xêp vào một trong 6 nhóm (bảng 16.2). Tên của các enzym thường được đặt theo tên 120

cơ chất mà chúng tác dụng lên và loại phản ứng được xúc tác. Ví dụ, Lactat dehitrogertaz (LDH) loại bò hydro khỏi Lactat: Lactat + NAD+

Pyruvat + NADH + H+

Lactat dehitrogenaz cũng có thể được đặt tên đầy đủ và chi tiết hon là L-Lactat: NAD oxydoreductaz. Tên này mô tả các cơ chất và loại phản ứng chính xác hơn. 16.2.2. C ơ chế của các p hản ứng enzym Cần nhớ ràng các enzym tăng cường tốc độ phản ứng nhưng không làm thay đổi hằng số cân bằng. Nếu một phản ứng lả thu nhiệt enzym sẽ không chuyển dịch cân bằng và nhiều sản phẩm hơn sẽ được tạo thành. Các enzym chỉ nâng cao tốc độ mà ờ đỏ phản ứng diễn ra theo hướng cân bằng cuối cùng. Để hiểu được enzym xúc tác các phản ứng như thế nào ta hãy xem xét diễn biến của một phản ứng hoá học thải nhiệt bỉnh thường sau đây: A+B

C+D

Khi các phân tử A và B tiếp cận nhau để phản ửng chúng sẽ tạo thành một phức hợp ờ trạng thải quá độ cho cả cơ chất và sản phẩm (hình Ỉ6.Ỉ3) E,

■1 Hình ỉ 6. ỉ 3: Coenzym như các chất mang. Chức năng của 1 coenzym trong vai trò mang các chất đi khắp tế bào. Coenzym c cùng với enzym El tham gia chuyển hóa A thành sản phẩm B. Tròng quá trình phản ứng coenzym c nhận X từ cơ chất A và có thể chuyển X sang cơ chất p trong phản ứng 2. Kết quả là coenzym lại trờ về dạng ban đầu đề sẵn sàng tiếp nhận IX khác. Coenzym không chi tham gia vào 2 phàn ứng mà còn vận chuyển X đí khắp tể bào. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005). Năng lượng hoạt hoả là cần nhàm mang các phân tử phản ứng tiểp xúc với nhau theo một cách chính xác để đạt được trạng thái quả độ (hay chuyển tiếp). Phức hợp ở trạng thái 121

quá độ có thể phân ly để tạo thành các sản phẩm c và D. Sự khác nhau trong mức độ năng lượng tự do giữa các chất phản ứng và các sàn phẩm là AG° . Vì vậy, trong ví dụ nêu trên cân bàng sẽ nằm về phía các sản phẩm vì AG° là âm (nghĩa là các sản phẩm ờ mức năng lượng thấp hơn cơ chất). Trong hỉnh 16.13 rõ ràng A và B không thể chuyển hoá thành c và D nếu chúng không được cung cấp một lượng năng lượng tương đương với năng lượng hoạt hoá. Enzym thúc đẩy các phàn ứng bằng cách hạ thấp năng lượng hoạt hoá. Do đỏ nhiều phân tử cơ chất hơn sẽ có năng lượng đẩy đủ để tiếp cận nhau và tạo thành sản phẩm. Mặc dù hàng số cân bàng (hoặc AGỸ ) không thay đổi nhưng cân bằng sẽ đạt được nhanh hơn khi có mặt enzym do năng lượng hoạt hoá giảm.

Hình 16.14: Enzym hạ thấp năng ỉuợng hoạt hóa. Trong tiến trình của 1 phản ứng hóa học nêu trên A và B được chuyển thành c và D. Phức hợp chuyển tiếp được biểu thị bởi AB* và năng luợng hoạt hỏa cần để đạt được trạng thái này bởi Ea. Đường đỏ biểu thị tiển trình của phản ứng trong sự có mặt của 1 enzym. Cần chú ỷ, năng luợng hoạt hóa trong phản ứng có enzym xúc tác thấp hcm rất nhiều. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005). Sở dĩ enzym có khả năng hạ thấp năng lượng hoạt hoả của các phản ứng vì chủng mang các cơ chât lại gân nhau tại một điểm đặc biệt gọi là vị trí hoạt động hoặc vị trí xúc tác để tạo thành phức hợp enzym - cơ chất (hình 16.15 và 16.16). Sự tương tác giữa cơ chất và enzym có thể diễn ra theo hai con đường: 1. Enzym có hình dạng cô định, khớp với hình dạng của cơ chất giúp cho cơ chất liên kết chính xác vả thuận lợi cho phản ứng diễn ra.

2. Enzym thay đổi hình dạng khi gắn với cơ chất tạo điều kiện cho vị trí xúc tác bao quanh và khớp chính xác với cơ chất. Cơ chể diễn ra theo con đường thứ nhẩt được gọi là mô hình “ổ khoả và chìa khoá” (lock - and - key model). Theo con đường thử hai cơ chế được gọi lả mô hình “khớp cảm ứng” (induced fit). Mô hình này được ứng dụng cho hexokinaz và nhiều enzym khác (hình 16.16). C ơ chất

Vị trí hoạt động

]

Enzym

Phức hợp cơ chẩt-enzym Sản phẩm

Hình ỉ 6. Ị 5. Chức năng cùa enzym. Sự tạo thành phức hợp enzym-cơ chất và chuyến hóa phức hợp thành 1 sản phẩm. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005).

Hình 16.16. Một ví dụ về sự tạo (hành phức hợp enzym~cơ chất. a) Mô hình đầy đù cùa hexokinaz nấm men và cơ chầí Glucoz (màu tỉa). Vị trí hoại động trong khe tạo thành bởi thùy nhỏ cùa ertzym (màu lục) và thùy lớn Ịmàu xám), (b) Khỉ GỈUC02 ỉiên kết đế tạo 123

thành phức hợp enzym-cơ chất hexokinaz thay đổi hình dạng và bao quanh cơ chất. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005).

Việc tạo thành pbủc hợp enzym - cơ chất có thể hạ thấp nãng lượng hoạt hoá theo một số cách. Chẳng hạn, bằng cách mang các cơ chất lại gần nhau tại vị trí xúc tác, trên thực tế, enzym đã làm tăng nồng độ của chúng và thúc đẩy phản ứng. Tuy nhiên, một enzym không chỉ đơn giản làm đậm đặc nồng độ các cơ chất của chúng mà còn liên kết các cơ chất sao cho các cơ chất này hướng chính xác với nhau để tạo thành phức họp ờ trạng thái quá độ. Một sự định hướng như vậy sẽ hạ thấp lượng năng lượng mà các cơ chất cần để đạt được trạng thái quá độ. Các hoạt tính này và các hoạt tính khác của vị trí xúc tác đã tăng cường phản ứng hàng trăm nghìn lần bất kể vi sinh vật sinh trưởng giữa 20 °c và khoảng 113°c. Những nhiệt độ nảy không đủ cao để giúp cho hầu hết các phản ứng hữu cơ trong sự vắng mặt của enzym, hơn nữa các tể bảo không thể sống sót ờ những nhiệt độ cao dùng bởi một nhà hoá học hữu cơ trong các quá trình tổng hợp hữu cơ thường ngày. Enzym giúp cho sự sống tồn tại bằng cách thúc đẩy các phàn ứng đặc biệt ở nhiệt độ thấp. 16.2.3. Tác động của môi trường lên hoạt tính enzym Hoạt tính enzym thay đổi rõ rệt với sự thay đổi của các yếu tố môi trường mà một trong các yếu tố quan trọng nhất là nồng độ cơ chất. Như ta đã biết, nồng độ các cơ chất bên ừong tế bào thường thấp. Ở nồng độ cơ chất rất thấp enzym chậm tạo thành sản phẩm do ít khi được tiếp xúc với phân từ cơ chất. Nếu có mặt nhiều phân tử cơ chất hơn enzym sẽ liên kết cơ chất thường xuyên hơn và tổc độ phản ứng (thường được thể hiện như tốc độ tạo thành sản phẩm) cũng lớn hom ở nồng độ cơ chất thấp hơn. Do đó tốc độ của một phản ứng do enzym xúc tác tăng lên theo nồng độ cơ chất {hình 16.17). Tuy nhiên nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng cững không tăng nữa vì các phân tử enzym đã bão hoà cơ chất và đang chuyển hốá cơ chất thành sản phẩm với tốc độ cực đại ( vmnx). Đường cong cùa nồng độ cơ chất bây giờ sẽ là dường hyperbon (hỉnh 16.17). Đẻ biết được nồng độ cơ chất mà một enzym cần để hoạt động thích hợp người ta thường dùng hàng sổ Michaelis (Km). Đây là nồng độ cơ chất enzym cần để thực hiện được một nủa tốc độ cực đại và được dùng như một đại luợng đo ái lực thực sự của một enzym đổi với cơ chất. Giá trị Km càng thấp có ý nghĩa là nồng độ cơ chất mà enzym xúc tác phản ứng cũng càng thấp.Hoạt tỉnh enzym cũng thay đồi theo sự thay đổi cỏa pH và nhiệt độ {hình ỉ 6. ỉ 8).

124

Hình ỉ 6. ỉ 7. Động học Mỉchaelis-Menten. Sự phụ thuộc của hoại tính enzym vào nồng độ cơ chẫt. Đường cong cơ chất ờ đây khớp với phương trình Michaeỉis-Menten cho trong hình; phtrơng trình này liên kết tốc độ phản ứng (Vj với nồng độ cơ chất (S) khi sừ dụng tốc độ cực đại và hằng số Michaeỉis (Km). Km - nồng độ cơ chất enzym cần đế hoạt động ở nửa tốc độ cục đại. Vmax = tốc độ tạo thành sàn phẩm khi enzym được bão hòa cơ chất và hoạt động nhanh toi đa. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005). Mỗi enzym hoạt độn^ mạnh nhất ờ một pH thích hợp nhất. Khi pH chệch xa khỏi giá trị tối thích hoạt tính của enzym sẽ giảm đi và enzym có thể bị hư hại. Với nhiệt độ enzym cũng có giá trị tối thích cho hoạt tính cực đại. Nếu nhiệt độ tăng quá cao so với giá trị tối thích cấu trúc của enzym sẽ bị huỷ hoại và enzym mất hoạt tính. Hiện tượng biến tính (đenaturation) này của enzym có thể là hậu quả của các giá trị quá độ (tột cùng) của pH và nhiệt độ hoặc các yếu tố khác. Các giá trị tối thích cùa pH và nhiệt độ của các enzym vi sinh vật thường phản ánh pH và nhiệt độ nơi sống của chúng. Dó đó, ta dễ hiểu, các vi khuẩn sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ cao thường có các enzym với nhiệt độ tối thích cao và độ bền nhiệt độ lớn.

125

5

7

10

10

30 50 Nhiệt độ (°C):)

pH

70

Hỉnh 16.18: pH, nhiệt độ vò hoạt tính enzym. Sự thay đổi hoạt tỉnh enzym cùng với những thay đổi trong pH và nhiệt độ. Phạm vi pH và nhiệt độ ờ đây chi là tượng trưng. Các enzym khác nhau về vị trí của điềm tối thích và hình dạng của các đuờng cong pHvà nhiệt độ. (Theo Prescott, Harỉey và Klein, 2005). 16.2.4. Sự kìm hãm enzym Nhiều hoá chất là độc đổi vi sinh vật và những chất độc mạnh nhất chính là những chất kìm hăm enzym. Một chất kìm hăm cạnh tranh trực tiếp cạnh tranh với cơ chất ở vị trí xúc tác của một enzym và ngăn cản enzym tạo thành sản phẩm. Chẳng hạn, xuccinat dehitrogenaz là enzym xúc tác sự oxy hoá xuccinat thành fumarat trong chu trinh Krebs. Axit malonic có cẩu trúc tương tự xuccinat đo đó là chất kìm hãm cạnh tranh của enzym nói trên. Sau khi liên kết vào enzym malonat không bị oxy hoá và việc tạo thành fumarat không diễn ra. Các chất kìm hãm cạnh ừanh thường chỉ vói các cơ chất bình thường nhưng không thể bị chuyển hoá thành các sản phẩm. CQOH I

CHj I

ỌOOH ĩ CH. I

H' COOH Succinic acid

*

COOH Melonic acid

Hình ỉ ó. Ị 9: Kìm hãm cạnh tranh của xuccinat-dehitrogenaz. Axit malomc cỏ cau trúc tương tự ax.it succinic do đó là chất kìtn hãm cạnh tranh cùa enzytn nổi trên. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005). Các chât kìm hãm cạnh tranh được sừ dụng để điều trị nhiều bệnh đo vi sinh vật. Chảng hạn các thuôc sulfa như sulfanilamit chi với /?-aminobenzoat là một phân từ đùng

trong việc tạo thành coenzym axit folic. Các thuốc cạnh tranh với /?-aminobenzoat đối với vị trí xúc tác của một enzym tham gia tổng hợp axit folic do đó ngăn cản sự tạo thành axit folic và kỉm hãm sinh trưởng của vi khuẩn. Cơ thể người không chịu tác dụng của thuốc đo không có khả năng tổng hợp axit folic và phải thu nhận axit này từ thức ăn. 16.3. TÍNH CHÁT VÀ Ý NGHĨA CỦA VIỆC ĐIÈƯ CHỈNH TRAO ĐỎI CHÁT Bộ máy điều chỉnh có vai trỏ cực kỳ phức tạp và khó khăn. Các con đường cần phải điều chình và phối hợp có hiệu quả sao cho tất cà các thành phần cùa tế bào đều có mật với số lượng thích hợp, chính xác. Hơn nữa tế bào vi sinh vật phải có khà năng đáp ứng rất kịp thời với những thay đổi của môi trường bằng cách sử dụng các chất dinh dưỡng hiện có và bằng cách bật mở các con đường dị hoá mới khi có mặt các chất dinh dưõng khác. Vì tất cả các thành phần hoá học của một tể bào thường không tồn tại ưong môi trường, do đó vi sinh vật cũng phải tổng hợp chúng và phải thay đổì hoạt tính sinh tồng hợp đáp ứng với những thay đổi trong việc sử dụng chất dinh dưỡng. Thành phần hoá học của môi trường bao quanh tế bào thường xuyên thay đổi, đo đó các quá trinh điều chỉnh này cũng phải năng động và phải liên tục đáp ứng với các điều kiện thay đồi. Việc điều chỉnh là cần thiết cho tế bào vi sính vật duy trì được năng lượng, vật chất và cân bằng trao đổi chất. Nếu một nguồn năng lượng đặc biệt không có mặt, các enzym cần cho việc sử dụng nguồn nãng ỉượng này là không cần thiết vả việc tổng hợp chúng tiếp tục sẽ là một sự tiêu phí c , N và năng lượng. Cũng tương tự như vậy, sẽ là rất vô ích đối với vi sinh vật náu chúng tồng hợp các enzym cần cho việc tạo thành một sản phẩm cuối cùng nào đó khi sản phẩm này đã có mặt với số lượng đầy đủ. Như vậy, cả dị hoá và đồng hoá đều được điều chỉnh theo cách sao cho hiệu quả của hoạt động đạt được tối đa. Cỏ thể thấy rõ xu hướng duy trì cân bằng và bảo tồn năng lượng của vật chất trong sự đáp ứng điều chỉnh ờ vi khuẩn E. coli... Khi sinh trưởng ừong một môi trường rất đơn giản chỉ chứa glucoz là nguồn c và nguồn năng lượng vi khuẩn sẽ tổng hợp các thành phần mà tế bào cần với số lượng cân bằng (chẳng hạn axit amin tryptophan). Việc bổ sung một sản phẩm sinh tổng hợp cuối cùng vào môi trường sẽ đẫn đến kim hãm ngay lập tức con đường tồng hợp sản phẩm cuối cùng nói trên. Việc tổng hợp các enzym cùa con đường cũng sỗ bị ngừng hoặc chậm lại. Nếu chuyển E. coli sang môi trường chỉ chứa lactoz, vi khuẩn sẽ tổng hợp các enzym cần cho sự chuyển hoá đường này. Trái lại, khi sinh trưởng trong môi trường chửa cả glucoz và lactoz E. coỉi sẽ sử dụng glucoz đầu tiên vì đây là loại đường đơn giúp cho sinh trưởng của vi khuẩn diễn ra nhanh nhất chỉ sau khi glucoz đã cạn kiệt, lactoz mới được sử dụng. Dòng cacbon chuyển hoá qua con đường có thể được điều chỉnh theo ba cách chủ yếu:

127

1. Tập trung các chất trao đổi và các enzym trong nhừng phân khác nhau của tê bào, từ đó ảnh hưởng đến hoạt tính của con đường, 2. Các enzym quan trọng thường được kích thích hoặc bị kìm hâm trực tiếp nhằm thay đổi nhanh hoạt tính của con đường, 3. Số lượng các phân tử enzym cũng có thể được điều hoà. Các phân tử chất xúc tác cỏ mặt càng nhiều thì hoạt tính của con đường càng lớn. Ở vi khuẩn, việc điều chinh thường chịu tác dụng ở mức độ phiên âm. Việc điều hoà tổng họp mARN chậm hơn việc điều chinh trực tiếp hoạt tính enzym nhưng tiết kiệm được nhiều nàng lượng và nguyên liệu vì các enzym không được tổng hợp khi không cần thiết. Hai cơ chế 1 và 2 sẽ được trinh bày ở đây, đó là: khu trú trao đổi chất và điều hoà hoạt tính enzym. 16.4. KHU TRÚ TRAO ĐỎI CHÁT (Metabolic Channeling) Một trong các cơ chế khu trú trao đổi chất phổ biến nhất là sự chia khoang (compartmentation) nghĩa là sự phân bố biệt hoá các enzym và các chất trao đổi trong các cấu trúc tế bào tách biệt hoặc các bào quan có màng bao bọc. Chẳng hạn, sự oxy hoá axit béo gặp bên trong ty thể nhưng tổng hợp axit béo lại diễn ra trong tế bào chất. Chu chất ờ vi khuẩn cũng có thể được xem là một ví dụ của sự chia khoang. Sự chia khoang tạo điều kiện cho việc hoạt động và điều chỉnh đồng thời nhưng iách biệt của các con đường cỏ thể được phối hợp nhờ sự điều chỉnh việc vận chuyển các chất trao đổi và các coenzym giữa các khoang của tế bào. Giả dụ, có hai con đường tồn tại ừong các khoang tể bào khác nhau nhưng đều cần NAD+ cho hoạt động. Sự phân bố NAD+ giữa hai khoang sẽ quyết định hoạt tính tương đối của các con đường cạnh tranh này và con đường nào chiếm dư thừa NAD+ sẽ có lợi thế hom. Sự chia khoang cũng gặp bên trong các khoang như nền tế bào chất. Nên (matrix) là vật thể đông đặc, có cấu trúc gồm nhiều khoang nhô. Ở sinh vật nhân thật nền cũng được chia nhỏ bởi lưới nội chất (endoplasmic reticulum) và bộ khung tế bào (cytoskeleton). Trong một môi trường như vậy các chất trao đổi và các coenzym không khuếch tán nhanh và các gradien chất trao đổi sẽ được thiểt lập gần các enzym hoặc cảc hệ thống enzym cục bộ. Điều này điễn ra vì các enzym ở một vị trí đặc biệt chuyển hoá các chất thành sản phẩm dẫn đến giảm nồng độ cùa một hoặc nhiều chất trao đổi này và tăng nồng độ của một hoặc nhiều chất trao đổi khác. Chẳng hạn, nồng độ sản phẩm sẽ cao ở gần enzym và thấp dàn theo khoảng cách tăng lên tính từ enzym.

1

Sự khu trú cỏ thể tạo ra những thay đổi rõ rệt trong nồng độ chất trao đổi và vì vậy ảnh hưởng trực tiêp đên hoạt tính enzym. Nồng độ cơ chất, nói chung, thường ờ vào 128

khoảng 10 "3 - 10'6M/1, thậm chí thấp hơn, nghĩa là có thể ở trong cùng phạm vi như nồng độ enzym và bằng hoặc nhỏ hơn hằng số Michaelis ịKm) của nhiều enzym. Dưới các điều kiện như vậy nồng độ cơ chất của một enzym có thể điều hoà hoạt tính của chất xúc tác vì nồng độ cơ chất là ở trong phần tăng lên của đường cong hyperbon cùa sự bão hoà cơ chất {hình ỉ 6.20).

Hình ỉ 6.20: Điểu hòa hoạt tính enzym bời nồng độ cơ chất. Trong hình là đtròng cong bão hòa enzytti'Cơ chai với hằng số Mỉchaeỉis (Km) và tốc độ tuưng đương với ‘Á tốc độ cực đợi (Vmax)- Tốc độ ban đầu cùa phàn ímg (v) được dimg đồ thị đối với tìồng độ cơ chất. Tốc độ cực đại ĩà tốc độ ỉởìì nhất đạt được với một sổ lượng enzym cố định dưới những

điều kiện xác định. Khi nồng độ cơ chai bằng hoặc nhỏ hơn Km hoạt tính enzym sẽ thay đôi hầu như tuyển tính với nồng độ cơ chất. Giả dụ, nong độ cơ chất tăng từ mức độ A tới mí(c độ B. Vì ììhĩmg nồng độ này đều ở trong phạm vi cùa Km nên hoạt tính enzym tăng íên rõ rệt. Sự giàm nong độ iừ B đến A sẽ hạ thẩp tốc độ lạo thành sàn phẩm, ịTheo Prescott, Harley và Klein, 2005).

Khi nồng độ cơ chất tăng, cơ chất sẽ được chuyển thành sản phẩm nhanh hơn; nồng độ cơ chất giảm đương nhiên dẫn đến hoạt tính enzym thấp hơn. Nếu 2 enzym ở hai con dường khác nhau cùng sử dụng một chất trao đổi chúng cỏ thể trực tiếp cạnh tranh chất này, con đường thấng trong cuộc cạnh tranh này, nghĩa là con đường với enzym có giá trị Km thấp nhất đổi với chất trao đổi, sẽ hoạt động gần như hoàn toàn thống trị. Do đỏ sự khu trú bên trong một khoang tế bào có thể điều chỉnh và phối hợp trao đổi chất thông qua những biển đổi trong nồng độ chất trao đổi và nồng độ coenzym.

I?9

16.5. ĐIÈU HÒA HOẠT TÍNH ENZYME

Hoạt động của nhiều con đường trao đổi chất có thể được điều hoà nhờ việc điều chỉnh hoạt tính của các enzyme điều chinh. Mục này mô tà các enzyme nói trên và đê cập vai trò của chúng trong việc điều chỉnh hoạt tính của con đường. 16.5.1. Đỉều chỉnh dị lập thể Các enzyme điều chỉnh thường là các enzyme dị lập thể (allosteric enzymes). Hoạt tính của một enzyme dị lập thể bị thay đổi bởi một phân tử nhò gọi là effector (effector, chất tác động) hoặc modulator (modulator, chất điều biến). Effector liên kết thuận nghịch nhờ lực không - cộng hóấ trị vào một vị trí điều chỉnh (regulatory site) tách biệt khỏi vị trí xúc tác (catalytic site) và gây ra sự thay đổi trong hình dạng hoặc hình thể của enzyme (Hỉnh ỉ 6.2ỉ). Hoạt tính của vị trí xúc tác đo đó bị thay đổi. Một effector dương làm tăng hoạt tính enzyme, một effector âm, trái lại, làm giảm hoạt tính hoặc kìm hãm enzyme. Những thay đối như vậy trong hoạt tính thường bắt nguồn từ những biến đổi trong ái lực biểu kiến của enzyme đối với cơ chất, tuy nhiên những thay đổi trong tốc độ cực đại cũng có thể diễn ra.

Effector và modulator Cơ chất

cấu trúc và chức năng của I enzyme (ỊỊ lập thể. Trong hình bén effector hoặc modulator (chất điều biến) íriỉởc hết gắn vào ỉ vị trí điều hòa tách biệt và làm thítv đôi hình thê enzyme dan đến sự thay đôi hình dạng cùa vị trí hoạt động. Vị tri hoạt độ nơ giờ có thể liên kết cơ chẩt hiệu quả hơn. ơ đáy effector là dương linh vì nó kich thích sự ỉiê/1 két cơ chất và hoạt íinh xúc tác. (Theo Prescott, Harley vù Klein, 2005). Các enzyme điều chỉnh thường là các enzyme dị lập thể (allosteric enzymes). Hoạt tính cùa một enzyme đị lập thể bị thay đổi bởi một phân tử nhỏ gọi là effector (effector, chất tác động) hoặc modulator (modulator, chất điều biến). Effector liên kết tiiuận nghịch nhờ lực không - cộng hoá trị vào một vị trí điều chỉnh (regulatory site) tách biệt khỏi vị trí xúc tác (catalytic site) và gây ra sự thay đổi trong hình dạng hoặc hình thể của enzyme (Hình 16.21). Hoạt tinh của vị trí xúc tác do đó bị thay đổi. Một effector dương làm tăng hoạt tính enzyme, một effector âm, trái lại, làm giảm hoạt tính hoặc kìm hăm enzyme. Những thay đổi như vậy trong hoạt tính thường bắt nguồn tù những biến đổi trong ái íực biểu kiến cùa enzyme đổi với cơ chất, tuy nhiên nhũng thay đổi trong tốc độ cực đại cũng cỏ ihể diễn ra.

ũ

0 Cartar*oyl phosphite synthetase L-Gliitomne * HCO; ♦ 2ATP ■■

--------►

I 0 -C

•0

II c

I

0

*0 - p ~ 0

CH

H,N

COO'

cr Cartiaroyi pbc»ptia;e

Aspartate

t A1P

f i CTP ■*---- •*— Lndme ronaph3spha:e iL'f/P

Hình 16.22: Sự điều chỉnh ACTcise. Phản ứng Aspartate, cacbamoyhntnsferase và vai trò cĩtit enzyme này trong việc điêu chinh sinh tỏng hợp pyrimidine. Sủrì phủm cuối cùng CTP kìm hãm hoạt tinh cua ACTcise

ị-) còn ATP Ịại hoại hóa enzyme (+). Cacbamoyl Phosphate synthetase cũng bị kìm hàm bới cúc sàn phẩm cuối cùng cùa con đường như UMP. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005). Các đặc tính động học của enzyme không - điều chỉnh chứng minh rằng hằng sổ Michaelis (Km) là nồng độ cơ chất cần cho một enzyme hoạt động ở tốc độ bằng nửa tốc độ cực đại. Hằng số này chỉ ứng dụng cho các đường cong bão hoà cơ chất hyperbon mà không cho các đường cong xích-ma thường gặp với các enzyme dị lập thể (Hình 16.23). Ị

Nồng độ cơ chất cần cho một nửa tốc độ cực đại với các enzyme dị lập thể có đường cong cơ chất xích-ma được gọi là giá trị [S]o,5 hoặc Ko.s. Một trong các enzyme điều chỉnh đị lập thề được nghiên cứu kỳ nhất đỏ là Aspartatecacbamoyltransferase (ACTase) ở E. coli. Enzyme xúc tác sự ngưng tụ của cacbamoylphosphate với aspartate tạo thành cacbamoylaspartate (Hình 16.22), ACTase xúc tác phản ứng quyết định tốc độ của con đường sinh tổng hợp pyrimidine ở E. coỉi. Đường cong cơ chất bão hoà là xích-ma khi nồng độ của một trong hai cơ chất

\i C ơ chất

Hình Ị 6.23: Động học cùa Aspartate cucbamoyltransferase ờ E. ColL

CTP lả Ị effecior âm làm tăng giả trị K0J, còn ATP ỉà ỉ effector dương, hụ thấp K0ỹ. vmia van là hằngsồ. (Theo Prescott, Harỉev và Klein 2005). 132

Enzyme có trên một vị trí hoạt động và sự liên kết cùa một phân tử cơ chất vào một vị trí hoạt động sẽ kích thích sự liên kết của cơ chất vào các vị trí khác. Hơn nữa, cytidine triphosphate (CTP), một sản phẩm cuối cùng cùa sinh tổng hợp pyrimidine, kim hãm enzyme, trái lại ATP (purine) lại hoạt hoá enzyme. Cà hai effector thay đổi giá trị Koj của enzyme nhưng không thay đổi tốc độ cực đại của enzyme. GTP kìm hãm bằng cách nâng cao Ko.s hoặc chuyển dịch đường cong bão hoà cơ chất lên các giá trị cao hơn. Điều này cho phép enzyme hoạt động chậm hơn ờ một nồng độ cơ chất đặc biệt khi CTP có mặt. ATP hoạt hoá bằng cách chuyển đuờng cong tới các giá trị nồng độ cơ chất thấp hơn khiến cho enzyme hoạt động cực đại qua một phạm vi nồng độ cơ chất rộng lớn. Do đó, khi con đường hoạt động tới mức nồng độ CTP tăng quá cao hoạt tính ACTase sẽ giảm và tốc độ tạo thành sản phẩm cuối cùng bị chậm lại. Trái lại, khi nồng độ sản phẩm cuối cùng ATP tãng lên so với CTP, ATP sẽ kích thích tổng hợp CTP thông qua tác dụng lên ACTase. Aspartate cacbamoyltransferase ở E. coli cung cấp một ví dụ rõ rệt về các vị trí điều chinh và vị

trí xúc tác riêng rẽ trong các enzyme dị lập the. Enzyme là một protein lớn gồm

2 dưới đơn vị xúc tác vả 3 dưới đơn vị điều chinh (Hình 16.24a). Các dưới đon vị xúc tác chi chứa các vị trí xúc tác và không chịu ảnh hưởng bởi CTP và ATP. Các dưới đơn vị điều chinh không xúc tác phản ứng nhưng có các vị trí điều chỉnh liên kết CTP và ATP. Khi liên kết vào enzyme hoàn toàn các effector này gây ra những thay đổi về hình thể trong các dưới-đcm vị điều chỉnh, sau đó trong các dưới đơn vị xúc tác và các vị trí xúc tác. Enzyme có thể thay đổi thuận nghịch giữa một dạng T ít hoạt động và một dạng R hoạt động hơn (Hình 16.24 b, c). Do đó vị trí điều chỉnh ảnh hưởng đến vị trí xúc tác ờ khoảng cách khoảng 6,0 nm.

I«I Hình ì 6.24: cấu trúc và điều chình cùa Aspartate cacbamayhrctnsferase ơ E. coli. (Theo Prescott, Harley và Klein. 2005).

133

16.5.2. Cải biến cộng hoá trị các enzyme Các enzyme cũng có thể được kích thích hoặc bị kìm hãm thông qua sự cải biên cộng hoả trị thuận nghịch. Thông thường điều này diễn ra do việc thêm và loại bỏ một nhóm đặc biệt, nghía là một đạng của enzyme được hoạt động hơn một dạng khác. Chảng hạn, glicogen phosphorylase của mốc bánh mì Neurospora crassa được gọi là phosphorylase a khi ở dạng phosphoryl hoá và phosphorylase b khi ờ dạng bị loại bỏ Phosphate (Hình 16.25). Phosphorylase b là bất hoạt vì chất hoạt hoá AMP mà nó cần thường không có mặt ở mức độ đủ cao. Dạng phosphoryl hoá của phosphorylase a hoạt động ngay khi không có mặt AMP. Glicogen phosphorylase được kích thích thông qua việc phosphoryl hóa phosphorylase b thành phosphorylase a. Việc gắn nhánh Phosphate làm thay đổi hình thể cùa enzyme chuyển nó thành dạng hoạt động. Phản ứng phosphoryl hoá và loại bỏ Phosphate được xúc tác bởi các enzyme riêng rẽ và các enzyme này cũng được điều chỉnh.

Phospharylase ò (inactive)

Phosphorylasea (active) (Glucose^. + p

IGtucose)., _______________ + Glucỡse-1-(p)

Hình Ị 6.25: Sự củi biến cộng hóa (rị thuận nghịch của gỉicogen phusphoryìase. Phosphoryhtse a là dựng hoạt động được tông hợp bời phosphỏryì hóa và bị bất hoạt khi Phosphate bị loợi bỏ do thuy phân đế tạo thành phosphoryỊase b bất hoạt. (Theo Prescott. Harley và Klein, 2005).

Các enzyme cũng có thể được điều chỉnh nhờ liên kết với các nhỏm khác Phosphate. Một trong các enzyme được nghiên cứu chi tiết nhất đó là Glutamine synthetase ờ E. coỉi. Đây là một enzyme lớn, phức tạp tồn tại ở hai dạng. Khi một nhánh acid adenylic liên kết với một trong 12 dưới-đơn vị cùa enzyme tạo thành một enzyme adenyl hoá, glutamine

synthetase hoạt động yếu. Việc loại bỏ các nhóm AMP tạo ra glutamine synthetase đã mất adenyl hoạt động hơn và glutamine được tổng hợp. Hệ thống glutamine synthetase khác hệ thống phosphorylase ở hai điểm: 1) AMP được đùng như tác nhân cải biến; 2) Dạng cải biến của Glutamine synthetase kém hoạt động. Glutamine synthetase cũng được điều chình dị lập thể. Việc sử đụng cải biến cộng hoả trị để điều chỉnh hoạt tính enzyme có một số ưu điểm. Các enzyme có thể chuyển hoá qua lại thường cũng là các enzyme dị lập thể. Vì mỗi dạng có thể đáp ứng khác nhau với các effector đị lập thể nên các hệ thống enzyme cải biến cộng hoá trị có khả năng đáp ứng với nhiều chất kích thích hon trong các con đường thay đổi và phức tạp. Cũng có thể được điều chỉnh là các enzyme xúc íác những cải biến cộng hoá trị, bổ sung vào hệ thống một mức độ điều chỉnh thứ hai. 16.5.3. Kìm hãm phản hồi hoặc kìm hãm bôi sản phẩm cuối cùng (Feedback inhibition) Như đã nói ở phần trên, tốc độ của nhiều con đường trao đổi chất được điều chinh thông qua sự điều khiển hoạt tính của các enzyme điều chỉnh. Mỗi con đường có ít nhất một enzyme dẫn-tốc độ (pacemaker) xúc tác phản ứng chậm nhất hoặc hạn chế tốc độ trong con đường. Vì các phản ứng khác diễn ra nhanh hơn phản ứng dẫn-tổc độ do đó những thay đổi trong hoạt tính của enzyme này trực tiếp ảnh hường đến tốc độ của con đường. Thông thường, bước thứ nhất trong một con đường là một phản ứng đẫn tốc độ xúc tác bởi một enzyme điều chỉnh. Sản phẩm cuối cùng của con đường thường kìm hãm enzyme điều chỉnh này. Quá trình nói trên được gọi là sự kìm hãm bời sản phẩm cuối cùng. Kiểu kìm hãm này bào đảm cho sự tạo thành cân bàng của sản phẩm cuối cùng của một con đường. Nếu tích luỹ với nồng độ quá cao sản phẩm cuối cùng sẽ kìm hâm enzyme điều chinh và làm giảm tốc độ tổng hợp của chính sản phẩm này. Khi nồng độ cùa sản phẩm cuối cùng giàm, hoạt tỉnh của con đường lạì lăng và nhiều sản phẩm hơn được tạo thành. Sự kìm hăm bởi sản phẩm cuối cùng, nhờ vậy, đâ tự động phối hợp việc cung cấp theo nhu cầu của sản phẩm này. Aspactate cacbamoyltransferase là một ví dụ điển hình của sự kìm hãm bởi sản phẩm một con đirờng sinh tổng hợp thường phân nhánh tạo thành trên một sán phẩm cuối cùng. Trong tinh hinh như vậy việc tổng hợp các sàn phẩm cuối cùng cùa con đường phải được phổi hợp một cách chính xác. Không thể để một sản phẩm cuối cùng này cỏ mặt dư thừa trong khi một sản phẩm cuối cùng khác lại thiếu. Sự phân nhánh các con

đường sinh tổng hợp thường tạo nên sự cân bằng giữa các sản phâm cuôi cùng qua việc sử dụng các enzyme điều chỉnh ở các điểm phân nhánh {Hình 16.26). Khi có mặt ở nồng độ dư thừa một sản phẩm cuối cùng thường kìm hăm enzyme ờ điểm phân nhánh trên chuỗi dẫn đến tạo thành sản phẩm này, nhờ vậy mà điều chỉnh việc tổng họp của chính sản phẩm đó nhưng không ảnh hướng đến tồng hợp các sàn phẩm khác. Hình ỉ 6.26 cũng cho thấy cả 2 sản phẩm cũng kìm hãm enzyme mở đầu trong con đường. Sự dư thừa của một sàn phẩm làm chậm dòng c đi vào cả con đường trong khi kìm hãm enzyme thích hợp ở điểm phân nhánh. Vì sụ phân nhánh không hoạt động cần ít c do đó sự kìm hãm bởi sản phẩm cuối cùng của enzyme dẫn tốc độ ban đầu giúp cho sự điều hoà giữa cung và cầu ở các con đường phân nhánh. Việc điều chỉnh ở các con đường phân nhánh nhiều thuờng được thực hiện phức tạp hơn đo sự có mặt của các izoenzyme tức là những enzyme khác nhau nhưng xúc tác cùng một phàn ứng. Bước đầu đẫn tốc độ ban đầu có thể do một so izoenzyme xúc tác, mỗi izoenzyme chịu sự điều hoà riêng rẽ và độc lập. Trong tình hình như vậy, sự dư thừa của một sản phẩm cuối cùng sẽ làm giảm hoạt tính của con đường nhưng không hoàn toàn kìm hãm chức năng cùa con đường vì một số izoenzyme vẫn còn hoạt động.

Sản phẩm cuối củng p

Sản phẩm cuối củng Q

Trẽn hình là sự kìm hãm phun hồi (rong ỉ con đường phản nhánh với 2 sun phảtn cuối cùng. Các enzyme ờ điếm phân nhánh xúc tác sự chuyên hóa chât trung gian E thảnh F và G được điều chỉnh bới kìm hãm phàn hỏi. Các sàn phám p và Q cũng kìm hãm phim ứng mở đầu trong con đường. Tín hiệu - chỉ ra rang p hoặc Q kìm hăm enzvme xúc tác bước tiếp theo tín hiệu. (Theo Prescott, tìarỉey và Klein, 2005). 16.6. SẢN XUẢT MỘT SÓ AXIT AMIN NHỜ VI SINH VẶT 16.6.1. Sinh tổng h ọ p axit glutam ic và sản x u ất mì chính Mì chính là muối mono - natri của axit glutamic - một axit amin trong 20 axit amin cẩu tạo nên protein trong cơ thể sinh vật. Mì chính là một gia vị thực phẩm phổ biến, tồn tại ở dạng bột hay tinh thể trắng, hình kim, óng ánh, hoà tan tốt trong nước, có vị ngọt cùa nước thịt và nấm có khả năng làm cho món ăn ngon hơn. Lịch sử ra đời của bột ngọt đã bắt đầu hơn 100 năm trước đây. Giáo sư Kikunae Ikeda - trường Đại học Hoàng gia Tokyo - Nhật Bản, trong thời gian học tập ở Đức, với khả năng cảm nhận vị tinh tế của mình đã nhận thấy: “Có một vị chung giừa măng tây, cà chua, phomat và thịt; vị này không giống vói vị nào trong 4 vị cơ bàn là ngọt, chua, mặn và đắng”. Ông cũng nhận trong thấy món nước dùng truyền thống Dashi được nau tử tảo biển (Konbu) cũng có vị ngon, vị ngọt đặc trưng như vị mà ông đã từng cảm nhận được khi ở Đức. Từ cảm nhận vị tinh tế đó, giáo sư Ikeda đã nghiên cứu và xác định được thành phần tạo nên vị ngọt tinh té trong tảo biển là axit glutamic hay glutamate. Ông đã đặt tên cho vị của glutamate là vị “umami” mà trong tịếng Nhật có nghĩa là vị ngon. Giáo sư Ikeđa cũng đã tiến hành nghiên cứu đặc tính nhiểu loại muối của glutamate và kết luận natri glutamate là dạng thích hợp nhẩt để làm gia vị với những ưu điểm nối bật về tỉnh tan, khả năng không hút ẩm và độ mạnh của vị umami: Cùng với những khám phá trên cùa giáo sư Ikeda, sản phẩm mì chính đã lần đầu tiên xuẳí hiện trên thị trường vào năm 1909. Vị "umami" - vị đặc trưng của mì chính - tồn tại độc lập và không giống bất kỳ vị nào trong bốn vị cơ bàn (chua, ngọt, mặn, đấng) mà chúng ta đã từng biết đến. Vị umami được mô ta là vị ngọt cùa thịt hay vị ngọt của nước đùng, (ồn tại tự nhiên trong thịt, cá, hái sán,

nấm, cà chua,

V .V ....

và đặc biệt là trong pho mát. Như vậy, umami chỉ là tên gọi mới cùa

một vị có từ rất lâu vốn rất quen thuộc với con người.

Không hút âm

Vị umamí

+ +

Tính tan -4-

1

-T- +■ -r-

-f + +

ị

+ + +

4- -r

;

-ỉ- -t f

G lu ta m a te Nítr1 glutamate (MSCÍ) ....

k a li

+

4-4-

g lu ta m a te

Canxi

+

i +

+ +

g lu ta m a te

ị Hiện nay, mì chính là một gía vị thực phẩm được sử dụng phổ biến trên toàn thế giới và đã được nghiên cứu trong một thời gian rất dài bởi nhiều tồ chức hàng đầu thế giới về thực phẩm và phụ gia thực phẩm như: ủ y ban Chuyên gia hồn hợp FAO/WHO về Phụ gia thực phẩm (JECFA) (WHO: Tổ chức Y tế Thế giới; FAO: Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực Liên Hiệp Quổc), ủ y ban Khoa học về Thực phẩm của Cộng đồng chung Châu Âu (EC/SCF), Cơ quan Quản lý Thuốc và Thực phẩm của Mỹ (US FDA). Tất cả các tổ chức này đều kểt luận rẳng mì chính an toàn cho sức khỏe khi được sử đụng dưới dạng gía vị và đã đặt mà số quốc tế cho mì chính là 621. Trước năm 1987, JECFA khuyến cáo ràng liều dùng hàng ngày cùa mì chính (Acceptable daily intake - ADI) không nên vượt quá 120mg bột ngọư kg thể trọng/ ngày tương đương với một người có thể trọng 50kg không nên dùng quá 6 g bột ngọt trong một ngày. Tuy nhiên, sau khi tập hợp hơn 200 nghiên cứu trên các lĩnh vực hóa học, sinh học, sinh ỉý học, độc học... các nhà khoa học của Tổ chức này nhận thấy mỉ chính không gây ra bất kì ảnh hường nào tới đổi tượng thí nghiệm. Tại hội nghị lần thứ 31 vào năm 1987, JECFA đã chính thức tuyên bổ không cần qui định liều dùng hàng ngày cho mỉ chính. EC/SCF trong báo cáo vào năm 1991 cùng xểp mì chỉnh vào danh sách các chất phụ gia thực phẩm an toàn với liều lượng sử dụng hàng ngày không xác định. Ngoài ra, tố chức nay cũng kêt luận ‘không có bât cứ băng chứng nào cho thấy mì chính gây độc cho người tiêu dùng”.

Tại Việt Nam, Bộ Y té Việt Nam cũng xếp mì chính vào danh mục các loại phụ gia thực phẩm được phép sừ dụng trong quá trình chế biến thực phâm. Bên cạnh mì chính truyền thống còn có siêu mì chính. Năm 1913, học trò của Giáo sư Ikeda là ông Komada đã phát hiện ra disodium 5'- inosinate (Inosinate Mono-phosphateIMP) - một chất có trong cá khò - có vị umamỉ. Năm 1957, ông Kuninaka và các cộng sự đã khám phá ra một chất có vị umami trong loại nấm Shiitake khô - đó là chất disodium 5'guanylate (Guanylate Mono-Phosphate GMP). Ông Kuninaka nhận thấy rằnsỉ nếu trộn mì chính với các nucleotide có vị umami kể trên thì sẽ được một hồn hợp có vị ngọt gấp nhiều lần so với mì chính thông thường (cường độ tùy vào tỉ lệ phối trộn), đó chính là siêu mì chính. Từ năm 1960, loại siêu mì chính này đã chính thức được giới thiệu và tiêu thụ trên thị trường. Ngày nay, nó đã trờ thành một chất điều vị được sử dụng phổ biến trên toàn thế giới. Inosinate có rất nhiều trong cá, thịt bò, thịt heo, còn guanyỉate thì được tìm thấy nhiều nhất là trong các loại nấm. 16.6,2. Sính tổng hợp axit glutamic Trong quả trình lên men axit glutamic, vi khuẩn sử dụng đườiìg, nhờ xúc tác của các enzym có sẵn trong nó, chuyển hóa qua nhiều phản ứng khác nhau đế cuối cùng tạo axit glutamic. Cơ chế như sau: Từ a-ketoglutaric (2 oxoglutarate) có thể có hai hướng tạo ra axit - glutamic. * Amin hóa keto-axii iZOXitrat-dehyđrogenase

(E1)

C 02

izoxitrat NADP

NADPH

a-Ẩs^-glutarate

L. glutamate NHĩ (E2) Sự tạo ra axit glutamic phụ thuộc vào sự tích tụ axit -a.ketoglutaric và sự có mặt của NH3, cũng như enzym glutamat- dehydrogenase.

Glucose Ỷ

V 'Ỷ

P y ru v a te J^C O

Acetyl-CoA

Mala

CO 2-oxoglu tarate

L-glutamate

Succinate. Succinfl-

Hình 16.27, Sơ đồ tổng hợp L-gỉiitamat. Khi không có NH3 thì axit a-keto-glutaric sẽ được tách ra từ chu trinh Kreb. * Chuyển amin hỏa kcttì-axìt Axit cc-ketoglutaric tác dụng với 1 axit amin nào đó - và có sự trao đổi nhóm keto (O O ) và nhóm amin (-NH 2) với nhau yOOH C=0 (CH2)2 + io O H

COOH CH-NH 2 R A x it am in

ctxit a-xetoglutaric

140

COOH ----------------* c |i-N H 2 + (CH2)2 COOHI

axit glutamic

COOH C- 0 k X et*-cuũl

16.6.3. Sản xuất mì chính nhờ vi sinh vật Là phương pháp sử dụng vi khuẩn lên men glucid thành axit glutamic. Năm 1956 nhà vi sinh học người Nhật là Kinosita đã phát hiện ra vi khuẩn Corynebacterium gỉutamicum có khả năng dùng tinh bột ngô, khoai, sắn tạo được axit glutamic. Từ đó, bắt đầu thời kỳ mới sản xuất mì chính bàng phương pháp lên men nhờ vi sính vật, thay cho phương pháp hóa giải từ bột lúa mi, Tính chất ưu việt của phương pháp này là sử dụng nguyên liệu có chứa glucid rẻ tiền, sử dụng vi sinh vật để lên men glutamic vì vậy tạo chù yếu là axit glutamic, giá thành rẻ, tốc độ sản xuất nhanh. Có thể cho lên men tạo axit glutamic trực tiếp tù nguyên liệu có sẵn đường hoặc từ nguyên liệu có bột đã qua đường hóa tạo dung dịch đường. Hiệu suất lên men thường rất cao. Trong môi truờng lên men, ngoài glucid còn cần cỏ muối amon, biotin (vitamin H) cho vi khuẩn phát triển và một ít kháng sinh để ngăn sự nhiễm vi khuẩn lạ. Chủng vi khuần lên men mì chính thường được sử dụng là Corynebacterium gỉutamicum, một loại trực khuẩn, hiếu khí. * Chủng lên men Giống vi sinh vật lên men được chọn phải có năng suất sản xuất cao, ốn định qua nhiều thế hệ, có khả năng chịu được các điều kiện môi trường khắc nghiệt (pH, nhiệt độ nồng độ cơ chất, nồng độ sản phẩm,...); niôi trường dinh dưỡng phải đơn giản, nguyên liệu rẻ tiền, dễ pha chế, đễ áp đụng vào thực tế. Hiện nay, giống vi sinh vật thường được dùng là: Corynebacterium gìutamicum, Brevìbacterìum divaricatum hoặc Brevìbacterium lactofermentum. Giống khi đưa vào sử dụng được trải qua nhiều giai đoạn cấy chuyền, nhân giống cấp 1, cấp 1IV.. nhàm tăng đù sinh khối phục vụ cho giai đoạn lên men.

Trong quá trình nhân giống, môi trường dinh dirơng phải cỏ chứa đầy đủ các cơ chất cần thiết cho sự phát triển của chủng như carbon, nitrogen, vitamin, và các chất khoáng như muối sulfate, phosphate... Đặc biệt đối với chủng lên men sản xuất axit glutamic thỉ trong môi trường dinh dưỡng phải có biotin (vitamin H), đồng thời phải kiểm soát các điều kiện nuôi cấy (pH, nhiệt độ, độ oxy hòa tan...) ở mức thích hợp nhất. Ngày nay, đa số các chủng sản xuất axit glutamic đâ được biến đổi di truyền nhàm tăng năng suất sản xuất axit glutamic.

Í4I

* Phương pháp đột biến tạo chủiĩg vi khuẩn tổng hợp thừa L-axit glutamic Trong điều kiện sống bình thường, lượng axit amin do vi sinh vật tông hợp nên thường vừa đủ đáp ứng nhu cầu sinh lý của bản thân vi sinh vật. Đó là tính chât tự điêu hòa và cân đối của vi sinh vật. Chính vì vậy, cần sử dụng các phương pháp chọn lọc và tác động tới cơ chế di truyền của vi sinh vật để chúng tổng hợp lượng axit amin dư thừa so với nhu cầu và bài tiết axit amin đó ra ngoài môi trường. c. gỉutamicum không tổng hợp thừa L-axit glutamic dưới nhừng điều kiện nuôi cay thông thường mà cần có một trong số các điều kiện sau đây: - Hạn chế bioíin - Bổ sung chất hoạt động bề mặt - Bổ sung kháng sinh nhóm /3- lactam Các nhà khoa học đã nghiên cứu cợ chế phân tử về ảnh hưởng của nhừng tác nhân này tới việc tổng hợp thừa L-axit glutamic. Những kết quả nghiên cứu cho thấy các tác nhân này đã thay đổi 2 yếu tố ở c. gìutamicum dẫn đến việc tổng hợp thừa L-axit glutamic và L- axit glutamic được tiết ra ngoài môi trường: thay đổi chuồi phàn ứng tổng hợp L-axit glutamic và thay đổi tính thấm của màng tế bào. Cơ chể phân tử của việc tổng hợp thửa L-axit glutamic ờ c. gỉutamicum * Thay đối chuỗi phản ứng tổng hợp Gỉu; tác nhân hạn chế bỉotin VÀ bổ sung chất hoạt dộng bề mật Tại một nhánh cùa chu trình TCA, enzyme 2-oxoglutarate dehydrogenase (ODHC) và Glutamate dehydrogenase (GDH) cạnh tranh cơ chất a - ketoglutarate, một nhánh tạo thành L-AG và một nhóm tạo thành succinyl - CoA. Dưới điều kiện hạn chế biotin trong môi trường nuôi cấy, hoạt tính của ODHC giám, trong khi đỏ hoạt tính GDH không thay đổi, dẫn đến việc tổng hợp thừa L-axit glutamic. Hình minh họa dưới đây cho thấy: dưới điều kiện giới hạn lượng biotin, lượng biotin sẽ giảm dân cùng với quá trình tăng sinh tế bào, làm cho quá trình tăng trưởng vi sinh vật bị chậm lại và L-AG sẽ được tích lũy trong môi trường. Trong khi đỏ với chủng đối chứng không giới hạn lượng biotin, không quan sát thấy sự tích tụ L-AG:

Glucose

1.5

Tăng trường (0 0 X Ự26)

Í!Õ

ssphoenolpyruvat

0 G lu tam ate (m M )

, Pyruvat

0.0

H o ạ t tính

g

ODHC

°°

biotin dổi d ả 0 ►CỌ

(A A 3 6 5 /p h ú t/ 0.0 m g p ro te in )

*0

biotin gióHí hạr t

H o ạ t tín h G D H (^ m o le s /p h ú t/ 2 00 m g p ro te in )

Fom arat

100 10

20

Thởtgten

utamate

ODBC; 2-oxogfutarate . debyrogenase complex o Biotin đối dào • Biotín giới hạn GDH; glutamate dehydrogenase Tham khào; Bíoscl. Btotachnot. Bkicham.,

nudi cáy (giở)

11,1109-1112,1®»7

Tương tự, khí bổ sung chất hoạt động bề mặt Tween 40 ngay cà khi cỏ mặt biotin thì hoạt tính của ODHC cũng giảm trong khi hoạt tính GDH không thay đổi. Như vậy, bang cách hạn chê biotin hoặc bổ sung chất hoạt động bề mặt (Tween 40), hoạt tính của ODHC bị giảm bởt trong khi hoạt tính của GDH không thay đối, từ ketoglutarate sẽ thiên về tạo thành L-axit gỉutamic hơn đi theo nhánh tạo succinyỉ - CoA. Hiện nay, cơ chế cùa việc hạn chế biotin và thêm chất hoạt động bề mật đến việc suy giảm hoạt tính ODHC vẫn dang được tiếp tục làm rò.

14}

300

1-5

Glucose

Tâng trướng (OD X 1/26 ) I 200

1.0

I

isphoenolpyruvate

G lu tam ate

(m M )

, Pyruvate

100

Hoạt tính0'05

ODHCO.04 0.03 {AA365/pIiútg Q2 /mg protein) 001

.

0

,

-

S u cd n ateS ^y '-^O z

Hoạt tín h * '^ GDH3.00 (/imoles/ph

H O P ị

L-qlutamate

oĐối Chứng o Tween 40

2.00

út/mg1-00

Tham khảo; Bioscì. Blotechnol. Biochem.,

protein) 10

61,1109-1112,1997

Thời gian nuôi cây (giờ)

* Thay đổi cấu trúc của màng tể bào: tác nhân hạn chế bìotin, bổ sung chất hoạt động bề mặt hoặc khảng sinh Ngay cả khi L-axit glutamic được tổng hợp thừa trong nộị bào, nếu L-axit glutíimic không được bài tiết ra ngoài môi trường thì cũng không đạt được hiệu quả mong muốn. Muốn L-axit glutamic được bài tiết ra ngoại bào cần có sự thay đồi tính thấm của màng tế bào. Ba tác nhân trên có tác dụng làm thay đổi cấu trúc của màng tế bào, giúp bài tiết Laxit glutamic ra ngoại bào theo minh họa hình đưới: -

Protein DtsRl có cấu trúc giống với tiểu phần của acetyl ~ coA carboxilase. Vì

biotin là cofactor cùa acetyl —coA carboxilase nên việc hạn chế biotin cũng như bổ sung chất hoạt động bề mặt cỏ thể ảnh hưởng đến phức hợp biotin - enzyme có chứa DtsRl. Phức hợp này tham gia vào quá trình tống hợp thành phần axit béo cùa màng tế bào, do vậy việc hạn chê biotin hoặc bổ sung chất hoạt động bề mặt ảnh hưởng đến việc tổng hợp lipid màng và làm thay đổi sức căng của màng tế bào. 144

Glucose

Chất hoat đông bề măt

Hình ỉ 6.28. Mó hỉnh thay đổi cẩu trúc màng (ế bào đè bài íiết axit glutamic.

- Penicillin ửc chế việc tổng hợp thành tế bào bàng cách bám vào các protein liên kết penicillin (penicillin binding protein - PBP). Các protein này tham gia vào nhiều giai đoạn trong quá trình tổng hợp peptidoglican cùa thành tế bào vi khuẩn. Như vậy, bàng cách thay đổi cấu trúc, sức căng và tính thấm của thành tể bào và màng tể bào vi khuẩn, các tác nhân này làm thay đổi cấu trúc GluE là protein vận chuyển L-AG ra ngoại bào - một kênh tương đồng nhạy cảm cơ học (Mechanosensitive channel Msc - homolog). Nhờ đó, L-AG được vận chuyển ra ngoài tế bào. Protein này được mã hóa bởi gene NCgỉỉ221. Cài biến di tniyền để c. gỉutamicum

tổng hợp thừa L-axit glutamic ngay dưới

những điều kiện sản xuất thông thường mà không cần bố sung tác nhân Trong điều kiện sản xuất thực tế, việc phải bổ sung các tác nhân để vi sinh vật tổng hợp thừa L-axit glutamic có một số nhược điềm như sau: - Tăng chi phí sàn xuẩt - Phải tiến hành tinh chế và loại bò tác nhân khoi thành phẩm

[45

- Việc hạn chế biotin mâu thuẫn với việc vi khuẩn

c. ghưamicuni

cần có biotin cho

nhu cầu tăng trưởng, ngoài ra nguyên liệu mật mía đường dùng đê sản xuât L-axit glutamic có chứa một lượng đáng kể biotin. Từ những khám phá về cơ chế phân tử, các nhà khoa học đã tiến hành cải biến gene của

c. gỉutamicum để chủng vi khuẩn này tổng hợp thừa L-axit glutamic ngay dưới những

điều kiện sản xuất thông thường mà không cẩn bổ sung tác nhân. * Thay đỗi chuỗi phản ứng tổng hợp L-axìt glutamic bằng cách giảm hoạt tính ODHC Điều này được thực hiện bằng cách loại bò gene odhÁ, Chủng vi khuẩn thiếu gene odhA không cỏ hoạt tính ODHC và sẽ tổng họp thừa L-axit glutamic ngay cả dưới nhừng điều kiện phản ứng bình thường, không cần hạn chế biotin hoặc bổ sung chất hoạt động bề mặt. - Cẩu trúc gene odhA '. Phức hợp ODHC gồm có 3 tiểu đơn vị: Elo, E2o và E3

Elo: 2-oxoglutarate dehydrogenase

(EC1.2.4.2)

odhA

E2o: dìhydrolipoamide S-succinyitransferase (EC2.3.1.61) E3: dihydrolipoaminde dehydrogenase

(EC1.8.1.4)

Tiểu đơn v ỊE lo được mã háa bởi gene odhA, Gene odhA gồm có 2 vùng chính: vùng xúc tác E2o có cấu trúc giổng domain và vùng bảo tồn Elo. Vùng xúc tác E2o có câu trúc giống domain thường thấy ờ những vi khuẩn Gram dương với ham lượng GC cao như Mycobacterium tuberculosis, Streptomyces coelicolor. Ngoài ra, genome của

c. glutamicum Vùng xức tác E2o giống dom ain

còn có tiểu đơn vị E2o.

Vùng bào tồn E to ------------------------------------

I

e / x / 257* a

3CCa.ứ Qem&đM/ĩ Hình 16.29. Mô ta gene odhA. 146

Phương pháp tạo chủng vi khuần khuyết gene oclhA + Nhân đoạn gene chứa odhA bàng PCR + Sử dụng enzyme giới hạn cat bỏ đoạn gene odhA + Phần gene còn iại được gắn vào plasmid bàng ligase + Đưa plasmid vào vi khuẩn * Điều chỉnh khả năng bán thắm của màng tế bào Điều chỉnh khả năng bán thấm của màng tế bào bằng cách cải biến gene NCgll221 mã hóa protein mang GluE. -

Khuếch đại gene bằng PCR, qua đỏ gia tăng sự bài tiết L-axit glutamic. Tuy nhiên, với cách cải biến này vẫn cần có những tác nhân như hạn chế biotin, bổ sung chất hoạt động bề mặt hoặc penicillin để kích thích bài tiết L-axit glutamic.

-

Đột biến gene để quá trình bài tiết L-axit glutamic diền ra mà không cần bổ sung các tác nhân. Tạo thể đột biến bàng cách nhân dòng đoạn gen NCgll221, sau đó cát đoạn gene bằng một số loại enzyme giới hạn khác nhau và gán vào plasmid. Tiến hành chọn lọc những chủng đột biển có khả năng bài tiết L-axit glutamic mà không cần có tác nhân.

* Thu hồi và tinh sạch: Dịch sau lên men ngoài axit glutamic còn các tạp chất khác nên cần phải tinh sạch và thu hồi axit glutamic bằng cách điều chỉnh pH địch axit glutamic về điểm đẳng điện của axit glutamic pH = pl = 3,22 bằng H2SO4 và giảm nhiệt độ xuống khoảng 4-15°C. Để loại tạp chẩt khác khỏi dịch lên men có chứa axit glutamic, thông thường người ta có thể dùng nhựa trao đổi ion (Resin). Resin có hai loại: - Resin dương tính (có tỉnh axit) trao đổi ion (+) - Resin âm tính (có tính kiềm) trao đổi ion (-) Môi trường khi tiến hành trao đổi ion phải axit, nếu pH kiềm hay gần trung tính, axit glutamic thể hiện âm tính, sẽ không tách được (pH phù họp < 5 ). * Loại màu: Có thể sử dụng than hoạt tính để loại màu dung dịch axit glutamic. Tạo mì chính

147

Trung hoà axit glutamic bằng Na2CƠ3 hay NaOH 40 - 50% đến pH bằng 6,8 để tạo glutamat - Na, lọc, cô đặc, kết tinh, sấy chân không ở nhiệt độ thấp, thu được tinh thể mì chính màu trắng - đem phân loại, đóng gói. Mỉ chính có vị umami, tinh thể trắng, khô, rời, không có mùi vị lạ. Theo tiêu chuẩn Việt Nam, sản phẩm mì chính phải đạt các tiêu chuẩn nhu bảng sau: Yêu cầu kỹ thuật Cảm quan

Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN)

Đơn vi•

Tinh thể trắng hoặc bột kết tinh trắng, không mùi, cỏ vị đặc trung

Monosodium glutamate

%

Không nhỏ hơn 99

Độ ẩm

%

Không lớn hơn 0,5 6,7 -7,2

pH

Độ quay cực đặc trung

độ

24,8 - 25,3

Clorua

%

Không lớn hơn 0,2

Tổng số bảo tử nấm men - mốc

CFU/g

Không lớn hơn 0,2

Kim loại nặng (qui ra chì)

mg/kg

Không lớn hơn 1o2

Asen

mg/kg

Không lớn hơn 10

Chì

mg/kg

Không lcm hơn 5

16.6.2. Sinh tổng họp lysine và sản xuất lysine L-ỉysine là axit amin không thay thế, có nhiều vai trò quan trọng trong cơ thể, cần được bô sung vào thức, ăn cho con người và động vật qua chế độ ăn để đáp ứng nhu cầu cho cơ thể. Đặc biệt các loại ihức ăn từ ngô, lúa mì hay đại mạch rất nghèo lysine. Lysine có công thức phân tử là C6H!4N 20 2, khối lượng phân tử 146,19 CH2(NH2)- (CH2)3- CH(NH2)- COOH Lysine dê tan ừong nước, trong axit và kiềm, khó tan trong cồn và không tan trong ete, bị phân huỳ ở 224-225°C. Lysine tinh thể có màu ừáng, hình lục giác, có vị chát, Bên cạnh đó, bô sung lysine là làm tăng giá trị sử dụng của thức ăn. Chẳng hạn như bổ sung 0,5% thì có thê tăng giá trị sử dụng protein tương đương 20% đậu tương. Vi bất cử nguồn

148

n itơ axit a m in th ư ờ n g sẽ bị c h u y ể n th à n h N H 3 v à thài ra n g o ài. B ổ su n g ly sin e v ào th ứ c ăn

có tác dụng làm giảm lượng protein sử dụng và giảm ô nhiễm chất thải động vật nuôi. * Sản xuất lysine Lysine được sàn xuất bằng con đường lên men sử dụng vi khuẩn Corymbacterium gỉutamicum trong vòng 40 năm nay. * Chủng vi sinh vật Các chủng sinh L-lysine có hiệu quả được tìm thấy trong số các chủng sinh axit glutamic, chủng đột biến của Corynebacterium và Brevibacỉerium và những chủng-khuyết dưỡng homoxerin hoặc khuyết dưỡng methionin-threonin. Những chủng sản sinh nhiều lysine cũng là những chủng bền đối với lizin-antiraetabolic S- (P-aminoethyl)-L-cystein (AEC). Người ta đã nghiên cứu tạo các chủng đột biến có khả năng tổng hợp L-lysin cao từ Brevibacterium lacto/ermentum. Trong cơng nghiệp, sử đụng B.flavum là chủ yếu. Ngoài ra có thể sử dụng s . cerevisiae, Toruỉopsis ĩitilis, Bacterium megaterum, Brevibacíerium sp., Streptomyces coroniformis, Bacillus subíiỉis, Corynebacterhm acetophìỉỉum, c. gỉutamìcum, từ parafin.' Aỉcaỉỉgem marshaỉỉiì, Pseudomonas fluorcscens, Nocardỉa sp. Bên cạnh đó, các nhà khoa học nhận thẩy rằng, dung họp tế bào trần giữa các chủng có hiệu

suất cao hơn các chủng hoang dại Brevibacterium

lactofermentum,

Corynebacterium và các chủng đột biến Brevịbacterium đã đem lại kết quả là cho ra những chủng có tính chất phát triển mạnh và hiệu suất sinh tổng hợp cao. * Cơ chế sinh tổng hợp ỉysine trong tế bào vì sinh vật Cơ chế sinh tổng họp lysine được giải thích từ axit aspactic. Một đường sinh tổng hợp biển axit aspactic thành lysine, còn con đường kìa thỉ sinh ra homoxerin. Homoxerin là sản phẩm trung gian để tạo thành treonin và isoleucin hoặc tạo ra metionin. Khi phá vỡ sự tổng hợp threonine, methionine và isoleucin ở giai đoạn hình thành homoxerin thì hướng của phản ứng sẽ chuyển sang tổng hợp lysine. Phản ứng đàu tiên của quá trình tồng hợp lysine được xúc tác bằng enzyme aspactate-kinase, được coi là enzyme quan trọng của sự tổng hợp lysine. Enzyme này dường như bị ức chế bởi 2 sản phẩm cuối cùng là L-lysine và L-threonin và sinh ra. ức chế ngược.

149

N hư vậy trong quá trình tổng hợp lysine, enzyme chìa khóa là aspactate kinase. Khi tổng hợp lysine, threonine ở nồng độ cao kìm hẫm enzyme aspactate kinase, kêt quà là làm

tăng lượng lysine. Threonine của các loài vi khuẩn E. coỉi, Micrococcus gỉutamicus kìm hãm sự hoạt động của các enzyme aspactate - aldehyt dehydrogenase và homoxerin dehydrogenase.

Tbreonindehydrogenase là chất kìm hãm isoleucin. 'Nhu vậy, các sàn phẩm trao đôi chất là chất làm giảm các hoạt tính của enzyme tham gia v:*0 qúa trình tổng hợp lysine. Các chất này cần được tách ra, chính vì thế các vi sinh vật khuyết dưỡng là thích hợp nhất để

dùng trong sản xuất như các loài vi sinh vật không cô hoạt tính enzyme homoxerin dehydrogenase đàm bào hiệu suất tạo lysine cao.

Quá trình tổng hợp lysine ở tế bào vi khuẩn (E. coiì, aspactic còn ở nấm men và nấm mổc (Toriiỉa utiỉis,

c. gỉutamìcum)-

s. ccrevisiae,

bát đầu từ axit

Penỉcìỉlium)- bắt đầu từ

cc-ketoglutaric.

* Môi tm ờ ng lên men Môi trường dinh dưỡng dùng để nuôi cấy vi sinh vật và để tổng hợp axìt amin chứa

nguồn cacbon, nước chiết ngô hay dịch thuỷ phân protein. Nguồn cung cấp đạm có thể là các muối amon hay ure. Trong quá trình tổng hợp lysine, các chất kích thích sinh truởng đóng vai trò quan trọng - ví dụ biotin. Ngoài ra, còn cần các axit amin như methionín, homoserin, treonin. Nếu giảm nồng độ bỉotin xuống 1-4 \igỉ\ thì vi sinh vật này sinh tổng hợp ra glutamic. Nếu tăng đến 2,5 mg thì tạo thành nhiều iỉXÌt lactic. Đó là hiện tượng của cơ chể tác dụng ngược. N guồn nguyên liệu sản xuất lizin bằng các chủng vi sinh vật khác nhau N guồn c ơ c h ẩ t

150

L oại VI sin h v ậ t

H iệu s u ấ t, g/1

Ri đường củ cải

Ẽrevibacterium sp .22

40

Rỉ đường mía

B. flavum

33

Glucoza

B.flavum

75-105

Giucoza

Corynebcicterium ghitamicum

34

Acetate

B. fla vu m

75

Ethanol

B.iactfermentum

66

n-alkanes

Nocardia

aỉkcmoglutinosa

i 29

Ọuá trình lên men từ ri đường mía bằng c. gỉutamicum (chùng 901), được thực hiện với các điểu kiện sau: - Giống cap 1: glucose 20g, pepton lOg, cao thịt 5g, NaCl 2,5g, nước 1L; - Giống cấp 2: ri đường 50 g, (NH4)2S04 20g, cao ngô 50g, CaC03 lOg, nước 1L. - Giống chính: Rỉ đường mía 200g (tính theo đường), dịch thủy phân protein đậu tương 18g, nước 1L. * Lên men sản xuất lysine Quá trình lên men diễn ra ờ điều kiện nhiệt độ: 28-30°C. Điều kiện pH tối thích 7,07,6 (thông thường trong thực tế duy trì 6 ,0-8,5). Thòi gian ln men sinh lysine 60-72 giờ. Trong những ngày đầu sử dụng gần 25% lượng nitơ tổng số, sau đó tốc độ sinh khối giảm Người ta đuy trì pH bằng cch sử dụng NH4OH (25%) hoặc NaOH 15%. Oxy cần cung cấp trong quá trình lên men: tốc độ khuấy 150 rpm, sục khỉ 0,6 vvm. Giống vi khuẩn thường được bổ sung với tỷ lệ 1-5% (so với thể tích dịch lên men) * Tách VÀ thu sản phẩm Có 4 loại sản phẩm: 3 loại dùng cho chăn nuôi và 1 loại lysine tinh khiết. - Lysine đặc - Lysine bột - Lysine thô có chất độn - Lysine tinh khiết Sân phẩm lysine đặc. cần cô đặc dịch lên men có cả tể bào đến nồng độ 5-6%.Sau đó sấy phun bằng không khí nóng 250°c. Sản phẩm này có thành phần: 15-20% lysine, 1517% protein, 14% axit amin khác, 24-25% chất tro, sản phẩm này rất dễ hút ẩm. Săn phẩm ỉysine bội: Để cố loại sản phẩm này cần cô đặc đến 40-70%, dạng sệt. Điều kiện cô đặc chân không 0,8 kg/cm2 để tránh làm hỏng lysine. Sàn phẩm màu đen, có mùi thơm đặc trưng . Sản phẩm bảo quản được 3-4 tháng. Thành phần: Lysine 15-20%; Protein 22-25%; hydratcacbon: 1-2%, đạm amin: 2,1-2,4%.

151

* Sản phẩm lysine

thô có chất đôn

Sản phẩm loại này có sử dụng phụ gia là cám mỳ hoặc cám gạo với mục đích làm giảm hao hụt trong quá trình sẩy và giảm tính hút âm của sản phâm. Sau khi cô đặc đèn độ ẩm 40%, trộn thêm chất phụ gia để độ ẩm đạt 30%, tạo hạt rồi sấy. sấy bàng không khí nóng nhiệt độ 110-120°c, v=6-7 m/s. Nhiệt độ không khí ra là 75-85°C. Các hạt có nhiệt dộ 70-80°C. Sau khi sấy, làm nguội đến 40°c trong 3 phút. Sau đó nghiền để tạo sản phẩm. Hàm lượng lysine trong sản phẩm loại này đạt 7-10% * Sản phẩm lysine tinh khiết Để tách được lysine tinh khiết, trong công nghiệp thường dùng phương pháp trao đổi ion và thực hiện theo các bước như trong sơ đồ. Các loại nhựa hay sử dụng đều là các cationit có tính axit mạnh. Các sản phẩm nhựa trao đổi ion DOWEX để thu nhận lysine Sản phẩm

Dạng

Chất nền

D O W EX N406

Cation axit mạnh

Styrene/DVB Gel, 10% liên kết ngang

DOW EX

Cation axit mạnh

Styrene/DVB Gel, 8% liên kết ngang

Cation axit mạnh

Styrene/DVB Gel 8% liên kết ngang

Cation axit mạnh

Styrene/DVB Gel 6% liên kết ngang

M ARATH ON *

C(H+) DOW EX HCRS

(11+) DOWEX N606

Để thu nhận lysine bàng phương pháp trao đổi ion thường sử dụng nhựa dạng cationit với NH+4. Dịch lên men sau khi tách tế bào được axií hỏa bàng axit HC1 hoặc H2SO4, sau đó cho qua cột trao đôi ion và lysine được gắn trên nhựa qua phản ứng trao đổi íon. Sau đó lysine được tách ra bằng phản ứng rưa giải bàng dung dịch hyđroxyt amon. Phản ứng hấp phụ: Lysine2+ + 2 (NH4 +) cationit

2 NH4+ + Lysine2+ cationit

Phản ứng nhả hẩp phụ: 2 NH4+ + Lysine2+ cationit —» Lysine2+ + 2 (NH4+) cationit Sau khi rửa giải bằng mrớc amoniac nồng độ 0,5-5% đến khi lượng lysine còn trong nước rưa là 1-2%, thu được dịch chứa iysine. Hiệu

SLiất

nhả hấp phụ đạt được 80-90%

lysine. Sau đó đun ớ 80°c dể loại NYU. Rồi dùng HC1 2N để điều chỉnh pH 4,5-5,0. cỏ

đặc ở 60°c, nồng độ lysine đạt 30-50%. Lysine.HCl kết tinh ở nhiệt độ 10-12°c, có tinh thể màu vàng. Các tinh thể này được rửa sạch khỏi các tạp chất bang ethanol (dùng 3-4 lần thể tích tình thể). Sau khi ly tâm thu được tinh thể có kích thước 0,2-2,5 mm có độ ẩm 17%. Các tinh thể này được đem sấy đến độ ẩm đạt 0,5-1% bằng không khí nóng ờ nhiệt độ 120°c, không qúa 80 giây hoặc 100°c không qúa 100 giây. Đặc điểm của sản phẩm tinh khiết 1 : 97% lysine. HC1, độ ẩm không quá 0,5%, thành phần chất tro 0,3%, khối luợng riêng 525-650 g/1 và độ hòa tan 642 g/1.

Tại Việt Nam đang sử dụng chủng vi khuẩn -

Khuyết gene odhA

-

Đột biến gene GluE

Chương ĩ 7

GIẢI PHÓNG VÀ BẢO TOÀN NĂNG LƯỢNG Ở VI SINH VẬT

17.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ TRAO ĐỎI CHẮT Sau khi đã đề cập đến các nguyên tẳc cơ bản của nhiệt động học, chu trình năng lượng và vai trò của ATP như đồng tiền năng lượng, bản chất và chức năng của các enzym cũng như việc điều chinh hoạt tính enzym trong chương này chúng ta sẽ bàn về trao đổi chẩt. Trao đổi chất là tổng số các phản ứng hóa học diễn ra bên trong tế bào nhờ có dòng năng lượng và sự tham gia của các enzym. Trao đổi chất có thể được chia thành hai phần chủ yếu: dị hoá (catabolism) vả đồng hoá (anabolism). Trong dị hoá các phân tử lớn hơn và phức tạp hơn bị bẻ vỡ thành các phân tử nhỏ hơn vả đom giản hơn đồng thời năng lượng được giải phóng. Một phần năng lượng này được giữ lại và tạo thành công, phần còn lại thoát ra ở dạng nhiệt. Sau đỏ, năng lượng giữ lại có thể được dùng trong đồng hoá là giai đoạn sau của trao đổi chẩt. Đồng hoá lả việc tổng hợp các phân tử phức tạp‘ từ các phân từ đơn giản hom và cần năng lượng. Quá trình đồng hoá sử dụng năng lượng để làm tăng trật tự của một hệ thống. Mặc dù việc phân chia trao đổi chất thành hai phần chủ yếu ỉ à tiện lợi và được sử dụng phổ biển, tuy nhiên, càn nhớ rằng, không phải tất cả các quả trình sản sinh năng lượng đều phù hợp với định nghĩa nói trên về sự dị hoá nếu như định nghĩa này không được mở rộng bao gồm cả các quá trình không có sự phân giải các phân tử hữu cơ phức tạp. Theo nghĩa rộng hơn các vi sinh vật thường sử dụng một trong ba nguồn năng lượng. Vi sinh vật quang dưỡng thu nhận năng lượng bức xạ từ mặt trời (hình 17.1), Vi sinh vật hoá đường hữu cơ oxy hoá các phân tử hữu cơ để giài phóng năng lượng, trải lại các vi sinh vật hoá dưỡng vô cơ lại sử dụng các chất dinh dưõng vô cơ lảm nguồn năng lượng.

154

PHOTOTROPHY

CHEMOORGA NOTROPHY

Reduced organic compound

Oxidized organic compound

CHEMOUTHOTROPHY Reduced inorganic compound

Oxidized Inorganic compound

Chemical energy

i

W ork

Hình Ì7.1: Các nguồn năng luợrtg được sử dụng bởi vi sinh vật. Hầu hét vi sinh vật sử dụng ỉ trong 3 nguồn nàng ỉuợng. Các vi sinh vật quang dưỡng thu nhận năng lượng bức xạ từ mật trời nhờ các sac tổ như bacỉeriochlorophyỉ và chỉorophyỉ. Các vì sinh vật hỏa dưỡng oxy hóa các chất dinh dường hữu cơ và vó cơ khử để giài phóng và thu nhận năng ỉuợng. Hóa năng dần xuất từ 3 nguồn này sẽ được dùng đế sàn ra công. (Theo: Prescott và cs, 2005). Vi sinh vật không chi khác nhau về nguồn năng lượng mà còn khác nhau về các chất nhận electron được sử đụng ở các cơ thể hoả dưỡng (hình ỉ 7.2). Các chất nhận electron gồm ba loại chính. Trong lên men cơ chất mang nâng lượng bị oxy hoá và phân giải không có sự tham gia của một chất nhận electron từ bên ngoài hoặc cỏ nguồn gốc từ bên ngoài. Thông thường con đường dị hoá sản ra một chất trung gian như Pyruvat tác dụng như chất nhận electron. Nói chung, lên men diễn ra trong điều kiện kỵ khí nhưng đôi khi cũng được thực hiện ngay khi có mặt oxy. Dĩ nhiên, trao đổi chất sản sinh năng lượng cũng có thể sử đụng các chất nhận electron từ bên ngoài hoặc cỏ nguồn gốc từ bền ngoài. Quá trình trao đổi chất này được gọi là hô hấp (respiration) và được chia làm hai loại khác nhau: 1. Hô hấp biểu khí: chất nhận electron cuối cùng là oxy; 2. Hô hấp kỵ khí: 155

chất nhận electron có nguồn gốc khác nhau từ bên ngoài. Chẩt nhận electron trong hô hấp kỵ khí phổ biến nhất là chất vô cơ (chẳng hạn, NO 3', SO42 , CO2, Fe3+, SeƠ42...) nhưng đôi khi cũng là chất hữu cơ (như fumarat). Trong hô hấp thường có sự tham gia của một chuỗi vận chuyển electron. Năng lượng thu được ừong lên men và hô hâp rất khác nhau. Chất nhận electron trong lên men có cùng trạng thái oxy hoá như chất dinh dưỡng ban đầu và không có sự oxy hoá hoàn toàn chất dinh dưỡng. Do đó chỉ một lượng nhỏ năng lượng được tạo thành. Chất nhận electron trong các quá trình hô hấp có thế khử dương hơn nhiều so với cơ chất, do đó trong hô hấp năng lượng được giải phóng nhiều hơn đáng kể. Trong hô hấp hiếu khí cũng như kỵ khí ATP được tạo thành nhờ hoạt động của chuồi vận chuyển electron. Các electron tham gia trong chuỗi có thể thu được từ các chất dinh dưỡng vô cơ và năng lượng có thể bắt nguồn từ sự oxy hoá các phân tử vô cơ hơn là từ các chất dinh dưỡng hữu cơ. Khả năng này gặp ở một số vi sinh vật nhân nguyên thuỷ gọi là vi sinh vật hoá dường vô cơ. Chất cho e’ hữu cơ

1' .Chất nhận electron hữu cơ nội sinh

Chất cho e' vô cơ

H ô hấp Hô hấp kị hiểu k h í k h í

02

NO3- SO,2",

H óa tự dưỡng

1f 0 2, s o / - , n o 3-

coj, fumarate

Hình ĩ 7.2: Các kiểu giải phóng năng luợng. Lên men là quả trình giáỉ phông năng htợng trong đỏ một chất cho electron hữu cơ chuyền các electron cho một chất nhận nội sinh thuừrtg là một chất trung gian bắt nguồn từ sự phân giải chất dinh dưỡng. Trong hô hâp, các electron được chuyền cho một chất nhận từ bên ngoài (ngoại sinh) như O2 (hô hâp hiêu khi) hay NOỉ, s o / ị.hô hấp kị khí). Các hợp chất khử vô cơ cùng có thế được dùng như các chát cho electron trong việc tạo thành năng luợng (sự hóa dưỡng vô cơ). (Theo: Prescott vờ cs, 2005). Cũng cân nhớ răng những định nghĩa về lên men, hô hẩp hiếu khí và hô hấp kỵ khí nói trên hơi khác với những định nghĩa dùng bời các nhà sinh học và sinh hoá học. Lên men cũng cỏ thê được định nghĩa như là một quá trinh sinh năng lượng trong đó cảc phân tử hữu cơ được đong thời dùng làm chât cho và chất nhận electron. Hô hẩp là một quá trình sinh năng lượng trong đó chất nhận là một phân tử vô cơ như oxy (hô hấp hiếu khí) hay một chất vô cơ (hô hấp kỵ khí). Vì vi sinh vật rất linh hoạt và thay đổi trong trao đổi năng lượng nên những định nghĩa nói trên chừng nào rộng hơn sẽ được dùng ở đây. 156

Hình ỉ 7.3: Ba giai đoạn cùa sự dị hóa. Sơ đồ tong quát cùa sự dị hóa hiếu khỉ trong 1 vi sinh vật hóa dị dưỡng hữu cơ chi ra 3 giai đoạn trong quá trình này vù vị trí trung tâm cùa chu trình axit trỉcacbonxyỉic. Mặc dù có nhiều protein, polixaccarit vỏ lipit nhưng chủng bị phân giài chi qua hoạt tinh của 1 vài con đường trao đổi chất phổ biển. Chú ý, các đường ...ở đáy chi dòng các electron mang bởi NADH và FADHj tới chuỗi vận chuyến electron. (Theo: Prescott và cs, 2005). Trao đổi chất trong điều kiện hiếu khí cỏ thể được chia thành 3 giai đoạn (hình ỉ 7.3). Trong giai đoạn thứ nhất của sự dị hoá các phân tử chất dinh dưỡng lớn hơn (protein, polixaccarit và lipit) bị thuỷ phân hoặc bị phân giải theo kiểu khác thành các phần nhỏ hcm. Các phản ứng hoá học diễn ra trong giai đoạn này không sản sinh nhiều năng luợng. Các 157

axit amin, monoxaccarit, axit béo, gỉyxerol và các sản phẩm khác của giai đoạn này bị phân giải theo kiểu khác thành một số phân tử đơn giản hơn trong giai đoạn hai như Acetyl-coenzym A, Pyruvat và các chất trung gian của chu trình axit tricacbonxylic. Giai đoạn thử hai có thể hoạt động trong điều kiện hiếu khí cũng như kỵ khí và thường tạo thành một số ATP cũng như NADH và/hoặc FADH2. Cuối cùng cacbon trong chất dinh dưỡng được chuyển vào chu trình axit tricacbonxylic trong giai đoạn ba của sự dị hoá và các phân tử được oxy hoá hoàn toàn thành CO2 đồng thời với sự tạo thành ATP, NADH và FADH 2. Chu trình hoạt động hiếu khí và giải phóng nhiều năng lượng. Phần lớn ATP bất nguồn từ chu trinh axit tricacbonxylic (và các phản ứng của giai đoạn 2) là do sự oxy hoá của NADH và FADH 2 nhờ chuỗi vận chuyển electron. Oxy hoặc đôi khi, một phân tử vô cơ khác là chất nhận electron cuối cùng. Mặc dù sơ đồ trình bày trẽn đã được đơn giản hoá đi nhiều nhưng vẫn thuận tiện cho việc phân tích mô hình tổng quát của sự dị hoá. cần chú ý rằng, vi sinh vật bắt đầu với rất nhiều phân tử và ờ mỗi giai đoạn số lượng và sự đa dạng của chúng bị giảm đi. Nghĩa là, các phân tử chất dinh đưõng được chuyển thành các chẩt trung gian trao đổi chất với sổ lượng liên tục nhỏ hơn cho tới khi, cuối cùng, chúng đi vào chu trình axit tricacbonxylic một con đường chung thường phân giải nhiều phân tử tương tự, chẳng hạn nhiều loại đường khác nhau. Các con đường trao đổi chất này bao gồm các phàn ứng do enzym xúc tác được sắp xếp sao cho sản phẩm của phản ứng này sẽ dùng làm cơ chất cho phản ứng sau. Sự tồn tại của một số con đường dị hoả chung, mỗi con đường phân giải nhiều chất đinh dưỡng, sẽ tăng rõ rệt hiệu quả trao đổi chất nhờ tránh được nhu cầu đối với một số lượng lớn các con đường kém linh hoạt về trao đổi chất. Các vi sinh vật thể hiện tính đa dạng về dinh dưỡng chính là trong pha dị hoá. Hầu hết các con đường sinh tổng hợp ở vi sinh vật và ở các sinh vật bậc cao là khác nhau. Tính độc đáo của trao đổi chất ở vi sinh vật là sự đa dạng các nguồn tạo thành ATP và NADH (hình 17.1 và ì 7.2). Cốc hidrat cacbon và các chất dinh đương khác đàm nhiệm hai chức năng trong trao đổi chất của các vi sinh vật dị dưõng: 1. Bị oxy hoá để giải phóng năng lượng. 2. Cung cấp các khối cacbon hoặc khổi xây dựng dùng cho tổng hợp các thành phần của tế bào mới. Mặc dù nhieu con đường đồng hoá và dị hoá tách riêng nhau nhưng cỏ một số con đường là lưỡng hoá (amphibolic) hoạt động cả trong đồng hoá và dị hoá. Hai trong số các con đường quan ừọng nhẩt là đường phân và chu trình axit tricacbonxylic. Hầu hết các phản ứng trong hai con đường này đeu thuận nghịch dễ dàng và có thể được dùng để tổng

158

hợp và phân giải các phân từ. Một số bước dị hoá một chiều được đi vòng trong sinh tổng hợp với các enzym đặc biệt xúc tác phản ứng ngược lại (hình Ị 7.4).

\ l / D

Sự dị hỏa Catabolism

Sự đồng hóa wiaiXHism

Hĩnh ỉ 7.4: Con đường lưỡng hóa. Đây là sơ đồ của ỉ con đường ìitỡng hóa, chẳng hạn đường phân, cằn chú ý, sự chuyển hóa qua lọi cùa các chất trung gian F và G được xúc tác bởi 2 enzym riêng biệt: E/ hoạt động theo hướng phân giải và E2theo hướng tổng hợp. (Theo: Prescott và cs, 2005). Chẳng hạn, enzym fructoz-bisphotphataz xúc • tác ngược chiều với

bước

photphorusfructozkinaz khi glucoz được tổng hợp từ pyruvat. Sự tồn tại của hai enzym riêng rẽ, enzym này xúc tác phản ứng ngược chiều với enzym kia cho phép chức năng dị hoá và đồng hoá của các con đường nói trên được điều chỉnh độc lập. 17.2. S ự PHÂN GIẢI GLUCOZ THÀNH PYRUVAT Vi sinh vật sử dụng một số con đường trao đổi chất để chuyển hoá glucoz và các đường khác. Do tinh đa dạng về trao đổi chất như vậy mà trao đổi chất của chúng thường rắc rối. Để tránh những rác rối cỏ thể xày ra các con đường vi sinh vật phân giải đường thành Pyruvat và các chất trung gian tương tự sẽ được tập trung vào ba con đường: đường phân, con đường pentoz-photphat và con đường Entner - Doudoroff. Tiếp theo đó, các con

159

đường phân giải pyruvat hiếu khí và kỵ khí sẽ được đê cập. Đê đơn giản, câu trúc hoá học của các chất trung gian trong trao đổi chất sẽ không đuợc dùng trong sơ đô của con đường. 17.2.1. Con đường đường phân (con đường Embden-M eyerhol) Đây ỉà con đường phổ biến nhất đùng phân giải glucoz thành pyruvat trong giai đoạn hai của dị hoá. Đường phân gặp ở tất cả các nhóm chù yếu của vi sinh vật và hoạt động trong sự có mặt cũng như vắng mặt của oxy. Quá trình này diễn ra trong phần nền tế bào chất cùa cơ thể nhận nguyên thuỷ và nhân thật. Đường phân có thể được chia thành hai phần (hình 17.5). Trong chặng mở đầu 6cacbon glucoz được photphoryl hoá hai lần, cuối cùng được chuyển thành fructoz-1,6bisphotphat. Các đường khác thường nhập vào con đường đường phân thông qua việc chuyển hoá thành glucoz-6-photphat hoặc fructoz-6-photphat. Chặng mở đầu này không sinh năng lượng, trái lại phải tiêu thụ hai phân tử ATP cho một phân tử glucoz. Tuy nhiên, nhờ việc gắn photphat vào mỗi đầu của đường mà các photphat này sẽ được dùng để tạo thành ATP. Chặng 3-cacbon của đường phân bắt đầu khi enzym fructoz-l,6-bisphotphat aldolaz xúc tác phân giải fructoz-l,6-bisphotphat thành hai nửa, mỗi nửa đều chứa nhóm photphat. Một ừong các sản phẩm là glyceraldehit-3-photphat được chuyển trực tiếp thành pyruvat trong quá trình gồm 5 bước. Sản phẩm thứ hai là dihydroxyaceton-photphat có thể dễ dàng chuyển thành glyceralđehit-3-photphat, do đó cả hai nửa của fructoz-l,6-bisphotphat đều được sử dụng trong chặng 3-cacbon. Trước hết, glyceraldehit-3-photphat bị oxy hoá nhờ NAD+ là chất nhận elecừon, đồng thời một nhóm photphat được gắn vào để tạo thành 1,3b isp h o tp h a t g ly cerat là m ộ t p h â n tử cao năng. S a u đó p h o tp h a t cao n ă n g ở c a cb o n 1 được

chuyên cho ADP và xuất hiện ATP. Việc tổng hợp ATP nói trên được gọi là photphoryl hoá ở mức độ cơ chât vì quá trình photphoryl hoá ADP liên kết với sự phân giải ngoại năng của một phân tử cơ chất cao năng. Một quá trinh tưong tự tạo thành một phân tử ATP thứ hai cũng nhờ photphoryl hoá ờ mức độ cơ chât. Nhóm photphat trên 3-photphorusglycerat được chuyển sang cacbon 2 và 2-photphorusglycerat bị loại nước để tạo thành một phân tử cao năng thứ hai là photphorusenol pyruvat. Phân tử này chuyển nhóm photphat sang ADP tạo thành một ATP thứ hai và pyruvat là sản phẩm cuối cùng của con đường.

160

k

Giai đoạn 6 carbon Glucose ATP'

ADP Glucose 6-phosphat« Sx-carbon stag * Fructose 6>phosphate

ATP-O ADP Fructos# 1,8-bìsptiosphate Aldolase

t=

Glycera)dehyde-3- (p ) NAỏr— . NADH

+ H'

Three-cartoon (tag *

1^J-bĩsphOiphỂ>glycerate ADP

Substrate-level phosphorylation ATP «*-•'

3-phosphữglycerate

2-phoaphog!yeerflie

I—

H.o

Phosphoenolpyruvate ADP ’—

Substrate-level phosphorylation ATP Pyruvate

Hình Ỉ 7.5: Con đường đường phản. Trong hỉnh là con đường đường phân phân giải glucoz thành Pyruvat. 2 giai đoạn cùa con đường và các sàn phẩm đuợc trình bày ờ đầy. (Theo: Prescott và cs, 2005). Con đường đường phân phân giải một glucoz thành 2 pyruvat qua chuỗi phản ứng mô tả như trên. ATP và NADH cũng được tạo thành. Sản lượng của ATP và NADH có thể tính được khi xem xét hai chặng riêng rẽ. Trong chặng 6-cacbon hai ATP được dùng để tạo thành fructoz*l ,6-bisphotphat. Vì 2 glyceraldehit-3-photphat xuất hiện từ một glucoz (1 từ dihydroxyaceton-photphat) chặng 3-cacbon tạo thành 4 ATP và 2 NADH từ 1 glucoz. Neu trừ ATP dùng trong chặng 6-cacbon ta sẽ được sản lượng thực là 2 ATP/glucoz. Do đó sự phân giải glucoz thành pyruvat trong đường phân có thể được biểu thị trong phương trinh đơn giản sau:

Glucoz + 2ADP + 2Pi + 2NAD+ -> 2 Pyruvat + 2ATP + 2NADH + 2H+ 17.2.2. C on đường pentoz-photphat (con đường hexo-monophotphat) Con đường này có thể được dùng đồng thời với con đường đường phân và con đường Entner - Doudoroff, diễn ra trong điểu kiện hiếu khí cũng như kỵ khí và có vai trò quan ừọng ữong sinh tổng hợp cũng như trong phân giải. Con đường pentoz-photphat bẳt đầu với việc oxy hoá glucoz-6-photphat thành 6photphorus-glucoznat, tiếp theo là oxy hoá ó-photphorusglucoznat thành ribulo-5-photphat và CO2 {hình 17.6). NADPH được tạo thành trong các phản ứng oxy hoá nói ừên. Sau đó ribulo-5photphat đuợc chuyển thảnh một hỗn hợp gồm các đường photphat 3 đến 7-cacbon. Hai enzym đặc trưng của con đường đóng vai trò trung tâm ữong những sự chuyển hoá này là: 1) Transketolaz xúc tác chuyển nhóm ketol 2 cacbon và 2) Transaldolaz xúc tác chuyển nhóm 3-cacbon từ sedoheptulo - 7 - photphat với glyceraldehìt-3-photphaí (hình 17.7). Kết quả chung là 3 glucoz-6-photphat được chuyển thành 2 fructoz-6-photphat, glyceraldehit3-phơtphat và 3 phân tử CƠ 2 theo phưomg trình sau: 3 glucoz-6-photphat + 6NADP+ + 3H 2O -> 2 fructoz-6-photphat + glyceraldehit-3photphat + 3C 02 + 6 NADPH + 6H+ Các chất Ưung gian nói ừên được sử dụng ừong hai con đường. Fructoz-6-photphat có thể được ehuyển trở lại thành glucoz-6-photphat, còn gỉyceraldehit-3-photphat được chuyển thành pyruvat bởi các enzym của đường phân. Glyceraldehit-3-photphat cũng có thể trờ lại con đường pentoz-photphat qua việc tạo thành glucoz-6-photphat. Điều này dẫn đến sự phân giải hoàn toàn glucoz-6-photphat thành CO 2 và tạo thành một lượng lớn NADPH: Gỉucoz-6-photphat + 12NADP+ + 7H20

6 C 02 + 12NADPH + 12H+ + Pi

Con đường pentoz-photphat có một sổ chức năng đị hoá và đổng hoá, chẳng hạn: 1. NADPH từ con đưòng pentoz-photphai được dùng làm nguồn electron cho việc khử các phân tử trọng sinh tổng bợp. . 2. Con đường tổng hợp các đường 4-cacbon yà S-cacbon dung vào một sổ mục đích. Đường 4-cacbon erytro-4-photphat được dùng để tổng hợp các axit Mnin thơm và vitamin B6 (piridoxal). Ribo-5-phơtphat là thảnh phần chù yếu của các axit nucleic và rìbulo-1,5-diphotphat là chất nhận G 0 2 đầu tiên trong quang bợp. Tuy nhiên; khi một vi sinh vật đang sinh trưởng trên một nguồn cacbon là pentozse, con đường cũng có thể cung cấp eacbori cho việc tổng họp hexoz (glucoz cần cho việc tổng hợp peptiđoglican).

162

Hình ì 7.6: Con đitờng pentoz-photphat. Ở đây, 3 phán tử gỉU C O Z - 6-photphal được chuyển hóa thành 2 fructoz-6-photphat và gỉyceraỉdehií-3-photphat. Fructoz 6-photphat được chuyển hóa trờ lợi thành ghicoz-6'photphat. Gỉyceraỉdehit-3-photphat có thê đitợc chuyên thành Pyruvaỉ hay két họp với ỉ phán từ dihydroxyaceton-phoiphaí (từ gỉyceraldehìt-3-photphat tạo thành ở vòng thứ 2 của con đường) đế sàn ra fructoz-6-photphat. (Theo: Prescott và cs, 2005).

Th« transketoiasB reaction

H — c — OH

/ H c I H “ c — OH I H — C““ OH I H — c — OH

C ^O ©

CHgO 0

Xylulose 5-phosphate

Ribos* 5-phosphate

CHjOH c\ ~ °

HO — c “ H

V

J

CI-iOH i c= 0 I HO — c — H I H — Ộ OH H— C - O H I H — c — OH

V H

c — OH I C H ,0 ®

dyceraldehyde 3-phosphate

C H ,O 0 Sadohéptuiosa 7-phosphata

Th« tra n u td « l« M reaction

CHjOH T

c= 0

I HO- C —H I H — C “~ OH H-~C ~ OH H — Ộ — OH I C H p®

\ V

c

Ĩ H — c — OH I A C H ,0® Glyc«raldehyde 3-phosphati

CH.OH I c “ 0 Ĩ HO — c — H I H—C-O H H “ C — OH

°*

c I

/ H

H— C-OH I H — c — OH

CH,Q© Fructosi 6«phosphat#

Sadohaptulosft 7-phosphat*

Erythrosft 4-phosphat®

Hình 17.7. Transketolaz và transaldolaz. Trong hình ỉà các phán ứng xúc tác bởi 2 enzym này. (Theo: Prescott và cs, 2005).

1. Các chất trung gian trong con đường pentoz-photphat có thể được dùng để tạo thành ATP. Glyceraldehit-3-photphat từ con đường có thể đi vào chặng 3-cacbon cùa con đường đường phân và được chuyển thành ATP và pyruvat. pyruvat cỏ thể bị oxy hoá trong chu trình axit tricacbonxylic đề cung cấp nhiều năng lượng hơn. Ngoài ra, một phần NADPH có thể được chuyển thành NADH để sản ra ATP khi NADH bị oxy hoá trong chuỗi vận chuyển electron. Vì các đường 5-cacbon là nhưng chất trung gian trong con đường đo đó con đường pentoz-photphat có thể được dùng để chuyển hoá pentozse cũng như hexoz.

164

Mặc dù có thể là nguồn năng lượng đối với nhiều vi sinh vật nhưng con đường pentoz-photphat thường có vai trò quan trọng hon trong sinh tổng hợp. Hơn nữa, tuy cả hai con đường đường phân và pentoz - photphat đều sử dụng glucoz-6-P nhưng mức độ hoạt động cùa mỗi con đường tùy thuộc vào trạng thái sinh trưởng của tế bào. Trong giai đoạn sinh trưởng mạnh mẽ nhất 2 con đường được sử dụng với tỉ lệ 2:1 (EM: pentoz-P). Tuy nhiên khi sinh trưởng chậm lại năng lực sinh tổng hợp cũng giảm theo, đồng thời NADPH cùng như các photphat đường C5 và C4 cần ít hom khiến cho tỉ lệ giữa hai con đường bây giờ trở thành 10:1 thậm chí 20:1. 17.2.3. Con đường Entner-D oudoroff Mặc dù đường phàn là con đường phổ biến nhất dùng chuyển hoá các hexoz thành pyruvat nhưng một con đường khác, tương tự cũng đã được phát hiện. Con đường EntnerDoudoroff mở đầu với các phản ứng chi như con đường pentoz-photphat tức là tạo thành glucoz-6-photphat và 6-photphorus-glucoznat (hình 17.8). Tuy nhiên, sau đó 6-photphorusglucoznat không bị oxy tiếp mà bị loại nước tạo thành 2-keto-3-deoxy-6photphorusglucoznat (KDPG) là chẩt trung gian chủ yếu ừong con đường này. KDPG sẽ bị phân giải bởi KDPG aldolaz thành Pyruvat và glyceraldehit-3 -photphat. Glyceraìdehit-3-photphat được chuyển thành pyruvat ở phàn cuối của con đường đường phân. Con đường Entner-Doudoroff phân giải glucoz thành pyruvat, 1 ATP, 1 NADH và 1 NADPH.

Glucosfl ■ATP

c

r - ‘' ADR

CtlLKoss 6>phosptut« 'hỉADPT

N i■ W D P H

6-phosphoglucon.at*

■HjO

h'

2*k#to*3-d»oxy-6*ptKaphoglLỉConat« Pyruvat®

.................... GÉycsraldBhyde 3-pho^>rtatt •NAlỳ

c

‘NADH

fc— ADR

f^A T P

^<-*A0P r^A T P PyruvaíB Hình ĩ 7.8: Con đường Entner-Doudoroff.

Thứ tự từ gỉyceraỉảehit-3-photphat tới Pyrưvat được xúc tác bời các enzym chung cho con đường đường phân. (Theo: Prescott và cs, 2005).

165

Hầu hết vi khuẩn sử dụng các con đường đuờng phân và pentoz-photphat nhưng một số lại sử đụng con đường Entner-Doudoroff thay cho đường phân. Con đường EntnerDoudoroff thường gặp ở các chi Pseudomonas, Rhizobium, Azotobcicter, Agrobacterium và một vài chi vi khuẩn Gram âm khác. Trong số các vi khuẩn Gram dương mới chỉ phát hiện Enterococcus faecalis sử dụng con đường nói trẽn. Do con đường Entner-Doudoroff không tạo thành các photphat đường c 5 và C 4 nên tế bào vẫn cần sự hoạt động đồng thời của cả con đường pentoz-P. Thử nghiệm đối với khả năng oxi hóa glucoz bởi con đường Entner-Doudoroff đôi khi được sử dụng để xác định Pseudomonas trong phòng thí nghiệm ỉâm sàng. 17.3. LÊN MEN Khi vẳng mặt hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí NADH không bị oxy hoá bời chuỗi vận chuyển electron do thiếu chất nhận electron từ bên ngoài. Tuy nhiên, NADH tạo thành ưong con đường đường phân vẫn cần phải được oxy hoá trờ lại thành NAD+. Nếu NAD+ không đuợc tái tạo việc oxy hoá glyceraldehit-3-photphat sẽ không diễn ra và đường phân sẽ ngừng hoạt động. Vì vậy chức năng chủ yếu của lên men là tái sản NAD+ cho đường phân. Đẻ khắc phục tình trạng trên nhiều vi sinh vật đã giảm hoặc làm ngừng hoạt tính của enzym pyruvat dehitrogenaz và sử dụng pyruvat hay một trong các chất dẫn xuất cùa pyruvat như chất nhận electron và hydro nhằm tái oxy hoá NADH ữong một quá trình lên men (hỉnh 17.9). Ờ đây chỉ giới thiệu một số quá trình lên men thường gặp nhất. Trong lên men vi sinh vật cần chú ý hai điểm: 1) NADH được oxy hoá thành NAD+ và 2) chất nhận electron thường là pyruvat hoặc một chất dẫn xuất từ pyruvat. Trong lên men cơ chất bị oxy hoả một phần, ATP chỉ được tạo thành bởi photphoryl hoá ờ mức độ cơ chất và O2 là không cần thiềt. Nhiều nấm và một số vi khuẩn, tảo và động vật nguyên sinh lên men đường thành etanol và CO2 trong một quá trình gọi là lên men etylic. Pyruvat bị loại CO 2 thành Acetaldehit, sau đó Acetaldehit bị khử thành etanol nhờ sự xúc tâc của alcoholdehitrogenaz với NADH là chất cho electron (hình 17.10, số 2). Quá trình lên men thứ hai gọi là lên men lactic còn gặp phổ biến hơn. Đây là sự khử Pyruvat thành lactat (hình 17.10, số 1). Lên men lactic diễn ra ở vi khuẩn (vi khuẩn lactic, Bacillus), tảo (Clolỉaị một số mốc nước, động vật nguyên sinh thậm chí ở cả cơ xương của động vật. Các vi sinh vật lên men lactic có thể được chia thanh hai nhóm: nhóm lên men lactic đồng hỉnh sử dụng con đường đưởng phân và trực tiep khử hâu hết pyruvat thành ỉactat nhờ sự xúc tác của enzym lactat dehitrogenaz; nhỏm lên men lactic dị hình tạo thành một tượng lớn các sản phẩm

166

không phải lactat, trong đó nhiều loài tạo thành lactat, etanol và CƠ2 qua con đường photphorusketolaz.

Hình Ị 7.9: Oxy hóa lại NADH trong tên men. NAĐH từ đường phân đirợc oxy hóa ìại nhờ được dùng để khít pyruvat hay I chất dãn xuất cùa pyruvat (X). Kết quả ỉà xuất hiện lactat hoặc sàn phẩm khừ Y. (Theo: Prescott và cs, 2005}. Lên men etylic và lên men lactic là hai quá trinh lên men rất có ích cho con người. Lên men etylic do nấm men được dùng để sản xuất các loại đồ uống có chứa cồn; CO 2 thoát ra từ quá trình lên men này có tác dụng làm nở bột mì. Mặc dù có thể gây hư hỏng thực phẩm nhưng lên men lactic được đùng phổ biến để muối dưa, cà, sản xuất sữa chua, nem chua, ủ chua thức ăn cho gia súc. Nhiều vi khuẩn, đặc biệt là các cá thể trong họ Enterobacteriaceae có thể chuyển hoá Pyruvat thành axit fomic và các sản phẩm khác trong một quá trinh đôi khi được gọi là lên men fomic (hình 17.10, số 5). Nhờ fomic - hydroliaz (là phức hợp gồm ít nhất hai enzym) axit fomic có thể bị phân giải thành H 2 và cc>2‘ HCOOH -> C 0 2 + H2

167

0

0 NADH Lactate

NADH Pyruvate

Acetaldehyde

Ethanoỉ

+ CoASH

0

0 Oi-Acetolactate

Oxaloacetate NADH

Malate

Fumarate

Acetoac

\

CO, Succinate

Acetone NADH

T , T , NADHỈ Propionate Isopropanol : V ; I Butanol

Batyrate

Hình ỉ 7.10; Một số quá trình lên men phô biển ở vì sinh vật. Để cho đơn giản ở đây chỉ giới thiệu các quá trình lên men Pyruvat; trên thực tế nhiều phân tử hữu cơ khác cũng có thể được lên men. Hầu hết các quá trình lên men này đã được đơn giản hóa bằng cách loại bỏ 1 hoặc nhiều buớc và các chất trung gian. (Theo: Prescott và cs, 2005). 1. Vi khuẳn axit lactic (Streptococcus, Lactobacillus, Bacillus). 2. Nấm men, Zymomonas. 3. Vi khuẩn axit propionic (Propionibacterium). 4. Enterobacter, Serratia, Bacillus. 5. Vi khuẩn đường ruột (Escherichia, Enterobacter, Salmonella, Proteus). 6. Clostridium. 168 k.

Có hai loại lên men fomic. Lên men axit hỗn hợp cho sản phẩm là etanol và một hỗn hợp các axit đặc biệt là axetic, lactic, succinic và fomic (bàng 17.2).Neu fomic hydroliaz có mặt axií íomic sẽ bị phàn giải thành H2 và CO2. Dạng lên men này gặp ở Escherichia, Salmonella, Proteus và một số chi khác. Lên men butandiol đặc trưng ở các chi Enterobacter, Serratia, Erwinia và một số ioài của Bacillus (hình 17.10, số 4). pyruvat được chuyển hoá thành acetoin, sau đó acetoin bị khử thành 2,3-butandiol với NADH. Một lượng lớn etanol cũng được tạo thành cùng với những lượng nhỏ các axit gặp trong lên men axit hỗn hợp. Bảng 17.1: Các sản phẩm lên men axil hỗn hợp ỞE. colù (Theo: Prescott và cs, 2005) Cân bằng lên men Lên meo

Etanoỉ Axitfomic Axií axeíic Axit lactic Axil succinic co2 H: Butandiol

(jiM sản phẩm/100fjM glucoz) Sinh trưởng axit (pH6)

Sinh trưởng kiềm (pH8)

50 2 36 80 ỉỉ 88 75 0

50 86 39 70 Ỉ5 2 0,5 0

Lên men fomic rất có ích trong việc xác định các cá thể của họ Enterobacteriacme. Các vi khuẩn lên men butandiol có thể được phân biệt với các vi khuẩn lên men axit hỗn hợp ỡ ba điểm sau: 1. Thử nghiệm (test) Voges-Proskauer là một phương pháp so màu dùng phát hiện tiền chất acetoin của butandiol (hình 17.10). Thử nghiệm này chỉ dương tỉnh với các vi khuẩn lên men butandiol. 2. Các vi khuẩn lên men axit hỗn hợp tạo thành các sản phẩm axit nhiều hơn 4 ỉần các sản phẩm trung tính, trong khi các vi khuẩn lên men butandiol tạo thành các sản phẩm trung tính là chủ yếu. Do đó các vi khuẩn lên men axit hỗn họp axit hoá rất rõ rệt môi trường nuôi cấy. Đây là cơ sở của thử nghiệm đỏ metil (metyl red). Thử nghiệm là dương tính chi với lên men axit hỗn hợp vì pH giảm xuống dưới 4,4 và màu của chất chi thị chuyển từ vàng sang đỏ.

169

3. CO 2 và H 2 xuất hiện đẳng lượng do hoạt tính của fomic-hydroliaz trong lên men axit hỗn hợp. Các vi khuẩn lẽn men butandíol tạo thảnh dư thừa CO2 và íỉ lệ CO2/H2 xấp xỉ 5:1. Các vi khuẩn lên men fomic đôi khi tạo thành ATP trong việc tái oxy hoá NADH. Chúng sử dụng Acetyl-CoA để tổng hợp Acetyl-photphat sau đó nhóm photphaí này được chuyển đến ADP. Acetyl-CoA + Pi

CoA.SH + Acetyl-P

Acetyl-P + ADP -» Axetat + ATP Các ví sinh vật tiến hành các quá trình lên men khác với các quá trình nói trên. Động vật nguyên sinh và nam thường lên men đường thành lactat, etanol, glyxerol, succinat, format, axetat, butandiol vả các sản phẩm bổ sung.

Hình 17.11: Phản ứng Stickland. Âỉanin bị oxy hóo thành axetat và glixin được dùng đè oxy hóa lợi NADH sàn ra trong sự phân giai alanin. Lên men cũng tạo (hành A TP. (Theo: Prescott Vđ cs 2005).

&.

170

Các chất không phải đường cũng được lên men bởi vi sinh vật. Chẳng hạn, một số loài cùa chi Clostridium thường lên men các hỗn hạp axit amin. Các Clostridia phân giải protein như các vi khuẩn gây bệnh. c. sporogens và

c.

botuỉinum thực hiện phản ứng

Stickland trong đó một axit amin bị oxy hoá trong khi một axit amin thứ hai tác đụng như chất nhận electron. Phản ứng Stickland điển hình là phàn ứng trong đó alanin bị oxy hoá và glixin bị khử để tạo thành axetat, CO2 và NH3. ATP được sản ra từ Acetyl - p nhờ photphoryl hoá ở mức độ cơ chất và kiểu lên men này rất thích hợp cho các vi khuẩn khi sinh trưởng trong môi trường kỵ khí giàu protein. Phản ứng Stickland được dùng để oxy hoá một số axit amin như: alanin, leuxin, isoleuxin, valine, phenylalanin, tryptophan và histamin. Các axit amin khác như glicine, glutamat, threonine, arginine và cả alanin cũng được vi khuẩn lên men nhưng theo cơ chế khác. Ngoài đường và axit amin các axit hữu cơ như axetat, ỉactat, propionat và xitrat cũng được lên men. Một sổ quá trình lên men nói ưên có ý nghĩa rất quan ừọng ừong thực tế chẩng hạn xitrat cỏ thể được chuyền thành diacetyl tạo cho sữa lên men hương vị thơm ngon. 17.4. CHU TRÌNH AXIT TRICACBONXYLIC Mặc dù một phần năng lượng có thể thu được từ sự phân giải glucoz thành pyruvat qua các con đường nói trên nhưng phần lớn năng lượng lại được giải phóng khi pyruvat bị phân giải hiếu khí thành CO2 trong giai đoạn 3 của sự đị hoá. Phức hợp đa enzym pyruvat dehiưogenaz trước hết oxy hoá pyruvat thành CO2 và acetyl - CoA cũng là một phân tử cao năng bao gồm coenzym A và axit axetic nối với nhau qua liên kết cao năng tiol este (hình ỉ 7.ỉ 2), Acetyl-CoA xuất hiện từ sự phân giải của nhiều hidrat cacbon, lipit và các axit amin (hình 17.3) có thể bị phân giải tiếp trong chu trình Axit trícacbonxylic (TCA) hoặc cững gọi là chu trình Krebs. Cơ chất đối với chu trình TCA là Acetyl-CoA (hỉnh 17.12). Khi xem xét chu trình này ta cần chú ý đến các chất trung gian, các sản phẩm và hoá học cùa mỗi chặng. Trong phản ứng thứ nhất Acetyl-CoA kết hợp với Oxaloaxetat (chất trung gian 4C) thành xitrat và mở đầu chặng 6C. Xitrat (chứa 3 gổc COOH) được sắp xếp lại tạo thành izoxitrat. Sau đó izoxitrat bị oxy hoá và loại carboxyl hai lần sản ra D-ketoglutarat rồi succinyl-CoA. Ở chặng này 2NADH được tạo thành và 2C bị tách khỏi chu trình như CO2 (Chủ ý: Ở vi khuẩn phản ứng izoxitrat —> a-ketoglutarat sử đụng NADP+). Vì 2C được bổ sung ở dạng Acetyl-CoA lúc ban đầu nên cân bằng dược duy trì và không có cacbon nào bị mất. Bây giờ chu trình đi vào giai đoạn 4C trong đó qua hai bước oxy hoá xuất hiện một FADH2 và một NADH. Ngoài ra, GTP (một phân tử cao năng tương đương ATP) được tạo thành từ succinyl-CoA nhờ photphoryl hoá ờ mức độ cơ chất. Cuối cùng

oxaĩoaxetat được tái tạo và sẵn sàng kết hợp với một phân tử acetyl-CoA khác. Từ hình 17.12 nhận thấy chu trình TCA sản ra 2 C 0 2, 3 NADH, 1 FADH2 và 1GTP đối với mồi phân từ Acetyl-CoA bị oxy hoá. pyruvate

' CoA NAD' 'V*-NADH + H' ,

S^CỌ,

Hình ỉ 7.12: Chu trình axỉt tricacbonxyĩic. Chu trình có thể được chia thành 3 giai đoạn dựa vào sổ ỉuợng các chất trung gian. 3 giai đoạn được tách riêng bởi 2 phàn ímg loại carboxyl, (phàn ứng trong đó nhóm carboxyl bị mất đi ở dạng CO2) Phức hệ pyruvat-dehitrogenaz tạo thành Acetyl-CoA qua oxy hóa Pyruvat. (Theo: Prescoti và cs, 2005).

Đứng về mặt chức năng có thể xem chu trình TCA là con đường oxy hoá AcetylCoA thành CO2. Ở đây, bước đầu tiên là việc gắn nhóm acetyl vào chất mang acetyl tức là oxaloaxetat để tạo thành xitrat. Bước thứ hai bắí đầu vói xitrat và kết thúc với việc tạo thành succinyl-CoA. Ở đây, phần mang acetyl của xitrat mất đi 2C khi bị oxy hoá để cho 2 CO 2. Bước thứ ba và bước cuối cùng chuyển succinyl-CoA ừở lại oxal-axetat (chất mang acetyl) rồi chất này lại kết hợp với một nhóm acetyl khác. Các enzym của chu trình TCA gặp phổ biến trong vi sinh vật. Chu trình hoàn toàn hoạt động ở nhiều vi khuẩn hiếu khí, động vật nguyên sinh sống tự do, hầu hết tào và nấm.

Điều này là dễ hiểu vì chu trình là nguồn năng lượng rất quan trọng. Tuy nhiên, E. colì kị khí không bắt buộc không sử dụng chu trình đầy đù trong điều kiện kị khí hay khi nồng độ glucoz cao nhưng sử dụng chu trình đầy đủ trong những trường hợp khác. Mặc dù thiếu chu trình hoàn chình nhưng E. coỉi thường vẫn có hầu hết các enzym cùa TCA vì một trong các chức năng chù yéu của chu trình này là cung cấp bộ khung cacbon dùng cho sinh tổng hợp. 17.5. S ự VẬN CHUYẺN ELECTRON VÀ PHOTPHORYL HÓA OXY HÓA Khi một phân tử glucoz bị oxy hoá thành 6 phân tử CO2 qua con đường đường phân và chu trình TCA chỉ khoảng 4 phân tử ATP được tạo thành, còn hầu hết ATP thu được là từ sự oxy hoá NADH và FADH2 ừong chuồi vận chuyền electron. 17.5.1. Chuỗi vận chuyển electron Chuỗi vận chuyển electron được nghiên cứu kỹ nhất là chuỗi ở ty thể. Chuỗi bao gồm một dãy các chất mang electron hoạt động phối hợp với nhau để vận chuyển electron từ các chất cho như NADH và FADH2 tới các chất nhận như O2 {hình ỉ 7. ỉ 3). -0.4

F&S

-0.3 -NADH

Phửc hệ I

FMN FeS -

0.2

-

0.1

í

tí i

+0.2

CU

i

+0.3

FeS

'

/f

■Succin°

_ ^ CoQ s

Phức hệ III CytbH

Phức hệ II <*». F®s OUj

è •*

I Cftg FAfU

0

- 0.1

Y

(

+ 0.4

Phức hệ IV

X C ytíị

+Ũ.5 +0.e +

0.7

+ 0.0

Vị trí gần trong chuễi

Hình Ị 7.13: Chuỗi vận chuyển electron ty thể.

173

Các chất mang quan trọng hơn được sắp xẽp theo thê khử và thứ tự tiỉơìĩg đòi chinh xác. Trong ty thể chúng được tổ c h ir r thành 4 phức hợp liên kêt với nhau bởi CoQ và Cytocrom c. Các electron di chuyển từ NADH và succỉnat xuôi theo graàien thê khừ {ới oxy. (Theo: Prescott và cs, 2005).

Các electron di chuyển từ các chất mang với thế khử âm hơn tới các chất mang với thế khử dương hơn, cuối cùng kết hợp với 0 2 và H+ tạo thành nước. Các electron vận chuyển xuôi theo gradien thế năng tương tự như nước chảy xuôi qua một dãy thác ghềnh. Sự khác nhau trong thế khử giữa O2 và NADH là lớn, khoảng 1,14V giúp cho việc giải phóng một lượng lớn năng lượng. Sự thay đổi thế năng ờ một số điểm trong chuỗi đủ lớn để cung cấp nãng lượng cho việc tạo thành ATP tương tự như năng lượng từ thác nước chảy xuống các bánh xe dùng để sản xuất điện, Chuỗi vận chuyển electron đã phân tách toàn bộ năng lượng thoát ra thành các bước nhỏ. Một phần năng lượng giải phóng được bảo tồn ờ dạng ATP. Việc vận chuyển electron ờ những bước này có thể tạo ra các gradien proton và gradien điện tích. Sau đó các gradien này có thể hướng dẫn tổng họp ATP. Khoang giữa màng

Succinate

Fumarate Matrix

Hình ỉ 7.14: Già thuyết hỏa thấm thấu áp dụng vào ty thế. Trong sơ đồ các chẩt mang được tô chức khốìig đối xúng bên trong màng trong sao cho các proton di chuyên qua màng trong khi các electron được chuyên dọc theo chuoi. Việc giài phóng proton vào khoang giữa các màng diên ra khi các electron được chuyển từ các chất mang như FMN và CoQ (vận chuyên cả electron và proton) tới các thành phần như các protein sắt khôìỉg-hem (các protein FeS) và các Cytocrom a tới 0 2. CoQ vận chuyến các electron từ các phức hợp Ị và // đến phức hợp III. Cytocmm c vận chĩỉyên các electron giữa các phức hợp IIỈ và IV. số lượng proton di chuyên qua màng ở mỗi vị trí đoi vởì một cặp electron được vận chuyển vẫn còn chira chắc chán nhưng có ỉẽ ít nhái lồ proton phải di chuyên rơ phía ngoài trong quá trình oxy hóa NADH. (Theo: Pì-escott và cs, 2005).

Các chât mang trong chuỗi vận chuyển electron nằm bên trong màng trong của ty thể hoặc m àn g sinh chât ở vi khuẩn. Sở dĩ vậy vì: (1) Các chất này cần ờ sát gần nhau để thuận tiện cho việc chuyền các electron cho nhau; (2) Mục đích của chuỗi là bơm H+ qua màng đê tạo thành gradien H , do đó nêu không cỏ màng cũng sẽ không có gradien. Hệ thống ty thề được sấp xếp thành 4 phức hợp các chẩt mang, moi phức hợp cỏ thể vận chuyển một 174

phần của các electron cùa con đường tới Ơ2 (hình ỉ 7.ỉ 4). Coenzym Q và Cytocrom c liên kết các phức hợp với nhau. Quá trình nhờ đó năng lượng từ sự vận chuyển electron được dùng để tổng hợp ATP được gọi là photphoryl hoá oxy hoá. Do đỏ cử 3 phân từ ATP có thể được tạo thành từ ADP và Pi mỗi khi một cặp electron chuyển từ NADH tới một nguyên từ của Ơ2- Điều này cũng chì như nói ti lệ của photphorus đối với oxy (P/O) là bằng 3. Vì các electron từ FADH2 chỉ đi qua haí điếm photphoryl hoá oxy hoá nên tỉ lệ p /o cực đại đối với FADH2 tà 2. Ở ty thể tỉ lệ p /o thực sự có thể nhỏ hơn 3 và 2. Mặc đù một số chuỗi hô hấp ở vi khuẩn tương tự như ờ ty thể nhưng nói chung chúng rẩt khác. Chẳng hạn các chất mang electron (ví dụ các Cytocrom) thường không chi nhau và các chuỗi ở vi khuần có thể phân nhánh mạnh mẽ. Các electron thường cỏ thể đi vào chuỗi ở một số điểm và rời khỏi chuỗi qua một số oxydaz tận cùng. Các chuồi ở vi khuẩn cùng có thể ngắn hơn và có ti lệ p /o thấp hơn các chuỗi ở ty thể. Như vậy, các chuỗi vận chuyển electron ở sinh vật nhân nguyên thuỷ và sinh vật nhân thật khác nhau trong chi tiết về cấu trúc mặc dù chúng đều hoạt động theo các nguyên tác cơ bản chi nhau. Những sự khác nhau trong chuỗi vận chuyển electron thể hiện rõ rệt ở E. coli và Paracoccus denitrificans. Hình 17.15 là sơ đồ đom giản chuỗi vận chuyển electron ờ E. coli. Mặc dù vi khuẩn này vận chuyển các electron từ NADH tới các chất nhận và vận chuyển các proton qua màng sinh chất nhưng chuỗi vận chuyển ở E. coỉi hoàn toàn khác với ở ty thể. Chẳng hạn, chuỗi ờ E. coỉì phân nhánh và chứa các Cytocrom rất khác nhau. CoQ hoặc ubiquinol cung cấp các electron cho cả hai nhánh nhưng chúng hoạt động dưới các điều kiện sinh trưởng khác nhau. Nhánh Cytocrom d có ái lực rất cao đối với oxy và hoạt động ờ nồng độ oxy thấp. Nhánh này hoạt động kém hiệu quả hơn nhánh Cytocrom 0 vì không chủ động bơm proton. Nhánh Cytocrom o có ái lực cao trung bình đối với oxy,là một bơm proton và hoạt động ờ nồng độ oxy cao hơn. Paracoccus denitrificans là một vi khuẩn đất, gram âm, kị khí không bắt buộc, có thể sinh trưởng đị dưỡng với hảng loạt chất dinh dương hoặc tự dưỡng với H 2 và CO2 nhờ N O 3 là chất nhận electron. Chuỗi vận chuyển electron hiếu khí gồm 4 phức hợp chi như ở ty thổ (hình ỉ 7.lóa). Ngoài các chất cho như NADH, succinat vi khuẩn nói trên còn oxy hoá metanol, metylamin như nguồn cacbon duy nhất cho sinh trưởng. Các electron đi vào chuỗi ở vị trí C y to c ro m c. M etan o l bị o x y h o á th àn h fo rm a ld e h it, chất này đirợc ch uyến t hành

CO? và đi vào chu trinh Calvin. Khi vi khuẩn sinh trưởng kỵ khí với NO, là chàt nhận electron chuỗi sẽ được sắp xếp hoàn toàn khác (hình 17.16b).

175

Hình 17.15: Hệ thống hô hấp hiểu khí ở E. coỉi. NADH ỉà nguồn electron. Ubiquinone-8 (Q) liên kết NADH-dehitrogenaz với 2 hệ thống oxydaz tận cùng. Nhánh phía trên hoạt động khi vi khuẩn ờ pha ổn định xà chứa ít oxy. h nhất 5 Cytocrom tham gia vào đây là bsss, b5Ịỳ, b}62, d và o. Nhánh phía dưới hoạt động khi E. coỉi sinh trưởng nhanh và nồng độ oxy cao. (Theo: Prescott và cs, 2005).

CH^W

HCK>

T

Hình Ị 7.16: Các chuỗi vận chuyển electron ở Paracoccus denitnficans. (a) Chuỗi vận chuyển hiểu khi chi với chuỗi vận chuyển electron ở ty thể và sứ dụng oxy ỉà chất nhận electron. Metano/ vỏ metiỉamin cũng cổ thế chuyển electron cho Cytocrom c. (b) Chuỗi vận chvỵển kị khỉ phàn nhánh mợnh mẽ được thực hiện bời cà các protein cùa màng và các protein chu chat. Nitrat bị khử thành nitơphân từ nhờ tác dụng phối hợp của 4 reductaz khác nhau tiếp nhận các electron từ CoQ và xừ.c. Vị tri di chuyền cùa proton được chi rô nhimg số hrợng proton bao gồm thì còn chưa chắc chắn. Ghi chú: FP- flavoprotein; MD = ĩũ£ỉat\ol-dehừrogenaz; Nar = nitrat reductaz; Nir = nitrit reductaz; Nor - oxỉt nitric reductaz; Nos = oxit nitrơ reduciaz. (Theo: Prescott và cs, 2005). ' Phức hợp Cytocrom aa3 không hoạt động. Các electron từ Cytocrom c của chuồi được chuyển tới nitrit oxyd nitric - và oxyd nitro reductaz. Nitrat reductaz nhận elecưon từ CoQ. Số lượng proton tách khỏi màng sấp xếp theo kiểu này là không lớn nhưng nhờ vậy vi khuẩn có khả nàng sinh trưởng kỵ khỉ. 177

17.5.2. Photphoryỉ hoá oxy hoá Mặc dù đã được nghiên cứu tích cực trong nhiều năm nhưng chỉ gần đây cơ chế của photphoryl hoả oxy hoá mới được chấp nhận rộng rãi theo giả thuyết hoá thâm thấu (chemiosmosis) do nhà sinh hoá người Anh Peter Mitchell đề xuất đầu tiên vào năm 1951. Khoang trong màng 4H+

4H+

2H+

3H+

AD P + P j

ị

ATP

air Hình ỉ 7. ỉ 7: Hỏa thẩm thấu. Sơ đồ già thuyết hóa thâm thấu áp dụng cho chức năng của tv thê. Dòng electron từ NADH tới oxỵ tạo điểu kiện cho các proton dì chuyển từ chất nền (matrix) ty thẻ tới khoang giữa cúc màng. Ke! quả là sự xuất hiện của các gradien proton và gradiert điện tích. Khỉ các proton chuyến trờ lại chất nền qua phức hợp F ịF0 F ị sẽ tổng hợp A TP. Ở vi khuẩn quá trình diềrt ra hỉơng tự nhimg các proton di chuyển từ tế bào chất đến chu chất. (Theo: Prescott và cs, 2005).

Theo giả thuyết này chuỗi vận chuyển electron được sắp xếp sao cho các proton được đẩy từ chẩt nền ty thể ra phía ngoài, còn các electron thì được vận chuyển bên trong chuỗi {hình 17.Ỉ7). Sự di chuyển của proton cỏ thể xuất phát từ các núm (loop) của chất mang (hình ỉ 7. ỉ 4) hay từ tác dụng của các bơm proton đặc biệt thu được năng lượng nhờ sự vận chuyển electron. Kết quả ỉà xuất hiện một động lực proton (proton motive force, PMF) bao gồm một gradien proton và một thế hiệu màng đo sự phân bổ không đều của điện tích. Khi các proton di chuyển trở lại chất nền ty thể nhờ PMF ATP sẽ được tổng hợp ngược chiều với phản ứng thuỷ phân ATP (hình ĩ 7. ỉ 7).

178 à

Ở vi khuẩn cũng diễn ra quá trình tương tự: dỏng electron tạo điều kiện cho các proton di chuyển ra phía ngoài qua màng sinh chất (hình Ì7.15 và 17.16) sau đó ATP được tổng hợp khi các proton này khuếch tán trở lại tế bào. PMF cùng có thể hướng dẫn vận chuyển các phân tử qua màng cũng như sự quay của tiên mao nghĩa là đỏng vai trò trung tâm trong sinh lý học của vi khuẩn (hình ỉ 7. ỉ 8). Giả thuyết hoá thẩm thấu đuợc chấp nhận bởi hầu hểt các nhà vi sinh vật học. Việc tạo thành gradien proton và gradien điện tích qua màng dã được chứng minh rõ rệt. Tuy nhiên, chứng cớ gradien proton là động lực trực tiếp của photphoryl hoá oxy hoá vẫn chưa được khẳng định. Ở một số vi khuẩn biển ưa mặn các ion natri có thể được dùng để hướng dẫn tổng hợp ATP.

Quang họp

Vận chuyển electron Dộng lực proton Y Electron transport

Photosynthesis

Sự quay của tiên mao vi khuân

ADR + P:i '"v— ATP

Bacterial tlagôHa rotation

Vận chuyển chủ động

Active

transport

Hình ] 7. ỉ 8: Vai trò trung tâm của động lực proton {Proton Motive Force).

Catĩ chú ỷ rằng việc vận chuvên chủ động khôngphài bao giờ củng được hưởng dân bởi PMF. (Theo: Prescott và cs, 2005).

179

ềầ

Cytoplasm

/yyKKy>

Energy

ATP

(>)

Hình 17.19: cấu trúc và chức năng cùa A TP-synthaz. (a) Các đặc tỉnh cẩu trúc chủ yếu của ATP-synthaz. FỊ là cấu trúc hình cầu bao gồm chù yếu là các duới-đơn vị luôn phiên a và P; 3 vị trí hoạt động nằm trên các dưới-đơn vị p. Dưới đơn vị y kéo dài lên trên qua trung tâm cùa cẩu trúc hình cầu và cỏ thể quay. Phần cuống (các dưới đơn vị Y và £) nối hình cấu với F0; Fỹ là phức hợp bên trong màng đóng vai trò như ỉ kênh proton. Fq chứa Ị dịtởi đơn vị a, 2 dưới đơn vị b vờ 9-Ị2 dưới đơn vị c. Nhánh stato bao gồm ditới đơn vị a, 2 chfới đơn vị b và dưới đơn vị ỗ; nhảnh síaio nằm trong màng và gắn với F/. Một vòng các dưới đơn vị c trong Fq được nổi với cuổng vò có thể tác dụng như 1 roto và chuyền động qua I ditởi đơn vị cùa stato. Khi vòng dtiới đơn vị c quay nỏ sẽ làm quay trục (các dưới đơn vị Y £)■ (b) Sơ đồ tổng hợp ATP theo cơ chế liên kết thay đổi trong đó (hể cầu F ỉ được nhìn từ phía màng. 3 vị trí hoạt động có thể tồn tại ờ 3 hỉnh thể khác nhau: ỉ hình thể mở, bất hoạt (O) với ái ỉực thấp đối với cơ chất và ỉ hình thể L bất hoạt có ái lực khả lỏng lẻo đối với cơ chất và Ị hình thể chột hoạt động (T) cỏ ái lực cao đối với cơ chất. Trong bước đầu tiền ADP và Pỉ gắn vào vị trí o. Tiểp theo dưới đơn vị ỵ quay Ỉ2Ơ1nhờ năng luợng có ỉẽ từ dòng proton di chuyến qua Fa. Sự quay này gây ra những thay đổi hình thề trong tất cà 3 dưới đơn vị dẫn đến việc giải phóng ra ATP mới được tạo thành và việc chuyển hỏa vị trí L thành ỉ hình thể T hoạt động. Cuối cùng ATP được tồng hợp ờ vị trí Tmới trong khi ADP và Pi lọi được liên kết vào vị trí o còn trổng và mọi việc lại sẵn sàng cho sự quay tiếp cùa dưới đơn vị y hướng dẫn nhờ năng luợng. (Theo: Prescott và cs, 2005). 180

Dù cơ chế nào là chính xác, việc tồng hợp ATP đều diễn ra trên F]Fo ATPaz hoặc ATP-synthaz {hình 17.19). Thành phần Fi ở ty thể có cấu trúc hình cầu gắn vào bề mặt màng bên trong ty thể bởi một cuống, còn thành phần Fo đuợc lắp vào màng. FlFo - ATPaz ở ví khuẩn lại nằm ở bề mặt bên trong của màng sinh chất. Fo tham gia vào việc di chuyển của proton qua màng và việc di chuyển này qua một rãnh trong F0 có thể dùng để hướng dẫn photphoryl hoá oxy hoá. Fi là một phức hợp lớn chứa 3 dưới - đom vị a luân phiên với 3 dưới - đơn vị Ịỉ. Dưới - đơn vị 7 kéo dài từ phức hợp 03)83 xuống phía dưới. Duới - đơn vị nảy bao gồm một phần cùa cuống và tương tác với Fo- Dưới - đơn vị ô cùng nàm ở phần cuống. Phần lớn dưới - đơn vị 7 gặp ở trung tâm của Fi được bao quanh bởi các dưới - đom vị a và p. Dưới - đơn vị xquay nhanh theo hướng trái chiều kim đồng hồ bên trong phức hợp Ọ3& tựa như trục quay ô tô và gây ra những thay đổi hình thể hướng dẫn tổng hợp ATP ở các vị trí hoạt động trên các dưới - đơn vị p (hình Ỉ7.19b). Do đó ATP - synthaz là một động cơ quay nhỏ nhất hiện biết, nhỏ hơn nhiều so với tiên mạo vi khuẩn. Ở nồng độ đủ cao nhiều hoá chất kìm hãm tổng hợp ATP trong điều kiện hiếu khí và thậm chỉ có thể giết chết tế bào. Các chất kìm hãm này, nói chung, có thể được phân thành hai loại. Một số ngăn cản trực tiếp việc vận chuyển electron. Chất kháng sinh pierixidin cạnh tranh với CoQ; chất kháng sinh antimixin A cản trở việc vận chuyển electron giữa các Cytocrom b và c; xianit vả azit làm ngừng việc vận chuyển electron giữa Cytocrom a và O2 do chúng cỏ cấu trúc tương tự với O2. Một nhóm chất kìm hãm khác gọi là chất cách li (uncoupler) cỏ tác dụng đình chi tổng hợp ATP nhưng không ức chế việc vận chuyển electron. Trên thực tế, các chất cách li cũng có thể nâng cao tốc độ di chuyển của electron. Thông thường, sự vận chuyển electron liên kết chặt chẽ với photphoryl hoá oxy hoá sao cho tốc độ tổng hợp ATP điều hoà tốc độ vận chuyển electron. Tổng họp ATP trong photphoryl hoá oxy hoá diễn ra càng nhanh thi chuỗi vận chuyển electron hoạt động để cung cấp năng lượng cần thiết cũng càng nhanh. Các chất cách li tách riêng photphoryl hoá oxy hoá khỏi vận chuyển electron. Vì vậy, năng lượng do chuỗi thải ra sẽ ở dạng nhiệt chứ không phải ATP. Nhiều chất cách ỉi như dinitrophenol và valineomixin có thể cho phép các ion H+, K+ và các ion khác qua màng mà không hoạt hoá FiFo-ATPaz. Kết quà là các gradien pH và ion bị phả huỷ. Valineomixin cũng có thể liên kết trực tiếp với FjFo-ATPaz vả kỉm hâm hoạt tính của enzym này. 17.5.3. Sản lượng của ATP trong đường phân và hô hấp hiếu kbí Sán lượng cực đại của ATP ở các sinh vật nhân thật trong quá trình đường phân, chu trình TCA và vận chuyển electron cỏ thể được tính toán dễ đàng. Sự chuyển hoá glucoz thành 2 pyruvat trong đường phân cho 2NADH và 2 ATP. Vì 1 NADH ở tế bào chất có thể

sản ra cực đại 2-3 ATP trong vận chuyển electron và photphory] hoá oxy hoá (ti lệ p /o - 2 hoặc 3), tổng sản lượng ATP khi có mặt O 2 của con đường phân là 6-8 phân từ. Bảng 17.2: Sản iuợngATP từ sự oxy hóa glucoz ở tế bào nhân thật. (Theo: Prescott và cs, 2005) Con đường đường phân Photphoryl hóa ờ mức độ cơ chất (ATP) Photphoryl hóa oxy hóa với 2NADH

2ATP 4-6ATP

2Pyruvat thành 2Acetyl-CoA Photphoryl hóa oxý hóa với 2NADH

6ATP

Chu trình TCA Photphoryl hóa ờ mức độ cơ chất (GTP) Photphoryl hỏa oxy hóa với 6NADH Photphơryl hỏa oxy hỏa với 2FADH2

2ATP 18ATP 4ATP

Tổng sàn lượng hiếu khí

36-38ATP

a/ Sản lượng ATP được tính với ti lệ p/o được thừa nhận là 3 đối vói NADH và 2 đối với f a d h 2.

b/ Sản lượng ATP đirợc tính tùy thuộc vào việc các electron của NADH đi vào ty thể như thế nao. Khi O 2 có mặt và chuỗi vận chuyển electron hoạt động pyruvat sẽ bị oxy hoá tiếp thành Acetyl-CoA tức cơ chất cho chu trình TCA. Phàn ửng này sản ra 2NADH vì 2 pyruvat xuất hiện từ một glucoz, đo đó 6ATP nữa được tạo thành. Việc oxy hoá một phân tử Acetyl-CoA trong chu trình TCA sản ra 1GTP (hoặc ATP), 3NADH và IFADH 2 nghĩa là nếu 2 phân tử Acetyl - CoA bị oxy hoá trong chu trình trên thì sẽ xuất hiện 2GTP (ATP), 6NADH và 2 FADH2. Theo bảng 17.2 việc oxy hoá NADH và FADH2 trong chu trình thông qua chuỗi vận chuyển electron sẽ cung cấp tối đa là 38ATP. Tuy nhiên, nhừng tính toán được tóm tát và trình bày ờ bảng 17.2 chỉ là lý thuyết và dựa vào tỉ lệ p /o (số lượng ATP tạo thành khi một nguyên tử oxy bị khử bởi 2 elecữon trong sự vận chuyển electron) là 3 đối với việc oxy hoá NADH và 2 đổi với việc oxy hoá FADH2. Trên thực tế tỉ lệ p /o có lẽ vào khoảng 2,5 đối với NADH và 1,5 đối với FADH2. Như vậy tổng sản lượng ATP trong điều kiện hiếu khí cỏ thể xấp xỉ chỉ 30 hơn là 38ATP. Vì các hệ thống vận chuyển electron ở vi khuẩn thường có tỉ lệ p /o thấp hơn hệ thống ở ty thể nên sản lượng ATP ở vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí có thể ít hơn. Chẳng hạn, E. coỉi với chuỗi vận chuyển electron ngắn có tỉ lệ p /o khoảng 1,3 khi sừ dụng nhánh cytocrom bo ở nồng độ oxy cao và chỉ 0,67 khi sử dụng nhánh Cytocrom bđ (hình 17.15) ở nồng độ oxy thấp. Trong trường hợp này việc tạo thành ATP thay đổi tuỳ theo điều kiện 182

môi truờng. Có ỉẽ vì thường sổng ở những nơi như đường ruột rất giàu chất dinh dường mà E. coỉi không cần phải tổng hợp ATP thật hiệu quả. Chuỗi vận chuyển electron chỉ hoạt động khi E. coỉi sống trong mõi trường nước ngọt, hiếu khí giữa các vật chủ. Rõ ràng, hô hấp hiếu khí hiệu quả hơn rất nhiều so với các quá trình kỵ khí không bao gồm sự vận chuyển electron và photphoryỉ hoá oxy hoá. Chẳng hạn, dưới điều kiện kỵ khí khi NADH không bị oxy hoá bởi chuỗi vận chuyển electron chì 2ATP được tạo thành trong sự phân giải glucoz thành pyruvat. Khi chuyển từ điều kiện kỵ khí sang điều kiện hiểu khí nhiều vi sinh vật giảm mạnh mẽ tốc độ phân giải đường và chuyển sang hô hấp hiếu khí. Đây là một hiện tượng điểu chỉnh được gọi là hiệu ứng Pasteur. Hiệu ứng này có lợi rò ràng cho vi sinh vật vì chỉ cần phân giải một lượng đường ít hơn mà vẫn thu được sàn lượng ATP như nhau do quá trinh hiếu khí đem lại hiệu quả hơn. 17.6. HÔ HÁP KỴ KHÍ

'

Các electron dẫn xuất từ đường và các phân tử hữu cơ khác thường được chuyển cho các chất nhận electron hữu cơ nội sinh hoặc cho Ơ2 thông qua chuỗi vận chuyển electron (hình 17.2). Tuy nhiên nhiều vi khuẩn có các chuỗi vận chuyển hoạt động với các chất nhận electron từ bên ngoài khác O2. Quá trình sản sinh năng lượng này được gọi là hô hấp kỵ khí. Các chất nhận electron chủ yếu là nitrat, sulfat và CO2 nhưng các kim loại và một số phân tử hữu cơ cũng có thể bị khử {bảng ỉ 7.3). Bảng 17.3: Mội sổ chất nhận electron được đùng trong hô hấp. (Theo: Prescott và cs, 2005) Chất nhận electron

Các săn phẩm khử

Các vi sinh vật dùng làm ví dụ

Hỉếu khí

Oj

h 20

Tất cả các vi khuẩn hiếu khí, nấm, động vật nguyên sinh vả tảo

Kỵ khí

N 03*

NCV

Vi khuẩn đường ruột

NCV SO42' C02 s° Fe3+ HAs0 42'

n o 2\ n 2o, n 2 h 2s CH< H-.S Fev HAs02

Pseudomonas, Bacillus,Paracoccus Desulfovibrio và Desulfotomacuium Tất cà các vi khuẩn sinh metan Desulfuaomonas và Thermoproteus Pseudomonas, Bacillus, và Geobacter Bacillus, Desulfotomaculum, Sulfuaospirillum

Se042‘ Fumarat

Se, HSe023‘ Succinat

Aeromonas, Bacillus, Thauera Wolinella

183

Một số vi khuẩn có thể sừ dụng nitrat làm chất nhận electron và tông hợp ATP. Quá trình này thường được gọi là sự khử nitrat dị hoá (dissimilatory nitrat reduction). Nitrat có thể bị khử thành nitrit bởi nitrat - reductaz là enzym thay thế Cytocrom-oxydaz. N 0 3'+ 2e + 2H+ -+ NO 2 +H2O Tuy nhiên sự khử nitrat thành nitrit không phải là con đuèmg thu nhận ATP có hiệu lực vì để sinh trường vi khuẩn cần một lượng lớn nitrat (1 phân tử nitrat chỉ nhận 2 electron). Nitrit tạo thành lại rất độc. Vì vậy niírat thường bị khử tiếp thành N 2 trong quá trình gọi là phản nitrat hóa (denitrification). Mỗi nitrat sẽ nhận 5e và sản phâưi sẽ là không độc: 2 NO 3' + 10e + 12H+ -> N 2 + 6H 2O Phản nitrat hoá là một quá trình nhiều bước bao gồm 4 enzym tham gia: nitrat-, nitrit, oxit nitric- và oxit niươ-reductaz: N 0 3'-> N 0 2‘ -> NO -> N20 ->N 2 Đáng chủ ý, một ừong các chất trung gian là oxit nitric (NO). Ở động vật có vú NO tác dụng như một chất dẫn truyền thần kinh đóng vai trò điều chỉnh huyết áp và được các đại thực bào sử dụng để tiêu diệt vi khuẩn cũng như các tế bào u. Ỏ vi khuẩn có hai loại nitrit reductaz xúc tác sự tạo thành NO: một loại chứa các Cytocrom c và di (ở Paracoccus và Pseudomonas aeruginosa) và một loại là protein chứa đồng (ở Alcaỉigens). Ở vi khuẩn Gram âm nitrit reductaz có lẽ nằm trong chu chất. Oxit nitric reductaz xúc tác việc tạo thành oxit nitrơ từ NO và là một phức hợp Cytocrom bc gắn vào màng. Phản nitrat được nghiên cứu kỳ ở vi khuẩn đất, gram âm Paracoccus denitrifìcans\ vi khuẩn này có khà năng khử nitrat thành N 2 trong điều kiện kỵ khí. Chuỗi vận chuyển elecừon ở chúng chứa nitrat - reductaz và oxit nitric - reductaz gan vào màng còn nitrit reductaz và oxit nitrơ re d u c ta z thì tồ n tại tro n g chu c h ấ t {hình Ỉ 7 . ì 6 b ) . 4 e n zy m sử d ụ n g các e le c tro n từ C o Q và

các Cytocrom typ c để khử nitrat và sản ra PMF. Phản nitrat hoá gặp ở một số loài thuộc các chi Pseudomonas, Paracoccus và Bacillus. Chúng sử đụng con đường này thay cho hô hấp hiếu khí bình thường và có thể được xem là các vi khuẩn kỵ khí tuỳ tiện. Khi O2 có mặt chúng thực hiện hô hấp hiểu khí (tổng hợp nitrat reductaz bị kịềm chế bởi O2). Trong đất kỵ khí phản ứng niừat hoá dẫn đến sự mất nitơ của đất vả ảnh hưởng xấu đến độ phì của đất. Hai nhóm vi khuẩn chủ yếu khác sử dụng hô hấp kỵ khí là các vi khuẩn kỵ khí bắt buộc. Bọn sử dụng CO2 hoặc cacbonat làm chất nhận electron tận củng được gọi là các vi khuẩn sinh metan vì chủng khử C 0 2 thành metan (CHẠ Sulfat cũng có thể đóng vai trò như chất nhận electron tận cùng ờ vi khuẩn Desulfovibrio. Sulfat bị khử thành sulfua (S2" hoặc H 2S) và 8 electron được tiếp nhận.

S 0 42' + 8 e + 8 H+ -> s 2' + 4H20 So với hô hấp hiếu khí - hô hấp kỵ khí kém hiệu quả hơn trong việc tổng hợp ATP nghĩa là việc photphoryl hoá oxy hoá vói các chất nhận electron tận cùng là nitrat, sulfat hoặc CO2 cho ít ATP hơn. Sàn lượng ATP giảm đì bắt nguồn từ chỗ các chất nhận electron nói trên có thể khử kém dương hơn so với O2 . Sự khác nhau trong thế khử giữa chất cho như NADH và nitrat lả nhỏ hơn sự khác nhau giữa NADH và O2 . Vì sản lượng năng lượng trực tiếp liên quan với độ lớn của sự khác nhau trong thế khử nên ít năng lượng hơn được cung cấp cho việc tạo thành ATP trong hô hấp kỵ khí. Tuy nhiên hô hấp kỵ khí là có ích vì có hiệu quả hơn lên men và cho phép tổng hợp ATP nhờ vận chuyển electron và photphoryl hoá oxy hoá ừong điều kiện vắng mặt O2 . Hô hấp kỵ khí chiếm ưu thế trong các đất và các bùn kỵ khỉ. Thường ta quan sát sự kế tiếp của các vi sinh vật trong một môi trường khi có mặt một số chất nhận electron. Chẳng hạn, nếu trong môi trường đặc biệt tồn tại O2 , nitrat, ion mangan, ion feưic (Fe3+), sulfat và CO2 ta sẽ thấy diễn ra thứ tự dự đoán của việc sử dụng chất nhận elecứon khi có mặt một cơ chất có thể oxy hoá thích hợp với chùng (population) vi sinh vật. Oxy được sử dụng truớc tiên như một chất nhận electron vì nỏ kìm hâm việc sử dụng nitrat bởi các vi sinh vật có khả năng hô hẩp với O2 cũng như với nitrat. Khi O2 có mặt các vi khuẩn khử sulfat và vi khuẩn sinh metan bị kim hãm vì chúng là bọn kỵ khí bắt buộc. Một khi O2 và nitrat bị cạn kiệt và các sản phẩm lên men, kể cả hydro, được tích luỹ thi sẽ bắt đầu diễn ra sự cạnh ừanh sử dụng các chất nhận electron khác. Mangan và sắt sẽ được sử dụng đầu tiên, tiếp theo là sự tranh giành giữa vi khuẩn sử đụng sulfat và vi khuẩn sinh metan. Sự cạnh tranh chịu ảnh hưởng bởi sản lượng năng lượng lớn hơn thu được với sulfat là chất nhận electron. Cũng quan trọng là sự khác nhau trong ái lực cùa enzym đổi với hydro vì đây là cơ chẩt phổ biến của cả hai nhỏm vi khuẩn. Vi khuẩn khử sulfat Desulfovibrio sinh trưởng nhanh và sử dụng hydro sẵn có với tốc độ nhanh hơn Metanobacterium. Khí sulfat cạn kiện Desulfovibrio không oxy hoả hydro nữa và nồng độ hydro tăng lên. Cuối cùng vi khuẩn sinh metan chiếm ưu thế và khử CO2 thành CH4 . 17.7. S ự PHÂN GIẢI CÁC HIDRAT CACBON VÀ CÁC POLYME D ự TRỮ NỘI BÀO Ngoài glucoz vi sinh vật có thể phân giải nhiều loại hidrat cacbon. Các hidrat cacbon cỏ thể bắt nguồn từ bên ngoài tế bảo hay từ những nguồn nội bào. Cảc bước mở đầu trong sự phân giải các hidrat cacbon từ bên ngoài thường khác với các bước mở đầu sử dụng với các polyme dự trữ nội bào.

185

17.7.1. Các hidrat cacbon Một số con đường phân giải các monoxaccarit (đường đem) như glucoz-, fructoz-, manno- và galactoz được trình bày ở hình ỉ 7.20. Ba đường đơn đầu tiên được photphoryl hoá nhờ ATP và dễ dàng đi vào con đường đường phân. Trái lại, galactoz, sau phản ứng photphoryl hoá mờ đầu phải được chuyển thành uridin diphotphat galactoz rỗi trong một quá trinh 3 bước được chuyển thành glucoz-6 -photphat (hỉnh 17,20). Monosaccharide intercứnvarsions

Gaỉactose

ỊÃn* Galactcse-1- (p )

ịuTP UDP galactose J glucose . UDP

Mamott

Glucosa

^S^G aM - ®

Tt

UDP Gal Glucose-1-(£)

AĨP

*

Glucosỡ-6- (p )

Fructostì-S- (p)

ATP

^Mannosộ-6-® ATP

ị Glycolytic pathway Disaccharidô ci*avaQ& mattase 2 glucose 1. Maltoss f ạ o „ maltos# phosDhorylasíL * + p — ------ p-o-glucos&-1 -(p)+ glucose

ATx

_ Mrtlobỉose phosphorylasô 2. CollobtDm I|+P|'-------------------------------► ~-o-gkicos#-1-CP;+ glucose ,, A Slicra&a

3. Sucm se + H jO -----Sucrcso

» gtuco«s+fruclo»&

:+ p, _iH£S¥££ÍL«E!ĩ£DdSV

- ® * tructo» .

Lactina + H,0 —0-gafactoãđas& —--------*» galactose + glucose

Hình ỉ 7.20: Sự phân giải hydrat cacbon. Trong hình là những vi dụ vê các enzym và các con đường dùng phân giải dixaccarit và monoxaccarit. (Theo: Prescott và cs, 2005).

Các dixaccarit thông thường bị phân giải thành các monoxaccarit bởi ít nhất hai cơ chế {hình 17.20). Malto-, saccaro- và lactoz có thể bị thủy phân trực tiếp thành các đưcmg đơn. Nhiều dixaccarit như malto-, xenlobio- và saccaroz cùng bị phân giải bởi sự tấn công của nhánh photphat trên liên kết nối giữa hai đường; quá trình này được gọi là phân giải nhờ photphat hay gọi tắt là lân phân (photphorolysis). Cũng như các dìxaccarit các polixaccarit bị phân giải bời cả íhuỷ phân và lân phân. Vi khuẩn vả nấm phân giải các polixaccarit ngoại bảo nhờ tiết ra các enzym thuỷ phân phân giải các polixaccarit thành các phàn tử nhỏ hơn, sau đó các phân tử này được đồng hoá. Tinh bột vả glycogen bị thuỷ phân bởi amilaz thành glucoz, mantoz và các sản phẩm khác. Xenluloz khó bị phân giải horn; nhiều nấm và một số vi khuẩn (vi khuẩn trượt, Clostridia và các xạ khuẩn) tổng hợp xenlulaz thuỷ phân xenluloz thành xenlobioz và glucoz. Một số loại thuộc chi Cytophaga phân lập từ biển cỏ khả năng tiết ra enzym agaraz phân giài thạch. Nhiều vi khuẩn đẩt và vi khuẩn gây bệnh thực vật tổng hợp enzym phân giải pectin là polyme của axit galacturonic (một dẫn xuất của galactoz), axit này là một thành phần quan trọng của mô và thành tể bào thực vật. Đáng chú ý, vi sinh vật cũng có khà riẫng phân giải các chất lạ (xenobiotic) rất bền vững. Đây không phải là các chất do sinh vật tổng hợp mà là do con người tạo Ta. Chẳng hạn các chất trừ sinh vật hại (pesticides) và các hợp chất thom khác nhau. Nhờ sử dụng các enzym và các con đường đặc biệt vi sinh vật chuyển hoá các chất này thành các chất trung gian trao đổi chất bình thường sau đó tiếp tục phân giải theo con đường thông thường. Phanerochaete chrysosporíum là một loài nấm đặc biệt có khả năng phân giải các chất lạ. 17.7.2. Các poỉyme dự trữ Vi sinh vật thường phải sống từng thời gian dài trong điều kiện thiếu vắng chất dinh dưỡng từ bên ngoải. Trong hoàn cảnh như vậy chúng phải tiến hành phân giải các chất dự trữ nội bào như glycogen, tinh bột, poli-/3-hydroxybutyrat... Glycogen vả tinh bột bị phân giải nhờ các enzym photphorylaz. Enzym này xúc tác phản ứng lân phận dẫn tới làm ngắn chuỗi polixaccarit một glucoz và sản ra gIucoz-1-photphat: (Glucoz)n + Pi —►(GluCOZ)n-l + glliC02-l-P

Glucoz-1-phophate có thể đi vào con đường đường phân qua con đường glucoz-6 photphat (hình 17.20). Poli~/3-hyđroxybutyrat (PHB) là một chất dự trữ quan trọng, phổ biến và sự phân giải PHB đã được nghiên cớu kỳ ở Azotobacter. Vi khuẳn này thuỷ phân PHB thành 3 -hydroxybutirat sau đó oxy hoá hydroxybutirat thành acetoaxetat. Acetoaxetat được chuyển thành Acetyl-CoA và Acetyl-CoA cỏ thể bị oxy hoá trong chu trỉnh TCA.

187

17.8. PHÂN GIẢI LI PIT Vi sinh vật thường sử dụng lipit làm nguồn năng lượng. Các triglixerit hoặc triaxilglyxerol, các este của glyxerol và các axit béo (hình 17.21) là các nguôn năng lượng phổ biến. Chúng có thể bị thuỷ phân thành glyxerol và các axit béo bời các lipaz vi sinh vật. Sau đó glyxerol được photphoryl hoá rồi được oxy hoá thành dihydroxyaceton phoíphat và bị phân giải trong con đường đường phân {hình 17.5). 0 I CH, — o — C — R,

I

p

1 y CH — 0 — C ■—

ỉ

0 !!

CHị —■0 “ C — Rj Hình 17.21: Một triaxilgỉyxerol hoậc trỉglixerit. Các nhỏm R biểu thị các chuỗi bền là axit béo.(Theo:Prescottvà Các axit béo từ các triaxilglyxerol và các lipit khácthườngbị đường j8 -oxy hoả sau khi chuyển thành các este của coenzym A (hình ỉ 7.22).

cs, 2005)

oxy hoá tron

Hình ỉ 7.22: p - Oxy hóa axit béo. (Theo: Prescott và cs, 2005). Trong chu trình này các axit béo bị phân giải thành acetyl-CoA; Acetyl-CoA có thể đi vào chu trinh TCA hay được sử dụng trong sinh tổng hợp. Mỗi vòng của chu trinh sản ra Acetyl-CoA, NADH và FADH 2- NADH và FADH 2 có thể bị oxy hoá trong chuỗi vận chuyển electron tạo thành nhiều ATP hơn. Axit-CoA ngán đi 2C lại sẵn sàng đi vào vòng

tiểp theo của chu trình. Các axit béo của lipit là nguồn giàu năng lượng đối với sinh trưởng của vi sinh vật. Theo cách tương tự, một số vi sinh vật có khả năng sinh trưởng tốt trên các hydrocacbon của dầu lửa trong điều kiện hiếu khí. Sự phân giải các axit béo giải phóng năng luợng chủ yếu ở dạng nhiệt hơn là sự tạo thành ATP. Điều này là do sự kết hợp phản ứng tái oxi hóa của FADH2 với oxi tạo thành H2 O2 . Sau đó H2 O2 bị phân giải bởi catalaz cho H2 O và V2 O2 với sự giải phóng nhiệt là chủ yếu. Vì vậy các vi sinh vật sinh truởng trên axit béo và các chất có liên quan như các alkan chuỗi dải thường tạo thành lượng lớn nhiệt. 17.9. PHÂN GIẢI PROTEIN VÀ AXIT AMIN Một sổ vi khuẩn và nấm, đặc biệt là các vi sinh vật gây bệnh, vi sinh vật làm hư hỏng thực phẩm và vi sinh vật đất, có thể sử đụng các protein làm nguồn cacbon và năng lượng. Nhiều vi sinh vật khác phân giải protein và axit amin chỉ khi vắng mặt các nguồn c như glucoz và lipit. Chúng tiểt ra enzym proteaz thuỷ phân các protein và polipeptit thành axit amỉn; các axit amin được vận chuyển vào tế bào và được phân giải.

ĩ CH, CH,

r----

I CH, CH,

II

c = 0

0

0 -

CHj

+

coo1 l c=0

l II

CH-NH.

i

0

T

0 -

cocr coo-

COO-

CH-NH,

CH,

coo-

COO«-Kôtoglutaratậ «-Kôtoglutaratậ

+

K

CH, Alaninử

coo*

Pyruvate Pyruvate

Glutamate

Hình 17.23: Sự chuyển amin. Trên đãy là ỉ ví dụ phổ biển của sự chuyển amin. Nhóm a-amino của alanin được chuyển sang chất nhận a-ketogỉutarat tạo thành pyruvat và gỉutamat. Pyruvat có thể được chuyên hỏa trong chu trình axit tricacbonxylic hoặc được dừng trong sinh tông hợp. (Theo: Prescott và cs, 2005). Bước đầu tiên trong việc sử dụng axit amin là loại amín (deamination) tức là tách nhóm amin khỏi axit amin. Điều này thường được thực hiện bằng sự chuyển amin (transamination): nhỏm amin được chuyển từ một axit amin sang một chất nhận là axit-aketó (hình ỉ 7.23). Axit hữu cơ xuất phát từ việc loại amin có thể được chuyển thành pyruvat, AcetylCoA hay một chất trung gian của chu trình TCA và, cuối cùng, được oxy hoá ừong chu trinh TCA để giải phóng năng lượng. Axit hữu cơ nói trên cỏ thể được sử dụng làm nguồn

c cho việc tổng hợp các thành phần của tế bào. Niíơ dư thừa do loại amin có thể được thài 189

ờ dạng ion amoni đo đó làm cho môi trường trở nên kiềm. Đáng chú ý, oxit trimetilamin (TMAO) là phế phẩm chứa N trong trao đổi chất của cá và có công thức (CH 3) 3NO. TMAO đóng vai trò trong việc tạo thành mùi “cá”. Đây là dạng N dư thừa trong sự phân giải axit amin và bị thải ra. TMAO là chất không mùi đo đó không ảnh hưởng đển mùi, vị và ngoại hình của cá tươi. Tuy nhiên một số vi khuẩn sử dụng TMAO như chất nhận electron tận cùng trong hô hấp kị khí và khử TMAO thành trimetilamin (TMA) có mùi “cá” khó chịu thậm chí mũi người chỉ vài phân tử TMAO đã cảm nhận được vì việc phân giải cá đo vi khuẩn và việc tạo thảnh TMA bắt đầu ngay khi cá chết nên khi cá không có mùi là cá tươi hoặc được ướp lạnh ngay khi cá còn tươi. 17.10. OXI HÓA CÁC PHÂN TỬ HỮU c ơ Như đã nói ở trên, vi sinh vật có thể oxy hoá các phân tủ hữu cơ như hidrat cacbon, lipit, protein và tạo thành ATP nhờ năng lượng được giải phóng. Chất nhận electron là: (1) một phân tử hữu cơ khác nội sinh, oxy hoá hơn xuất hiện trong lên men; (2 ) O 2 trong hô hấp hiếu khí hoặc (3) một phân tử oxy hoá khác O 2 có nguồn gốc từ bên ngoài dùng trong hô hấp kỵ khí (hình 17.2). Trong cả hô hấp hiếu khí và kỵ khí ATP đều được tạo thành do kểt quả hoạt động của chuỗi vận chuyển electron. Các electron đi vào chuỗi có thể bắt nguồn từ các chất vô cơ và nãng lượng có thể thu được từ sự oxy hoá các phán tử vô cơ hơn là từ các chất dinh dưỡng hữu cơ. Khả năng chỉ gặp ở một nhóm vi khuẩn được gọi là hoá dưỡng vô cơ (chemolithotroph). Mỗi loài đều đòi hỏi các chất cho và chất nhận electron đặc trưng (bảng 17.4). Chất nhận electron thường là 0 2 nhưng cũng có thể là nitrat hoặc sulfat. Các chất cho electron phổ biến nhất là H 2, các hợp chất nitơ khừ, các hợp chất sulfua khử và sắt ferrơ (Fe2+). Vi khuẩn hoá dưỡng vô cơ thường là tự dưỡng và sử dụng chu trình Calvin để cố định C 0 2 là nguồn cacbon. Tuy nhiên một sổ chúng có thể sinh trưởng như vi khuẩn hoá dị dưỡng khi có mặt các hợp chất hừu cơ khử. Quá trình khử C 0 2 thành hidrat cacbon tiêu tốn nhiều năng lượng. Việc gán một phân tử C 0 2 vào chu trình Calvin cần 3ATP và 2NADPH. Tuy nhiên phản ứng oxy hoá các phân tử vô cơ (bảng 17.5) cho năng lượng ít hơn nhiều so với-oxy hoá hoàn toàn glucoz thành C 02; sự oxy hoá hoàn toàn này đi kèm với sự thay đổi năng lượng tự đo chuẩn là - 686 kcaVmol. Tì lệ p /o đối với photphoryl hoá oxy hoá ở vi khuẩn hoá dưỡng vô cơ chỉ vào khoảng 1,0 (tỉ lệ này cao hơn nhiều trong phản ứng oxy hoá H2). Do sản lượng ATP thấp vi khuẩn hoả dưỡng vô cơ phải oxy hoá một lượng lớn chat vô cơ đê sinh trường và sinh sản, điều này tăng cường tốc động sinh thái cùa chúng.

Bảng 17.4: Các vi khuẩn hóa dưỡng vô cơ tiêu biểu và các nguồn năng ĩuợng của chúng. (Theo: Prescott và cs, 2005) Vỉ khuẩn Aỉcaỉigens, Hydroophaga, và Pseudomonas spp. Nitrobacter Nitroxomonas Thiobacilỉus denitriýicans Thiobacilỉusferrooxydans

Chất cho electron h2

Chất nhận electron

Sản phẩm

02

h 20

n o 2'

02 0,

NOj-, h 20 NOĩ', HiO so/-, n 2 Fe3+,H 20, h 2s o 4

n h 4+

s°, h 2s Fe3+, s°, H2S

NO302

Bảng 17.5: Sản lượng năng luợng từ những sự oxy hóa sử dụng bởi các vi khuẩn hóa dưỡng vô cơ. (Theo: Preệcoít và cs, 2Ơ05) Phản ứng

AC"’(kcaI/mol)*

H2 + ’/ : 0 2 --------- ►HjO n o 2 + '/ĩ o 2 --------► n o 3-

-56,6 - 17.4

NH4++ 1'/2O2 -------- ►N02' + H20 + 2H+ s° +1 y20 2+ h 20 --------► h 2s o 4

-65,0 -118,5 - 223.7 - 11,2

s20 32- + 2O2 + H,0 -------- ►2SO42' + 2H+ 2Fe2+ + 2H++ '/2 0 2 ------- ► 2Fe3+ + H30

a,/ ả ơ đổi với sự oxy hỏa hoàn toàn của gỉucoz thành C02 là -686 kcaưmol.ỉkcaỉ tương đương với 4,184 kJ. Một số chi vi khuẩn (bảng ỉ 7.4) có thể oxy hoá khí hydro để sản ra năng lượng vì chúng có enzym hydroaz xúc tác phản ứng oxy hoá hydro: H2

2H+ +2ẽ

Các elecừon được chuyển vào chuôi vận chuyển electron hoặc chuyển đến NAD+ tuỳ thuộc vào hydroaz. Nếu NADH được tạo thành Ĩ1Ó cỏ thể được dùng để tổng hợp ATP nhờ việc vận chuyển electron vá photphoryỉ hoá oxy hoá với c>2 là chất nhận electron tận cùng. Tuy nhiên khi đầy đủ chất dưỡng các vi khuẩn hydro nói trên lại thường sử dụng chất hữu cơ làm nguồn năng lượng. Các vi khuẩn hoá dưỡng vô cơ oxy hoá nitơ được nghiên cứu kỹ nhất là vi khuẩn nitrat hoả. Đây là nhừng vi khuẩn đất và vi khuẩn nước có ý nghĩa sinh thái rõ rệt. Sự oxy hoá amoni thành nitrat phụ thuộc vào hoạt tính của ít nhất hai chi khác nhau. Chẳng hạn, Nitroxomonas và Nitrosospira oxy hoá amoni thành nitrit: nh; +

1 /2

0 2 -> N O 2 + H20 + 2H+

191

Sau đó nitrit có thể bị oxy hoá tiếp bởi Nitrobacter và Nitrococcus thành nitrat:

no;

+ y2o2->NO~, Poriplasm

NOf + HjO

NO*' + 2H*

H* Cytoplasm

Hình 17.24: Dòng electron trong chuỗi vận chuyển electron ỞNỈtrobacter Nitrobacter oxy hóa nitrit và thực hiện việc vận chuyên electron bình thường đê sản ra PMFdùng cho tông hợp ATP. (Nhánh bên phàỉ cùa sơ đồ). Một phần PMF cũng được đùng đê đây các electron di chuyên ngược với thời gradien thế khử từ nitrit đến NAD+(nhánh bên trái cùa sơ đồ). Xit.c và 4phức hợp tham gia vào đây ỉà: NADH-Ubiquinone oxydoreductaz (ỉ), ubiquinol-xit.c oxydoreductaz (2), nitrit oxydaz (3) và xit.aaj oxydaz (4). (Theo: Prescott và cs, 2005). Khi hai chi hoạt động phổi hợp araoni trong đất bị oxy hoá thành nitrat. Quá trình này được gọi là nitrat hoá (nitrification). Năng lượng thoát ra trong quá trình oxy hoá của cả amoni và nitrit được dùng đế tổng hợp ATP nhờ photphoryl hoá oxy hoá. Tuy nhiên để khử C 0 2 và các phân tử khác vi sinh vật cần một nguồn electron (lực khử) cũng như một nguồn ATP. Vì amon và nitrit có thể khử dương hơn NAD+ chúng không thể truyền trực tiếp cảc electron đổ tạo thành NADH và NADPH càn thiết. Nguyên nhân là vì các electron chuyển động ngẫu nhiên chỉ từ các chất cho với thế khử âm hơn tới các chất nhận với thế khử dương hom (hình 1 7.7). Vi khuẳn oxy hoá sulfua cũng gặp phải khó khăn như trên. Cả hai nhóm vi khuẩn hoá dường vô cơ đã khắc phục trở ngại này bằng cách sử dụng PMF để đảo ngược dòng electron trong chuỗi vận chuyển electron và khử NAD+ với các electron từ các chất cho nitơ và sulfua (hình 17.24). Vì năng lượng được dùng để tạo thành NADH và ATP nên sản lượng thực của ATP ỉà rất thấp. Vi khuẩn hoá dưỡng vô cơ chịu được sự kém hiệu quả này vì chúng không có các đối thủ cạnh tranh về các nguồn năng lượng đặc trưng.

192

(a) Direct oxidation of sulfite

so;-

sulfiteoxidas^ s o ;- + 2e-

(b) Formation of adenosine 6 -phosphostjffats 2 S O j' + 2 AMP — +■ 2APS + 4ô*

2APS + 2p ,---- ► 2ADP + 2SO;2ADP — *• AMP + ATP

2SOs:" +AMP + 2Pj ■ —** 2SO;' + ATP + 4e~

NH, N o l] -o -s-o -p IJ i o o 0

o - CH, 0>

Adộnosinô 5'-phosphosultat& ĩ

y OH OH

(c)

jtfwA Ỉ 7.25: Sự tạo thành năng hiợng bởi sự oxy hóa sulfua. (a) Sulfil cỏ thể bị oxy hỏa trực tiếp để cung cáp electron cho vận chuyển electron vù phoíphoryl hóa oxy hóa. (b) SuỊ/ìt cũng có (hẻ bị oxy hỏa rờ diuvên thành APS. Con chrỏiìg này sàn ra các electron dùnệ cho việc vận chuyến electron và sàn ra A TP nhờ photphoryỉ háu ở mức đọ cơ chất với APS. (c) Cẩu trúc cùa adenozin - 5' - photphontssiúĩat (Theo: Prescoit vù cs, 2005). Vi khuẩn oxy hoả sulfua ỉà nhóm quan trọng thử ba tron” so củc vi Uhuản hoá vL:C..0 vô cơ. Trao đổi chất của Thiobaciỉỉus đẵ được nghiên cứu chi tiết nhất. Vi khuẩn này oxy hoá sulfua (S°), sulfua hydro (H2S), tiosulfat (S 20 ^ ) và các hợp chất sulfua khử khác thành axit sulfuric, do đó chúng có ý nghĩa sinh thái rõ rệt. Đáng chú ý Thiobacilỉus tổng hợp ATP nhờ photphoryl hoá oxy hoá cũng như photphoryl hoá ở mức độ cơ chất bao gồm adenozin-5-photphorussulfat (APS) là phân tử cao năng tạo thành từ sulfit và adenozin monophotphat (hình 17.25). Một sổ V! k h u ẩn o x y h o á su lfu a rất linh h o ạ t tro n g tra o đ ổ i chất. Ơ 2 c h ú n g tiế n h à n h hô hấp kỵ khí và oxy hoả chất hữu cơ với sulfua là chất nhận electron.

193

Cũng như các vi khuẩn hoá dưỡng vô cơ khác vi khuẩn oxy hoá sulfua có thể sừ dụng CƠ2 làm nguồn cacbon. Nếu được cung cấp eác nguồn cacbon hữu cơ khử (glucoz hay axit amin) nhiều loài sẽ sinh trưởng dị dưỡng. 17.11. QUANG HỢ P Chẳng hạn, Sulfolobus brierỉeyi và một vài vi khuẩn khác có thể sinh trường hiểu khí nhờ oxy hoá sulfua với O 2 là chất nhận electron. Bảng 17.6: Tính đa dạng của các cơ thể quang hợp (Theo: Prescott và cst 2005) Cơ thể nhân thật Thực vật bậc cao Tảo đa bào màu lục, màu nâu và màu đỏ Tảo dcm bào (tảo mắt, tảo giáp, tảo silic)

Cơ thể nhân nguyên thủy Vi khuần lam Vi khuẩn sulfua màu lục, vi khuẩn không sulfua màu tía, Prochỉoron

Vi sinh vật thu được năng lượng không chỉ từ sự oxy hoá các hợp chất vô cơ và hữu cơ nhưng nhiều trong số chúng có thể thu nhận năng lượng ánh sáng (quang năng) và sử dụng năng lượng này để tổng hợp ATP và NADH hoặc NADPH (hỉnh 77.7). Quá trinh ữong đỏ quang năng được thu nhận và vận chuyển thành hoá năng gọi là quang hợp. Thường một cơ thể quang hợp khử và cố định CO2 và đây cũng là các phản ứng nằm trong quá trình ưên. Quang hợp là một trong các quá trình trao đổi chất quan trọng nhất trên trái đẩt vì hầu hết năng lượng của chúng ta tựu trung đều bắt nguồn từ năng lượng mặt trời; năng lượng này cung cấp cho các sinh vật quang hợp ATP vả NADPH dùng tổng hợp chất hừu cơ cần cho sinh trưởng. Các sinh vật quang hợp lại là cơ sở cho hầu hết các chuỗi thức ân trong sinh quyển. Quàng hợp cũng có chức năng bổ sung 0 2 cho con người, đây là quá trình quan trọng đo nhiều cơ thể thực hiện, cả sinh vật nhân thật tẫn nhân nguyên thuỷ ( b ò n g 1 7 . 6 ) . M ặ c d ù c o n r ì g ư ò í t h ư ờ n g ĩrá n q u a n g h ọ -p c h o

cý:

• ; v ậ t b ậ c c a o n i i ư t v tL'Cii

thực tế quá nửa quang hợp trên trái đất là do vi sinh vật góp phần. Nhiii chung, có thể chia quang hợp thành hai phần. Trong các phản ứng sáng quang năng bị thtì giữ và được chuyển thành hoá năng. Sau đó năng lượng này được dùng đề khừ hoặc eổ định C 0 2 và tổng hợp các thành phần của tế bào trong các phản ứng tối.

17,11.1. Phản ứng sáng ở các sinh vật nhân thật và vi khuẩn lam Cốc sình vật quang hợp đeu có các sắc tố dùng hấp phụ ánh sáng trong đó sắc tố quan trợng nhất là chlorophyl (chất diệp lục). Đây lả các vòng phăng, lớn gồm 4 nhân pirol thay thể bởi 1 nguyên từ magiê phổi hợp với 4 nguyên tử nitơ ở trung tâm (hình 17.26). Một số chlorophyl gặp ở sinh vật nhân thật mà quan trọng nhất là chlorophyl a và chlorophyl b 194

(hình 17.26). Hai phân tử chlorophyl này hơi khác nhau về cấu trúc và-cac đặc tính quang phổ. Khi hoà tan trong axeton chiorophyl a có đình hấp thụ ánh sáng ở 665 nm; còn chlorophyl b có đỉnh hấp thụ ở 645nm. Ngoài đặc tính hấp thu ánh sảng đỏ các chlorophyl cũng hấp thu mạnh ánh sảng xanh (đỉnh hấp thu thứ hai đối với chlorophyl a là ở 430nm). Vi các chlorophyl hấp thu chủ yếu trong vùng đỏ và xanh do đó ánh sáng íục được truyền qua. Hậu quả là các sinh vật quang hợp có màu lục. Đuôi dài kỵ nước gắn vào vòng chlorophyl giúp cho sắc tổ này gắn vào màng là vị trí của các phàn ứng quang.

Bactanochlorophyli a CH, I

Ca 0 T

/ >CH,

I

H' c S °

I h

'•C ' Q

ch-

I

I

“Chlorophyll b CH.

V

7

\

H

Bacterk>chIoro phy! I a

Chlorophyll a

0

H - l H ./ í * \ 0= \0 v

\ - J ừ

X

c ^0\— -CH.

Hình ỉ 7.26: cẩu trúc chỉorophyì. Trong kình là cẩu trúc của chlorophyl a, chlorophyl b và bacteriochlorophyl a. Chi ỉ nhóm trong chỉorophyì a bị thay đổi để sàn ra chỉorophyl b, trái lại để chuyển chlorophyi a thành bacteriochỉorophyl a phải cần 2 sự cải biển trong hệ thống vòng. Chuỗi bên (R) cua bacteriochĩorophyl a có thể ỉà phytil (ỉ chuỗi gồm 20C cũng gặp trong các chỉorophyỉ a và b) hay geramỉgeranil (ì chuỗi bền gồm 20C tương tự phytìl nhung nhièĩi hơn 3 nối đôi). (Theo: Prescott và cs, 2005).

195

P-Carơt*ne

Hình ĩ 7.27: Cảc sắc tổ phụ tiêu biếu. Beia-caroíen là Ị caroíenoìt gặp ở tào và các thực vật cao cẩp. sắc tổ này chúa ỉ chuỗi dài cùa các nối đôi và nổi đơn luân phiên gọi là các nối đôi tiếp hợp. Fucoxantin là 1 sắc tố phụ cùa carotenoit gặp trong một số ngành tào (Dấu chấm trong cấu trúc biêu thị ỉ nguyền từ c'). Phycoxyanobiỉin là một ví dụ cùa tetrapiroỉ đường thẳng ỉiên kết với ỉ protein để tạo thành phycobỉỉiprotein. (Theo: Prescott và cs, 2005). Các sắc tố quang hợp khác cũng thu giữ quang năng mà phổ biến nhất là c a ro te n o it. Đây là các phân tử đài thường cỏ màu vàng nhạt có một hệ thống liên kết kép tiếp họp (hình 17.27). jă-caroten gặp ở Prochloron và hầu hết các nhóm tảo; ílucoxantin cỏ mặt ò khuê tảo (diatoms), tảo giáp (Dinoflageỉỉates) và tảo nâu (Phaeophyta). Tảo đỏ và vi khuẩn lam chứa các sắc tố quang hợp gọi là phycobiliprotein bao gồm một protein liên kết với một tetrapyrol (hình 17.27). Phycoerytrin là một sắc tố đỏ có đinh hấp thu cực đại ở 550nm và phycocyanin là sắc tố xanh (hẩp thu cực đại ở 620-640nm). v ề vai ưò trong quang hợp carotenoit và phycobiliprotein thường được coi là sác tố phụ. Mặc đù các chlorophyl không thể hấp thu quang năng một cách có hiệu quả trong vùng xanh - lục đến vàng (khoảng 470-630nm) nhưng các sác tố phụ hấp thu ánh sáng trong vùng này và truyền năng lượng thu được đến chlorophyl. Nhờ vậy chúng giúp cho quang hợp có hiệu quả hơn qua một vùng rộng hơn của chiều dài sáng. Các sắc tố phụ cũng bảo vệ vi sinh vật khỏi ánh sáng mặt trời gay gắt có thể oxy hoá và gây hư hại cho bộ máy quang hợp ừong trường hợp thiếu chúng.

196

Các chlorophyl và sắc tố phụ được tập hợp thành từng dãy có tổ chức cao gọi là ăngten với chức năng tạo ra một diện tích bề mặt rộng dùng thu giữ các photon càng nhiều càng tốt. Mỗi ăngten chứa khoảng 300 phân tử chlorophyl. Quang năng được thu giừ trong một ãngten và được chuyền từ chlorophyl này sang sang chlorophyl khác cho đến khi đạt tới một chlorophyl đặc biệt ở trung tâm phản ứng; chlorophyl này trực tiếp tham gia vào việc vận chuyển electron quang hợp {hình 17.28).

Hình ĩ 7.28: Một chuỗi phàn ứng quang hợp. Trung tâm phản ứng của vi khuẩn không sulfua màu tía Rhodopseudomonas viridỉs. Sơ đồ cận cành của các nhóm thêm ở trưng tâm phán ứng. Trước hết 1 photon được hấp thu bởi ỉ “cặp đặc biệt ” của các phân từ bacteriochỉorophyỉ a và kích hoạt chúng. Sau đó ỉ electron được kích hoạt chuyển động tới phân từ bacteriopheophytin ở nhánh bên phải của hệ thong. (Theo: Prescott và cs, 2005). Ở các tế bào nhân thật và vi'khuẩn lam có hai loại ăngtcn liên kết với bai hệ

quang

khác nhau. Hệ quang I hấp thu ánh sáng vói bước sóng dài hon (> 680nm) và chuyền năng lưạng tới phân tử chlorophyl a đặc biệt gọi là P700. Thuật ngữ P700 có nghĩa rằng phân tử hấp thu ánh sáng hiệu quả nhất ở chiều dài sóng 700nm. Hệ quang II hấp thu ánh sáng ở các bước sóng ngắn hơn (<680nm) và chuyền năng lượng tới chlorophyl đặc biệt P680. Khi ăngten của hệ quang I chuyền quang năng tới chlorophyl P7p0 ở trung tâm phản ứng P700 sẽ hấp thu năng lượng và được kích hoạt khiến thế khử của nó trở nên rất âm. Sau đó P700 chuyền electron được kích hoạt hoặc electron cao năng cho một chất nhận đặc biệt có lẽ lả một phân tử chlorophyl a đặc biệt (A) hoặc một protein sắt - sulfiia {hình 17.29).

197

“ I.H p*

IS

-

1.2

-

1.0

-

0.8

-

0.6

^

-0.4

9 I a o.

-0.2

Su

Reaction C»nỉer^

- l ? l S IAorFeS':*

I

Ịểíi^ỵj.:[:Ạ::

Ị»wỊ

X

I

0.0 + 0.2

‘i ■ ■ • - . '(*: t

♦ 0,4

’ (Nottcyctic)

+0.6

OEC

+0.8 +1.0

-

■•Í3

..V

.lĩ

...

j

. ..

Hình Ỉ 7,29: Quang hợp ở cây xanh. Dòng electron trong quang hợp ờ thực vật bậc cao, Vi khuẩn ĩam và tảo nhân thật cũng tương tự như thực vật bậc cao ớ chỗ đều có 2 hệ quang mộc dù giữa chúng cỏ những khác nhau về chi tiết. Các chất mang tham gia trong vận chuyển electron làferredoxin (Fd) và các protein FeS khác; các Cytocrom bũ, bs6ỉ vàf; pỉastoquinon (PQ); pỉastoxyanin chứa đồng; pheophyíin a (Pheo a); có thế chỉorophyl a (A); và quinon Q chưa rõ có ỉẽ là pĩastoquinon. Cả hệ quang I (PS I) và hệ quang lĩ (PS II) để tham gia vào quang phoiphoryĩ hỏa không vòng; chi PSI tham gia vào quangphotphoryỉ vòng. Phức hợp giải phỏng oxy (OEC = oxy evolving complex) lấy các electron từ nườc chửa cảc ìon mangan và chẩt 2 có chức năng chuyển các electron tởì trung tâm phàn ứng của PSỈI. (Theo: Prescott và cs, 2005). Cuối cùng electron được chuyền cho ferredoxin, sau đó có thể được di chuyển theo một trong hai hướng. Theo con đường vòng elecữon di chuyển qua một dãy các chất mang electron và quay trờ về P700 bị oxy hoả. Con đường được gọi là vòng vì elecừon từ P700 lại trở về P700 sau khi đã trải qua chuỗi vận chuyển electron quang họp. Động lực proton (PMF) được hình thành trong việc vận chuyển electron vòng ưong vùng của Cytocrom bô và được sử dụng để tổng hợp ATP. Quá trình này được gọi là quang photphoryl hoá vòng

198

vì các electron di chuyển theo đường vòng và ATP được tạo thành. Chí hệ quang I tham gía vào quá trình nảy. Các electron cũng có thể di chuyển theo đường không vòng với sự tham gia của cả hai hệ quang P700 được kích hoạt và chuyển các electron tới feưedoxin như đã nói trên. Tuy nhiên trong con đường không vòng feưedoxin bị khử sẽ khử NADP+ thành NADPH (hình 17.29). Vỉ các electron cung cấp cho NADP+ không thể dùng để khử P700 bị oxy hoá nên sự tham gia của hệ quang II là cần thiết. Hệ này chuyền các electron cho P700 bị oxy hoá và .sản ra ATP trong quá trinh. Ảngten của hệ quang II hấp thu quang năng và kích hoạt P680, sau đó P680 khử pheophytin a. Pheophytin a chính là chlorophyl a nhưng ở đây hai nguyên tử hydro đã thay thế magiê ở trung tâm. Các electron chuyển tiếp cho Q (có lẽ lả 1 plastoquinon) và xuôi theo chuỗi vận chuyển electon tới P700. Sau đó P680 bị oxy hoá nhận 1 elecữon từ sự oxy họá của nước thành Ơ2- Như vậy các electron di chuyển suốt từ nước đến NADP+ nhờ năng lượng từ hai hệ thống quang và ATP được tổng hợp nhờ quang photphoryl hoá không vòng, Một ATP và 1 NADPH có thể được tạo thành khi 2 (electron di chuyển qua con đường không vòng. Cũng như sự vận chuyển electron ở ty thể, sự vận chuyển electron trong quang họp diễn ra bên trong màng. Các màng dạng hạt của lục lạp chửa cả hai hệ thống và các ăngten. Màng thylacoit thực hiện quang photphoryl hoả không vòng nhờ cơ chế hoá thẩm thấu. Các proton di chuyển vào bên trong thylacoit trong quả trinh vận chuyển electron quang hợp và quay trờ lại chất đệm (stroma) khi ATP được tạo thành. Các phiến cùa chắt đệm có lẽ chỉ chứa hệ quang I và đơn độc tham gia vào quang photphoryl hoá vòng. Ở vi khuẩn lam các phản ứng quang trong quang hợp cùng nằm bên trong các màng. Các phản ứng tối cần 3ATP và 2 NADPH để khù 1 CO2 và sử dụng CO2 để tổng hợp hidrat cacbon (CH2O). C 0 2 + 3ATP + 2NADPH + 2H+ + H20 -> (CH 20 ) + 3AĐP + 3PÌ + 2NADP*

Hệ thống không vòng sản ra 1NADPH và 1ATP đổi với mỗi cặp electron, do đỏ 4 electron đi qua hệ thống sẽ sản ra 2NADPH và 2ATP. Tống cộng 8 lượng tử (quantum) của quang năng (4 lượng tử cho một hệ quang) là cần để đẩy 4 electron từ nước đến NADP+. Vì tỉ lệ của ATP đối với NADPH cần cho cố định C 0 2 là 3:2 nên ít nhất .1ATP nữa phải được cung cấp. Quang photphoryl hoá vòng có lẽ hoạt động độc lập với việc sản ra ATP thêm này. Điều này đòi hỏi sự hấp thu 2-4 lượng tử nữa. Như vậy khoảng 10-12 lượng từ quang năng là cần để khử và cố định một phân tử CO 2 trong quang hợp.

199

Chkxoplast

Trên đậy là minh họa màng thyỉacoit của lục lạp chứng minh chức năng cùa chuỗi vận chuyên electron quang hợp và quangphotphoryỉ hóa không vòng, Chuỗi bao gồm 3 phức họp: PSỈ, phức hợp Cytocrom bf và PSỈI. Dồng electron hướng dẫn bởi ánh sáng bơm các proton qua màng thyỉacoit và tạo ra ỉ gradìen điện hóa, sau đỏ gradien nậy cô thể được dùng để tổng hợp ATP. Nước là nguồn electron và phức hợp giải phỏng oxy (OEC) sản ra oxy (Theo Prescott và cs, 2005).

17.11.2. Phản ứng quang ờ vi khuẩn lục và vi khuẩo tía Vi khuẩn lục và vi khuẩn tía quang hợp khác vớỉ ví khuẩn lam và các cơ thể quang hợp nhân thật ở một số điểm quan ừọng (bảng 17.7), Đặc bỉệt, vỉ khuẩn lục và vi khuẩn tíạ không sử dụng nước là nguồn elecừon hoặc tạo thành Ũ2 trong qụang hợp nghĩa là chúng tiến hành quang hợp không thải 0 2. Trái lại, vi khuẩn lam và các sinh vật quang hợp nhân thật hầu nhu bao giờ cũng thải oxy (một số vi khuẩn lam có thể tiến hành quang hợp không thải oxy). Trong phản ứng sáng của quang hợp ờ vi khuẩn tía NADPH không được tạo thành trực tiếp.

Bảng 1 7.7: Đặc tính của các hệ thống quang họp vi sinh vật. (Theo: Prescott và cs, 2005) Đặc tính

Sinh vật nhâa thật

Vi khuẩn lam

Vỉ khuẩn màu lục và màu tía

Sắc tố quang hợp

Chlorophyl a

Chlorophyl a

Bacteriochlorophyl

Hệ quang II

Có mặt

Cỏ mặt

Vắng mặt

Các chất cho electron quang hợp

h 20

h 20

H2, H2S, s, chất hữu cơ

Kiểu sản sinh 0 2

Thải 0 2

Thải 0 2’

Không thải 0 2

Các sản phẩm sơ cấp của sự chuyển hóa năng luợng

ATP + NADPH

ATP + NADPH

ATP

Nguồn cacbon

C0 2

C0 2

Cacbon hữu cơ và/hoặc C0 2

* Một số vi khuẩn lam có thể hoạt động không thải Oĩ dưới Ị số điều kiện, chẳng hạn Osciũatorìa cỏ thể sử dụng HỉS ỉàm chất cho electron thay cho HỉO. Tuy nhiên, vi khuẩn lục có thể khừ NAD+ trực tiếp trong phản ứng sáng. Để tổng hợp NADH và NADPH vi khuẩn lục và vi khuẩn tía phải sử dụng các chất cho electron như hydro, sulfua hydro, sulfiia nguyên tố và cảc hợp chất hữu cơ là các chất có thể khử âm hơn nước và vì vậy dễ oxy hoá hơn (nghĩa là các chất cho electron tốt hơn). Cuối cùng, vi khuẩn lục và vi khuẩn tía chứa các sác tổ quang hợp hơi khác nhau gọi là bacteriochlorophyl (hình ỉ 7.26), nhiều trong số chúng có điểm cực đại hấp thu ở những bước sóng dài hom. Các bacteriochlorophyl a và b có đỉnh cực đại trong ete lần lượt ở 775 và 790 nm. Đỉnh cực đại in vivo của bacteriochlorophyl a là khoảng 830-890 nm và cùa bacteríochlorophyl b là 1020-1040 nm. Sự chuyển dịch của cực đại hấp thu vào vùng hồng ngoại như vậy sẽ giúp cho vi khuẩn thích ứng tốt hơn với các ổ sinh thái. Có 4 nhỏm vi khuẩn quang hợp màu lục và màu tía, mỗi nhóm đều chửa một số chi: vi khuẩn sulfua (Chỉorobium), vi khuẩn không-sulfua màu lục (Chloroflexus), vi khuẩn sulfua màu tía (Chromatium) và vi khuẩn không-suỉfua màu tía (Rhodospirillum, Rhodopseudomoanas).

Hình ỉ 7.31; Quang hợp ở vi khuẩn không-suỉ/ua màu tía. Hệ ỉhổng vận chuyến electron quang hợp ờ vi khuẩn không suỉfua màu tía, Rhodobacter sphaeroides. Sơ đồ trên ỉà chưa hoàn toàn và mới ỉà giả định. Ubiquinone (Q) rât giổng với CoQ.BPh là bacteriopheophytin, NAD+yà succinat (nguồn electron) được đảnh dấu. (Theo: Prescott và cs, 2005). Do thiếu hệ quang II nhiều sự khác biệt gặp ở vi khuẩn rriảu lục và màu tía. Những vi khuẩn này không thể sử đụng nưóc làm chất cho electron trong sự vận chuyển electron không vòng. Thiếu hệ quang II chúng không thể tạo thành O2 từ H2O trong quá trình quang hợp và bị hạn chế ở quang photphoryl hoá vòng. Trên thực tế hầu như tất cả vi khuẩn sulfua màu tía và vi khuẩn sulfua màu lụe là bọn kỵ khí bắt buộc. Trên hình 17.3ỉ là sơ đồ giả định đối với chuỗi vận chuyển electron quang hợp của một vi khuẩn không - sulfua màu tía. Khi chlorophyl P870 đặc biệt của trung tâm phản ứng bị kích hoạt nó sẽ chuyển một electron cho bactériopheophytin. Sau đó các electron di chuyển đến các quinon rồi qua một chuỗi vận chuyển electron lại ừở về P870 đồng thời ATP được tổng hợp, Mặc dù cà vi khuẩn lục và vi khuân tía đều thiếu hai hệ quang nhưng vi khuẩn tía có một bộ máy quang hợp tưcmg tự như hệ quang II, còn vi khuẩn sulfua màu lục có một hệ thống tương tự hệ quang I. Do cũng cẩn NADH và NADPH để cổ định CO2 nên vi khuẩn lục và vi khuẩn tía còn phải đối mặt với một vấn đề nữa. Chúng có thể tổng hợp NADH theo ít nhất ba con đường. Nếu vi khuân đang sinh trường trong sự có mặt của H2 có thể khử âm hơn của NAD+, hydro có thể được sử dụng trực tiếp để sản ra NADH. Cũng như bọn hoá dưỡng vô cơ nhiêu vi khuân tía quang họfp sử dụng PMF để đẩy ngược dòng electron trong chuỗi vận chuyển electron và chuyển các electron nảy từ các chất cho vô cơ hoặc hữu cơ tới NAD+ 202

(hình 17.31 và 17.32). Các vi khuẩn sulfua màu lục như Chỉorobium có lẽ khử NAD+ nhờ một dạng đơn giản cùa dòng electron quang hợp không vòng (hình ỉ 7.33).

ATP V

ADP 4 p

4 + ỈVADH + H'

Hình ỉ 7.32: Sự khừNAD ờ vi khuẩn màu lục v à

Vỉ' khuẩn

màu tía.

Dòng electron ngược được sừ dụng đế khừ NAD+, Mũi tên trong sơ để biếu thị ỉ chuỗi vận chuyến electron chuyền ngược hướng nhờ động iực proton hoặc ATP, nghĩa ịà các eỉectrọn di chuyển từ các chất cho với thể khử dương hơn tới 1 chất nhận (NAD+) với the khừám hơn. (Theo: Prescott và cs, 2005).

Hình ỉ 7.33: Quang hợp ờ vi khuẩn sulfua màu lục. Hệ thống vận chuyển electron quang hợp ớ vi khuẩn suifua màu lục Chlorobium lìmicoỉa. Quang nâng được dùng để tổng hợp ATP nhờ quang photphorỵl hóa vòng và vận chuyên các electron từ chất cho s tới NAD+. Chuỗi vận chuyển electron chứa I quinon gọi là menaquinon (MK). (Theo: Prescott và cs, 2005).

Chương 18

s ử DỤNG NĂNG LƯỢNG TRONG SINH TỒNG HỢP Ở VI SINH VẬT

Như trên đã nói vi sinh vật có thể thu nhận năng lượng qua nhiều con đường. Phần lớn năng lượng này được đùng cho sinh tổng hợp hoặc đồng hoá. Trong quá trình sinh tổng hợp vi sinh vật bát đầu với các tiền chất đơn giản như các phân tử vô cơ và các monome và kiến trúc nên các phân tử ngày càng phức tạp hơn cho tới khi xuất hiện các bào quan và các tế bào mới (hình 18.Ỉ). Mỗi tế bào vi sinh vật phải sản xuất ra nhiều loại phân tử khác nhau; tuy nhiên, ừong chưcmg này chỉ cỏ thể giới thiệu việc tổng hợp những thành phần tế bào quan trọng nhất. Vi du

Cắp đô tồ chức Tế bào

Bào quan

Algae Fungi Protozoa Nuclei

Miiochondria Ribosomes Flagella

Các hệ thống siêu phân tử

Các cao phân tìr

Các monome hoặc các đơn vj kiến trúc

I Các phân tử vô cơ

Membranes Enzyme complexes

Nucleic acids Proteins Polysaccharides Lipids Nucleotides Amino acids Sugars Fatty acids

co>' NHJ' H10, P0*J

Hình 18.1; Kiến trúc cúa các tế bào.

204

Sinh tổng hợp của các thành phần tể bào nhân nguyên thủy và nhãn thật. Sinh tòng hợp được tồ chức ở các cấp độ ngày càng phức tọp hơn. (Theo Prescott và cs, 2005). Vì đồng hoả là tạo ra một trật tự và mỗi tế bào được sắp xếp ở mức độ cao, cực kỳ phức tạp, do đó sinh tổng họp đòi hỏi nhiều năng lượng. Điều này dễ nhận thấy khi ta xem xét năng lực sinh tổng hợp của tế bào E. coỉi đang sinh trưởng nhanh (bàng 18.1). Mặc đù hầu hết ATP dành cho sinh tổng hợp được dùng cho tổng hợp protein, nhưng ATP cũng được dùng cho tổng họp các thành phần khác của tế bào. Bảng 18.1: Sinh íểng hợp ởE . coli (Theo: Prescott và cs, 2005) Tbànb pbần tế bào

Sổ phân tử/tế bào*

Các phân tử được tổng hợp/giây

Các phân tử ATP cần/giây cho tỗng họp

ADN ARN Poỉyxaccarít Lipit Protein

lb 15.000 39.000 15.000.000 1.700.000

0,00083 12,5 32,5 12.500 1.400

60.000 75.000 65.000 87.000 2 . 120.000

aỉ Tính cho ỉ tế bào cỏ thế ịich 2,25 ỊMn, trọng lượng ỉx ỉơ 12g, trọng lượng khô 2,5xlơn g và chu trình phân bào là 20 phút. b/Chủ ý: vi khuẩn có thể chửa nhiều bản sao cùa ADN genome. Năng lượng tự do cần cho sình tổng hợp trong các tế bào trưởng thành có kích thước ổn định vì các phân tử của tế bào liên tục bị phân giải và được tổng hợp lại ừong một quá trình được gọi là vòng quay (turnover). Các tế bào không bao giờ chi nhau ở từng thời điểm khác nhau. Mặc dù vòng quay của các thành phần tế bào là liên tục nhưng trao đổi chất vẫn được điều hoà cẩn thận sao cho tốc độ sinh tổng hợp nói chung, được cân bằng với tốc tộ phân giải. Ngoài năng lượng dùng cho quay vòng các phân tử nhiều tế bàơ không sinh trưởng cũng sử đụng năng lượng để tổng hợp các enzym và các chất khác giải phổng vào mồi trường. 18.1. CÁC NGUYÊN TẲC ĐIỀU CHỈNH SINH TỎNG HỢP Trao đổi chất trong sinh tồng hợp tuân theo một số nguyên tắc chung, 6 trong số các nguyên tắc này được tóm tát dưới đây: 1. Mỗi tế bào vi sinh vật chứa một lượng lớn các protein, axit nucleic và polixaccarite. Tất cả đều là các cao phân từ tức là các polyme gồm các đơn vị nhỏ hơn liên kết với nhau. Việc kiến trúc cảc phân tử lán, phức tạp từ một vài đem vị cấu trúc đom giản hoặc monorne tiết kiệm được nhiều dự trữ đi truyền, nguyên liệu cho sính tổng hợp và năng lượng. Ta hãy xem xét tổng hợp protein để hiểu rõ vấn đề này. Các protein, bất kể có kích thước, hình dạng

205

hoặc chức năng như thể nào, đều được tạo thành chỉ bời 20 axit amin thông thường nổi với nhau nhờ liên kết peptít. Các protein khác nhau đơn giàn chỉ là do có thứ tự axit amin khác nhau nhưng không phải là các axit amin mới và khác. Giả dụ, nếu các protein được tạo thành không phải bằng 20 mà bằng 40 axit amin khác nhau, tế bảo sẽ phải cần các enzym để sản xuất ra các axit amin nhiều gấp đôì (hoặc phải nhận được các axit bổ sung từ thức ăn). Các enzym bổ sung đòi hỏi phải có các gen và tế bào lại phải đầu tư thêm nguyên liệu và năng lượng cho việc tổng hợp các gen, các enzym và các axit amin bổ sựng nạy. Rõ ràng, việc sử dụng một vài monome nối với nhau bởi một liên kểt cộng hoá trị duy nhất khiến cho việc tổng hợp các cao phân tử trờ thảnh một quá trình rất có hiệu quả. Hầu như tất cả các cấu trúc tế bào đều được kiến trúc chủ yếu bởi khoảng 30 tiền chất nhỏ. 2. Tế bào thường tiết kiệm các nguyên vật liệu và năng lượng bằng cách sử dụng các enzym đùng cho cả dị họá và đồng hoá. Chẳng hạn, hầu hết các enzym đường phân đều tham gia tổng họp và phân giải glucoz. 3. Mặc dù nhiều enzym ừong các con đường lưỡng hoá hoạt động trong cả phân giải và tổng họp nhưng một số bước lại được xúc tác bởi hai enzym khác nhau: một xúc tác phản ứng theo hướng phân giải và một theo hướng tổng hợp (hình 18.2). Vỉ vậy, cậc cori đường dị hoá và đồng hoá không bão giờ chi nhau mặc dù có nhiều enzym chung. Việc sử dụng các enzym riêng rẽ theo hai hướng ở một bước đơn độc cho phép điều chỉnh dị hoá và đồng hoá một cách độc lập. Cần nhớ răng việc điều chỉnh đồng hoá hơi khác với điều chinh dị hoá. Cả hai con đường đều có thể điều chỉnh được bởi sân phẩm cuối cùng cũng như bởi nồng độ ATP, ADP, AMP và NAD+. Tuy nhiên, trong các con đường đông hoá việc điều chỉnh bỏd sản phẩm cuối cùng, nói chung, có vai trò quan trọng hơn. 4. Để tổng hợp các phân tử một cách hiệu quả các con đường đồng hoá phải hoạt động không thuận nghịch theo hướng sinh tổng hợp. Tế bào có thể thực hiện điêu này bằng cấch liên kết một số phản ứng sinh tổng hợp với sự phân giải ATP và các nucleozit triphotphat khác. Khi hai quá trinh này được liên kêt năng lượng tự do thoát ra trong sự phân giải nucleozit triphotphat sẽ hướng đẫn phản ứng sinh tổng hợp hoàn thành, 5. ơ các vi sinh vật nhân thật các con đường sinh tổng hợp thường diễn ra bên trong các khoang tê bào khác với các con đường phân giải tương ứng. Chẳng hạn, sinh tông hợp axit béo gặp ưong tế bào chất trong khi sự oxy hoá axit

béo được thực hiện bên trong ty thể. Sự phân khoang tạo điều kiện cho các con đường hoạt động đồng thời không phụ thuộc vào nhau.

Hình 18.2: Một con đường sình tồng hợp giả thuyết. Các con đường íìêỉĩ kểt G vời X, Y và Z hoàn toàn là đồng hỏa vì chúng chi được dùng để tồng hợp các sản phẩm cuối cùng. Con đường từ A ăển G là ỉtrỡng hóa, nghĩa ỉà có cả chức nâng dị hỏa và đồng hỏa, Hầu hểt các phàn ứng được dùng trong cả 2 vai trò; tụy nhiên, sự chuyển hỏa qua lại cùa c và D được xúc tộc bởi 2 enzym riêng biệt, Eì (dị hóa) và Eĩ (đằng hỏa). (Nguồn Prescott và cs, 2005). 6 . Cuối cùng, các con đường đồng hoá và dị hoá thường sử dụng các cofactor khác

nhau. Gác phàn ứng oxy hoá trong phân giải, nói chung, sản rạ NADH là một cơ chất cho vận chuyển electron. Trái lại, khi một chất cho electron ỉà cần cho sinh tổng hợp thì NADPH chứ không phải NADH thường đảm nhiệm chức năng này. Trao đổi chất của axit béo cung cấp ví dụ thứ hai. Các phân tử acyl-CoA của axit béo bị oxy hoá để sản ra năng lượng trong khi tổng hợp axit béo có sự tham gia cùa các tioeste của proteịn mang nhánh acyl. Sau khi các cao phân íử đã được kiến trúc từ các tiền chất đơn giản hơn chúng sẽ được tập hợp thành các cấu trúc lớn hơn, phức tạp hơn như các hệ thổng siêu phân tử và các bào quan (hình 18. ỉ). Các cao phân tử thường chứa thông tin cần thiết để tạo thành một 207

cách ngẫu nhiên trong một quá trình gọi là tự tập hợp. Chẳng hạn, riboxom là những tập hợp lớn gồm nhiều protein và các phân tử axit ribonucleic nhưng chúng được tạo thành nhờ sự tập hợp của các thành phần không cần cỏ sự tham gia của các yếu tổ bổ sung: 18.2. CÓ ĐỊNH QUANG HỢP C 0 2 Mặc dù hầu hết vi sinh vật có thể cố định CO2 ít nhất là trong các phản ứng bổ sung tuy nhiên chì các cơ thể tự dưỡng mới cỏ khả năng sử dụng CO2 làm nguồn cacbon duy nhất hoặc chủ yếu. Sự khử và cổ định CO2 đòi hỏi nhiều năng lượng. Các cơ thể tự dưỡng thường thu năng lượng nhờ sự hấp thu ánh sáng trong quang họp nhưng một số nhận được năng lượng từ phản ứng oxy hoá các chất cho electron vô cơ khử. Sự cố định CO2 tự dưỡng cỏ ý nghĩa quyết định đối với sự sổng trên ừái đất vì nó cung cấp chất hữu cơ cho các cơ thể dị dưỡng. Vi sinh vật có thể cố định CO2 hoặc chuyển phân từ vô cơ này thành cacbon hừu cơ và đồng hoá nó theo ba con đường chủ yếu. Hầu như tất cà các vỉ sinh vật tự dưỡng đều cố định CO2 qua con đường trao đổi chất đặc biệt được gọi là chu trình Calvin (cũng gọi là chu trình Calvỉn-Benson hoặc chu trình pentoz-photphat khử). Mặc dù hoạt động trong các cơ thể quang hợp có nhân thật và hầu hết cơ thể quang hợp có nhân nguyên thuỷ nhưng chu ưình Calvin lại vắng mặt ở Archaea (Cổ khuẩn), một số vi khuẩn kỵ khí bắt buộc và một số vi khuẩn hiếu khí. Những vi khuẩn này thường sử dụng một trong hai con đường khác. Một số archaea Ợhermoproteus, Suỉ/oỉobus) và các vi khuẩn Chỉorobium và Desulfobacter sử dụng con đường axit tricacbonxylic khử. ở các vi khuẩn sinh metan, vi khuẩn khử sulfat và các vi khuẩn sinh axetat (các vi khuẩn tạo thành axetat từ CO2 trong quá trình lên men) lại tồn tại con đường Acetyl-CoA. Chu trình Calvin gặp trong chất nền (stroma) của lục lạp của các vi sinh vật nhân thật tự dưỡng. Vi khuẩn lam, một sổ vi khuẩn nitrat hoá và các thỉobacỉllỉ chứa các thể vùi, đa diện gọi là cacboxyxom. Cacboxyxom chứa enzym ribulo-1 »5-bisphotphat carboxylaz, có thể là vị trí cổ định CO2 hoặc Vị trí dự trữ carboxylaz và cốc protein khác. Có thể chia chu trình Calvin thành 3 pha: carboxyl hoá, khử và tái sản. Sơ đồ chung của chu trinh được giới thiệu ở hình ỉ 8.4.

18.2.1. Pha carboxyl hoá (carboxylation phaz) Sự co định CO2 được xúc tác bởi enzym ribulo-l,5-bisphotphat-carboxylaz hoặc oxyaz (rubisco) {hình 18.3) xúc tác việc gắn C 0 2 vào ribulo-ỉ,5-bisphotphat (RuBP) tạo thành 2 phân tử 3-photphorus-glycerat (PGA).

208

18.2.2. Pha khử (reduction phaz) Tiếp theo, PGA bị khử thành glyceraldehit-3-photphat. Sự khử được xúc tác bởi 2 enzym, thực chất là sự đảo nghịch một phần của con đường đường phân mặc dù glyceraldehit-3-photphat-dehitrogenaz khác với enzym đường phân trong việc sử dụng NADP+ thay cho NAD+ (hình ỉ 8.4). ooc—Ỹ~-OH H—c —OH 1 '

■ ."

*

c -f 0 ĩ

H,0

CH,0 (p) H—C—OH 1. ĩ . COOH

; ;VV:" ' ■ COOH ■

■,

CHẠ0 _

CHP

' Rlbuloso 1.5«

titephosphate

1

(RuBP)

<. ■*

O H fi©

' ì3*phosphogìycerat& (POA); • 1,

'

Hình 18.3: Phàn ứng rìbuỉo-ỉ, 5-bisphotphat carboxyỉơ2 . Enzynt xúc tác bổ sung CO2 vào ribulo-ỉ,5-bisphoíphat tạo thành 1 chất trung gian không bền, sau đỏ chất này bị phần giãi thành 2 phân tử 3-photphorusglycerat. (Theo: Prescott và cs, 2005).

18.2.3. Pha tái sỉnh (regen ratio II phaz) Trong pha này RuBP được tái sàn và sản ra các hidrat-cacbon như glyceraldehit-3photphat, fructoz và glucoz (hình 18.4). Phần này của chu trình chi với con đưòmg pentozphotphat và bao gồm các phản ứng của ứans-ketoIaz và transaldolaz. Chu trình được hoàn thành khi photphorusribulokinaz tái tạo RuBP.Để tổng hợp fructoz -6 -photphat hoặc glucoz -6 -photphat từ CO2 chu trình phải hoạt động 6 lần để sản ra hexoz cần thiết và tái tạo 6 phân tử RuBP: 6RÙBP + 6C02

12PGA

6RuBP + Fructoz -6 -P

Việc cố định một CO2 thành chất hữu cơ cần 3ATP và 2NADPH. Glucoz được tạo thành từ CO2 theo phương ttinh sau: 6CO2 + 18ATP + 12NADPH + 12HV+12H20 -> glucoz + 18ADP + 18Pi + 12NADP* ATP và NADPH được cung cấp bởi các phản ứng sáng quang hợp hay bởi sự oxy hoá các phân tử vô cơ ở các vi khuẩn hoá tự dưỡng. Sau đỏ các đường tạo thành trọng chu trình Calvin có thể được dùng để tổng hợp các phân tử cần thiết khác.

209

ch2o ® p =0 I_ HỘOH i_ HCOH

HỘÃ

.

CHjO® CO:’2 RibuĩoseHjO 1,5-btephosphata

p

carboxylase

I HQCH TOOH. C

Krif

HCOH 3-phosphogiycerate CHjO®

•

4 Phosphotfycerate kinase •■>* ■ ■> •A D P -* > ■■ ij* '*■ "1 Ỉ : ATP —^ t * t

.f "■ ■■k ■ '■> ’Ì1 1

► ' : ■ . rr ■

COOH

ATP ADR fl ^ G-Q©

HCOH

1,3-bispho8pbogtyeerat«

CHjO(P) -NADPH + H* Gtyceraldehyde3-phosphate

dehydrogenase

robylọaá s - ■■ ' phosphate

I ị -; , v . I' ■ -

1

PHASE

Biosynthetic

(5)

products

Fructose ^,5*u'sp.‘:c:.i::,';.a Fructose 6-phosphate

L ‘ J- • •

r e g e n e r a t io n

I '

■■■•'"|. Erythrose 4-phosphate 1 Hibose 5-phosphate /,ạhdơtheíÍ ntejwiedipta*,

,- f ” * - ' , - i" ,'i

Hình 18.4: Ghtt trình Calvin. Trên đây là sơ đo van tẳt của chu trình chì với các pha carboxyl hóa và khử ẩirợc trình bày chi tiết. 3 ribuỉo-Ị,5-bisphotphat được carboxyl hóa tạo íhành sáu 3-photphorusglycerat trong pha carboxyl hóa. Các chất này đirợc chuyển hỏa thành ổ gỉycerat-3-photphat rồi có thể thành dihydroxyaceton phoiphat (Ì)HAP) S trong sổ 6 trió2 (gỉyceraìấehit photphat vổ dìhydroxyaceton photphat) được dùng để tạo lại 3 ribuỉo-ĩ,5-bispỉìotphat trong pha tái sởn. Trioz còn ỉại được dùng trong sinh tống hợp. Những con sổ trong ngoặc đơn ở bên phải phía dưới chi ra dòng cacbon này. (Theo: Prescott và cs, 2005).

210

18.3. TÒNG HỢP CÁC ĐƯỜNG VÀ POLISACCHARIDE Nhiều vi sinh vật không có khà năng quang hợp và là các cơ thể dị dưỡng phải tổng hợp đường từ các phân tử hữu cơ khử thay cho từ C 0 2. G lucose A TP Hflxckmase

ADP

G lucosa I p h o sp h ate

F ructose 8 5ho*phat« ATP Phsspnolructakinase

^ p .

A D P ^t

H.o

Fructose 1,0-bi

íh a ta

: D ihydroxyaeeton# p h o sp h a ts

Q ycsraldahycts 3-phosphat«

wP, —MAD'

-f'iADH + K 1,ạ-bíspho®phoglyeflrate A -*-Á d p

h — ATP 3-ptiosphoglycflratu

L

2-pỉiosphoglyc«ratfl

ph o s ph Qù n o\pyruvat fl

^GŨP ADP

Pyrưvate k m as »

p h c Sph 2 è II ữl pyru . Í1i ử

— GTP

carbaxykịnasa

Q xaỉoacatata AD p

ATP

K _ ATp ^

• — CO

“:r

-jgff ịj;i; '

utàtcậrbt^ắmTị

ìỂèẵ^M rịám sM ầữÊỉ^i

Pyruvat#

Hình Ị 8.5: Sự tải tạo đường. Cort đirờng tảị tạo đường gap ở nhiều V I sinh vật. Tên cùa 4 enzym gộp trong đường phản được đóng khung. Các bttởc đường phân cùng âược biểu thị để so sảnh.(Theo: Prescott VÀ cs, 20Ọ5).

211

Việc tổng hợp glucoz từ các tiền chất không phải hydratcacbon được gọi là sự tái tạo đường (gỉucoz neogensis). Mặc đù con đường tái tạo đường không chi con đường đường phân nhưng chúng cỏ 7 enzym chung (hình ỉ 8.5). Ba bước đường phân sau đây là không thuận nghịch trong tế bào: 1) Chuyển hoá photphorusenolPyruvat thảnh pyruvat; 2) tạo thành fructoz -1,6-bisphotphat từ fructoz -6photphat và 3) photphoryl hoá glucoz. Các bước này phải đi vòng khi con đường hoạt động theo hướng sinh tổng hợp. Chẳng hạn, sự tạo thành fructoz -1,6-bisphotphat bởi photphorusfructoz kinaz được đảo nghịch bởi enzym fructoz -bisphotphataz, enzym này loại bỏ nhờ thuỷ phân một photphat từ fructoz -bisphotphat. Thông thường ít nhất hai enzym tham gia vào việc chuyên hoá pyruvat thành photphorusenol pyruvat (đảo nghịch buớc pyruvat kinaz). Từ hình 18.5 cỏ thể thấy con đường tổng họp fructoz za tương tụ ihhư con đường tổng hợp glucoz se. Một khi glucoz và fructoz za đã được tạo thành các đường phổ biến khác cũng được sản sinh. Chẳng hạn, mannoz được hình thành trực tiếp từ fructoz qua một sự sáp xếp lại đon giản: Fructoz -6 -photphat

Mannoz-6 -photphat

Một số đường được tổng hợp trong khi liên kết với một nucleozit diphotphat. Đường nucleozit điphotphat quan ừọng nhất là uridin diphotphat gỉucoz (ƯDPG). Glucoz được hoạt hoả nhờ gẳn với pyrophotphat của uridin diphotphat qua phản ứng với uriđin triphotphat (hình 18.6). 0

mA o K r í

CH,

0

0'

V -r OH

ỎH

Uridtrwdiphosphat* Hình 18.6: Uriđin diphotphaị glucoz (Theo: Prescott và cs, 2005). Phần UDP của HDPG đurợc các enzym nhận ra và mang glucoz đi kháp tể bào dùng tham gia vào các phản ứng hệt như ADP mang photphat ở dạng ATP. ƯDP-galactoz được tổng hợp từ UDPG qua việc sắp xếp lạĩ của một nhóm hydroxyl. Một enzym khác xúc tác việc tổng hợp ƯDP - axit glucuronic qua việc oxy hoá UDPG (hình 18.7). 212

Các đưcmg nucleozit điphotphat cũng đỏng vai trò chủ chốt trong việc tổng hợp các polixaccarite như tinh bột và glycogen. Cũng lại ở đây, sinh tổng hợp không đơn giản chỉ là sự đảo ngược trực tiếp của phân giải. Sự phân giải glycogen và tinh bột diễn ra qua sự thuỷ phân để tạo thành các đường tự do hay qua việc gắn thêm nhảnh photphat vào các polyme này để sản ra glucoz -1-photphat. Các đường nucleozit diphotphat không tham gia vào quá trinh trên. Trái lại trong việc tổng hợp glycogen và tinh bột ở vi khuẩn và tảo adenosine diphotphat glucoz được tạo thành từ glucoz - 1-photphat và sau đó chuyển glucoz vảo cuối chuỗi glycogen và chuỗi tinh bột: ATP + Glucoz -1-photphat -» ADP-glucoz + PPi (Glucoz se)n + ADP-glucoz -> (Glucoz se)n+i + ADP Các đường nucleozit diphotphat cũng tham gia vào việc tổng hợp cảc phân từ phức tạp như thành tế bào vi khuẩn.

UDP-galactose

UDP-glucuronic acid

Hình 18.7: Uridin diphotphat galactoz vò tổng hợp glucuronat. Trên hình là việc tổng hợp UDP-gaỉactoz và UDP-axit glucuronic từ UDP-glucoz se. (Theo: Prescott và cs, 2005).

18.4. S ự ĐỎNG HÓA PHOTPHORUS, LƯU HUỲNH (SULFUA) VÀ NITƠ (NITƠ) VÔ C ơ Ngoải cacbon và oxy vi sinh vật cũng cần một lượng photphorus, sulfua và nitơ cho sinh tổng hợp. Mồi nguyên tố nói trên được đồng hoá hoặc được cổ định thành các phân tử hữu cơ qua các con đường khác nhau.

213

18.4.1. Sự đồng hoá photphorus Photphorus gặp trong cảc axit nucleic, protein, photphoỉipit, ATP và các coenzym như NADP. Nguồn photphòrus phổ biến nhất là các este của photphat vô cơ và photphat hữu cơ. Photphat vô cơ được cố định qua việc tạo thành ATP thông qua một tròng ba con đường: I) quang photphoryl hoá; 2) photpboryl hoá oxy hoá và 3) photphoryl hoá ờ mức độ cơ chất. Đường phân cung cấp một ví dụ của con đuòmg thứ ba. Photphat được gắn với glyceraldehit-3-photphat tạo thành 1,3 -bisphotphorusglycerat, sau đỏ chất này được đùng để tổng hợp ATP. Glyceraldehit-3-photphat + Pi + NAD+ -» 1,3-bisphotphorusglycerat +- NADH + H* 1,3'bisphotphorusglycerat + AJDP

3-photphòrusglycerat + ATP

Vi sinh vật có thể thu nhận các photphat hữu cơ từ môi trường bao quanh ở dạng hoà tan hay dạng hạt. Các este cùa photphat hữu cơ thường bị thuỳ phân bời các photphataz và tách ra photphat vô cơ. Vi khuẩn gram âm chứa cảc photphataz trong khoang chu chất nằm giữa thành tế bào và màng sinh chất;vì vậy sau khi được giải phóng photphat được hấp thu trực tiếp qua màng. Động vật nguyên sinh, trái lại, có thể sử dụng trực tiếp các photphat hữu cơ sau khi ăn hoặc thuỷ phân chủng trong lyzoxom và tiêu thụ photphat.

18.4.2. Sự đồng hoá sulfua Sulfua cần cho việc tổng hợp axit amin (cystein và metionin) và một số coenzym (coenzym A, tiamin-pyrophotphat và biotin) và có thể thu được từ hai nguồn. Nhiều vi sinh vật sử dụng cystein và metionin dẫn xuất tử các nguồn bên ngoài hoặc từ dự trữ axit amin nội bào. Ngoài ra, sulfat có thể cung cẩp sulfua cho sinh tổng hợp. Nguyên tử sulfua trong sulfat oxy hoá hơn nguyên tử sulfua trong cystein và các phân từ hữu cơ khác, do đỏ sulfat phải bị khử trước khi có thể được đồng hoá. Quá trình này được gọi là sự khử sulfat đồng hoá để phân biệt với sự khử sulfat dị hoá diễn ra khi sulfat tác dụng như chất nhận electron trong hô hấp kỵ khí. 0

0

!! 0

I 0'

tí J| ■0 —S ~ G—p —o —CH

o

Aổônina

OH

0= p - 0

cr H ình 18.8: Photphorusadenosin 5 ’-photphorussulfat (PAPS). Theo: Prescott và cs, 2005).

pp, Aderiosina5'«phosptiòsú]faté

L ^A TP

Phosphoade nosine 5'- phosphosuJfat* K — NỊADPIHUH* .

Phospỉvoạdenosln# ậ"*phosphatộ

1^

’W I F ' '

:

" ■Ỉ+ H*

■-1

;' " " i

,-

1 ^M A D P‘

**■ ' 1r .....j-'K.i '

", V.'

Ọ rộáÃíe s u lfu r COm p p u n ậ *

'

•,

ỉ

"■' I '

•

’

Hình 18,9: Con đường khử sulfat (Theo: Prescott và cs, 2005). Sự khử sulfat đồng hoá đòi hỏi phải hoạt hoá sulfat qua việc tạo thành photphoadenosine-5’-photphosulfat (hình ỉ 8.8) tiếp theo là sự khử sulfat. Đây là một quá trình phức tạp (hình Ị 8.9) ữong đó sulfat trước hết bị khử thành sulíĩt (S O 3- ) sau đỏ thành H2S. Cystein có thể được tổng hợp từ sulfua hydro qua hai con đường. Nấm cỏ thể kết hợp H2S với serin tạo thành cystein nhưng nhiều vi khuẩn lại gắn H2S với O-Acetylserin (quá trình 1 và 2, lần lượt): (1) H2S + Serin -»Cystein + H2O Acetyl-CoA

(2) Serin

CoA

H2S

Acetat

O-Acetylserin Cystein

215

Một khi được tạo thành cystein có thể được đùng để tổng hợp cảc hợp chât hữu cơ khác có chứa sulfua. 18.4.3. Sự đồng hoá nitơ Do là thành phần chủ yểu của các protein, axit nucleic, coenzym và nhiều thành phàn khác nên năng lực đồng hoá nitơ của tế bào là cực kỳ quan trọng. Mặc dù khí quyển giàu khỉ nitơ nhưng chỉ một số ít vi khuẩn có thể khử khí này và sử đụng làm nguồn nitơ. Còn hầu hết vì sình vật có khả năng đồng hoá amonỉ hoặc nitrat.

Sự đồng hoá amonỉ Nitơ của amoni có thể được chuyển hoá thành chất hữu cơ tương đối dễ dàng và trực tiếp VI nitơ ở đây gặp trong ừạng thái khử hơn các dạng khác của nitơ vô cơ. Một số vi sinh vật tổng hợp axit arain Alanin ừong một phản ứng amin hoá khừ xúc tác bởi Alanin dehitrogenaz: Pyruvat + N H J + NADH (NADPH) + H* Alanin

^

+ NAD+(NADP+) + H20

Hình 18.10; Con đường đồng hỏa amonì. Sự đồng hỏa amoni nhờglutamat.dehitrogenaz (GDH) Vớ tramaminaz. Cảc GDHphụ thuộc NADP hoặc NẢD cỏ thể tham gia vào đây. Con đường này hoạt động mạnh nhất ở những nồng độ amonỉ cao ( Theo Prescott va cs, 2005). Con đường chủ yếu đồng hoá amoni là tạo thành glutamat từ a-ketoglutarat (một chất trung gian của chu trình TCA). Nhiều vi khuẩn và nấm sử dụng glutamat*đehitrogenaz khi nồng độ amoni cao: a -ketoglutarat + NHJ + NADPH (NADH) + H*

Glutamat + NADP+(NAD+) + H20

Việc sử dụng NADPH và NADH (tác nhân khử) trong tổng hợp glutamat thay đổi tuỳ theo loài. Một khi Alarnn hoặc glutamat đã được tổng hợp nhóm a-atnin mới được tạo thành có thê được chuyên sang các bộ khung cacbon khác thông qua các phản ứng chuyển atnin, từ đó sẽ xuât hiện các axit amin khác. Các ừansaminaz chứa coenzym pyridoxal photphat có

chức năng chuyển nhóm amin. Vi sinh vật có một sổ transaminaz, mãi enzym này xúc tác việc tạo thành một số axit amin bàng cách sủ dụng cùng một axit amin làm chất cho nhóm amin. Khi glutamat-dehitrogenaz hoạt động phối hợp vói các transaminaz amoni có thể được chuyển thành nhiều axit amin (hình ì 8.10).

Phản ứng glutamine synthetase 0

II

COOH

C -N H ,

ĩHỉ

CH,

I

I

CH I '

+

I

CH,

NH, + ATP

I

+ ADR + P.

ĨH — NH,

C H -N K

COOH

COOH

Acid glutamic

Glutamine

Phản ứng glutamat synthase COOH

COOH

ỢOOH

COOH

ọ= 0

CH—NH

CH—NHj

C H -N H ,

CH,

CH I CH}

I

ĩ

1

! CH,

?H' ỸH' COOH

Acỉd aketoglutaric

ỸHj c

I

+ NHj

Glutamine

NADPH + H’

or Fci

ĩ Hj COOH

I I

I

+

NADP* or

Fd

COOH

2 acid glutamic

Hình 18.1 ỉ: Gỉutamin syntetaz và gỉutatnạt synthaz. Các phàn úng do 2 enzym này xúc tác tham gia vào việc đồng hóa amonỉ. Một số gỉutamat syntetaz sử dụng NADPH là nguồn electron, số khác lại sử dụng ferredoxin khử (Fd). (Nguồn Prescott và cs, 2005). Con đường thứ hai dùng đồng hoá amoni bao gồm 2 enzym tác dụng theo thứ tự, đó là glutamin syntetaz và glutamat-synthaz (hình ì 8.l ì) . Amoni được dùng để tổng hợp glutamin từ glutamat, sau đó am it nitơ của glutamin được chuyển đến oketoglutarat để tạo thành một phân tử glutamat mới. Vì glutamat tác dụng như một chất cho amin trong các phản ứng cùa transaminaz nên amoni có thể được dùng để tổng hợp tất cả các axit amin thông thường khi có mặt các transaminaz thích hợp {hình 18A2).

Cả ATP và một nguồn các electron như NADPH hay ferredoxin khử đều cần. Con đường này gặp ở E. coli, B. megaterium và nhiều vi khuẩn khác. Hai enzym tác dụng theo thứ tự hoạt động rất hiệu quả ở các nồng độ amoni thấp khác với con đường glutamat dehiưogenaz. Như đã nói ở trên glutamin syntetaz được điều hoà chặt chẽ nhờ sự cải biến cộng hoá trị thuận nghịch và các effector dị lập thể.

Con đường nậy hoợt động có hiệu quả ở nhãng nồng độ amoni thấp. (Theo: Prescott và cs, 2005).

* Sự khử n itra t đồng hoá Nitơ trong nitrat ( N O 3 ) ở trạng thái oxy hoá hơn nhiều so với nitơ trong amoni. Nitrat trưởc hết phải bị khử thành amoni trước khi nitơ có thể được chuyển hoá thành một dạng hữu cơ. Sự khử này của nitrat được gọi là khử nitrat đồng hoá. NỌ,‘

Nitrate reductase Mo*+ -PAD -^-NADPH

NO.2

26' ịNOH]

Nitroxyl

2e‘

Niiriíe reductase

NHpH H/droxylùmìne 2H

2e" H,0

NH. Hình ỉ 8.13: Khừ nỉtrat đồng hóa.

218

Con đường này gập ớ các vì khuân có thể khừ và đồng hóa nitơ cùa nitrat. Theo: Prescott và cs, 2005). Quá trình này khác với quá trình diễn ra trong hô hấp kỵ khí và khử nitrat dị hoá. Trong sự khử nitrat đồng hoá nitrat được chuyển thành chất hữu cơ và không tham gia vào việc sản sinh năng lượng. Khử nitrat đồng hoá gặp phổ biến ờ vi khuẩn, nấm và tảo. Quá trinh nói trên diễn ra trong tế bào chất ở vi khuẩn. Bước thử nhất trong đồng hoá nitrat là khử nitrat thành nitrit xúc tác bài nitrat reductaz là enzym chứa FAD và molipden (Hình 18.13), NADPH là nguồn electron: N O ; + N ADPH +H+

N 0 2+ NA D P+ + H 20

Sau đó, nitrit bị khử thảnh amoni thông qua một số lần bổ sung 2 elecừon được xúc tác bởi nitrit reductaz và có thể cả các enzym khác. Hydroxylamin có thể là một chất trung gian. Tiếp theo amoni được chuyển hoá thành các axit amin nhờ các con đường đã mô tả. ỉ 8.4.4. Sự cố định Nitơ (Nỉtơ fixation) Sự khử khí nitơ của khí quyển được gọi là sự cố định nitơ. Vì nồng độ của amoni và nitrat thường thấp, hơn nữa chỉ một số vi khuẩn cỏ khả năng trên (các tế bào nhân thật hoàn toàn không thể thực hiện được cố định N 2) nên tốc độ của quá trình này trong nhiều hoàn cảnh, hạn chế Eniymê sinh trưởng của thực vật. c ố định nitơ gặp ở: 1) các vi khuẩn sống tự do (vỉ dụ: Azotobacter, Klebsiella, Clostridium và Metanococcus); 2) các vi khuẩn cộng Enzym# • N = N sinh với thực vật như các cây họ Đậu (Rhizobittm), cây phi lao (xạ khuẩn Frankia) và bèo dâu (vi khuẩn lam Anabaena azollae) và 3) các vi khuẩn lam {Nostoc và Y Enzynifi * = NH Anabaena). | ^ . 28‘t2 H4 Sự khử nitơ thành amoni được xúc tác bởi enzym nitaaz. Mặc dù các chất trung gian gắn vào enzym ta còn chưa rõ nhưng cỏ lẽ nitơ bị khử qua một số lần bổ sung 2 electron như Hình 18.14 mô tả. Sự khử nitơ phân tử thành amoni phát nhiệt mạnh nhưng phản ứng có năng lượng hoạt hoá cao do nitơ phân tử là một khí trơ với một liên kết ba giữa hai nguyên tử nitơ.

Enzyms »

— NH2

2NH3 Erưyma ĩ

Hình 18.14: K h ừ n itơ . Già thuyết k h ù rtiíơ nhờ nitơaz (Theo: Prescott và cs, 2005).

219

Vì vậy, sự khử nitơ là tốn kém và tiêu thụ nhiều ATP. ít nhất 8 electron và 16ATP, cứ 4ATP là cần cho một cặp electron: N 2 + 8H* + 8e + 16ATP

2NH3 + H2 + 16ADP + 16PÌ

Các electron bắt nguồn từ ferredoxin đã bị khử bởi một số con đường, chẳng hạn qua quang hợp ở vi khuẩn lam, qua các quá trình hô hấp ờ các YỈ khuẩn cố định nitơ hiếu khí hoặc qua lên men ở các vi khuẩn kỵ khí. Ví dụ, Clostridium pasteurianum (một vi khuẩn kỵ khí) khử ferredoxin trong quá trình oxy hoá Pyruvat, trong khi Azotobacter (một vi khuẩn hiếu khí) lại sử dụng electron từ NADPH để khử ferredoxin. Nitơaz là một phức hệ gồm 2 protein chủ yếu: một protein MoFe (hay nitaaz, MW 220.000) liên kết với 1-2 protein Fe (hay nitoaz reductaz, MW 64.000). Protein MoFe chứa 2 nguyên tử molipđen và 28-32 nguyên tử sắt; protein Fe chứa 4 nguyên tử sắt (hình 18.15). Fe và Mo của protein MoFe được chứa bên trong một cofactor gọi là FeMo-co và sự khử N 2 diễn ra ở cofactor này. Trước hết protein Fe bị khử bởi ferredoxin sau đó nó liên kết ATP (hìnhl8.'ỉ6). Sự liên kết ATP làm thay đổi hỉnh thể của protein Fe và hạ thấp thế khử của protein này (từ lOOmV đển ~ 400 mV) tạo điều kiện cho protein Fe khử protein MoFe. ATP bị thuỷ phân khi diễn ra sự chuyền electron này. Cuối cùng, protein MoFe khử chuyền các electron tới nitơ nguyên tử. Một số vi khuẩn chứa enzym hydrogenaz oxi hóa H 2 thành H2O và liên kết phản ứng này với việc tạo thành ATP hay với việc khử ferredoxin (Fd) hoặc flavodoxin (Fld) rồi các chất này lại cỏ thể chuyển electron cho protein Fe. Nitơaz rất mẫn cảm với O2 và phải được bào vệ sao cho khỏi bị bất hoạt bời O2 bên trong tế bào. Ở nhiều vi khuẩn lam sự bảo vệ này được thực hiện nhờ một cấu trúc đặc biệt gọi là dị bào nang (heterocyst), có vách dày, chi chứa hệ quang I (dùng tổng hợp ATP nhưng không tạo thành O2).

H ình 18.15: c ẩ u trúc của protein Fe ở nitơaz (Theo: Prescott và cs, 2005).

220

Nitoaz cố định N 2 bên trong dị bào nang và nhận được saccaroz từ các tế bào lân cận sau đó truyền nitơ cố định đuợc cho các tế bào trên. Ở các vi khuẩn hiếu khí, cổ định N2 nhu Azotobacter nitoaz được bảo vệ nhờ: (1) Lớp vò nhày bao quanh tế bào cản trở sự khuếch tản của O2 vào tế bào; (2) Vận tốc hô hấp cao nhờ đó O2 bị loại bỏ nhanh; (3) Nitơaz được kết hợp với một protein đặc biệt nhờ đó không bị bất hoạt bởi O2. Nốt rễ cùa các cây đậu thuộc họ Leguminosae tạo thành một protein màu đỏ gọi là leghemoglobin có khả năng liên kết O 2 tự do đủ cho quá trình hô hấp tạo thành ATP nhưng không kìm hãm hoạt tính của nitơaz của vi khuẩn Rhizobium.

Hình 18. ì 6: Cơchể tác dụng của nitơaz. Quá trình di chuyển của 2 electron từferredoxin tới nitơ được lặp lại 3 lần để khửN2thành 2 phàn từ amoni. Cân bằng ở phía dưới bao gôm cả việc khừ proton thành H2. (Theo: Prescott và cs, 2005). Đáng chú ý, ở đây có sự cộng sinh di truyền giữa hai cơ thể: cây tổng hợp phần protein còn vi khuẩn tổng hợp nhóm hem. Tổng hợp nitơaz không những bị kìm hãm bởi O2 nhưng cũng bời các hợp chất nitơ vô cơ và hữu cơ. Khi thiếu nguồn năng luợng ADP được tích lũy lại và ức chế hoạt tính của enzym. Điều nảy làm tăng cái giá của sự khử N2. 221

Theo tính toán để cố định được 1 mg N Clostridium pasteurianum phải tiêu thụ lg c hữu cơ trong glucoz khi đó vi khuẩn hiếu khí Azotobacter chroococcum thậm chí cần tới 30g. Trong điều kiện đất thiếu Mo một số vi khuẩn có thể tổng hợp 2 loại nitơaz khác: chứa Va (vanadi) Fe hay chi chửa Fe. Các cofactor tương tự FeMo-co gặp trong cả 2 nitơaz nói ữên nghĩa là FeVa-co (trong nitơaz vanadi) và 1 nhóm Fe*s (tương tự FeMo-co và FeVa-co) nhưng thiếu cả Mo và Va (ừong nitơaz sắt). Sự khử nitơ thảnh NH 3 diễn ra qua ba bước, mỗi bước cần 2 electron {hình ỉ 8. Ị 4 và 18.16). Như vậy 6 electron sẽ được chuyển và cần tổng cộng 12ATP đối với một phân tử nitơ bị khử. Tuy nhiên trẽn thực tế quá trình thường tiêu thụ ít nhất 8 electron và 16ATP vi nitơaz cũng khử các proton thành H 2. Hydro phản ứng với diamin (HN = NH) tạo thành nitơ và hydro. Chu trình vô ích này sản ra một phần N 2 ngay trong điều kiện thuận lợi khiến cho việc cố định nitơ trở nên tốn kém hơn. Các vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh có thể tiêu thụ tới 20% ATP do cây chủ sản ra nitơaz có thể khử một số phân tử chứa liên kết ba (như acetylen, xianit vả azit): HC s CH + 2H+ + 2e

H2C = CH2

Tốc độ khử acetylen thành etilen được dùng để đánh giá hoạt tính nitơaz. Một khi nitơ phân tử đã bị khử thành amonì, amoni có thể được chuyển thành các chất hữu cơ. Ở Rhizobium (vì khuẩn cố định nìtơ QỘng sinh), có lẽ amoni khuếch tán khỏi tế bào vi khuẩn và được đồng hoá bởi các tế bào của cây đậu bao quanh. Việc đồng hoá amoni có lẽ chủ yếu là tổng hợp glutamin bởi hệ thống glutamin syntetaz - glutamat synthaz (hình 18.11). Tuy nhiên, allantoin và axit allantoic (các dẫn xuất của Purin) cùng được tổng hợp và được dùng cho việc vận chuyển nitơ tới các phân tử khác của cây. 18.5. TỎNG HỢP CÁC AXIT AMIN Vi sinh vật thay đổi về các nguồn nitơ được sử dụng nhưng hầu hết có thể đồng hoá một vài loại nitơ vô cơ nhờ các con đường đã mô tả. Việc tổng hợp axit amin cùng đòi hỏi sự kiến trúc nên các bộ khung cacbon thích hợp và thông thường đây là một quá trình phức tạp bao gồm nhiều bước. Do nhu câu bảo ton nitơ, cacbon và nâng lượng nên các con đường tổng hợp axit amin, nói chung, được điều hoà chặt chẽ bởi các cơ chế đị lập thể và cơ chế kìm hãm bởi sản phẩm cuổi cùng. E. coỉi, tảo và hau hết thực vật có khả năng tổng hợp tất cả axit amin từ các tiền chất. Các sinh vật khác ke cả người không có khả năng tổng hợp một số axit amin không thay thê và phải thu được chúng trong thức ăn. Một số vi khuẩn lactic như Lactobacillus hoàn toàn không tông hợp được một axit amin nào và phải thu nhận chúng nhờ phân giải protein

222

trong môi trường.Trong mục này không thể trình bày chi tiết con đường sinh tổng hợp của tùng axit amin mà chi giới thiệu khái quát về sinh tổng hợp axit amin.

Hình 18. ỉ 7: Tồ chức của sự đồng hóa. Các sản phẩm sinh tổng hợp dẫn xuẩt từ cảc chất trung gian của con đường lưỡng hỏa. Chú ý 2 phản ứng cố định c o 2 bể sung chủ yếu. (Theo: Prescott VÀ cs, 2005). 223

Hình 18.17 mô tả quan hệ của con đường sinh tổng hợp axit amin với các con đuờng lưỡng hoá. Bộ khung của axit amin bắt nguồn từ Acetyl-CoA và các chất trung gian của chu trinh TCA, đường phân và con đường pentoz-photphat. Để cho hiệu quả và kinh tế nhẩt các tiền chất dùng cho sinh tổng hợp axit amin được cung cap chi từ một vài con đường lường hoá chủ yếu. Thứ tự dẫn đến các axií amin riêng rẽ phân nhánh từ các con đường trung tâm này. Alanin, aspatat và glutamat được được tổng hợp nhờ sự chuyển amin lần lượt, trực tiếp từ pyruvat, oxaloaxetat và a-ketoglutarat.

Oxaloacetate

Aspartate

Aspartate p-semialdehyde

Hình Ị8.18: Con đường phân nhảnh của tọng hợp axỉt amin. Các con đường dẫn tới metionin, threonine, izoleuxin và lỵzin. Mặc dù ỉ sổ mũi tên biểu thị ỉ bước tuy nhiên hầu hết những sự chuyên hỏa qua lại đêu đòi hòi sự tham gia của ỉ sỗ enzym. (Theo: Prescott và cs, 2005). Hâu hêt các con đường sinh tổng hợp đều phức tạp hơn và các chất trung gian quen thuộc thường được dùng trong sinh tổng hợp của các họ axit amin có liên quan nhàm mục đích tiêt kiệm hơn. Chăng hạn, lyzin, threonine, izoleuxin và metionin đều được tổng hợp từ oxaloaxetat từ một con đường đồng hoá phân nhánh (hình 18.18), Con đường sinh tổng hợp các axit amin thơm phenylalanin, tyrozin và tryptophan cũng có chung nhiều chât trung gian (hỉnh Ì8.Ỉ9).

224

Pho sphoenolpy ruvate

+ Erythrose-4- (p)

1' Shikimate

Prephenate

Anthranitate

/ V T

Phonyiaianlne I

Tyrosine

H

Ttyptophan

Hình 18.19: Tổng hợp cácaxit amin thơm (phenyìaỉữnin, tyrozin, tryptophan). Chú ý: hầu hết các mũi tên đều biểu thị trên ĩ phàn ứng enzym. (Theo: Prescott vỏ cs, 2005). 18.6. CÁC PHẢN Ú ttG BỔ SUNG Khi xem xét hình ỉ 8. Ị 7 ta thấy các chất trung gian của chu trinh TCA được dùng trong sinh tổng hợp các pyrimiđin và nhiều axit amin. Trên thực tế, các chức năng sinh tổng hợp của chu trình này quan trọng đến mức hầu hết chu trình hoạt động kỵ khí để cung cấp các tiền chất sinh tổng hợp mặc đù NADH là không cần thiết cho việc vận chuyển electron và photphoryl hoá trong sự vẳng mặt của 0 2. Do đó chu trình TCA có vai trò đáng kể trong việc cung cấp cacbon cho sinh tổng hợp và các chất trung gian của chu trình có thể bị cạn kiệt nếu tế bào không có biện pháp duy trì chúng. Tuy nhiên vi sinh vật có các phản ứng hoàn lại các chất trung gian của chu trình giúp cho chu trình TCA cỏ thể hoạt động liên tục khi sinh tổng hợp đang diễn ra mạnh mẽ. Các phản ứng thay thế các chất trung gian của chu trình được gọi là các phản ứng bổ sung (anaplerotic reactions). Hầu hết vi sinh vật cỏ thể thay thế các chất trung gian của chu trình TCA bằng có định CƠ2 , ừong đó CO2 được chuyển hoá thành cacbon hữu cơ và được đồng hoá. cần phân biệt là, các phản ứng bổ sung không đảm nhiệm cùng chức năng như con đucmg cố định CO2 cung cấp cacbon cần thiết ở các cơ thể tự dưỡng, c ổ định CO2 ở các cơ thể tự dưỡng cung cấp hầu hết hoặc toàn bộ cacbon cần cho sinh trường. Các phản ứng bổ sung cố định CO2 chỉ nhằm thay thế các chất trunggian và duy trì cân bàng trao đổi chất. Thường thường CO2 được gắn vào mộtphân tử chất nhận (Pyruvat hoặc photphorusenolPyruvat) để tạo thành chất trunggian cùa chu trình là Oxaloaxetat (hình

225

18.17). Arthrobacter globiformis và nấm men sử dụng Pyruvat-carboxylaz xúc tác phàn ứng này: Pyruvat + C 0 2 + ATP + H20 — —

» Oxaloaxetat + ADP + Pi

Enzym trên cần COfactor là biotin và sử dụng năng lượng của ATP để liên kết CO2 vào Pyruvat. Biotin thường là cofactor của các enzym xúc tác phản ứng carboxyl hoá. Do có chức năng quan trọng như vậy nên biotin là yếu tố sinh trưởng cần thiết đối với nhiều loài vi sinh vật. Các vi sinh vật khác như E. coli, Salmonella typhìmurium lại sử dụng enzym photphoenolpyruvat-carbox ylaz xúc tác phản ứng dưới đây: Photphoenolpyruvat + CO2 -> Oxaloaxetat + Pi

GKAlesMtầto H o

CHU TR ÌN H G LIO X Y LA T

H -U -O -

CKS1ỞK*18t« Q LYO XYLATE C Y C LE

C ltrsl*

1—C— [I 0* o C -o-~c-c H

i ầữữĩì-m *

i f . - ĩ i-y.i

u»

\

Fum arat*

H 0 / y

1 /4 ỉ— — H—A— c— C o

°0.

H -^ -H

Suectnyl-CoA Ov*rall •quatlon; 2 A c « t y i - C o A 4. f a d

♦ 2N A D ' ♦ 3 H 0

— ► 0*ílo*cétit» ♦ 2CoA-» FADH.+ 2NADH *

ĨH

Hình 18.20: Chu trình glioxylat. Chú ý: Các enzym của chu trình TCA ở phần dirới được bỏ qua. (Theo: Prescott và cs 2005). 226

Một số vi khuẩn, tảo, nấm và động vật nguyên sinh có thể sinh trưởng với nguồn cacbon duy nhất là axetat bằng cách sử đụng axetat để tổng hợp các chất trung gian của chu trình TCA trong chu trình glioxylat (hình 18.20). Chu trình được thực hiện nhờ hai enzym đặc biệt - Izoxitrat liaz và malat synthaz - xúc tác các phản ứng sau: T_izoxurai ÍV< lzoxitrat — — ■ — Succínat + Glioxylat Glioxylat + Acetyl-CoA

malatsin taza— sm_t££a

> Malat + C o A

Chu trình glioxylat, thực ra là một chu trình TCA cải biến. Hai phản ứng loại carboxyl của chu trình TCA (bước Izoxitrat dehitrogenaz và ữ-ketoglutarat dehitrogenaz) được bỏ qua giúp cho việc chuyển hoá Acetyl-CoA để tạo thành Oxaloaxetat mà không để mất cacbon của Acetyl-CoA như C 02. Theo cách này, axetat và bất kỳ các phân từ nào được chuyển hoá thành axetat đều có thể đóng góp cacbon vào chu trình và giúp cho sinh trưởng của vi sinh vật. 18.7. TỐNG HỢP CÁC PURIN, PYRIMIDIN VÀ NƯCLEOTIT Sinh tổng hợp của purin và pyrimidin là sống còn cho mọi tế bào vì các phân từ này được dùng để tổng hợp ATP, một so cofactor, axit ribonucleic (ARN), axit deoxyribonucleic (ADN) và các thành phần quan trọng khác của tế bào, Hầu hết vi sinh vật có thể tổng hợp các Purin và pyrimiđin cho bản thân vỉ các chất này có vai trò quyết định đổi với chức năng của tế bào.

Glycine

Vy gj

Nhỏm format từ acid folic

Nittf amide của glutamine Hình 18.21: Sinh tổng hợp Purin.

Chú ỷ: Sự chỉ dẫn các nguồn N và c của bộ khung Puriti. (Theo: Prescott và cs, 2005).

Purin và pyrímiđin là các bazơ nitơ vòng chứa một số nối đôi và có các đặc tính tham rõ rệt. Purin gồm 2 vòng nối với nhau, còn pyrimidin chỉ có một vòng {hình ĩ 8.21 và ĩ 8.23). Trong vi sinh vật thường gặp các purin adenin và guanin và các pyrimidin uracyl, xitozin và thymine. Một bazơ purin hoặc pyrimidin nối với một đường pentoz (riboz hoặc deoxyriboz) là một nucleozit. Một nucleotit là một nucleozit nối với một hoặc trên một nhóm photphat liên kết với đường.

18.7.1. Sinh tổng hợp Purin Con đường sinh tổng hợp các purin là một thứ tự phức tạp gồm 11 bước trong đó 7 phân tử khác nhau góp phần vào bộ khung purin cuổi cùng (hình Ỉ8.2Ỉ). Vì con đường mở đầu với ribo-5-photphat và bộ khung purin được kiến trúc trên đường này nên sản phẩm purin đầu tiên của con đường là nucleotit axit inosinic chứ không phải là một bazơ purin tự do. Trong sinh tổng hợp của purin cofactor axit folic đóng vai trò rất quan trọng. Các dẫn xuất của axit folic đóng góp cacbon 2 vả 8 vào bộ khung purin. Trên thực tế, thuốc sulfonamit kìm hãm sinh trưởng của vi khuẩn là do ửc chế tổng hợp axit folic. Điều này sẽ ảnh hưởng đến sinh tổng hợp của purin vả các quá trình khác cần axit folic. Một khi axit inosinic đã được tạo thành, các con đường tương đối ngắn sẽ tổng hợp adenosine monophotphat và guanozin monophotphat (hình 18.22) và sản ra nucleozit diphotphat và triphotphat bàng cách chuyển photphat từ ATP. ADN chứa deoxyrìbonucleotit (riboz thiếu một nhỏm hydroxyl trên C2) thay cho ribonucleotit gặp trong ARN. Các deoxyribonucleotit xuất hiện từ sự khử của các nucleozit diphotphat hoặc nucleozit triphotphat qua hai con đường khác nhau. Một số vi sinh vật khử triphotphat nhờ hệ thống cần cofactor vitamin B 12. số khác, như E. coli, lại khử riboz trong nucleozit diphotphat. Cả hai hệ thống đều sử dụng một protein nhỏ chứa s gọi là thioredoxin làm tác íihân khử. Hỉnh ĩ 8.22. Sinh tổng hợp adenosine monophosoahíe và Guanozin Monophotphat. 228

18.7.2. Sinh tổng họp pyrimidin Sinh tổng hợp pyrimidin mở đầu với axit aspartic và cacbamoyl-photphat (một phân từ cao năng được tổng hợp từ C 0 2 và amoni) (hình 18.23). Aspatat e-cacbamoyltransferaz xúc tác việc ngưng tụ hai cơ chất này để tạo thành cacbamoyl-aspatat, sau đỏ chất này được chuyển thành sản phẩm pyrimiđìn đầu tiên đó là axit orotic. Sau khi bộ khung pyrimidin được tổng hợp, một nucleotit sẽ được tạo thành bằng cách thêm vào ribo-5-photphat nhở tác dụng của chất trung gian cao năng 5photphorusribosyl-l-pyrophotphat. Do đó việc kiến trúc vòng pyrimidin được hoàn thành trước khi riboz được thêm vào trái với việc tổng hợp vòng Purin bát đầu với ribo-5photphat. Việc loại carboxyl hoá của orotiđin monophotphat sản ra uridin monophotphat và cuối cùng uridin triphotphat và cytidin triphotphat.

Hình ỉ 8.23: Tổng hợppyrimìdin.

229

PRPP ỉà axit 5-photphorusriboz I- pyrophotphorusric, chẩt cung cắp chuôi ribo-5'photphat. Phần dẫn xuất từ cacbamoyỉphotphat được in đậm. (Theo: Prescott và cs, 2005). Pyrimiđin thứ ba phổ biến là thymine - một thành phần cùa ADN. Riboz trong các nucleotit pyrimidin bị khử theo cùng cách như trong các nucleotit purin. Sau đó deoxyuriđin monophotphat được metyl hoá với dẫn xuất của axit folic đế tạo thành deoxithymidin monophotphat {hình 18.24).

Hình 18.24: Tổng hợp deoxithymìdin monophotphat. Chú ý: deoxìthymidỉn khác với deoxyuridirt ở chỗ có thêm nhóm metyl (Theo: Prescott và cs, 2005). 18.8. TỎNG HỢP LIPIT Vi sinh vật chứa nhiều lipit đặc biệt là ở màng tế bào. Lipit thường chứa các axit béo hoặc dẫn xuất cùa axìt béo. Axit béo là các axỉt monocacbonxylic với các chuỗi alkyl dài thường có một số chẵn cacbon (chiều dài trung bỉnh là 18 cacbon). Một số có thể là chưa bão hoà nghĩa là có một hoặc ữên một nối đôi. Hầu hết axit béo của vi sinh vật là chuỗi thẳng nhưng có một số phân nhánh. Các vi khuẩn gram âm thường có các axit béo cyclopropan (tức là các axit béo chửa một hoặc trên một các vòng cyclopropan trong chuỗi). Việc tổng hợp các axit béo được xúc tác bởi phức hệ syntetaz axit béo với Acetyl' CoA và malonyl-CoA như cơ chất và NADPH như chất cho electron. Malonyỉ-CoA dẫn xuất từ sự carboxyl hoá của Acetyl-CoA với sự tiêu thụ ATP. Việc tổng hợp diễn ra ‘sau khi axetat và malonat đã được chuyển từ CoA đến nhỏm sulíĩhidril của protein mang acyl (ACP, acyl carrier) là một protein nhỏ mang chuỗi axit béo đang sinh trưởng trong tổng hợp. Ờ mỗi thời điêm syntetaz lại thêm 2 cacbon vào đầu carboxyl của chuỗi axit béo đang sinh trưởng ừong một quá ưình gồm hai chặng {hình ] 8.25). Trước hết, maìonyl-ACP phản ứng với acyl-ACP axit béo để sản ra C 0 2 và một acyl-ACP axit béo có 2 cacbon dài hom. Việc mất đi CƠ2 hướng cho phản ứng hoàn thành. Ở đây ATP được dùng để bổ sung CO2 vào Acetyl-CoA tạo thanh malonyl-CoA. Cũng CO2 như vậy mất đi khi malonyl-ACP chuyền các cacbon cho chuỗi. Do đó CO2 là cần thiết cho tổng hợp axit béo nhưng không

230

phải luôn luôn được cố định. Trên thực tể, một số vi sinh vật cẩn CO2 để sinh trưởng tốt nhưng chúng vẫn có thể sinh trường thuận lợi khi không có CO2 mà có mặt một axit béo như axit oleic (một axit béo 18 cacbon không bão hoà). Trong chặng thứ hai của tổng hợp nhóm a-keto xuất hiện từ phản ứng ngưng tụ ban đầu bị loại đi trong một quá trình ba bước bao gồm hai sự khử và một sự loại nước. Sau đó axií béo sẵn sàng cho việc bổ sung thêm 2 nguyên tử cacbon nữa.

Hình 18.25: Tổng hợp axit béo. Chu trình được lặp lại cho tới khi chiều dài chuỗi thực sự đã đạt đtrợc. ACP = acyl carrier protein (protein mang acyl). (Theo: Prescott và cs, 2005). Các axit béo không bão hoà được tổng hợp theo hai con đường. Các tế bào nhân thật và vi khuẩn hiếu khí như Bacillus megaterium sử dụng con đường hiếu khí với sự tham gia của cả NADPH và O 2: o

n II

R—(CfỈ2 ) 9 —ế —SCoA + NADPH + H+ 0 2— R - C H =CH-(CH2)7 - C — SCoA + NADPH+ + 2H20

Một nối đôi tạo thành giữa các cacbon 9 và 10 và 0 2 bị khử thành nước nhờ các electron do cả axit béo và NADPH cung cấp. Các vi khuẩn kỵ khí và một so vi khuẩn hiếu

231

khí tạo Fa các nối đôi trong quả trình tổng hợp axit béo bàng cách loại nước các axit béo hydroxy. Oxy không càn cho việc tổng hợp nối đôi theo cách này. Con đường kỵ khí hoạt động ở một số vi khuẩn gram âm quen thuộc (ví dụ: E. coỉi vả Salmonella typhimurium), vi khuẩn gram dương (ví dụ: Lactobacillus plantarum vả Clostridium pasteurianum) và vi khuẩn lam. c h 2o h

i=0 y-

Dihydroxyacetona phosphate '

C H ,0 ® MADH + hf

NAD‘ CH.OH

T

.

HO— CH

Glycwol 3-phosphate

9H.O® 0

jj

r

2 R— C - C o A 0

Í Ị H .- O - C - R ,

^ “ C - 0 -ỌH

1 CHtO ®

'X

7

Ỹ . lỉ —o —

c~ R 1

Rj — c — o - C H

t

0

Phosphatldic acid C TP

Q II

C H ,- 0 “ C - R , CH,

II ĩĩ R4—c —o —CH ỉ _ _ c Hj—0 —(g) (g)

COP-diaeyiglycerot

0 —cytiổinB

CH.OH

Sarina

R.COOH

Q II

CH, i

0

R — c ~ 0 ~ CH

q (I c R,

ỷ^CMP Phosphatidyl sarl riB

Ị - co,

Ọ

I

ìí

CH, — o — c — R,

THacylgỉycerol

o

ịỊ

CH,— 0 — C — R.

II I R, —c - 0 ~ CH I CH - 0 -

o II p — o - CH2— C H ,-

0

*

Phospíiaíldylâthanolamin# Hình 18.26: Tồng hợp trỉacylglyxerol và photpholipit. (Theo: Prescott và cs, 2005).

232

Các vi sinh vật nhân thật thường dự trữ cacbon và năng lượng ở dạng triacylglyxerol, glyxerol được este hoá vói 3 axit béo. Glyxerol xuất hiện từ sự khử dihydroxyaceton photphat (là chất trung gian của đường phân) thành glyxerol-3-photphat, sau đỏ glyxerol-3photphat được este hoá vói 2 axit béo để cho axit photphatidic {hình 18.26). Photphat bị thuỷ phân khỏi axit photphatidic tạo thành diacylglyxerol và axit béo thứ ba được gắn vào để sản ra một triacylglyxerol. Photpholipit là thành phần chủ yểu của màng tế bào nhân thật và hầu hết tế bào nhân nguyên thuỷ. Tổng hợp photpholipit cũng thường diễn ra theo con đường của axit photphatidic. Một chất mang đặc biệt-cytidin diphotphat (XDP)-đóng vai trò tương tự vai trò của các chất mang của uridin và adenosine diphotphat trong sinh tổng hợp hidrat cacbon. Chẳng hạn, vi khuẩn tổng họp photphatidintanolamin (một thành phần chù yếu của màng tể bào) qua việc tạo thành XDP - diacylglyxerol đầu tiên (hình 18.26). Sau đó dẫn xuất XDP này phản ứng với serin để tạo thành photpholipit photphatidilserin và qua việc loại carboxyl sẽ xuất hiện photphatidintanolamin. Theo cách này, một lipit màng, phức tạp được tạo nên từ các sản phẩm của đường phân, sình tổng hợp axit béo và sinh tổng hợp axit amin. 18.9. TỎNG HỢP PEPTIDOGLYCAN Hầu hết thành tế bào vi khuẩn chứa một phân tử lớn, phức tạp bao gồm các chuỗi polixaccarite đài tạo thành bởi các nhánh luân phiên axit N-Acetylmuramic (NAM) và NAcetylglucoz semin (NAG). Gắn vào các nhánh NAM là các chuỗi pentapeptit. Các chuỗi polixaccarite được liên kết với nhau bởi các pentapeptit hay bởi các cầu nối gian - peptit phức tạp cùa peptidoglycan, dĩ nhiên, càng đòi hỏi một quá trình sinh tổng hợp phức tạp, đặc biệt còn vì các phản ứng tổng hợp diễn ra ở cả bên trong và bên ngoài màng tế bào. Tổng hợp peptidoglycan là một quá ừình nhiều bước và đã được nghiên cứu chi tiết ờ vi khuẩn gram dương Staphylococcus aureus. Ở đây cỏ sự tham gia cùa hai chất mang là uridin điphotphat (UDP) và bactoprenoỉ (hình 18.27). Bactoprenol là một alcohol 55 cacbon gắn vào NAM bởi một nhóm pyrophotphat và vận chuyển các thành phần của peptidoglycan qua màng kỵ nước.

ò-

ò-

Hình 18.27: Bactoprenolpyrophotphat. Chú ý: Chẩt này được gắn vào NAM (Theo: Prescott và cs, 2005). 233

Tổng hợp peptidoglycan (hình 18.28 và 18.29) diễn ra qua 8 bước: 1. Các dẫn xuất UDP của axit N. Acetyỉmuramic và N-Acetylglucozsamin được tổng hợp trong tế bào chất. 2. Các axit amin lần lượt được thêm vào UDP-NAM tạo thành chuỗi pentapeptit (2 D-Alanin tận cùng được thêm vào ở dạng dipeptit). Năng lượng cùa ATP được dùng để sản ra các liên kết peptit nhưng không có sự tham gia của tARN và riboxom.

C ytoplasm

UDP -

NAM

j r L-Aìa

ầ r D'GIu

» ^

_

O-AI*

L-Lys [DAP)

ý * n -A is— B-Ai*

*

UDP —NAM —p s n ta p s p tid a

®

__-^CyclOMrln*

P srrta p ep tiđ t

\ €)

P ín ta p e p tid *

l o 0*1* (ỆKễ>-NAM-NAG • i 1! <3fectopren nl

l/Eftfbrarii

1 ®

fty jt idogíyca n ~ NAM— N A Ồ \

pBptíđoộtycsn

Periiafoptiif!

Vancijrnycm

Hình 18.28: Tổng hợp peptidogỉycan. Chú ỷ: pentapeplit chứa L-ỉyzin ởpeptidtìglycaiỉ cua s. aureus và axừ diaminopimeỉic (DAP) ờpeptidogỉycan cùa E. coli. Tác dụng làm hãm cùa baxitraxin, Xiclozrine và vancomixin đirợc chì rò. Các con số tương ứng với 6 trong 8 bước nói trong bài. Bước s được mô tả ở hình 18. 29. (Theo: Prescott và cs, 2005). 3. NAM - pentapeptit được chuyển từ ƯDP sang photphat của bactoprenol ở bề mặt của màng. 4. UDP - NAG bổ sung NAG vào NAM - pentapeptit tạo thành đom vị lặp lại của peptidoglycan. Nếu một cầu nổi pentaglycine là cần thiết các glycine sẽ được thêm vào băng cách sử đụng các phân tử glycyl-tARN đặc biệt nhưng không cần riboxom.

234

5. Sau khi đã hoàn thành đơn vị lặp lại của peptidoglycan NAM - NAG được chuyển qua màng đến bề mặt bên ngoài nhờ chất mang bactoprenol pyrophotphat. Đơn vị peptidoglycan được gắn vào đầu đang sinh trưởng của một chuỗi peptidoglycan kéo dài chuồi một đơn vị lặp lại. 6 . Chất mang bactoprenoỉ trở lại bên trong màng. Trong quá trình này một

photphat được tách ra để cho bactoprenol photphat giờ lại có thể nhận một NAM-pentapeptit khác. 1. Cuối cùng, các liên kết peptit chéo giữa các chuỗi peptidoglycan được tạo thành nhờ phản ứng chuyển peptit (hình 18.29). Ở E. coỉi nhóm amino tự do của axit diaminopimelic liên kết với D-Alanin gần tận cùng tách ra nhánh D-Alanin tận cùng. ATP được dùng để tạo thành liên kết peptit tận cùng bên trong màng. Khi sự chuyển peptit diễn ra bên ngoài năng lượng của ATP là không cần nữa. Quá trình như vậy cũng được thực hiện khi cỏ sự tham gia của một cầu nối; chỉ nhóm phản ứng với D-Alanin gần tận cùng là khác. £ C Q ii tra n sp sp tid a tio rt

•-NA.G - NAM •••

I

&VU* I

oA ta

O-Ala

T O-Glu I ĐẠP

I QẠP I D-Q5ư

D-AJa'

írAI*

•** NAG — NAM

b-AI*

i

L-Ala

I“

r

NAQ

NAG — NAM **•

D-Ala

1

- NAM

. Penicillins

/

s. aw#us ĩranspsptidatiorc "•NAG — NAM *** I

' , I

;

l*Ã tặ

■'

" D»ẠJ*

:

►Ala I [>Aía

***NAữ — NAM "• . Ị

:1

^

I ChGIuNH, 1 L*Ịy* T ^ bAla ^

- (Giy),

DhAla 1 D iẠls

I vty* EVGlílNH,

IrAIJt •**Wkd — NAM

Hỉnh 18.29: Chuyển peptit.

235

Các phản ímg chuyển peptit trong việc tạo thành peptidoglycan ở E. coỉi và s. aureus. (Theo: Prescott và cs, 2005). Tổng hợp peptidoglycan rất mẫn cảm với các tác nhân kháng khuẩn. Sự kìm hãm bất kỳ bước nào trong tổng họp đều làm cho thành tế bào bị yếu đi và có thể dẫn đến phá vỡ tế bào do thẩm thấu. Nhiều chất kháng sinh ảnh hưởng đến tổng hợp peptidoglycan. Chẳng hạn, penixilin kỉm hãm phản ứng chuyển peptit (hình ì 8.29) và bacitraxin ức chế việc loại photphat khỏi bactoprenol pyrophotphat. 18.10. CÁC KIẺU TỒNG HỢP THÀNH TÉ BÀO Để sinh trưởng và phân chia được thuận ỉợi tế bào vi khuẩn phải bồ sung peptiđoglycan mới vào thành tế bào của mình một cách chính xác và có điều hoà cẩn thận trong khi vẫn duy tri được hình dạng và tính nguyên vẹn của thành nếu phải tồn tại ở điều kiện áp suất thẩm thấu cao. Vì peptidogỉycan của thành là một mạng lưới khổng lồ duy nhất nên vi khuẩn đang sinh trưởng phải có khả năng phân giải lưới sao cho đủ để cung cấp các đầu nhận dùng lắp vào các đơn vị peptidoglycan mới. Sự phân giải peptidoglycan hạn chế này được xúc tác bởi enzym gọi là autolyzin, trong đó một sổ autolyzin tác dụng lên các chuỗi polixaccarite, số khác thuỷ phân các liên kết chéo peptit. Các chất kìm hãm autolyzin điều hoà chặt chẽ hoạt tính của các enzym này. Mặc dù vị trí và sự phân bố của hoạt tính tổng hợp thành tế bào thay đổi tuỳ theo ỉoài nhung có lẽ tồn tại hai kiểu phổ biến (hình ỉ 8.30) sau đây.

Vùng vách ngân

*

3

>

Hình 18.30: Các kiểu tồng hợp thành. Trong hình là các kiêu tông hợp thành tể bào ở các vi khuẩn đang sinh trường và phân chia (a) Các streptococci và một sô cocci khác gram dương, (b) Tổng hợp ở các vi khuân hình que ịE. coil, Salmonella, Bacillus). (Theo: Prescott V ớ cs. 2005).

236

Nhiều cầu khuẩn Gram đương (Enterococcus faecalis và Streptococcus) chi cỏ một tói một vài vùng sinh trưởng. Vùng sinh trưởng chính thường ở vị trí tạo thành vách ngang và các nửa tế bào mới được tổng hợp giáp lưng nhau. Kiểu tổng hợp thứ hai gặp ở các trực khuẩn E. coli, Salmonella và Bacillus. Tổng hợp peptidoglycan mạnh mẽ diễn ra ở vị trí tạo thành vách ngăn ngang như ừên nhưng các vị trí sinh trưởng cũng năm rải rác dọc theo phần hỉnh trụ của trực khuẩn. Do đó sinh trường được phân bố ở trực khuẩn ưàn lan hơn ờ cầu khuẩn. Việc tổng hợp phải kéo dài các tế bào hỉnh que cũng như phân cắt chúng. Có lẽ điều này giải thích cho những sự khác nhau trong kiểu sinh trưởng của thành.

237

Chương 19

MỐI QUAN HỆ GIỮA VIRUT VÀ TÉ BÀO

19.1. NHỮNG KHÁI NIỆM c ơ BẢN 19.1.1.MỔÍ quan hệ giữa vỉrut và tế bào Virut không có khả năng ưao đổi chất và trao đổi năng lượng nên chúng phụ thuộc hoàn toàn vào bộ máy tổng hợp của tế bào. Vì vậy ở virut người ta dùng thuật ngữ nhân lên thay cho sinh sản. 1.

Tê bào cho phẻp

Muốn nhân lên virut phải xâm nhập được vào tể bào cho phép (permissive cells), đó là các tế bào có đủ điều kiện cho virut nhân lên, bao gồm: - Có thụ thể phù hợp với protein bề mặt virut. - Có các yếu tổ cần thiết như yếu tổ phiên mã, enzym của tế bào. - Một số virut có phạm vi tế bào cho phép hẹp, ví dụ HBV chỉ có thể nhân lẽn trong tế bào gan. - Một số vinit cỏ phạm vi tế bào cho phép rộng, có thể nhân lên cả ở ĐVCXS, ĐVKXS và ở cả thực vật.

238

Một số chỉ nhân lên khi tế bào đang ờ pha nhất định của chu kỳ phân chia tế bào. Ví dụ virut retro cần tế bào ờ pha M (mitosis), khi đó màng nhân bị vỡ, genome virut mới vào được trong nhân để cài xen vào nhiễm sắc thể của tế bào. Virut parvo sử dụng enzym ADN polymeaz của tế bào chủ nên khi nhân lên chúng cần tế bào ở pha s, là lúc có mặt enzym này. 2. Chu trình tan {lytic cycle): Chu trình nhân lên, kết thúc bằng sự làm tan và giết chểt tế bào gọi là chu trình tan. Virut chỉ nhân lên theo chu trình tan gọi là virut độc. 3. Chu trình tiềm tan (ỉysogenic cycle): Chu trinh lây nhiễm không tạo ra virut mới hay không giết chết tế bào, mà gắn xen genome của mình vào nhiễm sắc thể của tế bào, được gọi là chu trình tiềm tan. ADN cùa virut ờ trạng thái tiềm tan gọi là provirut (nếu ở phage thì gọi là prophage), còn bản thân virut có khả năng tiến hành cả 2 quá trình tan và tiềm tan được gọi là virut ôn hoà (ví dụ phage X). Dưới tác động của yếu tố ngoại cảnh (bức xạ, hoá chất) genome virut thoát khỏi nhiễm sắc thể để tiển hành chu trình tan. 19.Ỉ.2. Tác động của virut lên tế bào Virut có thể tác động lên tể bào theo 4 cách: (ỉ) Gây chết tế bào. Virut nhân lên gây huỷ hoại tế bào, gọi là hiệu ứng gây huỷ hoại tế bào CPE (cytopathic effect) dẫn đến làm tan tế bào. (2) Chuyển dạng (transformation). Virut gây nhiễm nhưng không gây chết tế bào mà chuyển dạng tế nào từ trạng thái bình thường sang trạng thái biến đổi mang đặc điểm cùa tế bào u ác tính. (3) Nhiễm tiềm ẩn ậatent infection). Virut xâm nhập và tồn tại trong tế bào ở dạng tiềm ẩn, không có tác động rõ rệt nào đến chức năng của tế bào. Những người nhiễm virut tiềm ẩn không biểu hiện ưiệu chứng. (4) Hấp phụ hồng cầu (haemadsorption). Một số virut có protein trên bể mặt (haemagglutinin) cỏ khả năng kết dính hồng cầu để gây ngưng kết. Trong tế bào nuôi cấy mô, các virut này tạo ra chất ngưng kết (haemagglutinin) trên bề mặt tế bào nhiễm, nên cho hồng cầu vào chúng sẽ bị kết dính.

19.1.3. Tổng quan về quá trình nhân lên của virut Quá trình nhân lên của virut trong tế bảo bao gồm 7 bước: 1. Hấp phụ (adsorption). 2. Xâm nhập và cởi vỏ (penetration và uncoating). 3. Phiên mã (transcription) tạo mARN của virut. 4. Dịch mã (translation) mARN để tạo protein virut.

239

5. Sao chép (replication) genome. 6. Tự lắp ráp (maturation) protein với genome để tạo virion. 7. Giải phóng (releaz) ra khỏi tế bào. Nếu các bước 3, 4, 5 nhập vào một bước gọi là bước tổng hợp các thành phần (biosynthesis) thì quá trình nhân lên còn 5 bước, Ở một số virut, quá trình nhân lên không treo binh tự như ừên mà xảy ra đồng thời. Ví dụ cùng lúc đều tiến hành phiên mã, dịch mã, sao chép, lắp ráp và chui ra khỏi tế bào. 19.1.3.1. Virut động vật ỉ 9.1.3.Ỉ.L Sự hấp phụ Virut gắn vào thụ thể (receptor) đặc hiệu nằm ừên màng sinh chất của tế bào chủ, theo nguyên tắc khoá - chia. Một sổ virut còn gắn thêm vào các đồng thụ thể (co-receptor). Sự hấp phụ xảy ra tốt nhất ở 37°c. Virut gắn được vào các thụ thể lả nhờ các liên kết hoá học như liên kết hydro, ion, Vander Waals, nhưng không cỏ liên kết đồng hoá trị. Vị tri gẳn: Virut có các vị trí khác nhau chứa protein gắn vào thụ thể cùa tế bào. Virut trần có vị trí gắn nằm trên bề mặt capsid, đôi khi nằm sau bên trong (ví dụ virut polio) hoặc đôi khi là đỉnh của khôi đa diện (virut lờ mồm long móng). Ở virut adeno, vị trí gắn là đầu mút của các sợi mọc ra từ đỉnh capsiđ khối đa diện. Đối với virut có vỏ ngoài, vị trí gắn là các gai glycoprotein bề mặt. 19.1.3.1.2.

Xâm nhập và cởi vỏ

Sau khi gắn vào thụ thể, vỉrut phải vượt qua màng sinh chất để xâm nhập vào tế bào theo một trong 2 cơ chế nhập bào hoặc dung hợp. ỉ. Nhập bào: Cả virut trần và virut có vỏ ngoài đều có thể xâm nhập theo lối nhập bào. Cơ chế chung bao gồm việc virion gắn vào màng sinh chất nơi mặt ừong được bao phủ bởi lớp clathrin (protein dạng sợi tạo thành mạng lưới với các mắt hình đa giác). Virion ấn sâu vào màng tạo hốc rồi khép lại tạo thành túi nội bào hay enđoxom được lớp clathrin bao phía ngoài. Kênh proton của màng endoxom vận chuyển H+ vào trong làm cho pH trong endoxom giảm xuống ( pH 4.5 - 5). Endoxom sẽ dung hợp với lyzoxom. Trước khi dung hợp, lớp clathrin bị loại bỏ. pH thấp hoạt hoá enzym phân giải capsid. Cũng như màng endoxom ờ một số virut, pH thấp ừong endoxom dẫn đến việc dung hợp vỏ capsid với màng endoxom, làm võ vỏ capsiđ và giải phóng genome.

240

2. Dung hợp: Khác vói virut trần, chỉ có xâm nhập vào tế bào theo lối nhập bào, các virut cỏ vỏ ngoài có thể vào tế bào theo cả 2 cách. Virut có vỏ ngoài có thể vào tế bào theo cách dung hợp vỏ ngoài virut với màng sinh chẩt vì chúng có cùng bàn chất. Khi 2 màng hoà nhập sẽ đứt ra, nucleocapsid sẽ được chuyển vào tế bào chất. Sự dung hợp này xảy ra với sự tham gia của protein dung hợp (protein F). Như trên đã nói, virut cỏ vỏ ngoài cũng có thể xâm nhập vào tế bảo theo lối nhập bào. Vỏ ngoài virut bám vảo thụ thể sau đó ấn lõm tạo enđoxom. Khi pH trong endoxom giảm gai protein F sẽ chồi lên cắm vào màng endoxom như chiếc neo, kéo vỏ ngoài virut sát với màng endoxom và tiến hành dung hợp.

Hình 19.1: Sự nhập bào theo kiểu thực bào, tạo endoxom. Bơm proton làm giảm pH ừong endoxom , hoạt hoá sự đung hợp giữa vỏ ngoài virut với màng endoxom (lb), hoặc hoạt hoá enzym làm tan màng endoxom (2). Dung hợp xảy ra ừên bề mặt tế bào giữa vỏ ngoài virut với màng sinh chất ì 9.1.3. ỉ .3. Sự vận chuyển genome virut vào nhân Hầu hết virut ARN ờ Eukaryota tiến hành sao chép ưong tế bào chất, vì chúng có thể mã hoá cho tất cả các enzym cần cho sao chép genome mà không cần đến các enzym của tế bào nằm ưong nhân. Virut cúm A là ngoại lệ, chúng cần bộ máy cắt nối của tế bào nên genome của chúng phải được đưa vào nhân. Virut reừo cũng là virut ARN, nhưng tiến hành sao chép trong nhân. Thoạt đầu chúng nhờ enzym phiên mã ngược tổng hợp ADN trên khuôn ARN trong tế bào chất, sau đó nằm đợi cho đến khi tể bào bắt đầu phân chia (giai đoạn M), màng nhân tạm thời bị võ,

241

ADN cùng với protein liên kết lúc đó mới vào được trong nhân. Do đó virut này chì nhân lên được ở giai đoạn tế bào đang phân chia. Hầu hết virut ADN tiến hành sao chép trong nhân, ngoại trừ virut pox và irido có thể sao chép trong tế bào chất. Đối với virut sao chép trong nhân, protein cấu trúc của chúng có trình tự bám được vào vi ổng (microtubule). Vỉ ống là các ổng rỗng, đường kính 25 nm, là thành phần của bộ khung tế bào, có chức năng nâng đỡ và neo giữ nhiều thành phần của tế bào và được ví như đường ray để vận chuyển vật chất hoặc bào quan tới một vị trí nhất định trong tế bào. Một đầu vi ống được ký hiệu là (+) và một đầu ký hiệu là (-). Đầu (+) nằm gần màng sinh chất, còn đầu (-) nằm gần nhân. Một protein gọi là proetin vận chuyển (motor protein) tự nó di chuyển và chờ các chẩt cũng như bào quan dọc theo vi ống từ vùng ngoại vi của tế bào tới vùng gần nhân. Các virut herpes, adeno, parvo, reứo sừ dụng hệ thống này để chở nucleocapsid vào sát màng nhân. Màng nhân được cấu tạo từ 2 lớp lipit kép, ờ đó có lỗ nhân. Hầu hết nucleocapsid có kích thước quá lớn để có thể lọt qua lỗ nhân. Các phân tử muốn qua lỗ phải tạo phức với các protein chuyên biệt cùa tế bào có chức năng mang gọi là importin để mang vào hoặc exportin để mang ra khỏi nhân. Kênh có thể mở để cho phép các hạt có kích thước đến 25 nm thậm chí ỉớn hơn đi qua, ví dụ virut nhỏ như parvo, nhưng vớì virut lớn hơn thì phải cời vỏ ờ lỗ nhân. 19. ỉ .3. ỉ . 4. Cởi vỏ cho genome Cởi toàn bộ hoặc một phần vỏ để giải phóng genome ra khỏi vỏ capsỉd. Tuỳ loại virut mả quá trình có thể diễn ra tại các vị thí khác nhau: •

Trên bề mặt tế bào, capsid rỗng nằm lại bên ngoài tế bào.

•

Cời vỏ bên trong tể bào chất.

•

Cởi vỏ tại lỗ nhân.

•

Cởi vỏ bên ừong nhân.

Cần nhớ rằng virut xâm nhập thành công vào tế bào không có nghĩa là chúng ỉuôn luôn nhân lên được. Tế bào cũng có cơ chể bảo vệ chống lại virut, ví đụ enzym từ lyzoxom cỏ thể làm bất hoạt virut trưởc và sau cời vỏ; interferon cảm ứng tạo protein dộc ức chế sự nhân lên của vimt. Một số virut nhiễm ỏ dạng tiềm ẩn, chúng không nhân lên, nhưng genome vẫn còn nguyên vẹn và vẫn có tiềm năng nhân lên. 19.1.3. ỉ. 5. Tổng hợp các thành phần Sau khi xâm nhận vào tế bào, pha đầu tiên của chu trinh nhân lên gọi là pha ẩn. Ở giai đoạn này không phát hiện được bất kỳ virut nào. Đây là đặc điểm chỉ thấy cỏ ở virut. Sự biêu hiện của genome được bắt đầu rất sớm, ngay sau khi vìrut xâm nhập vào tế bào. Có 4 quá trình xảy ra trước khi hạt virut đuợc lắp ráp:

242

1.

Phiên mã tạo mARN.

2.

Dịch mã sớm tạo protein phi cấu trúc - đó là các enzym dùng cho sao chép.

3.

Sao chép tạo genome.

4.

Dịch mã muộn tạo protein cấu trúc để cấu tạocapsỉd và vỏ ngoài.

(1) -Phiên mã tạo mARN a- Phiên mã genome viruí Thông thường phiên mã là quá trình truyền thông tin đi truyền từ ADN sang ARN nhờ enzym ARN polymeaz (chính xác hơn là ARN polymeaz phụ thuộc ADN), tuỵ nhiên genome của virut có thể là ARN, cho nên ờ virut phiên mã đơn giàn chỉ là quá trình truyền thông tin di truyền từ genome sang mARN. Có 3 loại ARN polymeaz: ARN polymeaz I phiên mã rARN, ARN polymeaz II phiên mã các gen mã hoá protein và ARN polymeaz III phiên mã rARN 5S, tARN và các ARN nhò bé khác. Dựa vào quá trinh phiên mã, tạo ra mARN mà David Baltimore đã phân loại tất cả virut thành 7 nhỏm như đã nêu ở phần phân loại: (1) Virut ADN kép, (2) virut ADN đơn (+/-), (3) virut ARN kép, (4) Virut ARN (+), (5) virut ARN (-), (6) virut ARN phiên mã ngược và (7) virut ADN phiên mã ngược. Axit nucleic sợi đơn (ẠDN hoặc ARN) có trình tự nucleotit giống với trình tụ nucleotit của mARN quy ước là sợi (+), ngược lại có trình tự tương bù với mARN đuợc quy ước là sợi (-). Nhóm L Virut ADN kép hàu hết tiến hành phiên mã trong nhân, sử dụng ARN polymeaz phụ thuộc ADN (tức là ARN polymeaz II) của tế bào. Đổi với virut ADN kép thì không phân biệt sợi (+) và sợi (-) mà gọi là sợi trái (L) và sợi phải (R), bởi vì genome cùa hầu hết các virut này có khung đọc mở (ORF) theo cả 2 hướng. Một số virut ADN phiên mã trong tế bào chất (ví dụ virut pox), sử dụng ARN polymeaz phụ thuộc ADN do virut mã hoả. Nhỏm II Virut ADN đom (+) hoặc (-), tất cả đều phiên mã trong nhân và sử dụng ARN polymeaz II của tế bào. Cả virut ADN (+) và ADN (-) khi phiên mã tạo mARN đều phải qua giai đoạn trung gian ADN kép, dạng sao chép, viết tắt là RF (replicative form). Nhóm III Virut ARN kép, tất cả đều phiên mã trong tế bào chất, sử đụng enzym ARN polymeaz phụ thuộc ARN do virut mã hoá để tạo mARN. Nhóm ỊV. Virut ARN (+) cỏ chức năng của mARN trước khi phiên mã phải dịch mẫ để tạo ARN polymea2 phụ thuộc ARN của riêng mình sau đó mới phiên mã tạo mARN. Nhỏm V. Virut ARN (-) không phân đoạn phiên mã trong tế bào chất, sử dụng ARN

polymeaz phụ thuộc ARN do chúng mang theo. Virut ARN (-) phân đoạn (ví dụ virut cúm)

243

tuy phiên mã trong nhân nhưng chúng sử dụng ARN polymeaz thụ thuộc ARN mang theo, vì tế bào không có enzym này. Nhóm Vỉ. Virut retro phiên mã ngược, gồm 2 giai đoạn: Lúc đầu phiên mã genome ARN (+) thành cADN (-) tiến hành trong tế bào chất nhờ enzym phiên mã ngược của virut, sau đó ADN vào nhân tích hợp với nhiễm sắc thể của tế bào và tiến hành phiên mã tạo mARN nhờ enzym ARN polymeaz phụ thuộc ADN của tế bào. Nhóm VII. Virut ADN kép phiên mấ ngược, ví dụ HBV, tiến hành phiên mã Ưong nhân dùng enzym ARN polymeaz phụ thuộc ADN của tế bào để tạo ARN (+) tiền genome, sau đó ra khỏi nhân, dùng enzym phiên mã ngược của vỉrut để phiên mã ARN tiền genome thành ADN (-) rồi sau đó tạo genome ADN kép. Tất cả các virut cỏ genome AKN đều phiên mã trong tế bào chất trừ virut cúm. Tất cả các virut có genome ARN (-) đều phải mang theo ARN polymeaz phụ thuộc ARN để phiên mã. b- Cải biên lý thuyết trung tâm Năm 1958 Fracis Crick đưa ra lý thuyết Trung tâm (Central Dogma), theo đó dòng thông tin di truyền luôn đi từ ADN —►mARN —►Protein.

Những kiến thức về virat đã đưa đến sự cải biến lý thuyết trung tâm. Nhiều virut có genome ARN được sao thành ARN và một sổ có genome ARN được phiên mã ngược thành ADN.

c- Promoter và enhancer Trong promoter của nhiêu tê bào Eukaryota và virut có trình tự chung (consensus) sau: TATAA/TAA/TA/G. Không phải promoter nào cũng có trình tự giống hệt nhau mà cỏ thể sai lệch, nên gọi là trình tự chung. Trình tự TATAA còn gọi là hộp TATA hay hộp

244

Pridnow nằm ở phía trước điểm khởi đầu phiên mã, khoảng 25-30bp. Hộp TATA chịu trách nhiệm cho phép ARN polymeaz gắn vào vùng khởi động phiên mã. Ví dụ: Hộp TATA có trong promotor duy nhất của HIV-1, nhưng trong số 4 promoter của HBV thì chỉ có 1 promoter chứa hộp này. Enhancer (đoạn tăng cường) cỏ trình tự bám vào yếu tố phiên mã. Sự tương tác này làm tăng tốc độ phiên mã bởi ARN polymeaz II.

Hĩnh 19.2: Phiên mã từADNkép cùa Eukaryota. d- Yếu tổ phiên mã Yêu tổ phiên mã là các protein gẳn đặc hiệu vào promoter và enhancer để kiểm soát sự biểu hiện gen. Một số virut tạo ra yếu tố phiên mã của riêng mình, ví dụ VP/6 của virut herpes simplex, nó là một thành phần của virion và protein Tax cùa virut HTLV (virut gây ung thư tá bào T ở người) được tạo ra trong tể bào nhiễm. Một số yếu tố phiên mã của tế bào cũng tham gia hoạt hoá hoặc kiềm chế sự phiên mã của các gen virut. Các yếu tố phiên mã đặc hiệu mô (tissue - specific transcription

245

factors) cần cho một số virut mang tính đặc hiệu mô nghiêm ngặt, nghĩa là chúng chi nhân lên trong một số mô nhất định. Một số yểu tố phiên mã của tế bào có tên là yếu tố phiên mã chung (genral transcription factor) tham gia vào sự kiểm soát biểu hiện gen của nhiều loại tế bào và virut. Ví dụ yếu tố phiên mã TFIID bám vào hộp TATA (hình 19.3).

Hĩnh 19.3: Sự bám cùa các yểu tẻ phiên mã và ARNpoỉ II vào hộp TA TA. TFIID là một phức hợp gồm 13 polypeptit, một ừong số đó là protein bám hộp TATA. Sau khi TFIID bám vào hộp TATA là đến lượt các yếu tố phiên mã chung khác (TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFÌI, TFIIH) và ARN pol II bám vào. Trong số các yểu tố phiên mã của tể bào bảm vào enhancer, có: - API và AP2 (activator protein 1 và 2) là các protein hoạt hoá. - SP1 (stimulator protein) là protein kích thích. - NF-kB (nuclear factor kB) là yếu tố nhân kB. Hầu hết các yếu tổ phiên mã này tham gia vào quá trình phiên mã của HIV- 1. Cũng như hoạt hoá sự biểu hiện gen, các yểu tổ phiên mã cũng tham gia vào sự kiềm chế biểu hiện gen.

246

Mọi cơ thể đều có khả năng tự điều hoà các gen của mình. Ví dụ côn trùng có các gen khác nhau và sự biểu hiện các gen này tuỳ thuộc việc chúng đang ở giai đoạn nào: ấu trùng, sâu non, sâu trưởng thành hay bướm. Ở virut cùng vậy, chúng có các gen khác nhau, biểu hiện ở các thời điểm khác nhau. Gen sớm mã hoá cho các protein sớm, đó là các protein không cấu trúc, thường là các enzym và gen muộn mã hoả cho các protein muộn, đó là các protein cấu trúc, tham gia vào tạo capsid hoặc vỏ ngoài. e- Gắn mũ vào ARN Ngay sau khi tổng hợp ARN và trong lúc quá trình phiên mã còn đang tiếp tục thì hầu hết các bản phiên mã (ARN) đã được gắn mù ở đầu 5 \ Mũ là guanosin ưiphotphat nổi với một nucleotit ả đầu 5’ nhờ liên kết 5’-5’, thay vì liên kết 5’-3’ như bình thường. Hầu hết mARN ở tế bào Eukaryota và ờ virut đều có mũ ở đầu 5’. Mẫ có chức năng: •

Giúp mARN vận chuyển từ nhân ra tế bào chất.

•

Bảo vệ mARN khòi sự thuỷ phân của enzym exonucleaz.

•

Cần cho khởi đầu cho dịch mã.

Enzym thực hiện gắn mũ của tế bào là guanylyl transferaz (thêm guauosin 5’ừiphotphat) và metyl ữansferaz (thêm nhóm metyl). Các enzym này nằm trong nhân, nên hầu hểt các virut phiên mã trong nhân đều sử dụng. Tuy nhiên các virut phiên mã trong tể bào chất sẽ mã hoá cho enzym gắn mũ và enzym metyl hoá của riêng mình. Virut có genome ARN (-) phân đoạn (cúm A) cần có một cơ chế riêng để đoạt lấy mũ từ mARN của tế bào. Phức hợp protein của vìrut giúp ARN polymeaz của nó gắn vào đầu 5’ của mARN đã gắn mũ của tế bào, sau đó nhờ hoạt tính endonucleaz của phức hợp sẽ cắt một đoạn khoảng 10-20 nucleotit (chứa cả mũ) ra khỏi đầu 5’ của mARN. Đoạn này sẽ được dùng làm mồi để khởi đầu phiên mã cho virut Không phải tẩt cả mARN virut đều có gắn mũ, mARN của virut picoARN (bại liệt) không cỏ mũ. Đây là virut phiên mã trong tế bảo chất, nên không phải vận chuyển ra khỏi nhân. Chúng có thể tiến hành dịch mã theo cơ chế không phụ thuộc mũ, mà nhờ đoạn IRES. f- Gắn đuôi poỉy (Ả) Các bản phiên mã đầu tiên của Eukaryota và virut được ngắn thêm một loạt gốc adenosin ở đầu 3’ để tạo đuôi poly (A). Sự polyadenin hoá ở đầu 3’ làm tăng tính bền của mARN tránh sự phân giải của exonucleaz và có vai trò nhất định trong khởi đầu dịch mã. Tuy nhiên mARN của một số virut không gắn đuôi (ví dụ virut reo) nên chức năng kể trên sỗ được thực hiện theo cách khác. 247

Trước vị trí gắn đuôi có một đoạn tín hiệu gấn đuôi dài 20-3 Obp. Đoạn này ở SV40 là AATAAA, ờ HBV là TATAAA (giống như hộp TATA). Khi phiên mã ARN polymeaz tiếp tục chạy đọc khuôn, vượt qua tín hiệu gắn đuôi và vị trí gắn đuôi. Sợi ARN mới tổng hợp được cắt tại vị trí gắn đuôi và các gốc adenosin được lần lượt thêm vào nhờ phức hợp protein, trong đó có enzym gắn đuôi (poly (A) -polymeaz). g- Cắt nối Một số bản phiên mã có chức năng của mARN nhưng hầu hết còn cần phải chế biến, cắt bò intron để tạo mARN. Hơn nữa từ mARN, bằng phương thức cắt nối (ghép đoạn này với đoạn kia), có thể tạo ra nhiều loại mARN khác nhau. Ví dụ bằng phương pháp cất nối, HIV-1 có thể tạo ra 30 loại mARN khác nhau. (2) -Dịch mã Tham gia vào địch mã gồm mARN, tARN, axit amin và riboxom. Quá trình gồm 3 giai đoạn: Khởi đầu, kéo đài và kết thúc. Ở Eukaryota, mARN lả đơn gen (monocistron) có nghĩa là chi có một khung đọc, mã hoá cho 1 protein, còn ở Prokaryota, mARN thường là đa gen (polycistron) có nhiều khung đọc và mã hoá cho nhiều protein. Có các vùng không mã hoá, còn gọi là vùng không địch mã, nằm ở phía đầu 5’ (5’ƯTR) và đầu 3’ (3’-UTR). Một khung đọc lớn có thể mã hoá cho một polyprotein lớn sau đó được enzym phân cắt thành các protein nhỏ với chức năng khác nhau.

Hình 19.4: Dịch mã từ mARN-monocistron. Một khung đọc mở bát đầu từ cođon khởi đầu AUG ở đầu 5’ của mARN và kết thúc tại codon kết thúc (ƯGA, UAA, UAG). Dịch mã theo hướng 5’ 3’. Đầu N của protein được tổng hợp trước.

248

a- Khởi đầu dịch mã Như đã nói trên, hầu hết mARN của Eukaryota và virut được gắn mũ và đuôi. Các cấu trúc này có vai trò quan trọng trong dịch mã. - Mũ là nơi bám của các yếu tố khởi đầu dịch mã, eIF (e = Eukaryota), tARN gắn với axit amin (Met-tARNjMet) và tiểu phần riboxom 40S (hỉnh 19.5) - Một protein gọi là protein bám poly (A) bám vào đuôi poỉy (A). Các protein bám vào đầu sợi ARN có khả năng tương tác và người ta cho rằng sự tương tác này làm cho mARN truyền tin đẫn đến sự kích thích dịch mã. Các mARN không có mũ hoặc đuôi có thể truyền tin theo cách khác. Tiểu phàn riboxom 40S di chuyển dọc theo ARN theo hướng 5’ ------►3’ và quét cho đến khi gặp codon khởi đầu AUG ở đầu 5’. Tuy nhiên, một số virut có cođon khởi đầu khác. Ví dụ virut Sendai dùng codon khởi đầu là ACG cho một số gen.

Hình 19.5: K hởi đầu dịch m ã trên m A R N cổ gắn mũ.

249

a - Các yếu tổ khởi đầu eỉF, tiểu phần riboxom 40S và tARN-metionin bám vào đầu 5' cùa

mẢRN, b - Phức hợp quét từ đầu 5 ’ theo hướng 3 ’ cùa mARN, c - khi tới codon khởi đầu A UG sẽ

được anticodon UAC trên tARN nhận diện, tiếu phần 60S bám vào và các yếu tố eIF sẽ rời ra. Một số mARN không có mũ thỉ sự dịch mã xảy ra theo cơ chế khác. Các eIF thay vì gắn vào mữ, chủng gắn vào vị trí IRES (inteARNl riboxom entry site) gọi là bến đỗ riboxom, đó là đoạn mARN có cấu trúc bậc 2 ở mức độ cao nằm trước khung đọc, cũng là vị trí gắn cùa tiểu đơn vị riboxom 40S. Đoạn IRES có ở một số virut ARN, như virut viêm gan c , picoARN, đồng thời cũng thấy có ở mARN của tế bào vả mARN của một số virut khác (ví dụ virut herpes simplex, Sarcoma Rous).

Hình ỉ 9.6: Khởi đầu dịch mã trên mARNkhông gắn mu. Tiểu phần roboxom 40S, các eIF bám vào vị trí IRES (bến đỗ riboxom) nằm phía trước khung đọc. b- Dịch mã từ mARNhaỉ khung đọc Hầu hết mARN của tế bào và của nhiều virut chi có 1 khung đọc mở (ORF), nhưng một sổ mARN của virut có 2 hoặc nhiều khung đọc, ừong số các mARN bicistron hoặc polycistron này có một sổ có chức năng là monocistron, nhưng một số mARN cố cấu trúc là bicistron thì cũng có chức năng là bicistron. Sự khác nhau về tỷ lệ dịch mã của hai khung đọc quy định cơ chế biểu hiện 2 gen ở mức độ khác nhau. Ở nhiều mARN bicistron có khung đọc chồng lớp. Ở trường hợp khác, khung đọc này nằm gọn trong khung đọc kia. Một cơ chế dùng để đọc khung thứ 2 gồm sự quét bỏ sót (leaky): Tiểu đơn vị riboxom 40S có thể quét bò qua codỡn khởi đầu của khung đọc thứ nhẩt và bắt đầu dịch mã tại điêm khởi đầu cùa khung đọc thứ 2. Các khung đọc cho hai protein là khác nhau nên hai protein do chúng mâ hoá là khác nhau.

250

(b)

o, 1

Rotavirus NSP5 ạndNSPỗ a ’ ' * 1t *’»» .5 -

■ próteirii- Ý ■ -» °> yfrroteln 1•

(«)

Ặ f c wĩ p - —

Mg:

•

*>'. - ' . J.4 *w/vi r l/.\ - I TJ.■. H’ ■

A

' .x*■’■ ■f"/'~Si-.- ■'>■

■

Í/ỉn/í /9.7: Sự dịch mã của mARN bìcistrort. a - Riboxom có thể dịch mã tại điềm khời đầu cùa ORF-J hoặc có thề quét qua codon khởi đầu của ORF-2, b - Hai codon khởi đầu là của 2 khung đọc khác nhau và protein được tổng hợp ỉà khác nhav.c - Khung đọc 2 được dịch mã ỉà nhở sự dịch khung riboxom, tạo ra một dạng kéo dài của protein 1. Một cơ chế khác để đọc khung đọc thứ hai của mARN là sự dịch khung (frameshifting) của riboxom: Riboxom nhảy sang khung đọc khác nằm trước điểm kết thúc của khung đọc thứ 1. Do đó nó không bị codon kết thúc của khung đọc thứ nhất nhận ra, mà tiếp tục chạy dọc mARN để đọc khung đọc thứ nhất kéo dài (hình 19.7c). Sự dịch khung xày ra khi riboxom di chuyển dọc theo ARN bắt gặp tín hiệu dịch khung (1 trình tự chuyên biệt) có cấu trúc bậc 2, và thường là một pseuđoknot (nút già). c-Cảì biển trong và sau dịch mã Trong hoặc sau quá trình dịch mã, protein có thể phải qua một hoặc nhiều lần cải biến, bao gồm glycosyl hoá, acyl hoá hoặc photphoryl hoá.

*Gỉycosyỉhoá Glycosyl hoá là sự gắn thêm nhóm oligoxaccarit vào chuỗi polypeptit. Khi một oligoxaccarit được gắn vào nhóm -OH của serin hoặc treonin thì gọi là O-glycosyl hoá,

251

còn nếu gắn vào nhóm -NH2 của asparagin thì gọi là N-glycosyl hoá. Protein được tổng hợp ừong mạng lưới nội chất hạt, nơi bắt đầu N-glycosyl hoá, sau đó chúng được chuyển tới bộ máy Golgi, nơi hoàn thiện N-glycosuyl hoá nhờ enzym a-mannosidaz I và II, và galactosyl transferaz. O-glycosyl hoá được thực hiện trong bộ máy Golgi. Có những virut chỉ cần một loại glycosyl hoá, ví dụ HIV-1 tiến hành N-gỉycosyl hoá gpl20 nhưng cũng có những virut càn cà 2 loại N- và O-glycosyl hoá, ví dụ gC và gD của herpes simplex. Các glycoprotein này được gắn vào vị ừí chuyên biệt trên màng sinh chất của tế bào và sẽ là các gai bề mặt sau này của vỏ ngoài. Virut rota không có vỏ ngoài nhưng cũng có glycoprotein. Protein bề mặt VP7 là glycoprotein. Một số glycoprotein của virut là protein không cấu trúc, ví dụ protein NSP4 của virut rota.

* Acylhoả Acyl hoá là sự gắn thêm nhóm acyl (R-CO-) vào phân tử protein. Nhóm acyl thường đuợc gắn là myristyl, trong đó R là CH3-(CH2)i2- nhóm myristyl đưực gắn vào glycin tại đầu N của protein. Hầu như virut không cỏ enzym N-myristyl transferaz để gán nhóm myristyl, chúng phải sử đụng của tế bào. Protein myristyl hoá gắn vào màng sinh chất, ví dụ protein Gag của hầu hết virut reíro. Nêu không được myristyl hoá thỉ chúng không gắn được vào màng sinh chất và sự lẳp ráp virut sẽ không xảy ra. * Photphoryl hoá Photphoryl hoá là sự chuyển nhóm photphat từ một nucleotit, thường là ATP, cho oxy ở nhóm -OH của serin, ứeonin hoặc tyrosin. Sự chuyển nhóm photphat nhờ enzym kinaz của tể bào hoặc của virut. Sự photphoryl hoá cỏ thể làm thay đổi cấu hình, hoạt tính, Vị trí và độ bền của protein. Nhiều quá trình của virut đòi hỏi protein phải được photphoryl hoá. c- Sự vận chuyển các phân tử trong tể bào Eukaryota Các phan tử của virut được vận chuyển tới các vị trí nhất định ừong tế bào. Genome của virut được đưa vào nhân nhờ trượt theo vi ổng và qua lỗ nhân, mARN virut được vận chuyển từ nhân ra tế bào chất và các protein virut sau khi được tổng hợp có thể được vận chuyển vào các vị trí khác nhau, kể cả vào nhân (các virut lắp ráp trong nhân). Nhiều protein có một trinh tự axit amin giống như mã số vùng của bưu điện, nó quy định đi em đên của protein. Protein đến gắn vào màng có một trình tự tín hiệu —đó là dãy các goc axit amin kỵ nước. Sự tổng hợp protein bắt đàu tại các riboxom tự do, nhưng khi

252

trình tự tín hiệu được tổng hợp thì nó sẽ hướng dẫn phức hợp polypeptit-riboxom đi vào mạng lưới nội chất và tiếp tục tổng hợp protein tại đó. Vùng mạng lưới nội chất có chứa riboxom vì thế gọi là mạng lưới nội chất sần. Mỗi một loại protein gắn vào màng cỏ một hoặc nhiều trình tự gắn vào màng, gọi là trình tự neo màng (membrane anchor sequences) giàu gổc axit amin kỵ nước. Một số protein loại này có trình tự tín hiệu hoạt động như cái mỏ neo cắm vào màng. Các protein gắn vào màng khác, ví dụ protein vỏ ngoài của HIV-1 sẽ được chuyển qua màng cho đến khi chạm tới trình tự neo và sau đó trình tự tín hiệu sẽ bị enzym của tế bào loại bỏ. Nhiều protein được tổng hợp trong mạng lưới nội chất hạt sẽ được tạo bọng để tới bộ máy Golgi. Hầu hết protein gắn màng được glycosyl hoá trong các khoang màng này, sau đó được chuyển tới các màng tế bào chất hoặc màng nhân và cỏ thể nẩy chồi qua các màng này. Các tế bào biểu mô có mặt đỉnh (ở phía ngoài) và mặt đáy (ở phía trong),được cấu tạo từ lipit và protein. Khi nhiễm virut có vỏ ngoài vào tế bào biểu mô chúng sẽ nảy chồi qua màng sinh chất một cách giới hạn hoặc qua mặt đỉnh hoặc qua mặt đáy. Ví dụ nếu là vsv (virut chốc mép), chúng sẽ nẩy chồi từ mặt đáy, còn virut cúm A sẽ này chồi từ mặt đỉnh. Điều này giải thích vỉ sao virut cúm nhiễm vào động vật có vú đều khu trú ờ đường hô hấp. Nêu virut nhân lên ở trong nhân thì hầu hết (nhưng không phải tất cà) các protein virut phải được đưa vào nhân. Cơ chế vận chuyển liên quan đến sự nhận diện của tín hiệu định vị nhân (NLS-nuclear localization signal) nằm ữên protein của tế bào, gọi là importin, sau đỏ gắn vào các sợi (fibril) mọc ra từ phức hợp lỗ nhân để vận chuyển qua lỗ nhân. (3) - Sao chép genome của virut Đây là bước thứ 5 của chu trình nhân lên. Nhìn chung virut ADN và virut ARN sao chép trực tiếp genome của mình thành ARN. Tuy nhiên một số virut ADN khi sao chép cần qua trung gian ARN và một số virut ARN cần qua trung gian ADN. Các virut ADN tiến hành sao chép trong nhân (trừ virut pox). Các virut có genome nhỏ (virut papilloma) sử dụng ADN polymeaz của tế bào, còn virut có genome lớn (ví dụ herpes) thì mã hoá cho enzym của mình. Các virut ARN tiến hành sao chép ưong tế bào chất (trừ virut cúm và retro), sử dụng enzym đo chúng mã hoá. Trong hầu hết trường hợp, sao chép và phiên mã là một. Enzym dùng cho sao chép cũng là enzym đùng cho phiên mã. 1. Virut ADN kép sao chép ừong nhân theo cơ chế bán bảo tồn như ở tế bào, sừ đụng enzym ADN polymeaz phụ thuộc ADN cùa tế bào. Tuy nhiên virut pox là

253

virut ADN kép, sao chép trong tế bào chất sử dụng enzym ADN polymeaz do chúng mã hoá. 2. Virut ADN đơn (+ hoặc -) tất cả đều sao chép trong nhân, sử đụng ADN polymeaz của tế bào và phải qua giai đoạn trung gian tạo sợi ADN kép, gọi là dạng sao chép (RF-replicative form). Tư RF sao chép tạo genome. 3. Virut ARN kép (ví dụ virut rota) luôn có genome phân đoạn, sao chép trong tế bào chất và sử dụng enzym ARN polymeaz phụ thuộc ARN do chúng mã hoá. 4. Virut ARN đơn, (+) khi sao chép phải qua bước tạo ARN (-) trung gian làm khuôn để tổng hợp genome ARN (+). Genome ban đầu được dùng làm mARN để tổng hợp ARN polymeaz. 5. Virut ARN đơn, (-) sao chép trong tế bào chất, sử dụng enzym ARN polymeaz phụ thuộc ARN (ARN-replicaz) do chúng mang theo để tổng hợp sợi ARN (+) trung gian làm khuôn tổng hợp genome (-). Virut ARN (-) phân đoạn (ví dụ virut cúm) sao chép trong nhân, sử dụng ARN polymeaz phụ thuộc ARN do chúng mang theọ. 6. Virut ARN (+) phiên mã ngược (ví dụ HIV), trước hết dùng ertzym phiên mã ngược cùa virut (ADN polymeaz phụ thuộc ARN) để tạo ADN kép trong tế bào chất, sau đó vào nhân gắn vào nhiễm sắc thể của tế bào rồi từ đó sao chép tạo genome ARN nhờ enzym ARN polymeaz phụ thuộc ADN cùa tế bào. 7. Virut ADN kép phiên mã ngược (ví dụ HBV). muốn sao chép phải qua bước trung gian tạo ARN tiền genome trong nhân, đùng enzym ARN polymeaz phụ thuộc ADN của tế bào. ARN mới sinh ra khỏi nhân làm khuôn để tồng hợp sợi ADN (-) (sợi L) nhờ enzym phiên mã ngược của virut. Từ sợi ADN (-) làm khuôn tổng hợp sợi ADN (+) tương bù do enzym của virut mã hoá. a- Khởi đầu sao chẻp Mỗi genome virut có một trinh tự đặc biệt, tại đó bắt đầu sao chép axit nucleic cùa virut. Khi sao chép cần gắn mồi. Đó là phản ứng đầu tiên của một nucleotit với nhóm -OH tại vị trí khởi đầu sự sao chép genome của nhiều virut (ví dụ rota, rhabđo) bắt đầu khi nucleotit đầu tiên của sợi mới bắt cặp với 1 nucleotit trong ARN của virut. Nucleotit đầu tiên hoạt động có hiệu quả như một mồi để sao chép ARN, khi nhóm 3’-OH của nó gán với nucleotit thứ 2. Một số virut ADN đơn (ví dụ virut parvo) sử đụng cách tự tạo mồi. Đầu 3’ của ADN có các ừình tự tương bù, nên có thể gập lại, bắt cặp với nhau tạo đầu 3’-OH thay cho mồi. Đê khởi đầu sao chép, nhiều genome ADN và một số genome ARN của virut dùng một phân tử ARN hoặc protein làm mồi.

254

b- ARN mồi vò protein mồi Sự tổng hợp ADN của tế bào được bát đầu sau khí một vùng xoắn kép được mở xoắn tạo bong bóng nhờ enzym helicaz và sau khi enzym primaz tổng họrp một đoạn ARN ngắn làm mồi. Cẩn một mồi cho sợi dẫn đầu và nhiều mồi cho tổng hợp các đoạn Okazki của sợi muộn (sợi sau). Nucleotit đầu tiên của ADN mới gán vào 3’-OH của ARN mồi. Một so virut ADN dùng mồi ARN để sao chép genome. Một số (ví dụ virut polymaz) dùng primaz của tế bào để tổng hợp mồi. số khác (ví dụ virut herpes và phage T7) lại mã hoá cho primaz của riêng mình. Virut retro dùng tARN của tế bào làm mồi khi ờ ngoài tế bào chất, nhưng khi cài xen genome của mình vào nhiềra sắc thể của tế bào nên để sao chép, chúng dùng mồi do primaz của tế bào tổng hợp. Một số virut động vật sử đụng protein làm mồi, trong đó có virut ADN như virut adeno và virut ARN như picoARN. Nhóm 3’-OH của serin hoặc tyrosin trong protein sẽ gắn với nucleotit sợi mới. Virut hepADNa (ví dụ HBV) là virut ADN kép, dùng mồi là protein để khởi đầu tổng hợp sợi ADN (-) và mồi ARN để khởi đầu tổng hợp ADN (+). Mồi protein và mồi ARN của virut hepADNa không bị cắt bỏ sau khi vai trò của chúng đã hoàn tất mà vẫn được dính vào đầu 5’ của genome. c- Sao chép ADN Mỗi ADN virut có ít nhẩt một trình tự chuyên biệt để bắt đầu sao chép gọi là trình tự khởi đầu (Ori). Các protein khởi đầu sao chép ADN bám vào vị trí này bao gôm: - Helicaz bám vào vị trí để tháo xoắn. - Một số protein bám sợi ADN đơn, giữ cho 2 sợi không bắt cặp lại với nhau. - Một ADN polymeaz. v ề cơ bản quá trình sao chép ADN của virut giống như của tế bào. Ở vi khuẩn, số enzym tham gia ít hơn so với ờ Eukaryota. Ví dụ helicaz-primaz của phage T7 (ở E.coli) chỉ là 1 phân tử, ừong khi của virut herpes simplex (ở tế bào động vật) là một phức hợp gồm 3 loại protein. Sự tổng hợp ADN diễn ra gần chạc sao chép. Một trong 2 sợi ỉà sợi dẫn đầu, sợi còn lại là sợi muộn, được tổng hợp thành các đoạn Okazki sau đó nối lại với nhau nhờ AĐNligaz. Sợi ADN kép mới tạo thành có chứa một mạch của sợi mẹ. Cách sao chép này gọi là bản bảo tồn. Ngược lại với nó là sao chép bảo tồn xảy ra ở một số virut. Một số genome ADN là phân từ dạng thẳng trong khi một sổ khác lại là dạng khép vòng. Một số phân tử dạng thẳng khi sao chép lại được khép vòng, cho nên nhiều genome virut được sao chép như là một phân tử vòng tròn. Từ đây cỏ 2 phương thức sao chép.

255

- Sao chép theo cơ chế theta hay dạng mắt. Từ vị trí Ori tạo ra 2 chạc ba sao chép. Sao chép cùng lúc theo 2 chiều thuận nghịch kim đồng hồ. - Sao chép theo cơ chế xích ma (8). Phân từ ADN kép dạng vòng gồm sợi ngoài (+) và sợi trong (-). Sợi ngoài bị cắt đứt ờ liên kết photphodiete tạo ra đầu 3’-OH tự do (gọi là điểm sinh trường). Sợi trong xoay được dùng làm khuôn. Các nucleotit nối vào đầu 3’-OH để tạo ra 1 sợi ADN mới. Từ sợi ADN mới này lại được gắn mồi tổng hợp mạch bổ sung tạo ADN kép. Một số virut lúc mới nhiễm sao chép theo cơ chế theta nhưng ở giai đoạn sau lại theo cơ chế xích ma (ví dụ phage ỘXỈ74). Một số virut ADN như virut herpes và phage T4, kết quả sao chép tạo ra phân tử ADN rất lớn gọi là phân tử trùng lặp (concateme). Mỗi concateme cấu tạo gồm nhiều bản sao genome nối với nhau. Trước khi lắp ráp vào virion concateme sẽ được phân cắt thành các phân tử có kích thước và trình tự của genome. (4) -Lắp ráp Lắp ráp là sự tự kết nổi các thành phần virut để tạo ra virion hoàn chỉnh đòi hỏi phải có cấu trúc bền vững, tồn tại được trong môi trường như là một thực thể có khả năng gây nhiễm, tuy nhiên cũng đòi hỏi khi vào trong tế bào cấu trúc này phài không bền vững thì mới có thể giải phỏng dễ đàng genome vào tế bào chất. Do vậy virion phải có cơ chế đóng mờ kiểu “công-tắc” để cỏ thể biến đổi từ trạng thái bền vững sang trạng thái không bền vừng. Công tắc này liên quan đến việc gắn vào receptor hoặc sự thay đổi pH ữong endoxom. Khi số lượng genome và protein cấu trúc được tích luỹ đến ngưỡng thì chúng sẽ tiến hành lắp ráp tạo nucleocapsid. 1.

Virut cỏ cấu ưủc dạng xoắn: Đối với virut ARN đơn có cấu trúc dạng xoắn, lúc đầu một số phân tử protein cấu trúc sẽ bám theo chiều xoắn của genome ARN, sau đó các phân tử khác lần lượt bám theo cho đến khi phù hết ARN.

2.

Virut có cấu trúc dạng khối đa diện: Trước hết cần phải lắp ráp một cấu trúc rỗng hình cầu gọi là procapsid. Genome virut chui vào procapsid, sau dó cải biến từ cấu trúc hình cầu sang hình khối đa diện; ví dụ các virut adeno, picoARN thực hiện cải biến bằng cách cắt bớt 1 hoặc nhiều protein cấu trúc.

Genome chui vào trong procapsid qua kênh nằm ở vị trí mà sau này sẽ ỉà đinh của khôi đa diện. Bât kỳ enzym nào tham gia vào đóng gỏi genome cũng năm ở vị trí này. Ở tế bào thực khuân cũng như vậy, trước hết cũng phải tạo một “tiền đầu” (prohead) sau đó genome chui qua 1 cái công năm ở một đỉnh. Vị trí này cũng cỏ chức năng nối với đuôi.

256

a- Đóng gỏi genome Trong tế bào có rất nhiều axit nucleic, của cả virut và tế bào. Vậy làm thể nào để genome của virut lại được lựa chọn và lắp ráp chứ không phải của tế bào? Sở dĩ như vậy vì virut có một protein chuyên biệt, nhận diện tín hiệu đóng gói, nằm ở vùng có cấu trúc bậc hai của genome. Hầu hết virut có genome sợi đơn có thế đỏng gói hoặc sợi dương hoặc sợi âm, nên tín hiệu đóng gói phải có duy nhất ờ sợi cần được đóng gói. Genome được nén trong thể tích nhỏ. Virut ADN kép có kích thước lớn như virut herpes, đóng gói genome chặt đến nỗi tạo áp suất lớn gấp 10 lần so với áp suất trong chai rượu sâm - banh. b- Cơ chế ỉắp ráp Trước đây Fraenkel-Conrat đã tách genome ra khòi capsid cùa virut đốm thuốc lá, sau đó lại lắp ráp chúng với nhau trong điều kiện pH và sự có mặt của một sổ ion nhất định, để tạo virut hoàn chỉnh. Với các virut đơn giản, chỉ chứa 1 axit nucleic và một số ít loại protein thì có thể tự lắp ráp một cách đơn giản như trên. Nhưng với các virut phức tạp, như virut herpes và phage có đuôi, thì không thể tái lắp ráp như vậy. Chúng cần phải được lắp ráp trực tiếp trong môi trường của tế bảo nhiễm. Khi lắp ráp cần phải có mặt tạm thời 1 protein dùng làm giàn giáo. Các protein cấu trúc theo đó mà lắp vào để tạo capsid. Khi công việc hoàn tất, protein giàn giáo bị loại bỏ khỏi virion hoặc bằng enzym phân giải hoặc giữ lại để tái sử dụng. c- Sự tạo màng virion Vỏ ngoài virut có thể được tạo thành theo 1 trong 2 cơ chế: Cải biển màng sinh chất của tể bào rồi nảy chồi ra hoặc tự tổng hợp màng mới bao quanh nucleocapsid. - Cải biển màng sinh chắt Vỏ ngoài của virut thường có nguồn gốc từ màng sinh chất, được cuốn theo khi virut nảy chồi. Vùng màng mà virut sẽ nảy chồi được đính trước 1 hoặc nhiều loại protein đặc hiệu của virut, thường là glycoprotein, các protein này ngâm trong lớp lipỉt kép. Protein M cùa virut (các phân tử protein này gắn với nhau tạo thành màng đệm - M) tập trung nhiều ờ vùng màng, có ái lực với nhau và đẩy protein tế bào ra khỏi màng. Đôi khi protein tế bào không bị đẩy ra hết nên chúng có thể tham gia vào thành phần vỏ ngoài. Ví dụ vò ngoài của virut HIV-1 có chứa protein MHC-II (phức hợp hoà hợp mô chính) của tế bào. Trước khi nảy chồi, protein M tới gắn vào phần đuôi nằm trong tế bào chất của glycoprotein xuyên màng, sau đó nucleocapsid tiến đến bám vào màng M. Nucleocapsid khi nảy chồi sẽ cuốn theo màng tế bào chất và màng M để tạo vỏ ngoài. Không phải tất cả các virut đều có màng M. Ví dụ ở trường hợp virut sốt vàng thì bề mặt nucleocapsid sẽ gắn trực tiếp vào đuôi glycoprotein trong màng.

?^7

- Tổng hợp mới màng virut C hỉ có m ộ t số ít v iru t tạ o m àn g lipit m u ộ n tro n g q u á trìn h n h â n lên. M à n g n ày có thể

tham gia hình thành vỏ ngoài (ví dụ virut pox) hoặc nằm trong nhân tạo 1 lớp phía mặt dưới của capsid (ví dụ virut irido). Khi nhân ỉên virut baculo tạo ra 2 loại virion có vỏ ngoài: Loại thứ nhất có chức năng ỉây nhiễm sang tế bào khác trong vật chủ. Loại này có được vỏ ngoài là do nảy chồi qua màng sinh chat. Loại virion thứ hai có chức năng gây nhiễm vào vật chủ mớỉ, vỏ ngoài cùa nó bao quanh nucleocapsid nằm trong nhân dẫn đến các virion hợp nhất với nhau trong một bọc gọi là thể bọc (occlusion body). Thể bọc giúp virut tránh tác động của môi trường bên ngoài, nên virut có thể duy trì rất lâu ngoài tế bào sống. (5) -Giải phóng virut khỏi tế bào Đây là giai đoạn cuối cùng của chu trình nhân lên. Nhiều virut được giài phóng khi tế bào bị nổ tung, do thành tế bào bị phân giải, cộng với áp lực lớn trong tế bào. Ví dụ nhiều phage, peptidoglycan bị phân giã dẫn đến làm vỡ tế bào. số khác lại có khả năng tổng họp protein ức chế enzym tham gia vào tổng hơp thành tế bào, làm cho thành tế bào yếu đi nên dễ bị vờ. Số lượng virut được tạo thành qua mỗi mẻ là rất lớn. Trong tể bào E.coli có kích thước nhỏ bé, phage T4 có kích thiĩớc lớn tạo ra được 200 virion. Virut picoARN có kích thước rất nhỏ khi nhiễm vào tế bào động vật có kích thước lớn đã tạo ra đến 100.000 virion. Một số virut không ỉàm tan tế bào mà chi chui ra từ từ theo lối nảy chồi, số khác chui ra thông qua việc tạo thành túi hay bọng từ màng ỉưới nội chất hoặc bộ máy Golgi. Màng bọng dung hợp với màng tế bào chất và đẩy virut ra ngoài, ở các trường hợp này, tế bào vẫn còn sống thêm một thời gian nữa. ỉ 9.1.3.2. Phiên mã và dịch mã ở Prokaryota 19. ỉ. 3.2. ỉ. Phiên mã ở Prokaryota Sự phiên mẫ ở các tế bào Prokaryota có những đặc điểm sau: - Chỉ cần một loại ARN polymeaz để tổng hợp tất cả các loại ARN. - mARN là đa gen (polycistron) có nhiều khung đọc, tất cả các khung đọc đều có thể được dịch mã cùng một lúc. - mARN không gắn mũ và đuôi poly (A). - Phiên mã được thực hiện khi ARN-polymeaz bám vào promoter. Sự tổng hợp bát đầu từ điểm xuất phát, thường là TAC, nằm sau điểm bám 7-8 bazơ nằm phía đầu 3’ của khuôn. 258

- Phiên mã tiếp tục cho đến khi đọc qua trình tự kết thúc. Khi kết thúc, ARN polymeaz và mARN rời khỏi mạch khuôn. - Quá trình phiên mã và dịch mã xảy ra đồng th ờ i. ARN-polymeaz của E.coỉi là một phức hợp gồm 5 tiểu đơn vị là aap p ’ và ô. ô (xích ma) có thể tách ra khỏi enzym lõi. aaỊ3Ị3’ (enzym lõi) là yếu tố xâc định tính đặc hiệu cùa promoter. Promoter là vùng khởi động. Nếu ký hiệu bazơ đầu tiên phiên mă thành mARN (thường là adenin) là +1 thì các bazơơ nằm phía trước theo hướng ngược chiều phiên mã sẽ ký hiệu là (-). Promoter gồm 2 trình tự một ưình tự là TATAAT cách điểm khởi đầu 5-8 bazơơ và có bazơơ trung tâm là -10. Trình tự này gọi là hộp TATA hay Pridnow và một trình tự nữa là TTGACA, có bazơơ trung tâm là -35 (nằm trước điểm khởi đầu 35 bp). Vùng -35 tham gia vào việc gắn ARN polymeaz

ITGACA

15-20 bazơ

| P

Cụ thể là ngay trước vùng -35 của một số promoter còn có thêm yểu tố ƯP để cho tiểu đơn vị a của ARN polymeaz nhận diện và tăng cường sự bám cùa enzym. Khi khởi đầu phiên mã hoàn thành, yếu tố a sẽ rời ra để tải sủ đụng. Phiên mã kết thúc sau khi một trình tự kết thúc được phiên mã. Sự kết thúc có thể theo cơ chế phụ thuộc hay không phụ thuộc yếu íố p (rho). - Kết thúc phiên mã không phụ thuộc rho được đặc trưng bởi trình tự giàu G-C trên* ADN. Trình tự này đối xứng 2 bên, có thêm 5 hoặc 6 adenin kèm theo. ARN được phiên mã từ trình tự này có thể tạo ra cấu trúc nút vòng cỏ cuống (stem loop) và cấu trúc nối A-Ư hình thành trong sợi lai ADN-ARN (ADN khuôn và ARN mới sinh). Đoạn lặp lại oligo A với oligo u bắt cặp không bền vững nên ARN có thể tách khỏi ADN khuôn. Sau đó sợi ADN kép được hình thành trong “bong bóng phiên mã”. Lõi của enzym ARN polymeaz có ái lực thấp với ADN kép nên được tách ra. - Kểt thúc phiên mã phụ thuộc yểu tổ rho cần phải có yếu tố rho. Đó là protein gồm có 6 tiểu đơn vị có ái lực cao với ARN đơn, có hoạt tính helicaz và ATP-az để tháo xoắn sợi lai ADN-ARN. Khi bám vào ARN, yếu tổ rho sẽ phân giải ATP. Năng lượng được giải phóng giúp nó chuyên dọc sợi ARN mới sinh tới bong bóng phiên mã, sau đó yểu tố rho tách đôi ADN-ARN và giải phóng ARN.

259

c

,u

c p I c 1 c I c I

-f I G I G I G I

Ạ— Ụ

r ? c—0 I I G— c\

5

/

U-A-A-U-C-C-C-A-C-A-G A—T —T —A —G — G—G—T —G—T

..

Ị- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - j

3’

A f u ~ Ụ - Ụ - u f OH A —A —A —A —ADN

Hình 19,8: cấu írúc bộc 2 ở đầu 3' của ARN ờ operon E.coỉì,

Gen của virut và vi khuẩn ít khi có intĩon. Một số phage đùng ARN pol phụ thuộc ADN của tế bào vật chủ để phiên mã, trong khi số khác lại tự tổng hợp enzym này cho riêng mình. ARN polymerase

Hình ỉ 9.9: Mô hình kết thúc phiên mã phụ thuộc yểu tố Rho ở E. coli.

19.1.3.2.2.

Dịch mã ở Prokaryota

Dịch mã ờ vi khuẩn có các đặc điểm sau: - Dịch mã có thể được bắt đàu tnrớc khi kết thúc phiên mã. Do không có nhân nên phiên mã và dịch mã xảy ra đồng thời. - Riboxom 70S gồm 2 tiểu phàn là 50S và 30S.

260

- mARN khỏng có mũ ntìưng có trình tự SD (Shine DalgARNo) nằm trước vị trí khởi đầu dịch mã AUG và bắt cặp với đoạn 3’ARN riboxom 16S trong tiểu phần 30S. - Metionin của tARN đầu tiên thường được metyl hoá (fMet'tARNjMet). - Chỉ cần m ộ t lượng rẩt ít các yếu té khởi đầu. - mARN cùng lúc.

có

nhiều khung đọc (polycistron). Tất cả các khung đọc đều được dịch mã

I— Virion

Nucleus

Ribosomes

Golgi A p p ara tu s

Hình 19.10: Quá trình nhân ỉên của vỉrut trong tể bào vật chù.

261

19.2. GIỚI THIỆU TÓM TẮT QUÁ TRÌNH NHÂN LÊN CỦA MỘT SÔ VIRUT ĐIÉN HÌNH

19.2.1. VirutADN 4 họ đại diện là: Adenovìridae, Herpesvìridae, Papovaviridae và Parvoviridae. 19.2.1.1, Adenoviriđae Họ này gồm các chi: - Mastadenovỉrut, gồm 49 serotyp gây bệnh cho người như viêm phổi, viêm mũi họng, viêm kết mạc, một số gây ung thư ở chuột. - Aviudenovirut, nhiễm ở chim, gia cầm. - Vir Jt chứa genome ADN kép. - Vii íon dạng khối đa diện, trên mỗi đỉnh có sọi lông dài. - Không có vỏ ngoài. a- Câu trúc

- Đường kính trung bình cùa virion 70-100nm. - Capsid chứa 7 protein: Protein II nằm trên vỏ capsid. Protein III hay protein penton, nằm ở đỉnh khối đa diện. Protein Ilia nằm ữên vỏ capsid. Protein IV sợi đỉnh. Protein VI nằm ở gần đỉnh. Protein VIII nằm trên cạnh tam giác của khống đa điện. 262

Protein IX nàm gần đỉnh. - Lõi chứa các protein. Protein V nối ADN vói protein II (penton). Protein VII bao quanh sợi ADN. Protein X nằm trên bề mặt tam giác cùa capsid. Protein 55 kDa gắn ở đầu chuỗi gọi tắt là protein đầu chuỗi (TP). - Ở đầu chuỗi ADN có các trình tự lặp lại đảo chiều.

b- Hấp phụ và xâm nhập - Sợi đình của virut gắn vảo thụ thể (CAR) dành cho kháng thể của virut coxsackia và adeno. - Intergrin gán vào trình tự RGD trong protein III (penton) để giúp virut xâm nhập vào tế bào theo lối nhập bào, tạo endoxom. - Virut thoát khỏi enđoxom nhờ pH trong endoxom thay đồi, bị vỡ ra giải phóng nucleocapsid. - Vi ổng gẳn với hexon và vận chuyển virion vào gần lỗ nhân, v ỏ capsid bị phân giải, ADN được giải phóng và vào nhân qua lỗ nhân. Protein 55 kDa ở đầu 5’bám vào màng matrix của nhân. c- Phiên mã và dịch mã sớm Genome được tách thành sợi R và L (phải và trái) không gọi là sợi (+) và sợi (-) vì cả 2 sợi đều có khung đọc. •

Cả 2 sợi đều phiên mã tạo mARN.

•

Sợi R có các gen El A, E1B, các gen cấu trúc, gen E3.

•

Sợi L có các gen E2A, E2B và E4.

263

- ARN polymeaz II phiên mã tạo mARN của virut có mũ ở đầu 5’ và đuôi poly (A) ở đầu 3’. •

mARN E 1 dịch mã tạo protein E 1.

•

Các gen sớm trung gian El A tham gia vào hoạt hoá trans các gen virut.

- Protein El gắn vào protein điều hoà của vật chủ, gắn vào hộp TATA, điều hoà ngược pha s, hoạt hoá protein p53. •

Protein E1B ức chế sự chết theo lập trình (apoptosis) cùa tế bào.

•

E1 gắn pRB (protein ung thư võng mạc).

- Phiên mã sợi L để tạo mARN cho E4 sau đó dịch mã để tạo protein E4. •

E4 điều hoà ngược các gen virut, tham gia vào vận chuyển mARN và vảo tổng hợp ADN.

- Phiên mã mARN E2, tổng hợp 3 protein quan trọng cần cho tổng hợp ADN, - Phiên mã mARN E3, địch mã tạo ra protein E3 để cải biến đáp ứng miễn dịch cùa vật chủ ức chế apoptosis. d-Sao chép Sao chép ADN tiến hành khi tế bào bước vào pha s và khi E2 được tích luỹ. - Các đoạn lặp đảo chiều ở 2 đầu dùng làm điểm khởi đầu sao chép. - Cỏ một protein 80 kDa (protein đầu chuỗi) và một ADN polymeaz. Từ vùng E2 tạo 1 heterodimer để bắt đầu sao chép. •

Cả 2 sợi của genome đều có thể bị thế chỗ do virut thực hiện sao chép theo cơ chế bán bảo thủ.

•

Sợi mẹ cỏ cấu trúc cán chảo (panhandle) do có các đoạn đầu lặp đảo chiều và tiến hành phiên mã.

•

Protein đầu chuỗi 80 kDa bị cắt bớt để tạo thành protein 55 kDa.

e- Phiên mã và dịch mã muộn - Sau sao chép, sự vận chuyển mARN của vật chù bi ức chế. •

Phức hợp E4.E1B ngăn cản sự vận chuyển mARN của vật chủ và tăng cưởng sự vận chuyển mARN của virut ra khỏi nhân.

•

Sản phẩm của gen sớm sau hoạt hoá trans các gen muộn.

- Sự cắt nối mARN và vị trí gắn đuôi poly (A) khác nhau tạo nên các mARN khốc nhau.

264

f- Lắp ráp và giải phóng - Penton và hexon đầu tiên được lắp ráp trong tế bào chất, sau đỏ tập hợp trong nhân để lắp ráp thành capsiđ. - ADN chui vào capsid nhờ phân tử protein đóng gói. Nếu ADN không chui được vào capsid, nó sẽ tách ra ở ngoài. Virion hoàn chỉnh ra khỏi nhân rồi thoát ra ngoài. 19.2.1.2. Herpesvirìdae Họ này gồm 3 chi: 1. Alpha herpesvirut - HHV-1 (human herpesvirut-1) gây chốc mép. - HHV-2, còn gọi là herpes sinh dục gây bệnh đường sinh dục. - HHV-3 gây bệnh thuỷ đậu, zona. - Simian herpesB gây bệnh ở khí. 2. Beta herpesvirut - HHV-4 virut Epstein-Barr gây ung thu vòm họng. - HHV-5 virut cự bào (CMV-cytomegalovirut), - HHV-6 gây bệnh ban (ban đào). - HHV-7 không biểu hiện triệu chứng. - HHV-8 Sarcoma Kaposi ở người. 3. Gamma herpesvirut ct- Cấu trúc

265

- Virut có vỏ ngoài, trên bê mặt có các glycoprotein, glycoprotein bê mặt gC, gD, gB, gE, gH, gi, gK, gL, gM. Vò ngoài chứa lipit đường kính 150-200nm. - Phía trong vò ngoài là lớp protein vô định hình (tegument) - vùng hạt chứa protein dạng cầu. * Capsid có kích thước trung bình (lOOrun), dạng khối đa diện với 162 capxom. - Lõi là ADN kép, dạng thẳng là một trong những genome lớn nhất của virut (240 kb). b- Hấp phụ và xâm nhập - Protein bề mặt gC của virut bám vào thụ thể bề mặt của tể bào. + Một số chất trung gian xâm nhập (HVEM-herpesvìrut entry mediators) giúp virut gắn dặc hiệu vào glycoprotein gD. + Khi dung hợp với màng tế bào cần có thêm sự tham gia của các glycoprotein bề mặt khác gB, gD, gE và gỉ. - Virut vào tế bào theo lối nhập bảo. - Virut tiếp cận nhân, chỉ có ADN và protein tegument mới qua lỗ nhân. c- Phiên mà và dịch mã sớm - Genome virut khép vòng nhưng không liên kết với protein chromatin. - Một phần protein tegument cùa virut herpes simplex vẫn còn giữ lại ở tế bào chất sẽ ngăn cản sự tổng hợp protein của tế bào chủ nhờ phân huỷ polyríboxom và ARN của tế bào. + Protein tugument, trong đó có CC-TIF (yểu tố cảm ứng trans của gen ct) tiến hành hoạt hoá trans và tăng cường tổng hợp mARN sớm ngay. + 5 gen a sớm ngay (khoảng 10%) không đòi hỏi tổng hợp protein mà là nguồn dự trữ cho sản phẩm gen ot. - ARN pol II phiên mã các gen a còn lại tạo mARN để tổng hợp protein a tham gia vào sự điều hoà biểu hiện gen cùa virut herpes. - Các gen p (gen sớm sau) được phiên mã ờ mức độ thấp nếu không có sản phẩm của gen a. - Gen £1 cần sản phẩm của gen a và được phiên mã trước tiên, tạo mARN để tổng hợp ICP-6 ((316) là ribonucleotit reductaz. ICP-18 (p 18) là protein bám ADN. - p2 là gen sớm sau phụ thuộc vào gen oc4 và được phiên mã sau gen pl. - Một số protein p2 ngăn cản sự tổng hợp protein a. Các sản phẩm của gen p đạt cao nhất sau 5-7 giờ nhiễm.

d~ Sao chép genome - Trước khi tổng hợp ADN đã cỏ một số protein cấu trúc y !. - Virut sử dụng nhiều enzym như helicaz, primaz và polymeaz để tiến hành sao chép genome theo cơ chế vòng tròn xoay. - Sao chép bắt đầu tại 3 điểm khởi đầu và nhiều đoạn ARN không được loại bỏ. Khi ADN sao chép tại nhiều điểm khời đầu sao chép, lúc đàu được sợi đơn rẩt dài, sau đó tổng hợp sợi bổ sung. Đây là sợi trùng lặp (concateme) gồm nhiều genome nối với nhau. Enzym sẽ cắt để được phân tử có kích thước và trình tự của genome. e- Phiên mã và dịch mã muộn - Các protein p hoạt hoá gen y l. Một số protein yl được tạo thành trước khi tổng hợp ADN. - Các gen y mã hoá cho các protein muộn - tức protein cấu trúc, tích luỹ trong nhân và ờ màng nhân, ví dụ các capxom dạng ống, các protein bề mặt vò ngoài. - Các protein y ức chế sự tổng hợp sản phẩm gen p.

Hình 19.12: Sự điều hoà biểu hiện gen của virut herpes.

Gen a được hoạt hoả bời protein CC-TIF do gen p mã hoả. Protein a tự điều hoà biểu hiện cửa chinh mình và hoạt hoá gen ậ Protein a và phiệp đồng hoạt hoá gen %proetin Y mà tham gia lẳp ráp tọo virion vừa điều hoà hoọt động cùa gen cc 267

Ghi chủ:----------►hoạt hoá;----------►ức chế f- Lắp ráp vờ giải phóng Protein tạo capsid gắn với trình tự “a ” nằm trên ADN kép, cắt chúng ra khỏi sợi trùng lặp, tạo capsid, qua màng nhân. Màng nhân bọc capsid sau đó dung hợp với màng sinh chất để ra ngoài. 19.2.1.3.

Papovavirỉdae

Gồm các chi: Papiỉomavirut gây bệnh mụn cóc, ung thư cổ tử cung. Polymevirut gây viêm não. Virut tạo bọt SV40. a- Cấu trúc

Capsid hình khối đa: diện, đường kính 45-55nm, không có vỏ ngoài, được tạo thành từ 72 capxom. Capxom được cấu tạo từ các protein VP1, VP2 và VP3. s

VP1 là protein lởn củạ capsid.

s

VP2 là protein nhỏ của capsid.

v'' VP3 là protein cạpsid gắn ADN. Lõi là ADN kép, khép vòng. b- Hấp phụ và xâm nhập

»

- Vìrut vào tê bào biêu mô theo cơ chế nhập bào. Sự hấpphụ thaỳ đổi tuỳ loạivirut, nhưng có thể cần phân tử MHC-I, yếu tố sinh trưởng hoặc axit sialic,thụ thể của HPV-6 là integrin, của HPV-11 là heparin sulphat. - Virut năm trong endoxom và cởi vỏ ở tế bào chất, sau đó genome ADN kép, khép vòng vào nhân qua lỗ nhân. 268

c- Phiên mã và dịch mã sớm Phiên mã nhờ ARN polymeaz II của tế bào để được pre-mARN (mARN tiền chất). Pre-mARN cắt nổi tạo 2 mARN, nhưng có cùng mũ ờ đầu 5’ và đuôi poly (A) ở đầu 3’. Có tên gọi là kháng nguyên T lớn và kháng nguyên T nhỏ. Virut SV40 có 2 kháng nguyên T trong khi virut polyoma có 3 kháng nguyên T (thêm kháng nguyên T trung bình). d- Sao chép genome - Sự tích luỹ kháng nguyên T lớn có tác dụng chuyển tế bào vào pha s, bởi vì virut phụ thuộc vào bộ máy sao chép của tế bào. - ADN của virut chuyển thành một nhiễm sắc thể nhỏ (minichromoxom). - Kháng nguyên T lớn bám vào ADN và hoạt hoạt động như enzym helicaz và ngăn chặn sự phiên mã sớm bằng cách phong bế điểm khởi đầu. - Sự sao chép theo cơ chế theta tạo ra 2 genome giống hệt nhau. e- Phiên mã và dịch mã muộn - Sự chuyển vị trí khỏi đầu sau sao chép ADN cho phép bắt đầu tổng họp mARN muộn. - Nhờ phương thức cắt nối lựa chọn (alteARNtive splicing) mà từ 1 bản phiên mã tạo ra được 3 mARN có đoạn dẫn đầu không địch mã giống nhau. + mARN VP1 tổng hợp protein Vpl. Các riboxom đôi khi bắt đầu dịch mã tại điểm khởi đầu dịch mã thay đổi để tạo ra VP3. + mARN Vp2/VP3 tồng hợp các protein VP2/VP3.

/- Lấp ráp và giải phỏng - VP2 và VP3 gắn vào VP1 và tín hiệu định vị nhân trên VP1 tạo thành phức hợp tích luỹ ữong nhân. - Các protein cấu trúc tự động lắp ráp với nhau tạo thành capsiđ rỗng. ADN loại bỏ histon-1 trước khi chui vào capsiđ.

269

- Nucleocapsid rời khỏi nhân, tạo bọng vởi màng iưởi nội chất nhẵn để ra khỏi bể mặt đỉnh của tế bào biểu mô nhờ dung hợp với màng tế bào chất,

19.2A.4. Parvoviridae Gồm các chi: - Parvoviriư gây bệnh ở động vật gậm nhấm, bệnh ở chó, lợn, bệnh mắt bạch tạng cầu hạt ở mèo,... - Eryừovirut gây bệnh ban đỏ B 19. - Dependovìrut khác với 2 chi trên là các virut tự lập (autonomous) có thể tự nhân lên trong các tế bào chủ thích hợp. Dependovìrut là virut khiểm khuyết, chủng chi cỏ thể nhân lên khi có sự hỗ trợ của virut đồng nhiễm, ví dụ virut adeno. s

Virut đi kèm adeno.

s

Virut đi kèm adeno ờ chim.

s

Virut đi lèm adeno ở chó.

a- Cẩu trúc

- Capsid cỏ kích thước rất nhỏ (20nm), dạng khối đa diện, gồm 32 capxom với 60 tiểu đơn vị VP {viral protein) ỉà VP1, VP2 (chiểm 90% tiểu đon vị protein) và VP3, * Lỗi: ADN đơn, dạng thẳng. Hầu hết là AĐN ("X ở hai đầu có đoạn palindrom (đoạn ADN mạch kép cỏ trình tự nucleotit trên mồi sợi giổng nhau nhưng trái chiều nhau) tạo thành các nút kẹp tóc, có một đầu 3’-OH thay cho mồi. b- Xâm nhập và cởi vò - Virot B19 gán vào thụ thể là kháng nguyên p trên bề mặt hồng cầu. Các cá thể không có thụ thể này sẽ không bị nhiềm. Cảch xâm nhập và cởi vỏ còn chua thật rõ. - ADN đơn vận chuyển vào nhân.

5Ỉ70

c- Phiên mã và dịch mã sớm - ARN polymeaz của tế bào tổng họp mARN của đoạn nằm trước hộp TATA để tổng hợp protein không cấu ừúc, tức là protein điểu hoà. - Cắt nổi mARN, tạo ra các bản sao ARN, gắn mũ và đuôi, đuợc mARN ra khỏi nhân để tổng hợp protein điều hoà N S1. - Tưong tự như vậy, tiếp tục cắt nối trong nhân để tạo mARN dùng cho tổng hợp protein điều hoà NS2. - Các protein không cấu trúc NS1 và NS2 vận chuyển vào nhân để tham gia sao chép ADN. d- Sao chép genome - Sự sao chép genome chỉ được tiến hành khi tế bào chủ ờ pha s của chu kỳ tế bào. - Đối với virut phụ thuộc adeno (AAV) đòi hỏi phải đồng nhiễm với virut adeno đề kích tể bào bước vào pha s. - Để sao chép, cần có ADN polymeaz và một số enzym của tế bào. Sao chép dựa trên mô hình kẹp tóc lăn cải biến. Sao chép bắt đầu từ đầu 3’ của nút kẹp tóc, được dùng thay cho mồi, để tổng họp sợi ADN (+) bổ sung, kéo dài đến khi đạt chiều dài genome. - Protein NS1 cắt và liên kết cộng hoá trị với genome, tạo ra điểm đứt trong mạch ban đầu cho phép nút kẹp tóc duỗi thẳng. Đoạn mới duỗi dùng làm khuôn để tổng hợp đoạn ADN (+) bổ sung. - Chu kỳ tiếp tục lặp lại tạo phân tử ADN trùng lặp (concateme) rất lớn. - Protein NS1 gắn vào mỗi trình tự genome để cắt, tạo genome hoàm chỉnh. e- Phiên mã Vứ dịch mã muộn

- Nhờ cất nối lựa chọn phân tử mARN, mà tạo được 2 phân tử mARN cho tổng hợp 2 protein cấu trúc khác nhau là VP1 và VP2. - VP2 lại phân cắt trong capsid nhờ enzym để tạo VP3. f- Lẳp ráp và giải phỏng - N S1 đỏng gỏi ADN virut ở ưong nhân. - Các protein cấu trúc (VP) vào nhân qua lỗ nhân tạo capsid. - Cơ chế chui ra của virut còn chưa rô.

271

T h re e fo ld

Twofold

19.2.2. Virut ARN Virut CỎ genome ARN, bao gồm ARN đơn (+), ARN đơn (-) và ARN kép, có số lượng họ rất lớn. Sau đây xin giới thiệu các họ quan trọng nhất. ỉ 9.2.2.1. Virut ARN đơn, dương Gồm một số họ đại điện: - Coronaviridae. - Flaviviridae. - PicoARNviridae. - Retrovìrìdae. - Togavirìdae. 19.2.2.LỈ. Coronaviridae ó 1 chi là chi coronavirut gây bệnh: - Viêm đường hô hấp cấp nặng (SARS). - Coronavirut ở người (HCoV) gây bệnh đường hô hấp. - Viêm phế quản ở chim (IBV). - Viêm gan chuột (MHV). - Bệnh mào xanh ở gà Tây. a- Cẩu trúc

272

Virut có kích thước trung bình (80-100nm) Vỏ ngoài có các protein: - Protein xuyên màng. - Protein hemagglutinin esteaz. - Protein gai, hình dùi cui, gọi là teplome, nên tạo diềm quanh virut. Khi quan sát dưới kính hiển vi, diềm có hình ảnh vầng hào quang (corona tiếng Latinh là hào quang). Nucleocapsiđ dạng xoắn, mềm mại. Protein nucleocapsid liên kết với genome. Lõi Genome là ARN đơn, (+), b- Hấp phụ và xâm nhập - Protein gai giúp virut bám vào một loạt glycoprotein bề mặt của tế bào. - Virut xâm nhập theo 2 cách: dụng hợp vớỉ màng sinh chất và nhập bào. - Sự cởi vỏ và giải phóng ARN vào tế bào chất còn chưa rõ. c- Dịch mã sớm Genome ARN, (+) có chức năng mARN, tiến hành dịch mã sớm tạo protein còn chưa rõ chức năng. d- Phiên mã - Phiên mã tạo sợi khuôn ARN (-), từ đó tổng họp rất nhiều mARN khác nhau. - Phiên mã tạo sợi ARN (-) không liên tục, rồi từ đó tổng hợp rất nhiều mARN. e- Tổng hợp protein - Từ các mARN tổng hợp nhiều loại protein khác nhau, như glycoprotein gai, protein xuyên màng, protein heamaggỉutinin, protein cấu trúc. f- Lắp ráp và giải phỏng - ARN genome cuộn lại, gắn với protein nucleocapsid.

- Các glycoprotein gắn vào màng bộ máy Golgi, nucleoprotein xâm nhập vào bộ máy Golgi, nối và gắn protein bề mặt của virnt, ỉắp ráp tạo virion, sau đó ra khỏi bộ máy Golgi, tạo dung hợp với màng sinh chất để ra khỏi tế bào. ì 9.2.2. ỉ .2. Flaviviridae Thuộc virut Arbo nhóm B gồm các chi: - Flavivirut gồm các virut: + Virut sốt Dengi/ sốt xuất huyết Dengi. + Virut viêm não Nhật Bản. + Virut viêm não do ve. + Virut viêm não St. Louis. - Pestivirut, gồm: + Virut gây tiêu chảy ở bò. + Virut gây tà lợn. - Virut viêm gan c (HCV). a- Cấu trúc Hạt virut được bọc bởi vỏ ngoài đường kính 40-60 nm. Vỏ ngoài có các protein M, protein E. - Capsid dạng khối đa diện, cấu tạo từ các protein c . - Lõi là ARN đơn (+), đầu 5’ gắn mũ, đầu 3’ không gắn đuôi nhưng có trình tự không dịch mã. b- Hấp phụ và xâm nhập - Virut gắn gai vào thụ thể glycoprotein bề mặt và xâm nhập theo kiểu dung hợp hoặc nhập bào tạo endoxom. - pH thấp trong endoxom làm thay đổi cấu hình trong protein E dẫn đến dung hợp với vỏ ngoài với màng endoxom đẩy nucleocapsid vào tế bào chất. - Việc cở vỏ còn chưa rõ. c- Tống hợp protein Bản đồ ARN genome gồm: 5 ’.mũ-UTR-C-prM-E-NS 1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3’UTR-đuôi - NS1 có trong vỏ ngoài và trong lumen 274

- Phức hợp protein không cẩu trúc NS2Ồ-NS3 là proteaz dùng đề cắt các protein khác. - NS4a và NS3 có chửc năng chưa rõ. - Peptidaz tín hiệu cắt các protein còn ỉại. - NS5 là ARN polymeaz phụ thuộc ARN. d- Sao chép genome - NS3 và NS5 hoạt động cùng nhau trong phiên mã. - Cả RF và RI đểu tham gia vào phiên mã rARN. Ở đây RF - dạng sao chép là sợi đôi trung gian được tổng hợp từ sợi đơn; RI - dạng trung gian sao chép là một số ARN được tổng hợp cùng ỉủc ừên cùng 1 sợi khuôn genome. “ ARN virut (vARN tức là genome) được tổng hợp nhiều gấp 10 lần C-ARN (ARN bổ sung). * vARN là khuôn để tổng hợp C-ARN. - mARN gắn mũ vả đuôỉ, để tổng hợp protein virut. - ARN cũng dùng làm genome, e- Lắp ráp và giải phỏng - Tiến hành dịch mã tạo protein vỏ ngoài, gán vảo mảng mạng lưới nội chất và tạo protein cấu trúc. - ARN (cỏ mũ và đuôi) trước hểt tổng hợp sợi ARN (-) tạo sợi ARN kép dùng để phiên mã tạo ARN genome. - Genome cuộn lại, gắn với protein c tạo capsiđ vào màng ỉưới nội chất th#o kiểu nhập bào tại nơi đâ gán protein vỏ ngoài. - Protein pr.M tạo phức với protein E để ngăn cản dung hợp với mảng ừong. - Protein pr.M gắn với protein c để bát đầu nảy chồi vào màng lưới nội chất. - Các hạt virut dược bọc trong bọng ra khỏi mạng lưới nội chất rồi đung hợp với màng tể bào để ra ngoài. - pr.M cắt thành M để virut có thể nhiễm vào tế bào mới.

275

ỉ 9.2.2.1.3. PicoARNvirỉdae Gồm các chi: - Enterovirut: + Poỉio gây bại liệt. + Coxsackia Avà B gây viêm màng não, viêm họng rộp, bệnh Bornholm. + Echo gây viêm màng não. + EV71 gây bệnh tay chân miệng. - CardioviruỊ (ECM) gây viêm não, cơ tim

ờ

gặm nhấm.

- Rhinovirut gây bệnh đường hô hấp trên, cảm lạnh thường. - Apthovirut gây bệnh lở mồm long mỏng ở động vật có móng chẽ. - Hepatovirut gây viêm gan A (HAV). - Parechovìrut typ 1 và 2 gây bệnh ờ người (HPEV 1 & 2). a- Cấu trúc V

>.

* - 4'■■. lv'.. V- > VTí, ■ ■„

■v> fV'if •»rt ^ ừV .

h ’ ỷ-

V r

Virion có kích thước nhỏ (20-30 nm). Capsid dạng khối đa điện, không cỏ vỏ ngoài, chứa các protein VP1, VP2, VP3 nằm trên mặt virion, VP4 nằm bên ưong liên kểt với ARN.

276

Lõi chứa genome ARN đơn, (+) cuộn chặt trong capsid. Ở virut bại liệt đầu 5’ liên kết với peptit vpg (thay cho mũ), đầu 3’ gán đuôi poly (A). Phần mã hoá của genome được chia làm 3 phần PI, P2 và P3. P1 mã hoá cho protein cấu trúc VP1, VP2, VP3 và VP4. P2 mã hoá cho các protein 2A, 2B và 2C. 2A ià proteaz ngăn cản dịch mã của tế bào chủ. 2B và 2C cần cho sự sao chép, trong đó 2C gắn với ARN, có hoạt tính ATP-az và GTP-az. Polymeaz chính của virut là C3Dpro tham gia phân cắt polyprotein nhưng có điểm cắt khác 2a. b- Hấp phụ và xâm nhập - Virut gắn vào thụ thể CD 155 trên bề mặt tế bào, vị trí bám là một “hèm” (canyon) trên bề mặt capsid. - Virut xâm nhập theo cơ chế thực bào, tạo endoxom. - Bơm proton trong endoxom tạo pH khoảng 5, gây biến tính protein capsid, làm thay đổi cẩu hình, lộ ra axit amin kỵ nước (không phân cực). - Các axit amin này tương tác với lớp lipit của màng enđoxom , giải phóng ARN vào tế bào chất. c- Phiên ma, sao chép và dịch mã - Phiên mã và sao chép là cùng 1 quả trinh và sử dụng enzym như nhau. - VPg có chức năng mồi trong sao chép. - ARN genome có chức năng mARN, tham gia dịch mã tạo polyprotein. Polyprotein lại được proteaz phân cắt thành các phân tử đơn lẻ, có chức năng khác nhau. - Protein 3Dpo1 là ARN polymeaz tiến hành tổng hợp sợi ADN (-). Sợi này sau đó được dùng làm khuôn để tổng hợp genome. - Nằm trước vùng mấ hoá ở đầu 5’ là cấu trúc bậc 2 IRES là “bến đỗ của riboxom” nhờ vậy mà quá trinh dịch mã không cần mũ. d- Lắp ráp và giải phỏng. - Trước hết tạo protome 5S gồm VPO, VP1 và VP3 . - 5 protome tạo pentame J2-M S. 12 pentame tạp procapsid 73S, chứa 60 protome. - ARN kết hợp với vỏ capsid tạo provirion 155S. - Khi VPO phân cắt thành VP2 và VP4 thì provừion sẽ trở thành virion hoàn chinh 155S.

277

- Virut được giải phóng do tan bào, đó là hệ quả của việc virut tạo enzym ức chế các quá trình phiên mã, địch mà của tế bào. Virut được phóng thích tiếp tục lây nhiễm vào các tế bàữ khác. 19.2.2. ì .4. Reíroviridae Gồm các chi: ỉ. Avian-ỉeukosis-sarcoma - Virut sarcoma Rous (RSV) gây ung thư ờ gia cầm. - Virut gây bệnh nguyên hồng cầu ở chim (AEV - avian erythroblasttosis vìrut). - Virut gây bệnh bạch cầu tuỷ bào (MC - myelocytomatosis). 2. Mammalian typ-C - Virut gây ung thư bạch cầu chuột Moloney (M oM LV-Moloney murine leukema). 3. ViruttypB - Virut gây ung thư vú chuột (MMTV - Mouse mammary tumor virut), 4. Virut typ D - Virut nhiễm ở khỉ Mason-Pfizer (MPMV - Mason - Pfizer Monkey virut). Virut gây ung thư bạch cầu tể bào T ở người (HTLV - Human T-cell leukemia virut) hoặc ở bò (BLV - borine leukemia virut). 5. Lentivirut - Virut gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV-1, HIV-2), Visna/Msedi. 6. Spumavirut - Virut tạo bọt ở người. a- Cấu trúc

- v ỏ ngoài có nguồn gốc từ màng sinh chất với các protein: + Protein gai gp 120. + Protein gai gp 41. Hai glycoprotein này gắn với nhau nhờ liên kết s - s để tạo gp 160. + Protein vỏ ngoài P17 - P18. - Capsid dạng khổi trụ, chứa protein capsid P24 - P25. - Lõi: + Genome lả 2 sợi ARN đơn. (+) giống nhau. + Chứa protein nucleocapsid P9 - P7 gắn quanh genome. + Chứa enzym phiên mã ngược (RT), integraz, Proteaz. b- Hẩp phụ và xâm nhập của HỈV - Protein gai gp 120 gắn vào thụ thề đặc hiệu trên bề mặt té bào, ví dụ CD4 của tế bào T. - Tiến hành dung hợp thông qua trung gian là vùng kị nước của protein màng TM. - Tuỳ thuộc vào loại virut và tế bào chủ, sự dung họp cũng xảy ra sau khi virut vào tế bào theo con đường nhập bào. - Virut cởi vỏ và nucleocapsiđ vào tể bào chất. c~ Phiên mã ngược - Phiên mã ngược xảy ra bên trong nucleoprotein trong tế bào chất. - Sơ đồ ARN (+). Mũ-R-Ư 5 -PB s -gag-pol-env-U3 -R-AA AA

mARN có mũ và đuôi poỉy A. -1 phân tử tARN cùa tể bào đặc hiệu cho mồi loại virut gán. vào trinh tự tương bù tại vị trí gắn mồi (PBS) và tiến hành phiên mă ngược tạo cADN. - Enzym RT hoạt động nhu một ADN polymeaz phụ thuộc ARN và cũng có hoạt tính ribonucleaz H. + Bước nhảy ỉ: Trình tự R của cADN nhày sang bắt cặp với trình tự R của ARN và tổng hợp cADN. + Ribonucleaz H phân huỷ toàn bộ genome ARN cũ chỉ còn để lại một mẫu ngán (trình tự p+) tại vùng env để làm mồi. + Enzym RT bát đầu tổng hợp sợi ADN (+) về phía U5 để tổng hợp U3 R U5. + Bước nhảy 2: đoạn Ư3-R-Ư5-PBS nhảy để PBS của ADN (+) bắt cặp với PBS của ADN (-).

279

+ Cả 2 sợi đều được kéo dài tạo phân tử ADN kép provirut với 2 đâu là 2 đoạn lặp đảo chiều LTR (long terminal repeats) gồm U3-R-U5. d- Gắn vào nhiễm sắc thể - Protein nền matrix có vai trò vận chuyển ADN vào nhân. - Provirut trong nhân khép vòng. - Intergraz tạo điểm đứt sole trong ADN tế bào chủ tại trình tự nhận diện provirut (att). - ADN virut được cài xen vào ADN vật chủ tạo phân tử lai. - Các bazơơ không bắt cặp sẽ bị ỉoại bỏ và một đoạn khuyết ngắn sệ được lấp đầy nhờ ADN polymeaz. Kết quả là loại ra 4 cặp bazơơ khỏi ADN provirat. e- Sao chép genome và dịch mã - Một khi được cài xen, genome virut nằm dưới sự kiểm soát của tế bào chủ và được phiên mã nhờ ARN polymeaz II của tế bào. - Đoạn U3 chứa promoter và enhancer. Phiên mã (cũng là sao chép) bắt đầu từ vị trí +] của trình tự R tạo bản sao mARN 35S giống với genome virut, được gẳn mũ và đuôi poly (A), vừa dùng để dịch mã tạo protein dùng làm genome. - Nhờ dịch khung (frameshift) mà tạo thành poly protein gag-pol. - Proteaz của virut phân cat polyprotein thành các protein cấu trúc và không cấu trúc riêng lè. - Sự cắt nối tạo mARN 24 s, gắn mũ, đuôi để mã hoá cho protein env (protein vỏ ngoài). - Gen gag được ưu tiên dịch mã nên protein cấu trúc vượt trội protein không cấu trúc. Cáe protein tích luỹ trong tế bào chất trong đó 1 sổ bị cắt trong quá trình chế biến sau lắp ráp. f- Lắp ráp và giải phỏng - Các thành phân khác nhau của virut liên kêt với nhau cả trước khí polyprotein bị căt thành các protein riêng lẻ. - Hai sợi ARN (+) liên kết cộng hoá trị với nhau tại đầu 5’ và gắn với nucleoprotein. - Protein capsid gắn với protein nền M và với nucleoprotein, - Protein vỏ ngoài cài sẵn vào màng sinh chất. Nucleocapsid nảy chồi ra ngoài.

280

ỉ 9.2.2. ỉ .5, Togaviridae Gồm các chi: - Aỉphavirut có các virut viêm não ngựa Miền Tây, viêm não ngựa Miền Đông, viêm não ngựa Venezuela, virut rừng Semliki, virut Sindbis và gây nhiễm ở động vật không xương sống. - Rubivirut: virut Rubella (sởi Đức). - Pestivirut: virut gây tiêu chảy bò, tả lợn. - Arterìvirut: virut viêm động mạch ngựa, a- Cấu trúc

-

Virut có kích thước trung bình (50-70nm). v ỏ ngoài rất dầy với các gai cấu tạo từ

các protein E l, E2, E3.

+ Capsid: dạng khối đa diện cấu tạo từ các protein c. Đầu c hình thành giá đỡ cứng ở phía ngoài của capsid lõi. + Lõi: ARN đom, (+) đầu 3’ và 5’ cỏ các đoạn tương bù nên bắt cặp với nhau.

281

ố- Hấp phụ và xâm nhập - Gai glycoprotein gắn vào protein thụ thể bề mặt của tế bào mà bản chat còn chưa rõ. Dùng kháng thể gắn E2 thì virut không vào tế bào được. - Virut vào tế bào theo cách nhập bào, tạo endoxom. - Endoxom dung hợp với lyzoxom. pH thấp trong endoxom làm thay đổi cấu hình protein El và E2 dẫn đến đung hợp màng, giúp virut thoát ra tế bào chất. - Riboxom gắn trên protein c dẫn đến cởi vỏ. c- Phiên mã và dịch mã sớm

- Dịch mã từ bộ 3 AUG tạo protein pl234, là do đọc mã vượt qua cođon đừng. - Enzym cắt protein pl234 để được 4 protein: + NSpl cỏ hoạt tính polymeaz cho cARN và ARN mũ của virut. + NSP2 là protein dùng cắt polypeptit, có hoạt tính polymeaz cARN và tổng hợp ARN 26s dưới genome. + NSP3 là protein được photphoryl hoá, chưa rõ chức năng. + NSP4 là ARN polymeaz phụ thuộc ARN, protein 123 cắt thành 3 protein, trong đó protein thứ 2 là proteaz dùng để cẳt polypeptit. d- Sao chép genome - Dịch mã tạo protein NS (không cấu trúc). - Protein NS hình thành phức hợp với ARN polymeaz để tạo ARN (-) từ sợi ARN kép trung gian, tiến hành phiên mã tạo vARN và mARN (gán mũ và đuôi) để tổng hợp protein. - Phiên mã mARN 26S e- Phiên mã và dịch mã muộn - Từ V-ARN phiên mã tạo sợi ARN kép trung gian để phiên mã tạo mARN, gắn mù và đuôi. - Dịch mã tạo các protein E l, P62,E2 và3), gắn vào màng mạng lưới nội chất, El, P62, E2 và E3 kết hợp với nhau tạo gai bề mặt dạng trime.

282

f- Lắp ráp và giải phóng: - Protein cấu trúc (C) gán với vARN để tạo provirion, xâm nhập vào mạng lưới nội chất, theo kiểu thực bào, sau đó hoàn thiện tạo virion, ra khỏi mạng lưới nội chẩt tạo bọng rồi ra khỏi tế bào nhờ dung hợp màng bọng với màng sinh chất. Ỉ9.2.2.2. VirutARNđơn, âm Ba họ đại điện là Rhabdoviridae, Orthomyxoviridae và Paramyxoviridae. ỉ 9.2.2.2. Ị- Rhabdovỉridae Có 2 chi là: (1) Vesiculoviriit gây bệnh chốc mép và ở động vật không xương sống. (2) Lyssavirut gây bệnh đại, ngoài ra virut này cũng gây bệnh ở thực vật. a- Cẩu trúc Virut có hình viên đạn, kích thước 70x170nm. 'V ỏ ngoài là lipoprotein. Trên bề mặt có protein G, tạo gai glycoprotein. Bên trong vỏ ngoài là ỉớp protein nền (M). - Nucleocapsid xoắn, gồm các protein: Protein nucleocapsiđ (N) gắn với genome, Photphoprotein (P), protein L. - Lõi chứa ARN đơn, (-) với đầu lặp đảo chiều cho phép bắt cặp với nhau tạo cấu trúc cán chảo. - ARN polymeaz phụ thuộc ARN gắn vào cấu trúc lõi. b- Hấp phụ và xâm nhập - Virut gắn protein G vào thụ thể bề mặt, chua rõ bản chất, của tế bào, có thể là photohatidyl serin. - Khi gắn không cần năng lượng nhưng khi xâm nhập cần 37°c. Nếu ở 10°c thì không xâm nhập được. - Virut vào theo iối nhập bào tạo endoxom. Endoxom dung hợp với lyzoxom. - pH thấp trong endoxom cảm ứng để vỏ ngoài virut dung hợp với màng endoxom và giải phóng nucleocapsid vào tế bào chất.

283

- Phiên mã và sao chép genome tiến hành trong cấu trúc nucleocapsid lối. c- Phiên mã mARN - Trong tế bào chất gARN kháng enzym ribonucleaz khi tạo phức với protein N.

- Protein L cùng với protein p và các yếu tố của tế bào tạo phức hợp gắn vào đầu 3’ phức hợp tự photphoryl hoá. - Phiên mã bắt đầu từ đầu 3’ và kết thúc sau khi gắn đuôi poỉy (A) vào gen đầu tiên, tạo ra nhiều loại mARN để tổng hợp protein N, p, M, G và L. - Tổng hợp protein: + Từ các mARN tương ứng tổng hợp các protein N, p, M, G, L. + Protein G cài vào màng mạng lưới nội chất, tạo bọng rồi mang ra gắn vào màng tế bào chất. + Protein M sắp xếp sát màng tế bào và gắn với protein G. d- Sao chép genome - Khi lượng protein N tăng lên sẽ phong bế vị trí khởi đàu phiên mã trên genome (vARN). - Sợi mARN có chiều dài đủ (bằng genome) được tổng hợp nhờ phức hợp polymeaz. + Các yếu tố của tế bào chủ có vai ứò quan trọng trong sao chép genome virut. + Lượng protein p tăng lên là cần thiết đối với quá trình sao chép. + Hầu hết gARN nhanh chóng tạo cấu trúc ribonucleoprotein. Một sổ gARN dùng để phiên mã mARN. e- Lẳp ráp vỏ giải phóng - Phức hợp ribonucleoprotein lỏng lẻo liên kết với protein M, ngăn cản sự sao chép và phiên mã của virut. - Khi cỏ nhiều protein M hơn, nó sỗ gán vào ribonucleoprotein xoắn chặt, ngăn cản sự phiên mã và đưa chúng tới màng sinh chất để nảy chồi ra ngoài. 19.2.2.2.2. Orthomyxoviridae Gồm 1 chi Orthomyxovirrus với các virut cúm A, B, c , cúm gia cầm H5N1,... a- Cẩu trúc

Virut đa hình thái, đường kính 80-120nm - Vỏ ngoài có các protein sau: + Protein heamagglutinin (HA) hay gai H, gồm 2 tiểu đom vị HAI và HA2. Virut cúm A có 16 gai H. + Protein neuraminidaz (NA) hay gai N. Virut cúm A có 9 loại gai N. + Protein kênh ion M2. + Protein nền M l. - Capsid dạng xoắn gồm phức hợp ribonucleoprotein (RNP), chứa các protein: Protein nucleocapsid (NP), protein polymeaz (PA), protein polymeaz (PB1), protein polymeaz (PB2). Genome là ARN đon, âm, phân đoạn. Cúm A và B gồm 8 đoạn, cúm c có 7 đoạn ARN. b- Hấp thụ và xâm nhập - Gai H bám vào thụ thể là axit sialic ừên màng tế bào, rồi xâm nhập vào tể bào theo lối nhập bào, tạo endoxom rồi dung hợp với lyzoxom. - pH thấp trong endoxom giúp protein dung hợp (protein F) nằm ẩn phía trong gai H chồi lên, cắm vào màng endoxom để đẩy nucleocapsid vào tể bào chất. Enzym từ lyzoxom cũng có thể phân giải màng endoxom. - Nucleocapsid vào nhân, tỉển hành phiên mã và sao chép trong nhân. c- Phiên mã Phức hợp polymeaz gồm PA, PB1 và PB2. - ARN virut gắn vào các vị trí gắn đầu 3’ và 5’ trên PB1, ARN của tế bào gắn vào PB2.

285

- Virut chiếm đoạt mũ ở đầu 5’ của mARN của tế bào để làm mồi cho mARN của mình nhờ enzym exonucleaz, vì thế nên mới phải chui vào nhân. - Tạo raARN rồi ra khỏi nhân. d- Tồng hợp protein - Tiến hành tổng hợp các loại protein của virut ở ngoài tế bào chất sau đó chui vào nhân để tạo nucleocapsid. e- Sao chép genome Khi protein NP tích luỹ nhiều, chúng sẽ bám và phong bế mũ ở đầu 5’ và các gốc 4-7 A trên ARN của virut, ngăn chặn sự lặp lại của các gốc u của vARN và tạo thành cARN (tức sợi ARN + bổ sung). - cADN được protein NP bao quanh dẫn đến việc phức hợp polymeaz mất đi protein PA và tiến hành sao chép vARN từ khuôn cARN mới tổng hợp. - vARN được bao bởi protein Np để tạo nucleocapsid. f- Lắp ráp và giải phóng - Phửc hợp RNP hình thành ữong nhân, cùng với protein MI được khuếch tán thụ động vào nhân đồng thòi cũng có sự gắn protein bề mặt virut vào màng sinh chất của tê bào. - MI gắn với RNP dẫn đến vận chuyển ra khỏi nhân. - Protein NA cắt gốc axit sialic để giúp virut nảy chồi thoát khỏi tế bào. 19.2.2.2.3. Paramyxoviriđa Gồm các chi: - Paramyxovirut gồm virut Sendai (á cúm typ 1 ở chuột), á cúm typ lvà 3 ở người. - Rubeỉavừut gồm virut quai bị, Newcastle, á cúm typ 2, 4a, 4b ờ người. Có protein HN. - Morbiỉỉìvirut gồm sỏi, dịch sốt chó (canine distemper). Có gai H nhưng không có gai N. - Pneumovirut, virut hợp bào hô hấp ở người (HR.SV - Human respiratory syncytial virut). Không có gai H và N.

286

a- Cẩu trúc Virut có kích thước 125-250 nm. - Vỏ ngoài gồm các protein: + Protein F (dung hợp). + Protein heamagglutinin neuraminidaz (HN) có hoạt tính gắn và cắt axit nucleic. + Protein nền (M) nằm ngay dưới vỏ ngoài. - Nucleocapsid dạng xoắn gồm: + Genome là một phân tử ARN đơn, (-). + Protein nucleocapsid (NP) bao quanh genome, liên kết với protein M và các protein L và p. + Protein lớn (L) cỏ hoạt tính polymeaz. + Photphoprotein (P). b- Hẩp thụ và xâm nhập - Virut gắn gai HN vào thụ thể bề mặt là axit sialic của tế bào ở pH trung tính. - Protein F được proteaz của tế bào chủ cắt và cho phép dung hợp vói màng tế bào để đưa nucleocapsid vào tế bào chất. - Protein M gắn vào protein NP, ức chế tổng hợp mARN và điều này phải được thực hiện trước khi phiên mã sớm. c- Phiên mã mARN - Các gen trên gARN tách biệt nhau nhờ trình tự gắn nằm giữa các gen gọi tát là -ICS (short intercisừonic nucleotit sequences). Đây ỉà ARN đa gen (polycisữon).

- Các sàn phẩm của các gen chồng lởp và tiếp đỏ là các sản phẩm của các gen p/c/v /D dùng ừong điều hoà chu trinh nhân lên. - Phiên mã tiến hành trong cấu trúc RNP lõi, bắt đầu tại đầu 3’ và kết thúc khỉ thêm đuôi poly (A) vào gen đầu tiên. 287

\

- số lượng bản sao mARN nhiều hay ít tuỳ thuộc vào sự tái khởi động phiên mã. Phiên mã hết gen này rồi đến gen khác rồi quay lại tái khởi đầu phiên mã để được các protein NP, p, M, F, HN và L. d- Tổng hợp protein - Tiến hành tổng hợp protein từ mARN trong tế bào chất. - Protein F và Hn cài vào màng mạng lưới nội chất, hỉnh thành bọng rồichuyển đến gắn vào màng tế bào. - Protein M liên kết với protein gai trong màng tế bào chất. - Protein NP phong bế vị trí khỏi đầu và ICS cho phép bắt đầu phiên mãsợi cARN (ARN tương bù). e- Sao chép genome - Từ sợi gARN (-) làm khuôn tổng hợp sợi tương bù cARN (+), rồi đến lượt cARN mới sinh ra làm khuôn để tổng hợp genome ARN. - gARN mới sinh lại làm khuôn để tổng hợp mARN và thêm nhiều cARN. - gARN liên kết với các protein NPt p và L để tạo cấu trúc lôi. /- Lẳp ráp vờ gỉảì phỏng - Protein NP gắn vào vị trí đặc hiệu bao quanh ARN tạo nucleocapsid nảy chồi ra ngoài. - Các protein heamagglutinin - neuraminidaz (HN) cắt axit sialic năm trên bề mặt tế bào cho phép virut thoát khỏi tế bào. ĩ 9.2,2.2.4- Reoviridae Bao gồm các chi: - Orthoreovirut. Virut reo typ 1 ở người. - Rotavìrut. Virut rota gây bệnh tiêu chảy ở trẻ em. - Orbỉvirut. Virut gây bệnh lưỡi xanh ở gia súc, virut gây bệnh sốt Colorado do ve - Phytoreovirut. Virut bệnh lúa lùn, virut khối u ờ thực vật. a- Cẩu trúc Virut có đường kích trung bình (60-80nm) không có vỏ ngoài, capsid gồm 2 lớp vỏ: - Vỏ capsid ngoài cấu tạo gồm các capxom và các tiểu đơn vị:

288

s

61 - protein hấp phụ.

s

Ịil và (J.16 - protein capsid ngoài.

s

53 - protein capsid ngoài.

- v ỏ capsid trong chứa các protein: s

Ằ.1 - protein capsid ừong (nằm ở bề mặt trong của capsid trong).

S

a2 - protein capsid trong.

s

ịx2 - protein lõi.

s

a4 - protein không cấu trúc.

•S ịj.3 —protein không cấu trúc. ■S Xi - ARN polymeaz. - Genome gồm 10-11 phân tử ARN kép: ✓ LI, L2 và L3: ARN kép dài. s

M l, M2 và M3: ARN kép trung bình.

✓ SI, S2, S3 và S4: ARN kép ngắn. b- Hấp phụ và xâm nhập - Gai VP4 của virut bám vào thụ thể bề mặt glycophorin - A của tế bào lông ruột. - Virut vào tế bào theo cỏ chế nhập bào qua trung gian thụ thể, tạo endoxom. - Màng endoxom dung hợp với màng lyzoxom. Enzym lyzoxom phân giải vỏ capsid ngoài, giữ lại vỏ capsid ừong và tìm cách thoát vào tế bào chất. c- Phiên mã và sao chép - ARN polymeaz phụ thuộc ARN do virut mang theo được hoạt hoá khi vỏ ngoài bị phân huỷ bởi enzym proteaz. - ARN tiến hành phiên mã tạo mARN ứên khuôn sợi ARN (-). Quá trình thực hiện bên trong vỏ capsid. - mARN có 2 chức năng: mARN và ARN khuôn để tổng hợp sợi tương bù cho genome. - mARN được đẩy qua kênh nằm ở đỉnh capsid vào tế bào chất. d- Dịch mã - mARN tổng hợp trên riboxom các loại protein cấu trúc và không cấu trúc (enzym). - Protein cấu trúc lắp ráp tạo vỏ capsid trong, bao quanh 11 đoạn ARN (+). Tiếp đó sợi ARN (+) đuợc dùng làm khuôn tạo sợi ARN (-) tương bù đẻ được genome ARN kép.

289

e- Lap ráp và giải phóng ~ Protein cấu trúc lắp ráp tạo vỏ capsid ngoài bao quanh capsid trong, tạo virion hoàn chỉnh, phá vỡ tế bào ra ngoài. Tế bào lông ruột bị phá huỷ, gây tiêu chảy. 19.2.3. Bacteriophage Bacteriophage (Bacterriophage), viết tắt phage (phage), là virut kí sinh ở vi khuẩn. Genome của chúng cỏ thể lả ADN hoặc ARN, với kích thước nằm trong khoảng từ 2,5 đến 150kb. Phage có thể có chu ưình sống đcm giản - chu trình tan hoặc phức tạp - chu trình tiềm tan, ở đó genome của chúng được cài vào NST của tế bào hoặc hoạt động theo phương thức chuyển vị. Phage được phát hiện từ đầu thế kỷ XX, một cách độc lập, bởi hai nhà khoa học là Twort (1915) và d’Herelle (1917). Phage được nghiên cứu rất sâu rộng như là một mô hình về virut và như một công cụ để phát hiện những kiến thức cơ bản đầu tiên về ADN (ADN là vật chất di truyền, xác định mật mã di truyền, sự tồn tại cùa mARN và nhiều khía cạnh sinh học phân tử cơ bản khác).

Vì phage kí sinh ở Prokaryota nên chúng thường có trinh tự quan trọng giống như tế bào chủ. Do vậy, chúng còn được sử dụng như là mô hình đơn giản cho nhiều khía cạnh sinh học phân tử khác nhau của Prokaryota. Phage được sử dụng phổ biến như là vectơ tách dòng, liệu pháp gen, sản xuat vacxin. Nhiều enzym do phage mã hóa được dùng trong kỹ thuật đỉ truyên đe noi các đoạn gen và biểu hiện gen trong tế bào Prokaryota...

* Các quả tìn h nhãn lên ở bacteriophage

v ề cơ bản, các bước nhân lên của các bacteriophage trong tế bào vi khuẩn là giống nhau. Tuy nhiên, cũng có những khác biệt ở từng loại. Một số nhân lên theo chu trình tan, số khác lại nhân lên theo chu trình tiềm tan. a. Hẩpphụ'. Trong môi trường địch thể, phage ờ trạng thái chuyển động tự do. Do va chạm ngẫu nhiên, phân tử protein ở đầu mút sợi lông đuôi gắn đặc hiệu vào thụ thể - phân tó polysaccharit, trên bề mặt màng ngoài của E.coỉi. Mỗi loại phage gắn vào một loại thụ thể, có thể là polysaccharit trên bề mặt tế bào Gram (-) hoặc axit teichoic của vi khuẩn Gram (+), số khác chỉ gắn được vào đầu mút của pilì F. b. Xâm nhập: Phage tíểt lyzozim phá hủy peptídoglycan. Bao đuôi co lại, ổng trục đâm xuyên qua thành tế bào, đẩy axií nucleic vào trong tế bào. c. Tổng hợp các thành phần: Sau khi axit nucleic vào tế bào là thời kỳ ẩn (eclipse period). Không có bất kỳ một virion nguyên vẹn nào được tạo thành. Genome của virut kiểm soát bộ máy tổng hợp của tế bào, ngân chặn sự tổng hợp bình thường của tế bào để chuyển sang tổng hợp các thành phần của phage bao gồm tổng hợp genome và protein (y như kẻ xâm lược trong một quốc gia không phòng thủ). d. Lắp ráp: Các bộ phận đầu, đuôi, lông, v.v. được tạo thành ờ các nơi khác nhau như trong phân xưởng, sau đó lắp ráp ngẫu nhiên với nhau. Genome ADN được tạo thành nhờ ADN polymeaz mới tổng hợp sau đó chui vào lõi để tạo virion hoàn chỉnh. e. Phỏng thích: Lyzozim do phage tổng hợp phá hủy peptidoglycan thành tế bào. Khi thành tế bào bị phá hủy, sự thẩm thấu sẽ làm cho tế bào trương lên và vỡ ra. Phage giải phóng ra môi trường xung quanh để lặp lại chu trình nhân lên ở tế bào mới. Sau đây là một sổ phage có tầm quan ừọng trong thực tiễn.

(1) Phage M13 Phage cỏ dạng sợi, chứa genome ADN (+) đơn, khép vòng, với kích thước 6,4Kb. MI 3 gắn đặc hiệu vào pili F (pili được mã hóa bời plasmit, gọi Jà yếu to F, chi có ở tế bào “đực”) của E.coỉi thông qua protein phụ (g3p) nằm ữên vỏ ở đầu sợi phage. Sự gắn này cảm ứng làm thay đổi cấu trúc của protein chính tạo nên vỏ capsid khiến toàn hạt co ngắn lại tạo động lực bơm ADN vào tế bào chất. ADN polymeaz của tế bào tổng hợp một sợi bổ sung tạo ADN kép dạng sao chép (RF). Genome gồm 10 gen nằm sát nhau, có một vùng xen nhỏ (intergenic region) ở đó chứa điểm khởi đầu sao chép (ori). Phiên mã xảy ra (vẫn nhờ enzym cùa tế bào chủ) tại bất kỳ một ứong số vài promoter, cho đến khi gặp một trong hai điểm kết thúc (terminator). Quá trình này dẫn đến những gen nằm gần điểm kết thúc được phiên mã nhiều hơn so với các gen nàm xa, và đây cũng là phương thức chủ yếu

291

trong việc điều hòa sự b ểu hiện gen của phage M I3. Tất cả RF đều được tổng hợp như tổng hợp ADN kép bình thường, nhưng sự khởi đầu sao chép cần phải cắt đứt sợi (+) nhờ enzym endonucleaz (sản phẩm của gen 2) để hở đầu 3’-OH, mà không cần mồi. Từ mỗi RF liên tục tạo ra các sợi ADN (+) dành cho đóng gói tạo virion. Các sợi này không dùng được làm khuôn tạo sợi ADN (-) vì ngay sau khi được tồng họp, chúng đã được bao bọc bời protein, sản phẩm của gen 5. cấu trúc này được chuyển ra màng tế bào, ở đó ADN bám vào protein chính của capsid trên màng tế bào rồi chui ra theo loi nảy chồi mà không phá vỡ tế bào. Vi khuẩn nhiễm M I3 vẫn tiếp tục sinh trưởng và phân chia, cho dù với tốc độ thấp hon, tạo ra thế hệ tế bảo mới và giải phóng MI 3. Lượng ADN được chui ra là khác nhau, nên các hạt có kích thước khác nhau. Trong quần thể luôn có những hạt mang nhiều genome và những hạt mang một phần genome. Nhờ cách nhân lên kỳ lạ và cấu tạo genome đặc biệt mà M I3 được sử dụng có hiệu quà trong công nghệ sinh học: - Genome là chuỗi đơn nên được dùng trong giải trình tự. - Dạng trung gian RF (ADN kép khép vòng) như ỉà một plasmit nên được dùng làm vectơ tách dòng. - Không có sự hạn chế về kích thước genome nên có thể gắn một đoạn ADN ngoại lai lớn. - Do không làm tan tế bào, nên có thể duy trì và liên tục tách chiết một lượng lớn ADN tách dòng.

(2) Phage T7 Cũng như các phage khác, T7 cũng có đầu hình khối đa điện gắn với một đuôi ngắn với 6 sợi lông đuôi. Phage T7 có kích thước nhỏ, có genome là ADN kép (khoảng 40 Kb) dạng thẳng. Trước hết đầu mút sợi lông đuôi gắn vào thụ thể LPS trên màng sinh chất. Khi xâm nhập, một đau của genome (gọi là đâu trái) bao giờ cũng đi vào trước, do vậy bản đồ genome đuợc chia theo phần trăm tính từ đầu trái. Ngay sau khi genome vào tế bào chất, ARNpolymeaz phụ thuộc ADN bình thường của E.coli nhận ra 3 promoter của các gen sởm ngay, nằm giữa vị trí 1% và 2%, ở đầu 3’ của genome. Tất cả các sàn phẩm của các gen sớm đều tham gia vào sự điều khiển làm dừng phiên mã của tế bào chủ, chuẩn bị cho sao chép và biểu hiện genome virut.

292

Bản phiên mã sớm được ribonucleaz III của tế bào chù phân cắt thành các mARN, trong đó có mARN mã hóa cho protein kinaz (gp0,7) dùng để photphoryl hóa và làm bất hoạt ARN polymeaz của vật chủ, ngăn cản sự phiên mã của các gen sớm khác. Và tổng hợp một ARN polymeaz (gpl) dùng để phiên mã các gen nằm ở giữa, tham gia vào sao chép ADN T7 và các gen muộn tham gia vào lắp ráp và làm tan bào để giải phóng virut. Các sản phẩm khác, gp2, cũng gắn vào ARN polymeaz của tế bào để làm bẩt hoạt enzym này. ARN polymeaz của T7 có tính đặc hiệu cao với promoter T7, nên ức chế ARN polymeaz của tế bào và dành toàn bộ hoạt động phiên mã cho T7. Sự sao chép genome T7 gồm 3 giai đoạn: a. Khởi đầu diễn ra tại một vị trí nằm ở đầu trái của genome. ARN polymeaz (gpl) của T7 tổng hợp một mồi ngắn từ các protomer tại vùng khởi đầu dùng cho bước khởi đầu. b. Kéo dài từ mồi theo 2 hướng, do 2 enzym gp5 và gp7 của T7 xúc tác. Protein gp5 gắn với thioredoxin để tạo một ADN polymeaz dùng cho tổng hợp ADN từ mồi, theo hưởng 5’ - 3’, do đó tạo thành sợi muộn. Protein gp4 là enzym đa chức năng, có hoạt tính pimaz, helicaz và NTP-az, nó gắn vào mạch ADN đơn duỗi xoắn của phân tử ADN mẹ và chuyển dịch theo hướng 5’ - 3' của ADN nhợ thuỷ phân NTP. Sự mờ xoăn của chuỗi ADN mẹ theo hướng chạc sao chép. Khi gặp vị trí đặc hiệu nhận biết primaz, gp4 sẽ tổng hợp các mồi tetraribonucleotit (pppApCpCpC hoặc pppApCpCpA). Các mồi này cung cấp đầu 3’-OH để khởi đầu tổng hợp sợi muộn nhờ ADN polymeaz của T7. Protein gp3 là một endonucleaz vả gp6 là một exonucleaz tiến hành phân giải ADN vật chủ để cung cấp các nucleotit làm nguyên liệu cho tổng hợp ADN T7. Gp6 vả ADN polymeaz I của vật chủ tham gia vào loại bỏ mồi mARN. c. Sự tạo thành phân íửADN trùng lặp (concatemer) Do phân tử ARN mồi ở đầu 5’ bị loại bỏ trước khi hoàn thành sao chép, nên mỗi phân tử ADN kép mới tạo thành, cỏ một đoạn ở đầu 5’ không được sao chép và tương ứng với nỏ ờ đầu 3’ của mạch tương bù là đoạn đơn. Các đoạn đcm này của hai chuỗi có trình tự lặp lại cùng chiều, nên có thể gắn với nhau, tạo phân tử ADN đúp (bimolecule). Những chỗ hở được tổng hợp bổ sung và nối với nhau nhờ ligaz. Concateme được endonucleaz T7 (gp3) cắt tại các vị ừí đặc hiệu ờ cả hai phía tạo thành các đoạn đầu sole, sau đó ADN polymeaz hoàn tất đầu mạch đom (sole) thành phân tử kép đầu bằng, có kích thước của genome J l . Phage trưởng thành thoát khỏi tế bào nhờ lyzozim (gp3,5) làm tan bào. Đáng chú ý là ARN polymeaz rất đặc hiệu với promoter T7, cho nên cỏ thể tiến hành phiên mã bất kỳ trình tự ADN nào nếu có promoter T7. ARN polymeaz của T7 có khả năng phiên mã mạnh gấp 5 lần ARN polymeaz của £ coỉi, do đó thường được đùng để biểu hiện gen trong E. coỉi.

293

(3) Phage T4 T4 là một phage T chăn, có kích thước lớn. Genome là ADN kép, dạng thẳng, chứa khoảng 100 gen với kích thước 1,7x1 o8 bp. Chu trình nhân lên bắt đầu khi lông đuôi bám vào thụ thể bề mặt của E. coỉi, tiết lyzozim phân giải peptidoglycan thành tế bào, rồi bơm ADN vào trong tế bào. Mặc đù genome là dạng thẳng nhưng trong quần thể, các virion chứa genome có ưình tự thay đổi theo kiểu vòng tròn, tức là đổi đầu quay vòng (circular permutation) và có hai đầu lặp lại cùng chiều. Do vậy đề dễ hình dung, người ta thường biểu diễn bản đồ gen của T4 là một vòng ừòn. Ví dụ các virion có thể chứa các genome cỏ trình tự sau đây: ABCDEFGAB. CDEFGABCD, EFGABCDEF, GABCDEFGA,... Một trong những gen được dịch mã đầu tiên là enzym dùng để chặt nhò ADN của tế bào chủ, nhưng không động chạm đến ADN của phage, bởi vì bazơơ cytosin thông thường trong ADN đã được thay thế bởi một bazơơ c cải biến, 5-hydroxy metylcytosin (HMC). HMC bắt cặp với guanin nên không làm thay đổi chức năng khuôn cùa virut, nhưng sự có mặt cùa nó giúp cho enzym virut phân biệt được axit nucleic của viruí với của tế bào chù. Sự cải biến này làm cho ADN cùa phage kháng lại nhiều enzym giới hạn của tế bào chủ. Tuy nhiên, các nhóm hydroxyl của 5-HMC được cải biến bằng cách thêm gốc glucozơ, ADN đã glucozyl hoá này kháng lại hầu như tất cà các endonucleaz của tế bào chủ. Toàn bộ cho trình từ lúc bắt đầu tiếp xúc với bề mặt tế bào đến khi làm tan tế bào kéo dài 20-30 phút ở 3°c, trong đỏ tổng hợp ADN bắt đầu khoảng 5 phút sau khi nhiễm. Genome T4 gồm 3 nhóm gen sớm ngay, gen sớm sau và gen muộn. - Gen sớm ngay được phiên mã nhờ ARN polymeaz (bỉnh thường otapp’ và §) đã được cải biến cùa tế bào để tạo cảc protein điều hoà. Khi xâm nhập, một protein (sản phẩm của gen alt (alteARNtion) của T4) được đưa vào tế bào chủ cùng với ADN để cải biến trình tự ARN polymeaz E. coli, làm giảm ái lực của yếu tố 6 với enzym lõi (a a ịỉp ’) khiến yếu tố nảy không nhận diện được promoter của E. coỉỉ dẫn đến cản trở phiên mã của tế bào, nhưng lại nhận diện được promoter gen sớm của T4 để tiến hành phiên mã. - Gen sớm sau mã hoá cho enzym ADN polymeaz tham gia và sao chép và phiên mã của virut. - Gen muộn mã hoá cho các protein cẩu trúc (đầu, đuôi, lông) và enzym dùng để giải phỏng phage khỏi tế bào. Sự sao chép ADN diễn ra tương tự như ở phage T7. Phân tử mới được sao chép có đâu thừa tận cùng tại đau 5’ của cả hai phân tử con. ARN mồi không được thay thế bởi ADN, do đó ở đầu 3’ đối diện là đoạn ADN đơn. Các bazơơ bổ sung ở đầu 3’ của 2 phân

294

tử trùng lặp (concateme). ADN ligaz hàn các chỗ đứt. Enzym giới hạn cắt phân tử ADN concateme thành các đoạn bằng nhau tạo genome đổi đầu quay vỏng. Phiên mã genome muộn hoàn toàn phụ thuộc vào sự có mặt của ADN mới tổng hợp, là dạng có cấu trúc lỏng lẻo thuận lợi cho phiên mã. Ba peptit, sàn phẩm của các gen T4 (33,45 và 55) gắn vào ARN polymeaz với các chức năng là các chất hoạt hoá gen (gen activators) giúp nhận diện promoter gen muộn. Quá trình lắp ráp và giải phóng diễn ra như ở các phage T khác. Tể bào bị phá võ, giải phóng 100-200 hạt phage. ADN-ligaz của T4 là enzym xúc tác cho phản ứng tạo liên kết photphodieste giữa 3’OH và 5’-P liền kề của phân tử ADN và ARN sợi đôi. Do enzym này có khả năng nối các đoạn ADN có đầu so le hoặc đầu bằng, nên được sử dụng rộng rãi trong tách dòng và cải biến ADN.

(4) Phage lamda Phage lamda là virut ôn hoà có cấu tạo giống T4, nhưng đuôi của nó chỉ có một sợi lông ngắn. Đầu chứa ADN kép, dạng thẳng. Sự lây nhiễm bắt đầu khi sợi lông đuôi gắn vào thụ thể bề mặt của E. coỉi, sau đó tiêm ADN vào tế bào chất. ADN của viron là sợi kép, dạng thẳng nhưng 2 đầu là mạch đơn và bổ sung cho nhau, gọi là đàu dính (cohesive end), viết tắ là COS. Ở trong tế bào chủ, hai đầu genome nhanh chóng gắn vào nhau tạo phân tử dạng vòng. Điều gì xảy ra tiếp theo là tuỳ thuộc phương thức sinh sản, chu trình tan hay chu trình tiềm tan. Chu trình tan về cơ bàn giống với T4, nhưng ở đây chia làm giai đoạn. - Gioi đoạn /: Từ điểm khởi đầu Ori, tiến hành sao chép theo hai hướng đối diện nhau, theo kiểu theta và kết thúc khi 2 chạc ba gặp nhau, để tạo nhiều khuôn cho phiên mã và khuôn cho sao chép. - Giai đoạn //: Từ khuôn ADN kép dạng vòng mới được tổng hợp, tiến hành sao chép theo cơ chế vòng tròn xoay (giống như <|>xl74). Enzym cắt làm đứt sợi (+) ngoài để lộ đầu 3’-OH, sợi (-) nguyên vẹn bên trong dùng làm khuôn. Sợi (-) xoay, trong khi các nucleotit gắn vào đầu 3’-OH để nối dài mạch mà không cần mồi, thường sau khi tổng hợp một đoạn ADN mạch đơn dài sẽ gắn mồi để tổng hợp mạch bổ sung, tạo phân tử ADN kép. Enzym cắt đo phage Ấ mã hoá sẽ cắt ở vị trí chuyên biệt trên cả hai mạch để tạo đoạn cỏ kích thước genome. Điểm cát là đầu dính COS. Sau sao chép genome là phiên mã gen muộn để tạo protein cấu trúc, tiếp đó là các giai đoạn lắp ráp và giải phóng.

295

Điều đáng chú ý là trên ADN của X có một đoạn (nằm giữa gen J và gen att) không đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của X. Do đó trong kỹ thuật di truyền, phage X được đùng làm vectơ chuyển gen. Người ta cắt bỏ đoạn này và thay vào đó đoạn gen mong muốn để tách dòng. Chu trình tiềm tan ngược với chu trình tan là chu trình tiềm tan, theo đó không một thành phần nào của phage được tổng hợp và tế bào không bị tan. Genome khép vòng được cài xem vào NST của tế bào. ADN ờ trạng thái này gọi là prophage. Một protein ức chế do phage mã hoá ngăn cản sự phiên mã của các gen muộn, do đó duy trì trạng thái tiềm tan. Khi tế bào phân chia, prophage cũng được phân chia theo. Trạng thái này sẽ bị mất khi chất ức chế bị bất hoạt. Ở trạng thái prophage, một vài gen của phage (ngoài gen mã hoá cho chất ức chế) vẫn có thể được biểu hiện, đôi khi làm thay đổi phenotyp của tế bào chủ, ví dụ làm thay đổi hình dạng khuẩn lạc. Các vỉ dụ đáng chú khác là độc tổ của vỉ khuẩn Corynebacterium diphteriae, gây bệnh bạch cầu, được mã hoá bởi prophage. Độc tố thần kinh do Clostridium botulỉnum có trong các hộp thịt phồng, cũng do prophage mã hoá. Tê bào tiềm tan có thể sinh trưởng, phân chia và hình thành tể bào mới giống như tể bào mẹ. Trong thực tế, hầu hết trong nuôi cấy, vi khuẩn đều có thể mang một hoặc vài prophage, nhưng chỉ một tỷ lệ rất nhỏ 1/10000 hoặc 1/100000 prophage có thể tách khỏi nhiễm sắc thể để tiến hành chu ừình tan, tạo virion mới và gải phóng ra môi trường. Các virion được giải phỏng không ảnh hướng tới các tế bào tiềm tan khác, bởi vì protein ức chế luôn duy trì prophage ờ trạng thái tiềm tan, giúp tế bào tiềm tan “miễn dịch” trước sự xâm nhập của virut cùng loại. Do có sự “miễn dịch” nên các phage ôn hoà chỉ tạo vệt tan khi cho xâm nhiễm vào các chủng không phải tiềm tan. Cảc vệt tan xuất hiện rất đặc trưng. Các virut độc tạo vệt tan rất rõ trong khi virut tiềm tan chỉ tạo vệt tan mờ. Các vệt tan nhìn thấy được vì nhiều tế bào bị tan do các phage tiên hành chu trỉnh tan. Vệt tan mờ là vì một số tế bào tiềm tan vẫn sống sót, sinh sản trong vệt tan,

(5) Phage chuyển vị (TP) Phage chuyển vị (ưansposable phage) chủ yếu gặp ở các vi khuẩn Gram âm, nhất là Pseudomonas. Một ừong các ví dụ điển hình nhất là phage Mu. Phage chuyển vị có vòng đòi theo cả chu trình tan và tiềm tan, giống như phage X, nhưng klhác ở phương thức sao chép genome. Ở pha tan sớm, một số quá trình phức tạp liên quan đển enzym transposaz của virut, ADN polymeaz của ví khuẩn và một số enzym khác (của virut và vi khuần) tiến hành sao chép ADN và cài bản sao genome mới tạo thành cùa virut vào tế một vị trí nào đó ừên NST của tế bào và do đỏ cỏ thể làm bất hoạt các gen tại Vị.trí gắn đẫn đến đột biến. Không có genome nguyên vẹn của virut rời khỏi NST tế bào chủ. Chỉ sau một sổ vòng

296

chuyển vị sao chép (replicative transposition), genome virut cùng với một phần ADN liền kề của tế bào được tách ra khỏi tế bào để thực hiện chu trình tan. Phage chuyển vị được dùng phổ biến trong công nghệ sinh học để đưa gen mong muốn vào các tế bào nhân sơ. 19.3. NUÔI CẨY VIRƯT ĐỘNG VẬT 19.3.1. Phát triển phương pháp nuôi cấy Trước kia nếu muốn nuôi cấy virut thì người ta phải nuôi cấy trên cơ thể động vật. Như vậy rất khó quan sát được các hiệu ứng đặc thù của virut ờ mức độ tế bào. Vào những năm 30 của thế kỷ 20 các nhà virut học đã phát hiện thấy trứng gà mang phôi (đã thụ tinh hay chưa thụ tinh) có thể được dùng để nuôi cấy virut herpes, virut đậu mùa và virut cúm. Mặc dù phôi gà có kết cấu giản đơn hơn nhiều so với cơ thể thỏ hay chuột thí nghiệm nhưng phôi gà vẫn là một cơ thể phức tạp. Sử dụng phôi gà không giải quyết được triệt để những vấn đề gặp trong hiệu ứng tế bào học do virut gây ra. Mặt khác, vi khuẩn cũng phát triển tốt trên phôi gà, trên các phôi nhiễm vi khuẩn rất khó đánh giá chính xác được các hiệu ứng do virut. Vì vậy ngành virut học đã phát triển chậm chạp khi chưa cài tiến được phương pháp nuôi cấy virut. Có hai phát hiện mới đã làm triển khai được phưcmg pháp nuôi cấy tế bào giúp cho các nhà virut học và các nhà khoa học khác. Một là, việc phát hiện và sử dụng chất kháng sinh để ngăn ngừa sự cảm nhiễm vi khuẩn. Hai là, các nhà sình học phát hiện thấy các enzym thủy phân protein (proteolytic), nhất là trypsin, có thể làm tách riêng các tế bào ra khỏi các mô xung quanh mà không làm tổn hại đến các tế bào này. Rửa các tế bào và đếm số lượng chúng, pha loãng rồi chuyển vào các bình, các ống nghiệm hay hộp Petri bằng nhựa (plastic). Các tế bào trong dịch huyền phù sẽ hấp phụ trên bề mặt lớp thành nhựa, cúng sinh sôi nẩy nở và lan ra thành một tầng tế bào gọi là tầng tể bào đơn (monolayer). Tầng tế bào đon này có thể truyền thế hệ (subcultured). Nuôi cấy truyền thế hệ (subculturing) là đem các tế bào nuôi cấy được đi nuôi cấy ừong các môi trường nuôi cấy mởi. Một lượng lớn các tế bào truyền thế hệ (subcultures) được tạo thành từ một mẫu tổ chức đơn sẽ là mẫu tế bào nuôi cấy đồng nhất cần thiết cho hàng loạt các nghiên cứu hiệu ứng của virut. Thuật ngữ nuôi cấy mô (tissue culture) đã được sử dụng rộng rãi nhưng nuôi cấy tế bào (cell culture) cần sử dụng chính xác hơn. Hiện nay, phần lớn các tế bào nuồi cấy đều là tầng tế bào đơn sinh trường ra từ các tế bào phân tán đã được xử lý nhờ enzym. Nhờ sử dụng nhiều loại hình nuôi cấy tế bào vận dụng chất kháng sinh để ức chế can nhiễm mà Virut học đã bước vào thời đại vàng (Golden Age). Từ thập kỷ 50 đến thập kỷ 60 cùa thế kỷ 20 đã có ừên 400 virut được phân lập và giám định (characterized). Mặc dù các virut 297

mới đã được phát hiện nhưng trọng tâm hiện nay là cần giám định kỹ hơn các đặc tính cùa vimt, xác định các bước cảm nhiễm (infection) và nhân lên (replication) của virut. Các thí nghiệm vệt tan (plaque) dùng trong nghiên cứu phage (phages) có thể dùng cho cà các virut động vật. Chẳng hạn, nuôi cấy tầng tế bào đơn các tế bào người, sau đó cấy virut, nếu virut làm tan tế bào thì rất nhiều vòng xâm nhiễm sẽ sản sinh vệt tan. 19.3.2. Các loại hình nuôi cẩy tế bào Trong Virut học lâm sàng và Virut học thực nghiệm thường sử dụng rộng rãi 3 kiểu cơ bản nuôi cấy tế bào: - Nuôi cấy tế bào nguyên đại (primery cell culture). - Các chủng nguyên bào sợi nhị bội thể (diploid fibroblast strains). - Các dòng tế bào liên tục (contínous cell lines). Vật nuôi cấy tể bào nguyên đại là lẩy trực tiếp từ động vật, không qua truyền thể hệ (not subcultured). Các động vật lấy mẫu càng non thì thời gian sống của tế bào nuôi cấy càng kéo dài. Điển hình của các tế bào này là thể hỗn hợp của nhiều loại hình tế bào như tế bào cơ bắp (muscle), tế bào thượng bì (epithelial). Tuy vậy số lần phân cắt của các tế bào này thường không nhiều, nhưng cũng đủ để hỗ trợ cho nhiều chủng virut sinh trưởng Nếu việc nuôi cấy tế bào nguyên dại có thể truyền thế hệ một cách lặp lại thì một tip (typ) tế bào sẽ chiếm ưu thế và vật nuôi cấy các tế bào này được gọi là chủng tế bào (cell strain). Trong chủng tế bào tất cả các tế bào loại hình gen giống nhau. Chúng có thể truyền thế hệ nhiều lần, mỗi thế hệ giữa các tế bào khả năng xuất hiện cảc khác biệt là rất nhỏ. Các khác biệt này có thể can thiệp vào kết quả xác định hiệu ứng của virut. Các chủng nguyên bào sợi nhị bội thể lả cảc chủng tế bào thường dùng nhất. Nguyên bào sợi (fibroblasts) là một loại tể bào chưa thành thục. Chúng có thể sản sinh ra collagen và các sợi khác như lả cơ chất của mô liên kết giống như chân bì (dermis of the skin) Các chủng tế bào này là lấy từ mô cùa phôi, giữ tổc độ phát ừiển nhanh và phân cắt liên tiếp của phôi. Chủng tể bào này hỗ ừợ cho sự phát triển của các loại virut và thường không mang các virut ô nhiễm như các chủng tế bào thu được từ các động vật trưởng thành. Chính vì vậy mà các chủng tế bào này thường được sử dụng để sản xuất các loại vaccin virut. Tip thứ ba nuôi cấy tế bào được sử dụng rộng rãi là đòng tế bào liên tục. Một dòng tế bào liên tục chứa các tể bào có thể sinh sản ra rất nhiều thế hệ. Dòng tế bào liên tục nổi tiếng nhất là đòng tể bào HeLa. Dòng tế bào này sau khi được phát hiện từ năm ỉ 951 đã được nuôi cấy liên tục và được các nhà nghiên cứu khẳp thế giới sử dụng rộng rãi. Nguồn gốc của dòng tế bào HeLa là lấy từ một phụ nữ bị ung thư tử cung và chữ HeLa là lấy từ các chữ đầu của tên người này. Trên thực tể rất nhiều dòng tế bào liên tục thời kỳ đầu đều

298

là dùng các tế bào ung thư ác tính, vì chúng có năng lực sinh trưởng rất nhanh. Các dòng tế bào vĩnh sinh (immortal cell lines) được nuôi cấy trong các phòng thí nghiệm không bị lão hóa, phân chia nhanh chóng, nhu cầu dinh dưỡng thường đom giản hơn các tể bào thông thưcmg. Ví dụ đòng tế bào HeLa có chứa 2 gen virut càn thiết cho năng lực vĩnh sinh hóa (immortality) của chúng. Dòng tế bào vĩnh sinh này là dị bội thể (heteroploid) -chứa sổ lượng khác nhau các nhiễm sắc thể, vì vậy mà có tính đa dạng đi truyền. Việc nuôi cấy tế bào đã thay thế trên mức độ rất lớn các động vật thực nghiệm và trứng chửa phôi khi nghiên cứu Virut học động vật. Tuy vậy trứng gà mang phôi vẫn là hệ thống vật chủ tốt nhất đối với virut cúm A.

Ngoài ra chuột nhỏ loại Albino Swiss vẫn được dùng để nuôi cấy Arbovirrus (j4rthropod-ốome virutes), có lúc cũng dùng những đòng tế bào động vật có vú khác hoặc các dòng tế bào muỗi.

19.3.3. Hiệu úng bệnh biến tế bào (The cytopathic effect) Hiệu ứng thấy được của virut đối với tế bào cảm nhiễm được gọi là hiệu ứng bệnh biến (cytopathic effect,CPE).Các tế bàó trong nuôi cấy biểu hiện các loại hiệu ứng chung, bao gồm sự biến đổi hình dạng tể bào và sự tách ra khỏi các tế bào phụ cận hoặc vật dụng nuôi cấy.

299

Tuy nhiên CPE có thể cũng cỏ những biểu hiện đặc biệt mà các nhà nghiên cứu virut học thực nghiệm có thể dùng để giám định sơ bộ virut xâm nhiễm. Chẳng hạn, adeno virut và herpes virut ở người có thể làm cho tế bào cảm nhiễm trương phồng lên do bị tích lũy dịch thể. Còn picoARN virut lúc xâm nhập tế bảo có thể ngăn chặn tế bào và làm tan vỡ tế bào khi chúng thoát ra. Paramyxo virut có thể làm dung hợp (fuse) các tế bào đứng gần nhau, tạo nên các thể hợp bào (syncytia, số nhiều là syncytium). Thể hợp bào có thể chứa từ 4 tới 100 nhân trong một tế bào chất chung. Ngoài ra có một dạng CPE khác là sự biến nạp (transformation): từ tể bào bình thường biến thành tế bào ác tính. 19.4. VIRUT VÀ UNG THƯ Ưng thư được biết là loại bệnh mà có sự rối loạn về hoạt động và chức năng của những tế bào bình thường. Có thể định nghĩa Ung thư (cancer) như là sự tăng trưởng không thể khống chế được của các tế bào dị thường, nói cách khác là các tế bào không ngừng phân chia. Rất nhiều trường hợp không thể đình chỉ được sự phân cắt của chúng, kết quà là tạo thành các Mô ung thư (Neoplasm) hoặc Khối u (Tumor). Mô ung thư cỏ thể là lành tính (benign) - tăng trưởng phi ung thư (noncancerous). Nhưng nếu các tế bào xâm nhập và can thiệp vào chức năng của các mô bình thường chung quanh thì sẽ ứở thành ác tính (malignant). Ung thư ác tính và các tế bào cùa chúng có thể di căn (metastasize) hoặc khuếch tán (spread) tới các mô khác của cơ thể. Năm 1911, F.Peyton Rous đã phát hiện thấy một số virut có thể gây ra ung thư ở động vật ông xác định một số sarcomas (neoplasm ở mô liên kết) ở gà là do một loại virut được gọi là Rous sarcoma virut, RSV- gây ra. Vì vậy không có gì đáng ngạc nhiên với cảc phát hiện virut có liên quan đến bệnh ung thư ờ người. Mặc dù phần lớn ung thư ở người là đo các đột biến di truyền (gentic mutation) hay do các hóa chất gây ô nhiễm môi trường, hoặc do cả hai gây ra ung thư. Các nhà nghiên cứu dịch tễ cho rằng có khoảng 15% các ung thư ờ người do cỏ sự xâm nhiễm của virut.

300

19.4.1. Các virut gây ung thư ở người Qua nhiều năm nghiên cứu và thực nghiệm hiện nay đã biết ít ra là đã có 6 loại virut liên quan đến ung thư ở người. Có thể còn có nhiều hom nữa sẽ được xác định. Virut Epstein-Barr, EBV hay thường gọi là virut EB: là loại virut gây ung thư ở người được hiểu biết nhiều nhất. Loại virut ADN này là một Herpes virut làn đầu tiên phát hiện trên trẻ em Châu Phi bị ung thư lympho Burkitt. Loại ung thư ác tỉnh này gây ra xưng phồng rồi dẫn đến hoại tử hàm dưới. Trên thực tế đã chứng minh được là có 3 loại ung thư khác liên quan đến virut EB. Một số virut Papilloma ở nguời (human papillomavirut, HPV) có liên quan đến mật thiết đến ung thư ở người. Mặc dù một số virut ADN này chỉ gây ra các mụn cơm (warts) lành tính nhưng có những tip khác (HPV-8, HPV-16) đã gây ra ung thư tử cung (ung thư mô thượng bì). Có thể nói 99,7% ung thư tử cung là do HPV gây nên. Một số virut ADN khác gây ung thư là virut viêm gan B (HBV). Chúng gây ra bệnh viêm gan và 80% cảc trường hợp ung thư gan là do chúng gây nên. Ung thư Sarcoma Kaposi là loại ung thư tế bào nội bì ừong mạch máu và hệ thống lympho, loại ung thư này có liên quan đến virut Herpes-8 ở người (human herpesvirut 8). Hiện nay đã phát hiện thấy các virut gây ung thư ở người chủ yếu là các virut hai chuỗi ADN (dsADN). Tuy nhiên một số virut ARN sợi thẳng, hay(+) sense ARN, nhất là các Retrovirut cũng có thể liên quan đến ung thư, Chẳng hạn HTLV-I gây nên bệnh máu trắng tế bào T ở người lớn hoặc ung thư lympho (aldult T cell leukemia/lymphoma).

19.4.2. Virut ung thư gây bệnh như thế nào? Giống như phage (thực khuẩn thể, phage), các virut động vật thường thông qua việc làm tan để gây chết tế bào. Một số virut động vật khác có thể xâm nhiễm tế bào và tạo thành các Tiền virut (provirutes). Trong một số trường hợp sự xâm nhiễm này có thể làm cải biến về sinh lý và di truyền của các tế bào vật chủ (host cells) - tức là các CPE đã nói tới ở phần trên. Ví dụ các virut RSV đã làm cho các tế bào tách khỏi dụng cụ nuôi cấy và biến thành hình cầu. Trong trường hợp virut ung thư ADN có thể tồn tại dưới dạng tiền virut. Các CPE chủ yếu của chúng là sự phân cắt không kiểm soát được ở các tế bào xâm nhiễm. Quá trình này được gọi là sự biến nạp gây u (neoplastic transformation), là đặc trưng điển hình cửa các virut ADN. Nhiều virut đã đưa toàn bộ hay một phần ADN xâm nhập vào vị trí ngẫu nhiên trong ADN của vật chủ. Tuy nhiên, chỉ có một ít gen virut là cần thiết cho biến nạp. Virut Papilloma (thuộc họ Papovaviridae) có thể gây ra các tế bào ung thư ở người, nhưng AĐN của chúng lại tồn tại tự do trong tế bào chất của vật chủ. Một ít gen của virut Papilloma là có hoạt tính và dẫn đến virut được sao chép (replicate) mỗi khi phân cát tế

301

bào. Nếu ADN virut ngẫu nhiên kết hợp với ADN trong tế bào vật chủ thì sẽ xảy ra sự tổng hợp protein virut không khống chế được. Các protein này có thể làm cho tế bào mất đi khả năng khống chế phân cắt. Một số protein virut này đã ngăn chặn hiệu ứng cùa các gen ngăn chặn ung thư (tumor-suppressor gens), các gen có thể ngăn chặn sự phân căt không khống chế được của tế bào. Không có sản phẩm cùa các gen này, vật chủ sẽ không khống chế được sự phân cắt tế bào và phát triển thành một khối u. Nhiều virut Retro là các Virut ung thư ARN. Trên thực tể chúng duy nhất là những virut ARN gây ung thư đã biết, cần nhắc lại, các virut Retro đx dùng enzym transcriptaz ngược để phiên mã sợi ARN (+) vào ADN, sau đó trở nên một tiền virut (provirut) xâm nhập vào nhiễm sắc thể của vật chủ. Protein phiên mã bởi Tiền virut HTLV-I sẽ chuyển hóa tế bào vật chù thành khối u. Sự xâm nhiễm cũng dẫn đến sự phát sình các hạt virut (virion) mới bằng nẩy chồi, chúng không làm gây chết tế bào bị xâm nhiễm. Do đó, virut ung thư ARN có thể tiếp tục xâm nhiễm vào các tế bào chưa bị xâm nhiễm khác hoặc các tế bào sinh sản (sex cells). Nếu là tế bào sinh sản sự tồn tại của các hạt virut sẽ làm cho thế hệ sau của vật chủ cũng sẽ bị virut xàm nhiễm.

19.4.3. Cácgen gây ung thư (Oncogens) Các protein sinh ra bởi các virut ung thư làm cho các tể bào vật chủ phân chia không khống chế được là được phiên mã từ các đoạn ADN được gọi là các Gen ung thư (oncogens), theo tiếng Hy Lạp thì onco là tích thành khối, Trong các virut AĐN gây ung thư. các gen ung thư không chỉ gây ra khối u mà chúng còn chứa các thông tin để tổng hợp protein virut cần thiết cho sự sao chép virut. Gen gây ung thư ở virut ARN gây ung thư thi hoàn toàn khác. Các nhà virut học và tế bào học đều đã phát hiện thấy một số virut ARN gây ung thư có thể sinh ra các gen độc biệt (extra gens) từ các tế bào vật chủ bình thường khi sao chép virut. Các gen này rất giống với gen gây ung thư và được gọi là gen Nguyên u (Proto-oncogens). Một gen Nguyên u là một gen bình thường, sau khi bị virut khổng chế nó có thể đẫn đến việc tế bào mất khả nămg khống chế sự phân chia, tức là nó biến thành gen gây ung thư. Nhiều gen gây ung thư đã được tìm thấy trong các virut gây ung thư và phần lớn mang thông tin đi truyền có thể làm cho tế bào phân chia không hạn chế. Các gen gây ung thư này là các gen đột biến chứa sự mất đoạn (deletions) hoặc sự thay thế (substitution). Các đột biển này gây ra sự biến đổi cấu trúc trong protein mà gen đã phiên mã. Gen gây ung thư hoạt dộng theo một trong hai phương thức sau đây: Một là, sản phẩm của gen gây ung thư có thể gây ra sự gián đoạn chức năng của tế bào bình thường đẫn đên sự phân cắt tế bào. Hai là, gen gây ung thư bị khổng chế bời các gen điều hòa của virut (viral regulators) nằm gần vị trí gắn kết (intergration) chúng vào nhiễm sắc thề của vật chủ, gen điều hòa này ”mờ ra” (’’turn on”) gen tạo ra các protein bình

thường, nhưng là sự tổng hợp quá mức hoặc là tồng hợp không phù hợp với chu kỳ sống của tế bào vật chủ; ngoài ra còn xuất hiện sự phân chia quá mức tế bào. Sự phát hiện ra gen gây ung thư ở virut có ý nghĩa quan trọng trong việc giúp hiểu biết về ung thư. v ề ung thư ở người còn. rất nhiều vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu, nhưng các thuốc đặc hiệu chống virut trong tương lai có thể ngăn ngừa được các bệnh ung thư do virut gây nên.

19.4.4. Hy vọng phòng chống ung thư Ung thư là một trong những nguyên nhân chính gây tử vong trên thế giới. Năm 2005, người ta ước tính có khoảng 7,6 triệu nạn nhân chết vì bệnh này và trong mười năm sắp tới, số người chết sẽ là 84 triệu nếu như không phòng chổng. Tổ chức Y tế thể giới (WHO: World Health Organization) đã thống kê trong 20 năm qua số người mới mắc ung thư hàng năm đã tăng từ 10 triệu ỉên đến 15 triệu, số người chết vì ung thư mỗi năm đã tăng từ 6 triệu lên đến 10 triệu. Phòng chống ung thư là một sự nghiệp hểt sức to lớn đối với cả thế giới. WHO đã đề nghị mục tiêu toàn cầu là làm giảm mức tử vong xuống 2% mỗi năm, từ 2006 đến 20] 5 để có thể tránh hơn 8 triệu người chết trong số 84 triệu người 9ẽ chết vì ung thư đự tính cho mười năm sắp tới và WHO cố gắng đạt mục tiêu này .Những nước nghèo có hơn 70% sổ người chểt do bệnh ung thư vì thiếu tiền để chẩn đoán lẫn trị bệnh. Chí mỗi chửng nhiễm độc thuốc lá mà cũng đã gây khoảng 1,5 triệu cái chết mỗi năm. WHO nỗ lực tích cực. Người ta ước tính có khoảng 40% bệnh ung thư có thể ừánh được. Tuy nhiên nguy cơ sẽ tăng rất nhiều khi bệnh nhân mập phì hay bị nhiễm độc thuốc ỉá. Người ta nhận xét thấy nguy cơ bệnh ung thư và những bệnh mạn tính trên phương điện toàn cầu tâng nhanh khi trong thức ăn hiện nay có quá nhiều mõ, đường và muối, còn rau quả thi ít đi. WHO họp lần thứ nhất tại Genève từ 6-17/2/2006 để thỏa thuận với nhau về một phương cách giảm tiêu thụ thuốc lá. Các đại biểu cho biết quỹ có 8 ừiệu USD cho những sinh hoạt chổng thuốc lá trong thòi gian hai năm. Chiến lược toàn cầu cũng chú trọng việc tránh tiêu dùng các thực phẩm cỏ chứa hóa chất gây ung thư, chương trình chủng ngừa các bệnh nhiễm virut viêm gan ưên bình điện quốc tế. Để cải thiện việc phát hiện sớm, điểu trị vả chăm sóc người bị ung thư, Trung tâm Nghiên cứu Ưng thư (IARC: InteARNtional Agency for Research on Cancer) của WHO đã tìm ra nhuyên nhân gây bệnh ung thư và các cơ chế cùa sự xuẩt hiện ung thư đồng thời tìm những pbưcmg cách phát hiện sớm. WHO còn kết hợp với những cơ quan ngoài hệ thống Liên hiệp quốc như Cơ quan năng lượng nguyên tử quốc tế, Hội chống ung thư quốc tế và nhiều Viện ung thư quốc gia. Cho đến nay chưa có nổi vaccin chổng ung thu ngoại trừ vaccin Gardasil phòng tránh ung thư cổ tử cung. Mục tiêu cùa vaccin phòng tránh ưng thư là sử dụng kháng nguyên ung thư biểu đạt đặc hiệu để kích hoạt, phục hồi và tăng cường các phản ứng miễn dịch kháng ung thư, nhằm cỏ thể sát hại, thanh lọc tế bào ung thư. Vì vậy có thể đem vaccin ung thư

303

chia thành 3 loại: loại Dự phòng, loại Chữa trị, và loại vừa Dự phòng và Chữa trị. Cục quản lý Thực phẩm và Thuốc Hoa Kỳ (FDA) đã phê chuẩn vaccin Gardasil để phòng tránh virut HPV- gây ra ung thư cổ tử cung. Vaccin này chống lại 4 nhóm HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18. HPV-16 và HPV'18 được coi là thủ phạm của 70% các trương hợp ung thư cổ tử cung, còn HPV-6 và HPV-11 là thủ phạm của 90% các trường hợp mụn cơm ờ bộ phận sinh dục (cả nam lẫn nữ). Vaccin này cũng được khẳng định là sẽ giúp phòng ngừa ung thư âm đạo và tử cung đo virut HPV. HPV lây truyền qua đường tinh dục là một loại virut rất phổ biến. Khoảng 20 triệu người Mỹ bị nhiễm loại virut này, và ở lứa tuổi 50, ít nhất 80% phụ nữ đã từng bị nhiễm các chủng của virut HPV. Không phải phụ nữ nào bị nhiễm virut này cũng sẽ bị ung thư. Tỉ lệ bị bệnh ung thư cổ tử cung do HPV là rất nhỏ.

Virut Humanpapilỉomavirut (HPV) thuộc nhóm ADN.

304

Mặc dù vaccin Gardasil có khả năng bảo vệ tránh khỏi một trong nhũng nguyên nhân hàng đầu dẫn đến căn bệnh ung thư cổ tử cung nhưng vẫn còn có những nguyên nhân khác không phải đo virut HPV gây ra căn bệnh ung thư đáng sợ này.

Chính vì vậy việc thường xuyên kiểm tra vẫn là rất cần thiết. Những đợt kiểm tra định kỳ sẽ giúp phát hiện ra những thể ung thư khác cũng như nguy cơ có thể bị ung thư do chủng virut HPV nhóm khác. Những nghiên cứu đã cho thấy hiệu quả 100% của vaccin này trong việc chống lại sự lây nhiễm virut HPV-16 và HPV-18 ở người. Các thử nghiệm cho thấy vaccin có hiệu quà tối ưu trong ít nhất 4 năm. Thời gian lâu hơn hiện vẫn chưa được kiểm chứng. Gardasil chỉ chứa cấu trúc phân tử của loại virut này chứ không phải là virut được làm yếu đi như một số loại vaccin khác. Cơ quan FDA Hoa Kỳ thừa nhận Gardasil tốt nhất cho nữ giới trong độ tuổi từ 9-26 và khồng đưa vào lịch tiêm chủng quốc gia. Công ty Merk & Co có nhiệm vụ tiếp tục nghiên cứu đưa vào sử dụng loại vaccin phòng chống virut HPV gây mụn rộp ở nam giới.Gardasil là thế hệ vaccin đầu tiên phòng ung thư cổ tử cung được cấp phép. Trên thực tế, đây là loại vaccin đầu tiên chống lại một nhân tổ gây ung thư. Tháng 4/2007 vaccin chống ung thư cổ tử cung Cervaríx cũng xin phép được đưa ra sử dụng tại Mỹ.

Chương 20

DI TRUYỀN HỌC VI SINH VẬT

20.1. MỞ ĐÀU Mãi đến những năm 40 của thể kỷ trước, các đối tượng vi sinh vật mới bắt đầu được sử dụng vào nghiên cứu di truyền học. Tuy ra đời chậm, nhưng các phát minh quan ừọng cỏ tính cách mạng trong sinh học như chứng minh trực tiếp ÂDN là vật chất di truyền, sao chép ADN, sinh tổng hợp protein, kỹ thuật di truyền,... đều thực hiện trên các đối tượng vi sinh vật. Do vậy, có thể nói di truyền học vi sinh vật đã đóng vai trò “cách mạng hóa ”, tạo ra những bước tiến nhảy vọt cho di truyền học nói riêng, hình thành Sinh học phân tử và sự phát triển Sinh học hiện đại nói chung cả về phương điện lí thuyết cũng như ứng dụng thực tiễn. Di truyền học của vi sinh vật đã góp phần chủ yếu cho sự phát triển di truyền học phân tử, mà đỉnh cao chói lọi là sự ra đời kỹ thuật tái tể hợp A D N hay kỹ thuật di truyền (KTDT), làm bùng nổ Cách mạng Công nghệ sinh học.

20.1.Ỉ. Tính cách mạng của Dí truyền học vỉ sinh vật Nhân loại đang sổng ở cuối thập niên đầu tiên của thế kỉ 21 - thế ki Công nghệ sinh học. Di truyền học đi sâu vào các vấn đề cơ bản của sự tồn tại và ỉưu truyền sự sống nên nó giữ một vị trí đặc biệt quan trọng, cỏ người ví "Di truyền học là trải tim của Sinh học”, vl không ít thì nhiều, nó liên quan và chi phối bất kì lĩnh vực nào của sinh học, từ các cơ chế phân tử của sự sổng cho đến sự tiến hóa của toàn bộ thế giới sinh vật trên hành tinh của chúng ta. Những phát minh ĩớn với số lượng tăng vọt của di truyền học đã có tác dụng cách mạng hóa sinh học, biến sinh học từ mô tả thành thực nghiệm chính xác. Hội nghị Di truyền học thế giới ở Toronto (Canada) năm 1988 đã nêu phương châm "Di truyền học hóa" Sinh học.

Suốt thế ki XX, các nghiên cứu tập trung giải quyết vấn đề gen dẫn đến Thời đại gen, Cách mạng di truyền, mà đinh cao là việc hoàn tất Bộ gen người vào năm 2003 và mở ra Thời đại sau Bộ gen (Post-Genomeics Era). Các đối tượng vi sinh vật đã góp phần chủ yếu vào các phát mình nền tảng không những cùa di truyền học phân tử, mà cùa sinh học phân tử và sinh học hiện đại nói chung. Điểm qua lịch sử các phát minh của sinh học phân tử sẽ thấy rõ vai trò cách mạng hóa của các đổi tượng này. 20.1.1.1. Giả th iế t m ột gen - m ột enzym

Vào năm 1941, G. Beadle và E. Tatum tiến hành thí nghiệm trên vi nấm Neurospora crassa. Công trình chứng minh mối liên hệ giữa gen và tính trạng thông qua việc kiểm soáĩ các enzym - protein và qua đó kiểm soát các phản ứng sinh hóa trong tế bào. Giả thuyết này mờ ra một trang mới về mối quan hệ chức năng giữa gen và enzym trong con đường trao đổi chất của cơ thể. Phát minh này có ý nghĩa quan ừọng: đó là bước chuyển tiếp từ di truyền học cổ điển sang đi truyền phân tử. Chính vì vậy, hai ông đã được nhận giải thưởng Nobel vào năm 1958. 20.1.1.2. Các chứng minh trực tiểp rằng ÁDN là vật chẩt di truyền Ngay sau khi các định luật của Menđel được phát hiện lại vào năm 1900, di truyền học đã phát triển rất nhanh với thuyết di truyền NST và nhiều thành tựu khác như gây đột biến nhân tạo... Tuy nhiên cho đến 1940, vẫn chưa có một bước tiến triển nào ữong hiểu biết bản chát hoá học của vật ỉiệu di truyền và chua hiểu được bằng cách nào gen trên nhiễm sắc thể biểu hiện ra tỉnh trạng. Trong một thời gian dài, mặc dù cỏ nhiều số liệu giản tiếp cho tháy ADN ỉà vật chất di truyền, nhưng protein vẫn được coi là thành phàn chù yếu của vật liệu di truyền vì nó có cấu trúc phân tử khá phức tạp. Do vậy, các chứng mình trực tiếp trên các Vi sinh vật có ý nghĩa quyết định trong xác nhận vai trò cùa ADN. a. Biến nạpĩ truyền thông tin di truyền nhờ ADN. Năm 1928, Griffith phát hiện hiện tượng biến nạp (ừansíbrmation) ở vi khuẩn Diplococus pneumoniae (nay gọi là Streptococus pneumoniae). Năm 1944, T.Avery, Mc Leod và Mc Carty đã xác định rõ tác nhân gây biến nạp là ADN. Hiện tượng biển nạp là bằng chứng trực tiếp đầu tiên xác nhận rầng ADN mang thông tin đi truyền. b. Sự xâm nhập của ADN virut vào vi khuẩn Năm 1952, A.Hershey và M.Chaz đã tiến hành thí nghiệm với bacteriophage T2 (virut của vi khuẩn hay gọi tắt là phage) xâm nhập vi khuẩn E. coli, chứng minh trực tiếp ràng ADN cùa phage T 2 đã xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và sinh sản tạo ra thế hệ phage

307

mới mang tính di truyền có khả năng tiếp tục lây nhiễm các vi khuẩn khác. Kết luận: Vật chất di truyền của phage T2 là ADN. Năm 1952 đă diễn ra nhiều cuộc tranh luận sôi nổi về vai ừò của ADN: là vật chất di truyền. Sau đó, năm 1953 mô hình Waston và Crick đã đặt dấu chấm kết cho giai đoạn nghi ngờ ràng ADN có là vật liệu di truyền hay không. Các chứng minh trực tiếp nêu trên là những tiền đề quan ừọng cho phát minh ra mô hình cấu trúc chuỗi xoắn kép ADN của Waston và Crick. Nó đã tạo nên bước phát triển mới cho sinh học dẫn đến sự hình thành sinh học phân tử hiện đại, 20.1.1.3.Chi tiết hóa “học thuyết trung tâm„ cửa sinh học phân tử: ADN -ỳ ARN -ỳ Protein a. Sao chép ADN - Trong năm 1955, A. Komberg và đồng sự đã phân lập ADN polymeaz I từ vi khuẩn E. coli. Sau khi cho enzym này vào ống nghiệm muối chứa ADN và 4 loại nucleotit triphotphat, hỗn hợp này có thể tổng hợp mạch ADN mới. - Năm 1958, ừên đối tượng E. coli, M.Meselson và F. Stahl đã chứng minh ADN sao chép theo cơ chế “bán bảo tồn”: mỗi mạch bố mẹ sẽ làm khuôn cho sự tổng hợp mạch ADN mới. Cho đến nay, toàn bộ chi tiết về sao chép ADN đều được thực hiện ưên E. coli. b. Các quá trình phiên mã, dịch mã vã điều hòa sinh tổng hợp protein Trên đối tượng E. coli: - Năm 1961: s. Brenner, Fr. Jacob và M. Meselson đã khám phá mARN là phân tử mang thông tin di truyền của ADN từ nhân đến bộ máy sản xuất protein nằm trong tế bào

chất. Điều này bác bỏ già thuyết của Fr. Crick nêu ra năm 1958 cho ràng ARN của riboxom là phân tử trung gian mang thông tin di truyền từ nhân sang tế bào chất. - 1961 - 1966: Mã di truyền được khám phá. (Giải Nobel) - Ngoài 2 phát minh trên, toàn bộ các quá trình phiên m3, dịch mã, cấu trúc của riboxom đều thực hiện trước tiên ừên E. coli. - 1962: Phát hiện cơ ché điều hòa sinh tổng hợp protein ở Operon lactoz.(Giải Nobel) - 1970: Phát hiện enzym Reverse ừanscriptaz. (Giải Nobel)

308

20.1.1.4. Những đóng góp cạ thể của các đối tượng làm mô hình chủ yếu Việc tỉm hiểu những đóng góp cụ thể của các đối tượng làm mô hình chủ yếu sẽ giúp hiểu rõ một cách hệ thống và cụ thể hơn về vai trò "cách mạng trong cách mạng” của di truyền Vi sinh vật. a. Vi khuẩn Escherichia coli (E. coỉỉ) -

Các đóng góp chủ yếu: Đối tượng chủ yếu được dùng cho các nghiên cứu: •

Sao chép, phiên mã, dịch mã và tái tẻ hợp.

•

Đột biến.

•

Điều hòa biểu hiện gen (Gen regulation).

•

Kỹ thuật ADN tái tổ hợp (recmbinant ADN technology).

- Đóng góp cho nghiên cứu các lĩnh vực khác: Trao đổi chất của tế bào (Cell metabolism), gen ức chế vô nghĩa (Nonsense suppressors), sự tuyến tính (Colinearity) giữa gen và polypeptit, các Operon, sự kháng thuổc dựa vào plasmid (plasmid-bazơđ đrug resistance) và sự vận chuyển tích cực (Active transport). b. Nấm men Sơccharomyces cerevisìae (S. cerevisiae) - Vai trò chủ yếu cho các nghiên cứu: •

Chu trình tế bào (Cell cycle): Sự xác định các gen kiểm soát phân bào nhở các đột biển nhạy cảm nhiệt (temperature-sensible mutants (cdc mutants)) dẫn đến mô hình rất tốt cho nghiên cứu sự phân bào.

•

Tương tác gen (Gen interaction): nghiên cứu sự ức chế gen (suppression). Hệ thống plasmid lai kép (two-hybrid plasmid system) giúp tìm các tươngtác giữa các protein ở nấm men đã dẫn đến các bản đồ tương tác phức tạp, mà là khởi đầu cho sinh học các hệ thống (systems biology).

•

Di truyền học ty thể: nhờ các đột biến “petite” mất khả năng hô hấp mà phát hiện các gen của ty thể. Nhờ chúng và các đột biến khác của ty thể mà phân tích chi tiết cấu trúc và chức năng bộ gen ty thể.

309

•

Di truyền học kiểu bắt cặp (Gentics of mating typ): Các alen MA T ở nấm men là các gen kiểu bắt cặp đầu tiên được xác định các đặc tính ở mức phân từ.

Những đóng góp khác: Di truyền cùa khóa đóng mờ (switching) giữa sự tăng trưcmg kiểu nấm men (yeast-like) và sợi (filamentous); di truyền học sự thoái hỏa (senescense).

c. Nẩm sợi Neurospora crassa: -

Các đỏng gỏp chủ yếu: •

Di truyền sinh hóa và trao đổi chất.

•

Di truyền học của giảm phân.

•

Di truyền ty thể.

Các đóng gỏp khác: sự đa dạng các loài nấm và thích nghi (adaptation), di truyền tế bào (cytogentics), các gen kiểu bắt cặp, các gen dung hợp thể dị nhân (heterokaryoncompatibility gens). 20.ỉ. 1.5. Kỹ thuật di truyền và sự mở đầu cách mạng Công nghệ sình học a. Enzym giới hạn (restriction endonucleaz): Năm 1962, W.Arber lần đầu tiên chứng minh rằng có những enzym đặc biệt hạn chế (restriction) sinh sản của phage ứong tế bào E. coil Năm 1968: Enzym cắt giới hạn đầu tiên được khám phá: EcoR 1. Đến năm 1970, Hamilton Smith và cộng sự đã tách được một loại enzym cát giới hạn mới từ vi khuần Haemophilus influenzae, gọi là Hind II.

Hammihon Smith, Nobel 1978 cùng D.Nathans và W.Arber.

Enzym này là công cụ đầu tiên trong kỹ thuật di truyền. (Giải Nobel)

b. Kỹ thuật ADN tái (ổ hợp: Năm 1972, nhóm của Paul Berg tạo nên phân tử ADN (ái tổ hợp if7 vitro đầu tiên từ ba nguồn khác nhau: nguyên bộ gen virut s v 40 gây ung thư ở khỉ, một phần bộ gen của phage và các gen của operon lactoz của E. coỉi. Năm 1973, nhóm Cohen, Helenski, Boyer đã lần đàu tiên thu nhận được các sản phẩm có hoạt tinh từ ADN tủi tể hợp ờ E. coỉi (Giải Nobel) Stanley Cohert, Nobeỉ ỉ 986 cùng c. Sản xuất protein tái tổ hợp: Năm 1977 Rita Levi-Montaỉcini. được xem là năm mở màn cho kỳ nguyên của công nghệ sinh học khi lẩn đầu tiên hormon tăng trưởng ở ngựờì xomatostatin đuợc sản xuất thành công bằng con đường tái tổ hợp gen vào vi khuẩn.£. coỉi. Năm 1978, đã sản xuất insulin người lần đầu tiên nhờ công nghệ gen. d. Genomeics: Sự xác định chính xác trình tự (sequencing) từng nucỉeotit cùa ADN hay gọi ngắn là giảitrình tự chuỗi (sequencing) thành công ở các vi sinh vật và bộ gen người đã tạo nên khoa học về bộ gen gọi là genomeics (genome - bộ gen) hay bộ gen học. Genomeics giúp xác định nhanh chóng trình tự nucleotit của ADN bộ gen và các chức năng của chúng. Những sinh vật đầu tiên được hoàn tất giải trình tự chuỗi đầu tiên cũng là các Vi sinh vật. Vi khuân Haemophilus influenza. - 1995: Hai vi khuẩn, cũng là hai sinh vật cỏ cấu tạo tể bào đầu tiên được hoàn tất giải trình tự chuỗi (sequencing) bộ gen là Haemophilus influenza vả Mycoplasma gemtaỉlum. ~ Thảng 5/1996, nấm men Saccharomyces cerevisiae, sinh vật Nhân thực Eukaryota đầu tiên được giải trình tự chuỗi hoàn tất. - Tháng 9/1997: đăng tải trình tự bộ gen hoàn chỉnh của E. coỉỉ. Toàn bộ việc giải trình tự chuỗi ADN ở tất cả các sinh vật, kể cả bộ gen người đều sử dụng các công cụ từ các đối tượng Vi sinh vật như enzym cắt giới hạn, vector plasmid tạo dòng, NST nhân tạo của nấm men (YAC) và vi khuẩn (BAC). 20.1.1.6.

Sự hấp đẫn đối với cảc nhà vật lỷ và hỏa học

Di truyền học hiện đại đã hình thành những phương pháp phân tích di truyền (methodes of gentic analysis) cho phép phát hiện các quá trình sinh học của tính di truyền

311

và biến dị đến cấp độ phân tử và nguyên tử, tức những phạm trù nghiên cứu chủ yếu của vật lý và hỏa học. Các vi sinh vật như vi nấm, vi khuẩn và phage đã đóng vai trò quyết định trong vẩn đề nảy. Dĩ nhiên, sự nhận thức các quá trình di truyền ở cấp độ phân tử chỉ trở thành hiện thực sau phát minh chuỗi xoắn kép ADN. Nhiều người cho rằng vai trò hàng đầu trong sự hình thành di truyền học phân tử là việc sử dụng rộng rãi các phương pháp vật lý và hỏa học. Vật lý và hóa học đã và đang đỏng vai trò quyết định trong các nghiên cứu những cơ chế phức tạp và mối quan hệ của bộ gen với các quá trình sinh tổng hợp trong tế bào. Tuy nhiên ý nghĩa căn bản của các quan niệm di truyền phân tử là sự tăng vọt năng lực phân giải di truyền (gentic resolving power) nhờ việc sử dụng các vi sinh vật. Vì thế cỏ thể nói rằng sự phát triển các quan niệm di truyền phân tử trở thành hiện thực nhờ di truyền học vi sinh vật. Đánh giá vai trò của các nhà vật lý học ừong sự phát triển của đì truyền học phần tử, có thể phân họ thành 2 nhóm. Một nhóm tham gia trực tiếp vào các thí nghiệm di truyền vi khuẩn và bacteriophage (Delbruck, Benzer, Fris, Leventaỉ,...) và họ đã thực hiện những công trình rất thú vị, tuy nhiên họ không tạo ra phương pháp nào mới trong phân tích di truyền (gentic analysis). Sự tham gia của họ vào di truyền học rất có lợi nhờ nguồn sáng tạo của tư duy vật lý. Nhóm các nhà vật lý khác tham gia vào di truyền học bằng các “suy diễn trí tuệ” và ít có đóng góp cho di truyền học phân tử. Trên thực tế, mầm mống của di truyền học phân tử đã chứa đựng ngay trong học thuyết về gen cua Mendel, trong các nguyên lý di truyền nhiễm sắc thể của Morgan. Trong những năm 1940, một giai đoạn mới của đi truyền học bắt đầu. Vào thòi điểm này cỏ một nhóm các nhà khoa học quan tâm đến bàn chất của gen. Phần lớn họ ỉà các nhà vật ]ý học, họ khác các nhà đi truyền học cổ điển cả về tư duy lẫn định hướng. Đa số các “tân binh„ này rất ít biết về những thành tựu đi truyền học trong vài thập niên trước đó, thậm chí cả sinh học nói chung. Sự quan tâm của họ đến sinh học chỉ giới hạn chủ yếu vào vấn đề thông tin dì truyền có cơ sờ vật lý như thể nào? Việc các nhà vật lý học tham gia giài quyểt các vấn đề sinh học thỉ không phải điều lạ, vì ngay Mendel xuất thân cũng là một nhà vật lý học. Tuy nhiên sự cuốn hút các nhà vật lý học đén với di truyền học vào những năm 1940 còn có nguyên nhân đặc biệt. Đúng vào thời điểm này, khi mà giới khoa học ngừng phổ biến 'sinh ỉực luận thì nhà vật lý học nổi tiếng Niels Bohr, được giải Nobel về thuyểt cơ ỉượng tử (Quantic Mechanics), nêu ra quan điểm rằng một sổ qua trình sinh học cỏ thể không giải thích trọn vẹn bằng các khải niệm vật lý cổ điển. Sau khi xây dựng thuyết cơ lượng tử, Bohr phát triển các khái niệm tổng quát hơn. Năm 1932, tại hội nghị quốc tế về quang học, Bohr đã phát biểu rằng:“Sự công nhận tầm quan trọng rất lớn của các nguyên tử căn bàn trong các chức năng của các sinh vật tự nó không đủ đê giải thích một cách toàn diện các hiện tượng sinh học. vấn đề là ờ

312

chỗ làm thế nào khi phân tích các hiện tượng tự nhiên không bỏ sót một số đặc điểm rất quan trọng để hiểu về sự sống trên cơ sờ thí nghiệm vật lý”. Năm 1935, Max Delbrtick, học trò của Bohr, trong bài báo “'Về bản chất các đột biển gen và cấu trúc gerT đã giải thích ràng, chính Di tuyền học là lĩnh vực sinh học, mà trong đó những giải thích từ các quan điểm vật lý và hóa học dường như “không đủ” theo quan niệm mà Bohr nêu ra. Ông chỉ ra ràng “nếu như trong vật lý các số đo, về căn bản, dẫn đến đo không gian và thời gian, còn khái niệm căn bản của di truyền học - sự khác nhau trong tính trạng - chẳng lẽ có thể biểu thị trong những đơn vị tuyệt đối”. Theo Delbrùck, di truyền học có tính độc lập và gen ìà phân tử có tỉnh ổn định cao trong một thời gian dài không phụ thuộc tác động của môi trường. Năm 1945, ngay sau thế chiến thứ II, quyển sách nhỏ “Thế nào ỉà sự sống ?” (What is the life ?) đã được xuất bản. Tác giả của cuốn sách là E. Schrodinger, một trong những nhà vật lý học nổi tiếng xây dựng thuyết cơ học lượng từ. Quyển sách đã thu hút được sự chú ý của công chúng, đặc biệt là các nhà vật lý học, vì trong đó Schrodinger cổ vũ cho nghiên cứu sinh học tìm các quy luật vật lý mới. Bắt đầu quyển sách, Schrõdinger cho rằng “việc vật lý và hóa học hiện đại chưa có khả năng giải thích các quá trinh sống không có nghĩa là không thể giải thích nhờ các khoa học này”. Ông cho rẳng chính tính di truyền là chủ đề cần được giải thích. Điều làm cho Schrodinger ngạc nhiên là làm thế nào các gen nhỏ bé có thể kháng lại những dao động của môi trường diễn ra liên tục mà như hình dạng môì của dòng họ Gabsburg được truyền qua nhiều thế kỳ. ông cho rằng nhiễm sẳc thể là một tinh thể ả chu kỳ (aperiodic crystall), trên đỏ có sự sắp xếp các mã di truyền (gnetic code) theo một thứ tự chính xác. Schrốdinger cho rằng trong chất sống có “những quy luật vật lý chưa biết đến”. Các quan điểm của Bohr và Schrodinger đã cổ vũ nhiều nhà vật lý học chuyển sang nghiên cứu di truyền học với hoài bão ỉãng mạn là tìm ra các quy ỉuật vật lý mới trong bản chất câu trúc gen. Đến năm 1965, kỷ niệm 100 năm công trinh của Menđel, bản chất của gen đã được sáng tỏ, nhưng không tìm ra quy luật vật lý mới, ngoải chuyện đứt và nổi các liên kểt hydro. Tuy nhiên, cỏ thể nói di truyền học được tiếp thêm một nguồn sinh lực mới đó là các nhà vật lý, hóa học với các công cụ và tư duy chinh xác thực hiện thí nghiệm trên những đổi tượng Vi sinh vật có nhiều ưu thế. Họ bắt đầu các nghiên cứu từ những sinh vật đơn giàn nhất đỏ là các phage, vi khuần - là các sinh vật nhân sơ. M. Delbruck, một nhà vật lý học đã chuyển hoàn toàn sang nghiên cứu sinh học, đã phát biểu ràng lĩnh vực nghiên cứu virut cùa vi khuẩn ỉà săn chơi tuyệt vời, nơi mà nhiều câu hỏi sâu xa cỏ thể nảy sinh, Thêm vào đó hóa học trên đà phát triển của mình đã cung cấp nhiều phương pháp tinh vi mởỉ để xác định đánh giá các kết quả thí nghiệm.

313

20.2. ƯU TH É CỦA CÁC Đ Ớ I TƯỢNG VI SINH VẶT Trong nghiên cứu di truyền học, các đối tượng vi sinh vật có nhiều ưu thế hơn hẳn các động vật thực vật bậc cao.

20.2.1. Thòi gian thế hệ ngắn, tốc độ sinh sản nhanh Trong điều kiện thuận lợi, tế bào E.coỉi có thể phân chia một lần trong 20 phút, còn bacteriophage có thể trong 30 - 40 phút tạo ra hảng trăm cá thể, nấm men có thể phân chia tế bào trong 2 giờ. Đặc điểm của nghiên cứu di truyền học là theo dõi qua nhiều thế hệ nên các đối tượng vi sinh giúp rút ngắn đáng kể thòi gian thí nghiệm. Nếu so thời gian thể hệ của ruồi giấm 2 tuần, của chuột 2 tháng, của người 20 năm thì các vi sinh vật hơn hẳn. Nếu nhà di truyền học phải chờ 2 tuần để có một thế hệ ruồi giấm, thì đối vói E.coỉi, thí nghiệm hôm trước, qua ngày sau đã có thể đánh giá kết quà.

20.2.2. Tăng vọt số lượng cá thể Các vi sinh vật đơn bào, mỗi tế bào là một cá thể. Nếu đủ dinh dưỡng các vi sinh vật sinh sản nhanh tạo quần thể cỏ sổ lượng cá thể lởn có thể khoảng 1010 - 1012 tế bào/ml. Tê bào E.coỉi cỏ đường kính 1 [im (micromet) nếu đủ dinh dưỡng và mọi điều kiện thuận lợi khác thì sau 44 giờ có thể tạo ra một lượng sinh khối nặng bằng quả đất. Ruồi giấm là đối tượng thuận tiện cho di truyền học quần thể cũng chỉ có thể đạt tới 105-106 cá thể. Nhờ số lượng lớn cá thể của vi sinh vật, có thể phát hiện các sụ kiện di truyền hiếm hoi (như đột biến hay các dạng tái tổ hợp) với tần số 10“8 “ 10-11.

Ruôi giâm. Như vậy, sổ lượng cá thể lớn giúp nâng cao năng suất phân giải (resolving power) di truyền, tức khả năng phát hiện các đột biến và tái tổ hợp có tần số xuất hiện rất nhỏ. Ưu thế này lại được tăng thêm nhờ môi trường nuôi đơn giản, dễ nuôi cấy, dễ nhân giống, mà điều kiện nuôi cây không cồng kềnh, ít tốn diện tích hơn so với nuôi ruồi, nuôi chuột và ữồng cây. Môi trường nuôi cấy dễ kiểm soát theo công thức chặt chẽ như khi làm thí nghiệm hóa học.

20.2.3. Cấu tạo bộ gen đơn giản Vi khuẩn và virut có bộ gen là-ADN trần dễ tiến hành thí nghiệm trực tiếp trên ADN cũng như chiết tách tinh sạch, số locus cũng ít hơn so với các sinh vật khác. Các vi nấm và vi tảo có thể tồn tại ở dạng đơn bội (n) với thời gian đài, nên các gen ỉặn có thể biểu hiện ngay, mà khỏi phải tiến hành lai phân tích hay đưa về dạng đồng hợp tử lặn. Tuy nhiên, các vi sinh vật kể trên có trạng thái ỉưỡnp, bội (2n) nên cũng dễ dàng thực hiện phân tích tái tổ hợp. Các tính trạng ở vi sinh vật cũng đơn giản hơn, xác định di truyền các tính trạng này ít phức tạp hơn, nên dễ nghiên cứu. Đối với các tính trạng sinh hóa hay tính đề kháng thì có thể dễ dàng sử dụng môi trường chọn ỉọc để phát hiện.

20.2.4. Dề thu nhận các đột biến Các phân tích di truyền học phần lớn dựa vào những khác biệt của dạng bình thường so với đột biến. Tần số đột biến ở thực vật và động vật khoảng 10“5 - 10”7, khó thu nhận và cần thời gian dài khoảng vài thế hệ để khẳng định đúng là dạng đột biến. Nhiều đột biến ở động vật dễ gây chết nên số lượng đột biến thu nhận được ở động vật rất hạn chế. Các đột biến ở vi sinh vật có thể thu nhận dễ dàng, thậm chi cỏ tần số xuất hiện thấp 10-10, mà việc xác nhận dạng đột biến cũng rất nhanh. Nhờ ưu thế này mà di truyền học vi sinh vật phát triển rấtnhanhhình thành nên di truyền học phân tử và sinh học phân tử.

20.2.5. Dễ nghiên cứu bằng các kỹ thuật vật lý hóa học Đa sô các vi sinh vật có cẩu tạo đơn bào nên quần thể của chúngcỏ độ đằng nhất cao hơn so với các tế bào sinh vật đa bào bậc cao bắt nguồn từ nhiều loại mô khác nhau. Cấu tạo tế bào vi sinh vật đom giản, dễ chiết tách, tinh sạch ADN. Có thể nuôi vì sinh vật đồng nhất (synchronous culture) tức là đa số các tế bào ở những giai đoạn phát triển gần giống nhau. Độ đồng nhất cao của vật liệu thí nghiệm tạo thuận lợi cho việc sử dụng các phương pháp vật lý hỏa học trong nghiên cứu di truyền. Do những ưu điểm kể trên, với việc sử dụng các đối tượng vi sinh vật, di truyền học đã bước vào giai đoạn nghiên cứu di truyền “trong ống nghiệm” (in vitro). Mặc dù các vi sinh vật có những đặc điểm riêng nhưng chúng vẫn tuân theo các quy luật di truyền chung, các kết quả thu được có thể đối chiếu áp dụng cho các vi sinh vật bậc cao.

315

20.3. CÁC ĐẶC ĐIẺM CỦA DI TRUYỀN HỌC VI SINH VẬT

20.3.1. Nghiên cứu trực tiếp ở cấp độ tế bào và cấp độ phân tử Di truyền học cổ điển sử dụng các mô hình đối tượng như đậu Hà Lan Pisum sativum, cây bắp (ngô) Zea mais, ruồi giấm Drosophila melanogaster và chuột nhắt Mus muscuỉus, là những sinh vật đa bào mà sự biểu hiện tính trạng phải trải qua một quả trình phát triển phức tạp và kèm theo biệt hóa. Ví dụ, tế bào hồng cầu ở động vật có vú chi chuyên sản xuất hemoglobin. Dĩ nhiên mọi biểu hiện sống đều liên quan đến tế bào, nhưng các quan sát ở những đối tượng trên là gián tiếp. Trong khi đó, nhiều đối tượng vi sinh vật như vi khuẩn Escherichia colì, nấm men Saccharomyces cerevisiae là sinh vật đơn bào nên các quan sát thực hiện trực tiếp hơn ở mức tế bào. Ví dụ, trên môi trường tối thiểu với ỉượng muối hữu cơ và glucoz cho trước, một ìế bào E. coỉi có thể tổng hợp tất cả các hợp chất cần thiết cho sự tăng trưởng, sống sót và sinh sản. Nếu tế bào bị đột biến mất khả năng tổng hợp một chất nào đó như một loại axit amin thì nó không mọc được trên môi trưcmg tối thiểu. Trên môi trường cỏ bổ sung thuốc kháng sinh thì chỉ có các tế bào đề kháng mới mọc được. Hơn nữa, các tế bào vi sinh vật có nhu cầu dinh dưỡng đơn giản dễ kiểm soát thành phần môi trường nuôi, dễ nuôi cấy, dễ nhân giống, dễ dàng thu nhận nhiều loại đột biến phục vụ cho nghiên cứu trực tiếp và nhanh chóng ở cấp độ tế bào, phân từ. Do vậy, chúng là những đối tượng lý tưởng cho nghiên cứu di truyền học phân tử.

20.3.2. Dòng tế bào Đặc điểm của các tế bào vi sinh vật là rẩt nhỏ bé, phải nhìn dưới kính hiển vi mới thấy được. Do vậy khó cỏ thể quan sát từng tế bào riêng lẻ, hơn nữa, bằng cách này cũng không ghi nhận được cảc tính trạng biến dưỡng, tính đề kháng và nhiều tính trạng khác. Do vậy, di truyền vi sinh vật không nghiên cứu từng tế bào riêng lẻ mà là đòng của tể bào, tức tập hợp của nhiều tế bào bắt nguồn từ một tế bào ban đàu nhở sính sản vô tính. Thông thường, tế bào vi sinh vật được cấy lên môi trường thạch đặc, rồi trải đều để các tế bào nằm rời xa ra thì mỗi tế bào mọc lên thành một cụm ròi gọi là khuẩn lạc (colony). Mỗi khuẩn lạc cũng là một đòng tể bào (clone) gồm các tế bào bắt nguồn tự sự phân chia của một tế bào ban đầu.

Khuẩn ỉạc (colony) của vi sinh vật

Mỗi khuẩn lạc dễ nhìn thấy bàng mát thường, có tối thiểu 1o7 (mười triệu) tế bào. Như vậy, các tính trạng ở vỉ sinh vật được ghi nhận qua một quần thể gồm hàng trăm triệu, hàng tỉ tế bào. Dòng tế bào mang một đặc tính di truyền nào đỏ gọi là chủng (strain). Ví dụ: chủng vi khuẩn tạo nhiều vitamin B 12 hay chủng vi khuẩn mất khả năng tổng hợp một axit amin nào đó.

20.3.3. Các tính trạng Các đột biến ở vi sinh vật thuờng được phát hiện theo sự biển đổi các tính trạng sau: a. Hình thái: kích thước, hỉnh dạng tế bào hay khuẩn lạc, có màng nhân hay không, khả năng di động... b. Sinh hóa: sự hiện diện của các sắc tố, màu sắc đặc trưng. c. Nuôi cấy: như kiểu hô hấp, kiểu dinh dưỡng (khuyết dưỡng - auxotroph) hoặc nhu cầu đòi hỏi các nhân tố tăng trưởng. d. Tinh đề kháng: như kháng thuốc, kháng phage, chịu nhiệt... e. Miễn dịch: như các phản ứng kháng thể, kháng nguyên... Các đột biển cỏ thể xuất hiện ngẫu nhiên hay do gây tạo ra nhờ các tác nhân gây đột biến. Mỗi gen có tần sổ đột biển đặc trưng. Các tính trạng ờ vi sinh vật được kí hiệu bàng 3 chữ tắt tiếng Anh hoặc đôi khi chữ hoa đầu tiên. Kèm theo kí hiệu còn thêm dấu + hoặc - hoặc chữ tắt để giải thích rõ thêm tính trạng. Ví dụ: lac để chỉ mất khả năng tổng hợp lactoz; his*' - tổng hợp histidin; strs nhạy cảm (Sensible) với Streptomycin, strR- đề kháng (Resistant) với Streptomycin. Để chi hai giới tính khác nhau không dùng hai kí hiệu 5 và s thay vào đó là các chữ như mỉ (+), mt (-) (mating typ) (ở Chỉamydomonas reỉnhardi), hoặc A, a (ở Neurospora crassa) hay a v à ữ (vi nấm).

Tảo đom bào Chỉamydomonas

317

20.3.4. Cấu trúc bộ gen ADN hiện diện trong bộ gen (Genome) của tất cả các loại tế bào từ vi khuân đên người. Giữa các sinh vật nhân sơ Prokaryota và nhân chuân Eukaryota có sự khác nhau đáng kể về kích thước, thành phần cấu tạo và tổ chức của ADN trong tế bào. Bộ gen của vi khuẩn E. coỉi và đa số các sinh vật nhân sơ là mội phân tử ADN có dạng vòng tròn kín. Khái niệm nhiễm sắc thể hiện nay được dùng cho cả vi khuẩn, nên nói nhiễm sắc thể vi khuẩn ta hiểu đó là sợi ADN. Ty thể và lục lạp cũng cỏ ADN riêng, mà cấu trúc bộ gen cũng tương tự vi khuẩn. Đa phần ADN của Eukaryota như nấm sợi, nấm men, vi tảo được tổ chức thành nhiều nhiễm sắc thể trong nhân tế bào. Mỗi nhiễm sắc thể chứa 1 phân tử ADN thăng mạch kép kèm theo một số protein nhu histon. Các nhiễm sắc thể có số lượng và hình dạng đặc trưng cho tế bào của mỗi loài sinh vật nhân chuẩn. Các virut có bộ gen rất đa dạng: ADN mạch đơn hoặc kép, ARN mạch đơn hoặc kép, nhưng chỉ một loại phân tử.

20.3.5. Kiểu sinh sản Các nấm sợi, nấm men, vi tảo có các quá trình sinh sản vổ tỉnh và hữu tính về căn bản giống các sinh vật bậc cao, thực hiện qua nguyên phân và giảm phần. Các vi khuẩn không có các cơ chế nguyên phân và giảm phân, phân chia tế bào theo cơ chế trực phân, nhưng cũng có sinh sản vô tính và sự trao đổi thông tin di truyền tương tự sinh sản hữu tính được gọi là quá trình cận hữu tỉnh. Các virut chỉ sinh sản ừong tế bào chủ sổng với nhiều cơ chế khác nhau phụ thuộc kiểu virut.

20.3.6. Vấn đề biến dị ở vỉ sinh vật Mãi đến năm 40, G. Beadle và E.Tatum lần đầu tiên sử dụng vi nấm Neurospora crassa vào nghiên cứu đi truyền học. Việc sử dụng chậm ừễ các đối tượng vi sinh vật vào nghiên cứu di truyền, một phần lớn do vấn đề biển dị. Trong khi ờ thực vật, động vật sự di truyền ở các tính tập nhiễm (do luyện tập hay bị nhiễm trong đời sống cá thể) đã được khẳng đjnh là không có thì ờ vi sinh vật vấn đề được hiểu ngược lại: chúng biển đôi trực tiếp dưới tác động môi trường. Nhiều hiện tượng thực tế tạo cảm giác các vi sinh vật biển đổi dưới tác động trực tiếp của môi trường. Ví dụ, hiện tượng các vi sinh vật nhòm thuốc hay các chất độc. Lúc đầu thuốc kháng sinh sử đụng với liều thấp, đần dần các vi sinh vật nhờn thuốc nên phải sử đụng liều cao. Trước đây một quan niệm phổ biến là các vi sinh vật biến đổi theo những quy luật đi truyền khác. Có thể nói vấn đề biến dị ở vi sinh vật là thành trì cuổi cùng của chù nghĩa Lamack (công nhận sự di truyền tỉnh tập nhiễm).

318

Tuy nhiên một số nhà di truyền học cho ràng biến dị ở vi sinh vật cũng tuân theo quy luật di truyền chung. Hiện tượng quen thuốc được giải thích là phẩn lớn tế bào nhạy cảm bị diệt, một số ít bị đột biến kháng thuốc còn sống sót nhờ sinh sản nhanh đã tạo quần thể mới vói kiểu gen kháng thuốc nên gây cảm giác “nhờn thuốc”. Tiếp theo nhiều thí nghiệm xác đáng chứng minh rằng biến dị ở vi sinh vật cũng xuất hiện do các đột biến ngẫu nhiên. Đó là thử nghiệm dao động (fluctuation test) của P.Luria vả M.Delbruck (1943) và đặc biệt là phương pháp in hay đóng dẩu của E. Lederberg (1952). Max Deỉbruck, Nobel 1969 cùng với Cho đến nay, thực tế cho thấy các dữ liệu A.D.Hershey vàS. Lurìỉa. nghiên cứu di truyền phân tử từ ADN, ARN, protein và các quá trình khác thu được từ các đối tượng vi sinh vật hoàn toàn có thể áp dụng cho sinh vật bậc cao. Hơn thế nừa, nếu thiếu những nghiên cứu ở mức độ đơn giản hơn ừên các đối tượng này thì khó hiểu được những cơ chế phức tạp hơn rẩt nhiều ở sinh vật bậc cao. 20.4. CÁC ỦTVG DỤNG T H ựC TÉ Di truyền học là cơ sở khoa học của chọn giống. Các thành tựu của đi truyền học được ứng đụng sớm, nhanh và nhiều hơn cả cho đến nay là trong chọn giống. Bước đầu, chọn giống đột biển đuợc ứng dụng và đã được những thành tựu ngoạn mục làm cơ sờ cho sự phát triển của công nghiệp lên men. Bước phát triển tiếp theo có tính chất cách mạng là ứng dụng công nghệ gen dẫn đến sự bùng nổ của Công nghệ sinh học, mà thế kỳ 21 được mang danh.

20.4.1. Chọn giống đột biến Các thành tựu của Công nghiệp vi sinh vật không thể tầch ròi với những tiến bộ nhảy vọt trong chọn ỉọc các chủng có năng suẩt cao. Các phương pháp chọn lọc đột biến được ứng dụng vào chọn giống làm tăng năng suất tạo các sản phẩm, làm biển đổi bản chất hoả học các chất và khắc phục một sổ nhược điểm của chủng được đùng trong sản xuất công nghiệp. Phương pháp chọn giống này có các đặc điểm: - Thu nhận kết quả rất nhanh.

319

- C h ỉ đánh g iá sàn phẩm th u được, kh ôn g quan tâm các b iế n đ ổ i sin h lí, sin h hoá.

Vi nấm Penoiciỉỉium chrysogenum Quá trình chọn giống các chủng Penỉcỉỉlium chrysogenum ở Mỹ có thể lây làm ví dụ điển hình cho phương pháp này. Từ dòng ban đầu có sản lượng 60mg/l, chọn các đột biến ngẫu nhiên được dòng 150mg/l, và sau đó sử dụng các đột biến nhận được do tác động tia X và u v . Việc chọn lọc theo nguyên tắc: lấy dòng có sản lượng cao nhất đem gây đột biến rồi chọn chủng có năng suất cao hen. Qua nhĩều bước trung gian cuối cùng cho đến nay nhận được dòng E.15.1 có sản lượng 7000mg/l. Trong bảng 20.2 không nêu một thành tựu quan ữọng là tạo chủng không sản sinh ra sẳc tổ độc, phải tốn kém nhiều cho việc loại bỏ sắc tố. Việc nhận các đột biển không tổng hợp sắc tố đã làm giảm đáng kể chi phí sản xuất và các dòng này được sử dụng để nâng cao năng suất trong quá trình chọn giống tiêp theo. Phưcmg pháp chọn giống đột biến đuợc sử dụng để tạo các chủng sản sinh ra nhiêu axit amin (như glutamic axit) hay các nucleotit. Ngoài ra còn có thể nhận các đột biến liên quan đến cơ chế điều hoà trao đổi chất: - Các đột biển cơ cấu (constitutive mutants): tạo sản phẩm không cần chất cảm ứng (inducer). - Các đột biển kháng ức chể ngược là các đột biến tạo sản phẩm nhiều mà không bị ức chế bởi sản phẩm cuối (end product repression). Phương pháp này đã đem lại những thành tích ngoạn mục, góp phần tích cực cho sự phát triển của công nghiệp lên men vị sinh như: - Chủng Penicillium chtysogenum ban đầu có năng suất 60 mg/1 và nay đạt 60000 mg/1, hom chủng ban đầu đến 1.000 lần. Chủng Corynebacterium glutamicum tạo glutamic axit đạt hom 200g/l (ban đầu 20g/l).

Vi khuẩn Corynebacterium gỉutamìcum.

- Chủng Serratia marcescens sinh ra biotin đạt 600mg/l.

Vi khuẩn Serratia marcescens

Riboflavin (vitamin B2) là sản phẩm thương mại được tổng hợp bằng phương pháp lên men và phương pháp hoá học. Siêu sản xuất riboflavin do 2 chùng vi nấm Eremothecium ashbyii vả Ashbya gossypii với sản lượng hom 20 g/1, gấp 40000 lần nhu cầu của nỏ.

Eremothecium ashbyỉi sinh vitamin B2ngay írên môi trỉtờng yy\

Sàn xuất vitamin B 12 ừong công nghiệp đo các chủng vi khuẩn Propionibacterium shermanii hoặc Pseudomonas denitrificans. Các chủng đột biến sản sinh một lượng sản phẩm lớn hơn rất nhiều so với nhu cầu của tế bào, thậm chí lớn hơn nhiều làn khối lượng khô cùa nó. Pseudomonas denitrificans sinh ra vitamin B )2 gấp 100000 lần nhu cẩu của nó. Cấu trúc cùa vitamin B ỉ2.

20.4.2. Cuộc Cách mạng công nghệ sinh học Công nghệ sinh học (Biotechnology, CNSH) là một thuật ngữ khoa học do kỹ sư người Hungary là Karl Ereky nêu ra vào năm 1917 để chi quả trình nuôi lợn với quy mô lớn bằng thức ăn là củ cải đường lên men nhờ các vi sinh vật. Sau đó vào năm 1961, tạp chí khoa học “JouARNl of Microbiological and Biochemical Engineering and Technology” (Tạp chí kĩ thuật và công nghệ vi sinh sinh hóa) được đỗi tên thành “Biotechnology and Bioengineering” (“Công nghệ sinh học và kĩ thuật sinh học”). Tuy nhiên, thuật ngữ này ít được nhắc đến ưong hơn 50 năm và chỉ được sử đụng rộng rãi sau phát minh ra Kĩ thuật đi truyền-Gentỉc engineering (KTDT) vào đầu những năm 70 của thế kỷ trước, cho nên có lúc người ta coi đó là sự "bùng nổ" của CNSH. Trước thập kỷ 70, CNSH được hiểu là sự lên men công nghiệp (industrial fermentation) vi sinh vật để tạo thương phẩm. Trong những thập kỷ 60 và 70, công nghệ lên men đã phát triển thành một ngành công nghiệp lớn ừên thế giới với doanh số gần ữăm tỉ USD/năm. Sự hoàn thiện các trang thiết bị ờ tất cả các khâu và sự kiểm soát, điều khiển phản ứng của tế bào ờ trinh độ cao làm tăng sân lượng đáng kể. Tuy nhiên, khâu quyết định lảm giảm đáng kể giá thành là năng suất chủng giống. Phương pháp chọn giống cổ điển được thực hiện với những chủng phân lập từ thiên nhiên và sau đó gây đột biển bằng tia tử ngoại, tia phóng xạ hay bẳng hóa chất.

322

CNSH thuở khởi đau.

Đẩu thập niên 1970, CNSH đã chuyển sang một giai đoạn mới cao hơn hẳn về chất nhờ KTDT. Các kĩ thuật mới cho phép tạo giống trực tiếp nhanh hơn, tận dụng nguồn gen từ nhiều sinh vật khác nhau để tạo các chủng sản lượng cao, mà ít tốn công sức để phân lập và gây đột biến như trước đây. Nhờ khả nãng vượt giới hạn tiến hóa của KTDT, các vi sinh vật, các tế bào động thực vật có thể được sử dụng như các “nhà máy sình học” (biological factories) để sàn xuất hàng loạt các protein người như insulin, hormone tăng trưởng, interferon,... Các động vật và thực vật có thể trở thành bioreactor tự nhiên tạo các sản phẩm từ gen lạ đưa vào, không cần lai tạo và chọn lọc các biến đị bằng lai trong loài như trước đây. Ngoài ra, KTDT đồng thời cung cấp các phương pháp ưị liệu và chẩn đoán mới để chữa trị bệnh ở người, cần nhấn mạnh răng, KTDT là công nghệ cao, gồm nhiều công đoạn phức tạp và nó thực sự đã tạo nên một cuộc cách mạng. Sự ra đời của Cách mạng sinh học mới làm cho thuật ngữ Công nghệ sinh học trở nên thông dụng vào nửa sau những năm 70. Trước 1973, người ta thường dùng các từ “Vi sình công nghiệp, Công nghệ lẽn men, Kĩ thuật sinh ho ả”.,. Công nghệ sinh học là một thuật ngữ rất đạt, đã bao hàm trong nó tất cả những tên đã gọi về các lĩnh vực ứng đụng trước đây và với nội dung mới. Nó phản ánh những thành tựu hết sức to lớn của sự phát ứiển sinh học ừong nhiều thập niên trước đó. Cách mạng sinh học mới cao hơn hẳn về chất so với “Cách mạng xanh” vào những năm 60. Từ thuở sơ khai thời cổ La Mã-Hi Lạp, khoa học là một hệ thổng nhất. Đên thời Phục hưng, sự phát ừiển khoa học dẫn đến sự tách biệt thành các ngành và chuyên ngành. Điều này cũng thể hiện rõ trong sinh học cho đến nay. Sự xuất hiện của cách mạng mới đã tạo ra các lĩnh vực đa ngành và hợp nhất các ứng dụng sinh học ở cấp độ tế bào VÀphân tử, đồng thòi gắn liền với công nghệ, dưới tên gọi chung là CNSH và được coi như "quyền lực ghê gớm nhất mà loài người giành đuợc kể từ sau thành tựu phân hạch nguyên tử " hay" Chúa tể của thế kỉ 21 Khó kể hết những thành tựu vô cùng to lớn của CNSH đến mức mà thế kỷ 21 được mang danh là thế kỷ công nghệ sinh học. Ở đây chỉ nêu tiếp một sổ ứng dụng chủ yếu liên quan đến các đối tượng vi sinh vật.

20.4.3. Giải mã các bộ gen của vi sinh vật Ngay từ năm 1995, Cr. Venter đã hoàn tất việc giải kí tự chuỗi của 2 loài vi khuẩn Haemophilus influenzae (1830121 bp) và Mycoplasma genitatum (0,58Mb). Hiện nay, sổ vi sinh vật được giải kí tự ehuỗi bộ gen đã xong là hơn 200 loài. Ngoài ra, nhiều loài quan trọng khác gồm: Streptomyces coeỉicoỉor (9,05Mb - 1996), Bacillus subtilis (4,21Mb 1997), Agrobacterium tumefaciens (,67Mb - 2001), Xanthomonas campestrìs (5,08Mb 2002) và Corynebacterium gỉutamicum (3,31Mb - 2003) đã biết được chi tiết về bộ gen.

323

Sự hiểu biết genomeics vi sinh vật có ỷ nghĩa hết sức quan trọng về mặt khoa học cơ bản cũng như ứng dụng, mà dự án nêu sau là một ví dụ về nghiên cứu đi sâu vào bản chất sự sống. Từ năm 2001, dự án tế bào vỉ sinh vật (Microbial Cell Project - MCP) được thực hiện với bốn mục tiêu: 1) Xác định các protein vi sinh tổ hợp thành các bộ máy protein để thực hiện nhiều qũá trình nội bào quan ừọng cho sự sống ; 2) Đánh giá đặc tính môi trường nội bào và các hiệu quà của nỏ lên các protein và bộ máy protein đến thực hiện các chức năng ; 3) Đánh giá đặc tính phân bố, số lượng, các luồng protein và bộ máy protein nội bào ; 4) Dùng điện toán xây dựng các mô hình gen - gen, gen - protein, các tương tác protein protein và hoá sinh nội bào. 20.4.4. Công nghệ protein tái tổ họp Những thí nghiệm tạo dòng gen đầu tiên được thực hiện ở vi sinh vật. Nhờ thao tác dễ dàng lại có công nghệ lên men phát triển mạnh, các vi sinh vật đã cung cấp rất nhiều sàn phẩm ở quy mô công nghiệp do KTDT, từ các protein, ADN, ARN đến các phân tử nhỏ. Từ lâu, các nhà khoa học mong muốn sản xuất các protein với số lượng lớn. Công nghệ gen cho phép sản xuất nhiều loại protein tải tồ hợp (recombinant protein - r-protein) khác nhau không những với sổ ỉượng lởn mà còn có chất lượng protein tốt hơn. Công nghệ r-protein thật sự đang phát triển với nhiều thành tựu rất ngoạn mục. Nhiều protein trị bệnh được biểu hiện ở các hệ thống vi khuẩn, nấm men. Chúng cần cho chữa trị một số bệnh, nhưng chiết tách từ cơ thể thì số lượng ít. Các r-protein đầu tiên được sản xuẩt nhờ các vi sinh vật chù như E. coỉi hay nấm men s. cerevisiae. Cụ thể là sáu trong bảy loại protein trị liệu với tổng doanh sổ không dưới 15 tỉ USD, mà bằng sáng chế (patent) đã hết hạn (thường khoảng 15 - 20 năm), được nêu trên bảng 20.1. Các protein tái tổ hợp được sản xuất gồm các nhóm chủ yểu: Bảng 20.1: Sáu loại r-protein trị liệu do E. coli hay s. cerevỉsiae tạo ra STT ] 2

Tên sản phẩm Insulin Interferon alpha

3 Interferon beta 4 Hormone tăng tnrờng người 5 -1 Erythropoetin 6 G-CSF (Granulocyte- Colony Stimulating Factor)

Các bệnh được điều trị Tiểu đường Viêm gan siêu vi c, mụn cóc qua đường tình dục, ung thư Xơ cứng (Multiple sclerosis) Thiểu năng tăng trưởng (Growth defiency) Thiếu máu Hóa tri liệu giảm bạch cầu trung tính (Chemotherapy-induced neutropenia)

Năm hết hạn patent 2001 2002 2003 2003 2004 2006

- Các protein trị liệu như một số nêu ưên bảng 20.1. - Các enzym: ADNz I, alginat lyaz, phenylalanin amoni lyaz, alpha-1-antitrypsin. - Các kháng thể dùng trong chẩn đoán và chữa trị nhiều bệnh. 20.4.5. Tạo các giếng vi sinh vật nhờ kĩ thuật di truyền E. coìi, Saccharomyces cerevisiae là những đối tượng đầu tiên được sử dụng KTDT để tạo ra các chủng sản xuất các r-protein người, tiếp đó là nhiều vi sinh vật khác. Sau đây là vài ví dụ cụ thể. a. Thiết kế trao đổi chất (Metabolic Design) KTDT đã can thiệp vào quá trình trao đổi chẩt ở cấp độ gen để sản xuất các chất phân tử nhỏ. Các ứng dụng đầu tiên của metaboỉomỉcs, công nghệ gen điều khiển trao đỏi chất, thực hiện ờ vi sinh vật. Hai ví dụ điển hình đầu tiên là tạo đòng tể bào E. coỉi sinh tổng hợp các chất, mà vốn nó không có khả năng này, như xanh indìgo và sắc tố đen melanin. Sự tạo dòng một gen từ Pseudomonas putìda vào E.coỉì làm nó có khả năng tổng hợp indigo xanh trong môi truờng có tryptophan. Sự tạo dòng gen tyrosinaz cho E. coỉi làm nó biến tyrozin thành dopaquìnom và chất này ngẫu biến thành melanin khi có không khí. Tiếp theo, các sàn phẩm trao đổi chất sơ cấp và thứ cấp được sản xuất từ các dòng thiết kế như các chủng sử đụng lactoz, chuyển hoả xyloz, sản xuất etanol từ pentoz, phân giải các chất dị sinh (xenobiotics),... b. Công nghệ bề mặt tể bào nấm men Các protein trên bề mặt tế bào nấm men cũng được tổng hợp bên trong tế bào, nhưng sau đó chúng được đưa ra gắn lên bề mặt tế bào. Dựa vào sự hiểu biết các gen tương ứng, công nghệ bể một tể bào (cell surface technology) đẫ ra đời, Sử dụng CN gen để cố định protein ngoại lai ừên bề mặt tế bào nhằm thay đổi và cải thiện chức năng của tế bào. Tiềm năng ứng dụng đa dạng của nó gồm: sản xuất các enzym, kháng thể, kháng nguyên, thụ thể.... Bước đầu, các nhà nghiên cứu đã thành công trong biểu hiện các enzym như glycosyl hydrolse, glucozamylaz, lipaz,... PTN Công nghệ sinh học phân tử của Đại học KHTN (TPHCM) đã tạo được chủng nấm men gắn protein GFP (green fluorescense protein protein phát huỳnh quang xanh lục của sứa) và chủng gắn alpha-amylaz. c. Sự can thiệp cùa KTDTvào sản xuất etanoỉ nhiên liệu Nấm men S. cerevisiae và vi khuẩn Zymomonas mobilis là 2 vi sinh vật chủ yếu có khả năng sử dụng ừong lên men etanol nhiên liệu. Nấm men vẫn giữ vai trò chủ yếu, nhưng nó không lên men xyloz, pentoz và một số loại đường khác. Do tầm quan trọng chiến lược cấp thiết, hiện tại và ưong tương lai có rất nhiều nổ lực được tập trung cho cải

325

thiện chủng giống nhằm sử dụng íổí hơn nguồn nguyên liệu đa dạng và thuận tiện cho quy trình công nghiệp. Các nghiên cứu chủ yểu nhằm thiết kế: - Các chùng sử dụng lactoz để tận dụng phụ phẩm công nghiệp sữa. - Các chủng vi sinh có khả năng chuyển hoá xyloz mà nấm men không đồng hoá - Các chủng nấm men phân giải tinh bột để lên men bột khỏi phải qua đường hoá. - Các chủng vi sinh vật để sản xuất etanoỉ từ pentoz. Ngoài ra, vấn đề quan trọng khác là sản xuất enzym cellulaz giá rẻ để giá thành etanoỉ nhiên liệu đủ sức cạnh tranh với xăng dầu. Chuyển hoả sinh khối thực vật thành etanoỉ nhiên liệu là một điểm nóng của CNSH hiện đạỉ. d. Cải biến các chủng vi sinh vật sản xuất vitamin - Riboflavin (Vitamin B2): Phương pháp mói sử đụng các loài Candida hoặc chủng Bacillus subtiỉus tái tổ hợp cho sản lượng 20 - 30g/l. - Tổng hợp các tiền chất của vitamin: Gần đây (1990) đã thành công trong tạo đòng các gen cho sự sinh tổng hợp carotenoit vòng, chứa p-caroten từ Erwinia uredovora. Sau khi 4 gen sinh tổng hợp P-caroten được chuyển vào z. mobiỉis và Agrobacterium tumefaciens, các khuẩn lạc màu vàng thu được trên các đĩa thạch. Các thể tiếp hợp sản xuất 220 - 350yg p-caroten trên gram khối ĩượng khô ở phaz ổn định trong môi trường nuôi. - Sinh tổng hợp L-ascorbic axit được cải biến nhờ KTDT. L-ascorbic axit (Vitamin C) thực hiện tổng hợp thương mại theo một quy trình đất tiền, bao gồm 1 giai đoạn lên men Vi sinh vật và một số giai đoạn hóa học bắt đầu với D-glucoz. Giai đoạn cuối cùng trong quả trình là sự chuyển hoổ 2-keto~L-gỉucoznìc axìt (2-KLG) thành L-ascorbỉc axit dưới xúc tác là axit. Do đó, cách tốt nhất để chuyển hoá glucoz thành 2-KLG là chế tạo một Vi sinh vật có mang tất cả các enzym cần thiết. Việc chuyển hóa D-glucoz thành 2,5-DKG bằng Erwirtia herbicoỉa bao gồm nhiều bước xúc tác bởi enzym, trong khi đó sự chuyển đổi 2,5DKG thành 2-KLG do Corynebacterium sp. đòi hủi chỉ một bước. Chiến lược đơn giản nhất để thiết kế một sinh vật cỏ khả năng chuyển D-glucoz thành 2-KLG là tách gen 2,5DKG reductaz từ Corynebacterium sp. và cho biểu hiện ừong Erwirtia herbicola. Các tế bào Envỉnỉci được biển nạp gen 2,5-DKG reductaz có khả năng chuyển hoả trực tiểp D-gỉucơz thành 2-KLG, vỉ các enzym nội bào của Envini nằm ở màng trong của vi khuẩn chuyển glucoz thành 2,5-DKG và 2,5-DKG reductctz xúc tác chuyển 2,5-DKG thành 2-KLG. Do đó, bằng thao tác gen, khả năng chuyển hoá của 2 Vi sinh vật rất khác nhau lại được kêt hợp thành một và do đó cỏ khả năng tạo sản phẩm cuối của quá trình chuyển hoả được thiết kế. Sinh vật loại này rất hữu ích như là một nguồn 2-KLG cho sản

xuất L-ascorbic axit, bàng cách đó thay thế 3 công đoạn đầu của quy trình hiện đang được sử dụng. Thông qua đột biến điểm định hướng bàng oligonucleotit đã thu được đột biến 2,5DKG reductaz có hoạt tính cao hơn khoảng 2 lần và bền với nhiệt hơn đạng enzym tự nhiên. Tóm lại, KTDT đã thể hiện quyền lực to lớn trong cài biến sinh giới về nhiều mặt, không những thay đổi các tính trạng khác nhau, mà can thiệp cả đến chi tiết các thành phần và quá trình trao đổi chất. Trên các đối tượng vi sinh vật, công nghệ gen đuợc ứng dụng đầu tiên, kỹ thuật đa dạng, hiệu quả hơn cả và hàng loạt sản phẩm đã xâm nhập thị trường từ năm 1982. 20.5. BIÉN DỊ Ở VI SINH VẬT Biển dị và đột biến có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu đi truyền học. Các đột biến gồm nhiều loại khác nhau và chúng được thu nhận dễ dàng từ các vi sinh vật nhờ các phương pháp phát hiện chuyên biệt. Các đột biến gen bắt nguồn từ những biến đổi phân tử ữên ADN. Con người có thể sử dụng các tác nhân vật lí và hóa học gây nên các đột biến nhân tạo hay cảm ứng. Các nghiên cứu về hồi biến giúp hỉểu rõ hơn về các ức chể trong gen của sự dịch mã Biến dị ở vỉ sinh vật cũng tuân theo các quy luật di truyền như ở sinh vật bậc cao. Nó cỏ nhiều loại và số lượng rất lớn, cung cấp nguyên liệu thường xuyên cho quá trình tiến hóa và nghiên cứu di truyền học. Nhiều phương pháp phát hiện và chọn ỉọc các đột biến khác nhau được sử dụng để thu nhận các đột biến có tần số xuất hiện rất thấp. Chúng góp phần đáng kể cho các nghiên cứu di truyền. Các thay đổi thêm, mất hay thay thế các nucleotit trên phân từ ADN dẫn đến các biến đổi phân tử, gây ra các đột biến gen như: lệch khung, sai hay nhầm nghĩa và im lặng. Phát minh ra các tác nhân gây đột biến vật lí và hóa học làm tăng đáng kể nguồn đột biến phục vụ cho nghiên cứu và chọn giống. Con người có thể tăng nguồn biến dị bằng lai tạo hay sử dụng các tác nhân gây đột biến. 20.5.1. Đại cưomg về biến dị ở vi sinh vật 20.5.L ì. Biển dị ở vi sinh vật cũng tuân theo quy luật di truyền chung Cỏ nhiều phương pháp chứng minh biến dị ở vi sinh vật cùng do các đột biến. Ở đây chỉ nêu 2 phương pháp chủ yếu: thừ nghiệm dao động (fluctuation test) và đặc biệt là phương pháp in hay đỏng dấu của E. Lederberg (1952).

327

a. Nguyên lý của thử nghiệm dao động (fluctuation test) Năm 1943, Luria và Delbruck tiến hành thí nghiệm như sau. Lấy 20 ống nghiệm cho vào mỗi ống một ít môi trường nuôi (lml) lỏng với một ít tế bào vi khuẩn nhạy cảm với bacteriophage và ủ cho chúng sinh sản đạt 108 tế bào/ml. Lấy dịch nuôi 20 ống nuôi riêng' lẻ và 20 Ống vói số địch nuôi tương tự từ bình lớn nuôi chung và dịch từng ống cấy lên các hộp Petri môi trưởng đặc chứa bacteriophage. Nếu đột biến là sự kiện ngẫu nhiên thì số lượng thể đột biến (mutants) ít (2 ở hình bên ưái) hay nhiều (8 - hình bên phải) do xuất hiện muộn hay sớm như mô tả ừên hình 20.1.

Hình 20. ỉ: Đột biển ỉà sự kiện ngẫu nhiên: số lượng thề đột biến phụ thuộc thời điểm xuất hiện. Sổ lượng thề đột biến (các tể bào tô đậm) ít (2 ở hình bên trái) hay nhiều (8 - hình bên phái) do xuất hiện muộn hay sởm trong dòng tể bào. Kết quả cho thấy có sự dao động (fluctuation) về số lượng khuẩn lạc kháng phage mọc lên từ dịch nuôi của 20 ống nuôi riêng lè. Cụ thể: 11 ống không có khuẩn lạc đề kháng, số còn lại có 1, 1, 3, 5, 5, 6, 35, 64 và 107 khuẩn lạc/hộp Petri. Trong khi đó, dịch nuôi 20 ổng từ bình lớn nuôi chung ít có sự dao động từ hộp Petri này sang hộp khác và trong koảng 1 4 - 2 6 khuẩn lạc/hộp Petri hay thuốc kháng sinh. b. Phương pháp in hay đỏng dẩu Các vi khuẩn được cấy để mọc rời từng khuẩn lạc trên môi trường cỏ dinh dưỡng. Dùng miếng nhung (có nhiều lông mịn) ấn nhẹ lên bề mặt môi trường thường để ghi dấu các khuẩn lạc nhờ các lông mịn, sau in đúng các vị trí khuẩn lạc ừên môi trường có phage hay thuốc kháng sinh. Các khuẩn lạc đột biến kháng phage hay kháng sinh mọc lên được. Căn cứ vị trí khuẩn lạc không mọc ở bản sao tách các đột biến tương ứng (hỉnh 20.2).

ị I-------------

-------- 1

Hình 20.2: Phiỉơngpháp in dùng phát hiện các đột biển. Như vậy, phưcmg pháp in cho biết phát hiện các đột biến đề kháng các nhân tố bất lợi nào đấy của môi trường trong quần thể vi khuẩn từ trước khi các tế bào của chúng tiếp xúc với tác nhân này. Điều đó có nghĩa răng, ví dụ, streptomycin không phải là nguyên nhân gây biến dị kháng thuốc, mà chỉ là tác nhân chọn ỉọc gìữ lại các ầột biến đã xuất hiện trước khi tiếp xúc với thuốc. Các đột biển này có kiểu hình giúp cho vi khuẩn thích nghi với biến đổi của môi trường và nhờ sình sản nhanh sau một thời gian ngẳn quần thể có kiểu hình mới. Các kết quả nghiên cửu này khẳng định các vi sinh vật cũng tuân theo các quy luật di truyền như các động vật và thực vật. Điều này có ý nghĩa rất lớn cho sự phát triển của di truyền học và sinh học phân tử. Do vậy, giải Nobel Y học năm 1969 được trao P.Luria và M.Delbruck vể đóng góp này. 20.5,1.2. Quả trình đột biến tự nhiên Đột biến theo nghĩa rộng chỉ các biến đổi di truyền xảy ra đột ngột. Từ xa xưa, con người đã nhận thẩy nhiều đột biển tự nhiên. Nhiều giống cây trồng và vật nuôi bắt nguồn từ các đột biến. Đột biển gen là đột biến được hiểu theo nghĩa hẹp, là chỉ những biển đổi xày ra bên trong cấu trúc gen. Mỗi đột biến gen dẫn đến sự thay đổi trình tự nucleotit tạo ra các alen khác nhau. Đột biến có thể xảy ra do biến đổi nhiều nucleotit, có thể do 1 nucleotit. Đột biến gen không phát hiện được khi quan sát tế bào học. Trong tự nhiên, đù giữ trong điều kiện nào, tất cả các gen đều có đột biến, được gọi là đột biển tự nhiên hay ngẫu nhiên (spontanous mutation). Các đột biến tự nhiên thường xuất hiện rất ít. Khái niệm tần số đột biển được dùng để đánh giá mức độ xuất hiện nhiều hay ít đột biến ở một gen. Có người phân biệt tần số (frequency) với tốc độ (rat) đột biến.

329

Bảng 20.2: Tần số đột biến ngẫu nhiên của một số gen Sình vật

Đột biến

Phage T2

Kim hãm tan r -» r+

E.coli

Lên men iactoz ỉac —> ỉac+ ỉeũ —*■ĩeu' arg+ arg trp+—» trp ara -» arã Kháng Streptomycin Stỉ2 -> StrR

Neurospora crassa

adenin ade' -» ade+

Tần số

Căn cử đánh giá

1.10'® Ị

đột biến/1 sao chép

2.10'7 7.10'10 4.10'9 6.10"8 2AQ-6

các tế bào đột biển / 1 lần phần bào đột biển /1 tế bào đột biển /1 tế bào đột biến /1 tế bào đột biến /1 tế bào

4.10'10

. đột biến /1 tế bào

4.10'8

đột biến/ 1 bào tử vô tính

Các gen khác nhau của cùng 1 sinh vật có thể có tần sổ đột biển khác nhau. Nhưng tần số đột biến tự nhiên đối với mỗi gen lả một số ổn định. Tần số đột biến được đánh giá theo các căn cứ khác nhau như: trên 1 lần sao chép, 1 lần phân bào hay ừên 1 giao tò và trên 1 tế bào /1 thế hệ (bảng 20.2). Để dễ hiểu các số trên có thể tính đảo ngược lại. Ví dụ: Ở E.coỉi đột biến từ nhạy cảm với streptomycin sang kháng tức Sứ? ->StrR với tần số 4.10"10 đột biến tính trên 1 tế bào/1 thế hệ. Để dễ hiểu ta có thể tính ngược lại tức trong 10 tỉ tế bào của một thế hệ có 4 đột biếnSỈ^ (resistance) kháng streptomycin xuất hiện ngẫu nhiên. Tuy tần số đột biến của từng gen là rất thấp, nhưng tổng các đột biến của nhiều gen là một số đáng kể, có ý nghĩa quan trọng cho tiến hóa. Đột biến ảnh hưởng đến mọi tính trạng khác nhau của sinh vật và tác động theo mọi hướng.

20.5.2: Các loại đột biến thường gặp ở vi sinh vật Vi sinh vật cũng có các loại đột biến như ở sinh vật bậc cao. Ở đây chỉ nêụ các đột biến thường gặp ở vì sinh vật và có ý nghĩa quan trọng đối với đi truyền phân tử. 20.5.2. ĩ. Đột biến gen hay đột biến điểm Biến đổi rất nhỏ trên một đoạn ADN, thường liên quan đến 1 nucleotit hay 1 cặp nucleotit.

a) Đột biến đồng nghĩa (Samesense) còn gọi là trung tỉnh (neutral) hay im lặng (silent), khi codon mã hóa cho một axit amin bị biến đổi, thường ờ bazơ thứ ba nên vẫn mã hóa cho axit amin đó (do tính suy thoái của mã di truyền. b) Đột biến vô nghĩa (Non-sense) khi codon mã hóa cho một axit amin biến thành một trong ba codon UAA, UAG và UGA là các codon kết thúc không mã hóa cho axit amin nào. c) Đột biến sai nghĩa (Mis-sense): Khi codon của axit amin này biến thành codon mã hóa cho axit atnin khác, làm thay đổi axit amin tương ứng trên phân tử protein. d) Đột biến lệch khung: Sự thêm 1 baza hay làm mất 1 bazơ dẫn đến các cođon sai nghĩa hay vô nghĩa so với codon tương ứng ban đầu từ điểm biến đổi về sau, sự dịch mã bị lệch khung cỏ tính dây chuyền từ bộ ba bị sai. 20.5.2.2- Đột biển nhiễm sắc thể Các đột biến nhiễm sắc thể hay còn gọi là sai hình nhiễm sắc thể xuất hiện ở sinh vật nhân thực. - Biến đổi trên 1 nhiễm sắc thể: mất đoạn, lặp đoạn, đảo đoạn. - Biến đổi giữa các nhiễm sẳc thể: chuyển đoạn. - Đột biến bộ gen (genome mutation) Đa bội thể (Polyploidy) hiểu theo nghĩa rộng là sự thay đổi số lượng nhiễm sắc thể gồm: Đa bội thể nguyên (Polyploidy hay Euploidy) (2n -> 3n, 4n, ...), đa bội thể ỉai còn gọi dị bội thể (AUoploidy)(2n A + 2n B) và đa bội ỉệch (Aneuploidy), hay đa nhiễm:(yí dụ: 2n + I hoặc 2n - 1). 20.5.2.3- Các biển đềi vi cấu trúc Các thay đổi thành phần nucleotit của gen. a) Đột biển thay thể: Thay một nucleotit này bằng nucleotit khác. - Đồng chuyển (Transition) khi pyrimidin được thay thế bời pyrimiđin hay purin bởi purin. Ví dụ: T thay cho c hoặc ngược lại. - Đảo chuyển (Transversion) khi pyrimidin được thay thế bởi purin hay purin bởi pyrimidin.VÍ dụ: T hay c thay cho A hoặc G và ngược lại. b) Mẩt nucỉeotit (Deletion): Mất một phần nucleotit của gen. c) Đột biến xen nucleotỉt (Insertion mutant): Thêm 1 hay nhiều nucleotit vào gen.

331

20.5,2.4- Các đột biến kiểu hình à) Các đột biến hình thái: Các biến đổi ảnh hường đến hình dạng, màu sắc và kích thước. Ví dụ: một dạng đột biến khuẩn lạc màu đỏ ở Serratia marcescen.

Hình 20.3. Đột biển khuẩn ỉạc màu đò ở Serratia marcescens.

b) Đột biến sinh hóa: - Các đột biến khuyết dưỡng (Auxotrophe mutation) làm mất khả năng tổng hợp các chất. - Các đột biến cỏ điều kiện: Các đột biến có thể không có biểu hiện trong những điều kiện giới hạn nhất định (restrictive condition) và có biểu hiện trong các điều kiện cho phép (permissive condition). Ví dụ, các đột biến nhạy cảm với nhiệt độ cao có biểu hiện ở nhiệt độ tương ứng. - Đột biến đề kháng: Các biến đổi sinh hóa giúp kháng lại được các tác nhân bất lợi. 20.5.2.5.

Đôt biến vờ hồi biển

a) Đột biển thuận hay trực tiếp (Direct mutation): Biến đổi từ kiểu hình hoang dại sang khác thường. b) Hồi biến (Reversion): Đột biến từ kiểu hình đột biến quay về kiểu hình hoang dại. - Hồi biển thật hay đột biển nghịch. Biến đi ừở lại y như ban đầu. Ví dụ: adenin -» guanin t

Đột biến thuận

ađenin t

Đột biến nghịch.

- Đột biến Iậtc chế hay kìm hãm (Supressor); Đột biến ở một điểm khác. Cả hai cùng tạo kiểu hình gần như hoang dại. - Đột biến kìm hãm ngoài gen: Xảy ra ở gen khác với gen bị đột biển.

Đột biến kìm hãm trong gen: Xảy ra ở nucleotit khác trong gen đưa gen trở về trạn thái tạo kiểu hình hoang dại. Nói chung, các đột biến là các biển đổi rắt đa dạng của vật chất di truyền và có nhiều tác động khác nhau. 20.5.3- Các phương pháp phát hiện đột bỉến Để nghiên cứu chi tiết về các đột biến, cần có các phương pháp phát hiện chúng một cách tương đối đầy đủ và chính xác. Đây là công việc khó khăn vì đa số đột biến ở dạng lặn và nhiều dạng khó phát hiện. Sự hoàn thiện các phương pháp phát hiện đột biến đã góp phần đáng kể cho sự phát triển của di truyền học và sinh học. 20.5.3,1-

Các hệ thống chọn lọc đột biến ở vỉ sinh vật

Muốn phát hiện các đột biến có hiệu quả càn có hệ thổng chọn lọc để tìm thấy các đột biến hiếm hoi trong khối rất lớn các dạng không đột biển. Các hệ thống chọn lọc đột biến có nhiều và phụ thuộc vào các đột biến khác nhau. Bảng 20.3 nêu các cách phát hiện 3 dạng đột biến. Bảng 20.3. Cơ sở phát hiện các kiểu hình đột biến của 3 loại đột biến căn cứ kiểu hình Đột biến có điều kiện (nhạy câm nhiệt độ)

Đột biến khuyết dưSmg

Đột biến đề kháng

Kiểu gen Nhiệt độ thường

Nhiệt độ cao

Kiểu hoang dại

Binh thưcmg Bình thuòmg

Đột biến

Bình thường

Đột biến

Không bổ sung

Có bổ sung

Không tác nhân

Có tác nhân

Tăng trưởng

Tăng trướng

Tăng trưởng

Không

Không

Tăng trưởng

Tăng trưởng

Tăng trưởng

Khái niệm lực phân giải (resolving power) được đùng để chỉ khả năng phát hiện các đột biến rất hiếm. Lực phân giải càng lớn khi phát hiện được các đột biến càng hiếm. Ví dụ, các đột biến đề kháng có độ phân giải cao vì khi cấy sổ lượng rất lớn tế bào lên môi trường chọn lọc có chứa tác nhân đù phần lớn tế bào chết, chỉ số rất ít tế bào có đột biến đề kháng mọc thành khuẩn lạc.

333

i

20.5.3.2. Phương pháp đề kháng Ở vi khuẩn, các tác nhân chọn lọc thucmg là thuốc và phage. Các đột biến dễ dàng được phát hiện trên môi trường agar có thuốc hay phage ở dạng các khuẩn lạc được mọc lên như trên hình 20.3. 20.5.3.3. Phương pháp làm giàu chậm (Default enrichment method) Việc phát hiện các đột biến khuyết dưỡng khó khăn hơn. Dung dịch vi khuẩn pha loãng được cấy lên bề mặt môi trường agar tối thiểu để mọc rời thành khuẩn lạc. Một lớp môi trường tương tự được đổ lên trên, phủ ỉớp mỏng. Hộp Petri được ủ để các khuẩn lạc bình thường mọc lên. Sau đó, đổ phủ lên thêm một lớp môi trường đinh dưỡng có bổ sung và ủ tiếp cho chất bổ sung khuếch tán. Các đột biến khuyết dưỡng sẽ mọc sau, khi có chất bổ sung, nên khuẩn lạc nhỏ hom do mọc chậm. 20.5.3.4. Phương pháp làm giàu hạn chế (Limited enrichment method) Đây là đạng đơn giản hơn của phương pháp lảm giàu chậm. Các vi khuẩn được cấy trên môi trường tối thiểu có một ít bổ sung. Trong điều kiện đó, các đột biến khuyết dưỡng mọc đến khi hết chất đinh dưỡng bổ sung thì dừng, nên tạo khuẩn lạc nhỏ. Các vi khuẩn bình thường tiếp tục mọc tạo khuẩn lạc to. 20.5.3.5. Phương pháp làm giàu nhờpenỉxilin Phương pháp được áp dụng cho các vi khuẩn. Penixilin có tác động diệt các vi khuẩn bình thường khi phân chia. Các vi khuẩn được cho vào môi trưởng tối thiểu có penixilin. Các vi khuẩn đang tăng trưởng bị diệt, chỉ các tế bào đột biển không tăng trưởng còn sống sót. Sau đó, hỗn hợp được cấy lên môi trưởng không có penixỉlin thỉ các đột biến khuyết dưỡng mọc lên với tỉ lệ tương đối cao hơn (hình 20.4). Te bào E. coli nuôi trong môi trường đủ được gây đột biển

Tế bào E. coli nuôi trong môi trường có penicillin thiếu leuxin

H ình 20.4. Phương p h á p penicillin chọn lọc âm tính (ví dụ chọn le u ).

334

Các tế bào E. coli được nuôi trên môi trường đủ và gây đột biến. Rửa sạch tế bào khỏi MT đủ và chuyển sang MT có penicillin thiếu leuxin (- leuxin). Sau đó cấy tế bào lên hộp Petri chứa MT có leuxin (MT + leuxin), các tế bào mọc lên thành khuẩn lạc. In các khuẩn lạc sang hộp Petri chứa MT tối thiểu không có leuxin. So sảnh 2 hộp Petri xác định được dòng tế bào đột biến: mọc trên MT đủ (+ leuxin) và không mọc trên MT thiểu leuxin (- leuxin) 20.5.3.6. Phương pháp lọc Phương pháp được sử dụng để chọn lựa các đột biến khuyết dưỡng ở nấm sợi. Dung dịch các bào tử được nuôi trong môi trường dinh dưỡng thiếu chất bổ sung. Các đột biến thiếu chất bổ sung không mọc được, các dạng bình thường mọc ra nhiều sợi. Khi lọc qua màng lọc sợi thủy tinh, các dạng bình thường nhiều sợi bị giữ lại, các dạng đột biến đi qua màng lọc. Dung dịch có nhiều dạng đột biến được cấy lên môi trường có chất bổ sung và kiểm tra tìm các dạng đột biến. 20.5.3.7- Phương pháp ìn Các vi khuẩn được cấy để mọc rời từng khuẩn lạc trên môi trường có đinh dưỡng. D ù n g m iế n g n h u n g (có n h iều lông m ịn ) in đ ú n g các VỊ trí kh u ẩn lạc trê n m ô i trư ờ n g tối

thiểu. Các khuẩn lạc đột biến không mọc lên được. Căn cứ vị trí khụẩn lạc không mọc ờ bàn sao tách các đột biến khuyết dưỡng (hình 20.5 phía ttên). a

c

b e d

1 Khuẩn lạc đột biến mọc trên môi trường âủ

I Khuẩn lạc đột biến không mọc

Môi trường đù

Môi trường tối thiểu

Hình 20.5. Phưcmg pháp in.

335

a) Khúc gỗ bọc miếng nhung vô trùng, b) Đĩa gốc trên môi trường đầy đù. c) Miếng nhung đã in dính tể bào tương ứng các khuẩn lạc. d) Môi trường đù hoặc có bổ sung chất cần thiết, e) Môi trường tẻi thiểu không có có bỗ sung. Ngoài các phương pháp nêu trên còn có các phương pháp chuyên biệt để phát hiện nhiều loại đột biển khác. 20.5.4- Cơ chế phân tử của đột biến 20.5.4.1- Các biến đổi írênA D N Tất cà các đột biến đểu do những thay đổi trình tự nucleotit ưên ADN. Các đột biến có thể xảy ngẫu nhiên (spontaneously) hay gây tạo (cảm ứng - induced) bởi các tác nhân gây đột biến (mutagens). Các đột biến có thể do thay đổi từng cặp bazơ hay những trình tự đài hơn. Đột biển điểm (Point mutation) là biến đổi trình tự của một cặp bazơ. Đột biển điểm có thể do chuyển đổi hoá học bazơ này thành bazơ khác hoặc do bắt cặp sai trong sao chép. Sự biến đổi gồm nhiều kiểu: - Sự đồng chuyển: thay cặp G*c bàng A T và ngược lại. - Sự đảo chuyển: thay A-T bằng T-A và ngược lại. - Sự bát cộp sai (Bazơ mispairing) là sự bắt cặp không theo đúng nguyên tắc của mô hình Watson-Crick, mà là adenin vói cytosin, thymine với guanin. - Xen đoạn (Insertion) là sự thêm vào một đoạn cặp bazơ vào ADN. Tăng đôi đoạn (Duplication) là một dạng đặc biệt của xen đoạn. - Mất đoạn (deletion) là sự mất đi một trình tự ADN, mà trình tự hai bên nối lại với nhau trừ trường hợp mất đầu mút nhiễm sắc thể. Transposon hay phần tử di động (transposable element) là trình tự ADN có khả năng tự xen vào (hay bản sao chính nó) ờ vị trí mới ữên bộ gen (genome), mà không cần có quan hệ gì với locus mục tiêu. Xen đoạn là kiểu đột biến phổ biển nhất và do sự di chuyển của các phần tử di động (ch. VI). Phần lớn đột biến ngẫu nhiên do sự hiện điện của các bazơ bất thường trên ADN. Ngoài ra, một số bazơ bị biển đổi (modified bazơs) như thường gặp hơn cà là 5meíyỉcytosin, được tạo ra do enzym metylaz thêm nhóm metyỉ vào một số cytosin ở những điểm đặc biệt trên ADN. 20.5.4.2- Các sai hỏng trong sao chép AD N Các đột biến có thể xảy ra do sai lầm khi sao chép ADN.

336

Mỗi bazơ tồn tại ở 2 dạng cấu trúc được gọi là tautomer. Ví dụ, adenin bình thường mang nhóm NH2 cung cấp nguyên tà hydro cho sự bắt cặp bổ sung với dạng keto (C = o keto form) cùa thymine. Khi có biến đổi tautomer, adenin chuyển sang cấu trúc hiểm là dạng imino NH sẽ bắt cặp bổ sung với cytosin. Thymine có thể chuyển sang dạng enoỉ (COH) không có trong ADN bình thường và bắt cặp với guanin. Khả năng bắt cặp sai của bazơ với tautomer không đúng đã được Watson và Crick nêu lên. Sự bắt cặp sai này có thể là các đột biến đồng chuyển, trong đó purin thay bằng purin khác và pyrimíđín thay bằng pyrimidin khác. Các biến đổi trên, ngoài việc thay thế các nucleotit ừên mạch ADN còn có thể làm tăng thêm hay khuyết các nucleotỉt gây nên các kiểu đột biến ảnh hường đến sinh tổng hợp protein. 20.5.4.3-

Ảnh hưởng của đột biến gen đến sinh tổng hợp protein

Sau khi tìm hiểu về dịch mã và mã di truyền, cần lưu ý đến biến đổi ảnh hưởng đến nghĩa codon và vị trí biến đổi ở đầu hay cuối mạch polypeptit. a) Đột biến lệch khung Hai kiểu đột biến có hiệu quả nặng là thêm bazơ (addition) và mất bazơ (delection). Các biến đổi này thường làm enzym mất hoạt tính. Sự thêm 1 bazơ hay làm mất 1 bazơ dẫn đến sự dịch mã ỉệch khung. Từ điểm biến đổi về sau, từ bộ ba bị sai cái sai sẽ kéo đài liên tục đến cuối mạch polypeptit. Ví dụ; - Bình thường: mARN: CCG GGA AGC AAU Polypeptit: Pro Gly Ser

Asn

- Đột biến lệch khung xen đoạn (Frameshift - insertion) mARN: CCG AGG AAG CAA Polypeptit: Pro Arg Lys

Gln

- Đột biến lệch khung mất đoạn (Frameshift - deletion) mARN: CCG GAA GCA AUG Polypeptit: Pro GIu Asp Met Sự tổng hợp mạch polypeptit có thể bị kết thúc sớm néu sự lệch khung dẫn đến codon kết thúc. b) Đột biển thay thể (Bazơ substitution) Đột biến thay thế bazơ nếu là đột biến sai nghĩa (mis-sense) sẽ có hiệu quả thay đổi từ axit amin này thành axit amin khác trong mạch polypeptit, còn nếu là đột biển vô nghĩa

337

(non-sense) hay đột biến trung tính (hay im lặng) sẽ không ảnh hưởng đến mạch polypeptit Ví dụ: - Bình thường: mARN: CCG GGA AGC AAƯ Polypeptit: Pro Gly Ser

Asn

- Sai nghĩa (Missense): mARN: CCG GCA AGC AAU Polypeptit: Pro Val Ser

Asn

- Vô nghĩa (Nonsense) mARN: CCG UGA AGC AAU Polypeptit: Pro STOP 20.5.4.4.

Sai hỏng ngẫu nhiên

Ngoài các sai hỏng ừong sao chép, phân tà ADN còn chịu các sai hỏng ngẫu nhiên có thể dẫn đến đột biến. Hai kiểu sai hỏng ngẫu nhiên thường gặp là mất purin (depurination) và mất amin (desamination). Mất purin là kiểu sai hỏng thường hơn, xảy ra khi liên kết glycosidic giữa c 1 của pentoz với baza bị đứt và làm mất A hoặc G. Sự mất amin của cytosin tạo ra uracil. Các gốc Ư không được sửa sai sẽ bát cặp bổ sung với A trong sao chép, gây ra đồng chuyển G-C-»A-T. Trong các enzym sửa sai, uracil ADN-glycosylaz nhận biết đặc hiệu uracil trên ADN và cắt rời tạo lỗ hỏng, sau đó được tổng hợp lại đúng theo mạch bổ sung. Trên phân tử ADN, một sổ cytosin được metyl hóa thành 5-metyl cytosin, chất này mất nhỏm amin biến thành thymine. Sai hỏng này không bị uracil-ADN-glycolaz phát hiện nên không được sửa lại. Sự chuyển c —» T do mất amin thường xảy ra ở các điểm có 5metyl cytosin. Kiểu biến đổi này có ở cà vi khuẩn và tế bào sinh vật bậc cao. 20.5.5. Đột biến nhân tạo hay cảm ứng Các tác nhân làm tăng tần số đột biển cao hcm mức tự nhiên được gọi là các tác nhân gây đột biển (mutagen). Các tác nhân vật lí như phóng xạ, tia X, tia tử ngoại gây đột biến. Nhiều hóa chất là tác nhân gây đột biến như các đồng đẳng của các bazơ nitric, HNƠ2 (niừous axit), các chất alxyl hỏa mạch...Các đột biến loại này được gọi là đột biển nhân tạo hay đột biến cảm ứng (induced mutation). Đối với các vi sinh vật, các tác nhân gây đột biến chủ yếu là tia tử ngoại và một sổ hóa chất.

338

20.5.5.1. Tác động của tia tử ngoại Tia từ ngoại có bước sóng dài (10'5 - 10'6 cm) nên khó tạo ion, có lẽ chi tác động đến những chất hấp thu nó trực tiếp. Trong tế bào, các chất hữu cơ’có mạch vòng chủ yếu như purin và pyrimidin hấp thu trực tiếp tia tử ngoại. Mối liên quan chặt chẽ giữa tia tử ngoại và các cấu phần của ADN đã được chứng minh. ADN hấp thu tia tử ngoại mạnh nhất ở bước sóng 2537Ằ, đây chính là bước sóng làm tăng tần số đột biến.

Hĩnh 20.6. Tác động cùa tỉa từ ngoại tạo các dimer thymine. Dưới tác động cùa tia từ ngoại, cytosin gắn thêm phân tử nước vào liên kết c = c của mạch vòng (hình 20.6) và thymine bị đứt liên kết c = c mạch vòng nối 2 phân tử thành thymine dỉmer. Ston và các cộng sự đã nhận thấy tần số đột biến tăng lên ở Staphylococcus aureus khi môi trường nuôi chúng được chiểu tia ƯV trong thời gian ngăn trước khi cẩy vào. Đây là tác động gián tiếp của tia từ ngoại.

339

Có thể khi hiện diện oxy, tia tử ngoại tạo ra nhiều hơn các gốc peroxit: H* + 0 2

HO*2

HO *2 + H*-> H2O2 2HO*2 + H*

H2O2 + O2

Các peroxit là những phân tử có phản ứng mạnh, chúng dễ tạo các đột biến. Hiện tượng quang phục hồi (photoreactivation) là một đặc điểm trong tác động của tia u v . Sau khi chiếu tia tử ngoại lên tế bào, nếu để ngoài ánh sáng, thì các sai hỏng phần lớn được phục hồi. Ánh sáng có tác động hoạt hóa enzym sửa sai, cắt đút các thymine dimer. 20.5.5.2.Các tác nhãn gây đột biến hỏa chất Ngay từ đầu những năm 1930, Xakharov và Lobashov (Liên Xô) đã tiến hành thử nghiệm gây đột biến bằng hóa chất, nhưng hiệu quả chưa rõ. Vào những năm 40, trong thế chiến thứ hai ở Anh, Auerbach và Robson đã chứng minh hơi ngạt nitơ và sulfua có khả năng gây đột biến ở Drosophila (thòi này Đức bắn hcả ngạt sang nước Anh, nên họ phải nghiên cứu tác động sinh học của các chất độc này), v ề sau, nhiều nhóm hóa chất gây đột biến đã được tìm ra. Có nhiều hóa chất gây biến dị dì truyền, đến nay tim ra những hóa chất cho hiệu quả đột biến cao hơn cả phóng xạ. Các hóa chất gây đột biến có đặc điểm lả có thể chỉ gây hiệu quả đột biến đối với một số lượng ít đối tượng. Ví đụ: Streptomycin chỉ gây đột biến ở tảo đơn bào và một sổ vi sinh vật, không gây đột biến trên nhiều đối tượng khác. Các tác nhân gây đột biển hóa học cỏ thể chia thành các nhóm sau: Nhóm 1: Các chất ức chế tổng hợp nitơous bazơ trong cấu trúc ADN như coíĩein, etyl uretan...

H ình 20.7. Thymine

340

vờ 5-Bromuracil (dạng keto).

Hình 20.8. Adenin bẳt cặp với 5-Bromuracìl và Guanin với 5-Bromuracil.

Hình 20.9. Công thức của etyỉ metansuifonat (EMS) - Nhóm 2: Các chất đồng đẳng với nitơous bazơ như coíĩein, 5-bromuracil (hình 20.7 và 20.8), các chất gần giống với nítơous bazơ, nên nó làm ADN gắn nhầm khi tổng hợp. - Nhóm 3: Các chất alkyl hóa làm đứt mạch ADN như etyl metansulfonat (EMS) (hình 20.9), metyl metansulfonat (MMS), etylen imine (EI), niừosoguanidin (NG),... - Nhóm 4: Các chất khác như nhóm oxy hóa, khử,: Ngược với sai hỏng sao chép, các tác nhân gây đột biến như nitrous axit và khí ngạt nitơ (nitơ mustard) cỏ thề gây biến đổi trực tiếp ưên ADN. - Nhóm 5: các chất chêm vào ADN Nhỏm các chất gồm proflavin, màu acridin và cảc chất được gọi là ICR (ICR compound) là những chất có phân tử mặt phẳng tương tự cặp baza. Chúng có thể chêm vào phân tử ADN làm thêm hoặc mất bazơ. Chúng thường gây đột biến lệch khung do thêm hay mất bazơ. Tất cả các tác nhân gây đột biến đều là tác nhân gây ung thư (carcinogen), nhưng các tác nhân gây ung thư không phải đều gây đột biến. Hiện nay nhiều tác nhân gây đột biến được sử dụng trong chọn giống nhằm tăng nguồn biến đị. Bên cạnh đó với nạn ô nhiễm trên thế giới người ta phát hiện nhiều tác nhân đột biến hỏa học mới xuất hiện ưong môi trường.

341

20.5.6. Hồi biển Quá trình đột biến, nói chung, có tính thuận nghịch, nghĩa là nếu một gen A đột biến thành a (.A ~> à) thì, ngược lại alen a cũng có thể đột biến quay lại thành A (a ->A). Thông thường một dạng được gọi lả đột biến khi nó mang kiểu hình khác với dạng hoang dại. Ví dụ, ruồi giấm hoang dại được bắt từ thiên nhiên vào phòng thí nghiệm có mắt đỏ. Trong quá trình nuôi xuất hiện dạng đột biến mắt trắng. Đột biến từ mắt đỏ hoang dại sang mắt trắng gọi là thuận vì từ hoang dại thành đột biến. Hồi biển là truờng hợp từ trạng thái đột biến do biến dị di truyền quay trở về kiểu hình hoang dại như đột biến từ mắt trắng trở lại thành mắt đỏ. Hồi biến do đột biến nghịch (back mutation) hoặc đo đột biến ức chể hay kìm hãm (supression). 20.5.6.1.

Các đột biến nghịch

Đột biến nghịch có được khi gen đột biến có sự biến đổi quay ừở lại có y cấu trúc như gen hoang dại ban đầu. Trường hợp này khó xảy ra và khi lai trở lại với dòng hoang dại thì thế hệ con tất cà đều có kiểu hình hoang dại. Ví dụ: - Đột biến nghịch: m" -> m+, khi lai với dạng hoang dại cho thế hệ con đều hoang dại - Đột biến ức chế: m~su+-> nTsu-, khi lai với dạng hoang dại trong thế hệ con sẽ có một ít kiểu hình đột biến. 20.5.6.2-

Đột biến ức chế

Đột biến ức chể (Suppressor mutation) là đột biến có tác động ngược lại hay kìm hãm của một đột biến khác. Các đột biến ức chế có những tính chất sau: * Đột biến ức chế xảy ra ở điểm khác với đột biến bị ức chế. Khi lai thể hồi biến (revertant) với dạng hoang dại sẽ xuất hiện dạng đột biến bị ức ché do tái tổ hợp làm tách rời không bị kìm hãm bởi đột biến ức chế (hình 20.10). - Đột biển ức ché có thể xảy ra ừong cùng một gen, ngoài gen hoặc ở gen khác. - Các đột biến ức ché có thể thực hiện tác động bằng nhiều cách khác nhau. Ví dụ, các đột biến ức chế có thể tảc động lên sự phiên mã, địch mã hay những biểu hiện sinh lí khác của tế bào. Đột biến kìm hãm thưòmg gặp hơn, nó có được đo 1 đột biến thứ hai làm cho biểu hiện kiểu hình của đột biến không biểu hiện ra được nên có kiểu hình hoang đại. Đột biến kìm hãm có thể xảy ra ngay ứên cấu trúc gen. Ví đụ: đột biến thuận mất một nucleotit, đột biến kìm hãm xảy ra gần chỗ đó thêm vào một nucleotit. Đột biến kìm hãm có thể đo sự bổ sung trong chu trinh trao đổi chất. Sai hỏng do đột biến thứ hai tạo sản phẩm bù trừ được đột biến thứ nhất.

342

Vào năm 1962, S.Benzer và Chemp mô tả đột biến được gọi là đột biến amber ở locus rll của phage T4. Chúng có thể trờ về kiểu hình hoang dại do đột biến khác (đột biến ức chế) ở bộ gen của tế bào chủ. Các đột biến ức chế được phát hiện ở nhiều gen khác của phage T4 và E.coỉi. Các nghiên cứu sử dụng hệ thống gen- enzym cho thấy, các đột biến amber dẫn đến sự kết thúc sớm hơn bình thường sự mọc dài của mạch polypeptit và ở trong các tể bào chỉ các đoạn có đầu NH 2 của các polypeptit tương ứng được tổng hợp. Nhờ đột biến ức chế, tổng hợp mạch polypeptit được hồi phục. A.Haren, khi nghiên cứu sự kiểm soát di truyền đối với tổng hợp enzym photphataz kiềm ở E.colì, đã so sánh thành phần các gốc axit amin trên phân tử enzym của dạng hoang dại và ở các thể hồi biến trong gen mã hóa cho enzym. Kết quả trên hình 20.10 cho thấy các ức chế đối với amber liên quan đến một thay thế nucleotit trong codon. Trên cơ sở các sổ liệu này đã xác định được codon - amber là UAG. Sau đó, 2 codon chấm dứt khác được tìm ra là ochre UAA và opaỉ VGA.

UGG Trp ÁAG Lys' CAG Gly GÀG Glu

Amber UAG

s&r Trn ■^Trp Leu

UCG UÁU UAC UUG

Hình 20.10. Sự thay thể các axit amin do các đột biến ức chế đổì với các đột biển amber ở gen cẩu trúc của enzym photphataz kiềm. Cảc biển đ ị ức chế được đùng để nghiên cứu sâu hơn về cơ chế dịch mã. Ví dụ, các đột biến ảnh hưởng tới anticodon của tARN, làm thay đổi tính đặc hiệu mã hóa của nó, có thể tạo khả năng ức chế đột biến khác ờ mức phiên mã. Các đột biến ức chế đối với cođon vô nghĩa (nonsens-suppressor) thường xảy ra trên các tARN, mà anticođon của nó có thể bị biến thành anticodon bổ sung với codon kết thúc do sự thay thế một nucleotit. Các nonsens - suppressor như vậy thường là ừội. Có thể xảy ra các đột biến ức chế đối với các đột biển nhầm nghĩa. Ví đụ, tARN8ly của axit amin glycine có anticodon CGC thường bắt cặp với GGG (gly) trên mARN. Sự biến đổi đột biến cùa anticodon thành c u c dẫn đến chỗ tARN8ly đột biến bát cặp với GAG (glutamic axit). Như vậy, néu như đột biến thuận ở một gen cấu trúc nào đỏ biến codon GGG (glycine) thành GAG (glutamic axit) của đột biến nhàm nghĩa (missens mutation), thì sự ức chế đối với đột biến này cỏ thể do đột biển của tARNsly với anticodon c u c sỗ gán glycine vào chỗ bị đột biển (ở đột biến nhầm nghĩa là glutamic axit).

343

Các đột biến xảy ra trên tARN có thể là đột biến ức chế đối với các đột biến lệch khung. Sự ức chế ở mức phiên mã có thể xảy ra do các đột biên trên các gen mã h ó a một sô protein của riboxom. 20.6. DI TRUYÈN HỌC VI KHUÂN Các vi khuẩn có quá trình sinh sản cận hữu tính nên vẫn thực hiện được tái to hợp di truyền. Ở vi khuẩn, thông tin di truyền được truyền một chiều từ thể cho sang thể nhận và tạo ra hợp tử từng phàn. Tái tổ hợp ở vi khuẩn có thể thực hiện bằng các đoạn ADN ưần trong biển nạp, hay phage ừong tài nạp, nhờ giao nạp khi 2 tế bào khác giới tính gắn với nhau. Bản đồ di truyền vi khuẩn được xây dựng nhở các phương phác khác nhau: giao nạp gián đoạn hoặc không gián đoạn, tái tổ hợp hay dùng mất đoạn. Plasmid là những ADN vòng ừòn có thể tồn tại độc lập hoặc chèn vào ADN tế bào chủ có vai trò quan trọng ừong chuyển gen. Transposition là sự chuyển vị gen gồm IS, Tn và phage Mu. Các phàn tử đi động có thể gây biển đổi sự biểu hiện gen. Vào những năm 1940, tái tổ hợp ở vi khuẩn E. coli được chứng minh. Từ đó đến nay, vi khuẩn E. coli ừở thành đối tượng mô hình cho di truyền học và sinh học phân tử. Những nghiên cửu ừên đối tượng này đã phát hiện các cơ chế căn bàn của sự sống ở cấp độ phân tử như sao chép ADN, sinh tổng hợp protein và điều hòa biểu hiện gen. Ngoài ra, các phát hiện về các quá trình di truyền đặc biệt ở vi khuẩn như biến nạp, tải nạp, giao nạp, transposition và plasmid có ý nghĩa quan trọng cho sự phát triển của di truyền học phân tử và góp phần xây dựng nên kĩ thuật di truyền.Trong một thời gian dài, các nghiên cứu di truyền học được tién hành ở các sinh vật nhân thực Eukaryota, còn ở vi khuẩn thì chưa vì cho ràng không cỏ sinh sản hữu tính. Khác với virut, vi khuẩn và cổ vi khuẩn (bacteria and archaea) là những tế bào sống thực hiện các chức năng căn bản của tế bào. Các sinh vật Prokaryota như vi khuẩn, vi khuẩn lam cũng có các quá trình sinh sản tương đương sinh sản hữu tính, được gọi là cận hữu tính (parazxuality). Sự đi truyền nhờ các quá trình cận hữu tính này ở vi khuẩn có những đặc điểm: - Sự truyền thông tin một chiều từ tế bào cho (donor) sang tế bào nhận (recipient). - Sự tạo thành hợp tử từng phần (merozygote). Thể cho (donor) chỉ chuyển một đoạn của bộ gen sang thể nhận (recipient) nên chi lưõng bội ở một phần, các phần khác đom bội.

344

- Bộ gen thường chi là một ADN trần nên chỉ có một nhóm liên kết gen và tái tổ hợp thực chất là giữa hai phân tử ADN. 20.6.1- M ột vài đặc điểm của vi khuẩn 20.6.1.1- Kiểu hỉnh và kiểu gen của vi khuẳtt Các đột biến có thể tác động đến 5 loại kiểu hình: - Biến đổi từ nguyên dưỡng iprototrophy) sang khuyết dưỡng (auxoỉrophy) và ngược lại. Ví dụ: mất khà năng tổng hợp một chất trao đổi của chụ trình và hồi biến để lại có khả năng tổng hợp chất đó. - Sự mất hay cỏ được khả năng sử dụng chất dinh dưỡng khác. Ví dụ: đột biến làm mất khả năng sử dụng đường lactoz. - Tỉnh nhạy cám hay đề kháng thuồc như nhạy cảm streptomycin đột biến thành kháng streptomycin. - Nhạy cảm với phage thảnh kháng phage hoặc ngược lại. Ví dụ: đột biến trên thụ thể ở bề mặt tế bào làm đề kháng với sự nhiễm phage. - Sự mất đi hoặc có lại các thành phần cấu trúc của bề mặt tế bào. Ví dụ,một loại Pneumococcus có vỏ bao poỉyxacarit (polyxacarit capsule), ừong khi đó dòng khác không có vò bao. Các kí hiệu dùng biểu hiện kiểu hình và kiểu gen được thống nhất theo nguyên tắc: - Kỉ hiệu kiểu hình gồm 3 chữ thường (chữ đầu viết hoa) với dấu phía trên góc “+” hay nhằm chỉ sự hiện diện hay thiếu tình trạng tương ứng, và “s” hay “r” tương ứng chỉ tính nhạy cảm (sensitive) hay đề kháng (resistance). - Kí hiệu kiểu gen được viết chừ nghiêng, chữ đầu khống viết hoa. Ví dụ 1: Tế bào hoang dại tự tổng họp được leuxin thì kiểu hình được viết Leu+. Đột biến khuyết dưỡng mất khả năng tổng hợp leuxin được kí hiệu kiểu hình Lêu". Tương ứng với hai kiểu hình trên kí hiệu kiểu gen là ỉeu hay ỉeu và ỉeũ. Nểu cần nhiều hem một gen để tạo ra một chất nhất định, sau 3 chữ nghiêng kí hiệu gen có thêm chữ nghiêng hoa. Ví dụ: ỉeuA, leuB... là các gen cần thiết cho tổng hợp leuxin khác nhau. Ví dụ 2: Kiểu hinh kháng hoặc nhạy cảm với penixilin được viết là Penr và Pen*. Kiểu gen tương ứng là penr và pens. Nếu lưỡng bội ở một phần thi viểt thêm gạch nghiêng. Ví dụ, \eu ỉleù.

345

20.6.1.2. Vài nét về sinh sản ở vỉ khuẩn Tế bào vi khuẩn phân chia theo lối trực phân. Phân tủ ADN gắn trực tiếp vào màng sinh chất. Sự sao chép ADN tạo ra hai bản sao gắn chung nhau trên màng sinh chất. Khi tế bào kéo dài ra, các bản sao ADN tách xa nhau do phần màng giữ chúng lớn dần ra. Kiểu sinh sàn vô tính này được gọi 1ầ”phân đổi”hay “ngắt đôi” (“binary fission”) (hình 20.11). Tế bào vi khuẩn chia nhanh (20 phút trong điều kiện tốt) hơn rất nhiều so với tế bào Eukaryota (24-48 giờ). DNA

Sao chép A £ N

I ị ị

Sepu

Chỗ that dể ngỊằt đôi

i M ội. bế h t ị

Nọật đôi

|LS Hình 20.11. Trực phân ngắt đôi ở vi khuẩn kèm theo tách 2 ẢDNcon về 2 tể bào. Quá trình sao chép ADN được bắt đầu từ điểm xuất phát oriC kéo dài về hai phía song song với quá trình sao chép màng sinh chất, nơi có điểmgắn vào của ADN bộgen, mọc dài tách 2 phân tử ADN về 1 tế bào con. ADN của E.coỉi cần 40 phút cho 1 vòng sao chép tương ứng với tốc độ 50.000 cặp bazơ/phút. Phụ thuôc vào tổc độ tăng trưởng, thời gian phân chia tế bào ừong khoảng từ 18 đến 60 phút. Như vậy ở các tế bào tăng trưởng nhanh, vòng saochép mới phải được bắt đầu sớm hom sự phân bào trước đó như tế bào con đầu tiên.

346

20.6.2. Vi khuẩn E.colỉ là đối tượng mô hình tốt nhất E sc h e ric h ia c o ỉi (E .c o ỉì) là vi k h u ẩ n đư ợ c n g h iên c ứ u k ĩ n h ấ t, Tất n h iề u c h ủ n g k h ác

nhau đã được phân lập. Ba dòng thường gặp ừong các phòng thí nghiệm di truyền là E.coỉi B (tế bào chủ cho các phage dãy T), E. colì c (tế bào chủ cho phage một mạch như ỘX 174) và E.coỉi K ỉ2 (tế bào chủ của phage Ằ). Do những thuận tiện trong nuôi cấy, nhân giống, thu nhận các đột biến và dễ phân tích các sự kiện di truyền hiếm hoi. Đến nay, nó đuợc coi là đối tượng mô hình sỏ một của Sình học phân tử và công nghệ gen. 20.6.2.1. Các dữ liệu di truyền học của E. coli - Kích thước bộ gen (Genome size): 4,6 Mb. - Nhiễm sắc thể: 1 phân tử ADN vòng ưòn. - Số lượng gen: 4.000. - Phần trăm gen tương đổng với người: 8%. - Kích thước trung bình của gen: 1 kb, không có intron. - Các transposon: tùy chủng, ~ 60 bản sao/bộ gen. Kết thúc giải ký tự chuỗi: 1997. 20.6.2.2. Các phương pháp phân tích đi truyền Ngoài các phương pháp lai để phân tích tái tổ hợp (recombination) và bổ trợ (complementation), có nhiều kỹ thuật biến đổi di truyền (Techniques of Gentic Modification): - Gây đột biển (Mutagensìs): •

Hóa chất và chiếu xạ: đột biến xoma ngẫu nhiên.

•

Dùng transposon: xen đoạn (Insertions) xoma ngẫu nhiên.

- Chuyển gen (Transgensis): •

Trên vector plasmid: tự do hay chèn vào (integratd).

•

Trên vector phage: tự do hay chèn vào (integratđ).

•

Biến nạp: chèn vào.

- Làm ỉm lặng gen mục tiêu (Targeted gen knockout): •

Alen không (Null alen) trên vector: thay gen bằng tái tổ hợp.

•

Alen được thiết kế (Engineered alen) trên vector: đột biến điểm định hướng (Site-directed mutagensis) bàng thay gen.

347

20.6.2.3. E.coli là tế bào chủ căn bản của kỹ thuật di truyền Các nghiên cứu trên E. coỉi đã làm cơ sở cho sự ra đời cùa kỹ thuật di truyền. E. coli đóng vai ừò chủ yếu trong chuyển gen đến các sinh vật khác. Nó là sinh vật chuẩn để tạo đòng gen (cloning gens) của bất kỳ sinh vật nào. E. coỉỉ được coi là tế bảo vật chủ đơn giản nhất ừong công nghệ gen. Vi khuẩn E. coỉi dễ dàng chấp nhận nhiều loại vector chuyển gen như plasmid hay phage qua biển nạp hay tải nạp. Những protein tái tổ hợp đàu tiên như insulin, xomatostatin và đến nay hàng trăm protein khác được tạo dòng ở E, coli đã đi vào sản xuất công nghiệp với thị trường hàng chục tỷ ƯSD/năm. 20.6.2.4. Các.đóng góp chủ yếu của E.coỉi - Đối tượng chủ yếu cho các nghiên cứu: •

Sao chép, phiên mã, dịch mã và tái tổ hợp.

•

Đột biến.

•

Điều hòa biểu hiện gen (Gen regulation).

•

Kỹ thuật ADN tái tổ hợp (recmbinant ADN technology).

- Đóng góp cho nghiên cứu cảc lĩnh vực khác: Trao đổi chất của tế bào (Cell metabolism), gen ức chế vô nghĩa (Nonsense suppressors), sự tuyến tính (Colinearity) giữa gen và polypeptit, các Operon, sự đề kháng thuốc dựa vào plasmid (Plasmid-bazod drug resistance) và sự vận chuyển tích cực (Active transport). 20.6.2. S- Các enzynt và protein tham gia tỗng hợp và cắt nucleic axit Sao chép ADN được nghiên cứu rất chi tiết ở E. coli, mà phần chủ yếu đã nêu ở chương II. Ở đây, một số chi tiết được bổ sung, cụ thể là các phức hợp enzym tách mạch ADN mẹ và tổng hợp các mạch con (bảng 20,4). Hàng loạt các enzym và protein, mà phần lớn là các phức hợp protein đa phân, tham gia tổng hợp ADN, phiên mẫ tạo ARN. Cả tế bào nhân sơ lẫn nhân chuẩn đều có hoạt tinh ADNpolymeaz đa năng. Một số ADN polymeaz hoạt động như những enzym độc lập, nhưng số khác (chủ yếu là replicaz) kết nhau thành phức hợp lớn nhiều protein. Tiểu phần (subunit) tổng hợp chi là một trong nhiều chức năng khác nhau của replicaz như tháo xoăn (unwinding), khởi sự tổng hợp mạch m ớ i,...

348

Bảng 20.4. Các enzym tham gia sao chép ADN ở vi khuẩn E. coiL E nzym

G en m ã hoá

C hứ c năng

p o ỉC ;

Enzym polyme hoá chù yếu

1. A D N polymeaz III

ADNE,Q,N,X; 2. ADN polymeaz I

Cắt mồi ARN, lắp chỗ trổng

p o ỉA - E ; m u tD . p o lA

3. Helicaz

ADNB

Tháo xoắn ở chẻ ba sao chép

4. Primaz

ADNG

Tạo mồi mạch ADN mới

5. Protein gắn điểm khởi sự (Origin-binding protein).

G ắn

ADNA

ssb

6 . P ro te in c ă n g m ạ c h S S B

(Single-strand binding protein)

7. ADN ligaz

điểm khởi sự sao chép (Ori); tạo thuận lợi cho mở tách mạch.

Ngăn các mạch đơn đã tách không chập lạ i.

ỉig A , ỉìg B

Nối các đ ầ u hở trê n ADN

Bảng 20.5. Các enzyntADNpolymeaz ở vi khuẩn E. coli Gen mã hoá

Chức năng

]. ADN polymeaz I

poIA;AĐNE, Q,N,X

Enzym phục hồi chù yếu. cắt mồi ARN và lắp kín khoảng trống

2. ADN polymeaz II

hoỉA-E; mutD.

Enzym phục hồi phụ (minor).

3. ADN polymeaz III

poỉB

Replicaz, polyme hoá chù yếu.

4. ADN polymeaz IV

poìC

Phục hồi cấp cứu (SOS repair).

5. ADN polymeaz V

ADNB umuD ’2C

Phục hồi cẩp cứu (SOS repair).

Enzym

349

Ở E. coỉỉ đã tìm ra và biết chức năng của 5 loại ADN polymeaz (bảng 20.5). Sự phân hủy nucleic axit cũng đòi hỏi enzym đặc hiệu: - Deoxyribonucleaz (ADNaz) là enzym cắt các liên kết trong phân tử ADN. Nó có thể cắt mạch đơn hay kép. Gyraz là một loại enzym topoixomraz cắt ADN làm tháo xoắn. - Ribonucleaz (ARNaz) là các enzym cắt ARN, có thể đặc hiệu đối với ARN mạch đơn hay mạch kép. Các nucleaz chia thành 2 nhóm: - Exonucleaz cắt tùng nucleotit một từ đầu mút của mạch polynucleotit; chúng có thể đặc hiệu đối với đầu mút 5’ hay 3’ của ADN hay ARN. Endonucleaz cắt các liên kết bên trong mạch ADN; chúng có thể đặc hiệu đối với ARN hay ADN mạch đơn hoặc mạch kép. * Cẩu trúc và chức năng các tiểu phần của ADNpoiymeaz III Tất cả các ADN polymeaz cùng có những tính chất cẩu trúc chung giống nhau. Replicaz ADN pol III là một holoenzym 900 kD (kilodalton), một phức hợp gồm hom 10 phân tử protein (hình 20.12). Đặc biệt là protein vòng (5 (P-ring) làm móc (clamp) bao ADN ở giữa để trượt về trước mà mạch đơn này không bị bong ra khi được chép. Ngoài ra, ADN polymeaz phải có khả năng nhận biết 4 loại N như chất phản ứng phụ thuộc vào chỗ được "đọc" trên mạch khuôn. Sao chép ADN ở E. coli diễn ra với tốc độ rất nhanh, có thể đạt đến 50.000 nucleotit/phút. Thật khó hình dung một quá trình phức tạp, được thưc hiện chính xác, mà diễn ra với tốc độ nhanh như vậy, chưa kể đến việc làm sao các N tập trung với nồng độ cao đáp ứng kịp thời cho nhu cầu.

H ình 20. ỉ 2-. RepUcaz A D N p o ỉ III là m ột p h ú c hợp gồm hơn 10 protein.

20.6.3. Biến nạp (Transformation) 20.6.3.1.

Hiện tượng và điều kiện

Hiện tượng biển nạp được Griffith phát hiện ở vi khuẩn Dipỉococus pneumoniae (nay gọi là Síreptococus pneumoniae - phế cầu khuẩn gây sưng phổi ở động vật có vú) vào năm 1928. Phát hiện này và các nghiên cứu về cơ chế biến nạp có ý nghĩa lịch sử cho sự ra đời của Sinh học phân tử. Vi khuẩn này có 2 dạng khác nhau: - Dạng SiH, gây bệnh có vỏ bao tế bào (capsule) bằng polysaccharid càn trở bạch cầu phá vỡ tế bào. Dạng này tạo đốm mọc (khuẩn lạc) láng (Smooth-láng) trên môi trường agar. - Dạng Rịi, không gây bệnh, không có vỏ bao, tạo đốm mọc nhăn (Rough-nhãn). Thí nghiệm tiến hành như mô tả trên hình 20.13.

Hình 20.13. Hiện tượng biển nạp: - Tiềm vi khuẩn s sổng gây bệnh cho chuột - chuột chểt. - Tiêm vi khuẩn R sổng không gây bệnh - chuột song.

351

- Tiêm vi khuẩn s bị đun chết cho chuột - chuột sổng. - Hỗn hợp vi khuẩn

s bị đun chết trộn với vi khuẩn R sống đem tiêm cho chuột - chuột chết.

Trong xác chuột chết có vi khuẩn S v à R Hiện tượng trên cho thấy vi khuẩn s không thể tự sống lại được sau khi bị đun chết, nhung các tế bào chết này đã truyền tính gây bệnh cho tế bào R. Nó được gọi là biển nạp (transformation). Năm 1944, T.A very, Mc Leod và Mc Carty đã tiến hành thí nghiệm xác định rõ tác nhân gây biến nạp. Nếu các tế bào s bị xử lý bằng proteaz (enzym phân hủy protein) hoặc ARN-az (enzym phân hủy ARN) hoạt tính biến nạp vẫn còn, chứng tỏ protein và ARN không phải là tác nhân gây biến nạp. Nhưng nếu tể bào s chết bị xử lý bằng ADNaz (enzym chỉ phân hủy đặc hiệu ADN) thi hoạt tính biến nạp không còn nữa, chứng tỏ ADN ỉà nhân tố biến nạp, Kết quả thí nghiệm cỏ thể tóm tắt như sau:

ADN của s + các tế bào R sống —» chuột —» chết (có R + S) Hiện tượng biến nạp là một chứng minh sinh hóa xác nhận ràng ADN mang tín hiệu di truyền. Như vậy, biển nạp là hiện tượng truyền thông tin di truyền bằng ADN. Trong biến nạp, ADN ừần từ một tế bào vi khuẩn (thể cho) này được truyền sang tế bào vi khuẩn khác (thể nhận). Biến nạp xảy ra khi vi khuẩn nhận ADN ngoại lai và hấp thu vào trong tế bào. Khi tế bào vi khuẩn bị vỡ do bị tan (lysis), ADN vòng tròn của chúng thoát ra môi trường thành các đoạn thẳng với chiều dài khác nhau, có khả năng gây biến nạp cho các tế bào nhận khác. Biến nạp được nghiên cứu kĩ nhất ở các vi khuẩn Sừeptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis, Haemophilus influenzae và ở một sổ nhóm vi khuẩn khác. Hiệu quả của biến nạp phụ thuộc vào 3 yếu tố: - Tỉnh dung nạp của tể bào nhận. - Kích thước của đoạn ADN ngoại lai. - Nồng độ của ADN 20.6.3.2.

Tỉnh dung nạp của tể bào nhận

Một điều quan trọng của biến nạp là tể bào nhận phải có trạng thái sinh lí đặc biệt được gọi là khả năng dung nạp hay khả nạp (competence). Tế bào có khả năng hấp thu ADN ngoại lai và được biên nạp (transformable) gọi là khả nạp (competent) và đây là tính trạng di truyên. Thậm chí trong các chi (genra) biến nạp, chi một số chủng (strains) hay loai la được biên nạp. Tinh khả nạp trong phần lớn các vi khuẩn biến nạp tự nhiên

(naturally transformable) được kiểm soát (regulated) và các protein đặc hiệu tham gia vào hấp thu và tác động đến ADN. Các protein đặc hiệu khả nạp đỏ gồm protein gắn ADN liên két màng (membrane-associated ADN-binding protein), autolysin vách tể bào và các nucleaz khác nhau. Ở loài Bacillus subtiỉis dễ biến nạp, các tế bào sản sinh và tiểí ra một peptit nhỏ trong quá trình tăng trưởng và sự tích lũy nồng độ cao của peptit này biến tế bào thành khả nạp. Ở Bacillus, chỉ 20% tế bào biến thành khả nạp và ở trạng thái này trong vài giờ. Trong khi đó, ở Streptomyces, 100% tế bào cỏ thể thành khả nạp, nhưng chỉ trong một thời kỳ ngắn của chu trình tế bào. Biến nạp tự nhiên hiệu quả cao được phát hiện chỉ ở một ít loài vi khuẩn như Acỉnobacter, Azotobacter, Bacillus, Streptococcus, Haemophilus, Neisseria và Thermus. Ngược lại, E, colỉ và nhiều loài vi khuẩn khó biến nạp ừong điều kiện tự nhiên. Tuy nhiên, có thể gây ra sự dung nạp bằng xử lý hóa chất hay tạo những điều kiện nhất định cho sự tăng tnrởng của tế bào. Khi xử lý tế bào E. coỉi với ion canxi nồng độ cao, chúng trờ thành khả nạp và biến nạp các plasmid thực hiện có hiệu quả. Những tế bào dung nạp trên bề mặt có các nhân tổ dung nạp (competence factor). Chủng đã được tinh sạch một phần và nghiên cứu ở nhiều loại vi khuẩn. Ờ Streptococcus (trước đây gọi là Dỉplococcus) pneumoniae đã trở thành dung nạp có 30 đến 80 điểm nhận trên tế bào có khả năng gắn với ADN mạch kép hầu như của bất kì nguồn nào. Mặt khác, Haemophilus influenzae cỏ một số lượng hạn chể từ 4 đển 8 điểm nhận (receptors), mà những điểm nhận này trước tiên nhận biết ADN mạch kép có các cặp bazơ trình tự như sau: 5’AAGTGCGGTCA-3’ được gọi là “điểm hấp thụ ” (uptake site). Sự kiện là các điểm hấp thụ này đặc biệt chung ờ ADN của Haemophilus (trên bộ gen có khoảng 600 điểm như vậy) và tương đối hiếm ở ADN cùa các loài khác đã giải thích vì sao Haemophilus chỉ biến nạp giới hạn với các vi khuẩn trong loài. Phần lớn các vi khuẩn chỉ dung nạp trong một giai đoạn giới hạn của chu trình sổng. Trong giai đoạn đung nạp, tế bào tổng hợp một hay nhiều protein được gọi là “các nhân tố dung nạp”, chúng biển đổi màng tế bào để có thể gắn với đoạn ADN ngoại lai. Như vậy, các điểm thụ thể chỉ hiện diện trong giai đoạn dung hợp. 20.6.3.3. Sự hấp thu AĐN Trong biến nạp, vi khuẩn khả nạp gắn thuận nghịch với ADN. Các tế bào khả nạp có thể gắn ADN nhiều hcm cả 1000 lần so với tế bào không khả nạp. Điều kiện quan trọng thứ hai để thực hiện được biến nạp là ADN phải cỏ mạch kép và đoạn biến nạp phải cỏ trọng lượng phân tử tối thiểu là 400.000 đalton (lớn khoảng 1/200 bộ gen của vi khuẩn), dĩ nhiên đây không phâì là giới hạn cao nhất, số lượng tế bào được biến nạp (transformants - thể biến nạp) tăng ti lệ thuận với nồng độ của ADN cho đến lúc

353

mà các điểm thụ thể (receptor sites) bão hòa do các đoạn ADN gắn vào (thường khoảng 10 đoạn/tế bào). Ở Streptococcus pneumoniae mỗi tế bào có thể gắn khoảng 10 phân tử ADN mạch kép dài 10 - 15 kbp (kilobazơ pairs)/phân tà. ADN được hấp thụ vào tế bào và bị enzym cắt làm giảm trọng lượng phân tử còn khoảng 8 kbp/phân tử và mạch đom. Mật độ ADN tối thiểu để có thể phát hiện biến nạp là 0,01 ng/ml, một con số thấp đến nỗi không thể phát hiện bằng phương pháp hóa học. Điều thú vị là trong biến nạp ở Haemophilus influenzae, đoạn ADN phải có chuỗi ký tự 11 bp chuyên biệt để xảy ra quá trinh gắn không đảo ngược và thu nhận ADN. Chuỗi này được tìm thấy với tần suất cao bất thường ở bộ gen của Haemophilus, bộ gen đã được giải ký tự chuỗi hoàn toàn. Bằng chứng này và việc một số vi khuẩn nào đó có thể biến nạp trong môi trường tự nhiên làm cơ sở cho giả thiểt là biến nạp không chỉ xảy ra ửong phòng thí nghiệm mà còn đóng vai ữò quan trọng ừong việc truyền gen cho thế hệ sau trong tự nhiên. Bằng cách tăng cường trao đổi gen, những vi khuẩn khá biển tự nhiên tăng tính đa dạng vờ tính thích ứng. 20.6.3.4. Đoạn ngoại lai và đoạn nội tại Khi ADN mạch kép xâm nhập vào tế bào, môt mạch bị phân hủy. Bất kì đoạn ADN nào từ tế bào cho xâm nhập tế bào nhận, được gọi ỉà đoạn ngoại ỉaì (exogenote), ADN nguyên vẹn của tế bào nhận gọi là đoạn nội tại (enđogenote). Tẻ bào vi khuẩn nhận đoạn ngoại lai sẽ lưỡng bội ở một phần bộ gen, được gọi là hợp tử từng phần (merozygote). Tuy nhiên, đoạn ngoại lai mạch đơn không bền vững và bị phân hủy nếu không được gắn vào bộ gen thể nhận. Quá trình ưao đổi thông tin đì truyền bằng chuyển chỉ một phần vật liệu di truyền từ tế bào này sang tế bào khác được gọi là sự giao nạp từng phần (meromixis). Có người cho rằng đoạn ngoại lai đơn mạch được gắn với protein (như protein Rec-A ở E. coỉi), protein này hỗ trợ tìm vùng bổ sung trên đoạn nội tại, làm đứt mạch và gán đoạn ngoại lai. Các enzym sẽ Qắt các đầu tự do (của cả thể cho và thể nhận) và ligaz hàn kín lõm trống. Khi đoạn ngoại lai đã gắn vào đoạn nội tại thỉ tế bào không còn là hẹrp tử từng phần nữa. Nếu đoạn ngoại lai chứa một alen với đoạn nội tại, thì mạch kép tái tổ hợp sẽ có một hay nhiều chỗ bắt cộp sai (mismatch bazơ paữs) và đoạn ADN này được gọi là heteroduplex. Nếu các tế bào con nhận alen mới, sửa sai (mismatch repair) được thực hiện băng cách cắt đoạn nội tại và dùng mạch ngoại lai làm khuôn để thay thế. Sự gắn đoạn ngoại lai vào ADN tế bào phận được thực hiện nhờ tái tổ hợp tương đồng (xem sau). Haị hoặc nhiều hơn các gen liên kết chặt có thể nằm trong đoạn ADN biến nạp. Nếu sự xâm nhập cùa hai hay nhiều gen vào đoạn nội tại, thì tế bào nhậa sẽ được đồng biển nạp (cotransformed). Tần số của đồng biến nạp tỉ lệ nghịch tương ứng với khnáng cách giữa các gen cùng biến nạp.

354

20.6.3.5.

Cơ chế phân tử

Diễn biến của quá trình biến nạp ở cấp độ phân tà được tóm tắt ừên sơ đồ hình 20.14. Để dễ hiểu, các giải thích dựa theo ADN của các dòng vi khuẩn s và R trong thí nghiệm của Griffith. Quá trình gồm các giai đọan chù yểu: - S ự phân hủy A D N tể bào cho: AON tế bào cho có thể là cùa tế bào tự nhiên bị phân hủy hoặc trong thí nghiệm bị gây chế bằng nhiệt độ cao hay tác nhân phá vỡ tế bào. - A D N bám vào bề mặt tế bào: Protein gắn vào ADN. - Thâm nhập của ADN: Sợi ADN mạch kép của dòng vi khuẩn s sau khi chui qua màng tế bào của dòng R thì một mạch s sẽ bị nucleaz của tế bào cắt, còn lại một mạch nguyên. - Bắt cặp (Synapsis)và tải tổ hợp: Nhờ sự hỗ trợ của protein RecA ADN của thể nhận R sẽ biến tính tách rời 2 mạch ở 1 đoạn đễ bắt cặp với đoạn ADN thể cho s vừa chui vào.

Các nucleotide FeeAprotein

Bắt cặp VÉ tái tồ hợp

Tể bào đa biển nạp

Hình 20.Ỉ4-. Sơ đồ diễn biển cùa <Ịuá trình biển nạp ở cấp độ phân tír a. ADN bám vào. b. Thâm nhập. c. Bất cộp và tải tổ hợp. d. - Tê bào biển nạp Sao chép: Sau khi bắt cặp tạo đoạn lai R - s, phân tử ADN sao chép tạo ra 2 sợi, một sợi kép R-R và sợi kép khác có mang đoạn ADN thể nhận S-S. Kết quả cuối cùng là đọan gen của SIII chèn vào bộ gen tế bào nhận. Sau phân bào thi một dống tế bào nhận được

355

ADN ngoại lai vào bộ gen - tế bào được biến nạp. Tế bào đã dược biến nạp sinh sản tạo dòng nhận RII mới. 20.6.4. Tải nạp (Transduction) Việc tìm ra biến nạp đã thúc đẩy nghiên cứu dẫn đến phát minh ra tải nạp, là hiện tượng truyền ADN qua trung gian vìrut từ tế bào cho đến tế bào nhận, c ỏ hai kiểu tải nạp: chung và chuyên biệt. Trong tải nạp (transduction), các virut mang các gen từ tể bào này sang tể bào khác. Ở chu trình tan (ỉytic cycle), một số bacteriophage gói nhầm ADN vi khuẩn chù vào capsid. Tế bào bị nhiễm bởi các virut như vậy nhận đoạn ADN của vi khuẩn A khác, chủ không phái ADN của virut. Do vậy, ADN vi khuẩn A tải tổ hợp với ADN nhiễm sắc thể cùa tế bào chủ B và biến đổi thành phần di truyền (gentic composition). 20.6.4.1. Phage là nhân tố chuyển gett Thí nghiệm được tiến hành trong ống hình chữ u , ở đáy ống được ngăn cách bằng màng ỉọc vi khuẩn. Mảng có lỗ nhỏ vi khuẩn không qua được, nhưng phage qua được (hình 20.15). Nhánh A của ống chứa ví khuẩn có khả năng tổng hợp tryptophan (trp+), còn nhánh B nuôi các vi khuẩn mất khả năng tổng hợp tryptophan (trp~). Sau một thời gian nuôi bên nhánh B xuất hiện vi khuẩn có khả năng tổng hợp tryptophan (trp+). Qua nhiều lần thí nghiệm việc phage tải gen trp+ từ nhảnh A sang nhánh B được chứng minh. Màng lọc vi khuẩn

Nhánh A Vi khuẩn trp+

Nhánh B Vi khuẩn

Hình 20.15-. Thí nghiệm chứng minh có tải nạp do virut. 20.6.4.2. Tải nạp chung (Cenral transduction) Tải nạp chung xảy ra khi phage mang bất kì gen nào của vi khuẩn A chuyển sang vi khuẩn B. Tải nạp chung (genralized transduction) có các đặc điểm:

356

- Thường do phage kiểu P ỉ thực hiện. - Bất kì gen nào của vi khuẩn cũng đều được tải nạp. - Tải nạp có được do gói nhầm ADN của tế bào chủ khi phage trưởng thành. - Các thể tái tổ hợp đơn bội được tạo ra. Do không có sự tương đồng giữa trình tự ADN trên các phage này với trình tự ờ tế bào chù, nên không có điểm gắn vào đặc hiệu cho prophage. Bất kì gen nào cũng được tải nạp vì đầu của phage có thể gói nhầm vào một đoạn ADN của tế bào chủ. Sự đồng tải nạp (cotransduction) là quá trình tài nạp đồng thời 2 gen. Quá trình phage xâm nhập vào vi khuẩn và sinh sản được mô tả trên hình 20-16. Đầu tiên phage bám trên bề mặt của vi khuẩn, sau 4 phút bom ADN của nó vào tế bào, sau đó chúng sinh sản và độ nửa giờ sau thi ỉàm tan vi khuẩn và giải phóng các phage con mới.

ADNphage Nhiễm sắc thề vi khuẩn A Capsid Phage mới phá vở tế bào, nhiễm VK B Hình 20. ỉ Ố-. Quá trình xâm nhập của phage và làm tan vi khuẩn. Khi ADN của phage xâm nhập tể bào vi khuẩn A, chúng cắt ADN của vi khuẩn A thành nhiều đoạn, đồng thời ADN của phage được sao chép thành nhiều phân tử con và các vỏ capsid của phage cũng được tạo thành. Sau đó các vỏ capsỉd được ỉắp ruột ADN vào, phá vỡ tế bào vi khuẩn ra ngoài và tiếp tục xâm nhập các vi khuẩn mới. Trong quá trình lắp ráp khoảng ]-2% phage vô tình mang đoạn ADN của vi khuân cỏ chứa gen. Phage mang gen của vi khuẩn A xâm nhập vi khuẩn B, quá trình tải tổ hợp xảy ra làm gen A gắn vào bộ gen B. 20.6.4.3.

Tải nạp chuyên biệt (Special transduction)

Tài nạp chuyên biệt hay hạn chế (restricted transduction) là trường hợp chỉ mang một vài gen nhất định, nó có 4 đặc điểm: - Những gen được chuyển nằm sát chỗ prophage gắn vào. - Chỉ prophage kiểu Ằ thực hiện.

357

- Do kết quả sự cắt sai của prophage khi tách khỏi nhiễm sắc thể của tế bào chủ. - Các vi khuẩn tái tổ hợp có thể ỉưỡng bội mội phần. Ví dụ: Phage X chỉ mang gen gaỉ (đồng hóa đường galactoz) từ vi khuẩn này chuyển sang vi khuẩn khác. Nhiễm vikhuấn V Á

1

ỉ

ỈUU'

A

X

Phags xâm nhiễm

Cos bắt cập

Hình 20. ỉ 7: Điểm gắn của phage X vào bộ gen vi khuần. Điểm gắn của phage X vào bộ gen của vi khuần nằm giữa 2 gen gaỉ (galactoz) và bio (tổng họrp biotin), tiếp theo xảy ra quá trinh tải tổ hợp ở điểm chụyên biệt (site-specific recombination) chèn ADN của phage vào Nhiễm sắc thể vi khuẩn (hình 20.17). Đầu của phage chi có thể chứa một lượng ADN giới hạn, nó chỉ tải nạp được gen gaỉ hoặc bio. Phage Ằ tải nạp các gen galactoz được gọi là Ảgaỉ hay Ádg (d = defective: khuyết, g = galactoz). Nếu tế bào g a ĩ được nhiễm bởi Ảdg (mang gen g a t), sự ráp phage biến dạng vào tế bào chủ sẽ tạo lưỡng bội một phần. Sự cắt sai của phage X rất hiếm nên tải nạp hạn chế có tần sể thẩp. Tuy nhiên, tải nạp tần số cao cỏ thể nhận được trong điều kiện thí nghiệm. Nếu tế bào vi khuẩn được gây nhiễm kép vói phage X hoang dại và phage Ấdg, phage hoang dại cỏ thể hỗ trợ chức năng sai sót ở phage biến dạng, và thế hệ con sẽ có cả 2 kiểu với số lượng bằng nhau. Khi địch tan được đùng tải nạp, quá trình được gọi là tải nạp tản sổ cao.

358

Trong nhiều trường hợp, đo bộ gen biến dạng Ảdg không gắn được vào bộ gen của tế bào chủ (nên không sao chép được). Sau mỗi lần phân bào, chỉ một trong 2 tế bào có bộ gen của phage biến dạng; quá trình này được gọi là tài nạp sẩy (abortive transduction). 20.6.5. Giao nạp (Conjugation) Vào năm 1946, J. Lederberg và E. Tatum chửng minh có trao đổi vật chất di truyền giữa các vi khuẩn sống. Sự trao đổi này gọi là giao nạp hay tiếp hợp (conjugation). Giao nạp ở vi khuẩn là sự kết hợp nhất thời của hai tế bào có kiểu bắt cặp đối nhau, được tiếp nối bằng sự chuyển một phần vật chất đi truyền từ tế bào cho sang tế bào nhận qua cầu tế bào chất, và sau đó các tế bào tách nhau ra (exconjugants). Giao nạp đòi hỏi sự tiếp xúc trực tiếp giữa 2 loại tế bào được khởi sự bằng ống giao nạp hay tỉnh mao (pilus), một sợi ống nhỏ rất dài do tế bào cho (donor cell) tạo ra (hình 20.18).

Hĩnh 20.18. Hai tể bào Vỉ' khuẩn giao nạp qua cầu tế bào chất pilus AĐN được truyền qua một cầu tế bào chất mỏng (a thin cytoplasmic bridge) gọi là ống giao nạp (conjugation tube). Kiểu sao chép sigma (ơ) được tế bảo vi khuẩn sừ dụng trong giao nạp để truyền phân tử ADN dạng thẳng sang tế bào khác. Khi đọan ADN vào bên trong tế bào nhận (recipient cell), nỏ thực hiện tái tổ hợp với cảc gen tương đồng (homologous gens). v ề thuật ngữ, nhiều tác giả dùng “tiếp hợp” để chỉ quá trinh này, theo chúng tôi, dùng “giao nạp” tốt hơn, vì phản ánh được bản chất cùa quả trình, nhất quán với biến nạp, tải nạp ở vi khuẩn và khỏi nhầm lẫn với tiếp hợp của nhiễm sắc thể. 20.6.5.1. Chứng minh có hiện tượng lai ở vi khuẫỉt Vào năm 1946, J.Lederberg và E.Tatum đã sử dụng các dòng đột biển khuyểt dưỡng khác nhau ở E.coỉi để chứng minh có tái tổ hợp giữa các đòng vi khuẩn khác nhau. Cụ thể dòng A có kiểu gen mefbioTthr+ỉeu+thi+(có khả năng tổng hợp threonin, leuxin và vitamin B| (thiamin) và không tổng hợp được metionin và biotin), còn ở dạng B thì ngược lại cỏ

359

khả năng tổng hợp metionin và biotin với kiểu gen met+bỉo¥thr ỉeu íhr. Trộn A và B trong ống nghiệm, sau đó cấy lên môt môi trường tối thiểu (Minimal medium -MM). Các khuẩn lạc mọc trên môi trường tối thiểu chứng tò có các dọng ỉaỉ, chúng chỉ mọc lên được nhờ sự bù đắp cho nhau các nhu cầu dinh dường. Dạng lai có kiểu gen met+bio+thr+ỉeu+thi+mọc được trên môi trường tối thiểu. Trong khi đó từng dạng A hoặc B riêng lè không mọc được trên MT tối thiểu (hình 20.19). Dòng A = met”bio~thr+leu+thi+ X dòng B= met+bio+thr leu thi Dạng lai met+bio+thr+leu+thi+ mọc thành khuẩn lạc, mỗi dạng riêng lẻ không mọc thành khuẩn lạc.

,, ,, Tể bào không mọc

Khuẩn lạc từ tể bào íaì rnPbmhrneii+thi*-

, Tế bào không mọc

Hình 20.19.. Sơ đồ ỉaỉ vi khuẩn (MM: môi trường tối thiểu).

20.6.5.2, Sự phân hỏa giới tính ở vi khuẩn Năm 1953, Hayes đã phát hiện ở vi khuẩn có các dạng khác nhau tương tự giống “đực " và "cải" ở sinh vật bậc cao. Các dạng đó được kí hiệu F* và F~ (từ chữ Fertility hữu thụ). F+ tương tự giống đực có ờ sinh vật bậc cao, nó truyền gen sang F“. Tần số lai F+ X F~ khoảng 10-6 tức lai 1 triệ u tế b ào sẽ cỏ 1 té b ào lai. a) Epixom và pỉasmid Khi tiếp xúc với F+ một thời gian tế bào F“ trở thảnh F+. về sau dạng Hfr (High frequency o f recombination) được phát hiện, dạng này có tần số lai với F cao hom F+ có thể đến 104 lần. Khi F+ tiêp xúc với F- một thời gian, F- biến thành F+ do nỏ nhận được một phần tử di truyền gọi là epixom. Epixom F+ là phần tử di truyền ngoài nhiễm sắc thể, có thể tồn tại

hoặc ở dạng phân tử ADN vòng tròn tự sao chép hoặc gắn vào phân tử ADN của tế bào chủ (ví dụ như phage À). Epixom F+ được gọi là nhân tố giới tính (sex-factor). Pỉasmid lúc đầu được định nghĩa là phân tử ADN vòng tròn nhỏ có khả năng sao chép độc lập với nhiễm sắc thể tế bào chủ và không có khả năng gắn vào nhiễm sấc thể tế bào chủ. Plasmid có thể mang một số gen khác nhau như đề kháng thuốc (ví dụ, plasmid R đề khảng nhiều thuốc kháng sinh),... Hiện nay '“plasmid” được dùng cho cả hai nghĩa là epixom lẫn pỉasmid. Các plasmid có thể tồn tại độc lập hoặc gắn vào bộ gen vi khuẩn, về sau người ta phát hiện ở vi khuẩn còn có nhiều plasmid khác. Bản chất di truyền cùa các dòng F”, F+ và Hfr được xác định do các plasmid như sau: - F“ không chứa plasmid. - F+ chứa plasmid ở dạng tự do không gắn vào bộ gen vi khuẩn. - Hfr - plasmid được gắn vào bộ gen vi khuẩn (hình 20.20).

Tế bào F+ Pỉasmid gắn với Nhiễm sắc thể Tế bào Hfr H ình 20.20. Quá trình chèn A D N plasm id vào A D N Nhiễm sắc íhể tế bào vi khuẩn,

b) Các nhân tổ F ’ và tỉnh nạp (sexduction) Sự cắt red nhân tố F từ nhiễm sắc thể của dòng H ử nhiều khi không chính xác và lúc đó một đoạn bộ gen của vi khuẩn thay thế một phần của F. Trong trường hợp này, nhân tố F’ được tạo thành và nó cò khả năng chuyển gen của vi khuẩn một cách độc lập, nhưng với các tính trạng của tế bào cho. Hiện tượng này được gọi là tính nạp (sexduction), có nghĩa là sự chuyển gen kèm theo nhân tố giới tính. Nhờ tính nạp có thể nhận được các thể lưỡng bội từng phần (merodipioid) theo các gen được gắn vào F+. Do vậy, có thể nghiên cứu mối tương quan alen và các hiệu quả do sự gia tăng liều lượng gen ờ vi khuẩn. 20.6.5.3. Tái tổ hợp Muốn xảy ra tái tổ hợp thì 2 dòng vi khuẩn phải tiếp xúc với nhau (F+ X F') hoặc (Hfr X F). Dòng tế bào mang nhân tổ F+ được coi là tế bào “đực" và có khả năng tạo protein piỉin, từ protein này tạo ống giao nạp là piỉus. Sự co lại của pilus đang nối hai tế bào làm chúng tiểp xúc kề nhau. Tế bào F” được coi là cái (female). Sau khi g iao nạp tế bào F" trở thành F+.

361

Việc chuyển gen chỉ thực hiện khi plasmid gắn vào bộ gen của vi khuẩn. Trong quá trinh chuyển vật chất di truyền sang F" thì ADN của tế bào chủ sao chép và mạch mới có ori đi đầu và F ờ cuối (hình 20.21). Quá trình chuyển ADN từ F+ sang F~ có thể bị ngắt quãng.

H fr X f

S a o c h é p A D N tr u y ề n c h o F H fr F tá i tổ h ợ p

H ìn h 2 0 .2 ĩ . S ự tr u y ề n A D N t ừ t h ể c h o s a n g t h ể n h ậ n .

Các gen A, B, c được chuyển một chiều từ Hfr sang p . Đoạn gen thể cho bắt cặp với các gen tương đồng của ADN tế bào F" và diễn ra ừao đổi chéo tạo tế bào F“ tái tổ hợp (hình 20.22). Dòng Hfr có tần số lai cao hơn nhiều vì plasmid đã nằm sẵn trong bộ gen. Còn F+ phải qua giai đoạn plasmid gắn vào bộ gen rồi mới chuyển gen. Trong điều kiện thí nghiệm ở 37°c, nguyên bộ gen của tế bào E. coỉi được chuyển sang tế bào nhận trong vòng 90 phút. Thường sự giao nạp bị ngắt giữa chừng do các pilus bị gãy, nên ít khi bộ gen được chuyển nguyên vẹn vào tế bào nhận. Lúc đó tế bào F~ vẫn là F . Bằng cách ngắt quãng giao nạp bản đồ di truyền của E.coỉi được xây dựng và có dạng 1 vòng tròn.

Hình 20.22- Đoạn AD N từ thể cho trao đổi chéo với ÂDN thể nhận tạo F~ tái tồ hợp.

20.6.6. Lập bản đồ di truyền nhiễm sắc thể của vi khuẩn 2Õ.6.6.I. Giao nạp ngắt quãng Ợnterrupted conjugation) Khi trộn dịch tế bào Hfr với F“, sự tiếp hợp có thể bị ngắt quãng vào thời điểm tùy ý băng rung ỉắc mạnh. Mầu được pha loãng nhanh và cấy lên môi trường chọn lọc. Ngoài ra,

362

đòng Hfr phải có gen đánh dấu hay khuyết dưỡng để chúng không mọc được trên môi trường chọn lọc và chỉ có các dạng tái tổ hợp mọc lên. Sự truyền ADN của Hfr sang F~ cỏ tính phân cực, các gen ở đầu sang trước và lần lượt các gen khác theo sau. Nhờ ngắt quãng có thể xác định được thời gian mà một gen được truyền sang F" và khoảng cách giữa chúng. Ví đụ, đòng Hfr có mang các gen nguyên dường (prototrophic) đánh dấu a+, b+, c+ được trộn với dòng F~ mang các alen khuyết dưỡng a,b,c. Sự tiếp hợp được ngắt quãng với khoảng cách 5 phút và pha loãng cấy lên môi trường chọn lọc (ví dụ, môi trường tối thiểu). Kết quả như sau: Thòi gian (phút)

Các thể tái tổ hợp

5 10 15

a b*c a b+ c+ a V c+

Trình tự gen ở dòng Hfr là b+- c+ - a+ ; b cách đầu mút truyền sang ít hơn 5 phút; c ít hom 10 phút; a ít hơn 15 phút. Ở đây đơn vị thời gian là phút. 20.6.6.2. Giao nạp không ngắt quãng (Uninterrupted conjugation)

Nếu không rung mạnh để ngát quãng nhân tạo, cầu tế bào chất giữa hai gen càng gần ori (ờ đầu của ADN thể cho), xác suất được chuyển sang tế bào nhận càng lớn. Tần sổ cùa các gen xuất hiện ở dạng tái tổ hợp trong thể nhận, được phát hiện trên môi trường chọn lọc, tỉ lệ nghịch với khoảng cách so với gen đánh dấu ở đầu. Các gen có nhiều dạng tái tổ hợp xuất hiện thì càng nằm gần phía đầu được chuyển sang tế bào nhận. Khoảng cách giữa các gen có thể tính bằng 3 loại đơn vị: đon vị thời gian, đơn vị tái tổ hợp vả đom vị cặp bazơ. Ví dụ: Nếu một phút giao nạp tương đương 20 đơn vị tái tố "hợp ở E.coỉi, và nguyên nhiễm sắc thể( ADN) được chuyển sang trong 100 phút, thì tổng chiều dài là 2000 đơn vị tái tổ hợp. Nếu ADN cỏ 107 cặp nucleotit, thì 1 đom vị tái tổ hợp bằng 10?/2000 = 5000 bp. 20.6.6.3. Lập bản đề bằng tả i tổ hợp

Đặc điểm của tái tổ hợp ờ vi khuẩn là chỉ một phần bộ gen được chuyển sang tể bào nhận. Một hay nhiều gen cỏ thể được gắn vào nhiễm sắc thể tế bào nhận nhờ giao nạp và phụ thuộc độ dài đoạn truyền sang. Exogenote phải đuợc gắn vào nhiễm sắc thể nhận thì mới được sao chép và chia về các tế bào trong dòng. Chỉ một đoạn ngán ADN thường được gán nhờ biến nạp và tải nạp. Như vậy, nếu hai gen cùng biến nạp (cotransformation) thì hai

363

locus phải liên kết chặt. Tương tự như vậy, hai gen cùng được tải nạp vào phage sẽ ở gần nhau. Mức độ liên kết giữa các gen có chức năng khác nhau (intercistronic) hay giữa các đột biến bên trong gen chức năng (intracistronic) có thể đánh giá từ các kết quả lai chuyên biệt. Ở hệ thống hợp tử một phần (merozygote), exogenote muốn gắn vào endogenote phải xảy ra 2 trao đổi chéo ở hai đầu vì nếu chỉ có 1 trao đổi chéo thì cả hai sản phẩm nhận được đều mất cân bằng. Trong các hệ thống này, tổng cá thể tham gia tái tổ hợp không biết được, nên tần số tái tổ hợp không thể tính như ở ruồi giấm (trên tổng số cá thể). Do đỏ, tần số tái to hợp được trình bày tương đối theo một số tiêu chuẩn chung cho tất cả các tổ hợp lai. Ví dụ, số lượng các cá thể tái tổ hợp nguyên đường được tạo ra khi lai hai dòng đột biến có so sánh với kết quả khi lai dạng hoang dại với mỗi loại đột biến. Tuy nhiên có nhiều sai lệch và cần chỉnh lí. Xác định trình tự gen ở vi sinh vật thường phức tạp vì có thề xảy ra hiện tượng nhiễu âm cục bộ (localized negative interference). Phương pháp xác định trình tự gen thường dùng là lai 3 điểm hoán đổi (three - factor reciprocal! crosses). 20.6.6.4. Bản đồ d i truyền của Escherichia co li

Operonlac Khời sư sqp chép

Ã-

- J

I

ĩ

operan Trp

Hình 20.23. Bản đồ di truyền E. coìi dòng K ỉ2 (theo Brock Microbiology 1ỉ, 2006). OriC - điếm khởi sự sao chép; RE - restriction endonucleaz Nostl. (xem thêm giải thích phía trên). 364

Sau đây là bản đè di truyền liên kểt gen vòng ừòn của nhiễm sắc thể ở E. colỉ dòng K ỉ2 (hình 20.23). Bộ gen của E. coỉi đã được giải ký tự chuỗi (sequencing) năm 1997, nó gồm 4.639.221 bp (cặp bazơ) với khòang 4288 ORF (khung đọc mở). Vòng ngoài cùng ghi ký hiệu một số gen, mà mặt trong các số từ 0 đến 100 chì vị trí tính theo sổ phút gen được chuyển qua. Các số ở vòng trong cùng chi số kilo cặp bazơ (kbp) tại các điểm nhận biết (recognition sites) cùa enzym cắt hạn chể (RE - restriction endonucleaz) có tên Not 1. Các mũi tên chi điểm khởi sự của các dòng Hfr. 20.6.7. Plasmid Trong phần nói về quá trình giao nạp (conjugation) hay tiếp hợp ở trên đã đề cập đến plasmid, là những ADN vòng tròn nhỏ hiện diện ở nhiều vi khuẩn. Plasmid là nhân tố di truyền sao chép độc lập với nhiễm sắc thể (Nhiễm sắc thể) của tế bào chủ. Không giống virut, plasmid không có dạng ngoại bào (extracellular form) và tồn tại trong tế bào đơn giàn là ADN tự do và điển hình là dạng vòng ừòn. Plasmid và ADN Nhiễm sắc thể của tể bào có vài điểm khác nhau cơ bàn: plasmid chỉ mang những gen không thiết yểu (nhưng thường rất có ích), còn những gen thiết yếu nàm trên Nhiễm sắc thể. Plasmid di chuyển giữa các tế bào trong quá trình giao nạp (conjugation), tức sự tiếp xúc giữa hai loại tể bào. Các kiểu plasmid khác nhau được phân loại dựa vào các gen mà chúng mang. Một sổ plasmid, các nhân tố trao đổi chất (metabolic factors) mang các gen mã hóa cho các chức năng trao đổi chất khác thường (unusual metabolic functions) như phân hủy dầu mỏ do tràn dầu. Đến nay đs biết hàng ngàn plasmid khác nhau. Trên thực tế, người ta đă phân lập hơn 300 plasmid khác nhau ừong tự nhiên chỉ từ đòng E. coli duy nhất. Nhiều plasmid được sừ dụng làm công cụ chuyển gen trong kỹ thuật di truyền. 20.6.7.1. T ỉnh chẳt vật ỉỷ vồ sự sao chép plasm id

Hầu hết các plasmid đã biết đều có ADN mạch kép, mạch vòng. Tuy nhiên vẫn có nhiều plasmid mạch thẳng. Các plasmid tự nhiên cỏ kích thước rất khác nhau, từ 1 kbp đến 1 megabp. Plasmiđ điển hình là một phân tử ADN vòng ừòn, mạch kép nhỏ chưa đến 5 % kích thước Nhiễm sác thể (hình 20.24). Phần lớn những plasmid ADN được phân lập từ tế bào cỏ dạng siêu xoắn, dạng nhỏ gọn nhất cỏ thể tồn tại trong tế bào. Enzym liên quan đến việc sao chẻp plasmid ưên thực tế là những enzym bình thường trong té bào. Vì thể những gen của plasmid chủ yếu liên quan đến sự kiểm soát quá trình khởi sự sao chép và với sự phân bổ những plasmid được sao chép vào các tế bào con.

365

Hình 20.24. Hình hiển vi điện tử các plasmid vòng (ròn. Tương tự, những plasmid khác nhau hiện diện trong tế bào với số lượng khác nhau, gọi là số bản sao (copy number). Một số plasmiđ chỉ có 1-3 bản sao trong tế bào, trong khi những plasmid khác lại có đến 100 bản sao. sổ lượng bản sao được kiểm soát bời những gen trên pỉasmid và bởi sự tương tác gen giữa tế bào chủ và plasmid. Phần lớn các plasmid ở vi khuẩn Gram âm sao chép tưcmg tự như Nhiễm sắc thể vi khuẩn. Việc này thực hiện từ điểm khởi sự sao chép (Ori) và chép theo hai hưcmg quanh vòng plasmid, tạo ra dạng trung gian íheta (0). Tuy nhiên một số plasmid không sao chép theo hai hướng. Do kích thích nhỏ của ADN plasmid, toàn bộ quá tìn h sao chép xảy ra rất nhanh, có lẽ bàng 1/10 tổng thời gian diễn ra chu kì phân bảo. Hầu hết plasmid của vi khuẩn Gr+ sao chép theo cơ chế vòng xoay tương tự như phage (pxl74. Cơ chể này sẽ tạo ra mạch đcm trung gian, và do đó những plasmid này thỉnh thoảng được xem như plasmid ADN mạch đơn. Phần lớn ADN mạch thẳng sao chép dùng cơ chế liên quan đến một protein gắn với đầu 5’ của mồi mạch mà được dùng trong tổng hợp mồi ADN. 20.6.7.2. Tính không tương hợp (Incompatibility) và chỉnh sửa (curing) Một số vi khuẩn cỏ thể chứa vài dạng plasmid khác nhau. Ví đụ, Borrelia burgdorferi (nhân tố gây bệnh Lyme) chứa 17 plasmid mạch thẳng và vòng. Khả năng hai plasmid khác nhau, mà mỗi một sao chép ưong cùng một tế bào, được kiểm soát bởi gen của các plasmid tham gia điều hòa sao chép ADN. Khi một plasmid được chuyển vào trong tế bào đã có sẵn một plasmid khác, thường thì plasmid thứ hai cỏ thể không tồn tại được và mất đi trong quá trình sao chép tế bào sau đó. Nếu điều này xảy ra, hai plasmid trên được gọi là không tương hợp (incompatible). Một số nhỏm không tương hợp (Incompatibility Inc) đã được ghi nhận. Các plasmiđ thuộc cùng một nhóm không tương hợp sẽ loại trừ nhau khi sao chép trong cùng tế bào nhưng có thể cùng tồn tại với plasmid của nhỏm khác. Plasmid cùng nhóm không tương hợp có chung cơ chế điều hòa sao chép, do đó chủng có

họ hàng với nhau. Vì vậy, dù tế bào vi khuẩn có thể chứa nhiều loại plasmid khác nhau, thì mỗi loại vẫn khác biệt nhau về mặt di truyền. Một số plasmid, gọi là epixom, có thể chèn vào nhiễm sắc thể, và sự sao chép của chúng chịu sự kiểm soát của Nhiễm sắc thể. Trường hợp này rất giống với virut mà bộ gen của chúng có thể chèn vào bộ gen của tế bào chủ. Plasmid thỉnh thoảng có thể bị loại bỏ khỏi tể bào chủ bằng nhiều xử lý khác nhau. Việc loại bỏ này, gọi là chỉnh sừa (curing), là kết quả của ức chế sao chép plasmid mà không có sự ức chế song song đối với Nhiễm sắc thể của tế bào chủ. Trong phân bào, plasmid bị loại bỏ mất. Sự chỉnh sửa có thể xảy ra tự phát, nhưng có thể tăng nhanh đáng kể bằng nhiều cách xử lí khác nhau. 20.6.7.3. Sự chuyển plasmid từ tể bào này sang tể bào khác Cơ chế chính của việc chuyển plasmid từ tế bào này sang tế bào khác là giao nạp, mà chức năng thực hiện được mã hóa bởi chính một số plasmid. Giao nạp là một quá trình sao chép ADN và plasmid của tế bảo cho và truyền bàn sao của Nhiễm sác thể cùng bản sao plasmid sang tế bào nhận. Hình 20.25 cho thấy bản đồ gen của plasmid F, một plasmid đã được nghiên cứu rất kĩ của Escherichia coli. Khỏang 25 gen trên F plasmid, bao gồm các gen sao chép ADN, các yếu tố thực hiện chức năng của một epixom và cuối cùng là một vòng cung ADN lớn, gọi là vùng ưa, chứa những gen giủp nó tự di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác.

Hình 20.25-. Sơ đồ getỉ cùa pỉasmid F cùa E, coỉi. Con sổ bên trong cho biết kích íhước của pìasmid (chính xác là 99.159 bp). Vùng màu xanh sẫm ở dưới chìta những gen chịu trách nhiệm chính để sao chép và tách plasmid F trong tể bào phát triển bình thường. Vàng xanh sáng, vùng tra, chứa những gen chịu trách nhiệm chuyển gen. Chuỗi ori T ỉà điểm khởi đầu cùa quá trình chuyển plasmid trong tiếp họp. Mũi tên cho biết hướng chuyến, (vùng tra sẽ được chuyển qua cuối cùng). Những vùng màu vàng là những yếu tố có thể

367

hoán đổi vị trí, nơi mà có thể xảy ra sự hợp nhất vào những yếu tẻ tương đồng trên nhiễm sắc thế vì khuẩn và đẫn đến sự hình thành dòng Hfr.(Theo Brock Microbiology lì, 2006). Plasmid điều khiển sự truyển gen của chính nó bởi sự tiếp xúc của hai tế bào gọi là có khả năng giao nạp. Không phải tất cả plasmiđ đều có khả năng tiếp hợp. Khả năng truyền trong tiếp hợp được kiểm soát bởi những gen trong plasmid gọi là vùng tra. Vùng tra chửa những gen mã hóa protein thực hiện chức năng bắt cặp. Sự hiện diện của vùng tra ở plasmid có thể dẫn đển kết quả quan trọng khác nếu plasmid chèn vào nhiễm sắc thể. Trong trường hợp này, plasmid có thể huy động sự chuyển ADN nhiễm sắc thể từ tế bào này sang tế bảo khác. Một vài plasmid tiếp hợp từ Pseudomonas có biên độ tế bào chủ lán, Điều này có nghĩa là chúng có thể được truyền sang rất nhiều vi khuẩn Gr+ khác. Những plasmid như thế có thể chuyển thông tin di truyền giữa những sinh vật ở gần nhau. Những plasmid tiếp hợp có thể chuyển giữa vi khuẩn Gr" và Gr+, giữa vi khuẩn và tế bào thực vật và giữa vi khuẩn và nấm. Thậm chí nếu plasmid không thể sao chép độc lập ừong vật chủ mới, sự chuyển plasmid tự nó có thể có ý nghĩa tiến hóa quan trọng nếu gen từ plasmiđ nối lại với bộ gen cùa vật chủ mới. 20.6.7.4, Vài loại plasmid khác và ý nghĩa sinh học của chúng Mặc đù plasmid không mang những gen thiểt yếu đối với vật chủ, nhưng nó có thể ảnh hưởng đáng kể đến kiểu hĩnh của tế bào. Chẳng hạn, khả năng của Rhizobium tương tác với thực vật và hình thành nốt sần ở rễ cố định đạm là nhờ những plasmid thực hiện. Những plasmid khác mang lại đặc điểm biến dưỡng đặc biệt ở tế bào, như sự phân hủy chất gây ô nhiễm độc hại. Thực ra, plasmid dường như là một bộ mảy chính để tạo ra những tỉnh chất riêng biệt của vì khuẩn, và trong nhiều trường hợp, còn “xuất khẩu” (export) những đặc tính này bởi sự chuyển gen theo chiều ngang. Hạn chế duy nhất đối với những kiểu gen này có trong plasmid là chúng không can thiệp vào sự sao chép của chính mình hoặc vào sự tồn tại của vật chủ. a) Pỉasmid đề khảng

Trong số những nhóm plasmid phổ biến nhất và được nghiên cứu kĩ nhất là các plasmid R, có khả năng kháng kháng sinh và nhiều chất ức chế sinh trưởng khác. Plasmid R lần đầu tiên được phát hiện tại Nhật ở đòng vi khuẩn ruột; đó là những vi khuẩn có tính đề kháng đối vói nhiều loại kháng sinh (đa kháng) và kể từ đó, chúng được phát hiện trên kháp thế giới. Bản chất gây nhiễm của plasmid tiếp hợp R cho phép chúng lan rộng nhanh chóng trong quần thể tế bào gây ra một vấn nạn lớn trong y học lâm sàng là sự xuất hiện nhanh các vi khuẩn đề kháng thuốc.

368

Một plasmid R có thể mang nhiều gen đề kháng. Chẳng hạn, plasmid R I00 có 94,3 kbp (hình 20.25), mang những gen mã hóa cho sự kháng sulfonamid, streptomycin và spectinomycin, fusidic axit, chloramphenicol, tetracylin và cỏ thể một số gen kháng thủy ngân (mercury). Plasmid R I00 có thể được chuyển giữa các vi khuẩn đường ruột thuộc chi (Genra) Escherichia, Klebsiella, Proteus, Salmonella và Shigella, có thể chuyển vào vi khuẩn Gram âm Pseudomonas. Những plasmid R khác có gen kháng kháng sinh cũng được ghi nhận.

Hình 20.26. Pỉasmid R ĩ00: RTF ỉà vùng các gen tra chuyển gett; r-determinant là vìmg các gen đề kháng (mer - thủy ngân, suỉ - s u lfa m id , s i r - streptomycin, cmỉ - chloramphenicol teí - tetracycỉin). (Theo Brock Microbiology l ĩ, 2006). b) Plasmid mõ hỏa chất độc và những độc tính khác ở một sổ vi khuẩn gây bệnh, một số tính chất này được mang trên plasmid. Thí dụ, dòng E, coli gây bệnh đường ruột có tỉnh chất này bởi khả nâng sinh sản thành tập đoàn trong ruột non và sản xuất một chất độc gây các triệu chứng của bệnh tiêu chảy. Sự hỉnh thành tập đoàn đòi hỏi sự hiện diện của một protein bề mặt tế bào gọi lả yểu tố kháng nguyên tạo quần thể (yếu tố kháng nguyên hình thành tập đoàn), được mã hóa bởi một plasmid. Protein này giúp tế bào có khả năng gán vói tế bào biểu mô của ruột. ít nhất hai chất độc ở E. coli gây bệnh đường ruột được mã hỏa bởi một plasmid: hemolysin ỉàm tan tế bào hồng cầu và enterotoxỉn gây tiết quá nhiều nưóc và muối vào ruột và do vậy là chất độc gây tiêu chảy.

369

c) Bacteriocin Nhiều vi khuẩn sản xuất protein ức chể hoặc giết chết tế bào các loài họ hàng gần, thậm chí ngay cả những dòng khác nhau của cùng một loài. Những tác nhân này, được gọi là bacteriocin để phân biệt với chất kháng sinh, có phổ tác động hẹp hơn kháng sinh. Các gen mã hóa bacteriocin và những protein chế biến (processing) và vận chuyển chúng (tạo tính miễn dịch cho sinh vật sản sinh ra nó) thường nằm trên plasmid hay transposon. Bacteriocìn được đặt tên theo loài tạo ra nó như ờ E. colì có colicin, mã hóa bởi Colplasmiđ; Bacillus subtilis tạo ra subtilisin,... Plasmid Col của E. coli mã hóa nhiều colicin khác nhau. Colicin được giải phóng từ một tế bào gắn với những thụ thể (receptors) đặc hiệu ữên màng tể bào đễ cảm nhiễm (susceptible). Colicin giết tế bảo bằng cách ngăn cản chức nâng quan ừọng nào đó của tế bào. Bacteriocin hoặc tác nhân tương tự bacteriocin của vi khuẩn Gram dương thi hơi khác colicin nhưng cũng thường được mã hóa bởi plasmid, một số thậm chí còn có giá trị thương mại. Chẳng hạn, vi khuẩn lactic tạo ra bacteriocin Nisỉn A ức chế mạnh sự tăng trưởng của một loạt vi khuẩn Gr+ và được dùng làm chất bảo quản trong công nghệ thực phẩm. 20.6.8. S ự chuyển vị (T ransposition) Các phần tử chuyển vị (transposable elements) hay phần tử di động (mobile elements) là những trinh tự AĐN cỏ khả năng di chuyên từ vị trí này đến vị trí khác (mục tiêu) của bộ gen (cùng bộ gen hay khác). Sự đi chuyển ADN này được gọi là transposition (sự chuyển vị). Tái tổ hợp (Recombination) trong chuyển vị (transposition) là sự kết nối (junction) giữa các đầu mút của phần từ chuyển vị với các đầu mút bị cát hở cùa ADN mục tiêu (target site). Khác với tái tổ hợp tương đồng (homologous recombination), transposition không đòi hỏi sự tương đồng (homologous sequence) giữa các phần tử di động và ADN mục tiêu, và nó độc lập với chức năng được mã hóa bởi recA, vi nỏ sử dụng enzym đặc hiệu là Transposaz. Đây là hiện tượng rất phổ biến trong thiên nhiên, các ừansposon được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm, thực vật và động vật (bảng 20.6). Chúng có chức năng như các vector quan ữọng thực hiện biến đổi di truyền. Các xen đoạn, mất đoạn và cấu trúc lại bộ gen thường kèm theo sự di chuyển của các transposon. Sự di chuyển này làm sai hỏng chức năng bình thường của gen. Chúng hoạt hóa hay ỉàm bât hoạt các gen băng cách xen đoạn vào kề bên hay vào giữa đoạn gen. Các ừansposon IS, là các phần tử lặp đoạn (repetitive elements), còn tạo các vùng tương đồng rải trong bộ gen, nhờ đỏ các hệ thống tái tồ hợp tương đồng có thể tác động.

370

Bảng 20.6. Các phần tử chuyển vị có ỞProkaryotae và Eukaryota Prokaryota - Trình tự xen đoạn: ĨS - Transposon: Tn như Tn3, Tn5, TnỉO,... - Virut: Mu

Eukaryota - Retrotransposon: Nấm men (Yeast): Ty Ruồi giấm: copia, p - Transposon (ADN): Ngô: hệ thống Ac-Ds - SINE: ờ ngưởi (họ Alù) - Retrovirut: Rous sarcoma, HIV

Transposition gồm các kiểu chính: - ỈS: trình tự xen đoạn (insertion sequence) là các transposon ngẳn. - Transposon (kí hiệu Tri)'. Các phần từ di động đài (khoảng 5000 bp) có chứa một hoặc vài gen. Nó thực hiện: + Transposition không sao chép (nonreplicative): Phần tử chuyển vị được cát khỏi ADN cho (donor) và được gắn vào phân tử ADN mục tiêu. Thuộc loại này có TnỉO, Tn5, Ty íĩ.

+ Transposition sao chép (replicative): ADN đuợc nhân đôi và bản sao được xen vào vị trí mới tạo coìntergrat (cộng gắn) và có Tn3, Mu. - Retrotransposỉtion\ Sự di chuyển qua trung gian ARN, nhờ reverse transcriptaz tạo thành cADN, và sự xen đoạn cADN vào vị tri mới. 20.6.8.1.

Các trình tự xen đoạn IS

Các íransposon đơn giàn nhẩt là các trình tự xer đoạn (insertion sequence) và được kí hiệu bởi tiếp đầu ngữ IS kèm số thứ tự như IS4. Các phần tử IS là các cẩu phần bình thường cùa ADN vi khuẩn vả plasmid. Dòng E.coli chuẩn thường chứa vài bản sao (<10) cùa bất kì một trong các IS chung thường gặp. Để mô tả sự xen đoạn vào điểm đặc biệt, kí hiệu 2 chấm kép được sử dụng như X:: 1S| chỉ ISi xen vào phage X. Các IS là những đơn vị tự trị, mồi một trong chúng mã hóa cho chi một protein cần thiết cho sự chuyển vị bản thân chúng. Trinh tự của mỗi loại IS có khác nhau, nhưng trong tổ chức cấu tạo có nhiều tính chất chung. Ờ giữa có gen fransposaz tnp, hai đầu có lặp đoạn đảo ngược (IR - Inverted repeats). Sự xen đoạn của IS ờ tiêu điểm (target) được minh họa trên hình 20 .27 . cấu trúc transposon và sự chèn vào ADN mục tiêu nêu trên hình 20.28.

371

Các đầu mút của transposon có trình tự lặp lại đảo ngược (inverted repeat - IR). Trong ví dụ này, tiêu điểm có 5 bp. Các đầu mút cùa transposon gồm các lặp đoạn đảo nguợc 9 bp được đánh số từ 1 đến 9.

DNA mục tiêu

IR

ỈR

V

Hình 20.27. cẩu trúc ỈS và sự chèn vào ADN mục tiêu. Ở hai đầu của IS luôn cỏ hai trình tự ĩộp đoạn trực tiếp (direct repeat) ngắn. Các trình tự này dao động tùy transposon, nhưng cổ định đối với mỗi loại IS. Chiều dài của phần lớn lặp đoạn trực tiếp là 9, chúng xác định các đầu mút cùa transposon. IR »987654321 •887654321

IR 123456789123456789'

I

•ATữCA. 'TACGT-

Mục tiêu •ATGCA1234S6789* •TACGT123456789DR

=#=

-987654321ATGCA. -987654321TACGT*

IR

IR

DR

Hình 20.28. Sơ đổ cấu trúc cùa transposon có các IS, cảc ỉộp đoạn đào ngược ĨR (inverted repeat) và tạo lặp đoạn trực íiểp ở hai đầu ADN điểm mục tiên. 20.6.8,2. Transposon không sao chép và sao chép Sự chuyển vị ADN theo 2 kiểu khác nhau (sao chép và không sao chép hay bảo tồn (conservative)) và có những tính chất chung (hình 20.29).

372

Sơ đồ diễn biến transposition sao chép (transposon Tn3) được nêu trên các hình sau: cắt và nối (hình 20.30), sự cộng gắn và phân tách.

/

Â

Saềchép

B ả o tồ n

Hình 20.29. Sơ đồ về transposition sao chép và không sao chép.

ADN cho

ADN nhận

Hình 20.30. Sơ đồ transposition sao chép (Tn3). Tiếp theo là sự cộng gắn (Cointegrat Formation) 2 loại ADN (hình 20.31).

373

L

D Tn

D Tn

Tn

3s

Hình 20.31. Sự cộng gắn (Coiĩỉỉegrat) cùa 2 ìoạì AND. Cuối cùng là sự phân tách (Resolution) ra 2 loại ADN (hình 20.32).

Hình 20.32. Sự phân tách ra 2 loại AND. Quá trình ưansposition có những đặc điểm sau đây: - Cả hai đầu của phân tử mang gần như một trình tự có định hướng đào ngược nhau. - Các ừansposon mã hóa ít nhất một protein là transposaz. Transposaz gắn đặc hiệu và cắt các trình tự ở cuối để thực hiện chuyên vị. - Các transposon tạo bản sao ngắn (< 12bp) của ADN ở điểm mục tiêu trong ừansposition. Chiều dài của trình tự này đặc trưng và không đổi đổi với một phần tủ nhât định và được tạo ra nhờ sự cắt so ỉe (staggered cleavage) của ADN mục tiêu nhờ ừansposaz. Cơ chế transposition được nghiên cứu chi tiết ở phage Mu và có thể tóm tắt như sau: - Sự nhận biết và bắt cặp 2 đầu mút của transposon nhờ transposaz để hình thành cấu trúc chuyên biệt protein - ADN. Sự hình thành phức hợp được kích thích bởi các protein HU và IHF là các nhân tố tham gia tái tổ hợp điểm chuyên biệt Mu transposaz, giống như Ằlnt protein, có 2 vùng gắn độc lập. - Sự cẳt khấc (nicking) đo transposaz tạo ra 3 ’-OH ờ mỗi đầu của Mu. - Cắt tiêu điểm nhờ transposaz tạo đầu mút so le 5 - p dài 5 bp.

374

Sự nổi đầu 5 ’ - p của tiêu điểm với 3 '-0 H của transposon tạo cấu trúc trung gian chuyển mạch (strand - transfer intermediate). TnlO có lẽ sử dụng cơ chế tương tự để thực hiện transposition không sao chép hay bảo tồn (conservative transposition) (hình 20.33 a, b, c và d). 20.6.8.3. Sự chuyển vị ngược ịRetrotransposition) Nhóm các transposon, được phát hiện ở nấm men (Ty) và Drosophila (copia) và có liên quan đến retrovirut, đi chuyển đến vị trí mới qua trung gian ARN. Transposon của nấm men Ty, giống với retrovirut, có lộp đoạn cuối dài (long terminal repeat) được gọi là trình tự ô nằm ờ 2 phía đoạn mã hóa. Các protein được mã hóa, có trinh tự tương đồng với integraz của retrovirut và reverse transcriptaz, rất cần thiết cho transposition. Phương thức phiên mã ngược của các phần tử đi động tương tự như của retrovirut. Có sự tương tự về cấu trúc giữa reưovirat và các retrotransposon ở nấm men (Ty) và Drosophila (copia). Sự chuyển vị ngược tạo bản sao của phần tử ở vị trí mới, trong khi phân từ cho ban đầu vẫn giữ nguyên cấu trúc không biến đổi. Do vậy, retroừansposition tạo nên một ít đứt đoạn và các tái cấu trúc (rearrangement) của bộ gen tế bào chù. Những biển đổi của bộ gen liên quan với retrotransposition sẽ dẫn đến việc làm ngừng hay hoạt hóa các gen, mà một số có thể gây ung thư. Các tramposon đã góp phần vào sự tiến hỏa của plasmid, và vài chứng cứ cho thấy các plasmid R cỏ được tính đề khảng khảng sinh thông qua các transposon.

a.

b.

375

/* ADN cho

Điểm cắt

V

;

/

^

T n

DNA nhận

c.

d.

Hình 20.33. Transposition không sao chép hay bảo tồn (conservative transposition) Mũi tên chi các điểm cẳi và sau đỏ nổi lợi theo trậị tự mới.

20.6.8.4. Gây đột biến bằng transposon Các ứng dụng của transposon bao gồm: - Gây đột biến (mutagensis) bàng transposition. Gen A Nhiễm sắc thề vi khuẩn [A+ TetS] (A cổ chức năng và nhạy cảm tetracycỉin) Clièn T n lô vào gene A *10

T tf

I

isto

1^00bp Hỉnh 20.34. Transposon TnỉQ chèn vào A làm mất chức năng, nhưng kháng tetra.

- Công cụ cho kỹ thuật di truyền in vivo (in vivo Gentic Engineering). - Nhân tố trung gian đề kháng kháng sinh (mediator of antibiotic resistance) Ở đây đề cặp chủ yếu đến gây đột biến nhờ transposon (Transposon Mutagensis). Sự chèn transposon vào giữa gen sẽ dẫn đến đột biến làm mất chức năng bỉnh thường của gen (hỉnh 20.34). Transposon cung cấp một phương tiện dễ dàng để tạo các đột biến trên Nhiễm sắc thể. Một thuận lợi cho gây đột biến bằng transposon là nó có chứa 1 gen kháng kháng sinh, mà gen này dùng làm marker (dấu chuẩn) để nhận biết transposon được chèn vảo. Trước tiên các dòng mang gen kháng kháng sinh được phân lập từ môi trường giàu dinh dưõng, nơi các đột biến khuyết dư&ng tăng trưởng tạo khuẩn lạc. Sau đó chúng có thê 376

được sàng ỉọc trên môi trường giới hạn được cung cấp các chất tăng trưởng nào đó để xác định chất nào cần thiết cho đột biến. Các transposon cũng hữu ích cho sự chèn 1 maker gen khuyết dưỡng (auxotrophic) vào trong dòng sinh vật hoang dại. Thường thì các đột biến khuyết dưỡng khó phân lập trực tiếp. Nhưng nếu marker khuyết dưỡng được đưa vào cùng ưansposon với marker kháng kháng sinh, thì có thể qua chọn dòng đề khảng kháng sinh mà xác định marker khuyết dưỡng. Hai transposon thường được sử dụng trong gây đột biến là Tn5 (kháng neomycin và kanamycin) và TnỉO (chứa 1 marker kháng tetracycline). Integron là các transposon có thể thu nhận và biểu hiện các gen từ nhiều nguồn khác nhau. Tuy nhiên, khác với các transposon được chèn vào một cách ngẫu nhiên, các integron chèn vào có tính chọn lọc cao (high selective) ừong cảc điểm xen đoạn (insertion site) của chúng, thường thì đựơc chèn vào trong plasmiđ. Integron chứa gen mã hóa cho protein được gọi là integraz, cần thiết cho sự tái tồ hợp ở điểm chuyên biệt (site-specific recombination). Bộ gen của phage X (lambda) chèn vào Nhiễm sắc thể của E. coli ở một vị trí đặc biệt nhờ hoạt tỉnh của enzym integraz X. Integron cũng chứa trình tự ADN đặc biệt cho phép integraz chèn các nhóm gen gọi là cassette vào Nhiễm sắc thể, mà trên đó có promoter cho phép các gen cassette mới được biểu hiện. 20.7. DI TRUYỀN HỌC VIRUT Virut có cẩu tạo đơn giản và rất nhỏ nên được phát hiện muộn hơn. Việc các nhà vật lí học khi chuyển sang lĩnh vực sinh học đã sử dụng các virut vào nghiên cứu di truyền học cho thấy rõ tầm quan trọng của các đổi tượng này. Di truyền học virut đã góp phàn đáng kể cho sự phát triển của sinh học phân tử, Sự hiểu biết chitiết về các virut không những giúp con người biết rõ các cơ nguyên gây nhiều bệnhhiểm nghèo (ung thư, AIDS,...), mà còn có thể biến chúng thành các công cụ chuyển gen có lợi cho con người 20.7.1. Sinh học của virut Virut được phát hiện vào năm 1892, khi nhà khoa học Nga Ivanovski (hỉnh 20.36) nhận thấy virut đốm thuốc ỉả (tabacco mosaic virut - TMV) qua được màng lọc ngăn vi khuẩn.Năm 1935, W.M Stanley phát hiện các virut cỏ thể tạo thành tinh thể. Còn cảc sinh vật khác, tế bào dù đơn giản nhất cũng không thể tạo thành tỉnh thể được. Đã có những bàn cãi rằng virut có được coi là sinh vật hay không. Đến nay, chúng được coi là những thực thể sống chưa cỏ câu tạo tế bào. Các virut hay các virion là những dạng sinh vật có cấu tạo đơn giản nhất. Xét từ gốc độ phân loại học, sinh giới có thể chia thành hai nhóm lớn: các sinh vật có cấu tạo tể bào và virut.

377

20.7.1.1. Đặc điểm chung của virut Vào những năm 1950, sự quan sát trực tiếp bằng kính hiển vi điện tử cho thấy virut có rất nhiều điểm khác vi khuẩn. Trước tiên cần kể đến đặc tính rất nhỏ bẻ, cấu tạo đom giản của virut. Virut nhỏ nhất cỏ đường kính chì 20 nm, nhỏ hơn cả riboxom. Ngoài ra, virut khác với các sinh vật có cấu tạo tế bào ở nhiều điểm: - Virut là các thể nội kỉ sinh bắt buộc, không có cấu tạo tế bào. Chúng phát triển và sinh sản chi trong các tế bào sống của vật chủ chuyên biệt. - Virut sử dụng bộ máy sinh tổng hợp của tế bàọ chủ để sinh sản và thường phá hủy tế bào chủ để phóng thích thế hệ virut con tiếp tục gây nhỉễm các vật chủ mới. - Virut có bộ gen chỉ gồm một loại nucleic axỉt (ADN hoặc ARN), trong khi đó các tế bào có cả hai loại, được bao trong vỏ protein. Phần lớn virut gồm 1 loại nucleic axit và một ít loại protein. - Chúng không có hệ thống sinh tổng hợp protein riêng (không có riboxom); không có hệ thổng trao đổi chất riêng nên không biến dưỡng năng lượng (không phân hủy thức ăn để tạo ATP), không thực hiện sự lên men, hô hấp và quang hợp. - Virut không tạo màng ỉipit riêng, mặc dù một số virut có màng bao (enveloppe) được tạo ra bằng biến đổi màng của tế bảo chủ trước khi thoát ra khỏi tế bào chù. - Virut không bị tác động bởi các thuốc kháng sinh vì không có cấu trúc vách tể bào và bộ máy sinh hóa riboxom như tế bào vi khuẩn. - Virut không có khung sườn tể bào (cytoskeleton) hoặc phương tiện đi động ngoài sự khuếch tán. - Virut không “tăng trưởng” theo nghĩa là tăng khối lượng, khi virut đã hình thành nó không tăng kích thước. Hình dạng đặc trưng của virut được xác định bởi vỏ protein. Virut đã hình thành ừọn vẹn được gọi là virion, bộ gen của nó được gói trong vỏ protein và bên ngoài có thể cổ màng bao. 20.7.1.2. Cấu tạo virut Virut có bộ gen rạt đa dạng. Bộ gen (Genome) của virut có thể là ADN mạch kép (double strand - dsADN), AD N mạch đơn (single sữand - ssADN), ARN mạch kép (double sữand - dsARN), hay ARN mạch đơn (single strand - ssARN). Các virut có ADN hoặc ARN mạch đơn còn phân biệt thành 2 dạng dương hay cộng (+) và âm hay trừ (-): - Vỉrut mạch đương (Plus (positive)-strand virut): virut với bộ gen ARN hay ADN mà bộ gen cỏ cùng trình tự nucleotit như mARN cùa vỉrut.

378

Vì'rut mạch âm (Minus (negaíive)-strand virut): virut với bộ gen ARN mà mạch ARN này có trình tự nucleotit ngược chiều (bổ sung vói) với mARN của virut. Bộ gen virut thường là một phân tử nucleic axit ở dạng vòng tròn hay thẳng. Virut nhỏ nhất có chừng 4 gen, virut lớn nhất có chừng vài trâm gen. Vỏ protein bọc bộ geiì được gọi là capsid thường có thể ở dạng hình que, hình ống xoắn, hình đa diện hay phức tạp. Nvcỉeocapsid là phức hợp nucleic axit và các protein của một virut. Các capsid thường được tạo nên bởi một số lớn tổ hợp các phân tử protein gồm ít loại, được gọi là capxome. Ví dụ, virut đốm thuốc lá có một capsid hình que dài cứng được tạo ra từ hơn 1000 capxomre (hình 20.36). Nucleic acid

b) Hình 20.36. Virut đốm thuốc lá.

a) Sơ đồ cẩu trúc; b) Ảnh hiển V / điện từ. Các Adenovirut, thường gây nhiễm đường hô hấp của động vật, có 252 phân tà protein tương tự nhau xếp lại tạo capsỉd hình đa diện với 20 mặt (hình 20.37).

Hình 20.37. Adenovirut có capsid đầu đa diện, a) Sơ đồ cẩu trúc; b) Ảnh hiển vi điện từ. Một vài virut có cấu trúc phụ hỗ trợ để chúng nhiễm vào tế bào chủ. Virut Flu và nhiều virut động vật cỏ màng bao (envelope) phía ngoài capsid (hình 20.38). Bao này bắt nguồn từ màng cùa tế bào chù, nhưng ngoài photpholipit và protein của tế bào chủ, chúng còn cỏ thêm cảc protein và glycoprotein nguôn gốc virut.

379

Hình 20.38. Sơ đồ cẩu trúc cùa virut có màng bao (enveloppe) với các gai. a) Sơ đồ cấu trúc; b) Anh hiển vi điện tử. Các virut nhiễm vi khuẩn có capsid phức tạp nhất. Các virut của vi khuẩn được gọi là bacteriophage (thực khuẩn thể - ăn vi khuẩn) hay gọi ngắn là phage. Bảy phage đầu tiên gây nhiễm E.coỉi được nghiên cứu mang tên Ti, T 2, T3...T7 (T từ chữ typ). Các phage T chẵn (T2, T4, T6) có cấu trúc rất giông nhau. Capsid của chúng gồm một đầu đa diện (20 mặt) bọc chất di truyền. Phần thứ hai là bao đuôi bằng protein thành ổng dài và phần thứ ba là sợi đuôi dài bám vào tế bào vi khuẩn khi gây nhiễm. Tóm lại, virut đuợc mô tả theo 4 tiêu chuẩn căn bản khác nhau: ” Bộ gen (Genome) chỉ gồm một loại phân tử là ADN hay ARN. - Nucleic axit bộ gen là mạch đơn (single strand - ss) hay mạch kép (double strand - ds). - Hình dạng (shape) của virion đơn giản hay phức tạp. - Virion có hay không màng bao (membrane hay envelop). 20.7,1.3.

Sao chép của các virut

Các hạt virut (virut particle) hay virion là những vật ki sinh nội bào bẳt buộc (obligate intracellular parasite). Chúng chỉ biểu hiện các gen của chúng và sinh sản bên ừong 1 tế bào sống khác. Phụ thuộc vào loại tế bào chù mà virut kí sinh, người ta gọi tên loại virut, ví dụ: vìrut thực vật kí sinh tế bào thực vật, virut động vật kí sinh tế bào động vật. Do đặc điểm này, sự sinh sản của virut khác hẳn với sự sinh sản của tế bào. Điểm nổi bậc là virut tạo ra hàng trăm hay hàng ngàn virion trong mồi thế hệ. Do có sự đa dạng như nêu trên, các bộ gen của virut được sao chép theo nhiều con đường khác nhau: - Các ADN mạch kép —> ADN mạch kép: kiểu bán bảo tồn.

380

- Các ARN mạch kép -> ARN mạch kép; kiểu bán bảo tồn nhờ ARN replicaz do gen tạo enzym sao chép này được mã hóa trong bộ gen của virut ARN. - Các ADN hoặc ARN mạch đơn -> chúng làm khuôn (mạch +) để tổng hợp mạch bổ sung (mạch -) thành dạng mạch kép trung gian (+/—), gọi là dạng sao chép (replicative form), mà từ nó lấy mạch - làm khuôn tạo ra mạch đơn + giống bộ gen ban đầu của virut (hình 20.39).

ADN hoặc ARN mạch đơn: +

^

mạch + Dạng sao chép

mạch -

Bộ gen cho virion mới: mạch +

^

Hình 20.39. Sao chép của ADN hoặc ARN mạch đơn qua trung gian mạch kép.

Ở Retrovirut ARN -> nhờ enzym reverse transcriptaz tổng hợp C-ADN mạch đơn từ khuôn ARN virut -> C-ADN kép -> Chèn vào bộ gen tể bào chủ -> tạo ra bộ gen ARN virut mới và mARN. Phụ thuộc vào bộ gen ADN hay ARN mạch kép hay đơn, mạch dương (+) hay âm (), kiểu sao chép bộ gen và tổng hợp mARN, các virut được chia thành 7 lớp (classes). Một cách sao chép đặc biệt được tế bào vi khuẩn sử dụng trong tiếp hợp để truyền phân tử ADN dạng thằng sang tế bào khác hoặc được các virut sử dụng để tạo các bộ gen của chúng, mặt khác làm đứt mạch của vòng tròn xoắn kép, tạo đầu hở 3’-OH và 5’-P kết thúc. Helicaz và SSB protein chen vào tạo chẽ 3 sao chép. Sự sao chép được thực hiện không cần mồi (primer) vì mạch 3’-OH sẵn sàng cho việc nối dài như mạch trước (leading strand) nhờ ADN polymeaz I. Đồng thời với sao chép mạch trước, mạch khuôn sau dịch chuyển. Sự dịch chuyển của mạch sau gián đoạn để tổng hợp các đoạn ngắn Okazki nhu bình thường và đàu 5’ mạch khuôn duỗi thẳng ra (hỉnh 20.40). Sự sao chép có hình giống chữ sìgma (ơ) của Hi Lạp, nên được gọi là sao chép sigma (ơ replication). Kiểu sao chép ơ này còn được gọi là vòng tròn quay (rolling-circle replication), vỉ mạch khuôn tròn ở giữa không bị đứt vả quay tròn làm khuôn cho mạch trước. Sự sao chép kiểu này có thể lặp lại vài lần tạo ra sợi ADN đài, lặp lại nhiều lần bộ gen thẳng của virut, được gọi là concatemer. Enzym endonucleaz cắt ở những điểm khác nhau trên mỗi mạch của ADN tạo ra các đoạn cỡ bộ gen với hai đầu “dính”. Bộ gen thẳng này sẽ tạo thành vòng nhờ bắt cặp bổ sung các đầu “dính”.

381

Hỉnh 20.40. Sao chép ơ(sigma) hay vòng tròn xoay; (Đường đậm dưới chi mạch khuôn cũ, các đoạn ngắn chi mạch mới được tổng hợp. Phía trên tổng hợp xong I bộ gen, phía dưới được 2 bộ gen của virut). 20.7.1.4. Sự tự ráp (Self-assembly) của các virion Các gen của virut sử dụng các enzym, chất dinh dưỡng, riboxom và các nguồn khác cùa tế bào chù để tạo ra nhiều bản sao của bộ gen và các protein của các cấu phần khác (capsid, cổ, bao đuôi...). Khi các sản phẩm riêng lẻ đã tích đủ, chúng tự ráp (selfassembley) nhau thành số iượng lớn các virion rồi phá vỡ tế bào tìm các tế bào chủ mới. Sự ráp nucleic axit của virut với các protein của capsiđ để hinh thành virion mới diễn ra tự động tương tự các mạch polypeptit tự gắn với nhau để tạo nên các protein có cấu trúc bậc bốn. Các cấu phần được gắn với nhau bằng liên kết yếu nên không cần enzym. 20.7.1.5. Tính đặc hiệu với tể bào chủ Mỗi kiểu virut có thể nhiễm và kí sinh chỉ ở một biên độ giới hạn của tế bào được gọi là biên độ chủ (host range). Các virut nhận biết tế bào chủ theo nguyên tắc "ổng khóa và chìa khóa" các protein bên ngoài của virion lấp vừa các điểm nhận (receptor site) trên bề mặt tế bào. Một số virut có biên độ chủ rộng đủ để xâm nhập vào vài loài. Các virut bệnh dại có thể nhiễm nhiều loài có vú gồm gậm nhấm, chó và người. Biên độ có thể rất hẹp như nhiều phage chỉ nhiễm vi khuẩn E.coỉi.

20.7.2. Bacteriaphage - Vứut của vi khuẩn Các phage là virut của vi khuẩn được phốt hiện từ năm 1915. Vào những năm 40, chúng được sừ dụng cho các nghiên cứu sinh học phân tử. Chúng là những vimt được nghiên cứu kĩ nhất, mặc đù một sổ ít chúng có cấu tạo phức tạp.

382

Bảy phage đầu tiên gây nhiễm E.coỉi được nghiên cứu mang tên Ti, T2, T3...T 7 (T tà chữ typ). Các phage T chằn (T2, T4, Tộ) có cẩu trúc rất giống nhau (hình 20.41). Capsid của chúng gồm một đầu đa diện (20 mặt) bọc chất di truyền. Phần thứ hai là bao đuôi bằng protein thành ống dài và phần thứ ba là sợi đuôi dài bám vào tế bào vi khuẩn khi gây nhiễm. Phage nhận biết tế bào chủ thông qua sự gắn kết đặc hiệu giữa các protein capsid và các protein thụ thể ừên tế bào chủ. Khi xâm nhiễm, các sợi đuôi bám lên bề mặt và bao đuôi co ngắn lại bơm bộ gen virut vào bên trong tế bào. Các virut có thể sinh sản trực tiếp và giết chế tế bào chủ, hoặc sinh sản chậm hơn bằng chèn nucleic axit của chúng vào bộ gen tế bào chủ. -B5 n m -

C apsid (đáu)

Hình 20.41. Bacteriophage T4 chẵn. Các nghiên cứu phage kí sinh ở tế bào E.coỉi phát hiện ràng chúng có 2 cơ chế siiih sản: chu trình tan (lytic cycle) và chu trình tiềm tan (lysogenic cycle). 20.7.2.1 Chu trình tan (Lytic cycle) Trong chu trình tan, tế bào nhiễm vimt bị tan phóng thích thế hệ phage con. Bộ gen nucleic axỉt của phage chi phổi bộ mảy sinh tổng hợp của tế bào chủ qua 2 giai đoạn: sớm và muộn. Bộ gen virut chứa trình tự promoter mạnh thu hút ARN polymeaz của tế bào chủ.

383

Trong giai đoạn sớm, các gen phage kế cận promoter được phiên mã. Các sàn phẩm của gen sớm thường gồm các protein làm dừng phiên mã của tế bào chủ và kích thích sao chép bộ gen (genome) của phage. Nucleic acid Capsìd Vách tể bào vi khuẩn

Đầu DNA vi khuẩn

Bám vào

Sinh tổng hợp các phần .cùa virus nhờ tế bào chủ

Thể đuôi

Trưởng thành các virion tự ráp

Làm tan tê bào chủ và thoát ra

Hình 20.42. Chu trình tan của phage T4. a) Bám vào; b) Xâm nhập; c) Sinh tống hợp các cấu phần nhờ tế bào chủ; d) Tnrờng thành: các virion được tỉ/ráp; e) Làm tan tể bào, các virion thoát ra.

384

Ở giai đoạn muộn, các gen muộn của phage mã hóa cho protein vỏ và enzym gây tan tế bào chủ dẫn đến phóng tích các virion con. Các bacteriophage làm chết tế bào chù gọi là độc (virulent) và chúng sinh sản theo chu trình tan (hình 20.42). Chu trình bắt đầu khi sợi đuôi của phage T4 gắn vào các điểm nhận (receptor sites) trên bề ngoài của tế bào E.coli. Ống đuôi co lại tạo lỗ thùng xuyên vách tế bào và bơm ADN vào trong tế bào tương tự như dùng ống tiêm (syringe) bơm thuốc. Capsid rỗng của phage còn lại bên ngoài tế bào. Khi ADN trần đã xâm nhập vào trong tế bào, các phage khác nhau có thể sử dụng các cách khác nhau để sản sinh ra thế hệ con. Sau khi bị nhiễm, tế bào E.colỉ nhanh chóng bắt đầu phiên mã và dịch mã các gen của virut. Phage T4 có khoảng 100 gen và phàn lớn đã được biết rõ. Một trong những enzym được tạo ra đàu tiên cắt ADN của tể bảo chủ. Nói chung, ADN của phage được phiên mã đầu tiên nhờ ADN polymeaz của tế bào chủ tạo ra “mARN sớm". Các mARN muộn hom có thể được tổng hợp bởi ARN polymeaz của phage hoặc ARN polymeaz của vi khuẩn bị biển đổi để phiên mã các gen của phage. Các mARN muộn được dịch mã tạo các loại protein enzym điều hòa và cấu trúc. Các protein điều hòa của phage kiểm soát sự phiên mã nổi tiếp của các gen (kiểu điều hòa nối tiếp). Khi ADN của tế bào chủ bị phân hủy, bộ gen của phage kiểm soát toàn bộ hoạt động của tế bào để tạo các cấu phần của nó. Các nucleotit đuợc dùng để sao chép ADN cùa phage ra hàng trăm bản sao. Các protein của capsid được tổng hợp thành 3 phần riêng: đầu đa diện, Ống đuôi và các sợi đuôi; rồi chúng tự ráp lại với nhau thành virion con (hình 20.42 - vòng tròn phía dưới góc phải). Phage hoàn tất chu trình khi enzym Lysozym được tạo ra để tiêu hỏa vách tể bào. Tế bào vi khuẩn bị vỡ, 100 đến 200 virion thoát ra và chúng có thể lặp lại chu trình mới. Toàn bộ chu trình từ lúc phage tiểp xúc bề mặt tế bào đến tan diễn ra ứọng khoảng 20 - 30 phút ở 37°c, Trong thời gian đó số lượng phage T4 tăng hơn cả trăm lần, cũng khoảng thòi gian đó số lượng tế bào E.coỉi mọc nhanh nhất cũng chỉ tăng gấp đôi. Nếu nhỏ một hạt T4 lên thảm tế bào E.coỉỉ mọc trên môi trường rắn trong hộp petri thì sau đó xuất hiện vết tan (plaque) do các tế bào vi khuẩn bị phá vỡ. Trên thực tế, có thể đo được các hạt phage ừong dung dịch bằng cách pha loãng dịch rồi ưộn với địch tế bào vi khuẩn và cùng cẩy lên môi tnrờng răn trong hộp petri và sau đó tính số vết tan suy ra mật độ phage.

COS

Hình 20.43. DNA cùa phage lamda dọng thẳng hoặc vòng tròn.

Phage dạng sợi (filamentous phage) như M.Ỉ3 có khả năng xâm nhập vách tế bào và lúc đó enzym cùa tế bào chủ tiêu hủy vỏ protein làm nucleic axit thoát ra. Ở phage ỉamda (Ắ), sự sao chép theta (9) hay sao chép “mắt” xảy ra rất sớm trong chu trình tan làm tăng nhanh các khuôn cho phiên mã và sao chép tiếp, về sau, sao chép vòng tròn xoay đảm bảo các bộ gen để gói vào đầu của phage thế hệ con. Các bộ gen của phage X cũng được cắt ra từ concatemer, nhưng khác với phage T4, sự cắt được thực hiện ở m ộ t trìn h tự c h u y ên b iệt dài 12N g ọ i là đ iểm COS ( từ c h ữ c o h e siv e site - đ iể m cố kết) do

terminaz hay hệ thống Ter (Ter system - nhận biết trình tự đặc hiệu). Sự cắt bởi Ter đòi hỏi hai điểm COS hoặc một điểm COS và đầu mút cô kết tự do (1/2 cos) hiện diện trên phân tử ADN của concatemer. Nhờ trình tự COS ở 2 đầu mút mà ADN bộ gen của phage X có thể ở dạng thẳng hoặc vòng tròn và cỏ thể chuyển đổi qua lại (hình 20.43). Bộ gen của phage X được biến đổi cỏ chiều dài trong khoảng 79-106% của bộ gen phage X bình thường khi bị cát bởi hệ thống Ter và được ráp vào đầu của phage. Đây là tính chẩt quan trọng của phage X được sử dụng trong kĩ thuật tái tổ hợp ADN (chương VII). Cố một sổ cơ chế khác nhau gói ADN vào vô. ở phage T4 cùa E.coỉi, sự sao chép vòng ữòn xoay của mạch ADN kép tạo ra một sợi ADN mạch kép dài gồm một dãy các

386

concatemer nối tiếp nhau. Các concatemer bị cắt ở những điểm không chuyên biệt. Vì khả năng chứa ADN của đầu lớn hơn chiều dài 1 bộ gen của phage, nên mỗi đoạn thẳng được cắt ra thành từng concatemer với trình tự gen khác nhau. Các bộ gen tểi thiểu cùa phags

DNA phage điĩơc chép Ihành phân từ

rổtdài chứa nhiều bộ gen ìểi thiều

ABC DE F$ ÀB CD EF <Ẵ AB CD EF $A BC O ẸỈ !< ị m G Ể B ề $ ề i

A

A

A

A

cầỉ đọan ra các bộ gen lồi thíầi

-y— — .i —

—

■

V --------------------Ạ—-* _

AB C IW ;F < m

1

‘ _ ' I c - R l l f i l l s ...........

I

\

\

Mmmm

j /

ị

f

..

Mỗi bộ gen cắt ra từ concotamer đài hơn một ít, dư thùa ở đầu mứt và đối đầu Hĩnh 20.44. Concatemer bị cẳt thành nhiều bộ gen virut với đù sổ gen hoặc dài hơn một ít, nhưng có thứ tự gen khác nhau vá khi cuộn ỉạì cỏ thể đối đầu.

Các đoạn cuối thường có đoạn lặp ỉại nên được gọi là sự dư thừa cuối (terminal redundance). Vì mỗi đoạn cùa concatemer được cắt ở những điểm khác nhau nên chúng tạo thành các bộ gen có thứ tự không gìổng nhau và có thể tạo vòng tròn đổi đầu (cyclically permuted) (hình 20.44). Sau khi phage tự ráp các cấu phần xong, protein phân hủy gọi là Lyzozym được sản sinh ra làm tan tế bào và giải phỏng các phage con. Phần lổm các phage độc theo chu trình tan vừa nêu ưên. Tuy nhiên, có một sổ ngoại lệ, như phage sợi (filamentous) MI 3 của E.coli hầu như không bao giờ làm chết hoặc làm tan tế bào. Các tế bào vi khuẩn chủ và các phage kí sinh có sự đồng tiến hóa (coevolution). Các tế bào vi khuẩn có các cờ chế bảo vệ như biến đổi màng tế bào để phage không bám vào được hoặc các enzym restriction endonucleaz cắt cảc ADN của phage. Phage cũng biến đổi để xâm nhập được vào tế bào vi khuẩn. Có trường hợp cả hai cùng tồn tại trong chu trình tiềm tan. Phage độc phá vỡ tế bào vi khuẩn chù, nên có thể dùng chúng ừị bệnh do vi khuẩn gây ra. Khả năng này được chứng minh rất sớm, nhưng chưa được ứng dụng do sự gia tăng thuốc kháng sinh. Nhưng hiện nay do sự gia tăng các vi khuẩn lờn thuốc kháng sinh, nó được quan tâm trờ lại.

387

DNA của phage

Ngẫu nhièn prophage bị cđí rời khỏi nkiễm sđc thể vi khuẩn

Phage bám rào tế bầo chủ fCS í/à bơm DNA

Chừi tế bào nhiều, lần

Làm tan tể bào chả và thoát ra

Phage tạo DNA tròn rà lại vào chu trình ừm kayy uem tiềm m tan \

DNA uà protein mái cảa phage được tổng hợp và ráp thành virrn

sinh sản bình thường Prophage

f

X Ễ )/ DNA của phage gắn vào DNA vỉ khuẩn và th m h prophage

Hình 20.45. Chu trình ta n và tiềm tan ởphage Ắ 20.7.2.2. Chu trình tiềm tan (Lysogetĩic cycle) Trong chu trình tiềm tan, phage không làm chết tế bào chủ, mà bộ gen virut gắn vào bộ gen tế bào chủ và cùng tồn tại nhiều thế hệ. Vi khuẩn bị phage xâm nhiễm mà không tan gọi là vi khuẩn tiềm tan (lysogenic bacteria). Các virut có thể sinh sản mà không làm chết tế bào chủ được gọi là phage ôn hòa (temperat virut). Vi khuân tiềm tan chứa phân tử ADN của phage không làm tan, gọi là prophage, chèn vào nhiễm sắc thể của nó. Vi khuẩn tiềm tan này có khả năng “miễn dịch ” chống sự xâm nhiễm của phage mới từ ngoài, tuy cơ chế này không đồng nghĩa với miễn địch tế bào. Trong một số điều kiện, prophage cùng được sao chép theo chu trinh sinh sản bình thường của vi khuẩn chủ mà không gây hại cho vi khuẩn. Một sổ điều kiện khác sẽ hoạt hóa prophage, làm nó khởi sự chu trình tan dẫn đến phóng thích số lớn phage tự do. Chi tiết chu trinh tan và tiềm tan được nghiên cứu ở phage X (hình 20.45).

Có hai kiểu chu trình tiềm tan. Trong kiểu chung cho đa số như phage X,, ADN cùa phage gắn vào nhiễm sắc thể tế bào chủ. ở kiểu khác mà đại diện là phage Pi, ADN của phage không gán vào nhiễm sắc thể tế bào chủ, mà bằng cách nào đó sao chép đồng thời như plasmid. Cả hai dạng đều được gọi chung là prophage. Khỏi sự

Hình 20.46: Chu trình tan và tiềm tan ở phage X.. Chu trình sổng bắt đầu khi phage gắn vào bề mặt tế bào E xoỉi và bơm ADN vào trong gây nhiễm. ADN của phage sau khi được bơm vào tế bào tạo vòng tròn và sẽ tham gia vào một ừong 2 chu trình. ADN của phage có thể hoặc tham gia vào chu trình tiềm tan cùa phage T4 hoặc gắn vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn nhờ tái tổ hợp ở điềm chuyên biệt (specific site) để bước vào chu trình tiềm tan. Ở prophage phần lớn các gen không có hoạt tính. Tuy nhiên có ít nhất 1 gen của prophage luôn hoạt động: gen cỉ mã hóa cho protein kìm hãm (repressor protein) giữ cho phần lớn các gen của phage im lặng. Trong quá trình sinh sản của tế bào, ADN của prophage cũng được sao chép vả chia đều về các tế bào con như ADN của tế bào. Một tế bào bị nhiễm có thể nhanh chỏng sinh ra nhiều tế bào vi khuẩn chứa prophage. Quá trình gắn ADN của phage thực hiện qua 4 bước: - ADN mạch thẳng được bơm vào tế bào; ADN cùa phage ở dạng vòng ứòn nhờ sự bẳt cặp các đoạn đuôỉ dư thừa. - Một sổ gen sớm của phage phiên mã và tổng hợp một số phân tử protein ức chế (repressor) và enzym integraz (enzym xúc tác việc gắn vào bộ gen tế bào chủ). Repressor ức chể sự phiên mã các gen của phage. - ADN cùa phage thường được gắn vào ở điểm chuyên biệt trên nhiễm sắc thể thành prophage nhở enzym integraz.

389

-

Vi khuẩn sống và sinh sàn; prophage đuợc sao chép cùng với nhiễm sác thể của tế

bào chủ. Đôi khi prophage có thể tách khỏi ADN của vi khuẩn một cách ngẫu nhiên hoặc có thể tách khỏi do tác động của các nhân tố môi trường như phóng xạ hay hóa chất. Quá trình tách diễn ra ngược lại với gán vào. Prophage được tách rời ra độc lập ừ ở thành phage tự do và bắt đầu chu trình tan. Neu vi khuẩn tiềm tan bị tác động phả hủy ADN , prophage sẽ có lợi nểu tách khỏi nhiễm sắc thể, chuyển sang chu trình tan tạo ra các phage mói thoát khỏi tế bào. Khi ADN của vi khuẩn bị thương tổn, proteaz (recA protein) của hệ thống sửa sai SOS được hoạt hóa. ADN của prophage bị ức chế, excisionaz (enzym cắt rời) được tổng hợp và prophage tách khỏi nhiễm sắc thể. Quá trình đó được gọi là cảm ứng của prophage (prophage induction). Nêu tia u v phá hủy ADN của tế bào chủ làm cảm ứng prophage thì được gọi là cảm ứng do u v . Khi tế bào vi khuẩn F" không tiềm tan giao họp với tế bào Hfr tiềm tan, tế bào nhận bị chết do chu trình tan của phage. Dạng cảm ứng phage này được gọi là cảm ứng hợp tử (zygotic induction). Vì tế bào chủ mang prophage ừên nhiễm sắc thể của mình sẽ có khả năng bị tan nếu prophage tách ra nên được gọi tể bào tiềm tan. Đôi khi một ít gen của prophage biểu hiện ở tế bào tiềm tan gây biến đổi kiểu hình ở vi khuẩn, quá trình được gọi là chuyển hỏa tiềm tan (lysogenic conversion). Một số prophage có thể tạo độc tố. 20.7.2.3. Kiểm soát sự phiên mã ở phage Các virut có chiến ỉược điều hòa sự phiên mã rất phức tạp, mà ở đây chỉ nêu tóm tát cơ chế đó. Bacteriophage X là phage trung hòa (temperat), có nghĩa là nó có thể đi vào chu trình tan hoặc tiềm tan. Khi tế bào chủ tăng trưởng trên môi trường giàu, prophage vẫn duy trì tính tiềm tan (lysogenic); nhưng khi tế bào chủ suy yếu, prophage trở thành sinh tan (lytic). Ở đây có một ‘công tắc di truyền’ (“gentic switch”) xác định hành vi của prophage. Có 2 protein điều hòa, cl and Cro, cạnh tranh nhau ở 2 vị trí operator/promoter ưên ADN của phage. Một operator kiểm soát hoạt tính các gen sinh tan; cái kia thuộc chu trình tiềm tan. Hai protein điều hòa này có tác động ngược nhau trên 2 operator, cl ức chế operator/promoter sinh tan và hoạt hóa operator/promoter tiềm tan. Cro hoạt hóa operator/promoter sinh tan và ức chế operator/promoter tiềm tan. Các nồng độ tương đối của cl và Cro xác định đầu ra (hình 20.47).

390

Lysis genes

cm gene

I \e p r « s s e s

-rtcu v attis

Activates

Represses

prom oter Operator

Hình 20.47. Cơ chểđiều hòa ởphage lamda: Protein Cro hoạt hóa sinh tan, ức chế tiềm tan; protein cỉ hoạt hóa tiềm tan, ức chế sinh tan.(Lytic gens: các gen tan; Lysogeny gerts: các gert tiềm tan). Khi ADN của phage đi vào tế bào kí chù mới, con đường sinh tan và tiềm tan bắt đầu với cùng một cách. Cả hai con đường này đều cần cho sự biểu hiện của những gen rất sớm và những gen sớm. Nhưng sau đó chúng tách ra: theo con đường sinh tan nếu những gen muộn được biểu hiện, hiện tuợng tiềm tan xảy ra nếu cỏ sự tổng hợp chất kiềm hãm Lambda chi có hai gen rất sớm được phiên mã độc lập nhờ ARN polymeaz của kí chủ: - Gen N mã hóa cho một nhân tố chổng kết thúc và hoạt động của nhân tố này tại những vị trí nút cho phép sự phiên mã tiến hành trong những gen sớm. - Gen cro cỏ hai chức năng: làm ngăn cản sự tổng hợp các chất kiềm hăm (hoạt động chủ yếu nếu chu trình sinh tan được tiến hành) và làm tắt sự biểu hiện của những gen rất sớm (những gen không cần về sau trong chu trình sinh tan). Các gen sớm gồm 2 gen sao chép (cần cho sự gây nhiễm sinh tan), 7 gen tái tổ hợp (một vài gen liên quan đển sự tái tồ hợp trong suốt quá ừình gây nhiễm sinh tan, 2 gen cần thiết cho việc gắn ADN của phage lambda vào nhiễm sắc thể vi khuẩn ừong hiện tượng tiềm tan) và 3 gen điều hòa. Vì thế những gen sớm đáp ứng hai vấn đề quan trọng: một số gen cần cho phage đi vào hiện tượng tiềm tan, những gen còn lại liên quan tới những kiểm soát khác của chu trình sinh tan.

391

Trạng thái tự nhiên của chuỗi kiểm soát này giải thích những nét đặc tnmg sinh học cùa sự tồn tại thế tiềm tan. Hiện tượng tiềm tan được ổn định YÌ chuỗi kiểm soát đảm bảo khi mức chất kìm hãm thích hợp, có sự biểu hiện liên tục của gen cl. Kết quà là Ol (Operator left - ừái) và O r (Operator right - phải) vẫn còn bị chiếm giữ vô thòi hạn. Bằng cách biểu hiện toàn bộ chu trình sinh tan hoạt động này duy trì prophage ở dạng không hoạt động. Những vùng kiểm soát phiên mã cung cấp một điểm áp lực, tại điểm này việc đi vào chu trình toàn vẹn có thể được kiểm soát. Bằng cách không cho ARN polymeaz đến gần những promoter này, một protein kìm hãm ngân cản bộ gen của phage đi vào chu trình sinh tan.. Protein kìm hãm được mã hóa bởi gen cỉ. Đột biển ở gen này không thể duy trì hiện tượng tiềm tan nhưng nó luôn luôn đi vào chu trình sinh tan. Tiến hành tách sơ khởi các protein kìm hãm, mô tả đặc điểm, người ta đã biết tại sao protein kìm hãm có thể duy trì cả trạng thái tiềm tan và tạo khả năng miễn dịch cho thể tiềm tan kháng lại sự bội nhiễm bởi những bộ gen của phage lambda mới. Lambda có sự lựa chọn giữa hai cách: hoặc đi vào hiện tượng tiềm tan hoặc bắt đầu sự lây nhiễm sinh tan. Hiện tượng tiềm tan được bắt đầu bằng sự hình thành chuỗi duy trì tự sinh làm ngăn cản toàn bộ chu trình sinh tan (lytic cascade) qua việc sử dụng áp lực tại hai điểm. Chương trình cho sự hình thành hiện tượng tiềm tan tiến hành qua một vài sự kiện tương tự nhau mà những sự kiện nảy cần cho chu trình sinh tan (lytic cascade) (sự biểu hiện của gen sớm qua sự biểu hiện của N là cần thiết). Làm thế nào để phage đi vào chu trình sinh tan? Gen cro có vai trò quan trọng ảnh hưởng lên chu trình sinh tan (gen cro mã hóa cho một chất kìm hãm khác). Gen cro chịu trách nhiệm ngăn cản sự tổng hợp protein kìm hãm, hoạt động này làm ngừng khả năng hình thành hiện tượng tiềm tan. Những đột biến cro thường hình thành hiện tượng tiềm tan hơn là đi vào còn đường sinh tan. Cro có dạng một dimer nhỏ hoạt động trong vùng miễn dịch. Cro có hai tác dụng là ngăn cản sự tổng hợp chất kìm hãm và giảm bớt sự biểu hiện của những gen sớm. 20.7.2.4. Tái tổ hợp ởphage Các phage tuy có kích thước nhỏ bé phải nhìn dưới kính hiển vi điện tử mới thấy được. Nhưng các tính ữạng của phage được quan sát đựa theo các vết tan (Plaque) hoặc biên độ chù. vết tan (Plaque) là vùng tan hay sự ức ché tế bào gây ra bởi sự nhiễm virut của các té bào nhạy cảm. Phage T2 có dòng hoang dại r + tạo vết tan bình thường, còn dòng đột biến r (rapid hoặc ký hiệu r~) làm tan nhanh nên vết tan to.

392

Lai . T2 h+r X T2 hr+ ị T2h r\ T2h+r T2h+r+, T2hr Thế hệ phage con: Cảc dạng cha mẹ trr*

Các dạng tái tổ hợp l í t lỉtrte

ff*r

DNrtl bố mẹ /N v

X Hình 20.48. Sự nhiễm kẻp hai phage.

*ĐNA tải tổ hợp

£

Hình 20.49, cờ chế tái tổ hợp gert.

về

biên độ chủ có dòng hoang dại h+ (host) chỉ làm tan vi khuẩn E.coli dòng B nhưng không làm tan dòng B2, đột biến h (hoặc ký hiệu /f) làm tan các vi khuẩn E.coỉi cả 2 đòng B và B2. Dòng phage T2 h*r làm tan cả B và B2 với vết tan nhỏ được lai với dòng Tỉ hr * làm tan chi B nhưng vết tan to. Sự nhiễm phage (hình 20.48), cơ chế trao đổi các đọan ADN (hình 20.49) và sự biểu hiện các vết tan thể hiện trên hình 20.50.

Hình 20.50. Các vết tan thể hiện tải tố hợp ở bacteriophage. Sự xuất hiện các dạng tái tổ hợp ĩ 2 /ỉ V và T2hr chứng tỏ 2 đòng phage T2 đã lai với nhau. Tải tổ hợp ở virut có các đặc điểm:

- Trong quá trình lai ở virut có sự tham gia của cả bộ gett như Eukaryota chứ không tùng phần như ở vi khuẩn. - Quá trình tái tổ hợp có tính quần thể. ADN của 2 dòng phage xâm nhập vào tế bào vi khuẩn, chúng sao chép ra hàng trăm bản sao và giữa hàng trăm ADN bộ gen của phage đã xày ra tái tổ hợp. Do điều này, ở phage thường thấy hiện tượng nhiễu âm (negative interference) trong tái tổ hợp: tần số tái tổ hợp đôi giữa 2 locus đáng lẽ phải giảm thì lại tăng cao hơn mức bình thường. 20.7.2.5> Locus rlĩcủ a p h a g e Tí, Các nghiên cửu chi tiết về các đột biến r ll của Phage T4 làm sáng tò hơn về cấu trúc gen. Phage T4 ở dạng hoang dại r+ có khả năng nhiễm đồng thời hai nòi E. coỉì B và K. Các đột biến rĩỉ chỉ nhiễm nòi B nhưng không nhiễm nòi K. S.Benzer (1955) đã nhận được vài nghìn đột bỉển rỉỉ có nguồn gốc độc lập với nhau. Ông đã cho lai các đột biến với nhau và cân cử vào sự xuất hiện các dạng tái tổ hợp hoang dại r+ mà lập bản đồ các điểm đột biến (mutation sites) (hình 20.51). Mỗí hộp thả hiện 6ự xuất hiện ngẫu nhiên của cảc đột biến tại vị trí đố

II \\ \' AJU\\ A \ll\ A II111 KVtII AVI: A W

M í A*

A W

7

ftlirt

I

f

I .X T

i M

Ị IK,

Nhĩều đột biển xuất hiộn ò 1 * một đỉẻm tặõ thành mội èi#điồm nỗng"

Hình 20.5ỉ Bản đồ các đột biển ở locus rll (Các hình tam giác đậm ỉà các “điểm n ó n g hot spot).

Trước thí nghiệm của ông, rỉl được coi là một locus. Thí nghiệm cho thấy các đột biến xếp thành hai nhóm rlỉA và rỉIB. Lai các đột biến rlỉA X rỉIB sẽ có r+, nhưng lai rlỉA X rỉỉẦ và rlIB X rlỉB thì kiểu hỉnh đột biến r. Kết quà thí nghiệm cho thấy, gen có thể phân chia nhỏ về mặt đột biển. Các đoạn rlIA và rlIB đ ư ợ c gọi là CIStro n , đơ n v ị chứ c n à n g nhỏ n h ấ t đ ảm b ảo k h ả n ă n g x âm rihập

nòi K. Thuật ngữ cistron thực chất ỉà gen, ngày nay nó chỉ có tính chất lịch sử, ít được dùng. Theo quan niệm hiện nay, rỉIA và rlỉB là hai locus. Hai khái niệm mới được nêu ra là muton - đom vị đột biến và recon - đơn vị tái tổ hợp, Đoạn gen nghiên cứu tỉm thấy có 2000 điểm đột biến, chúng phân bố không đều nhau, có những điểm “nóng” (hot spot) tập trung nhiều đột biến hơn (hình 20.51). 20.7.3. Các vỉrut Eukaryota 20.7.3.1.

Các virut thực vật

Các virut thực vật là một tai họa lớn cho trồng trọt vì nó làm giảm đáng kể năng suất cây trồng. Các virut thực vật có thể được truyền theo 2 đường: - Theo chiều ngang (Horizontal transmission) là sự lây truyền từ cây này sang cây khác. - Theo chiều đọc (Vertical transmission) qua đường sinh sản các virut từ cây mẹ đến thế hệ con. Đê xâm nhiễm tế bào thực vật, virut phải xâm nhập vách tế bào và màng sinh chất cùa thực vật. Các côn trùng có thể ỉà tác nhân truyền virut, khi chúng phá vỡ vách tế bào thực vật và đưa virut vào. Một cách lây nhiễm virut khác là sự tiếp xúc giữa mô bị thượng tổn cùa cây bị nhiễm với cây không nhiễm. Sự truyền theo chịều dọc có thể thông qua sinh sản vô tính hay hữu tính. Khi đã vào trong tế bào thực vật, các virut cỏ thể phát tán bằng cách di chuyển theo cầu chất liên bào (plasmodesmata), các chỗ nối tế bào chất giữa các tể bào. Các virut gắn vód các prqtein đặc hiệu giúp chúng bằng cách nào đó đi xuyên qua các lồ hẹp của plasmodesmata. a) Các vìrutA RN

Phần ỉớn các virut thực vật phát hiện cho đến nay, đa số có bộ gẹn ARN mạch đơn kiểu (+) và nhiều dạng cỏ capsỉd hình que, kể cả virut đốm thuốc lá (hỉnh 20.36 phía trên). Các protein capxomr xếp hình xoắn. b) Các virut ADN Các virut thực vật có bộ gen là ADN rất hiểm và chỉ gồm 2 nhóm:

395

- Nhóm thứ nhất là các cauliflower mosaic virut. Chúng có bộ gen là ADN mạch kép nằm trong vỏ (capsule) đa diện (polyhedral). - Nhóm thứ hai là các geminivirut (gemini có nghĩa sinh đôĩ). Chúng có đặc tính là các capsid dính thành đôi, mỗi cái chứa một phân tò ADN mạch đơn vòng tròn với khoảng 2500 nucleotit. Các bộ gen bắt cặp cỏ thể tưcmg tự nhau ở một số virut và khác nhau đáng kể ở sổ khác. c) Các viroid Các vìroìd là một nhỏm tác nhân gây bệnh ở thực vật, có kích thước nhỏ và cấu trúc đơn giản như virut. Chúng là những ARN mạch đơn, trần, nhỏ bé có chiều dài chi vài trăm (240 - 350) nucleotit. Có sự bắt cặp mạnh giữa các bên ừong phân từ ARN tạo cấu trúc kép. Các viroid không được bao trong vỏ protein, không gán vào bộ gen tế bào chủ vả sao chép không qua trung gian ADN. Một số tế bào thực vật có enzym sao chép ARN. Các phân tử ARN của viroid bằng cách nào đó ngăn trở trao đổi chất của tế bào và làm ngừng tăng trưởng của cà thực vật. Một bệnh viroid khác làm hại đáng kể đến sản xuất hoa cúc ở Mĩ. Các viroid cũng tác hại đến khoai tây và cà chua. Gần đây phát hiện rằng trình tự nucleotit của viroid giống với trình tự của intron của các gen Eukaryota. Người ta cho rằng có lẽ các viroid bằng cách nào đó tác động lên các hệ thống điều hòa kiểm soát các gen của tế bào. 20.7.3.2. Các virut động vệt Chính xác các virut động vật thể hiện đầy đủ sự đa dạng của các bộ gen ở virut. Một số virut động chứa ADN, và một sổ ARN, mạch đơn hay kép nhưng bộ gen của chúng rất nhỏ bé. Các virut động vật gây nhiều bệnh ở động vật và người, một số virut liên quan đến cả các bệnh ung thư, AIDS... Arbovirut xâm nhiễm cả côn trùng và động vật có xương. Các virut truyền từ các loài chân khớp (arthropod), vector trung gian, đến động vật cỏ xuomg (vertebrat) qua vết đốt của côn trùng. Các virut động vật xâm nhập thế bào theo 3 con đường khác nhau: - Sự nội nhập bào (Endocytosis) của virion trần. - Sự nội nhập bào (Endocytosis) của virut có màng bao (a membrane-encazd virut). - Sự dung hợp (Fusion) virut có màng bao với màng tế bào. a) Các nhóm viruí động vật Sự đa dạng rất lớn của các virut động vật thể hiện ở 15 - 20 họ khác nhau, căn cứ theo các đặc tính như: kiểu và cấu trúc của nucleic axit, hình thái virion và cách xác định thể kháng nguyên chung. Do sự phụ thuộc của các bộ gen virut vào mARN của chúng, các virut động vật được chia thành 7 nhổm.

396

b) Các chu trình sao chép của virut động vật Các chu trình sao chép của virut động vật có nhiều điểm tương tự với các virut khác với nhiều biến dạng đáng kể. Ví dụ trường hợp của cúm (influenza virut) hay của Paramyxovirut gồm các virut gây bệnh sởi vả quai bị. Các virut cúm và Paramyxovirut có bộ gen 1à A R N một mạch được gỏi trong capsid xoắn dẻo. Phía bên ngoải capsid có màng bao là tính chất chung của nhiều nhóm virut động vật vả phage (hình 20.52).

Mảng bao gỉycoproteỉn ■Lơ'p ìịpidđôt bĩucìeocapsỉd "RNA virus

Hình 20.52. Vỉrutcủm, Bao màng giúp virut xâm nhập tế bào chủ. Khi virut tiếp xúc với tế bào, các glycoprotein thòi ra ở màng bao gắn vào các thụ thể (receptor) ừên màng sinh chất (hình 20.52). Quá trình này chuyển capsỉđ có chứa ARN vào tế bào chất và ở đỏ capsid bị mất (bóc vỏ), Các enzym của virut tham gia sao chép ARN của bộ gen và tạo mARN, nhưng bộ máy của tế bào được sử dụng để tổng hợp protein của virut. Các capsid mới được láp ráp bao các bộ gen của virut và chúng đội màng sinh chất của tế bào mọc chồi rồi thoát ra khỏi tế bào. Bằng cách này các capsìd có màng bao chính là màng sinh chất của tế bào chủ cũ và các virion mới có thể sử dụng các bao màng này để hòa nhập với màng của tế bào chủ mới. Toàn bộ chu trình này được gọi là chu trình sinh sản (reproductive cycle), chứ không phải chu trình tan vì các virut cỏ thể thoát ra bằng mọc chồi mà không phải phá vỡ tế bào chù. Đáng chú ý là chu trình sinh sản của các virut loại này diễn ra ở tế bào chất của tế bào và không tác động đến nhân tế bào. Không phải tất cả các màng của virut đều bắt nguồn từ màng sinh chất. Ví dụ, bao màng cùa herpesvirut từ màng nhân của tế bào chủ. Các bộ gen của herpesvirut là ADN mạch kép , chúng sinh sản bên ừong nhân tế bào, sử đụng phối hợp cả enzym của virut và tế bào để sao chép ADN và phiên mã. Khi ờ trong nhân của tế bào, ADN của herpesvirut (tiền virut) tương tự prophage ở vi khuẩn. Provirut ờ dạng tiềm ẩn có thể'gây một số triệu chửng bệnh ở người. Đôi khi các stress vật lí (như tác động ánh sáng mặt trời mạnh) hay tình cảm có thể làm cho provirut herpes bắt đầu chu trình sinh sản tạo các triệu chứng khỏ chịu cho con người.

397

Hình 20.53. Chu trình sinh sản cùa virut cúm (Influenza virut).

c) Các retrovirut Các nhà khoa học đã nhận thấy rằng một số virut có thề gây ung thư ở động vật và cả ở người. Các virut gây ung thư gồm: retrovirut, papovavirut, ađenovirut và nhóm herpesvirut. Có lẽ các virut gây ung thư quan trọng nhất là retrovirut, các virut có bộ gen ẢRN sinh sản qua trung gian ADN. Retrovirat HTLV-I gây bệnh bạch cầu tế bào T (T-cell leucemia) và retrovirut Hrv gây bệnh AIDS lầm suy yếu hệ thống miễn dịch (hỉnh 20.54).Nói chung, retrovirut liên quan đến những bệnh nguy hiểm, khó chữa trị nhất hiện nay của nhân loại, kế cả ung thư. Tất cả các virut biến đổi tế bào qua việc gắn nucleic axtí của virut vào ADN của tể bào chù. Sự gắn này được ổn định (các provirut không bao giờ bị cắt rời ra như prophage). Đối với các virut gây bệnh ung thư là ADN, sự gắn vào là quá trinh trực tiếp. Các retrovirut thì khác, trước hết chúng sừ dụng reverse transcriptaz để từ khuôn ARN tạo ra ADN. Sau đỏ ADN của virut có thể được gán vào ADN bộ gen của tế bào chủ và chúng cũng sao chép vớỉ bộ gen này ừong mỗi thế hệ.

398

C á c g a i lip o p r o te in c ù a m à n g b a o

Bộgsngộm 2SỢ ÌENA mạch đcn Reverse

transcriptase

Hình 20.54. cẩu trúc của viruí HIV (retrovirut). Hình 20.55 mô tả và giải thích chu trinh sinh sản reừovirut trong tế bào. Hiện nay, nhiều người cho ràng các virut có thể tác động đến sự biểu hiện của các gen ung thư. Thường các virut gây ung thư phối hợp với những tác nhân khác ừong gây bệnh. Thụ thấ CD 4 73 bào chủ động vật có vú

ỊữỉAvtnu đ tỊỈ^^mạch i
EN A chù trong nhăn tể bào

& M âcho ra protein

RNA dừng tạo bộ gạn

Virus con m ởi tạo ra

H ình 20.55. C hu trình sinh sàn của reírovinứ H ĨV gãy bệnh AIDS. 399

v ề nguồn gốc của các virut thì nhiều người cho ràng chúng bắt nguồn từ các đoạn nucleic axit được gói lại một cách chuyên biệt. Một số virut ở Eukaryota giống về cấu trúc và chức năng so với một số gen của tế bào chủ hon virut của vi khuẩn. Bộ gen của một số virut giống các phân tử di truyền của tế bào như plasmid hay ừansposon.

20.7.4. Các Prion Hai bệnh thoái hóa não ở người là bệnh kuru và Creutzfeldt-Jacob (bệnh tương tự ở cừu) có thể gây nên do các phàn tử protein gây nhiễm được gọi là prỉon (proteinaceous infectious particle). Cho đến nay, sự hiểu biết về chúng còn rất ít. Gần đây, khi xuất hiện dịch bò điên ở Anh, chúng được nhắc tới nhiều vì không phát hiện thấy các virut. 20.7.4,1.

Lược sử

Vào những năm 1960, T. Alper và J.s. Griffith nêu giả thuyết rằng một số bệnh não nhũn (spongiform encephalopathies) lây truyền do các tác nhân gây nhiễm chỉ gồm các protein. Thuyết này giải thích việc phát hiện tác nhân bí ẩn gây bệnh gãi và CreutzfeldtJakob (scrapie and Creutzfeldt-Jakob diseazs) đề kháng tia tử ngoại u v . Francis Crick, người đã nêu “Học thuyết trung tâm” ("Cenừal dogma of molecular biology") đặc biệt quan tâm đến giả thuyết của Griffith vì nỏ mâu thuẫn với học thuyết của ông. Vào năm 1982, S.B. Prusiner (Đại học California) thông báo đã tinh sạch tác nhân gây bệnh giả định và nỏ chỉ gồm protein đặc hiệu. Prusiner dùng thuật ngữ prỉon chỉ tác nhân gây bệnh, là sự kết hợp 2 chữ đầu của các từ proteinaceous (phần tử protein) và infectious {gây nhiễm), còn đuôi -on thì tương tự virion. Protein đặc hiệu mà prion tạo ra gọi là PrP (viết tát của cụm từ "proteaz resistant protein" - protein kháng proteaz). Prusiner đã nhận giải Nobel Sinh lý hay Y học (Nobel Prize in Physiology or Medicine) vào năm 1997 đo công trình nghiên cứu các prion. 20.7.4.2►Cấu trác S ự tồn tại cảc đằng dạng (Isoform). Protein mà các prion tạo ra được thấy ở khăp cơ thể, thậm chí ở cả người và động vật khỏe mạnh. Tuy nhiên, protein của prion ừong vật liệu nhiễm có đặc tính gỏi cuộn khác (different folding pattern) và kháng với proteaz, enzym mà trong cơ thể có thể phân hủy các protein một cách bình thường. Dạng protein bình thường gọi là PrPc, dạng gây nhiễm là PrP& ( c bắt nguồn từ chữ 'cellular1(của tế bào) hay gọi chung (’common') là PrP, còn Sc từ chữ fs crapie\ là bệnh prion ở cừu. Trong khi PrP0 được xác định cấu trủc tốt (structurally well-defined), thi PrP* phân tán rộng và khỏ xác định. PrP có thể được gây cảm ứng gấp cuộn (induced to fold) thành các isoform

400

xác định tốt (well-defined isoforms) in vitro, và mối quan hệ với dạng gây bệnh (pathogenic) in vivo còn chưa rõ. - PrP0: PrPc là protein bình thường- ừên màng tế bào. N6 có 209 axit amin s (ở người), một cầu đisulííte, 35-36kDa và chù yếu là cấu trúc xoắn alpha. PrPc dễ dàng bị phân hủy bởi proteinaz K và có thể phỏng thích khỏi bề mặt tế bào in vitro bởi enzym photphoinositit photpholipaz c (PI-PLC). - PrPSo: Dạng đồng hình gây nhiễm (infectious isoform) của PrPc là PrPSo có khả năng chuyển đổi PrPc protein bình thưởng thành isoform gây nhiễm bằng cách thay đổi cấu hình (conformation) của nó. Mặc đù cấu trúc 3 chiều (3D structure) của PrPSc chưa biết, ở đây cỏ sự gia tăng lượng phiến beta ((3-sheet content) ở dạng đã nhiễm bệnh của phân tử thay thể các vùng bình thường của xoắn alpha (a-helix). Các tổ hợp (aggregations) của những isoform bất thường đó có thể hình thành các sợi có cấu trúc giàu amyloid (highly structured amyloid fibers). Phần cuối của sợi tác động như là khuôn cho các phân tử protein tự do, nó làm cho sợi mọc ra. Có những khác bỉệt nhỏ trong trình tự axit amin của vùng hình thành prion (prion-forming regions) dẫn đến những tính chất cấu trúc khác biệt trên bề mặt cùa các sợi prion. Do vậy, chỉ các phân tử protein tự do tương tự trong trình tự axit amin với protein prion có thể được tham gia vào sợi đang mọc ra (growing fiber). 20.7.4.3. Chức năng Hiện nay đã chứng minh được ràng vai trò tế bào bình thưòng của các protein prion lả chất oxy hỏa (antioxitant) phụ thuộc Cu.

PrP và ghi nhớ đài hạng (long-term memory), c ỏ chứng minh cho thấy PrP cỏ thể cỏ chức năng bình thường khi duy trì sự ghi nhở dài hạng . Đã cho thấy chuột thiếu các gen cho protein PrP bình thường của tế bào đa có hippocampal LTP biến đổi. - PrP và sự tái sinh tể bào gốc (stem cell renewal). Bài báo năm 2006 cho tháy rằng sự biểu hiện PrP ở tể bào gốc ỉà cần thiết cho sự tự tải sinh tủy xương của sinh vật (organism's self-renewal o f bon marrow). Công trình này cũng chi ra rằng tát cả các tể bào gốc tạo mảu đài hạng (all long-term hematopoietic stem cells) biểu hiện PrP trên bề một tể bào của chúng vờ các mô tạo mảu (hematopoietic tissues) với các tể bào gốc không PrP (PrP-nuỉỉ stem cells) thể hiện sự nhạy cảm gia tăng đổi với sự suy kiệt tể bào. i

20.7.4.4. Bệnh Prion Tất cả các bệnh theo giả thuyết do prỉon đều tác động lên cấu trúc của não hay các mô thần kinh khác và cho đến nay tất cả bệnh đều không chữa trị được và luôn gây chết. Nói chung, priori có thể liên quan cả hai là đơn vị nhiễm bệnh lý thuyết (theoretical unit of

401

infection) hay protein đặc hiệu (ví dụ, PrP) biến thành tác nhân gâynhiễm (infective agent), dù có hay không ở trạng thái nhiễm bệnh (infective stat). Các prion được già định là gây nhiễm và phát tán bằng cách tái gấp cuộn (refolding) bất thường thành cấu trúc cỏ khả năng chuyển đổi (convert) các phân tử bình thường (normal molecules) của protein thành dạng cấu trúc bất thường. Tất cả các prion biết được gây ra sự hình thành gấp cuộn amyloid (amyloid fold), mà trong đó protein polyme hóa thành phức hợp (aggregate) gồm các phiến beta (beta sheets) gói chặt nhau, cấu trúc biến dạng này rất ổn định và tích lũy trong mô nhiễm làm phá hủy và gây chết tế bào. Sự ổn định đó có nghĩa là các prion đề kháng các tác nhân vật lý và hóa học gáy biển tinh (denaturation) làm cho việc loại bỏ và ngăn chặn các phần tử này rất khó khăn. Các protein của prion (PrP) rất giống nhau ở tất cà các động vật có vú. Do những khảc nhau nhỏ này toong PrP giữa các loài khác nhau, nên bệnh do prion được truyền từ loài này sang loài khác một cách không bình thường. Tuy nhiên, bệnh prion ở người biển dạng bệnh Creutzfeldt-Jakob được cho rằng gây nên bời prion gây nhiễm điển hình ờ bò và được truyền qua thịt bị nhiễm (infected meat). Ngoài những bệnh đã kể ừên, còn một số bệnh khác ở động vật và người do prion. Mặc dù đõ xác định và biết rõ các tính chất chung của prion, nhưngcơ chế của sự gây nhiễm và phát tản prion vẫn còn trong bí ẩn. 20.7.4.5. Các giả thuyết về prỉon Cho đến nay có nhiều bàn cãi về bản chất của prion. Các giả thuyết chủ yếu được tóm tắt như sau: - Giả thuyết chỉ protein (Protein-only hypothesis). Theo giả thuyết này, protein có thể sao chép không đùng nucleic axit. - Già thuyết đa cẩu phần (Muiti-component hypothesis): các prion gây nhiễm có thể gồm nhiều cấu phần của tế bào chủ như PrP, Iipit, và các phân tử polyanionic, hơn là chỉ có PrPSc. - Giả thuyết virut (Viral hypothesis): tháng 1/2007 đã công bố bài báo cho thấy 10% hoặc ít hơn các tể bào nuôi cấy bị nhiễm prion cỏ virut và cho rằng bệnh do phần tử thông tin có khả năng sao chép (a replicable informational molecule) tương tự nucleic axit gắn vào PrP. “ Giả thuyết nhiễm độc kim loại nặng (Heavy metal poisoning hypothesis): số lượng bât thường của đồng (Cu) và manganese (Mn) trong môi trưởng và thức ăn chăn ttuôi có thể gây ra bệnh.

402

20.7.4.6. Dì truyền học (Gentics) Nhiều vấn đề còn chưa sáng tỏ. Gen cho protein bình thường đã được phân lập: PRNP gen. Một số bệnh prion có thể được di truyền và trong mọi trường họp liên quan đến các đột biến ở gen PRNP này. Nhiều đột biến khác nhau của PRNP đã được xác định và cho rằng các đột biến bằng cách nào đó làm cho PrPc ngẫu biến (spontaneously change) thành dạng PrPSc bẩt thường. 20.7.4.7. Các prion ở nấm men và nấm khác Protein của prion đã được phát hiện ở nấm men Saccharomyces cerevisiae từ đầu những năm 1990. Sau đó, prion cũng đựợc tìm thấy ở Podospora anserina. Các phát hiện protein có biểu hiện kiểu prỉon (prion-typ behavior) này ở một số nấm (fungi) có ý nghĩa hết sức quan trọng giúp cho sự hiểu biết về các prion ở động vật cỏ vú. Tuy nhiên, các prion nấm không gây bệnh trong tế bào chủ và thậm chí còn có ưu thế tiến hóa (evolutionary advantage) thông qua dạng di truyền dựa vào protein (form of protein-bazơd inheritance). Sinh học hiện đại đã phát hiện hai dạng có biểu hỉện sống đặc biệt: viroiđ có nucleic axit, không có protein vàprion có protein, không có nucleic axit. 20.8. DI TRUYỀN HỌC VI NÁM VÀ V ITẲ O Các vi sinh vật nhân thực Eukaryota như vi nấm, vi tảo có chu trình sống đa dạng và ở nhiều điểm giống với các Eukaryota bậc caó. cấu tạo đơn bào giúp cho việc sử dụng có hiệu quả các phương pháp phân tích di truyền ở vi sinh vật. Phân tích bộ bốn giúp nghiên cứu được chi tiết từng sản phẩm của giảm phân. Các nghiên cứu di truyền vi nấm tập trung ở 4 vấn đề căn bàn: tính không phổi hợp, phân tích bộ bổn, tái tổ hợp nguyên phân và đơn bội hóa. Neurospora crassa và Saccharomyces cerevisiae là những đối tượng nghiên cứu quan trọng của di truyền. Ở vi tảo Chỉamydomorías reỉnhardii được nghiên cửu chỉ tiết hơn cả trong số các vi tảo. Các nghiên cứu ở vi tảo làm sáng tỏ nhiều vấn đề của di truyền quang hợp và sự xác định các sắc tố. Trong sổ gần 50.000 loài vì nấm, đến nay đã nghiên cứu về di truyền học được khoảng 30 loài. Những vi sinh vật đầu tiên được sử dụng vào nghiên cứu Dỉ truyền học từ những năm 30 của thế kỉ trước chính là các vi nấm. Đó là Neurospora và các loài khác nhau của chi Saccharomyces. Saccharomyces cerevisiae là Sinh vật nhân thực (Eukaryota) đơn bào, cho nên là mô hình rất tốt cho nghiên cứu di truyền của Sinh vật nhân thực và vì thế cho nên được hiểu biết chi tiết hơn cả. Các vi tảo (Microalgae) cũng có số lượng loài rất lởn (gần cả 100.000) và giữ vai trò rất quan trọng trong sinh quyển, là nguồn cung cấp oxy chủ yếu trong nuớc. Tuy nhiên chi

403

một số ít tảo lục đơn bào được dùng làm đối tượng nghiên cứu của di truyền học, đặc biệt là Chỉamydomonas reinhardii. Hai đối tượng tiêu biểu cho nghiên cứu di truyền học là nấm men Saccharomyces cerevisiae và nấm sợi Neurospora crassa. Chúng có các đặc tính ưu việt vì vừa là vi sinh vật, mà tế bào có nhân thuộc Sinh vật nhân thực Eukaryota

20.8.1. Nấm men Saccharomyces cerevỉsiae Nấm men Saccharomyces cerevisiae (hình 20.56) là một loài thuộc lớp Nấm Túi (Ascomycetes), còn gọi là “men bánh mỉ” (baker yeast) hay “men rượu”. Đó là loài nấm men chủ yếu được dùng trong các quá trình lên men rượu. Vì là Eukaryota đơn bào (kích thước khoảng 5 - 10fim, được biết rất chi tiết về di truyền học và sinh lí học, cho nên là đổi tượng mô hình nghiên cứu đi truyền các sinh vật nhân thực.

Hình 20.56- Nấm men S.cerevisiae diĩới kinh hiền vi điện tử và kính hiển vi quang học. a) Các đặc tính sinh học Các nghiên cứu di truyền học được tiến hành ở s. Cerevisiae đã từ hơn 70 năm nay. Đổi tượng này kết hợp trong nó 2 tính chất tuyệt vời: là đơn bào nên có thể tiến hành thí nghiệm như vi khuẩn, đồng thời có những đặc tính chủ yếu điển hình của Eukaryota và có ty thể với bộ gen ADN nhỏ. Giống với vi khuẩn, nó có thể nuôi trên môi trường dịch thể hay đặc và tạo lchuẩn lạc trên môi trường thạch, c ỏ thể nuôi tể bào nấm men quy mô lớn ừong các nồi lên men và đễ dàng thu nhận sinh khối tế bào. Chu trình sổng của nấm men được nêu lên trên hình 20.57. Nấm men có 2 dạng tế bào đơn bội (n) là a và a cỏ thể tồn tại độc lập nhờ sinh sản vô tính qua nguyên phân (mitosis). Khỉ 2 dạng a và a gặp nhau bắt cặp, rồi phối hợp tế bào và hợp nhân tạo 1 tế bào lưỡng bội (2n). Té bào ỉưỡng bộỉ có thể sinh sản vô tính vô hạng và đây là dạng thường sử dụng trong sản xuất. Trong những điều kiện nhất định, tế bào 2n sinh sản hữu tính qua giảm phân tạo nang có 4 bào tử (2 a và 2 a), mà sự kết hợp a và a tạo tế bào 2n, lặp lại chu trinh.

404

N guyên p h â n

B ât cặp a + a

C á c tể b à o ĩt a v à a

4

P h ố i h ợ p tể b à o

riCũig b à o t ử

Tể bờo 2n

H ợp nhân

S in h sea l h ữ iỉ tin h

S in h s ả n vổ tin ỉĩ ịm ọ c c h ồ i)

( 2 a + 2a)

G iả m p ỉtâ íĩ

Hình 20.57. Chu trình sinh sản của nẩm men s. b) Các dữ liệu di truyền học của s. cerevisiae: - Kích thước bộ gen (Genome size): 12 Mb. - Nhiễm sắc thể: n = 16. - Sổ lượng gen: 6.000. - Phần trăm gen tương đồng với người: 25%. - Kích thước trung bình của gen: 1,5 kb, 0,03 intron/gen. - Cảc transposon: một tỷ lệ nhỏ của AND. - Kết thúc giải ký tự chuỗi: 1996. c) Phân tích di truyền Nấm men có thể tồn tại ở dạng đơn bội vởi 2 kiểu bắt cặp (mating typ) là a và a.Ngoài cảc phương pháp lai để phân tích tái tả hợp (recombination) và bổ trợ (complementation), có nhiều kỹ thuật biến đổi di truyền (Techniques of Gentic Modification): Gây đột biển (Mutagensis): - Hóa chất và chiếu xạ: đột biến xoma ngẫu nhiên. - Dùng transposon: xen đoạn (Insertions) xoma ngẫu nhiên. Chuyển gen (Transgensis):

405

- Pỉasmìd tích hợp (integrative): xen đoạn (Inserts) nhờ tái tổ hợp tương đồng (homologous recombination). - Plasmid sao chép (replicative): Có thể sao chép tự lập (autonomously) (Ori sao chép của plasmid 2(4, hay ARS). - Nhiễm sắc thể nhăn tạo của nấm men: sao chép và phân ly như một nhiễm sắc thể. - Vector con thoi (Shuttle vector): Có thể sao chép trong tế bào nấm men hay E. coỉi. - Làm ỉm lặng gen mục tiêu (Targeted gen knockout): Thay thế gen (Gen replacement): tái tổ hợp tương đồng thay alen hoang dại bằng alen không (null alen). d) Kỹ thuật di truyền

Hình 20.58. cẩu trúc tể bào nấm men S.cerevisiae với các đặc điểm cùa tế bào nhân thực. Các thao íác gen (Gen manipulation) thực hiện ừên 1s. cerevisiae dề dạng hơn bât kỳ sinh vật Ẹukaryota nào khác. Đặc biệt nó ;có Ịihiễm sắc thể nhân tạo (Yeast artificial chromoxom - YAC) có trình tự sao chép ẠRS (Autonomously replicative sequence), tâm động (cenừomẹre) và 2 telomere (trinh tự đầu mút nhiễm sắc thể). YAC tồn tại độc lập trong tế bào nấm men như một nhiễm sắc thể và các gen được chèn vào nó được di truyền như nhiễm sắc thể Mendel. YAC có khả năng mang đoạn gADN ngoại lai dài 1 —2 Mb, nên thuận tiện cho tạo dòng và giải ký tự chuỗi (sequencing) những bộ gen lớn như bộ gen người. Nẩm men s. cerevisiae được sử dụng rộng rãi làm tế bào chủ trong KTDT. Ngoài ra, một số protein tái tồ hợp (gốc động vật) nhu interferon khi biểu hiện trong tế bào Prokaryotae như E. coỉì thì không có hoạt tính do thiếu biến đối saụ dịch mã, nhưng khi cho biểu hiện trong tế bào nấm men thì sản phẩm có hoạt tính.

406

e) Các đóng góp Vai trò chủ yếu cho các nghiên cứu: - Chu trình tể bào (Cell cycle): Sự xác định các gen kiểm soát phân bào nhờ các đột biến nhạy cảm nhiệt (temperature-sensible mutants (cdc mutants)) dẫn đến mô hlnh rất tốt cho nghiên cứu sự phân bào. - Tương tác gen (Gen interaction): nghiên cứu sự ức chế gen (suppression). Hệ thống plasmid lai kép (two-hybrid plasmid system) giúp tìm các tương tác giữa các protein ở nấm men đã dẫn đến các bàn đồ tương tác phức tạp, mà là khởi đầu cho sinh học các hệ thống (systems biology). - Di truyền học ty thể: nhờ các đột biến “petite” mất khả năng hô hấp mà phát hiện các gen của ty thể. Nhờ chúng và các đột biến khác của ty thể mà phân tích chi tiết cẩu trúc và chức năng bộ gẹn ty thể. - Di truyền học kiểu bắt cặp (Gentics of mating typ): Các alen MAT ở nấm men là các gen kiểu bắt cặp đầu tiên được xác định các đặc tính ở mức phân từ. - Đóng góp khác: Sự di truyền của khỏa dóng mở (switching) giữa sự tăng trưởng kiểu nấm men (yeast-like) và sợi (filamentous); đi truyền học sự thoái hóa (senescense).

20.8.2. Nấm sọi Neurospora crassa a) Các đặc tinh sinh học Giống với vi khuẩn và nấm men, nẩm sợi này có thể nuôi trên môi trường dịch thể hay đặc và tạo khuẩn lạc trên môi trường thạch. Nó thể hiện các tính chất điển hình cùa Eukaryota giống nhu nấm men: bộ gen gồm nhiều nhiễm sác thể, bào tử túi có trạng thái đan bội (n) và hợp tử lưỡng bội (2n), sinh sản vô tính qua chu trình nguyên phân (mitotic cycle), sinh sản hữu tính qua giảm phân và cỏ ty thể với bộ gen ADN nhỏ. Nấm thường mọc trên bánh mỳ cũ và cỏ màu vàng tươi (hình 20.59):

H ình 20.59. N ấm sợi Neurospora crassa dưới kính hiền v i quang học.

407

Sợi nấm phân đoạn có chứa nhiều nhân đơn bội. Có hai kiểu giới tính được điều khiển bởi một căp alen A và a. Sinh sản hữu tỉnh chỉ thực hiện khi có sự kết hợp của các tế bào khác alen (hình 20.60). Như hình vẽ mô tả khi bào tử đỉnh a rơi ừên tiền quả thể dạng chai (protoperithecium). Các cơ quan sinh đục cái hay A rod lên tiền quả thể a thì sự thụ tinh sẽ được xảy ra. Lúc đàu hai nhân đơn bội A và a tồn tại song song và chia đồng thời. Sau đó xảy ra sự hợp nhăn và tiền quả thể dạng chai biến thành quả thể dạng chai (perithecium). Mỗi hợp tử ỉưỡng bội 2n tạo thành một tế bào kéo dài gọi là nang hay túi (ascus) và lập tức chia giảm nhiễm được 4 nhân, mà 4 nhân này lại chia nguyên nhiễm một lần nữa tạo thành 8 nhân của 8 bầo tử nang hay bào tử túi (ascospores).

H ình 20.60. Chu trình sống cùa nấm sợi Nettrospora crassa.

408

Một đặc điểm độc đáo của Neurospora crassa là các sản phẩm của giảm phân, 8 nang bào tử xếp thẳng hàng trong nang. Nhờ vậy, qua phân tích bộ bốn (tetrade analysis) nghiên cứu hàng loạt các cơ chế di truyền như trao đổi chéo, gen chuyển biến (conversion), tái cẩu trúc nhiễm sắc thể (chromoxom rearrangement), sự không chia ỉy trong giảm phân (meioiic nondisjunction) và sự kiểm soát di truyền đổi với giảm phân. Các Nhiễm sắc thể tuy nhỏ, nhưng có thể nhìn thấy dễ dàng. N, crassa đạt kỷ lục về tốc độ tăng truởng trong các loài nấm: mỗi sợi nấm (hypha) mọc dài ra hơn 10 cm/ngày. Sự tăng trưởng nhanh đó kết hợp với chu trình đơn bội và khả năng mọc ừên các môi trường nuôi cấy có thành phần xác định làm cho nó thành một đối tượng rất thuận tiện cho nghiên cứu dì truyền hỏa sình (biochemical gentics). Trên thực tế, nó nổi tiếng với sự ra đời giả thuyết một gen - một enzym. b) Các dữ liệu di truyền học của Neurospora crassa: - Kích thước bộ gen (Genome size): 43 Mb. - Nhiễm sắc thể: 7 Nhiễm sắc thể thường (n = 7). - Số lượng gen: 10.000. - Phần ừăm gen tương đồng với người: 6 %. - Kích thước trung bỉnh của gen: 1,7 kb, 1,7 intron/gen. - Các transposon: rất hiếm. - Kết thúc giải ký tự chuỗi: 2003. c) Phân tích di truyền Khi nuôi chung 2 loại sợi tơ nấm có kiểu bắt cặp đối ngược nhau là A và a dề dàng nhận được các nang bào tủ lai. Mặc dù ở Neurospora crassa không nhận được các sợi tơ lưỡng bội điển hình (nhân 2n), nhưng sự phối hợp 2 loại tơ tạo ra thể dị nhân (heterokaryon), mà trong đó 2 nhân đơn bội khác nhau cùng tồn tại song song trong tế bào chất. Nhờ vậy có thể tiến hành phân tích tái tổ hợp và bổ ừợ. Ngoài ra, có các kỹ thuật biển đổi di truyền sau: Gây đột biến (Mutagensis): - Hóa chất và chiéu xạ: đột biến xoma ngẫu nhiên. - Dùng ửansposon: không. Chuyễn gen (Transgensis): - Biến nạp qua trung gian plasmid (Plasmid-mediated transformation): xen đoạn ngẫu nhiên (Random insertion). Làm im lặng gen mạc tiêu (Targeted gen knockout):

409

- RIP: các đột biến GC -> AT trong các đoạn tâng đôi chuyển gen trước khi lai. - ứ c chế (Quelling): bất hoạt xoma sau phiên mã các gen được chuyển vảo (Xomatic posttranscriptional inactivation of transgens). d) Kỹ thuật dì truyền: Biến nạp đầu tiên trên Eukaryota đã được thực hiện ở Neurospora crassa, Ngày nay, nó dễ dàng chấp nhận nhiều vector plasmid mang các gen mong muốn. Không có plasmid nào tái bản trong Neurospora, và như vậy các gen chuyển vào phải được chèn vào nhiễm sẳc thể mới có sự di truyền ổn định. e) Các đóng góp - Di truyền sinh hóa và trao đổi chất. - Di truyền học của giảm phân. - Di truyền ty thể. - Đóng góp khác: sự đa dạng các loài nấm và thích nghi (adaptation), di truyền tế bào (cytogentics), các gen kiểu bắt cặp, các gen phối hợp thể dị nhân (heterokaryoncompatibility gens). 20.8.3. Các đặc điểm dỉ truyền của vi nấm Chu trình sống của các loài nấm khác nhau rẩt đa dạng, nhưng cỏ thể xếp vào 5 kiểu căn bản khác nhau như: 1. Sinh sản vô tính; 2. Thể đơn bội; 3. Thể đom bội với giai đoạn đị nhân; 4. Đơn bội - Lưỡng b ộ i; 5. Lưỡng bội. Ngay trong các nấm sinh sản hữu tính cũng có sự dao động từ hoàn toàn đơn bội như Neurospora đến hoàn toàn lưỡng bội như ở Saccharomyces cèrevisiae ' Đối với phần lớn nấm sợi, điểm đặc trưng là nhiều nhân cùng hiện diện trong một tế bào. Các nhân này có thể cỏ kiểu gen khác nhau. Trong trường hợp này được gọi là thể dị nhăn (heterokaryon) tương tự dị hợp tử. Ở các vi sinh vật nói chung, các tính trạng hình thải thường không nhiều, nhưng có sự đa dạng lớn về nhiều loại phản ứng hóa học khác nhau. Sự ra đời của giả thuyết nổi tiếng 1 gen - 1 enzym đã dựa trên các đột biển sinh hóa ở N. crassa. Các môi trường chọn lọc được sử dụng để thu thập các dạng lai hiếm hoi giừa các dòng cha mẹ đơn bội mang các đột biến khuyết dưỡng lặn, khi sai hỏng trong chuỗi phản ứng sinh hóa của chúng bổ sung cho nhau. Ngoài ra tính đề kháng với các tác nhân bất lợi được sử dụng rộng rãi làm tính trạng đánh dấu trong các nghiên cứu di truyền ờ nấm. Nói chung, các vi sinh vật nhân thực cỏ ưu thế đặc biệt là sự kết hợp giữa cấu tạo tế bào và chu trình sống như sinh vật bậc cao với cơ thể đơn bào của vi sinh vật. Nêu như trong những năm 70 của thế kỷ trước, các đổi tượng căn bản của đĩ truyền học phân tử là

410

phage và vi khuẩn, thì những từ năm 80 cho đến nay các Eukaryota đơn bào đã thay thế dần. Bốn vấn đề căn bản được chú ý trong nghiên cứu di truyền ở nấm là: tinh không phổi hợp (incompatibility), phân tích bộ bổn (tetrade analysis), tái tổ hợp nguyên phân (mitotic recombination), và sự đơn bội hóa (haploidisation). Nhiều nấm sợi có quả thể nHin thấy được không phải là vi nấm, nhưng có thể sử dụng các phương pháp dùng cho vi nấm để nghiên cứu. 20.8.3.1. Tính không phối hợp ở nấm Khái niệm tính không phối hợp (incompatibility) ở nấm được dùng để chỉ khả năng kết hợp với nhau giữa các dòng nấm trong sinh sản hữu tính. Cho đến nay, gần 450 loài nấm đã được nghiên cứu về các kiểu không phối hợp. Sự không phối họp được xác định về mặt di truyền. Theo kiểu phối hợp thì nấm được phân làm 2 loại: - Đồng tản (Homothallic) là khi có sự kết hợp với nhau giữa các tế bào (hay hệ sợi tơ-mycelium) giống nhau trong sinh sản hữu tính, Ví dụ, tế bào a kết hợp với tế bào a hay a với a tạo dạng lưỡng bội (2n) tương ứng aa hay aa. - Dị tản (Heterothallic) là kiểu khi có sự lai nhau giữa 2 loại tế bào khác nhau như a với a tạo dạng dị hợp tử lường bội aoc như ở nấm men. Các nấm dị tản có thể chia thành: lưỡng cực (bipolar) và tứ cực (tetrapolar). Đại diện điển hình của nấm dị tản ỉưỡrtg cực (bipolar heterothallic) là nấm men s. cerevisiae (hình 20.56). Ở nấm men này, sự hợp bào (cytogamy) và hợp nhân (karyogamy) chỉ xảy ra giữa các tể bào (hay nang bào tử-ascospore) có kiểu bẳt cặp (mating typ) khác nhau như a và a, và các alen khác nhau của locus MAT. Do có sự tham gia cùa 2 alen, nên gọi là lưỡng cực. Nấm Neurospora crassa cũng thuộc kiểu không phối hợp này (hình 20.59). Nấm rơm (Voỉvarieỉla voỉvacea) và nấm mỡ (Thachicus bisporus) cũng thuộc loại này. Kiểu dị tản tứ cực (tetrapolar heteropoỉic) đặc trưng cho nhiều loại nấm đảm Basidiomycetes, mà đại diện là Schizophyllum communae. Nấm bào ngư (Pleurotus•) và nấm hương {Lentinula edodes) thuộc kiểu không phổi hợp này. Sự xác định di truyền không phối hợp ở các loài nấm này do 2 gen A và B. Mỗi gen có 2 alen hoặc nhiều hơn; thường là Ai, A 2 và Bi, B2. Sự kết hợp giữa các đòng đơn bội chỉ tạo dạng hữu thụ có kiểu gen A 1A 2B 1B2 tức bốn nhân tổ khác nhau (nên gọi là tử cực) như ưên bảng 20.7.

411

Bảng 20.7. Sự két hợp giữa các dòng đơn bội có các kiểu không phổi hợp khác nhau ở nấm dị tản tứ cực A .B 2

a 2b

A ,B ,

-

-

-

+

A iB 2

-

-

+

-

2b ,

-

+

-

-

A2B2

+ "

'

a

,

a 2b

A ,B ,

2

Dấu + chì các tổ hợp lai được với nhau.

Ở Podospora anserina, trong các giới hạn của mỗi chủng địa lí cỏ 2 kiểu bát cặp “+” và Quá trình sinh sản hữu tính bình thường chỉ có được khi lai dòng “+” yà dòng giống nhau theo alen của gen t. Truờng hợp này có thể gọi là đồng tản khác alen. Sự đa dạng của các chu trình sống và các kiểu không phối hợp ở nấm có ảnh hưởng đến các phương pháp phân tích di truyền (gentic analysis). Ờ một số nấm sinh sản hữu tính thực hiện trên cơ sở dị hợp bào (heterogamy) như ở Neurospora crassa. ở những loài khác trên cơ sở đồng hợp bào (isogamy), Song song với sinh sàn hữu tính còn có chu ưình cận hữu tính hoàn toàn hay không hoàn toàn phụ thuộc vào loại nấm. Chu trình cận hữu tính (parazxual cycle) là quá trình kết hợp và tái tổ hợp gen diễn ra trong nguyên phân chứ không phải giảm phân, không có sự thụ tinh như sinh sản hữu tính. 20.8.3.3. Phân tích bộ bốn ở nang khuẫn (Nấm túi) Lớp Nang khuẩn hay Nấm túi (Ascbmyceĩes) có đặc điểm là khi các tế bào lưỡng bội chia giảm nhiễm sẽ tạo ra các bào từ nằm trong một nang, Nấm men bánh mì, men rượu s. cerevisiae và nấm sợi N. crassa là những nang khuẩn được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu di truyền học. Điểm đặc biệt của nấm sợi N. crassa là cảc nang bào tử xếp thẳng hàng trong nang như lúc các nhiễm sắc thể xểp trên mặt phẳng xích đạo của kì giữa. Chúng xếp theo một trình tự nhất định phản ánh được tiến trình giảm phân I và II (hình 20,61). Ở nấm men, bổn nang bào tử đại diện cho 4 nhiễm sắc thể của giảm phân (xét một cặp nhiễm sắc thể tương đồng) xểp theo một thứ tự nào đó, khó biết trình tự. Sử dụng máy vi thao tác (micromanipulator), người ta cỏ thể tách rời từng nang bào tử một của một nang để nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu trực tiếp các sản phẩm của mỗi lần giảm phân được gọi là phân tích bộ bổn (tetrade analysis). Khi có sự phân li của một cặp alen thì trong mỗi nang của Neurospora sẽ có sự phân bố nang bào tử 4: 4 nếu sự phân li xảy ra ở giảm phân I hoặc sự phân bố 2: 2: 2: 2 nếu sự phân li xảy ra ở giảm phân II.

412

à) Sự phân li ở giảm phân ỉ Hình 20.61 mô tả quá trình lai một dòng N. crassa hoang dại (c+) với một dòng đột biến (c) có khuẩn lạc cụm (colonial). Nếu tách các nang bào tử theo thớ tự trong nang và để chúng mọc lên thành dòng thì sẽ có thứ tự 4c:4c+. Sự phân bố 4:4 cho thấy không có ữao đổi chéo xảy ra giữa gen và tâm động (centromere). Gen càng cách xa tâm động xác suất xảy ra trao đổi chéo giữa gen và tâm động càng lớn. Do đỏ nếu số phần trăm nang 4c:4c+ càng lớn, tức trao đổi chéo ít xảy ra thì gen c càng gần tâm động. b) Sự phân ỉỉ ở giảm phân II Trường hợp b (hình 20.61), khi có trao đổi chéo xảy ra giữa gen và tâm động. Sau lần chia thứ nhất hai nhiễm sắc thể chị và em vẫn còn giống nhau. Đen lần chia thứ hai mới có sự khác nhau thể hiện ở sự phân li và tỉ lệ 2c: 2c+: 2c: 2c+ phản ánh điều đó. Kêt quả này chứng minh rằng trao đổi chéo xảy ra giữa 4 nhiễm sắc thể.

Khuẩn ỉạc cụm c Công hoang dại c+

Tiếp họp

r: uU* *a)u«"

/

\

«UUe Ỉ

«’UU«

A

/ \

6 J

A

Oỉảmphân I

à

,J l

«*■/*»"

<11

Ngỉyènphân

A

W 4
4c: 4c+

i wili tyt*

Sự phân ly ở giám phân I

,-ll h

.11 í \

S

M

«*l

A S

- w

B totonUl 1 trib) lyp* lcnbm ial B Milil typi

2

c: 2 C+: 2 c: 2

Sựphân ly ở giâm phân l ì

H ình 20.61. Phương thức tạo bào từ ở nẩm sợi N eurospora crassa.

413

c) Lập bản đồ di truyền bằng phân tích bộ bốn Đối với trường hợp bộ bốn sắp theo thứ tự như ở Neurospora, số phần trăm các nang tái tổ hợp phản ánh khoảng cách giữa gen và tâm động, cần nhớ rằng trao đổi chéo chỉ liên quan đến hai nhiễm sắc thể, nên chỉ có hai sản phẩm của giảm phân chứa nhiễm sắc thể tái tổ hợp. Do đó để tính phần trăm các nhiễm sắc thể tái tổ hợp, lấy phần trăm nang tái tổ hợp chia đôi. Trường hợp bộ bốn không theo thứ tự như ở nấm men thì việc tính tần số tái tổ hợp có phức tạp.

Hình 20.62 Các kiểu bộ bốn khác nhau: Kiếu PD parental dityp (không trao đổi chéo) - Kiểu RD recombination dityp hay NPD nonparentaĩ dityp (có trao đổi chéo) - Kiểu TT tetratyp (có trao đổi chéo). Ví dụ: Phân tích bộ bốn từ tổ hợp lai hai gen AB X ab. Sự thụ tinh cho nhân lưỡng bội (AB/ab) và nó chia giảm nhiễm ngay. Nếu không có trao đổi chéo xảy ra hoặc trao đổi chéo đôi xảy ra trên cùng hai nhiễm sắc thể thì sẽ có các bộ bốn kiểu cha mẹ 2AB: 2ab được gọi kiểu đôi chạ mẹ (parental dityp) (PD) (hình 20.62). Nếu trao đổi chéo xảy ra giữa nhiễm sắc thể 2 với 3 và 1 vởi 4, sẽ cỏ 2Ab:2aB. Kiểu này được gọi kiểu đôi tái tổ hợp (^com binational Dityp - RD) hay kiểu đôi không cha mẹ (Nonparental Dityp - NPD). Kiểu này ít nhất trong các bộ bổn có tái tổ hợp.

414

Các trường hợp tạo ra mỗi nang bốn loại bào từ có kiểu gen khác nhau 1AB: lAb: laB: 1ab, được gọi kiểu bốn (tetratyp - TT). d) Hiện tượng chuyển biến (conversion)Chuyển biến (conversion) là hiện tượng lệch khỏi sự phân li bình thường 2: 2 của các bộ bốn, khi có sự di truyền của 1 gen, được Lindegreen phát hiện năm 1949. Ví dụ: Dị hợp tử của nấm men a+/+b tạo các bộ bốn bất thường như: (a +) (a +) (a b) (+ b) và (a +) (+ +) (+ b) (+ b) hoặc (a +) (a b) (+ b) (+ b) và (a +) (a +) (+ +) (+ b). Sự phân li bất thường có thể liên quan đến cả 2 gen như: (a +) (a +) (a +) (+ b) hay (a +) (+ b) (+ b) (+ b). Các nghiên cứu tiếp theo cho thấy chuyển biến (conversion) là hiện tượng bình thường ở các gen khác nhau của nấm men với tần số 1%. Hiện tượng này cũng được mô tả ờ các loài nẩm khác như Neurospora crassa, Sordarìa fimicola và nó có ý nghĩa quan trọng trong giài thích cơ chế tái tổ hợp. 20.8.3.4.

Phân tích di truyền trong chu trình cận hữu tính

Nhiều loại nấm có sợi dinh dưỡng (vegetative hyphae) kết hợp với nhau, làm cho các nhân đon bội từ các dòng cùng ở chung trong tế bào chất. Các thể dị nhăn (heterocaryon) được tạo nên có thể tồn tại lâu đài như ở N. erassa. Sự tạo thành các thể dị nhân được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu sự tương tác giữa các gen, giữa các alen và giữa các gen của nhân với tế bào chất. Trong một sổ trường hợp, sự so sánh các dị hợp tử và dị nhân cho thấy sự khác nhau trong tương tác giữa các alen, có lẽ do: - Tỉ lệ số lượng nhân và tương ứng các alen trong thể đị nhân có thể khác nhau. - Các alen của các gen ở một nhân không được ngăn cách như ở giữa các thể dị nhân. Các nhân ở thể dị nhân đôi khi hợp nhau tạo nên đoạn lưỡng bội Hơn nữa, trong quá trinh chia nguyên phân tiếp theo, nhân lương bội có thể chịu tác động của 2 quá trình: đơn bội hóa hoặc tái tổ hợp nguyên phân. a) Sự đơn bội hóa Sự đơn bội hỏa (Haploidisation) diễn ra ngẫu nhiên. Nó có thể được gây tạo có hiệu quả bởi chất n-fluorphenylalanin. Nếu như các nhân trong nhiều nguyên phân bị mất 1 nhiễm sắc thể (2n-l), thì nhân lệch bội vừa xuất hiện ừở nên không ổn định và tiếp tục mất các nhiễm sắc thể khác của một bộ đơn bội, cho đến khi trờ thành nhân đơn bội (n) ổn định. Trong quá trình đỏ nhiễm sắc thể bị mất độc lập nhau, các gen của cùng một nhiễm sắc thể có sự liên kết hoàn toàn. Dựa vào đặc điểm này có thể xác lập sự liên kết gen dựa vào gen đánh dấu trên mỗi nhiễm

415

sác thể. Ví dụ, nếu có lưỡng bội dị hợp tử (AB/ab N/n) khi đơn bội hóa sẽ có các kiểu gen: (ABN), ABn, (abN) và (abn). b) Tái tổ hợp trong nguyên phân Tái tổ hợp nguyên phân (Mitotic recombination) là hiện tượng thường gặp ở nhiều sinh v ậ t, khi xảy ra trao đổi chéo giữa các nhiễm sắc thể tương đồng trong nguyên phân (hình 20.63). Trong trường hợp này, khoảng cách của gen đánh đấu xa tâm động nhất, sự đồng hợp từ hóa thường xảy ra hơn cả (được coi là 100%) và sự phân bố các gen được tính theo công thức: D = ^ .1 0 0 % Nb

D biểu thị khoảng cách của gen đến tâm động. Nb - tổng số các dạng phân li, đồng hợp tử theo b. Nab - số các dạng phân li đồng hợp cả a và b, nếu như b là gen đánh đẩu xa tâm động nhất. Bản đồ liên kết gen được xây dựng bằng tái tổ hợp giảm phân và tái tổ hợp nguyên phân (trong chu trình cận hữu tính) có thứ tự gen xếp giống nhau ở Aspergillus nidulans. Tái tổ hợp nguyên phân a)

b e d 2 - ---- V/----------0

Sự phân ỉi các chromatid a b c d 1 -0 + + ++ á -o+ + + + 2 -0 -g -± + + + + ++ 3 -0 + b e d hoâc

3Z . 1X f \ d---------------------

. . a b e d 3_o____ ______ + b c d 2^3 4 -0

h)

+

t- +

+ + + +

+ bed + + ++

a b + d + + + +

hoậc á -2_____________

c

a h +d 1-0 3-0+ h + d 4 -0 .

+ 6 +d + + c+

+ +

c +

H ình 20.63. Trao đồi chéo nguyên p h â n (M itotic crossing-overj ở đoạn a-b.

a) Trong tứ dị hợp tử theo các gen ỉiên kết, khi aỉen lặn c (cần được xác định vị trí) nằm trên đoạn tương đồng được đánh đẩu. b) Trong đoạn tương đồng không đánh dấu, trao đổi chéo ờ đoạn giữa gen và tâm động đưa đếtì sự đồng hợp tử của các gen xa điếm trao đói ở một nửa số nhân cùa tế bào (thế kệ con cùa nhân tái to hợp). Nhờ đó, có thể sử dụng trao đổi chéo nguyên phân để xác định vị trí gen ở một vai

cùa nhiễm sẳc thể so với iâm động.

20.8.4. Dỉ tru y ền ở các T ảo lục đơn bào Các tảo đơn bào (Microalgae) cũng được dùng làm đối tượng nghiên cứu của Di truyền học, đặc biệt là di truyền quang hợp và di truyền của bào quan lục lạp. So với nấm, các vi tào và nói chung là tất cả thực vật, các đột bỉến khuyết dưỡng ở tảo lục đơn bào chỉ hạn chế trong một phạm vi hẹp như mất khả năng tổng hợp argìnìn (arg~) và một số vitamin. Nguyên nhân của hiện tượng này đến nay chưa rồ. 20.8.4.1.Vì tảo Chlamydomonas reinhardii Loài vi tảo được sử dụng sớm nhất và nghiên cứu di truyền chi tiết hơn cả là Chlamydomonas reinhardiỉ (hình 20.64), nó có chu trinh sinh sản hữu tính. Ưu thế của đối tượng này là có thể tiến hành lai và phân tích bộ bổn không xếp theo thứ tự.

Hình 20.64. cẩu trúc và hình thái Chlamydomonas. a) Độc điểm sinh học Vi tảo Chl. reihardii có thể nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng dịch thể hay môi trường thạch đặc như các vi sinh vật khác. Các tế bào mọc thành khuẩn lạc trên môi trường thạch. Vi tảo cỏ thể nuôi ngoài sáng (ánh sáng mặt ười hay đèn huỳnh quang thông dụng) hoặc trong tối (phải bổ sung axetat natri hoặc glucoz).. Trong điều kiện thí nghiệm, cỏ thể nuôi các tế bào Chl. reinhardii để nhận các tế bào đồng nhất (synchronous culture), khi thay đổi chu kì 12 giờ sáng 12 giờ tối đều đặn. Theo dõi tổng hợp ADN cho thấy ADN của

417

lục lạp tổng hợp vào giờ thứ 5-6 ngoài sáng, còn ADN của nhân tổng hợp khoảng giờ thứ 16-18, sau đỏ chia tế bào đồng loạt. Chu trình sống của Chl. reihardii được nêu trên hình 20.65. Bình thường các tế bào dinh dưỡng tồn tại lâu dài ờ ừạng thái đơn bội n với 2 kiểu bắt cặp khác nhau mt+ (mating typ) và mtf tương đương với 2 giới tính, mà về hình thái thì rất giống nhau. Các tế bào dinh dưỡng nay có thể tạo nang bào tử kín hay túi bào tử (sporangia) và sinh sản vô tính tạo ra các tế bảo con đơn bội. Khi được kích thích, như nuôi ừên môi trường dinh dưỡng thiếu nitơ, các tế bào dinh dưỡng chuyển thành các động bào từ (zoospores) mt+ và mt”. Sự kết hợp và phối hợp 2 loại tế bào khác kiểu bắt cặp mt+ và m f sẽ tạo ra hợp tử lưỡng bội 2n. Hợp tò này gặp điều kiện thuận lợi sẽ thực hiện giảm phân tạo ra 4 tế bào đơn bội n, mà chúng sinh sản vô tính tạo ra số lượng lớn tế bào dinh dưỡng. Ở Chl. reinhardii có thể nhận được nhiều đột biến khác nhau, đặc biệt là các đột biến sắc tố khác với màu khuẩn lạc xanh lục của dạng hoang đại như màu cam, vàng, trắng kem, xanh lợt,.. .thuận lợi cho nghiên cứu di truyền lục lạp và quang hợp. X

Túi bào từ

____- >

Động bào tử n 2 ỉần chia nhãn

-AI V 'Ệỷ'Tểtec ^

)

f

* * *

\

S ìn h s à n v ô tín h S in h s ả n h ữ u tín h

c° Giâm phân

Phôi hợp

Kết hợp 2 tế bào đơn bội

H ợ p tử ỉu õ n g b ộ i 2 n H ình 20.65. C hu trình sổng của vi tào Chỉamydom onas reinharđii.

418

b) Các gen của lục ỉạp ở Chlamydomonas reinhardii Sự di truyền của lục lạp được nghiên cứu chi tiết hơn cả ở vi tảo Chlamydomonas reinhardii. Tế bào của vi tào này có một lục lạp lớn với đường kính trưng bình 5 micrometer chứa 50 đến 80 bàn sao của phân tử ADN vòng tròn dài 196 kb. Bảng 20.8. Các đột biển trong nhóm liên kết gen của ỉục lạp Các gen J.ơc/-ac4 2.tmr tm3- tmọ ĩ.trriì 4. till- tils

Kiểu hình đột biến 1.Mất khả năng quang hợp, cần bổ sung axetat. 2,Không mọc được ờ 35°c. 3.Mọc ở 35°c khi có streptomycin. 4.Hỉnh thành khuẩn lạc nhỏ ở tất cà các loại MT.

s.eryi

5.Kháng erytromycin ờ nồng độ 50 |i g/ml.

1ỉ 1 1 C 1 'Ỏ 1

6.Kháng kanamycin ở 50|1 g/ml.

ĩ.spci

7.Kháng spectinomycin ờ 50ịj. g/ml.

8.spii-spií

8.Kháng spiramycin ở 50fi g/ml.

9.0Ỉer 0Ỉeỉ

9.Kháng oleodomycin ở 50|i g/ml.

10. car- ỉ

lO.Kháng carbamycin ở 50|4. g/ral.

lỉ.eỉẻì

11 .Kháng eleosin ở 50n g/ml.

12.eryì-eryi

12.Kháng erythromycin, carbamycin, oleandomycin spyramycin ở nồng độ tùy các chất nêu trên.

J3.sni2-sms

13.Kháng streptomycin ớ nồng độ 500ụ g/ml.

I4.sm3

M.Kháng streptomycin ở nồng độ 50|I g/ml.

15.sm4

I5.Phụ thuộc streptomycin. (phải cỏ streptomycin mới mọc được).

Một số đột biến kháng streptomycine đã được thu nhận và nhận thấy ở một số có sự di truyền trong nhân, sổ khác có sự di truyền ngoài nhân.

Theo Sager (1975), ở Chlamydomonas reinhardỉỉ có các đột biến trong nhóm liên kết gen của lục lạp như sau (bảng 20.8): Các đột biến có biểu hiện kiểu hình như sau: “ Mất khả năng quang hợp; để mọc được ngoài ánh sáng và trong tối cần bổ sung đường khử là axetat. - Nhạy cảm với nhiệt độ cao hoặc thấp. - Tính đề kháng với thuốc kháng sinh hoặc có nhu cầu được cung cấp thuốc kháng sinh. Tất cà các đột biến trên có sự di truyền theo một cha mẹ (uniparental inheritance), có kiểu bắt cặp mt+ (có thể coi là dòng mẹ). Điều này ỉiên quan đến sự hình thành lục lạp ữong họp tử, bàng cách nào đó chỉ nhận ADN từ lục lạp mt+. Năm

1954, R.Sager đã nghiên cứu các đột biến kháng streptomycin ở

Chlamydomonas reinhardii từ dạng hoang dại nhạy cảm sm-s. Một số đột biến sm-r có sự di truyền nhiễm sắc thể với sự phân li 1:1. Tuy nhiên, một số đột biến có sự di truyền khác thường như sau: sm -r mt+ X sm -s mt“ -> tất cả thế hệ con đều sm -r với tỉ lệ lm t+: lmt-

sm-s mt+ X sm-r mC —> tất cả thế hệ con đều sm-s với ti lệ lmt+: lmtNhư vậy, ở đây khi có sự hoán đổi cha mẹ trong ỉaỉ, thế hệ con đều có kiểu hình streptomycin của mt+. Sự truyền thụ tính trạng này được gọi là sự di truyền theo một cha mẹ (uniparental inheritance). Sager coi mt+ như dòng mẹ và trường hợp trên giống như di truyền theo đòng mẹ. Các gen kiểu bắt cặp mt cỏ tỉ lệ phân li của gen trong nhân là 1: 1. Ở c . reinhardii, streptomycin cỏ tác động gây đột biến. Các đột biến nhận được do tác động bởi streptomycin đều có sự di truyền theo một cha mẹ (bảng 20.9). Đặc biệt đột biến smt4 còn gọi là smd (streptomycin - dependent) chỉ mọc khi ứong môi trường nuôi có sừeptomycin. Sager đã tiến hành thí nghiệm chứng minh sự di truyền của các gen nêu ưên liên quan đến cpADN của lục lạp. Các kĩ thuật dùng đồng vị phóng xạ đánh dấu N 15 và li tâm trên thang nồng độ CsCl được sử đụng. CpADN của hai cha mẹ đem lai được đánh dấu khác nhau: một dạng mang N 14 nhẹ, dạng kia mang N 15 nặng, Tỉ trọng của cpADN từ các tế bào cha mẹ như vậy tương ứng với 1,69 và 1,70. Nhờ li tâm trên thang nồng độ CsCl có độ nhạy cao nên có thể ghi nhận sự khác nhau giữa các dòng cha mẹ và dòng lai (bảng 20.9).

420

Bảng 20.9. Tỷ trọng của cpADN ở thế hệ con từ các tổ hợp laỉ Chỉamydomonas T ỗ hợ p lai

T ỉ trọ n g của cpAD N của h ọ p tử (g/cm 3)

N 14 m t+ X N 14 mt"

1,69

N 15 m t + X N 15m f

1,70

N 15 m t + X N 14mt"

1,70

N 14 m t+ X N 15m t

1,69

Trên thực tế, các kết quả này cho thấy cpADN của cha mẹ mt bị mất hoặc bị phân hủy như thể nào đó. Sự mất đó kèm theo mất các đột biến (ví dụ: sm) trên cha mẹ m í. Các thí nghiệm khác theo nguyên tắc tương tự được tiến hành với việc sử dụng các đoạn RFLP. Mỗi dòng cha mẹ có cpADN với RFLP khác nhau. Kết quả cũng cho thấy cpADN ờ thế hệ con nhận được từ đòng mt+. Như vậy, có thể kết luận ràng cpADN của Chlamydomonas được truyền thụ từ một dòng cha mẹ (uniparental) và các gen của nó cũng có sự truyền thụ tương tự. c) Lập bản đồ các gen của Chỉamydomonas Trong tổ hợp lai mt+sm -r X mCsm-s có khoảng 0,1 % thế hệ hợp tử con mang cả sm r và sm-s. Các hợp tử như vậy là hợp tử hai cha mẹ (biparental zygote) và được gọi là cytohet (cytoplasmically heterozygote). Tần số các cytohet có thể tăng lên 40-100% ở thế hệ hợp tử con nếu mt+ được chiếu tia tử ngoại trước khi lai. Ở Chlamydomonas, các cytohet hay hợp tử hai cha mẹ được dùng làm điểm xuất phát cho tất cả các nghiên cứu về sự phân li và tái tổ hợp của các gen lục lạp. Trên cơ sở nhiều tổ hợp lai, R.Sager đa nêu ra bản đồ vòng tròn của cpADN với các gen tương ứng. 20.8.4,2. Các v i tảo sinh sản vổ tỉn h

Các thí nghiệm di truyền được tiến hành ở các vi tảo sinh sản vô tính như: Clolla, Eugỉena, Scenedesmus. Do không tiến hành lai được nên phân tích di truyền chỉ giới hạn ở thu nhận các đột biển. Các đột biển sắc tổ ờ Cỉolỉa góp phần hiểu sâu về cơ chế đi truyền quang hợp. Các nguyên sinh động vật (Protozoa) là một nhóm lớn gồm hom 65.000 loài, trong đỏ có khoảng 10.000 loài kí sinh. Di truyền học của nhóm này hầu như chưa được nghiên cứu.

421

Chương 21

VI SINH VÁT VÀ MIỄN DICH HOC • • •

21.1. HAI LOẠI MIẼN DỊCH Đấu tranh sinh tồn là thuộc tính của mọi cơ thể sống. Mỗi loài, bất kể là cơ thể bậc thấp hay bậc cao đều có ít nhiều khả năng tự bảo vệ mình trước sự xâm lăng của các tác nhân gây bệnh để tồn tại và bảo vệ tính toàn vẹn của cơ thể. Trong quá trình tiến hoá khả năng này dần dần được hoàn thiện và đạt đỉnh cao ở động vật có vú về mức độ tinh vi, hoàn hảo và tính hiệu quả, mà có lẽ sẽ không bao giở có bộ máy nào do con người tạo ra có thể so sánh nổi. Thế giới xung quanh chúng ta đầy rẫy các vi sinh vật, mỗi khi có ẹơ hội là xâm nhập vào cơ thể. Chúng lẫn vào thực phẩm khi ta ăn, lẫn vảo không khí khi ta hít thở. Nhưng vì sao chúng ta vẫn sống khoẻ mạnh, vì sao vi sinh vật không phát triển tràn lan khãp cơ thể? Bởi vì cơ thể đã biết tự bảo vệ mình bởi hàng loạt các cơ chế chổng trả lại. Khả năng của cơ thể nhận biết và loại trừ các thể lạ ẩy gọi là miễn dịch. Nếu hệ thống các phản ứng miễn dịch hoạt động tốt cơ thể sẽ thoát khỏi nhiễm trùng, còn ngược lại sẽ rơi vào bệnh tật. Miễn dịch được chia làm hai loại: Miễn dịch không đặc hiệu hay miễn dịch tự nhiên và miễn dịch đặc hiệu hay miễn dịch thu được. Cả hai loại miễn dịch này đều song song tồn tại, liên quan chặt chẽ và bổ túc cho nhau.

21.1.1. Miễn dịch không đặc hiệu Miễn dịch không đặc hiệu mang tính tự nhiên, được hình thành sẵn trong cơ thể từ khi mới lọt lồng mà chưa cần có sự tiếp xúc với kháng nguyên, do đỏ không phụ thuộc vào bản chất của kháng nguyên và không có đáp ứng chọn lọc hoặc đặc hiệu với bất kỳ kháng nguyên nào. Hiệu quả miễn dịch là như nhau đối với mọi mầm bệnh. Miễn dịch không đặc hiệu bao gồm các hàng rào bảo vệ từ ngoài vào trong, nếu lọt qua hàng rào thử nhất sẽ vấp phải hàng rào thứ hai...nhàm tiêu diệt và ngăn cản mầm bệnh trước khi chúng kịp nhân lên, nhờ đó mà hệ thống miễn dịch đặc hiệu có đủ thời gian

422

vận hành. Tuy nhiên, trong thực tế nhiều khi hai loại miễn dịch này xen kẽ và bổ sung cho nhau. 2 L lJ .I.H à n g rào vật lý Da và niêm mạc ngăn cách nội môi của cơ thể với ngoại môi xung quanh. Da gồm hai lớp. Lớp ngoài mỏng là biểu bì chứa các tế bào biểu mô. Các tế bào biểu mô ken chặt và hóa sừng, chứa keratin (giống thành phần của tóc và móng tay) khiến cho nước và vi sinh vật không xâm nhập vào được.

Tế bào lua lỏa nhánh

Hình 21. ĩ: Mô lympho da. Tể bào keratin chiểm 90% biểu bì, chúng tiểt cytokine gây viêm để chống tác nhân gầy bệnh Tế bào Langerhans (tể bào tua) bẳt giữa khảng nguyên (KN), đưa vào hạch Ịympho nằm dưới da. Tại đây chứng biệt hóa thành tể bào tua xòe ngón tiêu hỏa và trình KN cho tể bào T hỗ trợ. Tế bào ỉympho biếu mô hoạt động như tể bào. (Theo LMPrescott, J,p.Harley, D.A.KỈein,2005ị. • Lớp biểu bì bong liên tục nên loại bỏ vi sinh vật bám vào. • Lớp đa khô cản trở sự sinh trưởng mạnh của vi sinh vật.

423

• Vi sinh vật thường trú trên da tiết enzym phân giải lipit thành axit béo làm giảm pH, ức chế sinh trường của vi sinh vật. Một số vi khuẩn còn tiết ra chất kháng khuẩn. Phía trong biểu bì lả lớp bì, là nơi chứa các mao mạch. Vi sinh vật có thể theo các vết xước xâm nhập vào mao mạch sau đó nhiễm vào tuần hoàn. Tuy nhiên, đướỉ lớp da cũng có các tế bào lympho của đa (gọi là SALT - skin associated lymphoid tissue) ỉàm nhiệm vụ bát giữ vi sinh vật xâm nhập, không cho chúng vào tuần hoàn. Một trong các tế bào SALT là tế bào Langerhans. Đây là tế bào tua ở biểu bì có khả năng bắt giữ và tiêu diệt kháng nguyên theo cơ chế thực bào. Tế bào này được vận chuyển vào hạch lympho nằm gần da, tại đây chúng được chuyển hóa thành tế bào tua xòe ngón (interdigitating dendritic cell) làm nhiệm vụ trình diện kháng nguyên cho tế bào T hỗ trợ và hoạt hóa tế bào này. Một loại tế bào SALT khác là tế bào lympho biểu mô. Chúng nằm trong da có khả năng tiết cytokin gây viêm. Trong phần bì còn chứa nhiều đại thực bào làm nhiệm vụ tiêu diệt để ngăn cản sự xâm nhập của kháng nguyên. Niêm mạc là lớp màng nhầy bao phủ phía trong các đường hô hấp, tiêu hỏa, niệu, sinh dục...giống như da, niêm mạc cũng gồm 2 lớp: lớp biểu mô ưên bề mặt và lớp mô liên kết ở phía dưới. Tuyến nằm dưới biểu mô tiết chất nhầy bẫy vi sinh vật không cho chúng xâm nhập sâu vào cơ thể, đồng thời màng nhầy cũng tiết ra chất kháng khuẩn, ví dụ : địch cổ tử cung, tuyến tiền liệt, nước mắt có chứa Lyzozym phân giải peptidoglycan của thành tế bào vi khuẩn. Cũng giống như da màng nhầy chứa mô lympho gọi là MALT (mucosal-associated lymphoid tissue). Trong đó dáng chú ý nhất là mô lympho ở ruột (GALT - gut associated lymphoid tissue) báo gồm các tuyến, mảng Peyer. Các mô lympho tương tự cũng thấy ở đường hô hấp như BALT (bronchial associated lymphoid tissue) và ở niệu (nhưng ở niệu không có tên gọi riêng). Hệ thống MALT hoạt động theo 2 cơ chế: 1- Khi kháng nguyên rod vào bề mặt màng nhầy sẽ tiếp xúc với tế bào M. Trên bề mặt tế bào M không có dạng bàn chải hay phủ lông nhỏ nhưng lại có các nang lớn chứa các tể bào T, B và đại thực bào. Tế bào M thâu lấy kháng nguyên rồi đưa vào nang. Tại đây đại thực bào tiêu diệt kháng nguyên. 2- Tế bào M cững làm nhiệm vụ thực bào sau đó chuyển kháng nguyên vào nang lympho. Tại đây kháng nguyên gắn vào thụ thể tế bào B, hoạt hóa chúng để biệt hóa thành tế bào plasma sản xuất kháng thể IgA. Đây là kháng thể IgA tiết (slgA = secretory IgA), sau đó slgA được đưa tới ruột để tương tác với kháng nguyên kích thích sinh ra chúng.

424

Hệ hô hấp: Ở động vật có vú, hệ hô hấp hoạt động rất có hiệu quả theo các cơ chế khác nhau. Vi sinh vật cùng bụi bặm theo dòng khí vào cơ thể khi ta hít thở. Các hạt lớn (>10)im) đều bị chặn lại ở khoang mũi nhờ đám lông dày đặc. Các hạt nhỏ (<10fim) tiến sâu vảo họng, tại đây chúng bị lớp lông nhỏ bao phù màng nhầy quạt hất ra ngoài. Chất nhầy ẩm và dính cũng bẫy vi sinh vật vào khoang miệng rồi theo phản xạ khạc ra ngoài hoặc nuốt vào dạ dày rồi ra ngoài theo phân. Kháng nguyửn 0

o

o

màng nhầy

Hình 21.2: Chức năng cùa tể bào M ở màng nhầy, a - Cẩu trúc tể bào M nằm giữa hai tể bào biểu mô ở màng nhầy. Tể bào Mbẳt giữa khảng nguyên đưa vào nang, nơi chửa các tể bào B, T hỗ trợ và đại thực bào. b - Khảng nguyên được tể bào M chuyển vào nang ỉympho chửa tế bào B. Tể bào B hoạt hóa và biệt hóa thành tể bào plasma sản xuẩt sỉgA - slgA vào ruột đề phản ứng với kháng nguyên kích thích sinh ra chủng. (Theo L.M.Prescotí, J.P.Harley, D.A.Klein,2005).

42 s

Các phàn xạ hắt hơi và ho có tác dụng làm bắn không khí chứa vi sinh vật ra khỏi đường hô hấp qua mũi và miệng. Nước bọt rửa trôi vi sinh vật khỏi vùng miệng và cho xuống dạ đày. Nếu vi sinh vật tới được phế nang chúng sẽ bắt gặp quần thể các tế bào làm nhiệm vụ thực bào gọi là đại thực bào phể nang (alveolar macrophage) bẳt giữ và tiêu diệt. Đường tiêu hóa: Dịch dạ dày có độ pH rất thấp (pH 2-3), là hỗn hợp bao gồm axit clohydrit, enzym phân giải protein và chất nhầy, có khả năng tiêu diệt hầu hết các vi sinh vật, ngoại trừ nang của nguyên sinh động vật, độc tố của Cỉostridium và Staphylococcus. Tuy nhiên một số vi sinh vật nếu được thức ăn bao bọc sẽ sổng sót để đi tới ruột non. Tại đây chúng lại bị phá hủy bởi các enzym của tuyến tụy, mật, enzym ừong ruột và hệ thống GALT. Nhu động ruột cũng có tác dụng loại bỏ vi sinh vật. Màng nhầy ruột chứa các tế bào Paneth sản ra Lyzozym và các peptit có tên là crytin. Crytin là chất độc đối với nhiều loại vi khuẩn. Đường niệu và sinh đục: Bình thường đường niệu từ thận đến niệu quản và bàng quang đều vô trùng. Nước tiểu cũng vô trùng. Dòng nước tiểu rửa ừôi vi khuẩn bám vào thành niệu quản. Nước tiểu diệt được một số loại vi khuẩn là đo cỏ pH thấp, do sự có mặt của ure và một sổ chất như axit uric, axit hippuric, indican, axit béo mucin và enzym. Niệu đạo nam (dài khoảng 20cm) cũng ià rào cản ngăn không cho vi sinh vật vào bàng quang. Niệu đạo nữ ngẳn hom (khoảng 5cm) nên tỷ lệ nhiễm trùng đường niệu ở nữ thường cao hơn ở nam khoảng 14 lần. Âm đạo lại có cơ chế bảo vệ khác. Estrogen kích thích biểu mô tăng cường tiết glycogen. Chất này được vi khuẩn kháng axit Lactobacillus axitophilus có tên gọi là trực khuẩn Dôderlein phân giải tạo ra axit lactic. Thông thường trong lml dịch âm đạo có 108 vi khuẩn này. pH 3-5 của dịch âm đạo là bất lợi cho sinh trưởng của nhiều vi khuẩn. Dịch nhầy cổ tử cung cũng có tính khảng khuẩn. Nước mắt: Nước mắt do tuyển lệ tiết ra có tác đụng rửa trôi bụi bặm chứa vì sinh vật ừong mát. Nước măt còn chứa các chẩt kháng khuần như Lyzozym, lactoferrin và slgA. 2L U . 2. Hàng rào hổa hẹc Động vật cỏ vú được trang bị vũ khí hỏa học để chổng lại vi sinh vật xâm nhập. pH thấp ở da, dịch âm đạo, dịch đạ dày ...ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật. Lyzozym trong nưởc bột, nước mắt, dịch âm đạo phá hủy thành tể bào vi khuẩn. Protein gắn sắt như lactoferrin làm giảm ỉượng sẳt trong máu, làm thiếu hụt sắt cần cho sinh trưởng của vi sinh vật. Màng nhầy tiết lactoperoxitaz là enzym tổng hợp superoxit rất độc đối với nhiều vi sinh vật, sau nữa nhiều vỉ khuẩn superoxit dismutaz biến superoxit thành H20 2 có khả năng diệt khuẩn.

426

Ngoài ra máu, dịch bạch huyết và một số dịch của cơ thể còn chứa bacteriocin, betalysin và một số polypeptit khác. Một số vi khuẩn có khả năng tiết ra chất kháng sinh có bản chất ỉà peptit hay protein, gọi là bacteriocin có khả năng diệt khuẩn, ví đụ E.colì tiết ra colicin hay Staphylococcus tiết ra staphyococcin. Colicin có thể bám vào receptor đặc hiệu trên màng tế bào để gây tan bào hoặc gây rối loạn quá trình tạo năng lượng. B-lysin là một polypeptit dạng cation do tiểu cầu tiết ra có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn Gram (+) bằng cách làm rối loạn màng tế bào chất. Các polypeptit dạng cation khác như leukin, plakin, cecropin và phagocytin. Một số polypeptit chứa kẽm do tuyến tiền liệt tiết ra là yếu tố kháng khuẩn quan ừọng. 21.1.1.3. Hàng rào vi sinh vật Cơ thể người ta luôn có các vi sinh vật đến cư ngụ, tạo thành một khu hệ phức tạp và cân bằng trong các xoang cơ thể, trong đường tiêu hóa, sinh dục, trên da. ..Chúng được tạo lập từ khi mới lọt lòng đến lúc trưởng thành, số lượng các tế bào vi sinh vật ở cơ thể lên đến 1014 trong khi tổng số tế bào của cơ thể người là 1013. Ở người khỏe mạnh, các vi sinh vật này không những không gây bệnh mà nhiều khi còn có lợi cho cơ thể. Chúng là bạn đồng hành của con người. Chúng chiếm trước các vị trí không cho các vi sinh vật gây bệnh đến sau bám vào, chúng tiết ra các chất kháng khẩn hoặc lảm giảm pH môi trường, tạo điều kiện bất lợi cho sự sinh trưởng cùa các vi sinh vật gây bệnh. Tuy nhiên do một nguyên nhân nào đỏ, nếu thế cân bằng bị mất, một số vi sinh vật của cơ thể cỏ thể tận dụng cơ hội để phát triển trội hom các vi sinh vật khác thì lúc đó chúng có thể trở thành tác nhân gây bệnh. Các vi sinh vật này gọi là vi sinh vật cơ hộì và các bệnh đo chúng gây ra gọi là bệnh cơ hội. Ví dụ Candida albicans cũng là thành viên của khu hệ vi sinh vật bình thường trong âm đạo. số lượng của chúng không vượt quá mức chọ phép do bị kìm hâm bởi Lactobacillus. Vi khụẩn này tiết axit lactic, làm giảm pH, ngăn cân sự phát triển mạnh của Candida albicans. Khi sử dụng chất kháng sinh chống vi khuẩn nhưng không chống được nấm thi số lượng Lactobacillus sẽ giảm đi, tạo điều kiện cho Candida albicans phát triển mạnh và gây viêm loét âm đạo. Vi sinh vật trong đường tiêu hóa còn tiết ra vitamin (ví dụ vitamin K) cung cấp cho cơ thể. 21.1.1.4. Viêm cấp không đặc hiệu Viêm là đáp ứng không đặc hiệu quan trọng nhằm khu trú tác nhấn gầy bệnh không cho chúng lan rộng ra. Đặc điểm của viêm đa dược mô tả cách đây 2000 năm, bao gồm 4 triệu chứng kinh điển là đỏ, nóng, sưng, đau.

• Đáp ứng viêm bắt đàu khi tế bào của mô bị tổn thương tiểt ra tín hiệu hóa học (các chất hóa học trung gian gây viêm) để hoạt hỏa dòng tế bào nội mô (endothelium nằm sát mạch máu - hình 21.3). • Trong mao mạch có một loại phân tử kết dính tế bào gọi là selectin. Chúng xuất hiện trên bề mặt tế bào nội mô thành mạch. Các chất này hấp dẫn bạch cầu trung tính và gắn một cách ngẫu rihiên các bạch cầu này vào các tế bào nội mô, rồi từ từ lăn trên mặt tế bào nội mô. Khi làn, bạch cầu tiếp xúc với các chất hóa học trung gian gây viêm. Các chất hoạt hóa (thụ thể kết dính) nằm trên mặt bạch cầu trung tính gán với các phân tử kết dính nội mô, ví đụ phân tử kết dính nội bào (ICAM-1-intracellular adhension molecule) và phân tử kết dính tế bào mạch (1) (VCAM-1: vascular cell adhension molecule-1) làm cho bạch cầu trung tính dính vào tế bào nội mô nên ngừng lăn. Động tác này làm cho bạch càu trung tính thay đổi hình dạng nên dễ chui qua kẽ thành mạch, di chuyển theo dịch mô tới các vị trí tổn thương để tấn công mầm bệnh và các chất ngoại lai khác gây phá hủy mô. • Bạch cầu trung tính và các bạch cầu khác được hấp đẫn tới vị trí viêm nhờ các chất hóa hướng động do vi khuẩn, tế bào mast và tế bào mô tổn thương tiết ra. Tùy mức độ tổn thương mà theo chân bạch cầu trung tính còn có các loại bạch càu khác như tế bào mono, đại thực bào và tế bào lympho vào cuộc. • Các chất trung gian gây viêm do tế bào mô tổn thương tiết ra, làm giảm pH dịch nội bào xung quanh. pH axit hoạt hóa enzym kallikrein dùng để tách bradykinin từ chuồi tiền chẩt. Bradykinin gắn vào thụ thể ở thành mạch, mở khe gian bào làm cho dịch và các bạch cầu chui qua mạch vào vị trí viêm. Brađykinỉn gán vào tế bào mast trong mô ỉiên kết năm ờ mao mạch, hoạt hóa tế bào mast, làm cho ion Ca** xâm nhập, dẫn đến làm vỡ bọng trong tế bào mast, giải phóng các chất hoạt mạch như hỉstamin. Nếu các dây thần kinh trong vùng viêm bị phá hủy thì sẽ tiểt ra chất p để gán vào tế bào mast, làm tăng sự tiết chất hoạt mạch. • Histamin gây dãn mạch (làm cho khe gian bào rộng ra) tạo điều kiện cho bạch cầu, kallikrein, tiền chất bradykinin thoát ra ngoài gây sưng. Sau đỏ bradykinin bám vào tế bào sát mao mạch kích thích chúng sản ra prostaglandin (PGE-2 và PGE-2a) làm sưng vùng bị nhiễm. Prostaglandin cũng gắn vào đầu dây thần kinh, kích thích và gây đau. • Sự thay đổi tính thấm màng sinh chất cùa tể bào mast làm hoạt hóa photpholipaz A2 là enzym tách axit arachidonic khỏi photpholipit màng tế bào. Tùy thuộc vào typ tế bào mast, từ axỉt này có thể tạo ra prostaglandin và tromboxan A2 nhờ enzym cyclooxyaz và tạo ra leukotrien nhờ enzym lipoxyaz. Prostaglandin và tromboxan A2 là chẩt gây co thắt cơ trơn phế quản. Leucotrien là chất phản ứng chậm của phản vệ (SRS —slow reacting substance of anaphylaxis), có khả năng gây co thắt phế quản gấp 100 - 1000 lần so với histamin và prostaglandin.

428

Tính Ihấm Ihătìl) mạch bình ihườnp

'linh iliấm (hành mạch lcbi h) viỄro

Chui (]UÚ tltuiih rnadt

Tiếp XỂC ugầu nhtèu

Quá ưìttli Uy ra irung tnạcb

Hoại h ó a / „ _

Holt M« back
Chất trang ỊỊỈaa I ( gây viêm kích thích xuy£n mạch

Hình 21.3: Các sự kiện xẩy ra trong viêm cấp: a) Viêm gậy giãn mạch, dỏng máu dồn vào động mạch nhỏ làm cho đường kinh to ra Vùng viêm bị xưng (xung hưyểt). b) Bình thường khe gian bào giữa hai tể bào nội mô cùa mạch đủ hẹp không cho dịch và các phần tử ỉớn lọt qua. Khi bị viêm, khe rộng ra làm cho dịch và các phân từ lớn rò ri vào dịch mô, gậy sung.

429

c) Bình thường bạch cầu (ví dụ bạch cầu trung tính) nằm trong mạch, khi bị viêm seỉectin và integrin ỉàm chn bạch cầu dính vào thành mạch, thay đồi hình dọng, thò “chân già " chui qua khe gian bào (xuyên mạch). d) Sau khi chui qua thành mạch các bạch cầu bị hấp dẫn bởi các chất hóa hướng động, tập trung tới vùng viêm đ ể làm nhiệm vụ thực bào, tiêu diệt các vi sinh vật và các tể bào mô chểt.(TheoL.M .Prescoít, J.p.Harley, D.A.KỈein,2005).

Trong viêm cấp mầm bệnh bị trung hòa hoặc loại trừ đo các nguyên nhân sau: • Sự giãn mạch làm máu đồn tới mang theo bạch cầu và các yếu tổ kháng khuẩn tới vùng nhiễm. • Máu dồn đến làm tă n g nhiệt độ kích thích đ áp ứng viêm. • Tạo ra các đám tơ huyết ngăn chặn sự lây lan của vi sình vật, khu trú chung tại chỗ bị tổn thương. • Bạch cầu tập trung tại vùng viêm để làm nhiệm vụ thực bào. Ngoài ra, các chất hóa học cũng kích thích tủy xương sản ra bạch cầu trung tính và bạch cầu hạt.

Vị trí viỗm phá hủy mô nhỉỗm khuẩn Bổ ihể C5a, C3a Bấp (fog mỉền Uịch

Các chết hồa httông động: Các chất trong gian gẫy vịẻm, hjslamin. prostaglandin và leukoỉricỉi.

21.1.2. Miễn dịch đặc bìệu Miễn dịch đặc hiệu còn gọi là miễn dịch thu được là trạng thải miễn dịch khi cơ thể đáp ứng lại một cách đặc hiệu với kháng nguyên. Đáp ứng miễn dịch là kết quả của sự hợp tác rất chặt chẽ, phức tạp và hài hòa giữa các tế bào và các phân tử của hệ thống miễn dịch. Hệ thống miễn dịch đặc hiệu ở động vật có xương sống có 3 chức năng chính:

1. Nhận diện bất kỳ “kẻ” nào được coi là lạ đối với cơ thể. 2. Đáp ứng lại (đánh trà) “kẻ xâm nhập” ấy. 3. Ghi nhớ “kẻ xâm phạm”.

• Sự nhận diện mang tính đặc hiệu cao. Hệ thống miễn dịch của cơ thể phân biệ được các vật lạ, các tế bào ung thư, tế bào nhiễm virut, nhận diện được các protein và tế bào của mình (self), các protein và tế bào không phải của mình (nonselí)-

Hình 21.4: Các loại miễn dịch thu được. • Sau khi nhận diện là giai đoạn đáp ứng. Hệ thống miễn địch tuyển mộ các tế bào và các phân tử phù hợp để tấn công “kẻ xâm phạm”. Hiện tượng này gọi là đáp ứng hiệu ứng (effector respond). Đáp ứng này nhàm loại trừ vật lạ hoặc biến chúng thành vô hại đối với vật chủ, do đó ngăn chặn được bệnh. • Nếu tác nhân gây bệnh xâm phạm lần sau thỉ hệ thống miễn dịch sẽ nhớ để đáp úng lại một cách nhanh và mạnh hơn. Miễn dịch đặc hiệu được chia làm hai loại là miễn dịch thể dịch (còn gọi là miễn địch qua trung gian kháng thể) và miễn dịch tế bào (hay miễn dịch qua trung gian tế bào).

431

Hình 21,5: Hoạt hóa tế bào mast và sự tạo thành các chất trung gian của tể bào mast dẫn đến viêm (Theo L.M.Prescott, J,p.Harley, D.A.KÌein,20Q5). Miễn dịch thể dịch dựa ừên sự hoạt động của kháng thể (protein hòa tan trong thể dịch của cơ thể và có ừên màng tế bào B). Khảng thể lưu động gắn đặc hiệu với vi sinh vật, độc tố do chúng sinh ra và virut ngoại bào để trung hòa hoặc làm tan chúng theo một cơ chế riêng. Miễn dịch tế bào dựa ừên sự hoạt động của các loại tế bào T đặc hiệu tấn công trực tiếp tế bào nhiễm virut, tế bào ung thư, các tế bào của mô ghép.. .Tế bào T có thể làm tan

432

các tế bào này hoặc tiết ra cảc chất hóa học gọi là cytokin để tăng cường đảp ứng miễn dịch. Miễn địch thu được chia ra thành miễíi dịch thu được tự nhiên và miễn dịch thu được nhân tạo, có thể là chủ động hay thụ động. Miễn dịch thu được tự nhiên chủ động được hình thành khi có sự xâm nhập của kháng nguyên, ví dụ khi bị nhiễm khuẩn. Hệ thống miễn dịch đáp lại bằng cách sản ra kháng thể và hoạt hỏa các tể bào lympho để làm bất hoạt hoặc phá hủy khảng nguyên. Miền địch có thể tồn tại suốt đời (ví dụ đậu mùa) hoặc chỉ vàỉ năm (ví đụ uổn ván). Miễn dịch thu được tự nhiên thụ động được hình thành khi truyền kháng thể từ cá thể này cho cá thể khác. Ví dụ kháng thể miễn dịch của mẹ truyền sang thai nhi. Một sổ kháng thể của mẹ cũng có thể truyền cho con ở thời kỳ đầu qua dòng sữa non. Điều này rất cần thiết vì hệ thống miễn dịch của bé chưa hoàn thiện để có thể tự lập. Tiếc rằng loại miễn dịch này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, trong vài tuần hoặc vài tháng. Miễn dịch thu đuợc nhân tạo chủ động được hình thành khi đưa vacxin vào cơ thể để tạo đáp ứng miễn dịch hoặc đưa cáọ tế bào lympho đã hoạt hóa. Miễn dịch thu được nhân tạo thụ động được hỉnh thành khi tiêm vào cơ thể kháng huyết thanh (huyết thanh chứa kháng thể). Đây là hành động chi viện có tác dụng ngay, nhưng thòi gian sống của kháng thể rất ngán, chi mấy tuần hoặc mấy tháng. 21.2. CHÁT SINH MIẺN DỊCH VÀ KHẢNG NGUYÊN

21.2.1. Chất sinh miễn dịch (immunogen) Là chất cỏ khà năng tạo ra một đáp ứng miễn dịch. Tất cả các chất sinh miễn dịch đều là kháng nguyên, nhưng cỏ một số kháng nguyên không phải là chất sinh miễn dịch. Chúng là kháng nguyên không trọn vẹn và được gọi là hapten, Bất kỳ chất nào liên kết được với kháng thể (KT) hoặc thụ thể tế bào T (TCR) một cách đặc hiệu đều được gọi lả kháng nguyên (antigen-KN). Ba điều kiện của kháng nguyên là: - Tính lạ (nonself): Chất được coi là KN trước hết phải là chất lạ. Cơ thể không tạo đáp ứng miễn dịch (ĐƯMD) đối với KN bân thân. Trước khi sinh, cơ thể rà soát các protein, các phân tử cùa mình và loại bỏ các tế bào T đặc hiệu vớỉ KN của minh, chỉ giừ lại các tế bào T phản ứng lại với các KN lạ. - Khối lượng phân từ đủ lớn: KN thưòng có khối lượng phân tử >10000Da. Nếu nhỏ hơn thì khả năng sinh mỉễn dịch yếu hoặc không có.

433

-

cấu trúc phân tử phức tạp: Một số chất như polysacarit có khối lượng lởn nhưng

khả năng sinh ĐƯMD yếu vì có cấu tạo đom giản do cấu trúc lặp đi lặp lại, trong khi hapten có khối luợng phân tử nhỏ nhưng nếu gán với protein thì lại ưở thành chất sinh miễn dịch.

21.2.2. Kháng nguyên Không phải toàn bộ phân tò KN nhận diện và liên kết với phân tử KT hoặc TCR mà chỉ có một phần nhất định của KN gọi là quyết định kháng nguyên (antigenic determinant) còn gọi là epitop, mới kết hợp vởị phần tương ứng nằm trên KT, gọi là vị trí kết hợp kháng nguyên hay paratop hoặc với TCR. Sự kết hợp giữa paratop và epitop mang tính đặc hiệu cao giống như enzym với cơ chất hay khóa với chìa. * Các loại kháng nguyên a. Theo thành phần hóa học Dựa theo thành phần hớa học người ta chia ra K.N protein, polyxaccarit, ỉipit, axit nucleic. Trong đó protein luôn là KN mạnh nhất vỉ vừa có khối lượng phân từ lớn, vừa có cấu trúc phức tạp. b. Theo nguồn gốc • KN đồng loài (alloantigen) là các KN khác nhau ở các cá thể trong cùng một loài, do cỏ sự khác biệt đi truyền. Ví dụ KN nhóm máu ABO, • KN khác loài (heteroantigen) là KN chung cho mọi cá thể của nhiều loài hay nhiều chủng vi sinh vật, Ví dụ albumin của người và thỏ. • Tự kháng nguyên là KN của bản thân cơ thể kích thích để tạo tự kháng thể, gọi là hiện tượng tự miễn. c. Siêu khảng nguyên (superantigen) Các KN có khả năng đáp ửng kích thích ĐƯMD cực mạnh thì gọi là siêu KN. Siêu KN kích thích không đặc hiệu tế bào T gây tăng sinh nhờ vừa liên kết với bề mặt ngoài của phân từ MHC-II của tế bào trình diện KN vừa gắn với TCR của tế bàọ T mà không mà không cần phải nhờ tế bào trình điện kháng nguyên (APC) chế biến. Ví dụ điển hình của siêu KN là độc tố tụ cầu gây ngộ độc thực phẩm. Siêu KN gây ra triệu chứng là do kích thích tế bào T thoát ra một lượng lớn cytokin.

434

APC (fcJTB)

Tế M o t

Hình 21.6: Siêu kháng nguyên. Hầu hểt thụ thể KNphổ biển cùa tể bào T ỉà TCR. Siêu KN một mặt gắn với Vậ của TCR, một mặt gắn với MHC-II (a.i) nên có thể hoạt hóa tể bào T mà không cần phải được tế bào APC ché biến như ở cảc KN bình thường. (Theo LM.Prescott, J.P.Hơrỉey, D.A.KỈeÌn,2005). d. KNphụ thuộc tuyển ức (gọi tắt ỉà KN phụ thuộc T - Thymus dependent antigen) Là loại KN phải có sự hỗ trợ của tế bào T mới kích thích được tế bào B biệt hóa thành tế bào plasma để sản xuất KT. Phần lớn KN đều là KN phụ thuộc T. KN không phụ thuộc T là KN không cần có sự hỗ trợ của tế bào T cũng có thể kích thích tế bào B biệt hóa thành tế bào plasma sản xuất KT, do vậy vẫn kích thích tạo KT ở cơ thể không có tuyến ửc hoặc không còn tuyến ức. Trên phân tử có nhiều quyết định KN trùng lặp, thường có bản chất là polysacarit (ví dụ polysacarit của phế cầu khuẩn typ III) là KN không phụ thuộc tuyến ức. KT sinh ra bởi KN này thuộc lớp IgM. e, Tá chẩt (adjuvant) Là các chất trơ. Ví đụ hydroxit nhôm, parafĩn...khi trộn với kháng nguyên sẽ tăng cường đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên đó. / Hapten Là phân tử có khối lượng thấp chỉ có thể trở thành chất sinh miễn dịch nếu kết hợp với chất mang phù hợp.

435

21.3. CÁC C ơ QUAN CỦA HỆ MIÊN DỊCH

21.3.Ỉ. Các cơ quan lympho trung tâm Các tế bào nguồn (còn gọi là tế bào gốc) từ tủy xương không khác nhau về hình thái, chúng vào tuần hoàn tới cư trú tại cơ quan lympho trung tâm, đó là tuyến ức và túi Fabricius (ở gia cầm) hoặc cơ quan tương đương túi (ở động vật có vú). • Tại đây chúng biệt hóa và tăng sinh không phụ thuộc bởi KN. • Dòng tế bào nguồn nếu đi vào tuyến ức sẽ được biệt hóa thành tế bào T, còn nếu đi vào túi (Bursa) Fabricius sẽ được biệt hóa thành tể bào B (B=Bursa). Ở người và động vật có vú không có túi Fabricius thi tủy xương và mô bạch huyết ờ thành ruột (mảng Peyer) được coi là tương đương túi Fabricius. 21.3.1.1. Tuyển ức Tuyến ức là khối dẹt gồm 2 thùy nằm sau xương ức. Tuyến ức xuất hiện sớm nhất so với các cơ quan lympho khác, đạt ữọng lượng tương đối lớn ở thòi kỳ phôi, sau khi trẻ ra đòi tiếp tục lớn và đạt trọng lượng cao nhất (30-40g) ở tuổi dậy thì, sau đó thoái hóa dần, đến khi già chỉ còn những đám lympho biểu mô. Tuyến ức được chia làm hai phần: vỏ và tủy • Vìrng vỏ: chứa phần lớn tế bào tuyến ức, mật độ dầy đặc. Vùng vỏ chứa tế bào Iympho, nhiều tế bào biểu mô và một ít đại thực bào. Các tế bào này làm lá chắn ngăn chặn sự xâm nhập của kháng nguyên. • Vùng tủy: chủ yếu chứa các nguyên bào ỉympho, rất hiếm đại thực bào và chứa cấu trúc đặc biệt gọi là thể Hassall. Thể Hassall gồm các tế bào biểu mô dẹt xếp đông tâm. 21.3.1.2. Tủi Fabricius Là cơ quan lympho trung tâm chỉ có ờ gia cầm, nằm gần hậu môn, là noi biệt hóa tế bào nguồn thành tế bào B. Động vật có vú không cỏ túi Fabricius nên sự biệt hóa tế bào B xảy ra ngay trong tủy xương.

21.3.2. Các cơ quan ỉympho ngoại vỉ Các tế bào T và B sau khi chín sẽ được vận chuyển đến các cơ quan lytnpho ngoại vi để tiếp xúc với KN thực hiện đáp ứng miễn địch, bao gồm các cơ quan có vỏ bọc (lách, hạch, lympho) và không có vỏ bọc (mảng Payer, hạch hạnh nhân ở họng, các mô lympho ở dưới da, dưới niêm mạc). 21,3,2.1.

Lách: là cơ quan lympho ngoại vi lớn nhất, là nơi bẫy KN vào theo đường máu

và là nơi chính tạo KT. Lách được chia ra thành các vùng:

436

- Vùng tủy đỏ: có chức năng tiêu hóa hồng cầu và các tế bào hư hại mà không gây miễn dịch. - Vùng tủy trắng: có hai loại cấu trúc (1) Cấu trúc dạng ống: các tể bào lympho T dọc theo động mạch bè, gọi là khu vực phụ thuộc tuyến ức. (2) Những nang chứa các tế bào lympho B, gọi lá khu vực không phụ thuộc tuyến ức. KN bị tể bào lưới ở vùng rìa bắt giữ, chế biến, đưa đển vùng phụ thuộc tuyến ức trình cho tế bào T và hợp tác với tế bào B để tạo KT. 21.3.2.2. Hạch lympho: hình hạt đậu nằm rải rác khắp cơ thể hoạt động như hệ thống sàng lọc, thu giữ KN theo đường bạch huyểt, di chuyển chậm theo các mạch hẹp, dích dắc để tăng sự tiếp xúc với đại thực bào và các tế bào lympho. Hạch chia thành 3 vùng: - Vùng vỏ: có các nang lympho chứa chủ yểu tế bào B, một ít lympho T và các tế bào tua. - Vùng vỏ sâu: nằm ở khoang giữa, chứa lympho T và đại thực bào tạo khu vực phụ thuộc tuyển ức. - Vùng lối: vùng chứa lẫn lộn các lympho T, B, đại thực bào và tương bào (tế bào plasma). Hạch là nơi thu gom và tập trung KN từ các vùng khác nhau theo mạch bạch huyết và là nơi sản xuất kháng thể rồi chuyển vào hệ tuần hoàn máu. 21.4. KHÁNG THÉ Kháng thể (KT-antibođy): là các gama globulin (Ig) có trong huyết thanh của động vật có khả năng liên kết đặc hiệu với KN đã kích thích sinh ra nó. Ở đây ta chỉ xét các kháng thể miễn dịch (KTMD).

21.4.1.Cấu trúc của KTMD Tất cả các KT đều có cấu trúc giống nhau gồm 4 chuỗi polypeptit. Hai chuỗi nhẹ kí hiệu là L và hai chuỗi nặng kí hiệu là H, gắn với nhau bởi càu disulíua (S-S) (hình 21.7). Chuỗi nhẹ: Trật tự axit amin của hai chuỗi nhẹ giống nhau và được chia làm hai vùng. Vùng có trật tự axit amin thay đổi gọi là vùng biến đổi (kí hiệu Vl), năm phía đầu axnin (-NH2) của phân tử. Vùng có trật tự không thay đổi gọi là vùng cố định (ký hiệu CL) nằm phía đầu cacboxyl (-COOH). Trật tự axit amin vùng cố định của chuỗi nhẹ luôn giống nhau ở tất cả các lớp kháng thể, hoặc theo trật tự lamda hoặc theo trật tự kappa. Ngược lại, trật tự ở vùng biến đổi luôn khác nhau, kể cả ở các kháng thể do cùng một tế bào sinh ra.

437

VỊ trí k cì hợp khíing Iiguvóiì

Vímg bún lổ

VỊ trí kôì liợp klìáng nguvCu

V ùng

bio'll tlrff

___

Vùng

cỏ' .định VỊ trí k ít liạp killing tiguyõVi

(XX)II

Hình 21.7: cẩu tạo của kháng thể Mỗi chuỗi n ặ n g c ó 4 v ù n g a x it am in : m ộ t vùng biến đổi v à ba vùng cố định. Vùng biến đổi (kỉ hiệu là V h) nàm phía đầu amin đổi xứng vói vùng biển đổi của chuỗi nhẹ tạo thành vị trí kết hợp KN (paratop). Vùng cố định nằm phía đầu cacboxyl, chia Chuỗi nặng:

làm 3 v ù n g n h ỏ có k í h iệ u C h I , C h2 v à C h3. G iữ a v ù n g C h I v à C h 2 là v ù n g k h ớ p nối có

tác dụng như bàn lề làríi cho phân tử có hỉnh chữ Y và cỏ thể điều chinh cho hai paratop . gắn với epitop của KN. i u iu iịỊ -- -----------

V Ị Ir í k í l hợp kháng ngiiyOn

Chuỗi nhẹ

Vfing trội tự í»ùt am in thay
Hình 21.8: Các axit amin nằm xa nhcạt trên cùng một chuôi cô thể gắn với nhau nhờ cầu nổi S-S để tạo vùng gấp (domain).

Dưới tác dụng của papain, phần tử KT bị phân giải tại vùng bản lề thành 3 mảnh: hai mảnh nhỏ chứa chứa toàn bộ chuỗi nhẹ và một nửa chuỗi nặng có đầu amin. Đây là nơi gán với KN và được gọi là mảnh Fab (Fragment of antigen binding). Mảnh còn lại của chuỗi nặng phía đầu cacboxyl có thể kết tinh được gọi là mảnh Fc (Fragment crystalizable). Mảnh này có thể liên kết với đại thực bào, tể bào B và bổ thể. Dưới tác dụng cùa pepxin thu được hai mảnh: Mảnh lớn gần như một kháng thể trọn vẹn với hai paratop và mành nhỏ thuộc phần Fc.

21.4.2. Các lớp kháng thể Có 5 lớp kháng thể mang tên chuỗi nặng là IgG, IgM, IgA, IgD và IgE. Tính chất và đặc điểm của các kháng thể miễn dịch được ghi ở bảng dưới đây: Đặc điếm

IgG

IgA

IgM

IgD

IgE

Tỉnh chat vật lý Khối lượng phân tử (xlOOODa)

150

160

90

180

19

Sổ phân tử/đơn vị

1

1 hoặc 2

5

1

1

Chuỗi nặng

r

a

2

s

Chuỗi nhẹ

IỈK

MK.

V UK

X/K

-

J+/-S

J

-

>

Yi.Y2.Y3.74

0C] a2

-

-

-

10g/l (66%, 23%, 7%, 4%)

2gfl (85%, 15%)

1,2 g/1

0,03 g/1

200 ng/ml

Các chuỗi peptit khác Dưới lóp Nồng độ trong huyết thanh

Hoạt tính sình học Cố định bổ thể Con đường cổ điển Con đường nhánh Gắn với ĐTB Gắn với tế bào mast Gắn với lympho hạt lém Gắn với bạch cầu axit

ri.Y2.Y3 +

-

++

-

-

+

-

-

-

n.73

+

-

-

+

-

-

'

-

++

n.Y3

-

-

-

-

-

+

ri.r3.Y4

- "

Yl.Y2.r3.Y4

+

-

-

+

Qua niêm mạc

-

++

+

-

-

Qua nhau thai

Yi.Y2.73.Y4

-

-

-

-

Khuếch tán ngoài mạch

439

IgG chiếm 80% tổng Ig trong huyết thanh người bình thường, cấu tạo gồm chuồi nhẹ Kappa hoặc lamda và hai chuỗi nặng gama. Ở người Việt nồng độ IgG trong máu là 1400 mg/100ml. IgG là kháng thể duy nhất được truyền tò mẹ sang thai nhi qua nhau thai. IgG giữ vai trò chính bảo vệ cơ thể chống tác nhân gây bệnh, đảm nhiệm các chức năng opsonin hóa (giúp đại thực bào bẳt giữ K.N), hoạt hỏa bổ thể, gây độc qua trung gian tế bào phụ thuộc KT (giúp tế bảo K diệt tế bào đích), trung hòa ngoại độc tố (độc tố uốn ván, độc tố do Clostridium botulinum gây ngộ độc thúc ăn, nọc rắn, nọc côn trùng...), gây ngưng kết vi khuẩn và trung hòa virut.

C huỗi J

Hình 2ỉ. 9: cẩu trúc IgM, kháng thể có kích thước ỉớrt gồm năm phân từkểt hợp với nhau (pentame) thành hình sao, tạo ra 10 vị trí kết hợp kháng nguyên. - IgM chiếm 5-10% trong huyết thanh ở người bình thường. IgM có cấu tạo gồm hai chuỗi nhẹ kappa hoặc lamda và hai chuỗi muy. Năm globulin chụm lại với nhau thành phân tử lớn hình sao năm cánh nhờ cầu nối disulfua và chuỗi protein J, do vậy cỏ tới 10 paratop. IgM xuất hiện sớm, thực hiện các chức năng như hoạt hỏa bổ thể, ngưng kết hồng cầu cùng loài trong trường hợp nhóm máu ABO, ngưng kết vi khuẩn. - IgA có cấu tạo gồm 2 chuỗi nhẹ kappa hoặc lamda với hai chuỗi nặng alpha. Có hai loại: IgA trong huyểt thanh chủ yểu ở dạng mônome và IgA tiết (slgA) luôn có dạng dime, có ừong dịch tiểt của cơ thể như sữa, nước bọt, nước mát, trong dịch nhầy đường tiêu hóa, sinh đục, hô hấp. IgA monome làm nhiệm vụ hoạt hóa bổ thể theo con đường nhánh. IgA tiết chống vi khuẩn ừên bề mặt niêm mạc gây nhiễm trùng đường hố hấp, tiêu hóa đồng thời chống KN nhóm máu ABO.

440

Hình 21.10: cấu trúc ỉgA íiểt. Mặc dù phần lớn IgA là monome nhưng IgA tiết là dime. - IgD có nồng độ trong máu rất thấp và cấu tạo gồm hai chuỗi nhẹ kappa hoặc lamda và hai chuỗi nặng deỉta. Hoạt tính sinh học của IgD còn chưa rõ nhưng nó có mặt trên tế bào B làm thụ thể cho KN. - IgE có nồng độ trong huyết thanh rất thấp và có cấu tạo gồm hai chuỗi nhẹ kappa hoặc lamda và hai chuỗi nặng epsilon. IgE tham gia vào quá mẫn tức thì (hay dị ứng) bằng cách gán phần Fc với tế bào mast (đuỡng bào) và phần Fab với kháng nguyên. Tế bào mast được hoạt hóa sẽ giải phóng các chất hoạt mạch như histamỉn, leukotrien, serotonin gây giãn mạch và tăng tính thẩm thành mạch.

21.4.3. Cơ chế hình thành kháng thể miễn dịch Việc hình thành KT là một quá trinh rất phức tạp đòi hỏi có sự tham gia của nhiều tế bào: tế bào T, tế bào B và tế bào trình điện KN (APC) và phải có mối tương tác giữa các phân tử bề mặt (TCR, MHC, kháng thể bề mặt tế bào B). Khi KN vào cơ thể sẽ theo dòng máu và hệ bạch huyết vào hạch lympho, iách và gan. KT sẽ được tạo thành ở lách và hạch lympho. Trước hết KN phải được APC trình diện. APC là đại thực bảo hoặc cũng có thể là tế bào B. - APC là tể bào B thông qua thụ thể là KT bề mặt sẽ nhận diện KN. KN vào tế bào rồi tiêu hóa trong endoxom. Các peptit được tạo thành sẽ kết hợp với phân tử MHC-II đi ra bề mặt tế bào để tương tác với TCR. - APC là đại thực bào cũng hoạt động như vậy nhưng không có thụ thể dành cho KN. Đại thực bào thâu tóm KN, tiêu hóa và giải phỏng peptit. Peptit cũng gán với MHC-II để đưa ra bề mặt trình diện tế bào T h như trường hợp với APC là tế bào B. Phức hợp MHC-II-KN sẽ được trình diện cho tế bào Th thông qua TCR. Phân tử MHC cũng tương tác với thụ thể CD4 trên mặt tế bào Th. Được kích thích bởi KN, tế bào

441

T h hoạt hóa và tâng sinh, sản ra interleukin để kích thích tế bào B tăng sinh và biệt hóa thành tế bào plasma sản xuất kháng thể và dòng tế bào B nhớ. Tế bào plasma chi sổng được khoảng một tuần nhưng lại sản một lượng lớn KT. Tế bào B nhớ có đời sống dài và tồn tại cả khi KN đã mất. Khi được khích thích bởi KN vào lần hai, chúng sẽ biến thành tế bào plasma để sản xuất KT nhiều nhanh chóng hơn. Đó chính là đáp ứng miễn dịch lần hai và là cơ sở của việc tiêm vacxin. Một số KN có thể kích thích tạo thành KT ở mức độ thấp mà không càn có sự tham gia của tế bào T, được gọi là KN không phụ thuộc tuyến ửc. Các KN này thường có cấu tạo đơn giản, lặp đi lặp lại như polyxaccarit. KT được tạo thành thường thuộc lớp IgM, có ái lực thấp. Tế bào B đáp ửng KN này không có trí nhớ miễn dịch. 21.4.4. T huyết chọn lọc dòng của Burnette Theo Burnette thì thông tin để hình thành KT đã phải có sẵn trong tế bào B từ trước khi có KN xâm nhập. Bằng con đường đột biến, hàng loạt loại tế bào B được tạo thành. Mỗi loại có khả năng đáp ứng với một loại KN. Trong thời kỳ bào thai, loại tế bào nào chống lại KN bản thân sẽ bị ức chế. Khi ra đời, cơ thể chỉ còn giữ lại các tế bào phản ứng lại KN lạ. Khi có KN xâm nhập, chúng sẽ chọn lọc tế bào nào phù hợp (có thụ thể phù hợp với quyết định KN) để kích thích, phân chia theo con đường gián phân tạo thành dòng. Các tế bào không phù hợp với KN thì không được kích thích để tạo đòng. Thuyết chọn lọc dòng được công nhận vì nỏ giải thích được nhiều hiện tượng miễn dịch như dung nạp miễn dịch (không tạo KT chống KN bản thân) và trí nhớ miễn dịch.

21.4.5. Cơ chế đi truyền của sự tạo thành kháng thể Một vấn đề đặt ra là làm thế nào có thể có khả năng tạo ra một lượng lớn và đa dạng các loại KT đến như vậy để đáp ứng lại các loại KN muôn hình muôn vẻ. Nếu theo quan niệm trước đây, một gen mã hóa cho một protein (hoặc một chuỗi polypeptit) thì có thể phải cần đến hàng tỷ gen mới có thể sản xuất được một lượng khổng lồ các loại KT. Điều đó vượt quá tiềm năng gen cùa cơ thể. Ngày nay vấn đề này đã được giải thích nhờ phát hiện ra sự tái sắp xếp lại các trình tự ADN và ARN xảy ra trong quá trình biệt hỏa tế bào B. Sự sấp xếp này đóng góp rất lớn vào việc tạo ra sự đa dạng của KT trong cơ thể. Muổn hiểu rõ cơ chế di truyền của sự tổng hợp kháng thể, chúng ta cần nghiên cứu chi tiết hơn cấu trúc kháng thể và sự sắp xếp lại gen. Cấu trúc kháng thể: các khảng thể khác nhau có ữật tự sắp xếp các axit amin khác nhau ờ vùng biến đổi. Trong vùng biến đổi lại có những vùng nhỏ có trật tự axit amin thay đổi rất mạnh, gọi là vùng siêu biến (HVR - Hypervariable region) chính là vị trí kết hợp với kháng nguyên.

442

Vùng biến đổi manh

Vùng biến đói chuỗi nặng

CÌIH

Vùng biến đổi của chuỗi nhc

Ch2

Vùng Vùng bi ổn ^ đổi mạnh

Hình 21.11: Biểu hiện cách sắp xếp ỉại trình iựADN mã hóa cho protein chuỗi nhẹ, K,. Vùng biển đổi của chuỗi nhẹ cũng như chuỗi nặng có 3 vùng siêu biến, được mã hóa bởi các gen vùng biến đổi (gen V) nằm ừên ADN của tế bào B ừong quá trinh chín ở tủy xương. Tại vùng siêu biến thứ 3 của chuỗi nặng còn cỏ một vùng được mã hóa bởi gen riêng gọi ]à gen D (từ chữ diversity - đa dạng) và một vùng nổi giữa vùng đa dạng (D) với vùng cố định ( C h ) gọi là vùng nói (J) được mã hóa bời gen J, ở chuỗi nhẹ không có vùng D. Vùng J nổi giữa vùng V với vùng Cl, cuối cùng là vùng cố định được mã hóa bởi các gen CL. Mỗi vùng biến đổi được mã hóa bởi hai đoạn gen (tức exon): một đoạn gen biến đổi (V) ừong đỏ có vùng siêu biển và một đoạn gen nối gọi là J (joining). Sợi ADN ban đầu dòng phôi nằm ưên nhiễm sắc thể thứ 2 chứa khoảng 40 exon V k và 5 exon J k- Trong quá trình phát triền của tể bào B ở tủy xương, nhờ sự chọn lọc ngẫu nhiên để biểu hiện một đoạn exon Jic và một đoạn exon Vfc trong mỗi tiền tể bào B, bằng cách tái sáp xếp lại ADN để có thể liên kết bất kỳ một exon Jk vói bất kỳ một exon Vk nào (tức V kI và J k2 ở hình 12). Vùng nối giữa hai exon V-J đã được tổ hợp sẽ mã hóa cho vùng HVR3 của vùng biến đổi. Ở vùng cố định của chuỗi nhẹ K, chi cỏ một exon (Ck) nằm ờ gần vùng J. Khi phiên mã, toàn bộ locut gen tạo thành ARN tiền chất sau đó được cát nối thành mARN gồm V-Jc hoàn chỉnh để mã hóa cho chuỗi nhẹ của kháng thể. Locut gen mã hóa cho chuỗi nhẹ X nằm trên NST sổ 22 và quá trình tái sắp xếp và biểu hiện của nỏ cũng giống như đối với chuỗi nhẹ K- c ỏ khoảng 30 exon Vx, 4 exon Jx và 1 exon Cx.

443

LI

VK1

12 Vk2

L3

V k3

ADN dòng phôi

Ln

V Kn

1 2

Ị,

I Sắp xếp lại

ADN của tế bào B

LI

V K1

2 3 k

3

4

ÌK

c*

4

Phiên TTiã và cắt nối ARN ị mARN

1.1vkiik2 ck Ặ Dịch mă

protein chuỗi nhẹ v«iìk2 C*

Hình 21.12: Tổ chức và sắp xếp ìạì các gen mã hỏa cho chuỗi nhẹ %. Kỉ hiệu Ck = vùng cổ định cùa chuỗi KỊ, L đoạn dẫn đầu, J - vừng nối, Vty, v%2 --- Vf
L1Vh1 U V h2

' lnVHn

0

ị

lu

ADN dòng phôi

Cfí Cị

Ll VI DJ

0,3 Cyt c* Ca2

iliiW L1V1DJ Cị,

T

cp. Cỵ I etc.

i

Phiên m ỉ và cắt nối ARN

Protein chu&i nặng

O ịi Cyl C & C al

Síp xếp lại

IXJXKHW.*

ADN cùa tế bào B '

mARN

C(i Gs

Sấp xếp lại ADN khác

ỮCDXKHk^M L1V1DJ CJ Cyt ete. II 1iM LlVlDJCg

ị

(D M UVlDJCyJ

T

I I IM

[ II w

V1DJC|Ì igM

v id ; c j

Igp

H P VID ỊCýS I*C3

Hình 21.13: Tổ chức và sẳp xểp lại gen m3 cho chuỗi nặng. Kỉ hiệu c% = vùng cồ định cùa chuôi %, L đoạn dẫn đau, J = vùng nổi, V^I, VK2 —Vk>ì~ các vừng J 4 Ằỉ /Trì. _ _ n I__ rỵ> T-_ biển đổi (Theo R. Gordon, T. Ian, 2000).

444

Trong các tế bào B chưa chín (tức các tế bào chưa được hoạt hóa bởi các KN), các sợi ARN tiền chất được cắt nối, sao cho đoạn gen vùng biến đổi được nối với đoạn gen vùng cố định CMví dụ Cy, c a, Cu, Cg hoặc c e để tạo ra các phân tử tưcmg ứng IgG, IgA, IgM, IgD hoặc IgE. * Nguồn gốc của sự đa dọng Các yếu tố đóng vai trò quan trọng để hình thành tính đa dạng của KT ở động vật có vú được liệt kê ở bàng sau: Sự đa dạng của các vùng mã hóa cho kháng thể Các gen dòng phôi

Các exon V, D và J

Sự tái sắp xếp các exon

Sự chọn lọc nẹẫu nhiên các exon V, D và J, tái sẳp xếp để biểu hiện.

Đa dạng cùa sự kết nối

Sự gắn các nucleotit sai hoặc cài xen các nucleotit vào điểm nối V-D-J.

Tái tổ hợp chuồi H và L

Sự lựa chọn độc iập các gen vùng biến đổi của chuỗi nhẹ và chuỗi nặng trong mồi tế bào B.

Đột biển xoma

Đột biến điểm trong các gen vùng biến đổi của tế bào B hoạt hóa.

Sự đa dạng được mâ hỏa trong genome lưỡng bội vả được hình thành nhờ sự chọn lọc ngẫu nhiên của các exon V, D và J trong mỗi tiền tế bào B. Hơn nữa sự đa dạng trong HRV3 được tạo thành trong quá trình liên kết các đoạn V và J hoặc V, D và J do sự tạo thành một cách ngẫu nhiên các biến dị trong trình tự nucleotit của tổ họp gen mới. Những biến dị này được tạo thành do được chèn thêm hoặc mất đi các nucleotit, dẫn đến mã hóa cho axit amin khác, tạo ra đột biến điểm, có thể làm thay đổi cấu hình của KT. Một điều cần chú ý là sự chọn lọc và tái sắp xếp của các exon chuỗi nặng V, D và J và các exon chuỗi nhẹ V và J, xảy ra hoàn toàn độc lập với nhau. Điều này dẫn đến sự đa dạng rất lớn về các vị trí liên kết KN (paratop), đưa đến sự đa dạng về tỉnh đặc hiệu của KT với KN. Ví dụ 2 tế bào B biểu hiện các vùng VH giống hệt nhau có thể nhận các vùng VL hoàn toàn khác nhau và do đó chúng đặc hiệu với các KN khác nhau. Mức độ cuối cùng của sự đa dạng xẩy ra trong các té bào B hoạt hóa và tăng sinh trong đáp ứng miễn dịch. Điều này bao gồm đột biến điểm (thay thế các nucỉeotit ừong quá trình sao chép AĐN) đặc biệt là ừong các trình tự mã hóa cho HVR có thể dẫn đến sự thay đôi các gốc axit amin gán với KN. Trong một sổ trường hợp đột bien xoma này tạo ra các tế bào B với thụ thể có ái lực cao với KN, sau đó các tế bào B này mới được chọn lọc trong trung tâm mầm để hoàn thiện thành tế bào plazma hoặc tế bào B nhớ.

445

* Sự loại trừ alen và chọn lọc dòng Sự tái sắp xếp các gen của KT trong qúa trình biệt hóa tế bào B không phải luôn thành công. Ví dụ có sự sắp lại các gen tạo thành tổ. hợp không mã hóa cho chuỗi nặng và chuỗi nhẹ hữu hiệu. Tuy nhiên mỗi tiền tế bào B có một số cơ hội tạo thành các tổ hợp có ý nghĩa do chúng có 2 alen trong mỗi gen của genome lưỡng bội, cùng vói khả năng sừ dụng 2 loại chuỗi nhẹ (kappa và lamda). Thứ tự tái sắp xếp bắt đàu với mỗi alen của chuỗi nặng và tiểp sau đó là các alen của chuỗi nhẹ kappa vả cuối cùng, nểu cần thiết là các alen của chuỗi nhẹ L Một sự tái sắp xếp đúng sẽ ngăn chặn sự tái sắp xếp khác cùng loại. Ví dụ nếu một alen của chuỗi nặng được sắp xếp thành công thì alen của chuồi nặng khác sẽ không bao giờ được sử dụng ừong tế bào B đó và một alen chuỗi lamda sẽ chỉ được sử dụng nếu cả hai đều tiến hành tái sắp sếp lại các alen chuỗi K nhưng không tạo ra tái tồ hợp hữu hiệu. Sự loại trừ alen này đảm bảo ràng tất cả các KT bề mặt (trên tể bào B) hoặc KT tiết (IgA) được sinh ra từ tể bào B đều có vùng V h và V l giống nhau và đo đó đều đặc hiệu với cùng một KN. Điều này giải thích cơ sở di truyền của các ĐƯMD đặc hiệu với KN được tăng lên bởi sự chọn lọc dòng, được mô tả ở phần 5.4. Điều đó có nghĩa là khi các tế bào lympho B có thụ thể (BCR) phù hợp nhất với epitop của KN sẽ được kích thích để hoạt hóa và phân chia tạo nhiều tể bào cùng loại, gọi là một dòng. Trong một số trường hợp có nhiều tế bào cùng được kích thích để phân chia dẫn đến đáp ứng đa dòng chứa các phân tử KT có ái lực khác nhau đối với epitop. Các KT được tạo thành trong ĐƯMD thứ cấp (lần 2) thường có ái lực cao và được ưu tiên nhân rộng tạo thành một đòng phù hợp nhất với một KN. Các đáp ứng đơn dòng (monoclonal) và ít dòng (oligoclonal) thường được coi là trường hợp đặc biệt, ví dụ ở bệnh u tủy (myelomatosis) trong quá trinh phục hồi sau ghép tủy xương hay khi lai tế bào plasma sinh KT với tế bào u tủy để tạo dòng tế bào lai đơn dòng (monoclonal hybridoma). * Kháng thể đơn dòng Trong tự nhiên, KN có nhiều epitop do đó khi đưa vào cơ thể sẽ kích thích cơ thể tạo ra nhiều KT. Muốn nhân một loại KT thì phải tiến hành tách chiết, vừa khó khăn vừa tốn kém. Năm 1975 lần đầu tiên Kôhler và Milstein mô tả phương pháp tạo KT đơn dòng bằng cách lai tế bào plasma với tế bào u tủy. Tê bào plasma có khả năng tạo KT nhưng không nhân lên được toong môi trường nhân tạo, vì chúng là tế bào đã biệt hóa tận cùng. Ngược lại tế bào u tủy cỏ thể phân chia rất nhanh, nhưng không cỏ khả năng tạo KT. Tế bào lai sẽ được ưu điểm của hai loại tế bào trên: vừa có khả năng tạo ra KT, vừa phân chia rất nhanh ữên môi trường nhân tạo.Nhưng tế bào lai này giống như các tế bào plasma đặc hiệu KN ban đầu, sẽ là đa dòng. Nhưng nếu pha thật loãng, rồi rỏ vào các giếng của bản nhựa, sao cho mỗi giếng chỉ có một tế bào riêng lẻ, rồi cho phân chia thì sẽ được một dòng tế bào có khả năng tạo ra một loại KT đặc hiệu với một loại epitop KN mong muốn. Do vậy người ta

446

định nghĩa KT đơn đòng là KT đo một đòng tế bào B sinh ra để đáp ứng đặc hiệu với một epitop KN. Ngày nay, KT đcm dòng được sử đụng rộng rãi bao gồm việc định loại vi sinh vật và xác định các tế bào biểu hiện các dấu ấn (marker) bề mặt khác nhau sử dụng trong y học thực hành, ví dụ theo dõi, quản lý các KT kháng CD3 đối với bệnh nhân ghép thận để ức chế tế bào T gây thải ghép, sử đụng để xác định doping trong thể thao, xác định liều lượng thuốc trong ngành dược. 21.5. CÁC TÉ BÀO THAM GIA VÀO ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH

# o k UỈ1 mill llffriiii lyiH’ftof t

Nmíii tòt' [jiitl cíu

m

iSMjiSTwiiMn

i

< t

' F

# A ID ija p F

fiiue&u

I♦

J V é

f

Hbugda

%

*•

/ ÌÍM tể kteh iik & N ,

l y

s

•

•

iympbo T I#1 bite lynipha B hff t trò*f ttiyến lie tióá tró*|iềy

y

\

T—

^ r ế h io p ỉa íin a

it

tfritimebaa

^

lể bảo lyrnptin r

!Tí&ỉạui*

Thifchio
lế h à n hạch cìu

Hình 21.14: Các tế bào tham gia vào ĐƯMD (Theo L.M.Prescott, J.p.Harley, D.A.KỈein, 2005).

447

Tất cả các tế bào tham gia vào đáp ứng miễn dịch (ĐƯMD) đều có nguồn gốc chung là tể bào gốc ờ tủy xương; chúng được biệt hóa để tạo thành các dòng tế bào khác nhau. - Dòng tạo máu biệt hóa thành các tế bào mono (monocyte, tiếng Hy Lạp: mono = đơn, cyte = tế bào), từ tế bào này tạo ra đại thực bào và tế bào tua, tức là các tế bào đơn nhân; các tế bào đa nhân (granulocyte) còn gọi ỉà bạch cầu nhân đa hình (PMN) bao gồm bạch cầu trung tính, bạch càu kiềm, bạch cầu axit; dòng hồng cầu tạo hồng cầu; dòng tế bào nhân khổng lồ tạo tiểu cầu. - Dòng lympho được tạo thành do các tế bào nguồn biệt hóa ờ các cơ quan lympho trung tâm. Nếu vảo tuyến ức sẽ tạo thành các tế bào T (từ chữ thymus = tuyến ức), còn nếu vào túi Bursa Fabricius thi sẽ tạo thành tế bào B. Ở động vật có vú không có túi Fabricius thì tế bào B được hình thành trong tủy xương hoặc gan bào thai. 21.5.1. Đại thực bào (ĐTB) ĐTB lả các tế bào đơn nhân có nguồn gốc từ tủy xương. Thường có kích thước lớn có khả năng thực bào, tức là bất và nuốt các phân tử lạ, kể cả các vi sinh vật. ĐTB có những hình thái khác nhau và cư trú ở nhiều nơi khác nhau. Trong huyết tương chúng ở dạng lưu động, đó là ĐTB thực sự, đóng vaĩ trò trung tâm trong ĐƯMD. Trong tế bào chất có nhiều lyzoxom chứa các enzym tiêu hóa, dễ bắt màu thuốc nhuộm dành cho esteaz không đặc hiệu, các peroxitaz và hydrolaz axit. - ĐTB tiết ra các sản phẩm sau: • Các thành phần của bổ thể C l, C2, C3SC4, C5, và các yếu tố B, D, propecdin, I, H. • Các proteaz trung tính (collagenaz, elastaz, chất hoạt hóa plasminogen). • Cytokin: Interleukin IL-1, “6, -8, -10, -12, yếu tố hoại tử ung thư a (TNF-a), yếu tố kích thích quần lạc (CSF), interferon a (IFN-a). • Các yếu tố gây đông tụ: tromboplastin mô, yếu tổ V, VII, IX, X. • Prostaglandin (PGE2, PGF2a). - Trên bề mặt ĐTB có các thụ thể: • Dành cho Fc của K.T (phàn Fab của KT gán với KN). ■Dành cho C3b (để rồi C3b lại gắn vào KN). • Dành cho lectin gắn vào đường mannoza trên thành tế bào vi khuẩn. ĐTB được biệt hỏa từ tế bào mono. Khi di chuyển tới các mô trở thành ĐTB cố định. Tùy theo từng ioại mô mà cỏ các tên gọi khác nhau, Ở phế nang thì gọi là ĐTB phế nang (alveolar), ở ổ bụng là ĐTB phúc mạc, ở dưới da là Langerhans (một đạng tế bào tua), ở gan là Kupíĩer, ở hạch lympho và lách là té bào tua, ở mô thân kinh là tế bào hình sao.

21.5.2. Bạch cầu đa nhân (PML-polymorphonuclear leukocyte) Bạch cầu (BC) đa nhân hay BC hạt cỏ nguồn gổc từ tủy xương, chiếm 60-70%. Trong máu ngoại vi, chúng có khả năng bám dính và xuyên mạch. Chúng bao gồm BC trung tính, BC ưa kiềm, BC ưa axit. Chúng không có tính đặc hiệu với KN nhưng đóng vai trò quan trọng trong viêm cấp. 21.5,2.1. BC trung tính (neutrophil) Gọi là BC trung tính là vỉ trong tế bào chất chứa nhiều bọng (hạt) nhỏ không bắt màu thuốc nhuộm kiềm hay axit, nhân tế bào có cấu tạo nhiều thùy: • Có khả năng thực bào mạnh. • Trên bề mặt có chứa các thụ thể dành cho lectin, Fc, C3b của bổ thể C3. • Trong bọng chứa các enzym myeloperoxitaz, Lyzozym, hydrolaz axit (ví dụ |3glucuronidaz, photphataz), peptit dạng cation (defensin). • Có các bọng nhỏ chứa lactoferrin, lyzozym, histaminaz. • BC trung tính cũng tiết ra các sản phẩm khác: như cytokin [IL-l, -6, -8, TNF-a, yểu tố kích thích quần lạc-(CSF), IFN-a], leukotrien [LTC4, LTD4, LTE4 (SRS)], prostaglandin (PGE2), yếu tổ hoạt hóa tiểu cầu (PAF). * Khả năng giết của thực bào ĐTB và BC trung tính đều có khả năng tiết ra các chất diệt khuẩn theo hai cơ chế: phụ thuộc oxy và không phụ thuộc oxy. Cơ chế phụ thuộc oxy bao gồm: (1) 0 2 oxitaz^

■_»

202

(superoxit)

(2) 2 0 i + 2H* supermha2’dismutaz ->

H2O 2 + *02 (singlet oxy)

(3) H2 O2 + Ơ2 * -----------► OH + OH' + ‘0 2 (oxy đom gốc hydroxyl)

(4) H20 2+ c r (hoặc ĩ') mydQperoxitaz

o c r (hoặc OI*) + H2O ( o c r = hapohalite)

(5) o c r +H2 O2 ------►'0 2 + C1‘ + H2O Oxit nitơ là hợp chất gây độc tể bào khác được tạo thành từ cơ chất là L-acginin và O2 với sự xúc tác bởi syntetaz cửa oxit nitơ. 2 acginin + 2 O 2 + 3NADPH + 3H+

+ 2NO + 2HC1 + 3NADP*

Cơ chế không phụ thuộc oxy bao gồm:

449

■

Ị^ IỆ Ig g g i§ p

M W ® £ i

v i sinh vật

í

M g á ii v à o hụ ( h í không d ặc b íộu

: :+ :

K h ả n g ih c

5 /

}

HÉh**Z (s 8\ M

Jầ ':Ê Ê sÊ ằ* *

ip)

■ t'

;
< , ' a *.

CM>ficuss'

K M a g .ã t ể

*+*+ ■ • •.

■\ ' ■ ■■■

■' -•

v à b ổ th ế C3b

. T

V ' 1 ■-■

.

fj

Hình 21.15: Cơ chế opsonin hỏa cùa ĐTB với các chấí opsonin ỉấ: á) thụ thể không đặc hiệu, b) là KT, c) C3b, d) phổi hợp cả KT và C3b (Theo L.M.Prescott, J.P.Harỉey, Đ.A.KỈein, 2005). • Lyzozym. • Các sản phẩm cửa lyzoxom (protein dạng cation như đeíensin, serprocidin), hydrolaz. • Lactoferrin. »Proteaz trang tính. Vai trò của ĐTB và BC trung tính có thể tóm tất như sau: 1.

450

Có khả năng thực bào.

2.

Tiết ra các chắt hóa học trung gian để diệt khuẩn và gây viêm.

3.

Các tế bào này khi nhận được tin hiệu hóa học (các chất hóa ứng động) sẽ tập trang ở ể nhiễm để gây viêm.

4.

Nhận dỉện tế bào đích nhờ các thụ thể bề mặt dành cho Fc của KT,lectin vả C3b.

5.

Tiêu diệt vi khuẩn nhờ tạo thành phagolyzoxom hoạt hóa cơ chế diệt phụ thuộc và không phụ thuộc oxy

21.5.2.2. Bạch cầu ưa kiềm ịbasophil leukocyte) Tế bào cỏ tỷ lệ thấp (0-2%) trong máu. Trong sinh chất chứa các hạt khác nhau về kích thước bắt màu thuốc nhuộm kiềm (xanh metylen). Các hạt này chửa các amin hoạt mạnh. Các chất này được giải phóng ra ổ viêm và VỊ trí xảy ra quá mẫn. Trên bể mặt tế bào kiềm có các thụ thể dành cho Fc cùa IgE. v ề mặt miễn dịch học tể bào kiềm giống như tế bào mast. 21.5.2.3. Bạch cầu ưa axlt (eosinophil leukocyte) Có trong máu ngoại vi chiếm 1-5% tổng số bạch cầu (ở ngưcri Việt là 6-10%). Trong tế bào chất chứa các hạt bắt màu thuốc nhuộm axit (eosin). Khi bị nhiễm ký sinh (giun, sán) hoặc khi bị dị ứng thì số lượng BC axit tăng lên. BC ưa axit được hấp dẫn bởi các chất hóa ứng động [C5a, ECF (eosinophil chemotactic factor do tế bào mast tiết ra] đi đến nơi có KN. Trên bề mặt BC axit có các thụ thể dành cho Fc của IgE hoặc IgG và C3b. Các KT và C3b lại gắn với KN trên bề mặt ký sinh (giun, sán). BC axit được hoạt hóa, tiết các chất hóa học trung gian để tiêu diệt vật ký sinh Các sản phẩm của BC ưa axit: - Có nhiều hạt đặc hiệu chứa protein chính, protein dạng cation, neurotoxin, peroxitaz. - Các hạt nhỏ chứa các enzym aryl sulphataz, photphataz. - Các chất hóa học trung gian gồm: H2 O2 , superoxit, leukotrien (LTB4 , LTC4 ), prostaglandin (PGE2), yếu tố hoạt hó tiểu cầu; các cytokin (ví đụ IL -la, -3, -5, -6, -8), yếu tố kích thích quần lạc của tế bào hạt và ĐTB (GM-CSF-granulocyte-macrophage colonystimulating factor), yếu tố hoại tử ung thư a (TNF-a); các enzym histaminaz, photpholipaz và P-glucuronidaz.

21.5.3. Tế bào mast (dưỡng bào) Tế bào mast (dưõng bào) có mặt trong các mô, ừong tế bào chất có các hạt ưa kiềm, nhưng nhỏ hơn các hạt ừong BC kiềm. Cũng như BC kiềm, tế bào mast được hoạt hóa khi trên bề mặt các thụ thể gắn với Fc của IgE còn phần Fab gắn chéo với KN, hoặc khi có các chất gây phản vệ C3a, C5a gắn vào thụ thể bề mặt. Trong cả hai trường hợp xẩy ra nhiều Sự kiện: enzym màng hoạt hóa ion Cà1"1" xâm nhập vào tể bào, các hạt (bọng) và các chất trung gian có sẵn tiết ra ngoài. Các chất hóa học trung gian mới được tạo thành từ axit arachidonic.

451

Đầu tiên là hoạt hóa esteaz serin tiếp theo là hoạt hóa metyl ưansferaz một mặt tác động lên photpholipit màng tế bào, một mặt tác động lên adenyl cyclaz, chất này làm tăng Adenosin monophotphat vòng (cAMP) và hoạt tính protein kinaz. Sự gắn metyl vào photpholipit và sự hoạt hóa photpholipaz cũng dẫn đến sự hoạt hóa protein kinaz (thông qua sự tạo thành diacylglyxerol) và liên quan đến 3 sự kiện: • Mở kênh Canxi ở màng sinh chất, làm thoát C a^ nội bào. • Sự tạo thành fusagenic lipit làm tăng sự dung hợp giữa màng sinh chất và màng hạt. •

Sự tạo thành axit arachidonic để từ đỏ tổng hợp nên các chất hóa học trung gian.

• Sự hoạt hóa adenyl cyclaz, rất quan trọng với các việc thoát các chất hóa học trung gian, cho dù nếu ngăn cản sự hoạt hóa, cũng không ngăn cản sự metyl hóa photpholipit •

Khi Ca** vào tế bào sẽ gắn với calmodulin nên làm tăng hoạt tính của nhiều loại enzym (trong đó cỏ protein kinaz) và thúc đẩy quá trinh, theo đó các protein khung tế bào làm co các vi sợi dần làm thoát hạt và các nội chất từ hạt. Thuốc chống dị ứng natri cromoglycat ngăn cản sự phá hạt của tế bào mast và ngăn cản sự tham ion Canxi qua màng.

* Các sản phẩm của tể bào mast Giai đoạn nghỉ Các chất hóa học trung gian có sẵn: • Histamin • Heparin proteoglycan • Yếu tố hỏa ứng động (ECF - eosinophil chemotactic factor và NCF - neutrophil chemotactic factor) • Hydrolaz axit (ví dụ glucuronidaz, photphataz) • Proteaz trung tính (ví dụ tryptaz, chymaz) G ia i đ o ạ n h o ạ t h ó a

Các chát tiết khác: • Leukotrien: v í đụ LTB4, LTC4, LTD4, LTE4 (SRS)

• Prostaglandin: ví dụ PGDi • Chất hoạt hóa tiểu cầu: PAF —platelet activating factor 452

• Cytokin: IL1, -3, -4, -6, -8, yếu tố kích thích quần lạc của các tế bào hạt và ĐTB (GM-CSF), yếu tố hoại tử ung thư-a (TNF-a) * Tóm lại: 1.

Tê bào mast và BC kiềm khi trên bề mặt gán với IgE hoặc các độc tổ gây phản vệ C3a và C5a sẽ được hoạt hóa làm thoát bọng (hạt) và tiết các chất trung gian gây viêm.

2.

Một số chất trung gian của tế bào mast được hình thành từ trước và tích lũy trong hạt (ví dụ histamin). Khi tế bào được hoạt hóa chúng sẽ được giải phóng ngay. Một số chất trang gian mới được hình thành (ví dụ leukotrien, prostaglandin). Tế bào mast cũng tiết ra cytokin.

3.

BC axit có các hạt chứa các chất trung gian gây dung giải (protein kiềm) chúng được tiết ra khi có các IgE, IgG gấn trên bề mặt, ví dụ giun ký sinh.

4.

BC trung tính cũng tiết ra một số chất trung gian gây viêm (ví dụ các trao đổi .axit arachidonic và cytokin) ngược lại một số chất lại có hiệu quà kháng viêm đổi với các chất trung gian của tế bào mast.

Các chất có sấn

\

Tế bào chất

protein cytoskeletaỉ^p

Tế bào mast hoạt động Các chất mớỉ tạo thành

Inosital triphosphate ị

V^Diacyl glycerol

A M Ị vòng

SRS-A

Hình 2116: Sự hoạt động \à tiểt chất trung gicm của tể bào mast (Theo R Gordon, T.Iart,2000). 21.5.4. Tiễu cầu Tiểu cầu là loại tế bào có nhâriị kích thưởc nhỏ (3 um) được biệt hóa từ tế bào nhân khồng lồ (megakaryocyte) ở tùy xương. Khi tiếp xúc với bề mặt lạ sẽ tiết ra tromboplastin, là một loại enzym (trombokinaz) gây đồng máu ngoài ra cũng sản xuất các amúi hoạt mạch (histamin) khi bị kích thích bởi các yếu tố hoạt hỏa tiểu cầu (PAF - platelet activating

453

factor) tham gia vào quá trình viêm. Trên bề mặt tiểu cầu cũng có MHC-I và các thụ thể dành cho IgE. 21.5.5. Các tế bào ỉym pho Các tế bào gốc từ tủy xương phát ừiển thành 2 quần thể tế bào lympho chỉnh. Nểu biệt hỏa trong tuyến ức thì được tế bào T còn trong túi Fabricius (hoặc tủy xương của động vật có vú) thì được tế bào B. Đây là cơ quan tiếp tục sản sinh và hoàn thiện tế bào lympho trong suốt đời sống cá thể. 21.5.5.1. Sự phát triển của tể bào B Trước hết tiền tế bào B (pre.B) được gắn với chuỗi muy của IgM, sau đó chuỗi muy lại gán ngẫu nhiên với chuỗi nhẹ để tạo IgM nằm trên bề mặt tế bào chưa chín, với chức năng thụ thể tế bào B (BCR), có thể liên kết được với KN. Thụ thể tế bào B rất đa dạng. Sở dĩ như vậy vì có sự sắp xếp lại gen dòng phôi. Chúng có khả năng chọn lựa một cách ngẫu nhiên các gen vùng biến đổi mã cho vị tri kết hợp với KN. Sự tái sắp xếp các gen này tạo ra trong cơ thể một lượng khổng lồ, có thể lên tới 1o8, các dòng tế bào B chuyên biệt có các BCR khác nhau và vì thế mà hệ thống miễn dịch có khả năng nhận ra nhiều loại KN khác nhau. Tuy nhiên mỗi tế bào B chỉ có một loại thụ thể giống nhau đành cho một loại KN xác định. Một số tế bào B không được trưởng thành theo cách này. Chúng không tái sắp xếp lại các gen vùng biến đổi để mã hóa cho chức năng nhận biết KN lạ, mà lại nhận biết KN bản thân, do đó chúng phải bị tự chết theo lập trình (apoptosis), theo đỏ ADN của chúng sẽ bị tự phân giải. 21.5.5.2, Quả trình hoạt hỗa vổ thành thạc tế bào B Phần lớn tể bào B chín được gắn đầu tiên là IgM, sau đó là IgD ừên bề mặt, sẽ ròfi khỏi tủy xương tới cơ quan lympho ngoại vi. Tại đây chúng sẽ được hoạt hóa bởi KN và bởi interleukin do tế bào T cung cấp, nhờ đó thúc đẩy sự biểu hiện của phân tử MHC-II (HLA-II) trên tế bào B. Kiểu đáp ứng này gọi là phụ thuộc tuyển ức, vỉ nó cần sự hỗ ỮỢ của tế bào T do tuyến ức sinh ra. Ngược lại, một sổ KN (ví dụ cacbohydrat, glycolipit, một sổ protein trùng hợp) có thể kích thích hoạt hóa tế bào B một cách trực tiếp mà không cần có sự tham gia của tể bào T. Kiểu đáp ứng này gọi là độc lập với tuyến ức (TI-thymus independent). Có hai dạng: TI-1 là các mitogen - là các KN kích thích trực tiếp tế bào B tăng sinh (ví dụ lipopolysaccharit của vi khuẩn). Loại khác là KN TI-2, chúng có các epitop lặp lại, có khả năng liên kết chéo với các thụ thể của tế bào B (ví dụ lông roi vi khuẩn). Sau khi được hoạt hóa bởi KN, tế bào B trở thành nguyên bào lympho (lymphoblast), một số chuyển thành tể bào plasma (tương bào) để sản xuất KT. Trên bề mặt tế bào plasma

không có KT. Một số tế bào B khác chuyển sang trạng thái nghỉ, tạo thành một quần thể tế bào B nhớ đặc hiệu; một khi KN cũ tái xuất hiện chúng sẽ tạo Đ ư MĐ thứ cấp nhanh và mạnh mẽ hơn.

J^Kháng nguyên

Cytokine

Cytokine

Hình 21. ỉ 7: Sự hoạt hỏa tế bào B nhớ (Theo R. Gordon, TJan ,2000),

(1) Chế biến và trình diện KN nhờ MHC-II được tế bào T h2 nhận điện. (2) Tế bào B đặc hiệu KN có MHC-II sẽ gắn và chế biến KN rồí tương tác vói tể bào T h2, (3) Hoạt hóa tế bào B tạo tế bào plasma sản xuất KT đặc hiệu với KN Cytokine tham gia vào quá trình hoạt hóa, APC - antigen presenting cell: tế bào trình diện kháng nguyên, P: tế bào plasma sản xuất kháng thể.

* Tóm tắt Tể bàoB Khi tế bào B biệt hóa trong tùy xương, chúng trở thành các té bào cỏ thẩm quyền mỉễn dịch, có khà năng tạo KT, là thụ thể cho một KN duy nhất. Sẽ có một tế bào B tạo ra một loại KT ứng với một loại KN mà ta sẽ gặp trong đời sống.

Nhận diện KN 1- Sự đa dạng của tế bào B là do tái tổ hợp di truyền. Khi xẩy ra biệt hóa, các lympho bào không biệt hóa sẽ láp ráp ngẫu nhiên các đoạn ADN để tạo ra hàng triệu tế bào B có ADN khác về mặt di truyền với các ADN nguyên thủy. 2- KT trên bề mặt tế bào B nhận điện KN trên bề mặt của các tác nhân gây bệnh hoặc của tế bào nhiễm. 3- Khi KT gắn với KN sẽ tạo ra phức hợp KN-KT, chúng có thể gắn khít hoặc không khít. Nếu không khít thì gọi là ái lực thấp sẽ dẫn tới ĐƯMD yếu. Hoạt hóa tế bào B 1- Chỉ các tế bào B có thụ thể (là KT) gắn được với KN lạ mới được hoạt hóa. Các tế bào được lựa chọn này sẽ phân chia tạo ra một dòng (chọn lọc dòng). Một số tiếp tục biệt hóa tạo tế bào plasma sản xuất KT, số khác trở thành tế bào nhớ tồn tại lâu dài, để chống lại KN trong tương lai, 2- Các tế bào B có thể được hoạt hóa trực tiếp bởi KN không phụ thuộc tuyến ức. Các KN lớn với nhiều epitop giống nhau sẽ kích thích một ĐƯMD tương đối yếu. 3- Hầu hết KN phụ thuộc tuyến ức đòi hỏi phải có tế bào T h. Tế bào T h hoạt hỏa tế bào B để nhận diện KN cùng loại. 4- ĐTB và các tế bào ữình diện KN khác (APC) tiết ra cytokin gọi là interleukin-1 (IL-1) để hoạt hóa tế bào B và tế bào T h. 5- Tế bào T h đã hoạt hóa tiết ra IL-2 để hoạt hóa tế bào T và B, IL-4, IL-10 để kích thích tế bào B tạo đòng và biệt hóa thành tế bào plasma, sán xuất KT. IL-5, JL-6 và IFN-Y cùng kích thích tế bào B biệt hóa thảnh tế bào plasma. 6- Khi hết KN, quá trình sản xuất KT cũng tát, chỉ còn lại tế bào B nhớ. Nếu gặp lại KN đó lần sau, tế bào B nhớ sẽ tạo ra ĐƯMD nhanh và mạnh hơn mà không cần phải kỉch thích tế bào B nguyên thủy để nhận diện KN từ đầu. Đáp ứng tể bào B 1- KT có thể chống KN trực tiếp hoặc gián tiếp. Một số KT gọỉ là khống độc tố (antitoxin) gắn trực tiếp vào epitop độc tổ của vi khuẩn để ỉàm bất hoạt, số khác có thể gắn trực tiếp vào KN bề mặt virut. 2

- KT có thể tác động gián tiếp toong phản ứng opsonin, ADCC hoặc hoạt bóa bổ thể,

3- KT là globulin được tạo thành để chổng lại KN kích thích sinh ra nó, KT có cấu

tạo gồm 4 chuỗi polypeptit: 2 chuỗi dài (H) và 2 chuỗi ngắn (L) gắn vói nhau bàng dây nối sulfua hydro, ở

(paratop). 456

2

đầu (phía NH2 ) của 2 chuỗi tạo vị trí kết hợp KN

4- KT có 5 lớp: IgG, IgA, IgM, IgD và IgE. 5' Cơ thể có khả năng tạo nhiều loại KT để đáp ứng với bất kỳ KN là đo chúng sắp xếp lại gen ADN dòng phôi của tế bào B. 21.5.5.3. Sự phát triển và huấn luyện tế bào T Tế bào gốc rời tủy xương theo đòng máu vào tuyến ức, trước hết là vào mép ngoài phần vỏ, từ đây được gọi là tế bào tuyến ức hay thymo bào (thymocyte). Phần vỏ gồm tế bảo tuyển ức chưa thành thục, đang biệt hóa và tăng sinh, còn phần tủy chứa các tế bào đã thành thục và các tế bào biểu mô. Ngay sau khi xâm nhập vào tuyến ức, mỗi thymo bào bắt đầu biểu hiện chuỗi p cùa thụ thể tế bào T (TCR), sau đó gắn thêm chuỗi a. Cũng giống như thụ thể tế bào B đã mô tả ở trên, thụ thể tể bào T cũng phải trài qua quá trình tải sắp xếp để có hai chuỗi a và p đặc hiệu cho từng KN đã gắn với MHC. Các gen vùng biến đổi của các chuỗi a và p được lựa chọn một cách ngẫu nhiên từ một lượng rất lớn sẵn có giống như với trường họp của tế bào B trong sàn xuất KT bể mặt. Do vậy số lượng tế bào T cỏ các TCR ứng với các KN khác nhau là rất lớn. xể bào T được phân chia ra hai quần thể dựa vào glycoprotein bề mặt, đó là CD4+ và CD8+. Các tế bào T CD4+luôn nhận diện KN liên kết với phân tử MHC-II, trong khi tể bào T CDg+ lại nhận diện KN liên kết với MHC-I. Sở dĩ như vậy vỉ phân tử CD4 tương tác với

vùng p2 của MHC-II, còn CDg lại tương tác với vùng a.3 của MHC-I. Các tể bào T là trung tâm của việc hoạt hóa và điều hòa miễn dịch. Vì vậy điều vô cùng quan trọng là chúng chi tương tác có hiệu quả với KN lạ do MHC trình diện mà không tương tác với KN của bản thân cơ thể. Có được giới hạn này là do sự lựa chọn ngay từ trong tuyến ức. Dòng tế bào T nào tương tác với KN của bản thân sẽ bị loại bỏ. Quá trình này gọi là huấn luyện tế bào T. 95% tể bào T trong tuyến ức bị thanh lọc và loại bỏ nhờ apoptosis. Các tế bào Tphân lớp - Quần thể tế bào T CDg+ gọi tắt là Tg bao gồm các tế bào T gây độc tế bào (cytotoxic T cell) gọi tắt là Tc có chức năng tấn công tiêu diệt các tế bào có KN lạ (tế bào nhiễm virut và tế bào ung thư) và tế bào T ức chế (Suppressor T cell) nên viết tắt là Ts tham gia điều hòa miễn dịch. - Quần thể tế bào T CD4+, gọi tắt là T4 , còn gọi là T hỗ trợ, viết tắt là Th (T-helper), bao gồm Thi và TH2. Cả hai đều có nguồn gốc chung là tế bào Tho•

T hi tiết ra interleukin-2 (1L-2) để kích tế bào Tc và interferon-Ỵ (1FN-ỵ) để kích

thích ĐTB, đẫn đến miễn dịch qua trung gian tế bào.

457

tiết ra IL-4 vả IL-10 kích tế bào B biệt hóa, tăng sinh, tạo thành tế bào plasma để sàn xuất KT, có nghĩa là tham gia vào ĐƯMD thể địch. • T h2

* Hai quần thể này cũng ức chế lẫn nhau thông qua sản phẩm cytokin của chúng : IFN-y ức chế sự tăng sinh của T h2» trong khi IL-10 (một số trường hợp là IL-4) lại ức chế sự phát triển và hoạt hóa của T Hị {hình 21.18).

Miễn dịch qua trung gian tế bào

Miễn dịch thể dịch

Hình 2J.J8: Vai trò khác nhau của tế bào Tfiỉ và TH2 (Theo RGorđon, T.Ian, 2000). *

Tóm tát Tế bào T 1. Có hai loại tế bào T chính là T CD8+ (Tc hay T độc) vả T CD4+ ( T h hay T hỗ trợ) 2. Tê bào Tc có thể giết các tế bào nhiễm virut và các tế bào ung thư. . Nhận diện KN của tể bào T 1- Các tế bảo T nhận diện KN đã được các tế bào APC chế biến. 2- Các tế bào APC (ĐTB, tế bào B) tiêu hỏa protein KN tạo ra các peptit, gắn với MHC-II tạo phức hợp KN-MHC-II đưa ra bề mặt để trình cho tể bào T h. 3- Tế bào APC (là tế bào nhiễm vừut) tiêu hóa protein KN, tạo peptit, gán với MHCI tạo phức hợp KN-MHC-I đưa ra bề mặt trình cho tế bào Tc. Hoạt hỏa tể bào T 1- Sau khi TCR gán với phức hợp MHC-KN, tế bào T sẽ được hoạt hỏa.

458

2- Các tế bào đầu tiên được hoạt hóa trong bất kỳ ĐƯMD nào là tế bào T h . Th được kích thích bởi IL-1 do ĐTB tiết ra. Khi được kích thích, Th tiết ra IL-2 để tự kích thích mình. IL-4 cũng giúp hoạt hóa Th. 3- IL-2 cũng hoạt hóa tiền Tc để ưở thành Tc chín phân chia giống như chọn lọc dòng ở tế bảo B. Đáp ứng tế bào T 1- Các tể bào nhiễm virut phân giải protein virut tạo peptit KN. KN gán với MHC-I tạo phức đưa ra bề mặt trình cho tế bào Tc. Tế bào Tc sau khi nhận điện KN (thông qua MHC-I) sẽ được hoạt hóa, tiết protein độc (perforin) để làm tan tế bào nhiễm. 2- Thi kích thích tạo ĐƯMD tế bào. Th2 kích thích tạo ĐƯMD thể dịch. 21.5.6. Các tế bào giết (Killer Cells) Nhiều loại tế bào của hệ mỉễn địch có khả năng phá hủy các tế bào sống khác như vi khuẩn, protozoa, các tế bào mô ghép và thậm chí trong một số trường họp nhất định là tế bào của bản thân cơ thể. Ví dụ ĐTB, BC trung tính, BC axit có khà năng tiét ra các gốc oxy, các enzym dung giải, các protein kiềm độc như đã nêu ở phần trên. Các tể bảo khác trình bày ở đây là các tế bào giết, chúng có khả năng tiêu diệt các tế bào đích. Các tế bào lympho giết có thể chia ra làm 2 loại: Tế bào T độc (Tc = cytotoxic T cell) và lympho bào lởn có hạt (LGL - large granular lymphocyte). Chúng khác nhau ờ cơ chế nhận diện nhưng giống nhau ở cơ chế gây tan bào. 21.5.6.1. Tể bào T độc (Tc) Te bào Tc CDg có thụ thể đặc hiệu liên kết với MHC-I trên bề mặt tế bào đích. Một số tể bào T CD4 cũng có thể là tế bào gây độc tể bào nhưng chúng iiên kết với phấn tử MHC-II. Sự biệt hóa tiền tế bào Tc thành tể bào Tc hoạt tính cần cỏ sự tác động của 1L-2 do tế bào T hỗ trợ (Thi) tiết ra. Sự biệt hóa cũng có thể được thực hiện do tương tác với tế bào trình điện KN (APC - antigen presenting cell), néu có đủ lượng phân tử kết dính để thúc đầy phân tử tiền Tc tự sinh ra IL-2 của chính mình. Các tế bào tua xòe ngóíi (interdigỉtating dendritic cell) có khả năng truyền KN ngoại lai theo con đường chế biếtì MHC-IÍ trong endoxom vào cytosol (tương bào), ở đó nhờ MHC-I chúng đượe trình cho tiền tế bào TCDg. Tế bào Tc đóng vai trò quan ừọng ữong việc làm tan tế bào nhiễm. Tế bào Tc tiêu diệt tế bào đích theo 3 bước : (1 )

- Kết đính và nhận diện.

459

Tế bào Tc gắn vào tế bào đích nhờ phân tử dính, ví dụ CD2 và LFA-1 (KN-1 liên quan đến chức năng lympho bào lymphocyte-function associated antigen-1). Nếu tế bào đích biểu hiện phức hợp KN-MHC-I thì nó sẽ tương tác với TCR của tế bào Tc. (2) - Gây chết Tế bào Tc có các bọng chứa các chất trung gian gây độc tế bào. Khi TCR gan vào phức hợp KN-MHC-1 sẽ ỉàm cho các hạt hướng về vị trí gắn với tế bào đích và thoát các chất trung gian vào tế bào đích. Mặc dù các chất độc này không mang tính đặc hiệu KN, nhưng chúng diệt tế bào đích mang KN đặc hiệu (ví dụ tế bào nhiễm virut), nên các tế bào ở xa không bị phá hủy. Các phân tử do tế bào Tc tiết ra sẽ tác động lên bề mặt tế bào đích để giết chúng. (3) Sự chết của tế bào đích. Có hai cơ chế giết tế bào đích cùng tồn tại và bổ sung cho nhau, đó là dung giải nhờ áp suất thẩm thấu và gây chết theo lập trình (apoptosis). Sau khi đánh đòn gây chết, tế bào Tc rời khỏi tế bào đích để lặp lại chu trình diệt tế bào đích khác. 21.5.7. Các tế bào lympho lớn có hạt (LGL) Các tế bào LGL bao gồm các tể bào giết tự nhiên NK (natural killer) và các tế bào giết K (Killer cell). Chủng chứa nhiều tế bảo chất hom các tế bào T và B ở dạng nghỉ. Bên trong chứa một số hạt bẳt màu xanh da tròi. Chúng có mặt trong máu ngoại vi ở mức thâp (4-10% tổng tế bào lympho trong mảu). Tế bào NK được gọi là tể bào giết tự nhiên vì có thể giết nhiều loại tế bào đích mà không cần hoạt hóa KN nhu là tế bào T. Tuy nhiên hoạt tính sẽ được tăng lên nhiều khi tiếp xúc với một số cytokin như ĨFN-a và IFN-p đo tế bào nhiễm virut sản ra hoặc IL-12 do ĐTB sản ra. • Trên bề mặt LGL không cỏ thụ thể đặc hiệu KN, nên không có sự sắp xếp lại gen để hình thành phân tử bề mặt như là TCR ờ tể bào T và KT bề mặt của tế bào B. • Trên bề mặt cỏ phân tử lectin - là protein gắn được với hydratcacbon (thụ thể hoạt tính) trên màng tể bào đích. Nếu chỉ có sự tương tác giữa lectin và hyđratcacbon thì LGL sẽ tiết protein độc giết tế bào đích. Đồng thời ưên bề mặt LGL có protein KIR - tức thụ thể ức chế tế bào giết (Killer cell inhibitor receptor) gắn với MHC-Ỉ của tế bào bình thường. Sự tương tác này ức chế tín hiệu hoạt hóa chương trinh dung giải tế bào. • Trên bề mặt các tế bào bị nhiễm virut hoặc các íế bào ung thư không có hoặc có rất ít MHC-I hay MHC-I đã bị biến đổi, nên không tương tác được với thụ thể KIR, do vậy không ức chế được tín hiệu hoạt hóa té bào LGL tiết chất độc giết tế bào đích.

460

Hình 2ỉ. 19: Cơ chể nhận diện tể bào đích: a) Thụ thể hoạt tinh nhận diện phân tứ ỉectin trên bề một tế bào bình thường. Vì thụ thể ức chế (KIR) nhộn điện và tương tác với MHC-I nên phát tin hiệu tie chế LGL : không tấn công. b) Ở tể bào không bình thường (nhiễm virut hoặc ung thư) không có MHC-I, nên thụ thề ức chế không hoạt động nên không phát tín hiệu ức chế: Tể bào đỉch bị giết. Tể bào NK có các hạt chứa perforin và granzym. Nểu không có tin hiệu ức chể, các tể bào này sẽ làm thoát chất độc để giết. (Theo L.M. Prescott, J.p. Harley, D.A.Klein,2005). * Gây độc tể bào p h ụ thuộc khảng thể Viết tắt là ADCC (antibody dependent cellular cytotoxicity). Đây là phản ứng giết tế bào đích của tế bào LGL (cụ thể là tế bào K) với sự tham gia của KT. LGL có thụ thể bề mặt dành cho phần Fc của IgGl và IgG3. KT lại cỏ phần Fab gắn với KN trên tế bào đích. LGL được hoạt hóa, tiết chất độc giết tế bào đích.

* Cơ chể gỉểt cửa các tể bào giết Các tế bào giết gồm tế bào Tc và LGL (K và NK) tuy cỏ cơ chế nhận diện tế bào đích khác nhau nhưng cơ chế giết lại giống nhau. Cả tế bào Tc và LGL đều tiết ra 2 loại chất độc là perforin và granzym.

461

Hình 2ỉ. 20: Cơ chế giết tể bào đích của tế bào Tc và LGL (Theo R. Gordon, T.Ian, 2000). v ề cấu trúc và chức năng thì perforin giống với bổ thể C9 tham gia vào phức hợp tấn công màng (MAC). Khi có ion Ca**, phân tử perforin polymẹ hóa tạo cấu trúc dạng ống, đâm xuyên vào lớp lipit kép của màng tế bào đích, làm thủng màng. Một mặt làm thoát nội chất ra khỏi tế bào dẫn đến gây ehết tế bào. Một mặt gây rối loạn gradien ion bình thường hoặc làm cho nước vào tế bào qua lỗ thùng dọ perforin tạo ra, dẫn đến tan bào do áp suât thẩm thấu. Granzym là proteaz serin cùng thấm vào tế bào qua lỗ thủng. Khỉ ở bên trong tế bào, granzym hoạt hóa enzym casp&z đang ở dạng bẩt hoạt. Khi được hoạt hóa enzym này sẽ hoạt hóa endonucleaz để phận giải ADN, dẫn đến ạpoptợsis {hình 2L2ơ)t.

* Protein kết nối mảng Ngoài hoạt động của các chất cố ừong hạt, tể bào giết còn cỏ thể gây chết tế bào đỉch thông qua sự tương tác của protein kết nổi trên bề mặt gọi là ligand (phối tử). Nhiều tế bào biểu hiện protein thụ thể trên bề mặt gọi là fas. Các tế bào giết có protein gán fas. Hai loại protein này có cấu trúc gần vói thụ thể dành cho yếu tố hoại tử ung thư (TNF) và cytokin TNF một cách tương ứng. Khi Gác tế bào giế; gán vào tế bào đích, sự tương tác giữa protein gán fas với fas sẽ gây apoptosis cho tế bào đích. Một số tế bào T CD4+ và tất cả các 462

tế bào T CD»+ biểu hiện fas và có thể giết theo cách này. Như vậy, các tế bào giết có nhiều vũ khí ữong “ kho quân dụng” để giết tế bào đích. Chúng có thể “ hành quyết” tế bào đích nhờ perforin phá hủy màng tế bào hoặc “ bức tử” thông qua granzym hoặc sự gắn vào fas. * Tóm t ắ t : Các cơ quan và tế bào của hệ miễn dịch: 1- Hệ miễn dịch lả một mạng lưới bao gồm các tế bào và các ca quan nàm khắp cơ thể. 2- Các tế bào chủ yếu là Iympho bảo. Có hai loại ìympho bào chính là tế bào B và tế bào T. 3- Tế bào B tham gia ĐƯMD thể dịch bằng cách tạo ra kháng thể. Tế bào T tham gia ĐƯMD tế bào băng cách tiết protein độc giết trực tiểp các tế bào có KN lạ hoặc gián tiếp bàng cách điều hòa chức năng năng hệ miễn dịch. 4- ĐTB và BC trung tính được gọi là thực bào đo có khả năng bát giữ và tiêu diệt vi sinh vật. 5 - ĐTB và BC trung tính sinh ra một loạt các chất trung gian gây độc và gây viêm. 6- Thực bào di chuyển đến vị trí nhiễm trùng hoặc viêm để đáp ứng tín hiệu hóa hướng động và tiêu diệt vi sinh vật thông qua opsonin hóa; đồng thòi tiết ra các chất độc theo cơ chế phụ thuộc và không phụ thuộc vào oxy. 7- Tế bào mast và BC kiềm được hoạt hóa nhờ KN gán chéo với IgE trên bề mặt hoặc nhờ các độc tố phản vệ (C4a, C5a), tiết ra các chất trung gian gây viêm. Một số chất có sẵn trong hạt (histamin), một sổ được tạo mới khi được hoạt hóa (leukotrien, prostaglandin). 8- BC axit tiết các chất ưung gian gây viêm (các chất trao đổi của axit arachidonic, cytokin), ngược lại một số chất lại có tác dụng kháng vĩêm do tế bào mast tiết ra. 9- Có hai loại tế bào g iế t: Tế bào Tc và LGL diệt tế bào nhiễm virut và ung thư. 10- Đa số tế bào Tc biểu hiện phân tử CDị+ tưcmg tác với phức hợp MHC-I-KN ưên bề mặt tế bào đích. 11- LGL (tế bào NK) không có thụ thể như TCR nhưng có lectin bề mặt tương tác với hydratcacbon. Tế bào không bị giết nếu tương tác được với MHC-I. 12- GL (tế bào K) cỏ thụ thể dành cho Fc của Ig, thực hiện phản ứng ADCC. 13- Cả Tc, K, NK đều có cơ chế diệt giống nhau nhờ perforin và granzym. 14- Th có hai loại là T h i và T h 2 - Thi tiết IL-2, IFM y...kích thích biệt hóa tiền Tc thành Tc chín và tham gia vào phản ứng viêm (quá mẫn muộn) tức là tham gia vào

463

ĐƯMD tế bào. Th2 sản IL-4, IL-10...kích tế bào B biệt hóa thành tế bào plasma tạo KT, tức là tham gia vào ĐƯMD thể dịch. 15- Tế bào Th biểu hiện phân tử CŨ4+, tương tác với phức hệ MHC-II-KN. Phản ứng miễn dịch 1 - Sự nhận diện miễn dịch đòi hỏi phải có sự tiếp xúc trực tiếp giữa KN và lympho bào. Lympho bào có phân tử nhận diện KN gọi ỉà thụ thề KN. Ở tế bào B thụ thể KN là KT bề mặt, còn ở tế bào T thụ thể KN là TCR. 2- Thụ thể KN gắn vào một vùng nhỏ của KN gọi là epitop (gọi là quyết định KN) chúng khớp vỏi nhau như khóa - chia. 3- Hầu hết các phân tử nhỏ không có khả năng gây đáp ứng miễn dịch. Đó là hapten. Khi gắn với một protein mang lớn hơn sẽ tạo KN trong đó hapten là epitop. 4- Khi hệ thống miễn dịch không phải đang chống nhiễm trùng thì chỉ có vài lympho bào tạo ra mỗi loại thụ thể KN là tồn tại 5- Khi hoạt hóa, lympho bào n h â n lên nhanh chóng để tạo đủ lượng tế bào để đấu tranh chống nhiễm trùng. 6- Một số tế bào B sau khi hoạt hóa sẽ biệt hỏa thành tế bào plasma, được ví là xí nghiệp sản xuất KT. Tế bào plasma có thời gian sống ngắn nhưng sản xuất một lirợng KT lớn. Các tế bào T hoạt hỏa giết các tể bào nhiễm hoặc điều hòa ĐƯMD. 21.6. KHÁNG NGUYÊN PHÙ H Ợ P MÔ (MHC) Thụ thể tế bào T chỉ có thể nhận điện được KN quen, đó là các KN “của mình” hoặc cùng loại với mình, gọi là KN hay phức hợp phù hợp mô chính, viết tắt là MHC (major histocompatibility complex). KN này nằm trên bề mặt tế bào bình thường và được mã hóa bởi vùng gen riêng, vùng gen MHC. MHC hoạt động như là phân từ ừình diện KN vi nó tương tác đặc hiệu vói cả KN lạ lẫn TCR và đóng vai trò quan trọng ừong toàn bộ ĐƯMD. Cỏ hai loại MHC: MHC-I và MHC-II. MHC-I có ữên bề mặt tất cả các tế bào có nhân ở động vật cỏ xương sống, còn MHC-II chỉ có mặt trên tế bào lympho B và đại thực bào. Ở người KN phù hợp mô là hệ thống KN bạch cầu gọi là HLA (human leucocyte antigen). Có nhiều gen mã cho MHC-I, song chỉ có các gen phụ mã cho MHC-ĨI. Protein MHC-I có cấu tạo gồm hai chuỗi polypeptit. Một chuỗi được mã hóa bởi gen nằm trong vùng gen MHC gọi là chuỗi a và được cắm sâu vào màng chất sinh, còn chuỗi kia nhỏ hơn, được mã bời gen nằm ngoài vùng gen MHC, gọi là chuỗi microglobulin p-2 (viết tắt là p2tn).

464

Protein MHC-II cũng có cấu tạo từ hai chuỗi polypeptit a và p, cả hai đều cám sâu vào màng sinh chất và nhô ra ngoài mặt tế bào. Cấu trúc MHC ở các cá thể khác nhau trong cùng ỉoài cũng khác nhau, đo vậy khi ghép cơ quan giữa hai cá thể có MHC không tương đồng sẽ đễ bị thải loại. Chức năng của MHC MHC làm nhiệm vụ trình diện KN hay nói đúng hom là nơi trung chuyển KN cho tế bào T. Với mồi loại MHC có một cơ chế trình diện riêng. Với MHC-Ỉ: KN sau khi được tế bào ký chủ chế biến nhờ enzym tiêu hỏa, sẽ được gắn với MHC-I trong lưới nội chất. Ví dụ tế bào nhiễm virut phân giải protein virut thành các peptit rồi gắn với MHC-I. Phức hệ MHC-I-KN sẽ xuyên qua mảng sinh chất và nằm trên mặt tể bào. Ở đây tế bào Tc thông qua TCR đặc hiệu KN sẽ liên kết với phức hệ trên. Đồng thời thụ thể CDs trên mặt tế bào Tc cũng gắn với MHC-I làm cho phức hệ mạnh han. Sau khi được KN kích thích, tế bào T tăng sinh và sản ra lymphokin để làm tan tế bào nhiễm. Rõ ràng tế bào T phải rà soát để nhận diện KN phù hợp với TCR của mình và TCR ấy phải tương tác được cả với epitop của KN lẫn MHC.

Hình 21.21: Cẩu trừ: cùa MHC: (a) Lớp I: MHC-J có trên bề một của tất cà các tế bào củ nhân. (b) Lớp 11: MHC-II chi có một trên một số loại tế bào trình diện kháng nguyên như ĐTB hoặc tế bào lympho B (Theo Brock Biology of Microorganism, Prentice Hall 9th edition).

465

Với MHC-lh được hình thành trong lưới nội chất cùng với các protein khác. Mộ chuỗi protein không đổi gọi là chuỗi I gắn trước với MHC-II để ngăn càn không cho MHC' II gắn với các peptit khác. MHC-ĨI cùng chuồi I được chuyển vào endoxom. KN lạ bị tế bào APC (đại thực bào, tế bào B) thâu tóm rồi chuyển vào endoxom. ở đây, nhờ proteinaz, chúng được phân giải cùng với protein I. Các peptit lạ KN được giải phóng ra sẽ thế chỗ cho protein I để gắn vào MHC-II tạo phức hệ chui qua màng sinh chất, trình diện tế bào T h 2 thông qua TCR. Thụ thể CD4 trên mặt tế bào Th2 cũng gán vào MHCII. KJii được KN lạ kích thích, tế bào Th2 hoạt hóa và tiết interleukin để biệt hóa tể bào B thành tế bào plasma sản xuất KT (hình 21.20).

Hình 21.22: Nhận diện kháng nguyên nhờ protein MHC. (Theo Brock Biology o f Microorganism, Prentice Hail $h edition). 21.7. THỤ THẺ TÉ BÀO T Tế bào T có khả năng nhận diện KN thông qua thụ thể bề mặt, viết tắt ỉà TCR (T-cell receptor). Sự nhận diện này mang tính đặc hiệu cao. Chẳng hạn tế bào Tc có thể phân biệt được mỗi loại virut khi chúng xâm nhập vào cơ thể. TCR có cấu tạo gần giống KT, gồm hai chuỗi peptit: a và p, gắn với nhau bời cầu nối disulfua. TCR cũng có hai vùng: vùng biên đổi nàm ở phía đầu amin của mỗi chuỗi tạo nên vị trí kết hợp KN. Vùng cố định nàm phía đầu cacboxyl và cắm sâu vào màng sinh chất của tế bào T.

466

Các gen của thụ thể tế bào T: Các gen mã hóa cho các chuỗi a và p của TCR rất giống với các gen mã hóa KT. Vùng biến đổi cùa TCR được mã hỏa bởi cảc gen V và MHC-] đối với chuỗi a và các gen V, D, MHC-I đổi với chuỗi 0. Hầu hết khả năng biến đổi được tập trung tại các điểm nổi giữa V-J và V-D-J, tạo thành những vùng chứa vị trí liên kết với KN lúc KN này đang nàm trên rãnh của MHC. Do vậy sự đa dạng của TCR cũng được thực hiện theo cùng một cơ chế như cơ chế tạo ra sự đa dạng của thụ thể tế bào B và KT. Tuy nhiên cỏ một số điểm khác là vùng cố định cùa TCR không có các biển dị idiotyp, không tồn tại ở đạng tiết và không có vùng xuyên màng.

HịNỴNHj

í

ĩs

.5

O —í

ị

HOOC

SI ĩ—o — Cacbonhydrat

í

COOH

Hình 21.23: So sảnh cẩu trúc của TCR với K.T. (Theo Brock Biology o f Microorganism, Prentice Hall y h edition). 21.8. BỞ THỀ Bổ thể (complement) là một nhóm protein huyết thanh có đặc điểm hóa học và MD học khác nhau, có khã năng phản ứng với nhau, với KT và với màng sinh chất của tế bào. Hệ thống bổ thể bao gồm 9 protein được kỷ hiệu từ C1 đến C9, các yếu tố B, D và propecđin. Các bổ thể muốn hoạt động phải được hoạt hóa. Sự hoạt động này theo kiểu

467

phản ứng đôminô. Một bổ thể sau khi được hoạt hóa sẽ kích thích để hoạt hóa bổ thể tiếp theo. Có hai cách hoạt hóa bổ thể. Cách thứ nhất phát hiện sớm hơn gọi là hoạt hóa theo con đường cổ điển. Cách thử hai phát hiện sau gọi là hoạt hóa theo con đường nhánh hay con đường propecdin. Hai con đường này chỉ khác nhau giai đoạn đầu, ở phần chót lại giống nhau, ngoài ra gần đây còn phát hiện thêm một con đường nữa gọi là con đường lectin mà về cơ bản cũng giống con đường cổ điển.

Hình 21.24: Tổng quan về các con đường hoạt hóa bổ thể. (Theo R. Gordon, T.lan. 2000).

21.8.1. Hoạt hóa theo con đường cổ điển Cần có sự tham gia của các bổ thể C l, C4, C2 và KT. Có thể chia ra làm ố bước: (1) - Tạo phức hợp KN-KT để hoạt hóa C l. C l (esteaz) cấu tạo gồm 3 protein hợp thành: C lq, C lr và Cls. C lq gồm 3 tiểu đơn vị hợp thành. Mỗi tiểu đơn vị có hình chữ y , đẩu hình cầu. Ba tiểu đơn vị gắn với nhau như 6 bông hoa tuỉip. Khi C1 gắn vào phần Fc của 2 IgG (thuộc loại IgG l, ĩgG2, IgG3 hoặc IgM) nằm kề nhau, thì C lq được hoạt hóa. Tiểu phần này kích thích hoạt hóa C lr, rồi C lr đã hoạt hóa lại kích thích Cls. C ls đã hoạt hóa sẽ tham gia hoạt hóa C4 và C2.

468

(2) - C ls đã hoạt hóa sẽ xúc tác để tách đôi C4 thành C4a (mảnh nhỏ) và C4b (mảnh lớn). C4b sẽ gắn vào màng sính chất của tế bào và vào C2 tạo thành C4bC2. C ls đã hoạt hóa tiếp tục tách đôi C2 thành C2a (mảnh nhỏ) và C2b (mảnh lớn). C4b kết hợp với C2a thành C4b2a, đó chính là convertaz C3 (enzym bổ thể C3). (3) - Dưới tác dụng của C4b2a, C3 bị tách đôi thành C3a (mảnh nhỏ) và C3b (mành lớn). C3b gắn với C4b2a thành C4b2a3b, đó chỉnh là convertaz C5 (enzym bồ thể C5). (4) - Dưới tác dụng của C4b2a3b, C5 bị tách thành 2 mành là C5a và C5b. (5) - C5b gắn vào tế bào đích và vào C6 để tạo phức hợp C5b6, sau đó gắn với C7 để tạo thành C5b67. Phức hợp này bám vào lớp ỉipit kép của màng sinh chất. (6) - C5b67 bám vào C8 sau đó bám tiếp vào C9. C9 trùng hợp với nhau tạo thành phức hợp tấn công mảng C5Ồ6789 khoan lỗ thủng, đâm thoát nội chất và giết chết tế bào.

phức IgM hoặc IgG

Clq : ĩ : S

C1ĨNH

¥

Clq

Clr: s

C4b2a

C4a

C2b

C4BP

@

+1

C2a

C3a

Hỉnh 21.25: Chi tiết hoạt hóa bổ thể theo con đường cồ điển. (Theo ỉtGordon, T.Ian, 2000).

469

Hình 21.26: Tương tác giữa CI và phức hợp KN-KT. (Theo R.Gordon, T.ỉan, 2000).

21.8.2. Hoạt hóa theo

COD

đường nhánh

Không cần có sự tham gia của KT, nhưng cần đến yểu tố B, D và màng tế bào vi khuẩn thay cho các bổ thể C1, C2, C4 để dẫn đến tạo thành enzym hoạt hóa 03. C3b gắn vào mảng vi khuẩn, yếu tố B gắn với C3b tạo phức hợp C3bB. Khi gán với C3b, yếu tổ B để lộ vị trí gắn chịu sự tác động của yếu tố D và bị tách ra thành Ba (mảnh nhỏ) và Bb (mảnh lớn). Mảnh Bb được giữ lại tạo thành phức hợp C3bBb (tương đương C4b2a). Đó chính là convertaz C3, dùng để bổ C3. C3bBb gắn thêm C3b tạo thành C3bBb3b (tương đương C4b2a3b). Đó chính là convertaz C5. Từ đây sự hoạt hóa bổ thể sẽ diễn ra giống như phần cuối của con đường cổ điển. bề mặt bền vữtig (vĩ dụ: màng vi sinh vật)

ĩ

Đb C3c + C3d

I

iC3b -4

©

D

C3bBb >4 4 r -r ị Ba

0

C3bBbP

B+ C3b

thủy phân tự phát hoặc protease

C3

Hình 21.27: Chi tiết hoạt hóa bổ thể theo con đường nhánh (Theo RGordon, TJcmt2Ồ00).

21.8.4. H oạt hóa theo con đường lectin Con đưcmg cổ điển cỏ thế được hoạt hóa bời nhân tố khác chứ không phải bằng kháng thể. ĐTB bắt giữ và tiêu hóa vi khuẩn, virut...tiết ra cytokin kích thích tế bào gan tiết ra lectin. Lectin có khả năng gắn với đường mannoza trên mặt tế bào vi khuẩn nên có tên gọi là protein gắn mannoza (MBP = mannoz binding protein). Lectin (MBP) có cấu trúc không gian ba chiều gần giống như Clq. Hai phân tử MASP-1 và 2 phân tử MASP-2 (MBP-associated serin protein, một loại loteraz) làn lượt giống với C lr và Cls. Quá trình hoạt hóa gồm: (1) - Lectin gắn vào các gổc đường mannoza trên bề mặt vi khuẩn. (2) - Lectin được hoạt hóa sẽ hoạt hóa 2 phân tử MASP'1. (3) - Đến lượt mình, MASP-1 được hoạt hỏa sẽ hoạt hóa 2 phân tử MASPP-2. (4) - MASP-2 được hoạt hóa sẽ hoạt hóa C2 và C4. (5) - Từ đây sự hoạt hóa bổ thể giống như con đường cổ điển. Sự hoạt hóa bổ thể được điều hòa bởi các chất ức chế. Chất bất hoạt C1 là C1INH còn chất bất hoạt C3b là yếu tố I, yếu tố H cạnh ừanh vớí yếu tố B để gán với C3b, ngăn cản sự tạo thành C3bB. - Sự hoạt hóa bổ thể đẫn đến nhiều hậu quả sinh học, trước hết là làm tan tế bào nhờ phức hệ tấn công màng (C5b6789). C3b vừa gắn với thụ thể của vi khuẩn, virut vừa gắn với đại thực bào do đó làm tăng khả năng thực bào. - C3b bao phủ quanh tế bào đích sẽ làm tăng khả năng tiêu diệt tế bào đích của tế bào K trong hiệu ứng ADCC (gây độc tế bào phụ thuộc KT). Phần Fab của KT đặc hiệu bám vào tế bào đích, còn phần Fc bám vào tế bào K, giúp cho tế bào K diệt tế bào đích. - C3a và C5a là độc tố gây phản vệ, chúng tham gia vào sự giài phóng histamin khỏi tế bào mast. 21.9. MIỀN DỊCH BỆNH LÝ

21.9.1. Quả mẫn Là những tổn thương bệnh lý xảy ra do một ĐƯMD quá mức và không hợp lý, gây hủy hoại mô. Quá mẫn không biểu hiện ngay sau khi tiếp xúc với KN lần đầu mà chỉ ở những lần tiếp xúc sau. Gell và Combs đã chia quá mẫn ra làm 4 loại sau: 21.9.1.1. Quả mẫn tip Ih a y 'quá mẫn tức thì Được đặc trưng bởi các phản ứng dị ứng, xảy ra nhanh (<30 phút), ngay sau khi tiếp xúc với KN vào lần hai. Nguyên do là IgE được hình thành gắn vào thụ thể Fc của tế bào mast, phần Fab của hai IgE nằm kề nhau gắn chéo với KN, dẫn đến làm thay đổi cấu trúc

471

không gian của thụ thể, gây biến đổi tại chỗ màng, làm thoát các bọng rồi từ bọng giải phóng các chất trung gian hoạt mạch như histamin (gây co thất cơ trơn), serotonin (tăng tính thấm thành mạch), heparin (kìm hãm động mạch), ECF-A (yếu tố hỏa hướng động bạch cầu trung tính). Sự hoạt hỏa tế bào mast dẫn đến việc tổng hợp các chất mới như chất phản ứng chậm SRS-A (làm tăng tính thấm thành mạch) và yếu tố hoạt hỏa tiểu cầu (PAF - gây ngưng kết tiểu cầu và giải phỏng histamin). Quá mẫn tip I có thể biểu hiện toàn thân như sốc phản vệ, sốc do dị ứng với thuốc, sốc do dùng huyết thanh điều trị hoặc bệnh chết trong nôi (KT chổng protein có trong sữa bò). Quá mẫn loại này cũng có thể biểu hiện cục bộ như hen phể quản và viêm mũi dị ứng. 27.9.7.2. Quá mẫn tip I I hay quá mẫn gây độc tế bào Xảy ra khi KT gắn trực tiếp với KN trên bề mặt tế bào, cùng với sự tham gia của bổ thể và các tế bào hiệu ứng (tế bào K, tiểu cầu, bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân hay đại thực bào) dẫn tới làm tan tế bào đích. Chẳng hạn tể bào đích gắn với KT đặc hiệu, hoạt hóa bổ thể tạo phức hợp C5b-9 tấn công màng tế bào đích. Đồng thời, mành C3b có thể bám quanh tể bào đích và bám vào đại thực bào thực hiện oposonin hóa, giúp đại thực bào diệt tế bào đích. Quá mẫn tip II thể hiện rất rõ trong các trường hợp sau: - Khi truyền máu không phù hợp, chẳng hạn truyền máu nhóm A cho người có máu nhóm B, thì kháng nguyên trên mặt hồng cầu B sẽ phản ứng với K.T (IgM) kháng B có sẵn ừong huyết thanh người cho. Phản ứng KN-KT sẽ hoạt hóa bả thể gây hiệu ứng tan hồng cầu của người nhận, gây tổn thương thận do tắc nghẽn bời một lượng lớn màng hồng cầu và gây độc đo giải phóng phức hợp hem (C34H2304N4Fe). - Nhóm máu Rh: Khi bố mang máu Rh+ và mẹ mang máu Rh* thì 50% đứa trẻ chào đời mang Rh+. Nếu thai nhi mang Rh+ thỉ hồng cầu có thể truyền sang mẹ, kích thích tạo khảng thể kháng Rh. Kháng thể này cỏ thể truyền cho con qua nhau thai gây tan hồng cầu của thai nhi. Để tránh tai họa cho lần có thai sau, người ta phải tiêm cho mẹ KT kháng Rh (RhoGAM) để loại bỏ KN Rh ở cơ thể mẹ. - Bệnh ban xuất huyết: xẩy ra khi phân tử thuốc (hapten) gắn xung quanh tiểu cầu, lúc đó chúng ưở thành KN mạnh. KT chống phức hợp này gây hủy tiểu cầu khi có mặt bổ thể. Vì tiểu cầu cần cho sự đông máu nên nếu thiếu sẽ gây xuất huyết ứên da. 21.9.1.3. Qua mẫn tip III Phức hợp miễn địch khác với quá mẫn tip II ở chỗ KT chỉ chống lại KN hòa tan phân bổ rộng rãi ữong máu.

472

Khi tiêm KN vào cơ thể sẽ kết hợp với KT kết tủa có sẵn tạo thành phức hợp KN-KT rồi lắng đọng vào giữa các tế bào nội mô và màng đáy mao mạch. Sự hoạt hóa dòng bổ thể tạo C3a và C5a (các chất gây phản vệ), làm tăng tính thấm thành mạch (gây phù nề). Các thành phần khác là các chất hóa ứng động, thu hút bạch cầu trung tính. Cùng với tiểu cầu, các tế bào này tập trung gây nghẽn mao mạch. Bạch cầu trung tính, hoạt hóa sẽ tiết enzym proteaz, colagenaz và các chất hoạt mạch gây viêm loét. Kết quả là mao mạch đứt, xuất huyết đẫn đển hoại tử cục bộ. Hiện tương này gọi là phản ứng Arthus. Bệnh viêm cầu thận là một ví dụ của quá mẫn tip III. Phức hợp KN-KT đọng lại trong gian bào nội mô và màng đáy vách mao mạch gây viêm. Kháng nguyên có thể là vi khuẩn (sau nhiễm liên cầu), ký sinh (viêm thận sau sốt rét ác tính) protein lạ (viêm thận trong bệnh huyết thanh). 21.9.1.4.

Quá mẫn tip IVhay quá mẫn muộn

Là tổn thương do sự tương tác giữa KN với các tế bào Thi đã mẫn cảm với các KN đó gây ra. Phản ứng xảy ra muộn, sau 24 h hoặc hơn, Các thương tổn có thể do tế bào Tc phá hủy các tế bào đích đã có các KN đặc hiệu bám trên bề mặt hoặc do tác động của lymphokin, do lympho T tiết ra có tác dụng làm cho đại thực bào tập họp quá nhiều, nhập lại thành tế bào khổng lồ (u hạt). Quá mẫn do tiếp xúc là một ví dụ. Một số chất như niken, cromat, các hóa chất trong cao su, đồ hóa mỹ phẩm.. .có trọng lượng phân tử thấp (
21.9.2. Bệnh tự mỉễn Bình thường cơ thể không sinh ra ĐƯMD chống lại KN bàn thân. Khi tính tự dung nạp bị mất và cơ thể không còn khả năng phân biệt KN bản thân với KN lạ thì sẽ gây ĐƯMD chổng lại KN bản thân và dẫn đến bệnh tự miễn. Bệnh tự miễn có thể thuộc quá mẫn tip II, ỊIỊ hoặc IV. Sau đây là một số ví đụ: - Bệnh Grave (tăng nâng tuyển giáp) (Tip II): là do KT gắn vào thụ thể của tể bào tuyển giáp dành cho hónnon kích thích tuyến giáp. Hormon này do tuyến yên sinh ra. Kết quả là tuyến giốp bị kích thích sản một lượng ngày càng lớn honnon tuyến giáp dẫn dén biếu cồ do tuyến giáp phình, to. - Bệnh nhược cơ (Tip II) làm cho cơ suy yếu, Ẩy là do KT gắn vào thụ thể dành cho axetylcolin tại điểm nối xung thần kinh cơ. Do không tiểp nhận xung thần kinh do phân tử axetylcolin, cơ sẽ bị yểu, hô hấp dừng dẫn đến tử vong.

473

- Luput ban đỏ hệ thống (Systemic lupus erythematosus) (tip III) là bệnh tự miễn hệ thống bao gồm các phàn ứng của phức hợp miễn địch tạo trên mặt vùng ban đỏ hình bướm hay mặt chó sỏi. Nguyên nhân gây bệnh còn chưa rổ hoàn toàn, nhưng ở đây cơ thể đã tạo kháng thể chống kháng nguyên bản thân, như ADN thoát ra trong quá trình phân hủy bình thường của các mô, đặc biệt là da. Tác hại nhất của bệnh là khi phức hợp miễn dịch tích tụ trong cầu thận. - Bệnh viêm càu thận do nhiễm trùng dai dẳng chẳng hạn như Streptococcus pyogens (viêm họng), virut viêm gan B, các loại Plasmodium gây sốt rét, Schistoxoma spp. (sán lá) đa cung cấp liên tục kháng nguyên. Kháng thể được tạo thành kết hợp với kháng nguyên, tạo phức hợp lắng đọng ừong màng cơ bản của mao mạch ở cầu thận gây viêm thận. - Bệnh tiểu đường phụ thuộc insulin (Tip IV) do KT đặc hiệu tiêu diệt tế bào tuyến tụy sản sinh insulin. Việc thiếu insulin lảm cho lượng đường ừong máu tăng dần đến mù lòa và hoại thư... Suy giảm miễn dịch Suy giảm miễn dịch là sự ĐƯMD không đầy đù. Nguyên nhân có thể do sự khiếm khuyết hệ thống miễn dịch mang tính bẩm sinh do sai sót hoặc thiếu các gen của hệ thống miễn dịch nhận từ cha mẹ hoặc có thể do mác phải sau khi đùng thuốc, bị ung thư hoặc sau khi nhiễm trùng. Ví dụ bệnh Hodgkin (ung thư) làm giảm ĐƯMD qua trung gian tế bào hoặc nhiều loại virut giết các tế bảo của hệ thống miễn địch (HIV). Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải(AỈDS) Virut HIV là Retrovirut mang genome ARN một sợi và enzym phiên mã ngược. Bao bọc capxit là vỏ ngoài lipoprotein. Trên mặt vỏ ngoài chứa các gai glycoprotein với trọng lượng phân tử 120kDa nên gọi tát là gpl20. Các gai này gán vào thụ thể CD4 nằm ừên mặt tế bào T CD4 và đại thực bào là tế bào đích chính của HĨV. Sau khi xâm nhập vào tế bào, virut cởi bỏ vỏ ngoài nhờ enzym tiêu hóa của tế bào, sau đó sợi ARN virut đuợc sao thành ADN đơn nhở enzym phiên mẫ ngược. Sợi ADN mới tổng hợp được đùng làm khuôn để tổng hợp sợi ADN mod theo cơ chế bổ sung. Hai sợi xoắn vào nhau tạo sợi ADN xoắn kép rồi vào nhân (khi tể bào phân chia) vào tích họp vào nhiễm sắc thể chủ nhờ enzym intergraz. Ở trạng thái này người ta gọi là provirut. Provirut có thể nằm im ừong tế bào vài tháng đến vài năm. Gen HIV được biểu hiện khi có sự kích thích của yếu tổ phiên mã cùa té bào chủ gắn vào đầu lặp lại đài của provirut. Sự kích thích này dẫn đến phiên mã tạo ARN khác nhau nhờ ARN-polymeaz của té bào, một số là ARN genome của virut, một số là ARN thông tin dùng để tổng hợp protein capxit. Vò capxit kết hgrp với ARN genome tạo thành hạt virut (vỉrion) chui ra ngoài để lặp lại vòng đời mới ở tế bào CD4 khác. Chỉ một thời gian ngắn sau khi nhiễm đã có 1-100 tế bào chứa HIV. Lúc đầu cơ chế bảo vệ của cơ thể làm giảm tốc độ nhân lên của virut nhưng sau chúng vượt qua

và nhiễm ngày càng nhiều vào các tế bào T. Dựa vào số lượng tế bào T trong máu để xác định mức độ nhiễm. Nếu lượng tế bào T trong máu xuống dưới 600/(il, bệnh nhân bắt đầu mất ĐƯMD qua trung gian tế bào vả dẫn đến nhiễm bệnh cơ hội. Khi mới bắt đầu nhiễm nhiều dòng tế bào B được hình thành và ưong huyết thanh chứa một lượng lớn IgG, IgM và IgA nhưng ở giai đoạn sau của AIDS, lượng KT giảm đột ngột và các KT kháng gpl20 cũng giảm theo. Liệu pháp thành công nhẩt để chống HIV là đùng dideoxynucleozit, chủ yếu là azidotimidin hoặc ziđovuđin. Các chất này ức chế enzym phiên mã ngược của HIV và đo đó cản trở sự tổng họp genome của virut. Cho đến nay mọi loại thuổc cũng chi là làm giảm sự tiến triển thảnh AIDS. Cách tốt nhất vẫn là phòng chống, ngăn chặn sự lây lan theo các con đường quan hệ tỉnh dục, tiêm chích ma túy và truyền máu. 21.10. CÁC PHẢN ỨNG HUYÉT THANH KT tồn tại trong huyết thanh miễn dịch, do đỏ các phản ứng KN-KT dùng kháng huyết thanh gọi là phàn ứng huyết thanh học. Phản ứng huyết thanh dùng để chẩn đoán KN hoặc KT khi đã biết một thành phần, gọi là phương pháp chẩn đoán huyết thanh học. Sự kểt hợp giữa KN-KT hay đúng hom lả giữa epitop và paratop dựa trên ba lực liên kết: Lực Vander-Wals, lực hút tĩnh điện giữa các nhóm chức và lực liên kết giữa các cầu nối hydro. Phản ứng xẩy ra theo hai pha, pha đầu xảy ra nhanh, đặc trưng bởi sự hấp phụ KN gọi là pha đặc hiệu hay pha không nhìn thấy. Pha sau xẩy ra chậm, biểu hiện ra ngoài có thể nhìn thấy được như kết tủa hoặc ngưng kết. Phản ứng KN-KT phụ thuộc vào điều kiện pH, nhiệt độ, chẩt điện giải, các ion Na+, c r , Mg**. ..Nhiều phản ứng xảy ra khó nhận biết do đỏ cần các chất chỉ thị như hồng cầu, thuốc nhuộm huỳnh quang, chất phóng xạ... Sau đây là các phản ứng chính: - Phản ứng kểt tủa-. Khi cho KT phản ứng với KN hòa tan. Ổ nồng độ chuẩn sẽ xuất hiện kết tủa. Phản ứng bị ức chế khi quá thừa một trong hai thành phần trên. Phản ứng đùng để xác định KN khi đã có sẵn KT đặc hiệu hoặc xác định KT khi đã có sẵn KN hòa tan đặc hiệu. Có thể thực hiện phản ứng kết tủa trong thạch, KN và KT khuếch tán trong thạch, nơi gặp nhau tạo thành vòng cung kết tủa. - Phản ứng ngưng kết'. Tương tác như phản ứng kết tủa nhưng đòi hỏi KN hữu hình có kích thước lởn như hồng cầu, tế bào vi sinh vật. KN liên kểt chéo với KT kết dính với nhau tạo thành từng cụm có thể nhìn thấy bằng mắt thường.

475

Cho KN vào dãy ống nghiệm chứa kháng huyết thanh với độ pha loãng tăng dần. Hiệu giá KT (titer) là ở độ pha loãng cao nhất mà vẫn xẩy ra ngưng kết. Ví dụ với độ pha loẫng 1/20,1/40, 1/80, 1/640 đều ngưng kết thì 1/640 là hiệu giá KT.

Phản ứng trung hòa: xẩy ra khi KT bao vây, trung hòa ngoại độc tố vi khuẩn hoặ bao vây virut. Ví dụ: KT bao quanh virut và ngưng kết virut. Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang: dựa trên nguyên tắc là thuốc nhuộm khi bị kích thích bởi bức xạ có bước sóng đặc biệt sẽ phát sáng. Chăng hạn fluorescein phát huỳnh quang màu vàng lục còn rodamin phát huỳnh quang màu đa cam.

476

Chương 22

SẢN XUẤT VÀ SỬ DỤNG VACXIN

22.1. L ỊC H s ử

Antoni van Leeuwenhoek phát minh ra kính hiển vi và nhìn thấy vi khuẩn vào năm 1684. Hơn 100 năm sau Edward Jenner là nguời đầu tiên trở thành phương pháp chủng đậu để phòng ngừa bệnh đậu mùa. Trong giai đoạn từ 1857 đến 1885 Louis Pasteur trở thành “Ông tổ” của ngành Vi sinh vật và cũng là người đầu tiên chế tạo ra vacxin phòng bệnh than và bệnh dại.

Hĩnh 22.1: Edward Jenner.

477

Bảng 22.1: Niên biểu phát hiện mầm bệnh và sản xuất vacxin a- Quá trình phát hiện mầm bệnh Năm 1863 1873 1878 1879 1880 1882 1883 1884 1885 1886 1887 1891 1894 1896 1901 1905 1906 1908 1909 1911 1933 . 1934 1938 1940 1953 1964 1967 1969 1970 1973 1976 1977 1983 1989 17U/ 1990 1884

Mầm bệnh Vi khuẩn than Vi khuẩn hủi (phong) Vi khuẩn sốt hồi quy Vi khuẩn tụ cầu Vi khuẩn lậu Vi khuẩn thương hàn Vi khuẩn lao Vi khuẩn tả Vi khuẩn liên cầu Vi khuẩn bạch hầu, uốn ván Vi khuẩn Exơli Vi khuẩn Bruccela Vi khuẩn não mô cầu Vi khuẩn lỵ Vi khuẩn dịch hạch Vi khuẩn gây ngộ độc thịt Virut sốt vàng Vi khuẩn giang mai Vi khuẩn ho gà Virut gây ung thư Virut bại liệt Virut Thủy đậu Virut cúm Virut quai bị và virut viêm não Nhật Bản Virut sởi Vừut sốt xuất huyết Dengue Virut Ađeno Virut.viêm gan B Marburg Lazza Dengue Virut viêm gan A Virut Ebola Virut viêm gan D VừutHIV Virut Viêm g an c Virut viêm gan E Vinxt viêm gan G

Người phát hiện L.Pasteur H.Hansen O.Obermeier L.Pasteur A.Neisser K.Eberth, G.Gaffky R.Koch R.Koch T.Bilroth, L. Pasteur E.KIebs, F.Loffler,A.Nicolaev T.Escherichi D.Bruce,B.Bang, G.Traum A.Weichselbaum K.Shiga A.Yersin E.Van Ermengen W.Reed E.Schaudina, E.Holiman Bordet-Gengou Ellerman-Bang Aragĩio-E.Paschen U.Smith-H.ADNewes C.Johnson-E.Goodpasture H.Plotz A.Smorodissev-A.Chumacov w Row Blumberg Fill

Frinston Rizzetto Montagnier Choo Reyes Simons

b. Sản xuất vacxỉn Năm 1796 1880 1885 1892 1896 1598 1915 1921 1923 1926 1927 1932 1933 1937 1938 1940 1943 1949 1953 1957 1960 1967 1968 1969 1971 1974 1978 1979 1980 1981 1983 19S3 1986 1988 1992 1993 1996 1998

Loại vacxin Vacxin đậu mùa Vacxin bệnh than Vacxin dại bất hoạt Vacxin tà Vacxin tả Vacxin thương hàn Vacxin chống hoại thư Vacxin BCG phòng lao Vacxin ho gà Vacxin bạch hầu Vacxin uốn ván Vacxin sống sốt vàng Vacxin Weil’s Vacxin cúm bất hoạt Vacxin viêm não Vacxin dại bất hoạt Vacxin cúm sống Vacxin Lepto Vacxin bại liệt chết (Salk) Vacxin bại liệt sống uống Vacxin sởi sổng Vacxin quai bị bất hoạt Vacxin viêm não mù c Vacxin Rubella sống Vacxin viêm não mù A Vacxin Rubella sống Vacxin viêm gan B huyết tương Vacxin Viêm phế cầu Vacxin đại nuôi cấy tể bào Vacxin ho gà vô bào Vacxin thủy đậu Vacxin viêm gan B tái tổ hợp Vacxin sởi+quai bị+Rubella Vacxin Hib Vacxinviêm gan A Vacxin cộng hợp 5 thành phần DTPIPV-Hib Vacxin DPT-Hib-HepB Vacxin Rota và Lyme

Người đề xuất E.Jenner Louis Pasteur Louis Pasteur Haffkine Kolle Raita Weinberg L.c .A.Calmette-A .F. Mguerin Blum-Madsen G .Ramon-Glenny Ramon-Zoeller M.Theiler Wani Salk A.Cmorodinsov-E.Levkovich D.Semple Francis Varpholomeev-G.Kovalxkii Salk Sabin J.F.Enders,Yokuno,A.A.Smordintsev (HoaKỳ) Gotschlich (HoaKỳ-Bi) Gotschlich Takahashi Maufas Ausừian (Pháp-Nhật) Sato Takahshí MerkCo.Ltđ (Hoa Kỳ), Myanohara (Nhật) Merieux

479

22.2. VACXIN

22.2.1. Sự phát triển của vacxỉn Vacxin học (Vacxinology) được mở đầu thành công vào cuối thế kỷ 18 bởi bác sĩ thú y E.Jenner (Anh) vói vacxin làm từ chủng gây bệnh đậu bò, tiêm cho cậu bé 13 tuổi J.Philip. Hiện nay, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã công nhận tiêm vacxin là phương cách bảo vệ hiệu quả, giúp nhân loại tránh được các bệnh truyền nhiễm. Từ 1880, Louis Pasteur (Pháp) đã sáng chế thành công vacxin chống bệnh Than và nhiều loại vacxin khác ữên ý tưởng của Jenner, tạo ra một trường phái riêng tồn tại cho đến ngày nay. Sang nửa thế kỷ 20, mặc dù công nghệ vacxin có những bước tiến vượt bậc và đạt nhiều thành tích đáng kể, nhưng cũng đã nảy sinh nhiều thách thức, nhiều bệnh dịch nguy hiểm tái phát và mới xuất hiện. Tình ữạng miễn dịch mà cơ thể có được sau khi sử dụng vacxin là kết quả của sự đáp ứng miễn dịch đổi với các thành phần kháng nguyên có trong vacxin. Tùy từng loại vacxin, hiệu lực bảo vệ có thể đo miễn dịch dịch thể, miễn dịch qua trung gian tế bào hoặc phối hợp cả hai loại. Ngoài miễn dịch đặc hiệu, vacxin còn có khả năng tăng cưởng cả miễn dịch không đặc hiệu như làm tăng quá trình thực bào nhờ kháng thể đỏng vai trò là yếu tô opsonin đặc hiệu và nhờ lymphokin hoạt hóa đại thực bào...

22.2.2. Nguyên tắc sử dụng vacxin Việc sử đụng vacxin phải đảm bảo các nguyên tắc sau đây: - Tiêm chủng trên phạm vi rộng, đạt tỷ lệ cao. - Tiêm chủng đúng đối tượng. - Bắt đầu tiêm chủng đúng lúc; bảo đảm đúng khoảng cách giữa các lần tiêm chủng; tiêm chủng nhắc lại đúng thời gian. - Tiêm chủng đúng đường và đúng liều lượng. - Nắm vững phương pháp phòng vả xử trí các phản ứng không mong muốn do tiêm

chủng.

- Bảo quản vacxin đúng quy định. 22.2.2.1.

-

Phạm vỉ và ộ? íệ tiêm chửng

về phạm vi tiêm chủng:

Phạm vi tiêm chủng được quy định theo tình hình dịch tễ của từng bệnh. Phạm vi tiêm chủng đương nhiên không giống nhau giữa các nước. Ngay cả các khu vực trong một nước cũng có thể cỏ sự khác nhau. Những quy định này lại có thể thay đổi theo thời gian do sự thay đổi về dịch tễ học của bệnh nhiễm khuẩn, v ề lý thuyết, người ta thường nói

480

tiêm chủng càng rộng càng tốt. Thực tế thì không thể thực hiện được điều đó vì những lý do sau đây: Thử nhất, sẽ rất tốn kém (chi phí cho việc mua hoặc sản xuất vacxin và cho việc tổ chức tiêm chủng); thứ hai, tuy các phản ứng không mong muốn do vacxin gây ra rất ít nhưng không phải là không có.

- về tỷ lệ tiêm chùng: Những khu vực có lưu hành bệnh truyền nhiễm, tiêm chùng phải đạt trên 80% đối tượng chưa có miễn dịch mới có khả năng ngăn ngừa được dịch. Neu tỷ lệ tiêm chùng chi đạt trong khoảng từ 50% đến 80%, nguy cơ xảy ra dịch chi giảm bót. N ếu tỷ lệ tiêm chủng

dưới 50% dịch vẫn dễ dàng xảy ra. 22.2.2.2. Đ ố i tư ợ ng tiêm chủng

Đối tượng cần được tiêm chùng một loại vacxin nào đó là tất cả những người có nguy cơ nhiễm vi sinh vật gây bệnh mà chưa có miễn dịch. Trẻ em là đối tượng cần được đặc biệt quan tâm. Sau khi hết miễn dịch thụ động do mẹ truyền (trong thời gian khoảng 6 tháng) nguy cơ mắc bệnh của trẻ rất lớn. Mặt khác miễn dịch thụ động nhờ kháng thể truyền qua rau thai hoặc qua sữa chỉ có đối với những bệnh mà cơ chá bào vệ chù yếu do miễn dịch dịch thể. Đối với những bệnh mà cơ chế bảo vệ là miễn dịch qua trung gian tế bào thì trẻ có thể bị bệnh ngay từ những tháng đầu tiên sau khi sinh. N h ữ n g h iểu b iết n à y là cơ s ở cho việc quy đ ịn h th ờ i đ iểm b ắ t đ ầ u tiê m ch ủ n g

cho trẻ em. Trừ những đổi tượng chống chỉ định, tất cả trẻ em đều phải được tiêm chùng. Đối với người ]ón, đoi tượng tiêm chủng thu hẹp hơn. Thường chỉ tiến hành tiêm chủng cho những nhóm người có nguy Cơ cao. Trong thời kỳ mờ cừa, số lượng người đi du lịch giữa các nước ngày càng lớn, tiêm chủng cho người du lịch đã trở thành yêu cầu bắt buộc đối vớỉ cả nước có công dân đi du lịch và cả nước đón khách đu lịch. Trong những năm gần đây, đề phòng bệnh uốn ván sơ sinh, phụ nữ ở lứa tuổi sinh để được tiêm phòng uổn ván.

Hình 22.2: Tiêm chùng vacxin.

481

Diện chống chỉ định tiêm chùng (không được tiêm chủng) có hướng dẫn riêng đối với mỗi vacxin. Nói chung không được tiêm chủng cho các đối tượng sau đây: - Những người đang bị sốt cao. Những trường hợp đang bị nhiễm khuẩn nhẹ không sốt hoặc chi sốt nhẹ thì không cần phải hoãn tiêm chủng. - Những người đang ở trong tình trạng dị ứng. Những người có cơ địa dị ứng hoặc có lịch sừ gia đình bị dị ứng vẫn tiêm chủng được, nhưng cần phải theo dõi cẩn thận hơn. - Vacxin sống giảm độc lực không được tiêm chủng cho những người bị thiếu hụt miễn dịch, những người đang dùng thuốc đàn áp miễn dịch hoặc những người mắc bệnh ác tính. - Tất cả các loại vacxin virut sống giảm độc lực không được tiêm chủng cho phụ nữ đang mang thai. 22.2.2.3. Thời gian tiêm chủng Việc tiêm chủng được tiến hành thường xuyên hoặc tập trung tiêm chủng hàng loạt tùy thuộc vào yêu cầu của mỗi loại vacxin và các điều kiện cụ thể khác. - Thời điểm tổ chức tiêm chủng: Khi đã xác định được quy luật x u ấ t h iệ n dịch, cần phải tiến hành tiêm chủng đón tnrớc mùa địch, để cơ thể có đủ thời gian hình thành miễn dịch. Đối với vacxin được tiêm chủng làn đầu, thời gian tiềm tàng kéo dài từ 24 giờ đến 2 tuần (trung bình khoảng 1 tuần), tùy thuộc vào bản chất vacxin và tính phản ứng cùa cơ thể. Hiệu giá kháng thể đạt được đỉnh cao nhất sau khoảng 4 ngày đến 4 tuần (trung bình 2 tuần). Đó là kết quả của đáp ứng miễn dịch tiên phát. Khi tiêm chủng nhắc lại, thời gian tiềm tàng sẽ rút ngắn, hiệu giá kháng thể đạt được đỉnh cao nhất chỉ sau một sổ ngày nhờ những tế bào lympho có trí nhớ miễn dịch. Đó là kết quả của đáp ứng miễn dịch thứ phát. ' Khoảng cách giữa các lần tiêm chủng: Đối với những vacxin phải tiêm chủng nhiêu lần (khi tạo miễn dịch cơ bản), khoảng cách hợp lý giữa các lần tiêm chửng là 1 tháng. Neu khoảng cách này ngắn hơn, mặc dù tiêm chủng lần sau nhưng kết quà đáp ứng của cơ thê vẫn chì như tiên phát, đáp ứng miễn dịch thứ phát sẽ không có hoặc bị hạn chế. Ngược lại, vì một ]ý do nào đó phải tiêm chùng lần tiếp theo sau hơn 1 tháng, hiệu quả miễn dịch vẫn được đảm bảo, vì vậy lần tiêm chủng trước vẫn được tính. Tuy nhiên, không nên kéo dài việc tiêm chủng nếu không có những lý do bắt buộc, vi trẻ có thể bị mắc bệnh trước khi được tiêm chủng đầy đủ. - Thời gian tiêm chủng nhắc lại: Tùy thuộc vào thời gian duy tri được tình trạng miễn dịch có đủ hiệu lực bảo vệ của mồi loại vacxin. Thời gian này khác nhau đối với các loại vacxin khác nhau. Khi tiêm chủng nhấc lại thường chỉ cần 1 lần. Với lần tăng cường này, cơ thể sẽ đáp ứng miễn dịch nhanh và mạnh hơn, cho dù kháng thể của lần tiêm chủng trước chỉ còn lại rất ít. 482

22.2.2.4. Liều lượng và đường đưa vacxin vào cơ thể a- Liều lượng

Liều lượng vacxin tùy thuộc vào loại vacxin và đường đưa vào cơ thể. Liều lượng quá thấp sẽ không đủ khả năng kích thích cơ thể đáp ứng miễn dịch. Ngược lại, liều lượng quá lớn sẽ dẫn đến tình trạng dung nạp đặc hiệu đối với lần tiêm chủng tiếp theo. b- Đường tiêm chủng

- Chủng (rạch da): đây là đường cổ điển nhất, được thực hiện ngay từ lúc Jenner sáng chế ra vacxin phòng bệnh đậu mùa. Đối vói vacxin này, đường chủng vẫn được dùng cho tới khi bệnh đậu mùa bị tiêu diệt hoàn toàn trên hành tinh của chúng ta (1979), không cần phải chủng đậu nữa. Ngày nay đường chủng vẫn còn được sử đụng cho một số ít vacxin. - Đường tiêm: Có thể tiêm trong da, tiêm dưới da hoặc tiêm bắp, không bao giờ tiêm vacxin vào đường tĩnh mạch. Tiêm trong da có thể được thực hiện bằng bom kim tiêm hoặc bằng bơm nén áp lực không kim. - Đường uống; Đường uống là đường đưa vacxỉn vào cơ thể dễ thực hiện nhất. Tuy nhiên chỉ thực hiện được đối với vacxin không bị dịch đường tiêu hóa phá hủy. Cùng với tiến bộ trong sự hiểu biết về vai trò của miễn dịch tại chỗ do IgA tiết, những vacxin phòng bệnh đường tiêu hóa (hoặc bệnh ở nơi khác nhưng vi sinh vật xâm nhập vào ca thể theo đường tiêu hóa) đã được sử dụng hoặc đang được nghiên cứu đưa vào cơ thể bằng cách uống. Đường uống kích thích miễn địch tiết tại chỗ mạnh hom nhiều so với đường tiêm. Ngoài 3 đường nói trên, vacxin còn được vào cơ thể theo một số đường khác như khí dung, đặt dưới lưỡi, thụt vào đại tràng, những đường này ít được sử dụng. 22.2.2.5. Các phản ứng phụ đo tiêm chủng v ề nguyên tấc, vacxin phải đảm bảo đù độ an toàn. Song trên thực tế không thể đạt được mức độ an toàn tuyệt đối. Tất cả các vacxin đều có thể gây ra phản ứng phụ ở một sổ người. - Phản ứng tại chỗ: Những phản ứng nhẹ thường gặp sau tiêm chủng là nơi tiêm có thể hơi đau, mẩn đỏ, hơi sưng hoặc nổi cục nhỏ. Những phản ứng này sẽ mất đi nhanh chóng sau một vài ngày, không cần phải can thiệp gì. Nấu tiêm chủng không đàm bảo vô khuẩn, nơi tiêm có thể bị viêm nhiễm, mưng mủ. - Phản ứng toàn thân: Trong các phản ứng toàn thân, sốt hay gặp hơn cả (10% đến 20%). Sốt thường hết nhanh sau một vài ngày. Co giật có thể gặp nhưng với tỷ lệ rất thấp (1/10.000), hầu hết khỏi không để lại di chứng gì. Một sổ vacxin có thể gây ra phản ứng nguy hiểm hơn, trong đỏ có sốc phàn vệ, tuy nhiên tỷ lệ rất thấp.

483

Khi bàn về những phản ứng đo vacxin, rất cần phải nhấn mạnh rằng mức độ nguy hiểm do vacxin nhỏ hem rất nhiều so với mức độ nguy hiểm do bệnh nhiễm khuẩn tương ứng gây ra. Thí dụ, tỷ lệ biến chứng nguy hiểm do bệnh ho gà gấp hàng trăm đen hàng nghìn lần phản ứng nguy hiểm do vacxin bạch hầu - ho gà - uốn ván (vacxin DPT) gây ra. 22.2.2.6.

Bảo quản vacxin

Vacxin rất dễ bị hòng nếu không được bảo quản đúng. Chất lượng vacxin ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu lực tạo miễn dịch, vì vậy các vacxin cần phải được bảo quản tốt ngay từ lúc nỏ được sản xuất cho tới khi được tiêm chủng vào cơ thể. Thường quy trinh bảo quản các vacxin không giống nhau, nhưng nói chung các vacxin đều cần được bảo quản trong điều kiện khô, tối và lạnh. Nhiệt và ánh sáng phá hủy tất cả các loại vacxin, nhất là những vacxin sống như vacxin sởi, bại liệt và vacxin BCG sổng. Ngược lạì, đông lạnh phá hủy nhanh các vacxin giải độc tố (như vacxin phòng uốn ván và bạch hầu). Trong quá trình sử dụng ở cộng đồng, các vacxin cần được bảo quản ở nhiệt độ ừong khoảng từ 2°c đến 8°c. Một trong những công việc quan trọng nhẩt trong việc tổ chức tiêm chủng là tạo lập được dây chuyền lạnh. Dây chuyền lạnh không đơn thuần là có các nhà lạnh, tủ lạnh, các phích đá hoặc các hộp cách nhiệt mà còn phải lưu ý cả những khâu trung gian trong quá trình vận chuyển vacxin và tiến hành tiêm chủng. Vacxin nếu đã bị phá hủy dù có được bảo quản lại ở điều kiện thích hợp cũng không thể có hiệu lực trờ lại, cũng không có tác dụng nữa, phải loại bỏ. Một điểm cũng cần được lưu ý là các hóa chất tẩy uế, sát trùng đều cỏ thể phá hủy vacxin. Nếu các dụng cụ tiêm chủng được khử trùng bằng hóa chất thì chi càn một lượng rất ít đính lại cũng có thể làm hỏng vacxin. Vì vậy các dụng cụ tiêm chủng trước khi dùng phải được rửa sạch sau đó khử trùng ở nhiệt độ cao bằng cách luộc hoặc hấp. 22.3. TIỀU CHUẨN CỦA VACXIN Hai tiêu chuần cơ bản nhất của vacxin là an toàn và hiệu lực. 22.3.1. An toàn Một vacxin lý tưởng khi sử dụng sẽ không gây bệnh, không gây độc và không gây phản ứng. Sau khi sản xuất vacxin phải được cơ quan kiểm định nhà nước kiểm tra chặt chẽ về mặt vô khuẩn, thuần khiết và không độc, gây bệnh.

484

V6 khuẩn: Vacxin không được nhiễm các vi sinh vật khác, nhất là các vi sinh vậ

- Thuần khiết: Ngoài kháng nguyên đưa vào để kích thích cơ thể đáp ứng miễn dịch chống vi sinh vật gây bệnh, không được lẫn các thành phàn kháng nguyên khác cỏ thể gây ra các phản ứng phụ bất lợi. - Không độc: Liều sử dụng phải thấp hom rất nhiều so với liều gây độc. Tuy nhiên, như đã nêu ở phần 2.5., không cỏ vacxin nào đạt được độ an toàn tuyệt đổi. Khi cân nhắc để quyết định xem một vacxin nào đó có được đưa vào sử dụng hay không, cần phải so sách giữa mức độ phản ứng do vacxin và tính nguy hiểm của bệnh nhiễm khuẩn tương ứng. 22.3.2. Hiệu lực Vacxin có hiệu lực lớn lả vacxin gây được miễn dịch ở mức độ cao và tồn tại trong một thời gian dài. Hiệu lực gây miễn dịch của vacxin trước hết được đánh giá trên động vật thí nghiệm, sau đó trên thực địa. Trên động vật thí nghiệm: Cách thứ nhất, đánh giá mức độ đáp ứng miễn dịch thông qua việc xác định hiệu giá kháng thể hoặc xác định mức độ dương tính của phản ứng da. Cách đánh giả này không cho biết hiệu lực bảo vệ. Cách thứ hai, xác định tỷ lệ động vật đã được tiêm chủng sống sót sau khi thử thách bằng vi sinh vật gây bệnh. Dù đã được cơ quan kiểm định nhà nước kiểm tra vả đã được đánh giá trên động vật, trước khi đưa ra tiêm chủng rộng rãi, vacxin đều phải được thử nghiệm trên thực địa (field test): Vacxin được tiêm chủng cho một cộng đồng, theo dõi thống kê tất cả các phản ứng phụ và đánh giá khả năng bảo vệ khi mùa dịch tới. Ngoài 2 tiêu chuẩn trên, để chọn một vacxin tiêm chủng, người ta còn quan tâm đến giá thành và tính thuận lợi cho việc tiến hành tiêm chủng.

22.3.3. Các nhân tế ảnh hưởng đến hiệu lực của vacxin 22.3.3. L Bản chất và liều lượng cửa vacxin Hiệu lực của vacxin sẽ cao nếu chứa các kháng nguyên cỏ tính sinh miễn địch mạnh. Mặt khác vacxin phải được sản xuất từ các chủng vi sinh vật “đủ tư cách đại diện” cho tác nhân gây bệnh. 22.3.3.2. Đường đưa vacxin vào cơ thể 22.3.3.3, Các chất phụ gia miễn địch Các chất phụ gia miễn dịch được đùng rộng rãi nhất ỉà các hợp chất của nhôm (aluminum hydroxit hoặc aluminum photphat). Chất phụ gia miễn dịch có tác dụng làm cho vacxin chậm giáng hóa, vì vậy có thể giảm được liều lượng và số lần tiêm chùng. Chất

485

phụ gia còn có tác dụng kích thích cơ thể đáp ứng miễn dịch mạnh hơn. Như vậy chất phụ gia miễn dịch vừa có tác dụng làm tăng hiệu quả kinh tế, vừa có tác dụng làm tăng hiệu quả miễn dịch. 22.3.3.4. Tinh trạng dinh dưỡng Những ảnh hưởng của tình trạng dinh dưỡng đến đáp ứng miễn dịch đã được xác định. Những kết quả nghiên cứu cho thấy, suy dinh dưỡng làm giảm đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào rõ hơn miễn dịch địch thể. Tuy nhiên các trẻ suy dinh dưỡng vẫn cần được tiêm chủng vì 2 lý do: Thử nhất, chúng vẫn có khả năng đáp ứng miễn dịch; thứ hai, chúng rất dễ bị mắc các bệnh truyền nhiễm. 22.3.3.5. Kháng thể do mẹ truyền Kháng thể do mẹ truyền có khả năng ức chế đáp ứng miễn dịch của loại vacxin tương ứng. Vì vậy hiệu lực miễn dịch của một số vacxin sẽ bị hạn chế nếu tiêm chủng quá sớm khi hiệu giá kháng thể do mẹ truyền còn tương đối cao. Những bệnh như lao, bại liệt có cơ chế đề kháng chủ yếu là miễn dịch qua trung gian tế bào, đứa trẻ không được mẹ truyền, vì vậy phải được tiêm vacxin phòng lao và uổng vacxin phòng bại Hệt từ rất sớm ngay những ngày đầu tiên sau khi sinh. 22.4. PHÂN LOẠI VACXIN Vacxin có thể chia thành 3 loại: 1) Vacxin giải độc tố, 2) Vacxin chết toàn thể hoặc kháng nguyên tinh chế, và 3) Vacxin sống giảm độc lực. 22.4.1. Vacxin giải độc tố Loại vacxin này được sản xuất từ ngoại độc tố của vi khuẩn đã được làm mất tính độc nhưng vẫn giữ được tính kháng nguyên. Vacxin giải độc tố kích thích cơ thể sản xuât ra kháng độc tố, là loại kháng thể có khả năng trung hòa ngoại độc tố. Vacxin này nhằm phòng chổng các bệnh nhiễm trùng đo vi khuẩn gây bệnh chủ yếu bằng ngoại độc tố.

22.4.2. Vacxin chết toàn thể hoặc kháng nguyên tinh chế Loại vacxin này sản xuất từ các vi sinh vật gây bệnh. Sau khi vi sinh vật đã bị giết chết có thể lấy toàn bộ huyền dịch làm vacxin (vacxin toàn thể), hoặc tinh chế lấy các thành phần kháng nguyên quan trọng, đó là các “kháng nguyên bảo vệ” (protective antigens).

486

Các kháng nguyên này chủ yếu kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể. Các kháng thể được hình thành có thể trực tiếp giết chết vi sinh vật, ngăn cản sự bám dính cùa chúng vào tế bào cơ thể vật chủ, làm tăng khả năng thực bào hoặc phối hợp các cơ chế trên. 22.4.3. V acxin sống giảm độc lực Loại vacxin này sản xuất từ vi sinh vật gây bệnh hoặc vi sinh vật giống vi sinh vật gây bệnh về cấu trúc kháng nguyên, đã được làm giảm độc lực không còn khả năng gây bệnh. Vacxin sống tạo ra trong cơ thể một quá trình nhiễm khuẩn tự nhiên, kích thích cơ thể đáp ứng cả miễn dịch toàn thể và miễn dịch tại chỗ, cả miễn dịch dịch thể và miễn địch qua trung gian tế bào. Tuy nhiên điều phải quan tâm đặc biệt là tính an toàn của vacxin sống, phải đảm bảo không còn khả nàng gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh rất nhẹ, và vi sinh vật phải có tính di truyền ổn định không trở lại độc lực ban đầu. 22.5. PHỐI HỢP VACXIN Mục đích chính của việc phối hợp vacxin là giảm bớt số mũi tiêm chủng hoặc làm giảm bớt sổ lần tổ chức tiêm chủng. Có 2 loại phối hợp vacxin: 1) Tiêm chủng vacxin phối hợp (trộn các vacxìn với nhau, tiêm chủng cùng một lần, cùng một đường). 2) Tiêm chủng nhiều vacxin riêng biệt trong cùng một thời gian, có thể ở các vị trí khác nhau hoặc theo những đường khác nhau.

Hình 22.4: Tiêm vacxìn cho trẻ em. Phối hợp vacxin phải đảm bảo giữ được hiệu lực tạo miễn dịch và không gây ra tác hại gì. Hiệu lực tạo miễn dịch đối với mỗi thành phần vacxin ít nhất phải bằng khi chúng được tiêm chủng riêng rẽ. Một sổ trường hợp khi phổi hợp vacxin tạo ra được đáp ứng miễn dịch mạnh hơn. Ngược lại có những trường hợp phổi hợp không hợp lý làm giảm hiệu lực tạo miễn dịch. Sự phối hợp vacxin hợp lý sẽ không làm tăng tỷ lệ phản ứng phụ. 487

Nghĩa là độ an toàn vẫn được đảm bảo như khi chúng được tiêm chủng riêng rẽ ờ những thời gian khác nhau. 22.6. PHÁT TRIẺN VACXIN 22.6.1. Tiêu chuẩn chấp nhận - Tuyệt đối vô khuẩn và an to à n khi sử dụng với số iượng lớn. “ Hiệu quả bảo vệ cộng đồng tương đối cao và phải kéo dài (có thể suốt đời người). - Thích ứng với tình h ìn h dịch tễ ở địa phương. - Được dung nạp tốt, dễ sử đụng, ổn định chất lượng kể cà ở các nước vùng nhiệt đới nóng ẩm vả giá cả được chấp nhận, 22.6.2. T hòi kỳ sơ khai Đậu mùa, sau bệnh sẽ không mắc lại, biện pháp miễn dịch chủ động do Jenner (1796) đề xuất với chủng đậu Bò, Kapikian và cộng sự đề nghị tiêm vacxin cho trẻ chống bệnh viêm dạ dày ruột qua đường uống Rotavỉrut từ khỉ theo phưomg pháp Jenner.

Hình 22.4: Vơcxin phòng chống đại.

H ình 22.6: P hân lập m ầm bệnh.

488

Hình 22.5: Vacxin BCG phỏng lao.

H ình 22.7: N uôi cổy m ầm bệnh trên p h ô i g à

Hĩnh 22.8: Nuôi cấy tể bào động vật trong nồi lẻn men. Năm 1885 Pasteur đùng vacxin làm yếu qua cấy truyền ừên thỏ phòng dại - phát sinh từ vacxin. Từ đó tạo nguyên lý “làm yếu mầm bệnh bằng cấy truyền sang cơ chất không thích hợp” còn gọi ỉà “phương pháp cố định”. 22.6.3. Thời kỳ giải độc tổ và vacxin bất hoạt - 1884 Laffler phát hiện vi khuẩn bạch hầu và Roux - Yersin phát h iệ n độc tố bạ* h hầu gây bệnh. - Sau khi Behring - Kitasato phát hiện kháng huyết thanh thì Gleumy - Ramon giải độc độc tố bằng formalin - ra đời vacxin giải độc tố bạch hầu 1923. - Tiến đến phát minh vacxin toàn thân tế bào bất hoạt chống vi khuẩn thương hàn, tà. ho gà, vacxin virut bất hoạt khác như: Bại liệt Salk, viêm não Nhật Bản, cúm. 22.6.4. Thời kỳ vacxỉn sống Nuôi cấy virut trong phòng thí nghiệm đã thành công vào giữa thế kỷ 20 nhờ đó việc sản xuất vacxin phất triển. Enders tạo môi trường nuôi virut từ 1948. Năm 1954 Sabin phái triển vacxin bại liệt bất hoạt bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào thận khỉ đồng thời Sabin và cộng sự làm vacxin bại Hệt sống gồm 3 typ, thực địa ờ Rumani thành công. Tiếp đó là các vacxin sổng như: sốt vàng, sởi, quai bị, rubella (thập kỷ 60), Rota, Bại liệt Sabin. 22.6.5. Thời kỳ công nghệ gen Virut học và nuôi cấy mô phát triển là tiền đề cho phát triển vacxin. Đặc biệt khi miễn dịch học hiện đại và công nghệ gen tái tổ hợp ra đời đâ kích thích mạnh mẽ nghiên cứu sản xuất vâcxin công nghệ cao. Trước đây chi có các bác sĩ nhân y và thú y quan tâm đến vacxin. Đến nay, nhiều nhà khoa học thuộc các lĩnh vực sinh, hóa, lý và công nghệ đã kết hợp với nhau nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen và protein trong phát triển vacxin.

489

Đầu tiên là với vacxin viêm gan B: Tác nhân gây bệnh là virưt nhóm ADN mà tiểu phần HBs có trong máu bệnh nhân là kháng nguyên chính. Vì chưa có thể sản xuất lớn, việc thu nhóm HBs lúc đầu dựa vào nguồn máu bệnh nhân nên dễ lây nhiễm, số lượng có hạn và không an toàn. Khắc phục điều này có hai nhà sản xuất Merck (Mỹ) và Matsubazo (Nhật) đồng thời tim ra phưcmg pháp tái tổ hợp dùng nấm men sản xưất kháng nguyên HBs. ADN của virut viêm gan B được gắn vào nấm men thông qua pỉasmiđ và nuôi cấy nấm men tái tổ hợp sẽ sản sinh số lượng lớn kháng nguyên dùng pha chế vacxin. Phương pháp mới đã thay thế hoàn toàn công nghệ cổ điển và đưa ngành sản xuất vacxin bước vào kỷ nguyên mới.

Hình 22.9: Vacxin phòng tránh một số ung thư.

22.6.6. Năm hướng phát triển trong tương lai - Sử dụng các phụ gia (adjuvant) mới, nhằm gây ra loại đáp ứng mịễn dịch mong muốn. Thí dụ, chất nhôm photphat và các oligonucleotit chứa CpG demetyl hóa đưa vào vacxin khiến đáp ứng miễn dịch phát triển theo hướng dịch thể (tạo kháng thể) thay vì tê bào. - Vacxin polypeptit: tăng cường tính sinh miễn dịch nhờ liên kết tốt hcm với các phân tử MHC: peptit nhân tạo Vi giống virut, Vĩ kia gán MHC; đoạn peptit mô phỏng một quyết định kháng nguyên (epitop).

490

- Anti-idiotyp: idiotyp là cấu trúc không gian của kháng thể tại vị trí gán kháng nguyên, đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng. Anti-idiotyp là các kháng thể đặc hiệu đổi với idiotyp, do đó anti-iđiotyp xét về mặt đặc hiệu lại tương tự với kháng nguyên. Vậy, thay vì dùng kháng nguyên X làm vacxin, người ta đùng iđiotyp anti-anti-X. - Vacxin ADN: ADN của tác nhân gây bệnh sẽ được biểu hiện bởi tế bào người được chủng ngừa. Lợi thế của ADN là rẻ, bền, dễ sản xuất ra số lượng lớn nên thích hợp cho những chương trình tiêm chủng rộng rãi. Ngoài ra, vacxin ADN còn giúp định hướng đáp ứng miễn địch: tác nhân gây bệnh ngoại bào được trình diện qua MHC loại II, đẫn đến đáp ứng CD4 (dịch thể và tế bào). Khi kháng nguyên của tác nhân đó được chính cơ thể người biểu hiện, nó sẽ được trình điện qua MHC loại I, lúc này đáp ứng miễn dịch tế bào qua CD8 được kích thích. Tuy nhiên phương pháp này là con dao hai iưỡi bời lể tế bào mang ADN lạ cỏ nguy cơ bị nhận điện là “không ta”, sinh ra bệnh tự miễn. - Sử dụng véctơ - dùng các virut hoặc Protein “tải” và “cộng hợp” kháng nguyên.

H ình 22.10: Định hướng sàn xu ấ t vacxin chong HIV/AỈDS.

491

22.6.7. Công nghệ mới trong sản xuất vacxỉn

22,6.7.1.Đại cương Các công nghệ mới trong sàn xuất vacxin đã góp phần quan trọng ữong quá trinh phòng chống bệnh tật cho con người. Sự bùng nổ về số lượng các công nghệ như tái tổ hợp ADN, tinh khiết đại phân tử, sinh hoá học Protein ... đã tạo ra nhiều ứng dụng trong sản xuất các loại vacxin đặc hiệu cho nhiều loại bệnh mà y học tường như bó tay (Viêm gan B, viêm não Nhật Bản, ...)• Trong khoảng hai thập kỷ cuổi của thiên niên kỷ thứ 2 đã có sự bùng nổ về số lượng những vấn đề kỹ thuật trong sản xuất vacxin mới. Có được sự phát triển này là do những tiến bộ nhanh chóng ừong nhiều lĩnh vực, bao gồm sinh học phân từ, công nghệ tái tổ hợp ADN (rADN), sinh hoá học protein, hoá học polysaccharit, sình hoá học phân tích, tinh khiết đại phân tử, virut học, vi khuẩn học, huyết thanh học và miễn địch học. Một vài ứng dụng sớm nhất của những công nghệ mới hơn đã dành cho những vacxin đã có, với mục đích là để tãng số lượng sản xuất (như vacxin viêm gan B) hoặc để có sự an toàn hơn (như vacxin ho gà). Tuy nhiên, phần lớn những ứng dụng đều hướng vào việc phát ữiển những vacxin mới mà từ trước đến nay chưa làm được. Các công nghệ mới còn được mở rộng sang những lĩnh vực khác như thay đổi sinh lý học (thụ tinh), dị ửng, ung thư, điều trị miễn dịch và hội chứng suy giảm miễn địch mắc phải.

Bảng 22.2: Công nghệ mới trong vacxitậ học Lĩnh yực Di truyền

Công nghệ ADN tái tổ hợp (rADN)

Áp dụng Nhận biết kháng nguyên Tách kháng nguyên Tổng hợp kháng nguyên Loại trừ đột biển Loại trừ độc lực

Hứa sinh

Tổng hợp peptid

Nhận biết các biểu vj peptid Tọng hợp biểu vị pẹptíd

Cẩu trúc protein và cacbonhydrat

Miln dịch

Kháng thổ đon dòng

Điều hòa miễn dịch

m

Dự đoán bằng vi tính về các biểu vị tế bàọ T Nhận biết kháng nguyên Tách kháng nguyên Xác định độ dao động cửa biểu bì Tá chất mái Nhận dạng kháng nguyên Tách khống nguyên Xác định sự biến đổi của bíều vị Kích hoạt biểu vị không là protein Tiềm năng của tá chất tnới Tính miễn dịch phân tử Khám phá miln địch niêm mạc đối với bệnh đường ruột

Mục tiêu của một vacxin chủ động là kích thích cơ thể tạo ra một trạng thái miễn dịch bảo vệ ở người được tiêm. Có hai loại vacxin chủ động: Vacxin “sống” là một vi sinh vật hoạt động n h ư một tác nhân gây miễn địch, có khả năng gây nhiễm cho các tế bào và nhân lên ở túc chủ mà không gây ra bệnh; Vacxin “chết” hay “bất hoạt” là một khátìg nguyên gây miễn dịch, không có khả năng gây bệnh truyền nhiễm túc chủ. 22.6.7.2. Vacxinsống Một vài vacxin sống đã đáp ứng về cơ bàn những tiêu chuẩn cho một vacxin lý tưởng. Đó là: Có khả năng tạo ra một sự bảo vệ suổt đời với một phản ứng tổi thiểu ở gầrt như toàn thể những người đã nhận một hoặc hai liều vacxiri. Những vacxin loại này chứa các vi sinh vật thường là các virut; chúng gây nhiễm các tế bào và nhân lên ở tức chùi giống như sự nhân lên của vi sinh vật hoang đại gây ra nhiễm khuẩn tự nhiên. Như vậy, vi sinh vật có trong vacxin sẽ gây ra một đáp ứng miễn dịch của cơ thể giống như đáp ứng với vi sinh vật hoang dại, Vacxin sống đã được giảm độc lực, tức là khả năng gây bệnh của vi sinh vật hầu như đã được loại bỏ bằng các thủ thuật sinh học hay kỹ thuật. Các vacxin sống thường tạo ra cả hai loại miễn dịch, đỏ là miễn dịch dịch thể (kháng thể) và miễn dịch tế bào (tế bào Limpho T). Vacxin sổng gồm có 2 lòại sau: a/ Vacxin cổ điển Thuật ngữ “cổ điển” đề cập tới những chiến lược vacxin không dùng tởi công nghệ rADN. Chiến lược vacxin cổ điển đầu tiên làm giảm độc lực trong nuôi tế bào đã trở nếíi hiện thực trong các thập kỷ 40 và 50 vói nuôi tế bào hiện đại invitro (trong phòng thí nghiệm) và khả năng nuôi virut trong các nuôi tế bào đỏ, tạo ra vacxin uống poliovirut, các vacxin tiêm như sởi, quai bị, thuỷ đậu, rubella. Một cách chế tạa- vacxin cổ điển thứ hai là phân lập và nuôi virut động vật, gây ra một bệnh động vật tương tự như bệnh ở người. Virut động vật này tạt) ra được miễn dịch ở nguời nhưng không gây bệnh cho người. Đỏ là troòttg hợp Jenner đã dùng virut Vacxina (đậu bò) để làm vacxin phòng bệnh đậu mùa ỗ người (Variola virut) 200 năm về trước. Chính vacxin này đa dẫn đến việc thanh toán bệnh đậu mùa trên phạm vi toàn thế giới vào giữa thập kỷ 70, đây cũng chính là căn bệnh đầu tiên được thanh toán

Hình 22. ỉ ì: Kiểm tra duởi kỉnh hiển vi điện tử.

băng vacxin.

493

b / V acxin tá i tổ h ợ p

Có 2 hướng trong đó công nghệ rADN đã được ứng đụng để phát triển những vacxin virut sống mới: ứ ng đụng thử nhất ỉà tạo ra những biến đổi đặc hiệu hoặc những xoá bỏ ở gen cùa virut, điều đó sẽ làm cho virut được giảm độc lực một cách vững bền. Nhu vậy, chúng sẽ không còn có khả nàng quay ừờ lại độc lực. Đây là hướng đi tạo vacxin H5NI của Viện Vệ sinh dịch tễ TƯ (Hà Nội), ứng đụng th ứ hai của công nghệ ADN cho việc phát triển những vacxin sống mới là làm cho những virut trở thành các vecto của những Polypeptit “ngoại lai” hay những Epitop peptit từ những tác nhân gây bệnh khác của người. Mục đích tạo ra những vecto như vậy là để giới thiệu Polypeptit hay peptit ngoại lai cho hệ thống miễn dịch, trong khuôn khổ của một virut sống, làm sao cho hệ thống miễn dịch đáp ứng với Polypeptit ngoại lai như một kháng nguyên miễn dịch “sổng”. Như vậy sẽ phát triển được một miễn dịch rộng rãi hơn (dịch thể, tế bào hay cả hai). Là một phàn của một virut sống, Polypeptit ngoại lai được biểu thị bên ừong bào tương của tế bào bị nhiễm, được làm gẫy thành những đoạn peptit, rồi được chuyên vận tói bề mặt của tế bào. Từ đó, chúng sẽ kích thích sự đáp ứng của tế bào Limpho T độc vói tế bào. Vecto virut mẫu thường được dùng rộng rãi trong việc tạo ra vacxin sống mới là virut đậu mùa. Để làm cho virut này trở thành một vecto, phải tạo ra một plasmid có chứa gen cho polypeptit ngoại lai, với những trình tự nối tiếp hướng sự biểu thị của nó vào trong các tế bào, sự kết hợp đó được gọi là “một cát xét biểu thị”. Virut Vaccinia và cát xét biểu thị được đưa cùng vào nuôi tể bào, các tế bào có thể tiếp nhận cả hai cùng một lúc vào trong bào tương. Ở đó xảy ra quá trình tái tổ hợp, sản xuất ra một virut Vaccinia tái tổ hợp biểu thị ra Polypeptit ngoại lai.

H ình 22.12: Sản xu ấ t vacxin ADN. AOđ

22.6.7.3. Vacxin bất hoạt So với vacxin sổng thì các vacxin bất hoạt dễ sản xuất hơn. Theo định nghĩa, các vacxin bất hoạt không thể nhân lên hoặc lan tỏa để cỏ thể gây ra bệnh. Nói chung, chúng dược dung nạp tốt hơn, đặc biệt phần lớn các vacxin bất hoạt đã qua xử lý tinh khiết để loại bỏ các đại phân tử khác. Ngoài ra, do công nghệ phát triển hiện nay, có thể dễ thực hiện được việc sản xuất các vacxin bất hoạt. Khả năng tạo miễn dịch cùa một vacxin bất hoạt thường được nâng cao nhờ thêm tá dược. Tá dược duy nhất được cấp giấy phép dùng cho người là muối nhôm hydroxit hay photphat, đã được dùng tiêm cho hơn 1 tỷ người trên toàn cầu. Kháng nguyên của vacxin gắn một cách vững bền vào muối nhôm nhờ tác động tương hỗ iôn và làm thành một hỗn dịch, Các vacxin chết thường có chức năng kích thích các đáp ứng miễn dịch dịch thể, cũng như khởi động cho miễn dịch tế bào. cư Vacxin bất hoạt nguyên tế bào Sản xuất vacxin bất hoạt nguyên tế bào vi khuẩn hay toàn hạt nhỏ virut, với mục đích kích thích việc hình thành các kháng thể đối với nhiều kháng nguyên; một vài vacxin còn cỏ tác dụng trung hoà tác nhân gây bệnh. Trong trường hợp vacxin viêm gan A chảng hạn, các tế bào bị nhiễm virut viêm gan A được làm dung giải bởi các hạt virut đã tinh khiết bàng phương pháp sinh hoá học, bất hoạt bằng Formalin, rồi sau đó hấp phụ vào một muối nhôm.Chiến lược cổ điển này đẫn đến việc sàn xuất ra những vacxin cỏ hiệu lực, đến nay vẫn còn là một công nghệ lựa chọn cho nhiều vacxin virut. bỉ Vacxin bất hoạt protein^ Đối với nhiều tác nhân gây bệnh thì việc phát triển một vacxin dựa trên Protein là chiến lược được lựa chọn. Phương pháp chế tạo ra một vacxin dựa trên Protein bằng các kỳ thuật miễn dịch, di truyền và sinh hoá học xác định tính đặc hiệu kháng nguyên. Kỹ thuật nói trên cho phép các biểu vị bảo vệ và những Polypeptit được xác định rất đặc hiệu. Vacxin viêm gan B làm từ nguồn huyết tương người là vacxin đầu tiên trong thể loại này. Protein bề mặt của virut viêm gan B (HBsAg), được xác định là một Lipoprotein, một kháng nguyên có những biểu vị bảo vệ trên bề mặt. HBsAg ỉấy từ huyết tương của những người mang virut viêm gan B màn dược tinh khiết rồi bất hoạt để làm vacxin. Vacxin viêm gan B tái tổ hợp là ứng dụng đàu tiên của công nghệ rADN cho việc sản xuất vacxin dùng cho người.

22.6.8. Định hưứng phát triển vacxin mói Để phát triển 1 vacxin mới có nhiều trở ngại thường làm nản lòng các nhà nghiên cứu và đầu tư: - Cần thời gian lâu 10-20 năm. - Rủi

.

V

Khoảng 80% gặp thất bại trong nghiên cứu lâm sàng. 495

- Không ngạc nhiên khi các doanh nghiệp nhà nước ở các nước tư bàn không tiếp tục phát triển sàn xuất vacxin nữa. - Báo ừước/tồn tại một hố sâu ngăn cách giữa cam kết của cộng đồng quốc tế, quốc gia về nhu cầu sức khỏe cộng đồng với vấn đề thương mại. - Các tổ chức thương mại luôn cân nhắc về khả năng thu hồi vốn, giá cả và thị trường. Nói chung, để phát triển vacxin mới cần xem xét các vẩn đề công nghệ sau: So sánh công nghệ bào chế “Cổ điển”: - Vacxin song giảm độc lực hay được bất hoạt. - Vacxin nguyên tế bào hay vacxin tiểu đơn vị“ Mới”; - Những vecto song, vật lây truyền khác. - Nhừng mầm bệnh được biến đổi về di truyền. - Cộng hợp. - Tá được. - Hấp thu qua niêm mạc. - Tái tổ hợp ADN. - Những kỹ thuật phát hiện kháng nguyên. - Các thiết bị chiết tách. Với các tế bào vi khuẩn hoặc nấm men đã được lắp ghép thêm các gen mới, người ta có thể nuôi cấy ờ quy mô lớn sản xuất các loại protein kháng nguyên để chế tạo ra các loại vacxin thế hệ mới. Ưu điểm cụa các loại vacxín này là: - Rất an toàn vì không sử dụng các tác nhân gây bệnh. - Giá thành hạ vi không phải nuôi cấy ttên phôi gà hoặc ừên các tổ chức động vật, trong các thiết bị đát tiền. - Hạn chế được kinh phí kiểm định, - Hạ thấp giá thành trong bảo quản và vận chuyển. Thuộc về các loại vacxin thế hệ mới có thể kể đến vacxin kháng nguyên nhân tạo, vacxin riboxom, vacxin các mảnh của virut, vacxin công nghệ ADN. Các vacxin chống ung thư gan nguyên phát, chống ung thư cổ tử cung , chống ung. thư bạch cầu Burkih là những bưởc tiến quan trọng đầu tiên của con người trong việo tim kiếm biện pháp miễn dịch chống hiểm hoạ ung thư. Nhờ ghép được ADN của vi khuẩn Hansen vào vi khuẩn E.coỉi mà người ta hy vọng làm ra dược vacxin chống phong thể hệ

496

hai ngừa một bệnh nan y đang làm khổ sở 15 triệu người trên thế giới. Theo Vane và Cuatrecasas (1984) có thể tóm tắt các tiến bộ lai của vacxin tương lai như sau: a. Vacxin thông thường: Vacxin sống giảm độc và vacxin bẩt hoạt mà việc sản xuất chủ yếu dựa trên kiến thức kinh nghiệm. b. Vacxin cài tiến: việc sản xuất dựa trên nuôi cấy inviừo (kể cả tế bào động vật có vú), nam chắc tính chất các kháng nguyên hiểu biết rồ các VỊ trí sinh miễn dịch và ADN của chúng. c. Vacxin protein đơn: bao gồm việc phân lập kháng nguyên tinh khiết sao nhân mã hoá các kháng nguyên đó, phân tích cấu trúc bậc nhất đua vào sử dụng công nghệ kháng thể dơn dòng và tá dược cải tiến. d. Vacxin peptit tổng hợp: việc chế tạo dựa ữên hoá miễn dịch, nghiên cứu cấu trúc peptit ừên máy tính vả hiểu biết cơ chế của hiện tượng cộng hợp. e. Vacxin qua đường uống, khí dung và thực phẩm.

22.6.9. Các dạng trình bày mới của vacxin tương lai Đó là các loại: ADN tái tổ hợp di tmyền, vacxin ân qua miệng, vacxin tinh thể Trehaloz, vacxin dán ừên da.Một gen kháng nguyên dược ghép vào hệ gen của một vi khuẩn hay virut (vecto) dưới sự điều hoà của một promoter, rồi gây nhiễm cho cơ thể, kích thích tạo miễn dịch. Vacxin tái tổ hợp có vecto dẫn truyền này, cũng như loại hỉnh vacxin sống giảm độc, còn nhiều hạn chế. Trước hểt Í1Ókhá cồng kềnh do phải duy trì nguồn virut hay vi khuin sống. Do vậy, người ta phải tỉm kiếm một phương thức khác, đưa gen kháng nguyên vào một vecto đơn giản là plasmid. Thực nghiệm cho thấy, khí đưa ADN của một loại plasmid tái tồ hợp mang gen kháng nguyên ngoại lai vào cơ thể thi cơ thể lại tạo miễn dịch chống lại. Việc nghiên cứu thử nghiệm này đã và còn tiếp tục trong những năm tới đây, Vacxin nucỉeic bao gồm vacxin ADN và vacxin ARN. Đó là các AĐN hoặc ARN của một loại plasmid tái tổ hợp mang gen kháng nguyên ngoại tai và prompter; 22.6,9,1. Vacxìtt táỉ íỗ hợp dàng tỉênt Loại vacxin này đang tạo một cụộc cách mạng trong công nghệ sảnxụẩt vaexin. Năm, 1989, Gustav (USA) tình cờ phát hiện ra liệu pháp gen ừong phòng thí nghiệm dùng té bào động vật có vú sản xuất một loại protein mã hoá trong gen. Ba năm sau, s. Johnston ở đại học Texas phát minh kỹ thuật nhân chuỗi ADN tạo sản phẩm protein ngoại lai trên tể bào động vật. Từ protein đến vacxin phải chờ đến bưởc đột phả tiếp theo của các nhà bác học Mỹ Harriet Robinson, David Weiner và nhóm SJohnstons tiến hành thành công vào năm 1991.

497

Vacxỉn ADN có tác đụng chống ung thư, chữa bệnh tự miễn dịch và đị ứng. Vacxin ADN có khả năng dung nạp cao, an toàn, ổn định và hiệu quả kéo đài so với vacxin cổ điển. Ngoài ra, việc dễ dàng sản xuất lớn, giá thành chấp nhận được rất cỏ lợi cho các nước đang phát triển. 22.6.9.2. Vacxin ăn qua miệng (thựcphẩm) Giữa những năm 80, RoyCutiss III và Guy Gardìnau (USA) đề xuất ý tưcmg cấy gen ADN

ngoại lai của virut, vi khuẩn vào thực vật. Năm 1992 nhà thực vật học Boyce

Thompson ở New-York có ý tưởng làm vacxin tự nhiên cho người qua việc ăn các thực phẩm cấy gen trên. Hiện đã có ít nhất 5 công ty công nghệ sinh học lớn đang nghiên cứu phát triển vacxin “ăn” được kiểu nảy. 22.6.9.3. Vacxin hỏa học dùng tỉnh thể “Trehaloz” làm “vật mang” Là loại đường đôi cỏ nhiều trong các mô sinh học, có khả năng tích trữ năng lượng để duy trì sự sống khi gặp điều kiện bất lợi. Năm 1990 B.Roz ở Anh đã đề xuất việc gắn các kháng nguyên với tinh thể này và xoa ưên da, dễ dàng xâm nhập vào mô sống phóng thích kháng nguyên như kiểu tiêm chủng cổ điển. Trehaloz còn là tá dược đông khô vacxin, dạng khí dung dùng qua đường thở (vacxiĩi cúm). Nhò khả năng bắt giữ và thải chậm, vacxin Trehaloz rất ổn định luôn giữ được công hiệu cao trong thòi gian dài ở bất kỳ nhiệt độ bảo quản nào

(60°c/l tháng không mất công hiệu).

22.6.9.4. Vacxìn dán trên da Người Mỳ cho rằng việc thấm qua đa cũng ià một cách đưa vacxin vào tiếp cận hệ thống miễn dịch của cơ thề người. Nhóm nghiên cứu cùa G.Glenm đã thừ đán miếng giấy thấm chứa độc tố tả CT. CT là chất kích thích miễn dịch mạnh nhưng nếu được làm giảm độc tính (các tiểu phần) thì chính nó trở thành một tá dược chuẩn cho nhiều loại vacxin khác, việc đưa CT qua da rất an toàn sau khi thử trên một số người tỉnh nguyện. Thử với LT của E.coli trên chuột cũng cho kết quả tốt. Đã có 30 loại kháng nguyên làm vacxín thừ ở dạng này (bạch hầu, uốn ván, cúm, dại ...) thậm chí không gây miễn dịch chéo với CT. “Miễn địch qua da” đã bước đầu được thử ưên 18 người tình nguyện với hai kháng nguyên CT và LT dán ưên cánh tay trong 6 giờ. Sau 3 tuần đo hiệu giá kháng thể thấy rất cao, không gây phản ứng phụ so với chứng. Có thể vacxin này sẽ phải cải tiến bàng việc thay dùng trực tiếp các độc tố vi khuẩn bằng các vector plasmid ADN.

22.6.9 5. Vicxin kh í dung: Phun xịt qua đường hít thở (Vacxin cúm...) 22*7. TIÊM CHỦNG VÀ NHỮNG s ự CÓ SAU TIÊM CHỦNG 22.7.1. Lợi ích và thách thức Trong 2 thế kỷ qua vacxin đã góp phần rất lớn đẩy lùi nhiều bệnh tật và giảm tỷ lệ từ vong cho con người. Trước khi bị khai tử bởi vacxin bệnh đậu mùa từng là nỗi kinh hoàng của cà Châu Âu ừong thế kỷ 18, đã cướp đi sinh mạng của hàng triệu người. Vacxin cũng là vũ khí hữu hiệu chống lại các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm như Bại liệt, Sởi, Viêm não góp phần quan trọng hạn chế những di chứng gây tàn phế cho bệnh nhân, tiết kiệm được nhỉều chi phí cho gia đình và xã hội. Trung bình hàng năm, tiêm chủng đã cứu sống được khoảng 3 triệu người trên toàn thế giới, khống chế và loại trừ được nhiều cân bệnh mới nảy sinh nhưng con người chưa có vacxin phòng chống.

Hình 22. ỉ 3: Biết bao trẻ em còn chưa được tiêm chùng vacxin hàng năm. Với một số bệnh cụ thể sau, nếu được miễn dịch bàng vacxin, số người trên toàn thế giới sẽ được cứu sổng hàng nãm sẽ là: - Từ bệnh đậu mùa: (5 triệu người). Thực tế bệnh đã chấm dớt từ năm 1997 đến nay. - Từ bệnh tiêu chảy (3 triệu người), riêng Rotavirut là 0,9 triệu người. - Nhiễm khuẩn hô hấp: (3,7 triệu người), trong đó do phế cầu là 1,2 triệu do virut 0,5 triệu. - Từ lao (3,2 triệu người), sởi (2,7 ừiệu người), sốt rét (2,1 triệu người). - Uốn ván (2 triệu người), viêm gan siêu vỉ B (1,2 triệu người), HIV/AIDS (1 triệu người), ho gà (1 ưiệu người), bại liệt (0,6 triệu người), bạch hầu (0,3 triệu người), sốt xuất huyết (0,03 triệu người)

499

Tổng cộng: 24.395.000 người (nguồn CVI/GPV1-1997). Lợi ích của tiêm chủng vacxin cho cộng đồng trong nhiều thập kỷ qua đã được thế giới công nhận. Thành tựu nổi bật nhất là việc thanh toán vĩnh viễn bệnh đậu mùa ừên phạm vi toàn cầu từ những năm 1980. Ở nhiều quốc gia trong đó có Việt Nam đã công bố xóa bỏ bệnh bại liệt vào năm 2000. Trong vòng 10 năm tới, có thể chúng ta sẽ đẩy lùi bệnh uốn ván sơ sinh bằng vacxin. Ở Việt Nam dự án tiêm chủng mở rộng quốc gia đã triển khai 10 loại vacxin, hai thập kỷ qua đã giảm đáng kể tỷ lệ mắc và tử vong do các bệnh truyền nhiễm như ho gà, bạch hàu, tả, thương hàn, lao. Tiêm vacxin sởi có thể giảm 80% nguy cơ mắc và tử vong do bệnh sởi gây ra ở trẻ em, song trong số trẻ được tiêm có một tỷ lệ nhỏ bị phản ứng. Khoa học ngày càng phát triển trong các lĩnh vực vi sinh vật học, miễn dịch học, sinh họe phân tử, di truyền học, hóa học, vật lý, tin học và công nghệ nano đâ hỗ trợ đắc lực cho công cuộc tìm kiếm những vacxin an toàn, công hiệu hom. Vacxin học đã tiếp cận sang nhiều lĩnh vực mới như bệnh đị ứng, bệnh xã hội học, các bệnh nan y (ung thư, HIV/ADIS), bệnh ký sinh trùng, sốt rét và đạt nhiều thành quà đáng kể. Giá vacxin cũng từng bưởc được tháo gỡ bàng những biện pháp hỗ trợ của các tổ chức Quốc tế (UNICEF thỏa thuận với các nhà sản xuất giảm giá các vacxin thiết yếu cho trẻ em) và chính phủ các nước (trợ giá các vacxin chương trình, giảm thuế, xóa bỏ sự ràng buộc của luật độc quyền sở hữu trí tuệ). Nhiều năm qua, Việt Nam đã mạnh dạn thực hiện chiến lược tự túc vacxin, Nhà nước hỗ ữợ sản xuất vacxin trong nước và vận động nhân dân sử đụng vacxin nội địa, giữ được giá vacxin ở mức hợp lý. Việc cải tiến phương thức sản xuất theo lối “cộng hợp” để có vacxin đa giá (1 mũi tiêm phòng được nhiều bệnh) và thay vacxin thế hệ mới nhàm giảm đau đớn và lo lắng cho người dùng (nhất là với ừẻ em) đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc triển khai các chiến dịch tiêm chủng. Các tổ chức phi chính phủ như GAVI, quỹ Bill Gates cũng tạo nhiều nguồn tài trợ mới cho việc nghiên cứu và phát triển vacxin. Những thách thức: a/ Tinh an toàn: Những phản ứng phụ không an toàn của vacxin cho người được tiêm đang là mặt trái, gây cản trờ lởiĩchỡ công tác vận động tiêm chủng. Mặc dù tỷ lệ xuất hiện nhũng phản ứng phụ nghiêm trọng do vacxin rất thấp, nhưng vẩn đề xác định đúng nguyên nhân vả cách khác phục vẫn là những thách thức không nhò đổi với mọi quốc gia. b/ Chi phi: Việc đầu tư sản xuất vacxin rất tổn kém. Chi phí từ giai đoạn nghiên cứu đầu tiên đến việc sản xuất thử, trang thiết bị và cuối cùng là đánh giá lâm sàng hiệu quả của một vacxin mới ra đời ước tính từ 200 - 400 triệu USD. Đây quả là mức chi không tưởng cho các nước nghèo. c/ Nhiều bệnh mời xuẩt. hiện chưa có vacxin: Từ 3 thập kỷ qua đã xuất hiện nhiều bệnh truyền nhiễm mói như: HIV/AIDS, bò điên, sốt xuất huyết, SARS, cúm gà - là thách

500

thức lớn cho giới khoa học và các nhà quản lý y tế của các nước. Trước hết nhân loại đang tập trung tìm hiểu nguyên nhân gây dịch, chủ động phòng và dập tắt các vụ dịch bằng nhiêu biện pháp tổng họp, song không thê bỏ qua giải pháp toàn diện và triệt để nhất ỉà sử dụng vacxin. Mặt khác, vẫn phải tiếp tục tìm kiếm các vacxin hữu hiệu phòng chổng các bệnh khác như: sốt rét, phong cùi, tim mạch, ung thư, dị ứng cùng nhiều bệnh nhiễm khuẩn và không nhiễm khuẩn khác.

Hình 22.14: Vùng dịch sốt vàng ở Châu Phi và Nam Mỹ. Mỗi năm có 130 triệụ trẻ em được sinh ra nhưng vẫn cỏ 30 triệu trẻ trong số này không được tiêm phòng, tỷ lệ tiêm phòng cho trẻ dưới 5 tuổi giảm từ 80% (năm 1990) xuống 74% (năm 1999) % số ừẻ mới sinh ra không được hưởng vacxin miễn phí của chương trình tiêm chùng mờ rộng phòng 6 bệnh cơ bản sởi, bại liệt, uốn ván, bạch hầu, ho gà và lao. Trẻ em ở các nước đang phát triển vẫn có nguy cơ chết vì những bệnh có vacxin phòng ngừa cao gấp 10 lần so với trẻ ở các nước phát triển. Tiêm chủng là sự lựa chọn đúng đắn, càn miễn dịch để bảo vệ cả cộng đồng, tiêm chủng tiêu diệt mầm bệnh, bảo vệ không chỉ một thế hệ mà còn cho các thế hệ tiếp nối. Đầu tư cho tiêm chủng vẫn là giải pháp rè nhất ứong các biện pháp phòng chổng dịch bệnh: 50 USD cho tiêm chủng có thể tiết kiệm hàng chục ngàn USD cho việc cứu sổng một sinh mạng do bệnh tật cướp đi.

22.7.2. Chương trình tiêm chửng mở rộng (TCMR) Chương trình TCMR hlnh thành khái niệm từ đầu những năm 1974 đề ra mục tiêu năm 1990 chống 6 bệnh nguy hiểm. Đặc điểm 6 bệnh:

501

- Sởi giết 2 triệu trẻ/năm. - Uốn ván giết 800.000 trẻ/năm (2 mũi bảo vệ cà mẹ và con 80% trong 3 năm). - Ho gà giết 600.000 trẻ/năm (công hiệu bảo vệ 62 - 80% nếu tiêm đủ 3 liều từ 6 tuần tuổi/cách 1 tháng). - Lao: 2 triệu trẻ dưới 5 tuổi mắc/năm (60.000 sẽ lao màng não, tử vong 50 100%). BCG giữ 2 năm <80C. Bảng 22.3: Nhận biết về chương trình TCMR Thế giới

Việt Nam

1974

1984

Loại vacxin

6 loại (Bạch hầu, ho gà, uốn ván, lao, bại liệt, sởi)

ó loại (Bạch hầu, ho gà, uốn vãn, lao, bại liệt, sởi)

Bỗ sung loại vacxin ( 1997)

Viêm gan B, thương hànVi, sốt vàng (tùy dịch tễ từng nước).

1997/ Viêm gan B, thương hàn Vi, viêm não, tả (4 loại).

Đối tượng mục tiêu

< 5 tuổi

< 5 tuổi 1,6 triệu trẻ sơ sinh/năm

Độ lớn về thị trường

130 triệu ừè sơ sinh/năm (các nước AZAN 26 triệu), 65% số trẻ ờ các nước đang phát triển

Nội dung Khởi động WHO

Bạch hầu: 10 - 18% từ vong trong các bệnh bạch hầu (25.000 trường hợp/năm trẻ em) hiệu quả bảo vệ 100% DTP nếu bảo quản tốt. Từ năm 1997 TCMR của Việt Nam bổ sung thêm 4 loại vacxin: Tả uống, viêm gan virut B, viêm n3o Nhật Bản B và Thương hàn. Trong TCMR tỷ lệ sau 20 năm thực hiện ở Việt Nam đã giảm 100 làn tỷ lệ mắc các bệnh ừên ở trẻ em.

H ình 22.17: C hương trình Tiêm chủng m ớ rộng.

5Ố2

Chương trinh tiêm chủng à Việt Nam: - Đổi tượng tiêm chủng gồm trẻ em, phụ nữ có thai, phụ nữ tuổi sinh đẻ. - Khoảng 17 triệu lượt đối tượng tiêm chủng ừong I năm trong TCMR. - Hom 50% nhu càu vacxin sử dụng trong TCMR được sản xuất ừong nước. 22.7.3. M ột số lưu ý về chỉ định tiêm chủng Không có nhiều chống chi định trong tiêm chủng. Tất cả ưè em cần được tiêm chủng, trừ một số trường hợp sau: a) Những liều tiêm tiếp theo đối với những trường hợp có phản ứng quá mẫn với liều tiêm trước hoặc những người có tiền sử đị ứng với các thành phần của vacxin. b) Không nên tiêm vacxin BCG cho ữẻ em bị bệnh AIDS. Chú ý: Trẻ bị nghi ngờ nhiễm HIV hoặc đã có dấu hiệu của bệnh AIDS nên tiêm vacxin sởi cho trẻ khi được 6 tháng tuổi và nhắc lạí khi trẻ được 9 tháng. c) Trong trường hợp trẻ bị ốm nếu bố mẹ trẻ không đồng ý tiêm, không tiêm cho trẻ, cán bộ y tế cần đề nghị bà mẹ mang trẻ trở lại khi đã khỏi ốm. Những trè đã có phản ứng quá mẫn với lần tiêm trước thì không nên tiêm tiếp. Nếu trẻ bị tiêu chảy khi uống OPV, cần cho trẻ uống 1 liều bổ sung cách liều thứ 3 ít nhất 4 tuần. Lưu ý khi tiêm vacxin: * Nêu tiêm hơn 1 loại vacxin trong cùng một thời điểm, hãy sử dụng một bơm kin tiêm cho mỗi loại vacxin đó và không được tiêm cùng một chỗ ở đùi hoặc tay. Mỗi loại vacxin cần được tiêm ở những vị trí khác nhau. * Không tiêm hơn một liều cùng một loại vacxin cho phụ nữ hoặc trẻ em trong một lần tiêm chủng. * Tiêm đúng khoảng cách giữa các mũi tiêm theo hướng dẫn. (Ví đụ: phải đợi tổi thiểu 4 tuần giữa các liều đối với Bại liệt, DTP và viêm gan B). * Những trường hợp sau không chống chỉ định: - Có tiền sử dị ứng hoặc hen (trừ trường hợp bạn biết rõ đị ứng với thành phần nào củavacxin). - Các trường hơp ốm nhẹ, như viêm nhiễm đường hô hấp hoặc tiêu chảy cỏ thân nhiệt dưới 38,50C. - Tiền sử gia đình co giật, động kinh hoặc ngất. - Đang điều trị các thuốc kháng sinh.

503

- Nhiễm hoặc nghi ngờ nhiễm HIV nhưng chưa biểu hiện ưiệu chứng AIDS. - Dấu hiệu và triệu chứng của AIDS, ngoại trừ vacxin BCG. - Bệnh mãn tính như các bệnh về tim, phổi, thận hoặc bệnh gan. - Các bệnh thần kinh bẩm sinh: Bại não hoặc hội chứng Down. - Đẻ non hoặc nhẹ cân (không nên trì hoãn tiêm vacxin). - Đã hoặc sắp phẫu thuật. - Suy dinh dưỡng. - Cỏ tiền sử vàng da khi đẻ.

22.7.4.Lịch tiêm chủng Bảng 22.4: Lịch tiêm chủng miễn dịch cơ băn cho trẻ em Việt Nam Tháng tuổi

Vacxin cần tiêm

Mũi tiêm

Sơ sinh (càng sớm càng tốt)

BCG (phòng lao) Viêm gan B

1 mũi Vacxin viêm gan B mũi 1

2 tháng tuổi

Bại liệt Bạch hầu, ho gà, uốn ván Viêm gan B

Bại liệt lần 1 Bạch hầu, ho gà, uốn ván, mũi 1 Vacxin viêm gan B mũi 2

3 tháng tuổi

Bại liệt Bạch hầu, ho gà, uốn ván

Bại liệt lần 2 Bạch hầu, ho gà, uốn ván, mũi 2

4 tháng ỉuổi

Bại liệt Bạch hầu, ho gà, uốn ván Viêm gan B

Bại liệt lần 3 Bạch hầu, ho gà, uốn ván, mũi 3 Vacxin viêm gan B mQi 3

9 thảng tuồi

Vacxin sởi

Mũi 1 khi trẻ đù 9 tháng tuổi Và đưa trẻ đi tiêm trong chiến dịch tiêm nhắc vacxin sởi

Từ 1-5 tuổi

Viêm não Nhật Bàn*

Vacxin viêm não mũi 1 Vacxin viêm não míli 2 (hai tuần sau mũi 1) Vacxin viêm nẫo mũi 3 (một năm sau mũi 2)

Từ 2 - 5 tuổi

Vacxin tả*

2 lần uống (lần 2 sau lần 1 hai tuần)

Từ 3 - 5 tuổi

Vacxin thương hàn*

Tiêm 1 mũi duy nhất

* Chi tiêm chùng ở các vùng cỏ nguy cơ bệnh

22.7.5. N hững sự cố sau tiêm chủng Lợi ích của tiêm chủng cho sức khỏe cộng dồng ai cũng rõ và là điều không thể phủ nhận. Song, những sự cố hay nhừng phản ứng có hạì cho sức khỏe từng cá nhân trong cộng đông thì cân nhìn nhận đúng. Cũng như thuốc, vacxin dùng trong tiêm chủng luôn đạt yêu cầu về tính an toàn và hiệu lực bảo vệ mới được lưu hành. Nhưng không thể cỏ một loại vacxin nào hoàn toàn an toàn vì vẫn còn nhừng tỷ lệ nhất định những sự cố xảy ra sau tiêm chùng. Thêm vào nguyên nhân do chính bản chất vacxin thì quá trình tiêm chủng cũng là một nguyên nhân gây sự cố đỏ. Việc giám sát để hạn chế tác dụng của các sự cố đang là yêu cầu bức thiết trong chiến lược tiêm chủng ở nước ta hiện nay. cần có hệ thổng từ Trung ương đến cơ sở để thống kè các báo cáo trung thực về những phàn ứng có hại đích thực do vacxin, do tiêm chùng hay do tác động ngẫu nhiên trùng hợp khi tiêm chủng. Để có cái nhìn trung thực ấy, cần phân loại những phản ứng sau tiêm như trong bảng dưới đây. Bảng 22.5. Năm loại sự cồ sau tiêm chủng Loại phản ứng Phản ứng cùa vacxin Sai sót trong tiêm chùng Ngẫu nhiên Phản ứng tâm lý Không rõ

Nguyên nhân Do bản chất vacxin gây ra với tỳ lệ vượt quá giới hạn cho phép về mức độ và phạm vi Sai sót trong sản xuất, bào quàn vacxin hay khi tiêm vacxin. Do tình cờ kết hợp nguyên nhân khác không phải do vacxin và tiêm chủng. Do lo âuf sợ hãi làm tăng đau đớn và phản ứng phụ Không xác định được nguyên nhân

Choáng phản vệ đù có khả năng gây tử vong nhưng vẫn có thể điều trị được mà không để lại hậu quả ỉâu dài. Các phản ứng nặng khác do tác động ngẫu nhiên trùng họp nhiều hơn do phản ứng đích thực của vacxin. Trong chiến dịch tiêm chủng, cần nám vững các thông tin để dự đoán tỷ lệ và loại phản ứng sau tiêm chủng, phải tiến hành điểu tra ngay nếu thẩy tỷ lệ xảy ra cao hơn và phản ứng nặng hơn. Ngất xỉu thường xảy ra ở trẻ trên 5 tuổi (không đòi hỏi phải xử lý gì ngoài việc đặt bệnh nhân ở tư thế nàm nghiêng). Có thể ngăn ngừa trước bằng cách rút ngắn thỉri gian chờ đợi, giữ nhiệt độ phòng ở mức vừa phải dễ chịu, khi chuẩn bị vacxin đừng cho trẻ thấy và tiêm riêng rẽ từng trẻ một. Không để trẻ được tiêm bị ngã và phải để trẻ ở tư thể ngồi khi tiêm. Cảm giác trúng gió là kết quả của sự lo sợ khi đi tiêm chủng với những triệu chứng đặc biệt như nhức đầu nhẹ, chóng mặt, tê xung quanh miệng và các bàn tay, hơn nữa hay gặp ở các ưẻ nhỏ, thậm chí ngừng thở, có khi hét trốn chạy. Lo sợ có thể dẫn đến một vài trường hợp co giật. Có tình huổng gây hysteria hàng loạt (khởi đầu thường ngất xiu từ một trẻ).

505

Giới hạn những tác động có hại của tiêm chủng và cách điều trị thê hiện trong bảng sau đây. Bảng 22.6: Triệu chứng, cách điều trị và loại vacxin gây ra Vacxin BCG

Viêm gan B Sởi

OPV

Uốn ván

PHẢN ỨNG

GIAI ĐOAN BỘC PHÁT

TỶ LỆ TRONG 1 TRÍỆU LIÊU

- Viêm hạch mủ - Viêm tai - Viêm nhiễm lan tỏa 2-6 thảng

2-6 tháng 1-12 tháng 1-12 tháng

100-1000 1-700 2

- Choáng phản vệ - Hội chứng Guilain-Barre

1-6 tuần

1-2 5

- Sốt co giật - Giảm tiểu cầu - Choáng phàn vệ

5-12 ngày 15-35 ngày 0-1 giờ

333 33 1-50

- Liệt liên quan đến vacxin bại liệt (VAPP). - Nguy cơ cao hơn với liều đầu tiên

4-30 ngày

0,76-1,3 (liều đầu) 0,17 (liều tiếp theo)

- Viêm dây thần kỉnh cánh tay.

2-28 ngày 0-1 Giờ ]-6 tuần

1-6 6-10

0-24 giờ 0-2 ngày 0-24 giờ 0-1 giờ 0-3 ngày

1000-6000

- C hoáng phản vệ

- Ap xe DTP

Viêm não Nhật Bản B Sốt vàng

506

- Khóc thét dai dẳng >3 giờ - Cơn co giật - Giảm trương lực, giảm phản xạ (HHE). - Choáng phản vệ - Hội chứng não

0,15 (người tiếp xúc)

20 0-1

10-1000 1-2.3

- P hản ứ ng d ị ứng n ặn g

- Triệu chứng liên quan đến hệ thần kinh -Viêm não tủy ' Dị ứng, choáng phàn vệ

570 570

7-21 ngày 0-1 giờ

500-4000 trẻ sơ sinh dưới 6 tháng tuổi 5-20

Để giảm thiểu tác hại của sự cố sau tiêm cần cỏ hệ thống giám sát, báo cáo thống kê, hành động xử lý kịp thời từ cấp cơ sở đến Trung ương. Ngoài ra, việc điều tra sau đó để tìm đúng nguyên nhân sai sót cần được làm mình bạch, trung thực. Việc tuyên truyền trấn an dư luận với cha mẹ và quần chúng nhân dân cần được làm nghiêm túc trên cơ sở khoa học cỏ tình, có lý. Việc xử lý và thông tin qua các cơ quan truyền thông là công việc hết sức tể nhị nhạy cảm cần thận trọng và đúng huớng nhàm tạo niềm tin lâu đài của cộng đồng với công tác tiêm chùng. 22.8. TRIÉN VỌNG CỦA CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VACXIN Vacxin là sản phẩm được chế tạo từ các vi sinh vật (virut, vi khuẩn, nấm men) hoặc các kháng nguyên đặc hiệu, được đưa vào cơ thể người gây miễn dịch chủ động nhàm phòng nhiễm khuẩn do các vi sinh vật tương ứng gây ra. Thuật ngữ vacxin E.Jenner dùng đầu tiên bắt nguồn từ chữ Latinh “vacca” (con bò) để chỉ chất chế từ vảy đậu bò dùng chủng cho người nhàm phòng bệnh đậu mùa. Sau này, L.Pasteur dùng thuật ngữ vacxin rộng rãi để ghi nhớ công trình có ý nghĩa lịch sử của E.Jenner. Nhìn chung các vacxin hiện này thuộc hai nhóm chính: Vacxin bất hoạt (còn gọi là vacxin chết) chứa các vi sinh vật đã bị diệt hoặc các ngoại độc tố của chúng đã được giàm độc không còn khả năng gây bệnh (tác nhân bất hoạt nhiệt, bức xạ, siêu âm, hoá chất như formalin, phenol, beta probiolactol, merthiolate). Những tác nhân này phải có tác dụng làm giảm độc và bảo vệ kháng nguyên, Vacxin giảm độc lực (Vacxin sống) chứa vi khuẩn hoặc virut đã được giảm độc bằng cách cấy chuyền hoặc xử lý sao cho mất khả năng gây độc hoặc bị biến chủng không còn khả năng gây độc nữa nhưng còn khả năng miễn dịch. Khởi đầu 200 năm trước đây là sự ra đờì của vacxin đậu mùa. Rồi gần 100 năm sau vacxin dại lần đầu tiên được chủng ngừa cho người, đến những năm 1890 lần luợt ra đời vacxin tả, thương hàn, dịch hạch. Thập kỷ đầu thế kỷ là vacxin ho gà, lao. Đên những năm 80 của thế kỷ 20, hơn 20 loại vacxin khác đư ợ c đưa vào sản xuất. Trong 27 loại vacxin, tất cà đều được tiêm trừ 3 loại đà có vacxin uổng là bại liệt, tả, thương hàn. Không phải tất cà các trẻ em trên thế giới đều có thể được dùng vacxin ví như vacxin tả, thương hàn, sốt - vàng chi cần cho người sổng trong một vùng dịch hoặc có ghé qua vùng đỏ. Trong sơ đồ miễn dịch chuẩn đang dùng ờ các nước đang phát triển cũng có tới ít ra từ 5-6 mũi tiêm. Ở Mỹ trè em được tiêm chủng với 14 loại (11 loại trước 8 tháng tuổi) nhiều gấp đôi số lượng yêu cầu 10 năm trước. Với hơn 200 loại vacxin đang nghiên cứu và phát triển, kể cà vacxin phòng bệnh do phế cầu khuẩn và não cầu khuẩn gây ra, số lần tiêm sẽ không giảm đi. Ỏng WaltervADNermissen của hãng SB phát biểu trong cuộc họp của CVI gần đây cho ràng ít nhất sẽ 507

cỏ 25 loại vacxin cho trẻ em vào năm 2010. Như vậy ừẻ em đang quá tải vì những mũi tiêm ! Và những thầy thuốc y học dự phòng có liên quan đến sự quá tải này hơn chính cha mẹ cùa những đứa trẻ khỏe mạnh phải tiêm vacxin. vấn đề này phức tạp hơn ở những nước phát triển vỉ cả những mũi tiêm không an toàn nữa. Việc phối hợp hầu hết các vacxin vào một mũi tiêm là một cách để hạn chế số lần tiêm vacxin. Các tiên bộ kỳ thuật trong tương lai dĩ nhiên sẽ sản xuất được nhiều loại khác như vacxin uống nhumg trước măt càn “Một hồn họp kháng nguyên trộn vào một sản phẩm đơn thích hợp vẫn là một giải pháp hợp lý tránh quá tải cho ừẻ”.

22.8.1. Thành tựu (1949 -1983) 1949: Vacxin đa giá đầu tiên, liên kểt các kháng nguyên bạch hầu và ho gà, bạch hầu và uống ván, bạch hầu - ho gà - uốn ván (DTP: Diphteria-Pertussis-Tetanus). 7955: Vacxin đơn giá (1 bệnh) đa chủng đầu tiên vacxin bạỉ liệt bất hoạt (IPV: Inactivated Polio Vacxine) liên kết 3 týp virut polio được dùng để tiêm và vacxin thương hàn, phó thương hàn A và B. 1957'. Phổi hợp ađenovirut, cúm (được chấp nhận sử dụng năm 1980). 1958: Vacxin bại liệt 3 týp theo đường uống (OPV) “sabin” đã được sử dụng rộng rãi ở Liên bang Xô Viết từ năm 1958 và được đăng ký ở Mỹ năm 1963. 1967: Phối hợp sởi - đậu mùa (được chấp nhận năm 1985 sau khi đã thanh toán bệnh đậu mùa). 1970: Phối hợp sởi Đức (rubella) - quai bị. ỉ 971: Phối hợp sời - rubella và sởi - quai bị - Sởi Đức. 1973: Phối hợp sởi - quai bị. 1975: Vacxin cộng hợp 2 chủng (A-C) của não cầu khuẩn sử dụng kháng nguyên vỏ vi khuẩn polyxacarit (MenPS). 1977: Vacxin phế cầu polyxacarit (PnPS) cộng hợp 14 chủng của phế cầu khuẩn. 1981: Vacxin viêm màng não thế hệ 2 phối hợp 4 chủng của não cầu khuẩn (A, c, Dịch vụ và w 135). 1983: Vacxin phế cầu 23 chủng thay thế loại 14 chủng. Với tổ chức CVI khuyến khích dùng vacxin đa giả và đơn giản hốa việc tiêm chủng nhằm tăng số lượng trẻ miễn dịch với kháng nguyên mới càng sởm càng tốt. Những lợi điểm của vacxin - về thực tiễn:

508

+ Người được chủng ngừa và gia đình: giảm đau và lo lắng vì bị tiêm ít hơn, giảm số lần đi tiêm. Năm 2001, tại Pháp, nhờ sử dụng vacxin liên hợp, trẻ < 2 tuổi, chỉ phải tiêm 7 mũi, thay vì phải tiêm 88 mũi; trẻ < 18 tuổi, chỉ phải tiêm 11 mũi, thayvì phải tiêm tổng cộng 55 mũi. + Nhân viên chủng ngừa: tiết kiệm thời gian, giảm nguy cơ bị kim châm. - v ề y tế cộng đồng: + Tăng tỷ lệ chủng ngừa. + Các kháng nguyên mới dễ được chấp nhận hom. + Lợi điểm về lịch chủng ngừa.

- về k in h

tế:

Tiết kiệm trong các khâu + Sản xuất: thù tục xuất lô, bao bì, kho chứa, chuyên chở, kiểm kê. + Đưa thuốc vào cơ thể: Ống tiêm, kim tiêm, nhân viên tiêm. a. Các khó khăn khi phát triển một vacxin phổi hợp Phải bảo đảm sự tương thích giữa các loại thành phần cùa các vacxin được Hên hợp với nhau (kháng thể, chất bảo quản, chất phụ gia, tá dược, chất ổn định). Phải bảo đàm được độ bền vững của các vacxin thành phần. Phải bảo đảm tính gây miễn địch và hiệu quả bảo vệ của từng kháng nguyên. Phải bảo đảm phổi hợp không làm tăng tác đụng phụ của các vacxin được phối họp. b. Nguyên ỉỷ phổi hợp Khi công nghệ vacxin phát triển, như Phó tổng Giám đốc hãng SB Francis ADNres đánh giá, vacxin phối hợp 10 loại khảng nguyên ỉà “kỹ thuật có thể thực hiện được”. Ngưởi ta cho rằrig vacxin DTP sẽ ỉà bộ khung chỉ cần đắp thêm các kháng nguyên khác sẽ có tác đụng hiệu quả toàn cầu. Sự lựa chọn này có 2 lý do chính: DTP được sử dụng rộng rãi, đồng thời DTP còn được xem là một vacxin ổn định và vẫn giữ vai trò chính của các chương trình tiêm chùng quổc gia trên toàn thế giới (những chương trình này đã chủng ngửa được khoảng 75-80% trẻ em trên thể giới dưới 2 tuổi). Vào năm 1991, một loại vacxin DTP mới thành phần khảng nguyên ho gà vô bào (DPaT) được đãng ký ở Mỹ. Vacxin ho gà vô bào này đã được phát triển đầu tiên ở Nhật gần 20 năm trước, sử đụng một hoặc nhiều kháng nguyên tinh khiết của vi khuẩn ho gà - thay cho vacxin ho gà “toàn tế bào” cổ điển (wP) DtaP công hiệu như DTwP nhưng ít có phản ứng phụ hơn. Song loại này đắt giá, cao gấp rưỡi so với DTvvP trên thị trường nước Mỹ.

509

Hĩnh 22.16: Sản xuất vacxirt íả ở quy mô ỉớn. Sự xuất hiện các kháng nguyên hóa học mới như Hep B (Viêm gan B) hoặc Hib (Haemophilus influenza typ b) gây viêm màng não và viêm phế quàn đã tạo thêm các dạng phối hợp mới, DTwP với HepB hoặc Hib hoặc với Hib vả IPV, cũng có khi người ta dùng của vacxin DTwP~HepB dạng nước tiêm cùng vacxin Hib đông khô, Bạn cũng có thể phôi hợp Hib và HepB với HepA. Cho đến nay, đã có 17 kiểu phối họp vacxin theo nhiều phương pháp thích hợp. Và sẽ không có lý do gì để chúng ta không thấy được 17 loại vacxin phối hợp khác thành 34 loại. Đe phối hợp tốt đã ra đời kỹ cộng hợp. Các vấn đề nảy sinh cần giải quyết vacxin là giá cả, liều lượng thích hợp, quy trình sản xuất, nhu cầu bảo quản lanh, tuổi thọ vacxin, phản ứng phụ, hiệu quà bảo vệ và nhiều điều khác. Nhờ máy tính với vacxin phòng 5 bệnh (bạch hầu, uốn ván, ho gà, Hib và viêm gan B), đã có 16.000 kiểu phổi hợp khác nhau, vì thế phổi hợp là một sự thay thế hợp lý để tiết kiệm mũi tiêm. Dù thế nào, cần loại trừ các kháng nguyên thừa khi phổi vacxin. Ở các nuớc đang phát triển cần cân nhắc khi phải đưa HepB hoặc Hib vào chương ừình tiêm chủng mở rộng. Có thật sự cần phối hợp vacxin, liệu có thừa - khi ghép thêm các kháng nguyên mới chưa gây dịch ... cũng như vấn đề giá cả và hệ thống dây chuyên lạnh. Trường hợp tự sản xuẩí DTP thì có nên nhập DTP-HepB-HiB hay chỉ nhập đơn lẻ các kháng nguyên dạng bán thành phẩm? Muốn vậy, yacxin DTP tự sản xuất phải đạt chất lượng cao của quốc tể quy định. Với các nước còn đang tự sàn xuất DTwP thì có nên nhập DtaP ? Nói chung các nước đang phát triển vẫn thích dùng DTwP hơn vì rẻ tiền, vì còn nghi ngờ công hiệu của Pa và cần duy tri nền sản xuất đang có của chinh các nước đó.

510

Giá còn đăt là cản trở trước nhât cho việc sử dụng vacxin phối hợp ở các nước đang phát triên. Các vacxin phôi hợp bán ở Mỹ (14-20 USD/liều) nếu mua số lượng lớn có UNICEF trợ giá với các nước nghèo có thể thấp hơn 10 USD nhưng chắc không dưới 2 USD/liêu. Trong khi các nước nghèo còn phải lo bao cấp các vacxin cần thiết hơn như DTP, BCG, bại liệt, sởi thì các vacxin phổi hợp quả là khó bán được rộng rãi ở các nước này. Đê giảm giá cần tăng cường tiểp thị để mọi người đân thấy được cái lợi của con em họ khi dùng vacxin phối hợp, tăng số lượng bán ra song song với việc giảm bớt các chi phí trung gian như công tiêm chích và đào tạo các nhân viên y tế, các chi phí do dụng cụ tiêm, phí vận chuyển và bảo quản, giàm tỉ lệ hao hụt vacxin như đóng ỉọ liều phù hợp tùy loại, tùy thị trường. Trở ngại cuối cùng để phổ cập vacxin phối hơp là vấn đề thông tin tuyên truyền về công thức phối hợp, hiệu quả phòng bệnh cao và các phản ứng phụ ít của vacxin mới chưa kê những thông tin công nghệ phối hợp vacxin cho các nước đang phát triển. 22.8.2. Những vấn để công nghệ Bản chẩt kháng nguyên, sự tương tác trong hỗn hợp, cộng hợp và dung nạp, định lượng kháng nguyên. Tính hiệu quả và an toàn so sánh giữa phối hợp với từng thành phần đơn. Công thức và ảnh hưởng của chat đệm, pH, bảo quản trong vacxin đa giá. Chi phí cho kiểm định in vitro và in vitro kết quả thực địa theo từng vùng dân cư và dịch tễ khác nhau. Sự tương đồng giữa hiệu quả huyết thanh học với dịch tễ học (nhất là các thành phần đơn nguyên tương tự như kháng nguyên vi khuẩn ho gà). Thực địa với vacxin hỗn hợp khó đánh giá hết hiệu quả của từng hợp phần nếu dùng riêng. Tổng chi phí để cho ra đời một loại vacxin phối hợp mới cần đầu tư 100-200 triệu USD.

22.8.3. Vấn đề thị trường Phối hợp vacxin cho phù hợp nhu cầu của khối các nước phát triển và nghèo hay cho cả hai. Liệu có thu hút tham gia chung của tất cả các nhà sản xuầt vacxin hay chỉ khu trú 5 công ty lớn. Liệu có độc quyền công thức phối hợp và độc quyền phân phối vacxin để hứa hẹn đầu tư ? Tuổi thọ vacxin phối hợp liệu có dài như vacxin đơn hay dễ bị thay thế trong thời đại phát triển công nghệ như hiện nay. Nếu tuổi thọ ngán, cần cân nhắc đầu tư sao cho giá cả phải chăng nếu không sẽ khó tiêu thụ vacxin phối hợp. Cuối cùng là thói quen về tiêu thụ và chính sách tự lực sản xuẩt vacxin ờ các nước đang phát triển cũng ảnh hưởng đến khả năng đầu tư phát triển các vacxin phổi hợp mới. 511

Dù sao cũng có những số liệu khả quan về thị trường tiêu thụ các vacxin phối hợp ví dụ thị trường ở Anh quốc từ l,2tỉ USD năm 1992 tăng dần 1,7 tỉ USD năm 1997 và năm 2002 sẽ là 3,8 ti USD (trong 10 năm qua vacxin phối hợp chiếm 40-50 thị phần vacxin). Phối hợp vacxin còn mở đường phát triển cho các nhà sàn xuất khi cần đẩy mạnh số lượng bán ra bằng cách phổ cập vacxin đcm giá thấp vào một loại đa giá và ngược lại. Phải nắm bắt yêu cầu của thị trường riêng mỗi nước theo kiểu bệnh từng địa phương để kịp đưa vào những vacxin phù hợp đó là chiến lược phát triển của các nhà sản xuẩt lớn hiện nay. Có những bệnh chưa phải tối nguy hiểm như thủy đậu hoặc quai bị nhưng nếu cỏ thêm vacxin này trong vacxin phối hợp đa giá sẽ hấp dẫn cộng đồng tránh hội chứng lạm dụng vacxin ví như việc phối hợp một số kháng nguyên nhất định trong nhiều nguyên nhân tiêu chày để chỉ định rạch ròi cho người du lịch hay chỉ dùng cho dân cư ở những noi có các bệnh địa phương. Các tổ chức quổc tế WHO, CVI sẽ định hướng phát triển vacxin phối hợp chung toàn cầu trong một ngày gàn đây để phát huy sức mạnh của dạng vacxin phổi hợp mới nhẳm tăng hiệu quả an toàn cho người sử dụng.

Chương 23

SINH THÁI HỌC VI SINH VẬT

23.1. KHÁI NHIỆM CHƯNG

23.1.Ỉ. Nội dung nghiên cứu về Sinh thái học vi sinh vật Môn sinh thái học (Ecology) từ ngày ra đời đến nay đã có ừên 140 năm lịch sử. Từ những năm 60 cùa thế kỷ 20, song hành với sự tăng trưởng kinh tế, không những đã xuất hiện những khủng hoảng về dân sổ, tài nguyên, môi trường, lương thực và năng lượng, những vấn đề môi trường tòan cầu như tầng ozon bị phá hủy, hiệu ứng nhà kính, mưa axit, hiên tượng El-Nino, thay đổi khỉ hậu toàn cầu... ngày một ừầm trọng. Tất cả đều tạo ra thách thách thức nghiêm trọng đối với sự sinh tồn của loài người. Muốn giải quyết những vấn đề nan giải nói trên, phải nhờ cậy vào việc ứng dụng những kiến thức sinh thái học. Cũng trong thời gian nói trên, Sinh thái học đã giao thoa với các ngành khoa học khác để hình thành nên nhiều phân ngành. Sinh thái học vi sinh vật (Microbial Ecology) là một trong các phân ngành đó. Phạm trù nghiên cứu Sinh thái học vi sinh vật bao gồm việc nghiên cứu sự phân bố, thành phần, đặc điểm sinh lý - sinh hỏa trong từng không gian xác định của vi sinh vật, mối quan hệ giữa chúng với nhau, cũng như chức năng và mối quan hệ của chúng với môi trường. Nếu chia theo nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể thi Sinh thái học vi sinh vật nghiên cứu sự sinh trưởng, phát triển, sinh sản, cơ chế phản ứng sinh lý của từng nhóm loài vi sinh vật cụ thể dưới các điều kiện khác nhau của môi trường (nhiệt độ, độ ẩm, độ mặn, pH, oxy và thành phần chất dinh dưỡng...); Sinh thái học vi sinh vật cũng nghiên cứu mối tương tác giữa các nhóm loài vi sinh vật (quan hệ cộng sinh, quan hệ có lợi, quan hệ có hại, sự cạnh tranh), cũng như mối quan hệ giữa vi sinh vật và các nhỏm loài sinh vật khác (động vật, thực vật); Sinh thái học vi sinh vật còn nghiên cứu đặc trưng, sự thay thế, chức năng của các nhỏm loài vi sinh vật; nghiên cứu các ứng dụng liên quan đến cơ chế ô nhiễm và cách xử lý ô nhiễm nước, nghiên cứu Vi sinh vật trong điều kiện hệ thống hàng không vũ trụ khép kín và ữong các điều kiện sống cực đoan (rất lạnh, rẩt nóng, rất mặn, rất ngọt, rất khô...).

513

Căn cứ vào đối tượng nghiên cứu có thể chia thành: Sinh thái học vi sinh vật thủy vực (biển, cửa sông và hệ thống nước ngọt), Sinh thái học vi sinh vật đất, Sinh thái học vi sính vật hệ rễ cây trồng, Sinh thái học vi sinh vật đồng cỏ, Sinh thái học ví sinh vật lêu men, Sinh thái học vi sinh vật xử lý nước, Sinh thái học vi sinh vật đường tiêu hóa các động vật thực nghiệm trong y học, Sinh thái học vi sinh vật công nghiệp trong công nghiệp thực phẩm và dược phấm... Cùng với sự phát triển nhanh chóng của công nghiệp và nông nghiệp hiện đại cũng như sự phát triển vượt bậc của các phương tiện nghiên cứu sinh học, kỹ thuật mởi trong việc cài tiến công nghệ vật ỉiệu, Sinh thái học vi sính vật cũng đang có sự phát triển vượt bậc. Do tình ừạng ô nhiễm môi trường ngày càng trầm ữọng và nhu cầu về công nghệ xử lý ô nhiễm, người ta càng quan tâm tới mối quan hệ giữa vi sinh vật và các chất gây ô nhiễm môi trường, tìm hiểu mối quan hệ đặc biệt giữa vi sinh vật và chất gây ô nhiễm môi trường, tìm kiếm các loải vi sinh vật đặc biệt có khả năng phân giải các chất gây ô nhiễm, đặc tính sinh học, nhu câu sinh thái đặc biệt của chúng, tìm hiểu mối tương quan giữa vi sinh vật và chất lượng môi trường. Những điều này đang ứở thành nội dung chủ yếu của Sinh thái học vi sinh vật hiện đại. Sinh thái học vi sinh vật cũng được ứng dụng thành công ừong các lĩnh vực xử lý nước thải nông nghiệp, nước thải công nghiệp ( phân giải kim loại nặng và dầu mỏ).

23.1.2. Nguyên lý và ỷ nghĩa của sinh thái học vi sỉnh vật Sự ra đời của Sinh thái học vi sinh vật gắn liền với những quan sát thực tế của loài người đối với cuộc sổng hằng ngày. Ví dụ sự khống chế điều kiện lên men rượu từ thời xưa thực chất là kết quà quan sát và tổng kết các yếu tố sinh thái tác động đến hoạt động của vi sinh vật. Cùng với đà phát triển nhảy vọt của nền công nghiệp hiện đạí, tình ừạng ô nhiễm môi trường ngày càng ứầm trọng, từ đó thúc đẩy việc nghiên cứu Sinh thái học vi sinh vật trong công nghiệp xử lý ô nhiễm, việc đổi mới kỹ thuật xử lý nước và các phương tiện kiểm nghiệm chất lượng nước. Nghiên cứu và ứng dụng Sinh thái học vi sinh vật đã thành một trọng điểm trong nghiên cứu khoa học. Trong nền y học hiện đại người ta càng ngày càng coi ừọng mối quan hệ giữa bệnh tật vả giới hạn của khả năng chống chịu của cơ thể, bao gồm điều tiết sự cân bằng vi sinh thái trong trao đổi chất, hạn chế việc phát sinh bệnh tật. Trong đợi sống hằng ngày đâu đâu cũng thấy tầm quan trọng và sự có mặt của Sinh thái học vi sinh vật. Nguồn gốc của Sinh thái học vi sinh vật không khác nhiều so với Sinh thái học nói chung, nhung việc hình thành khoa Sinh thái học vi sinh vật thì muộn hơn nhiều. Tuy nhiên sự phát triển của Sinh thái học vi sinh vật luôn song hành với suốt lịch trình phát triển Sinh thái học. Từ giữa thế kỷ 19 khi Louis Pasteur phát hiện thấy vai trò quan trọng của vi sinh vật ữong quá trình lên men lactic, đồng thời cũng đã quan tâm đến điều kiện

514

cần thiết cho sự lên men. Các học giả Nga đã làm sáng tò tàm quan trọng của vi sinh vật đất; từ những thập kỷ 20-50 của thế ký trước đã lần lượt xuất bản những cuốn sách chuyên ngảnh về Vi sinh vật học đất, trình bày tỷ mỷ các cách phân lập vi sinh vật đất (vi khuẩn nitrat hóa) và vi sinh vật tự duõng. Học giả Hà Lan đã phân lập được vi khuẩn cố định đạm tự dưỡng, đồng thời nêu lên những vấn đề cần lưu ý khi ứng đụng nguyên lý Sinh thái học để nghiên cứu vi sinh vật đất. Waksman đã nghiên cứu mối quan hệ giữa đất và vì sinh vật đất. Những năm cuối thập kỷ 50, người ta đã nghiến cứu nhiều lĩnh vực mới như Vi sinh vật hải dương, Vi sinh vật môi trường. Bước sang thập kỷ 60, Sinh thái học vi sinh vật chính thức ra đòi. Đầu thập kỷ 70, ủ y ban Quốc tế Sinh thái học vi sinh vật (InteARNtionaỉ Comission of Microbial Ecology) đã đươc thành ỉập. Những tác phẩm liên quan đến Sinh thái học vi sinh vật được xuất bản ngày càng nhiều..

23.1.3. Các loại hỉnh sinh thái vi sinh vật Sinh thái học vi sinh vật nhấn mạnh đến cơ thể vi sinh vật và môi trường, cơ thể vi sinh vật liên quan đến virut, vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm, vi khuẩn lam, một phần nguyên sinh động vật, vi tảo...Những sinh vật này có chủng loại nhiều, phân bố rộng, phương thức sổng rất đa dạng. Môi trường là không gian mà vi sinh vật sình tồn. Tùy theo đặc điểm sống của vi sinh vật có thể chia thành môi trường lớn theo nghĩa rộng và vi môi trường theo nghĩa hẹp. Vi sinh vật cũng như các sinh vật khác đều là những nhóm loài ứong môi trường lởn, mặt khác, cơ thể vi sinh vật cực nhỏ, nên trong môi trường lớn còn cổ không gian nhỏ (microenvironment). Các nhóm loài nhất định cũng như đặc điểm nhóm loài so với Sinh thái học vĩ mô có sự khác biệt rố ràng. Ví dụ các ngăn dạ dầy của động vật nhai lại cỏ chức năng khác nhau, nền có những nhóm loài vi sinh vật vớỉ nhưng đặc điểm khác nhau. Các vi sinh vật sổng bám ờ đáy nước vừa phải thích nghi với giá thể (môi trường lớn), vừa phải thích nghi lẫn nhau (vi môi trường). Nói chung vi môi trường là không gian lỷ tưởng để những vi sinh vật nhất định nào đó sinh sống, do đó ở mỗi vi môi trường nhất định sẽ có một khu hệ vi sinh vật (microflora) nhất định. Một khái niệm quan trọng khác là tiểu sinh cảnh (niche). Khái niệm này nhấn mạnh vị trí và vai ừò của sinh vật trong hệ sinh thái. Sự lý giải của Sinh thái học hiện đại đối với tiểu sinh cảnh là chỉ trạng thái thực tế của sinh vật trong không gian N chiểu, nói chung việc diễn tả trực quan đổi với tiểu sinh cảnh vẫn là nhấn mạnh tiểu sinh cảnh dinh dưỡng và tiểu sinh cảnh không gian. Thông thường Sinh thái học vi sinh vật có thể chia théo các chức năng thực tế của vi sinh vật, chẳng hạn như Sinh thái học vi sinh vật ừong xử lý nưởc, Sinh thái học vi sinh vật đường tiêu hóa, Sinh thái học vi sinh vật hệ rễ cây ừồng, Sinh thải học vi sinh vật trong môi trường khép kín của hàng không vũ trụ v.v...

515

23.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u SINH THÁI HỌC VI SINH VẬT

23.2.1. Những phưong pháp nghiên cứu truyền thống Sinh thái học vi sinh vật là khoa học nghiên cứu mối tác động qua lại giữa vi sinhvật và môi trường, cũng như các quy luật của chúng. Do đặc điểm của vi sinh vật cho nên không thể phân tích và quan sát tất cả các vi sinh vật trong hệ sinh thái của chúng, mà phải phân tích và nghiên cứu có mục tiêu một số loại hình vi sinh vật trong đó, bao gồm nghiên cứu về số lượng, đặc tính, chức năng. Một số loài phải nuôi cấy thuần khiểt mới có thể nghiên cúu được. Trong quá trình nghiên cửu và quan sát thực tiễn lâu dài người ta đã tích lũy được những phương tiện kỹ thuật và phương pháp nghiên cứu có hiệu quả, như lấy mẫu, phân lập , nuôi cấy lảm giàu, đếm trực tiế p (qua kính hiển vi), đếm khuẩn lạc (phương pháp CFU), đếm bằng phương pháp giá trị xác suất cực đại (phương pháp MPN). Sau đây sẽ giới thiệu sơ lược các phương tiện kỹ thuật và phương pháp nói ưên. 23.2.1.1. Lẩy mẫu, nuôi cấy làm giàu và phâp lập thuần khiểt Căn cứ vào những mục đích vả yêu cầu khác nhau, cách lấy mẫu cũng khác nhau. Lấy mẫu đất và bùn không yêu cầu thao tác vô trùng, vì số lượng vi sinh vật trong đất vốn đã cực kỳ lớn, những ô nhiễm do không khí và dụng cụ lấy mẫu mang lại có thể bỏ qua, phài chủ ý vào phạm vi và chiểu sâu lấy mẫu. Khi lấy mẫu nước thì căn cứ vào độ trong sạch của nước, có thể lấy mẫu trực tiếp hoặc cô đặc bằng cách lọc qua giấy lọc (yêu càu vật dụng và thao tác vô khuẩn). Khi lấy mẫu không khí cần lọc qua giấy lọc và bằng thao tác vô trùng. Lấy mẫu trên cơ thể sinh vật, thường cần phải lấy lượng mô nhất định, rồi rửa bằng dung dịch vô khuẩn để thu gom vi sinh vật. Mầu lấy được thường tiến hành phân tích ngay hoặc giữ ứong tủ lạnh. Sau khi lấy mẫu phải đếm số lượng vi sinh vật hoặc nuôi cấy, phân lập. Nuôi cấy làm giàu (hay nuôi cấy phong phú) là nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường chọn lọc, nhằm tăng sô lượng chúng trong mẫu để dễ phân lập. Thường chỉ tiến hành 2-3 lần nuôi cấy làm giàu là cỏ thể phân lập được. Thông thường dùng cùng loại môi trường đổ trên đĩa Petri, lấy que gạt để gạt đều ttên mặt thạch. Tiếp theo, tách khuẩn lạc đứng riêng biệt và cấy chuyền trên một mồi trường nhất định. Sau 2-3 lần như vậy sẽ thu được chủng thuần khiết. a- Phương pháp giá trị xác suẩt cực đại Để nghiên cứu kết cấu và chức năng vỉ sinh vật trong hệ sinh thái vi sinh vật, cần phải xác định số lượng vi sinh vật. Ngoài phương pháp đêm trực tiếp bằng kính hiển vi, còn có thể sử đụng phương pháp các định giá trị xác suất cực đại (Most possible numberMPN, hoặc còn gọi là phương pháp pha loãng). Pha loãng mẫu (thường phải làm tới 5 độ pha loãng), cấy vào môi trường dịch thể, sau một thời gian nuôi cấy, quan sát tỉnh trạng sinh trưởng của chúng ở các độ pha loãng khác nhau, càn cứ vào số lương những ổng

516

nghiệm có vi sinh vật sinh trưởng, dùng phương pháp thống kê để tìm ra số lượng vi sinh vật (tìm trên các bản thống kê có sẵn). Phương pháp giá trị xác suất cực đại thường dùng 3 ống nghiệm hoặc 5 ống nghiệm đựng môi trường nuôi cấy. Phương pháp này có thể dùng để định lượng tổng số các vi khuẩn dị dưỡng hiếu khí, dị dưỡng kỵ khí, niữat hóa và phản nitrat hóa, vi khuẩn khử sulfat... b- Phương pháp kiểm tra sổ ỉượng vỉ sinh vật sống Có thể đếm số lượng vi sinh vật sống thông qua việc xác định số khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường thạch đĩa. Vì mỗi khuẩn lạc có thể do vài vi sinh vật đứng cạnh nhau tạo thành, cho nên mởi có khái niệm Đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming units, CFU). Thao tác cụ thể về phương pháp này lả dùng nước sinh lý vô khuẩn pha loãng thành một dãy các độ pha loãng khác nhau. Lựa chọn ba độ pha loãng thích hợp để cấy 1 giọt lên mặt thạch của môi trường thích hợp đựng trong hộp Petri. Gạt đều giọt dịch huyền phù ấy bằng 1 que gạt thủy tinh rồi đưa vào nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp. Sau đó lấy ra đếm số khuẩn lạc trên mỗi đĩa Petrí, nên chọn các độ pha loãng nào cho số lượng khoảng 30-300 khuẩn lạc trên mỗi hộp Petrí. Phương pháp này dùng để đếm số lượng vi sinh vật sống, vì có sống thì mới tạo thành được khuẩn lạc. Phương pháp này thường được dùng để xác định tổng sổ nấm men, nấm sợi, vi khuẩn, xạ khuẩn. Khi tính số lượng vi sinh vật còn phải chú ý đến số lượng các vi sinh vật không nuôi cấy được, mà đa sổ vi sinh vật trong thiên nhiên hiện nay thực ra vẫn chưa có thể nuôi cấy được ứong phòng thí nghiệm (Pace, 1996). số lượng các vi sinh vật nuôi cấy được chưa tới 1% tổng số vi sinh vật. Đối với việc phân bố và tính đa dạng của các vi sinh vật không nuôi cấy được cần sử dụng những phương pháp khác , bao gồm các phương pháp sinh học phân tử. 23.2,1.2. Các phương pháp sinh học phân tử đùng trong nghiên cửu sinh thái học vi sinh vật Các kỹ thuật sịnh học phân tử hiện đại đã được ứng dụng trong nghiên cứu Sinh thái học nói chung và Sinh thái học vi sinh vật nói riêng. Các kỹ thuật này đã giúp khắc phục những khiếm khuyết của các phương pháp Sinh thái học vi sinh vật truyền thống, giúp trực tiếp khám phả cấu trúc quần thể Vi sinh vật trong thiên nhiên và mối quan hệ giữa chúng với môi trường. Những kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng trong Sinh thái học vi sính vật chù yếu gồm các kỹ thuật dò ADN (ADN probing), kỹ thuật nhân bản ADN đặc hiệu PCR (polymeaz chain reaction), kỹ thuật phân tích ARN riboxom, phưong pháp điện di gel gradỉen biến tính v.v...ứng dụng các kỹ thuật nói ừên có thể giúp thu được các thành quả quan ứọng và tạo ra sự đột phá ữong nghiên cứu Sinh thái học vi sính vật, làm cho một sổ nghiên cứu về vi sinh vật ừở nên khả thi và cho phép tìm hiểu những vấn đề sinh thải ở mức độ phân tử.

517

a- Kỹ thuật lai ADN Kỹ thuật lai ADN cho phép xác định chính xác ADN của vi sinh vật môi trường. Kỹ thuật này kết hợp với phương pháp xác định mật độ quang học còn có thể dùng để trực tiếp để so sánh cường độ các mẫu lai đương tính (băng điện di hoặc vết chấm do lai), từ đó cho phép phát hiện các vi sinh vật có liên quan và đánh giá mức độ biểu hiện chức năng của chúng. Các mẫu dò dùng cho lai ADN dạng chuỗi nucleotit đánh dấu có thể được đùng trực tiếp để phát hiện các trình tự ADN được quan tâm trong dung dịch, cố định trên màng, ừong tế bào hoặc ừong mô. Mầu dò có thể dài (100-1000 cặp bazơ), cũng có thể là chuỗi ngắn (10-50 cặp bazơ), sẽ liên két bổ sung với trình tự ADN được quan tâm. Phương thức lai có thể là lai giữa khuẩn lạc, lai in situ (lai nguyên vị hay lai tại chỗ). Người ta đã dùng phương pháp sinh học phân tử để thăm dò và phân tích định lượng gen mã hoá enzym khử thủy ngân của quần thể Vi sinh vật trong nguồn nước đã bị ô nhiễm bởi thủy ngân. Lai vết chấm (dot blot) của gen mã hóa enzym phân hủy polyclorinađ biphenyl (PCB) cỏ thể giúp xảo định sự phân giải PCB trong quần thể vi sinh vật đất ở mức độ phân tử. Có người dùng cách lai với khuẩn lạc để theo dõi quần thể vì sinh vật trong hồ đã được cấy chủng Alcaligens có khả năng phân giải clorophenol. Người ta đã phát hiện thấy rằng khi xử lý bằng clorophenol với những nồng độ khác nhau, hoạt tính của quần thể phân giải clorophenol tỷ lệ thuận với nồng độ clorophenol, H oàn đã ứng dụng phương pháp lai bằng mẫu dò gen trao đổi chất phân hủy để nghiên cứu, phân tích những quần thể vi sinh vật thủy sinh có thể phân hủy creosot, các hydrocacbon đị vòng thơm và đa vòng thơm. Kết quả cho thấy, sau khi được thuần hóa, tổng sổ vi sinh vật nuôi cấy được đã tăng gấp 100 lần, mà tổng sổ vi sinh vật chứa gen phân hủy đã tăng 3 lần. Hogan và đồng sự ứng dụng phương pháp lai bàng mẫu đò nucleotit nghiên cứu sự phân bố của gen tfdA (gen mã hoá enzym dioxydaz trong bước đầu tiên phân hủy 2,4-D) ừong các vi sinh vật đất không phân hủy 2,4-D. Kết quả cho thấy, gen nói trên phân bố rộng rãi trong các vi khuẩn đất. Có thể gen này còn có những chức năng khác. Guo và cộng sự đã ứng đụng phương pháp lai ADN để nghiên cứu ADN chiết xuất từ vi khuẩn trong các mẫu đất bị ô nhiễm dầu mỏ hoặc chưa bị ô nhiễm. Kết quả cho thấy, tỷ lệ phát hiện các gen mã hỏa các enzym phân hủy hydratcacbon trong ADN của vỉ khuẩn lấy từ đất bị ô nhiễm rõ ràng cao hơn so với từ các mẫu không bị ô nhiễm. Phân tích định lượng còn cho thấy, ô nhiễm càng nghiêm trọng, hàm lượng gen mã hóa enzym phân hủy càng cao. Vì vậy cỏ thể dùng phương pháp này để đánh giá mức độ ô nhiễm dầu mỏ trong đất. Pollard, nhà nghiên cứu sinh thái học người Australia đã đùng phương pháp lai bằng mẫu dò ADN để đo tốc độ sinh trưởng của các vi sinh vật xác định trong bùn hoạt tính, ông thêm tymin đánh dẩu phóng xạ vào hệ thống xử lý bùn hoạt tính, khiển vi khuẩn khi phân bào bị đánh dấu phỏng xạ. Sau đó chiết xuất toàn bộ ADN của bùn hoạt tính. Cuối cùng iấy mẫu đò nucỉeotít chuyên biệt cố định trên màng

518

lai, cho lai với toàn bộ ADN bùn hoạt tính, rồi căn cử vào cường độ phóng xạ để có thể phân tích định lượng ADN của vi khuẩn xác định. Điều này cho thấy dùng phương pháp này có thê nghiên cửu động học của quần xã vi khuẩn ừong bùn hoạt tính. Đổi với các vi sinh vật ở kích thước có thể quan sát được bằng kính hiển vi, kỹ thuật iai in situ có thể giúp định lượng vi sinh vật trong môi trường một cách hữu hiệu. Kỹ thuật này cũng đã được ứng dụng rộng rãi ừong ngành Sinh học môi trường. b- Kỹ thuật nhân bản độc hiệu PCR Trong công tảc kiểm tra môi trường thực địa, đối vói việc thăm dò những vi sinh vật nhất định hoặc những gen nào đó trong quần thể phức tạp, phương pháp lai ADN trực tiếp sẽ không còn nhậy nữa vì các đoạn ADN được quan tâm thường lẫn ữong hỗn hợp dịch chiết xuất tể bào, nhưng với hàm luợng thấp. Dùng kỹ thuật PCR có thể nhân đoạn ADN được quan tâm lên nhiều lần, sao đỏ lai bằng mẫu dò để phát hiện những đoạn ADN đích được nhân lên đỏ, qua đó nghiên cứu phân tích cấu trúc quần thể Vi sinh vật định tính hoặc định lượng. Kỹ thuật PCR thường được kết hợp sử dụng với các kỹ thuật khác như PTPCR, PCR cạnh ữanh, PCR dạng máng, RAPD, ARDRA v.v... Kỹ thuật PCR cũng đã được kết hợp với kỹ thuật cắt bằng enzym giới hạn để xác định sự tồn tại của gen phân hủy naptalen nah Ac trong bùn đáy tự nhiên. Enzym giới hạn được đùng để cắt sản phẩm nhân bản PCR của gen nah Ac, rồi thông qua phân tích sản phẩm cắt để đánh giá tính đa dạng của gen đó. Erb và cộng sự đã từng dùng phương pháp nhân bản PCR từ bùn đáy bị ô nhiễm PCB để chiết xuất gen bph c từ ADN tổng số, từ đó nghiên cứu sâu hơn đổi với sự biểu hiện của gen bph ừong quá trình phân hủy PCB. Phân tích bằng enzym giới hạn sau đó chứng tỏ quần xã vi sính vật phân hủy PCB trong bùn đáy có tính đa dạng sinh học cao. Kết quả cũng cho thấy số lượng gen bph c ừong bùn đáy của nước hồ chưa bị ô nhiễm PCB tương đối ít hơn. RAPD (randomly amplified polymorphic ADN) cũng là kỹ thuật được ứng đụng rộng rãi. RAPD là dùng mồi (đoạn nucleotit) không đặc hiệu để nhân bản một đọan gen nhất định nào đó. Điện dí đồ đặc trưng (finger-printing) của phân tích RAPD đổi với các nhóm gen là rất hừu đụng khi so sánh sự thay đổi quần thể vi sinh vật trong quãng thời gian xác định của thiết bị xử lý có quy mô vừa và nhỏ, nhưng chưa đù để dự đoán tính đa dạng sinh học của quần thể. Dùng phân tích RAPD để kiểm fra quần xã vi sinh vật ừong môi trường sình lầy nhiều dầu cặn ở quy mô phòng thí nghiệm đã cho thấy: dùng môi trưởng có thêm sinh lầy dầu cặn còn thích hợp hơn cho sự phát triển và hoạt tính của những nhóm loài vi sinh vật khác nhau so với môi trường ban đầu. c- Phương pháp phần tích gen ARN riboxom (rARN) Phương pháp phân tích gen rARN là ứng dụng tổng hợp nhiều kỹ thuật sinh học phân tử để phân tích gen rARN trong vi khuẩn, từ đó vạch ra tính đa dạng cùa vi sinh vật. Đây là

519

phương pháp quan trọng nhất ứong Sinh thái học vi sinh vật phân tử, và kết quả đạt được cũng nhiều nhất. Trong phương pháp này, những kỹ thuật sử đụng chủ yếu bao gồm chiết xuất ADN tổng số từ mẫu môi trường, thiết kể mồi và mẫu dò, nhân bản PCR, điện di gel gradien biến tính (bao gồm DGGE và TGGE), phân tích đoạn đổng hình (restricted fragment length polyphorism - RFLP), sàng lọc kho lưu trữ gen, xác định trình tự, phân tích trình tự và xây dựng cây tiến hóa hệ thống, lai tái tổ hẹrp điểm, lai tái tổ hợp in situ (tại chỗ), in vivo và lai tái tổ hợp dò tuần tự (nested probes) v.v... Tùy theo đối tượng và mục đích nghiên cứu khác nhau, những kỹ thuật đó có thể sử dụng đơn độc hoặc kết hợp. Phương pháp phân tích gen rARN, thực sự đã tạo ra cuộc cách mạng về phương pháp nghiên cứu tính đa dạng vi sinh vật cũng như Sinh thái học vi sinh vật, và qua đó thúc đẩy mạnh mẽ việc nghiên cứu tính đa dạng vi sinh vật, khiến người ta có nhận thức hoàn toàn mới về quần thể vi sinh vật không nuôi cấy được (uncultured microbes). ề

Phương pháp phân tích gen rARN được ứng đụng lần đầu để phân tích quần thể vi sinh vật phù du biển, Đây là nhóm vi khuần SARII không nuôi cấy được, chuỗi rARN có 12,5% khác với trình tự gen trong kho số liệu; dùng phương pháp RFLP phản tích 51 clone thì có đến 47% trình tự khác với của quần thể đã biết. Phương pháp này cũng đã được sử dụng để tiến hành giám định phân tử và hiển vi đổi với quần thể vi khuẩn trên màng sinh vật của giá tạo thể rán. Quá trinh thực hiện như sau: dùng 1 cặp mồi đặc hiệu để nhân bản 16S rADN của vi khuẩn khử sulfat, lấy sản phẩm PCR làm mẫu dò, tiến hành lai tái tổ hợp in situ. Kết quả cho thấy: có 2 quần thể vi khuẩn có hình thái khác biệt rõ ràng (phẩy khuẩn to và phẩy khuẩn nhỏ), và các vi khuẩn đỏ sinh sôi nảy nở nhanh chóng ở mặt phăng giới hạn mới tạo thành. Qua phân tích trình tự ADN, có 3 loài chính được phát hiện: Desulfovibrio vulgaris (độ tương quan trình tự 98%), Desulfuaomouas acefoscidans (độ tương quan 96%) và một dạng xoắn thể (Spirochaeta). Dùng bùn hoạt tính xử lý nước thải là một trong những phương pháp kỹ thuật và công nghệ quan trọng nhất hiện nay nhưng người ta lại biết rất ít về tương quan giữa thành phần và chức náng của các thể hội sinh vi sinh vật trong bùn hoạt tính. Phần đáy bùn hoạt tính có thể được coi là một lớp biofilm cố định. Bioíìlm có thể tiêu thụ rất nhiều hợp chất hữu cơ và các chất ô nhiễm. Kỹ thuật lai táỉ tổ hợp dò tuần tự (nested probe hybridization) rất thích hợp để nghiên cứu thể hội sinh cực kỳ phức tạp này: Sử dụng mẫu dò chuyên biệt tiến hành nghiên cứu từ cấp độ lớn đến nhỏ (top-to-bottom) đối với những phân loài khác nhau. Ví dụ lai tái tổ hợp vòng một lần lượt sử dụng mẫu đò chuyên biệt cho vi khuẩn hoặc cổ khuẩn; kết quả: phát hiện nhiều tể bào kết hợp với mẫu dò vi khuẩn. Vòng hai sử đụng mẫu dò vi khuẩn cho các lớp phụ a, p, Ỵtrong lớp trực khuần biến hình cũng như vi khuẩn thuộc các phả hệ khác để tiến hành tái tổ hợp, Kết quả là việc sử dụng mỗi mẫu dò đều giúp phát hiện được vài loại hỉnh thải khác nhau.

520

Vi khuẩn oxy hóa amon có ý nghĩa sinh thái học quan trọng. Đó là nhóm vi khuẩn tự dương đặc biệt và có vai trò rất quan trọng trong vòng tuần hoàn nitơ. Dựa trên các đặc tính hình thái, chi có thể phân biệt được các vi khuẩn này tới cấp độ chi. Để phân biệt các loài thuộc từng chi phải căn cứ vào tỷ lệ % (G+C) trong ADN và việc lai ADN-ADN. Vì vậy phương pháp phân tích rARN đặc biệt thích họp để nghiên cứu nhóm vi khuẩn này. Kết quả phân tích ữật tự gen 16S rARN chứng tỏ vi khuẩn tự dưỡng oxy hóa amon có hai nhỏm: một nhóm có chứa vi khuẩn Nitrosococcus oceanus - thuộc về lớp phụ Y, còn nhóm kia có chửa vi khuẩn Nitrosococcus mobilis và các chi vi khuẩn khác - thuộc về lớp phụ p. Có thể nói phương pháp phân tích gen rARN là một phương pháp lý tưởng khi nghiên cứu hệ thống sính thái. Kết hợp nhiều phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử cho thấy Niứosospira phân bố rộng rãi ữong các loại môi trường, còn Nitroxomonas lại chỉ tìm thấy trong rất ít loại môi trường. Nhưng các kết quà thu được trong nghiên cứu phòng thí nghiệm thì lại cho kết luận ngược lại. Điều đó chứng tỏ các loài phân lập nuôi cấy dễ dàng không luôn luôn là loài ưu thế ừong sinh thái học. Phương pháp phân tích rARN còn được ứng dụng để xác định vi khuẩn đất, xác định tính an toàn của các vi sinh vật chuyển gen, sự chuyển gen giữa các vi sinh vật trong đất, v.v... Woese và cộng sự đã kiến nghị xây dựng kho dữ liệu về 18S rARN và 16S rARN (dự án RDP- the riboxomal databazo project). Muốn liên hệ với kho dữ liệu này có thể theo địa chỉ e-mail: [email protected] hoặc server @rdp.life.uicu.edu d- Kỹ thuật điện di geì gradien biển tính Kỹ thuật điện di gel gradien biến tính (denaturing gradien gel electrophoresis, DGGE). Đây là một dạng kỹ thuật ”dấu vân tay” (fingerprinting) phân tử. Kỹ thuật này cho phép phân biệt các trình tự ADN khác nhau dựa trên sự khác nhau về tỷ lệ (G+C)/(A+T) giữa các trình tự. Khi được điện di trên một gel có građien chất biến tính, tùy theo thành phần nucleotit mà một phân tử ADN sẽ dừng lại ờ một vị trí nhất định đặc trưng: trong phân tử càng nhiều G và c thì phân tử càng lâu bị biến tính và do đó càng lâu dừng lại trên gel điện di. Vì vậy, vị trí khác nhau trên điện di đồ DGGE phản ánh sự khác nhau về trình tự của các đoạn ADN được phân tích. Trong từng trường hợp cụ thể, mỗi vị trí có thể đặc trưng cho một trình tự ADN và phản ánh sự cỏ mặt của một loài hay cá thể trong quần xã được phân tỉch. Myuzer lần đầu tiên dùng kỹ thuật DGGE để nghiên cứu Sinh thái học vi sinh vật, xác định tính đa dạng đi truyền của quần thể vi sinh vật trong môi trường thiên nhiên. Gần đây người ta còn mở rộng phương pháp DGGE để tuyển chọn các chủng vi sinh vật và rút ngắn được rất nhiều khối lượng công việc. Trong thực tế, nên phối họp các phương pháp nghiên cứu truyền thống với các phương pháp nghiên cửu sinh học phân tử mới có thể nghiên cứu tính đa dạng vi sinh vật

521

và cấu trúc quần lạc vi sinh vật trong hệ thống sinh thái vi sình vật vô cùng phức tạp. Khi phân tích tính đa dạng vi sinh vật cần sử dụng ADN chung của quần thể vi sinh vật chứ không thể sử dụng ADN của các vi sinh vật nuôi cấy thuần khiết. 23.3. QUAN H Ệ SINH THÁI HỌC CỦA VI SINH VẬT VỚI CÁC NHÓM VI SINH VẶT Vi sinh vật sống ừong hệ sinh thái, ngoài tác dụng tương hỗ với các nhân tố lý hóa cùa môi trường, còn có tác dụng tương hỗ cực kỳ phức tạp với các sinh vật khác (bao gồm cả bản thân vi sinh vật). Các mối tác dụng đó đã tạo ra kết cấu hoàn chinh và phát huy chức năng bỉnh thường của các hệ sinh thái.

23.3.1. Quan hệ tương hễ giữa vi sinh vật với nhau Tác đụng tương hỗ giữa các vi sinh vật trong hệ sinh thái thường thể hiện qua tác đụng tương hỗ giữa các nhóm loài. Tác đựng đó không những phát sinh giữa các nhóm loài mà còn phát sinh ngay trong nội bộ của một nhóm loài. Hình thức tác dụng đó gồm các loại hình sau đây: quan hệ trung tinh (neutralism), hội sinh có ỉợi cho một phía (commensalism), tác dụng hiệp đồng (synergism), cộng sình cùng có lợi (mutualism), hội sinh cộ hại cho một phía (amensalism), tác dụng đối kháng (antagonisism), quan hệ ký sinh (parasitism), quan hệ bắt mồi (predation). Còn có thể kể thêm quan hệ cộng sinh cùng có ỉợi nhưng không bình đẳng giữa hai phía (protocoperation), quan hệ cạnh tranh (competition). 23.3.1.Ỉ. Quan hệ trung tính, hay quan hệ thông thường Quan hệ trùng tính thể hiện giữa 2 nhóm loài vi sinh vật thiếu tác dụng tương hỗ với nhau. Quan hệ trung tính không thể xuất hiện ở các nhóm loài vi sinh vật có chức năng giổng nhau hoặc gần giống nhau, mà chỉ cỏ thể tồn tại giữa các nhỏm loài có kiểu trao đổi chất khác biệt cực lớn. Giữa các nhóm loài vi sinh vật cách xa nhau về không gian, mật độ thấp, nghèo dinh dưỡng, trong môi truờng bất lợi cho sinh trưởng và sinh sản (như trong không khí đông lạnh, khô hạn) hoặc ờ trong ữạng thái nghi thi mới có thể phát sính quan hệ trung tỉnh. 23,3.1.2. Quan hệ hội sinh cổ lợi cho một phia Chi mối quan hệ có lợi cho một phía nhưng không ảnh hưởng đến nhóm loài phía bên kia, Quan hệ hội sinh có lợi cho một phía tuy thường gặp nhưng không là chuyên biệt Đây là mối quan hệ giữa hai nhóm loài mang tính chất một chiều, tác là một nhóm loài không ảnh huửng đến việc cung cấp lợi ích về môi trường và vật chất cho các n h ó m bên kia, nhung nhỏm loài hưởng lợi lại có thể nhận được lọi ích về môi trường và vật chất từ cảc nhóm loài khác. Ví dụ, một loài sinh vật chuyển hóa vật chất từ dạng không tan thành

522

dạng hòa tan cung cấp cho loài sinh vật kia sử dụng, hoặc sinh vật chuyển hóa một chất hữu cơ thành những chất cần thiết cho sự sinh trưởng của loài kia (như nấm chuyển hóa xenluloz thành glucoz cung cấp cho vi sinh vật khác sử đụng). 23.3.1.3. Tác dụng hiệp đềĩtg Tác đụng hiệp đồng giữa hai nhóm loài vi sinh vật nói lên cà hai đều hưởng lợi qua mối quan hệ đỏ, nhưng quan hệ hiệp đồng đó không mang tính chuyên biệt, tức là cả hai nhóm loài đỏ đều có thể tồn tại độc lập trong môi trường thiên nhiên. Tác dụng hiệp đồng là mối quan hệ lỏng lẻo, bất kỳ nhóm loài nào đều dễ dàng bị nhóm loài khác thay thế. Quan hệ hồ trợ dinh dưỡng (syntrophism) là điển hình của mối quan hệ tác dụng hiệp đổng. Hỗ trợ đinh dưỡng chỉ mối quan hệ hiệp đồng giữa hai hoặc trên hai nhóm loài cung cấp dinh dưỡng cho nhau. Ví dụ nhóm loải I có thể sinh ra họp chất A, nhưng không thể tiếp tục chuyển biến B thành hợp chất c , nhóm loài II không thể sử dụng hợp chất A, nhưng cỏ thể sử dụng hợp chất B, cả 2 nhóm loài đều có thể sử dụng hợp chất c , sinh ra năng lượng và các chất dinh dường cần thiết. Trong mối quan hệ trên nhỏm loài I và II đều có thể bị các nhỏm loài khác thay thế. Những ví dụ về quan hệ hỗ trợ dinh dưỡng rất nhiều, như mối quan hệ giữa vi khuẩn Lactobacillus arabìnosus và Enterococcus faecalis được nuôi cấy trong một môi trường vô cơ, loài trước cần axit folic của loài sau, loài sau cần phenylalanin của loài trước, khi hai loài đó sống chung với nhau chúng đều sống rất tốt. Quan hệ hỗ trợ dinh dưỡng đỏ rất thường gặp trong việc sử dụng sinh vật để phân giải những chất cỏ nguồn gốc ngoại lai như nông được (thuốc trừ sâu, trỉr bệnh, trừ cỏ), chất nhuộm... do đó quan hệ hỗ trợ dinh dưỡng cỏ ý nghĩa rất quan trọng trong việc xử lý môi trường, đặc biệt là đối với các chất gây ô nhiễm nguồn gốc ngoại lai. 23.3.1.4. Quan hệ cộng sinh càng có lợi Quan hệ cộng sinh cùng cỏ lợi (hay quan hệ cộng sinh tương hỗ) có thể coi là khái niệm kéo dài cùa quan hệ hiệp đồng, là mối quan hệ chuyên biệt giữa hai nhóm loài, trong đó một nhóm loài không thể bị nhóm loài khác thay thế. Chúng sống dựa vào nhau, không thể tồi tại riêng biệt trong môi trường. Địa y là điển hinh của mối quan hệ này. Địa y là hệ cộng sinh giữa tảo (hoặc vi khuẩn lam) với nấm, hai thành viên này không thể bị các tảo hoặc nấm khác thay thế. Địa y được tạo nên bởi một sinh vật sản xuất sản phẩm sơ cấp (tảo, vi khuẩn lam) và một sinh vật tiêu thụ. Sinh vật sản xuất sản phẩm sơ cấp sử dụng năng lượng ánh sáng để tổng hợp ra chất hữu cơ cung cấp cho sinh vật tiêu thụ sử đụng, sinh vật tiêu thụ cung Cấp sự bảo vệ cùng những chất khoáng, nhân tố sinh trưởng (vitamin, axit amin, enzym). Trong quan hệ cộng sinh cùng có lợi còn có hiện tuợng nội cộng sinh (endosymbiosism) giữa nguyên sinh động vật và tảo. Ngoài ra, tác đụng tương hỗ giữa thực khuẩn thể ôn hòa và vi khuẩn cũng có thể coi là mối quan hệ cộng sinh cùng có lợi.

23.3.1.5. Quan hệ cạnh tranh Quan hệ cạnh tranh chỉ hai nhóm loài vi sinh vật đo sử dụng cùng một loại tài nguyên (không gian hoặc chất dinh dưỡng hạn chế), nên cả hai đều chịu ảnh hưởng bất lợi đổi vói nhau. Quan hệ cạnh tranh cỏ thể nẩy sinh do việc hạn chế bất kỳ tài nguyên sinh trưởng nào, như nguồn cacbon, nitơ, photpho, lưu hùynh, oxy, nước v.v...Chúng ta có thể thấy giữa hai nhóm loài vi sinh vật có quan hệ họ hàng càng gần càng dễ xẩy ra quan hệ cạnh tranh. Vì vậy quan hệ cạnh tranh là phương thức tác dụng tương hỗ tồn tại phổ biến giữa các vi sinh vật. Quan hệ cạnh tranh có thể đẫn đến tác đụng phân ly giữa các nhóm loài vi sinh vật có quan hệ họ hàng gần gũi, đó là nguyên lý cạnh tranh loại trừ (compectitive exclusion principle). 23.3.1.6. Tác dụng đối kháng hoặc tác dụng gây hại một phía Một nhóm loài vi sinh vật sinh ra một chất có tác dụng độc hại hoặc ức chế những nhóm loài vi sinh vật khác, mối quan hệ đó giữa các nhóm loài được gọi là tác dụng đối kháng hoặc tác dụng gây hại cho một phía. Nhỏm loài vi sinh vật sinh ra chất đó không bị ảnh hưởng, khiến chúng ở vị thể có lợi trong cạnh tranh, sẽ tồn tại tốt hơn ưong môi trường thiên nhiên. Những chất có tác dụng đối kháng gồm rất nhiều rất loại, như axit béo phân tử lượng thấp (như axit lactic), axit vô cơ (axit sulfuaic, axit niưic), oxy, rượu, chất kháng sinh, bacteriocin V.V...VĨ khuẩn lactic có thể sinh ra và chịu đựng được axit lactic ở nồng độ cao, trong điều kiện như vậy, nhiều Vi sinh vật khác không sống nổi; vi sinh vật tạo chất kháng sinh là điển hình của tác dụng đối kháng, nhiều Vi sinh vật, đặc biệt là xạ khuẩn, cỏ khả năng sình ra chất khảng sinh. Việc phát hiện và ứng dụng chất kháng sinh đã giúp nhân loại chống lại có hiệu quả đối với nhiều bệnh tật. Bacteriocin là loại chất có tác dụng đối kháng quan ưọng khác, chúng có thể phát huy tác dụng dưới nồng độ rất thấp, nhưng đối tượng tác động thường chỉ giới hạn trong nhóm loài vi sinh vật có quan hệ họ hàng rất gần gũi với các vi sinh vật sinh ra bacteriocin đó. c ấu tạo của bacteriocin là polypeptit hoặc những protein có phân tử lượng thấp. Trong tác dụng đổi kháng, nhóm loài vi sinh vật chịu tác dụng đối kháng cũng không phải luôn ờ tư thế tiêu cực, bị động. Nhiều nhóm loài vi sinh vật có thể có những cơ chế chống lại tác dụng của chất đối kháng, chẳng hạn nhiều vi sinh vật có thể sinh ra tính kháng thuốc đối với chất kháng sinh... Chính mối quan hệ này đã làm tăng áp lực chọn lọc tự nhiên và từ đỏ xúc tiến cho quá trình tiến hóa. Cũng chính vì vậy mà chúng ta khống nên lạm dụng thuốc kháng sinh, và đã dùng thuốc kháng sinh phải dùng đúng loại có tác dụng và dùng đúng liều lượng cần thiết (để hạn chế hiện tượng nhờn thuốc của các vi khuẩn gây bệnh).

23.3.1.7, Quan hệ ký sinh Một loài vi sinh vật sống trong cơ thể vật chủ, chiếm đọat chất dinh dưỡng và gây hại cho vật chủ, đó chính là quan hệ ký sinh. Thông thường quan hệ ký sinh thường mang tính chuyên hóa cao. Virut (virut) là sinh vật ký sinh nội bào, mang tính chuyên hóa cao với tế bào vật chủ. Vi khuẩn, nấm, tảo đều có thể bị virut ký sinh, virut ký sinh trên vi khuẩn được gọi là Thực khuẩn thể (Bacteriophage, Phage). Thực khuẩn thể còn chia thành 2 loại: độc tính và ôn hòa. Thực khuẩn thể ôn hòa có giá trị ứng dụng rất cao trong nghiên cứu sinh học phân tử, có thể dùng chúng làm thể chuyển tải gen vào tế bào vật chủ và tái tổ hợp, mang lại những đặc tính mới cho tế bào vật chủ. Ngoài ra còn có loài phẩy khuẩn thực khuẩn (Bdeỉíovìbrio bacteriovorus) giống như thực khuẩn thể ký sinh trong vi khuẩn, chúng ký sinh trong nhỏm loài vi khuẩn Gram âm, nhưng bản thân chúng lại là vật chủ của thực khuẩn thể. Quan hệ ký sinh có tác đụng khổng chế nhóm loài, quan hệ đó chỉ có thể phát sinh khi đật tới mật độ nhất định trong tể bào vật chủ và khiến mật độ tế bào vật chủ giảm xuống, do đó những tài nguyên bị vật chủ tiêu hao được tích lũy và bổ sung lại. 23.3.1.8. Quan hệ săn mồi Một loài sinh vật nuốt và tiêu hóa loài khác gọi là quan hệ săn mồi. Trong thế giới vi sinh vật, phân biệt giữa quan hệ ký sinh và quan hệ bắt mồi thật ra không rõ ràng lắm. Chẳng hạn quan hệ giữa phẩy khuẩn Bdelỉovibrìo bacteriovorus và các vi khuần Gram âm, có người cho là quan hệ ký sinh, người khác lại cho là quan hệ bát mồi. Giống như quan hệ ký sinh, quan hệ bắt mồi cũng là cơ chế nhằm kiểm soát nhóm loài trong thiên nhiên, tránh sự bùng nổ của một nhỏm loài và nguồn đinh dưỡng bị tiêu hao quá mức, nguy hại cho sự sinh tồn của các nhóm loài. Mối quan hệ tương hỗ giữa vi sinh vật không những phát sinh giữa các nhóm loài, còn xẩy ra trong nội bộ từng nhóm loài. Quan hệ tương hỗ trong nội bộ một nhóm loàỉ chủ yếu dưới 2 hình thức: hợp tác và cạnh tranh. Đặc biệt trong những nhóm loài vi sinh vật gây bệnh đều tồn tại "liều cảm nhiễm thấp nhất", chỉ khi loài vi sinh vật đó đạt được tới số lượng nhất định mới có thể cảm nhiễm vào sinh vật khác và gây bệnh. Điều đó chứng tỏ ừong nội bộ từng nhóm loài vi sinh vật có tồn tại một quan hệ hợp tác. Trong thiên nhiên hoặc trong điều kiện nuôi cấy, sau khi nhóm loài sinh trưởng đến một giai đọan nhất định, do tiêu hao nguồn dinh dưỡng mà trong nội bộ nhóm loài cũng xẩy ra quan hệ cạnh ưanh.

23.3.2. Quan hệ tương hỗ giữa vi sinh vật và thực vật Nhỏm loài vi sinh vật trong hệ sinh thái, ngoài phát sinh quan hệ với nhau, còn cỏ quan hệ tương hỗ với thực vật, chủ yếu có thể chia thành quan hệ tương hỗ dương và quan hệ tương hỗ âm. Vì vi sinh vật trong đất cỏ rất nhiều cả về chủng loại và sổ lượng cho nên quan hệ tương hỗ giữa vi sinh vật và thực vật chủ yếu thể hiện ở bộ rễ thực vật.

525

Hệ rễ thực vật cung cấp chỗ cư trú tốt cho nên xưng quanh hệ rễ có thể phát hiện thấy nhiều nhóm loài vi sinh vật. Nhóm loài vi sinh vật đất và hệ rễ thực vật có tác dụng qua lại, giúp thỏa mân nhu cầu dinh dưỡng của nhau. Hệ rễ thực vật tạo môi trường sống tốt cho vi sinh vật, như hấp thu nước, giải phóng chất hữu cơ, điều tiết mật độ và tỷ lệ nhóm loài vi sinh vật. Nhóm loài vi sinh vật hệ rễ cung cấp cho thực vật nhiều lợi ích, như đảm bảo sự tuần hoàn vật chất, hòa tan chất đinh dưỡng khoáng, cung cấp vitamin, axit amin, nhân tố sinh trưởng, một sổ vi sinh vật còn sinh ra chất kháng sinh để giúp thực vật ngăn ngừa bệnh hại v.v... 23.3.2.1. Khuẩn căn (Mycorrhiza) và Nốt sần (Nodules) và Xạ căn (Actinorhizae) Nhiều loài nấm cỏ quan hệ cộng sinh với thực vật và hình thành khuẩn căn (mycorrhizae). Trong trường hợp này nấm cộng sinh ữở thành một phần của hệ rễ. Nấm được thực vật cung cấp đinh dưỡng, đồng thời cũng cung cấp chất dinh dưỡng ngược lại cho thực vật mà không gây bệnh hoặc làm tổn thương gì đối với thực vật. Ngoài ra nấm khuẩn căn còn mang lại những lợi ích khác, như kéo dài tuổi thọ hệ rễ, nâng cao tốc độ hấp thu chất dinh dưỡng, nâng cao khả năng chống đỡ bệnh tật và mức chống chịu đối với nhiều chất độc v.v...

Hình 23.1: Ngoại khuẩn căn ở Thông.

Hình 23.2: Nội khuẩn căn ờ bong.

Khuẩn căn được chia thành 5 loại khác nhau: khuẩn căn cây bụi- Arbuscuỉar mycorrhizae, Nội khuẩn căn Phong lan- Orchid endomycorrhizae, Nội khuẩn căn Thạch Nam - Ericoìd endomycorrhizae, Khuẩn căn nội ngoại sinh Dương Mai- Arbutoid ect€ndomycorrhizạe và Khuẩn căn ngoại sình - Ectomycorrhizae

526

Hình 23.3: Các dợng khuẩn căn (theo sách của LMPrescott và cộng sự).

tu e đ )

Hình 23.4: Nốt sần và sự xâm nhập của vi khuẩn nốt sân: d- Vi khuẩn nốt sần trên lông hút; e- Xâm nhập vào rễ;f- Dầy xâm nhập dưới kỉnh hiển vi điện tứ; g-Vi khuẩn nổt sần xầm nhập vào mô rễ; i- Nốt sân trên rễ cây bộ Đậu; j- Nốt sần trên rễ cây Melỉỉotns aỉba.

528

Thân, lá và quả thực vật cung cấp cho vi sinh vật nơi cư trú tốt cho nên trên các bộ phận đó cũng thường phát hiện thấy nhiều loài vi khuẩn dị dưỡng, vì khuẩn quang hợp, nấm (nhất là nấm men), địa y và tảo. Thực vật cung cấp cho những vi sinh vật nơi trủ ngụ, nước, chất dinh dưỡng và sự che chở, vi sinh vật cũng có thể cung cấp ngược lại chất dinh dưỡng, chất kích thích sinh trưởng, cố định đạm... Đó là mặt tác dụng tương hỗ dương. Đương nhiên, sự có mặt của các vi sinh vật đỏ cũng có ảnh hường âm. Mối quan hệ sinh thái giữa vi sinh vật và thực vật đáng chú ý là vi khuẩn hình thành tinh thể tuyết gây tác hại sương giá đối với thực vật. Một số chủng của vi khuẩn Pseudomonas siringae đã hình thành một loại protein bề mặt, có khả năng kích phát tinh thể băng tuyết. Khi nhiệt độ môi trường hạ thấp xuống tới -4 ~ -2°c, sẽ hình thành những tinh thể tuyết, gây bàng giá và làm chết thực vật.

Hình 23.5: Nấm ký sinh trên thực vật: Trái- Sợi nấm trong tế bào thực vật; phài- Thể đệm (stroma) của nẩm Ảtkỉnsoneĩĩa hypoxyỉonởrê Danthonia compressa. Thực nghiệm đã chứng minh, khi thay chùng vi khuẩn tự nhiên này bằng chủng đột biến không hình thành protein bề mặt kích phát tinh thể tuyết thỉ khi nhiệt độ hạ xuổng tới 9 °c cũng không hình thành tinh thể tuyết, giảm bớt tác hại của băng giá. Ở bộ rễ các cây họ đậu thường có sự cộng sinh của vi khuẩn nốt sần (chi Rhizobium) vởi các cây bộ Đậu. Chúng giúp cho cây bộ Đậu có khả năng cổ định nitơ (nitơ fixation). Người ta chế biển phân vi khuẩn nốt sần (Nitragin) để nhiễm vào hạt giống có thể giúp làm tăng rõ rệt năng suất đậu cũng như khối lượng chất xanh (thân, cành, ỉá) của cây bộ đậu.

Hình 23.6: Nẩt sần trên thân một số cây họ Đậu nhiệt đới (Điền Thanh...).

Hình 23.8: Các dạng cộng sinh: Vi khuẩn ỉam Anahaena azoỉỉae trong Bèo hoa dâu; Nẻt sần dạng phân nhảnh; Vi khuân trong nốt sần.

Hình 23.9: Bèo hoa dâu (Azolla)- nguồn phân xanh cố định nỉtợ. Bèo hoa dâu (Azolla) lả một loại phân xanh quý giá đo có khà năng cố định nitơ, khả năng này có được là nhờ có sự cộng sinh với loài vi khuẩn lam Anabaena zoilae. Loại thực vật hạt kín nhiệt đới Gunnera lại có sự cộng sinh với vi khuẩn lam Nostoc, còn loại thực vật hạt kín Ardisìa lại có sự cộng sinh với chi vi khuẩn Protobacterìum Xạ căn (Actinorhizae) là sự cộng sinh của chi xạ khuẩn Frankia với các cây không thuộc bộ Đậu. Chúng rất quan trọng vì cũng tạo nên những nốt sần (thường có hình phân nhánh) ở bộ rễ hay cả ưên thân và giúp cây cỏ thêm khả năng cố định nitơ. Cây Phi lao (chi Casuarina) sống được trên đất cát bạc màu chính là nhờ tác dụng cố định nitơ của Xạ căn. Cho đến nay đã tìm thấy Xạ căn ở các chi thực vật sau đây: Aỉlocasuarina, Casuarina, Ceuthostoma, Gymnostoma (họ Casuarinaceae), Coriaria (họ Coriariaceae), Datisca (họ Datiscaceae), Aỉnus (hộ Betulaceae), Comptonia, Myrica (họ Myricaceae), Eỉaeagnus, Hippophae, Shepherdia (họ Elaeagnaceae), Adoỉphia, Ceanothus, Coỉỉetia, Dìscaria , Kentrothamnus, Retanilla, Talguenea, Trevoa (họ Rhamnaceae), Cercocarpus, Chaemabatỉa, Cowania, Dryas, Purshia (họ Rosaceae).

Hình 23.10: Xạ căn (Actinorhizae) - Xạ khuẩn Frankia tạo nốt sần trên rễ cây Ceanothus.

531

23.3.2.2. Bệnh vi sinh vật ở thực vật - Mầm bệnh Đa số bệnh thực vật đều liên quan đến vi sinh vật, cũng có nghĩa là rất nhiều vi sinh vật (virut, vi khuẩn, nấm) gây ra bệnh thực vật. Điều này không những gây ra vấn đề sinh thái nghiêm trọng mà còn gây ra những tổn thất kinh tế nặng nề. Bệnh thực vật còn có thể gây ra nạn đói vì thiếu hụt lương thực. Năm 1845 bệnh thối nhũn khoai tây ở Irland đã gây nên nạn đói lớn, làm 1/3 dân số chết đỏi và khiến nhiều người Irland phải di dân sang Bắc Mỹ. Bệnh thực vật phát sinh và phát triển là do Vi sinh vật xâm nhập, rồi sau đó sinh sôi nẩy nờ, làm cho thực vật xuất hiện các triệu chứng bệnh.Có những vi sinh vật sau khi xâm nhập cơ thể thực vật sẽ sinh ra các loại enzym như proteaz, cellulaz, hemicellulaz...]àm phân giải các cao phân tử trong cơ thể thực vật, khiến cấu trúc thực vật bị phá hủy. Có vi sinh vật còn sinh ra các nhân tố điều hòa sinh trưởng, phá hoại hệ thống điều hòa sinh trướng bình thường của thực vật, đẫn đến phần thân phình to quá mức, hình thành khối u, mọc nhanh nhưng gây hạt lép... Cũng có những vi sinh vật sinh ra độc tố, tác động lên thành tế bào và ty thể, dẫn đên cấu trúc tế bào và chức năng của ty thể bị phá họai. Một số vi sinh vật có thể làm thay đổi hoạt tính ữao đổi chất của thực vật, khiến thực vật bị bệnh sẽ thay đổi tốc độ hô hấp, thay đổi con đường trao đổi hydrat cacbon. Một số vi sinh vật gây nhiễu tác dụng quang hợp, gây tổn thương cho quá ưình trao đổi chất của thực vật. Những bệnh virut của thực vật: Nhiều virut có thể gây bệnh cho thực vật, như virut khảm lả ở thuốc lá, đu đủ, sắn, virut gây bệnh vàng lùn, vàng xoắn lá ở lúa. Virut thực vật có thể là ỉoại virut ADN hoặc ARN. Những virut đó có thể sống tương đối lâu ngoài cơ thể, khi gặp vật chủ thích hợp sẽ xâm nhập ngay. Nỏi chung, virut gây bệnh thực vật ký sinh nội bào bắt buộc.

H ình 23.11: M ột s ố virut g â y bệnh ớ cây trồng.

532

Những bệnh vi khuẩn của thực vật: Vi khuẩn và Xạ khuẩn gây bệnh thực vật chủ yếu thuộc về các chi Mycoplasma, Sỉpiroplasma, Arthrobacter, Corynebacterium, Agrobacterium, Pseudomonas, Xanthomonas,Clavibacter, Rhodococcus, Streptomyces, Erwinina, Empoasca... Chúng đều là sinh vật ký sinh trên thực vật, phân bố rộng rãi, gây ra n hiều th ứ b ệ n h cho th ự c v ậ t, n h ư sin h trư ở n g q u á m ứ c , h é o ú a , th ố i rữ a , k h ô v ằ n ... N h iề u vi khuẩn gây bệnh thực vật có thể tiếp tục sống trong hạt hoặc các mô đang ở trạng thái nghi, khi hạt nẩy mần lại gây nhiễm bệnh cho cây con. Những bệnh nấm của thực vật: Những nấm gây bệnh thực vật thuộc về nhiều chi khác nhau: Pyricularia, Synchtricum ,01pidium, Rhizopus, AlteARNria, Helminthosporium, Cochliobolus, Claviceps, Aspergillus, Fusarium, Puccinia, Plasmodiophora, Spongospora, Polymyxa, Achlya, Saprolegnia, Pythium, Sclerophthora, Sclerospora,Peronospora, Pseudoperonospora, Peronosclerospora, Plasmopora, Bremia, Peronophthora, Albugo, Physoderma, Urophylactis, Mucor, Choanephora, Taphrina, Erysiphe, Blumeria, Sphaerotheca, Podosphaera, Phyllactinia, Uncinula, Microsphaera, Ceratocystis, Valsa, Gibberella, Gaeumannomyces, Diaporthe, Elsinoe, Guignardia, Venturia, Pleospora, Sclerotinia,Monilinia, Uromyces, Gymnosporangium, Ưstilago, Tilletia, Entyloma, Thanatphorus, Heỉicobasidium, Septobasidium, Exobasidium, Penicillium, Botrytis, Verticillium, Thichothecium, Cercospora, Cladosporium, Fulvia, Fusicladium, Curvularia, Ustilagonoidea, Colletotrichum, sphaceloma, Marssonina, Pestalotia, Phoma, Phompsis, Phyllosticta, Macrophoma, Septoria, Diplodìa, Ascochyía, Rhizoctonia, Scerotium... Bệnh nấm ứiực vật là những bệnh hay gặp nhất, cũng nghiêm trọng nhất, gây ra tổn thất kinh tế cũng lớn nhất. Ở nước ta thường xuyên gặp các bệnh do nấm như bệnh đạo ôn, bệnh lúa von, bệnh gỉ sắt... Nhiều loài nấm ưong cùng một bộ hay một họ có thể gây ra các bệnh thực vật, như nấm thuộc bộ Uredinales và nấm thuộc họ Ustilaginaceae. Có tới 20.000 loài nấm thuộc bộ Uredinales và 1000 loài mnh 23 ỉ2: Bệnh nẠm trên lá lúa, nấm thuộc họ Ustilaginaceae đã được mô tả. Các loài nấm đó đều là nấm đảm (Basidiomycetes), có chu trình sổng hết sức phức tạp. Nấm gây bệnh thực vật có thể nhiễm ờ nhiều bộ phận khác nhau, dẫn đến nhiều bệnh thực vật khác nhau (bệnh gỉ sắt, bệnh phấn đen, bệnh héo úa, bệnh thối rữa, bệnh đạo ôn, bệnh xoắn lá, bệnh đốm hoa, bệnh u rễ.. .)•

533

k'

Hình 23.13: Vi khuẩn Agrobacterium tạo khối u trên rễ cây Kalanchoe sp. Cần nhấn mạnh đến ứng dụng cùa trực khuẩn Agrobacterium tumefacciens trong sinh học phân tử thực vật hiện đại. Chúng xâm nhập thực vật qua vết thương hình thành khối u ở rễ cây. Đặc tính này của trực khuẩn do plasmid Ti điều khiển, những chủng thiếu plasmid này không gây bệnh cho thực vật được. Plasmid Ti chứa nhóm gen vir sinh ra protein cần thiết cho việc đi chuyển Í-ADN, nhóm gen đó được thể hiện do hợp chất phenol đặc hữu của thực vật (do mô bị tổn thuơng sinh ra) khởi động, từ đó đẫn đến việc chuyển dịch vật chất đi truyền từ vi khuẩn sang tế bào thực vật, rồi vào nhân của tế bào thực vật, kết hợp với nhiễm sắc thể thực vật. Vì vậy có thể sử dụng plasmid như thể vận chuyển clone trong công nghệ di truyền thực vật: nối gen đích với plasmid Ti, qua đó vận chuyển gen đích vào trong tế bào thực vật và kết hợp với nhiễm sắc thể thực vật, từ đó mang lại đặc điểm và chức năng mới cho thực vật. Nghiên cửu những plasmid như plasmid Ti mang ý nghĩa quan trọng về lý thuyết và có giá trị ứng dụng rất cao về thực tiễn.

23.3.3. Tác dụng tương hẫ giữa vi sinh vật và động vật Đại đa số tác dụng qua lại giữa vi sinh vật và động vật là quan hệ cùng có lợi. Quan hệ công sinh giữa vi sinh vật và nhóm loài động vật bao gồm trao đổi dinh dưỡng, giúp động vật tiêu hóa những thức ăn khỏ tiêu (đặc biệt là chất xơ- xenluloz), sinh ra vitamin và a x it a m in , c h ố n g đ ề k h á n g v ớ i v i s in h v ậ t g â y b ệ n h , d u y trì n ơ i tr ú n g ụ th íc h h ợ p V.V...VÌ

sinh vật cũng có thể là vật gây bệnh cho động vật, sinh ra độc tổ , gây ra những bệnh nghiêm trọng, thậm chí gây thành các dịch bệnh. Quan hệ qua lại giữa vi sinh vật và động vật cỏ thể tóm tắt thành mấy điểm sau đây. 23.3.3.1.

Vỉ sinh vật cung cẩp chất dinh dưỡng cho động vật

a- Bản thần vi sinh vật là chất dinh dưỡng của động vật Nhiều động vật sống nhờ vi sinh vật, đặc biệt là động vật phù du và động vật thủy sinh bậc thấp. Chúng nuốt vi sinh vật để dùng làm thức ăn, hoặc lọc bỏ nước giữ vi sinh vật

534

lại dùng làm thức ăn. Ngoài ra, có nhiều động vật biết nuôi vi sinh vật để làm thức ăn hoặc nhờ vi sinh vật để xử lý thức ăn.

Hình 23.14: Kiến trồng nấn trong tổ từxenìuỉoz thực vật để đùng làm thức ăn (theo R,M.Ảtlas), Xenluloz là nguồn thức ăn thực vật phong phú nhất trong thiên nhiên, nhưng đa số động vật ăn cỏ không tiêu hóa trực tiếp được mà phải nhờ các vi sinh vật phân giải thành những hợp chất mà động vật có thể s ử dụng được. Chẳng hạn như vi khuẩn trong đạ cỏ của các động vật nhai lại, hoặc là loài mối, chúng biết nuôi vi sinh vật ngoài cơ thể để dùng làm thức ăn.Có một số côn trùng biết cách nuôi cấy vi sinh vật thuần khiết trong cơ thể thực vật để đùng làm thức ăn. Để đáp trả, động vật phát tán rộng rãi vi sinh vật và cung cấp nơi trú ngụ cho chúng. b- Hệ vi sinh vật cộng sinh đường ruột Trong dạ dày và đường ruột của phần lớn các động vật máu nóng đều có những nhóm loài vi sinh vật cộng sinh hết sức phức tạp. Trong ruột người cỏ nhiều loại vi sinh vật kỵ khí bắt buộc như Bacteroides, Fusobacterium, Bifidobacterium, Eubacterium. Nhóm loài vi sinh vật dạ dày và đường ruột động vật dạ dày 1 ngăn chủ yếu cung cấp những tác ahân sinh trưởng như vitanmin, axit amin, không giúp gi về mặt phân giải để tiêu hóa thức ăn. Trong dạ dày và đường ruột động vật cỏ dạ dày nhiều ngăn (động vật nhai lại), đậc biệt trong dạ cỏ cùa trâu bò, c ó chửa những nhóm loài vi sinh vật hết sức phức tạp, ừong đó bao gầm những nhóm loài vi sinh vật phân gỉảỉ xenluloz, phân giải tinh bột, phân giải h em icello z, V! k h u ẩ n lê n m e n đ ư ờ n g , vi k h u ẩ n sin h m e ta n (C H 4), v i k h u ẩ n th ủ y p h â n

protein, vi khuần thủy phân lipit... Những vi sinh vật này thuộc cề các chi Bacteroides, Ruminococcus, Selenomonas, Metanobacterỉum, Butyrìvibrìo, Succinimonas, Succinivibrio, Streptococcus, Eubacterium, Lactobacillus v.v...Các nhóm loài vi sinh vật

535

k

này, ngoài khả năng cung cấp vitamin, axit amin, còn giúp động vật tiêu hóa những thức ăn khó tiêu như xenluloz, hoặc còn có cả tác dụng cố định nitơ. Nhóm ỉoài vi sinh vật bình thường trong dạ dày và đường ruột còn là lá chắn thiên nhiên giúp động vật chống đỡ lại với các vi sinh vật gây bệnh cho dạ dày và cho đường ruột. Những động vật phải uống thuốc kháng sinh dài ngày rất dễ bị nhiễm khuẩn dạ đày và đường ruột khá trấm trọng, điều đó cho thấy vai trò cùa các nhóm loài vi sinh vật dạ dày và đường ruột. Trong quan hệ cộng sinh nói trên, động vật đã cung cấp cho vi sinh vật môi trường kỵ khí thích hợp và các chất dinh dưỡng một cách ổn định. Nhóm loài vi sinh vật trong đường tiêu hỏa của các động vật bậc thấp cũng có những tác dụng tương tự như vậy.

Hình 23. ì 5: Vi khuẩn dạ cỏ Ruminococcus và sự chuyển hóa trong dợ cỏ (theo R, M.Atlas).

536

Quan hệ cộng sinh giữa động vật không xương sống và vi sinh vật quang hợp Có một số động vật không xưang sống và vi sinh vật quang hợp như tảo đơn bào, vi khuân lam hình thanh nên môi quan hệ cộng sinh. Trong mối quan hệ cộng sinh đó, vi sinh vật quang hợp cung cấp chất dinh dưỡng hữu cơ cho động vật, còn động vật thì cung cấp môi trường sinh lý và đinh dưỡng thích hợp cho vi sinh vật.

Các vi khuẩn phát quang như Vibrio fisheri cộng sinh với loài mực Euprymna scoỉopes.. Cộng sinh với mực còn có vi khuẩn phát quang Photobacterium fischerei. Nhiều vi khuẩn phát quang thuộc các chi Vibrio và Photobacterỉum cũng cộng sinh với cá. Vi khuẩn phát quang Photorhabdus luminescens cộng sinh với các loài tuyển trùng thuộc chi Heterorhabditis spp. Còn tìm thấy quan hệ cộng sinh của vi khuẩn Buchnera aphidicoỉa với loài rệp Schizaphis graminum.

/n ' / ầ s

,

■ '/

..

,7

-O'/./:'

• /

Hình 23. ì 6: Vi khuẩn Photobacterium phái quang.

23.3.3.2. Nấm săn mồi động vật Có một số loài nấm có thể bắt tuyến trùng và luân trùng để dùng làm nguồn dinh dưỡng. Nấm bắt tuyến trùng thuộc về các chi Arthrobotrys, Dactyỉaria, Dactyleỉỉa, Trichothecium. Nấm bắt tuyến trùng lảm mồi theo nhiều cơ chế khác nhau: sinh ra cấu tạo dạng lưới phân nhánh có phủ chất kết dính, đạng nút kết dính, dạng vòng kết dính và dạng vòng co rút. Khi tuyến trùng bò qua các cấu tạo có chất kết dính sẽ bị dính lại, hoặc khí bò qua vòng co rút cấu tạo bởi ba tế bào thì vòng sẽ đột nhiên co thát lại và bắt được con mồi. Tuyến trùng đã bổ sung nguồn đạm mà nấm cần dùng để sinh trưởng và phát triển. Nấm ký sinh H a p to g ỉo ss a m ir a b iỉis c ó th ể b ắ t đ ư ợ c lu â n trù n g . B ào tử d i đ ộ n g c ủ a lo à i n ấ m n à y có

thể sinh ra bào nang đặc biệt, khi bào nang nẩy mầm sẽ sinh ra tế bào”súng”, cùng với bào nang h ợ p th à n h k ế t c ấ u đ ặ c b iệt, k h i lu ân trù n g g ặp p h ả i k ế t c ấ u đ ó , tế b à o ” sú n g ” liề n b ắn

nang bào tử vào trong cơ thể luân trùng. Nang bào tử phát triển trong cơ thể luân trùng tạo thành sợi nấm, giét chết vật chủ và thu được nhiều chất dinh dưỡng. Quan hệ giữa Trùng vỏ ốc (Coccoidea) và nấm Septobasìdium cũng rất thú vị. Coccoidea là loại sinh vật ký sinh thực vật, sổng nhờ vào việc hút nhựa cây. Trứng của chúng có thể bị nhiễm nấm, loại nấm này phát triển trên khắp cơ thể luân trùng trưởng thành, nhưng không làm chết ngay. Luân trùng vẫn có thể sống và đẻ trứng. Ấu trùng cùa luân trùng vẫn có thể hút nhựa cây giữa các sợi nấm, luân trùng trưởng thành sau đó sẽ bị nấm phân giải thành các chât dinh dư&ng. Trong quan hệ đó nấm đa bảo vệ cho luân trùng và luân trùng cung cấp chất dinh dưỡng cho nâm, đồng thời

537

bằng sự di chuyển của mình, luân trùng đã giúp nấm phát tán rộng rãi. Những mối quan hệ điển hĩnh như vậy, còn có ở Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis).

Hình 23.17: Nẩm bắt tuyển trùng Arthrobotrys.

Hình 23.18: Đông trừng hạ thảo.

23.3.3.3. Vi sinh vật gây bệnh cho động vật Nhiều vi sinh vật, bao gồm virut, vi khuẩn, nấm, tảo, đều có thể gây bệnh cho người và động vật. Phần lớn bệnh tật ở người có liên quan đến vi sinh vật, từ cảm cúm đến một sổ loài ung thư, rồi AIDS, SARS đều do vi sinh vật gây ra. Quá trinh gây bệnh cho nguời và động vật của vi sinh vật chia thành 2 loại: Một là, vi sình vật sống bên trong hoặc bên trên bề mặt cơ thể động vật và trực tiểp gây bệnh. Hai là, vi sinh vật sống ngoài cơ thể động vật sinh ra các chất độc, làm gây bệnh cho động vật hoặc làm thay đổi điều kiện cư trú của động vật khiến chúng không thể sống được. Những vi sinh vật sinh trưởng trong trạng thái tự nhiên cỏ thể làm thay đổi điều kiện môi trường, gây ảnh hưởng bất lợi cho động vật. Ví du, tảo trong hồ nước nểu sinh trưởng quá mức sẽ sinh ra quá nhiều chất hữu cơ, sau đố bị các vi sinh vật phân hủy làm tiêu hao nhiều oxy hòa tan, tạo ra môi trường kỵ khí, và gây chết cho nhiều nhóm loài động vật. Vi sinh vật còn có thể sinh ra nhiều chất độc vô cơ hoặc hữu cơ. Như vi sinh vật sống ưong bùn có thể làm tích lũy H 2S, gây độc cho động vật. Những độc tố do vi sinh vật sinh ra, qua đường tiêu hóa đi vào cơ thể người và gây nên ngộ độc thức ăn. c ỏ thể kể đến độc tố thần kinh Botulin của vi khuẩn Cĩosdium botuỉinum, độc tố gây ung thứ Aflatoxin của nấm sợi Aspergillus flavtis, độc tổ gây tử vong amatoxin của nấm mũ Amanitaphaloides v,v...Khi nghiên cứu độc tố Vi sinh vật gây bệnh động vật, phải tính đến điều kiện sinh trưởng và sinh ra độc tố của vi sinh vật, nồng độ gây bệnh.... Ngược lại, vi sinh vật gây bệnh hoặc vi sinh vật ký sinh tất nhiên có thể sinh trưởng bên trong hoặc bên ngoàỉ cơ thể động vật (có một số là ký sinh bắt buộc). Những vi sinh vật đó thưòng xâm nhập qua các cửa ngõ tự nhiên như miệng và đường hô hấp, cũng có thể qua vết thương hoặc vết bị động vật cắn hay đốt. Sau khi vào cơ thể động vật, chúng ừanh giành chất dinh dưỗng của vật chủ, sinh

trưởng và sinh sản hoặc lợi dụng hệ thống tổng hợp của vật chủ để tự tổng hợp ra bản thân chủng. Hậu quả là lam cho vật chủ tử vong hoặc bị ngăn chặn bởi hệ thống miễn địch của cơ thê động vật. Mặc dâu các mô ở người và các động vật khỏe manh là vô khuẩn, nhưng bên ngoài cơ thê ẩn náu rất nhiều vi sinh vật, ví dụ nhu trên đa người, tế bào biểu bì chết, chât tiêt tuyên mô hôi đêu có chứa keratin, lipit, axit béo... đều có thể làm cơ chất cho vi sinh vật sinh trưởng, vì vậy trên đa người có thể phát hiện thẩy rất nhiều loài vi sinh vật, đặc biệt là các vi khuẩn Gram âm và aấm men.

Hình 23.19: Vi khuẩn ngộ độc thịt Clostridium botuỉinum. i

Hình 23.20: Nấm độc Amanitaphaỉoides.

Tuy bình thường chúng là vô hại, nhưng trong một một số trường hợp (như bị thương hay bị bỏng), một số vi sinh vật sẽ trờ nên gây bệnh (như Tụ cầu vàng - Staphylococcus aureus). Đa sổ vi sinh vật gây bệnh đều có tính lây lan, việc đó quyết định bởi năng lực truyền nhiễm của vi sinh vật gây bệnh sau khi rời khỏi vật chủ, mật độ vi sinh vật gây bệnh, mật độ động vật, sức đề kháng của vi sinh vật gây bệnh đối vởi các yếu tố môi trường bất lợi bên ngoài cơ thể vật chù v.v...Bệnh vi sinh vật là một ừong các nhân tố khống chế số lượng, mật độ và chất ỉượng nhóm loài động vật.Vi sinh vật gây bệnh cho các nhóm loài động vật là một trong những nhân tố khống chế mật độ và chủng loại động vật cả về số lượng lẫn chất lượng. 23.4. TUẢN HOÀN SINH ĐỊA HÓA HỌC CÁC NGUYÊN Tuần hoàn sinh địa hỏa học là sự di chuyển và chuyển hóa của các họp chất hợp thành bởi những nguyên tổ xác định ừong sinh quyển, khí quyển, thủy quyển, thạch quyển (bao gồm thổ quyển) dưới cảc tác dụng sinh hóa học. Trong các quá trình tuần hoàn này luôn liên quan đến sự chuyển biến từ ừạng thái hóa học này đến trạng thái hóa học khác, từ trạng thái oxy hóa (hoặc trạng thái khử) này đến trạng thái oxy hóa (hoặc Ưạng thái khừ) khác, từ dạng khí đến dạng lỏng hoặc từ dạng rắn, lại ừở về dạrg khí.

539

N ếu chỉ dựa vào các định luật nhiệt động học, thì những phản ứng như oxy hóa-khử sẽ khó m à xẩy ra, nên tuần hoàn sinh địa hóa học (biogeochem istry cycle) tồn tại trong hệ phức hợp sinh vật-phi sinh vật và có ảnh hưởng sâu sắc đến việc bảo vệ m ôi trường toàn cầu và xây đựng sự ổn định sinh thái. Từ khi có cuộc cách m ạng công nghiệp, do hoạt động tăng cường của nhân loại sẽ sinh ra nhiều vật ô nhiễm chứa c , N , p , s, do đó không thể tránh khỏi gây xáo trộn cho vòng tuần hoàn sinh địa hóa học, trực tiếp uy hiếp đến sự sinh tồn v ả sức khỏe nhân loại.

Hình 23.21: Khái quát về tuần hoàn sình địa hỏa học (theo L.M ,Prescott và cộng sự).

Hình 23.22: Dòng năng lĩỉợng và chẩi dinh dường trong các hệ sinh thái (Theo J.G.Black). 1- Mặt trờ i, E-năng lượng, N- chât dinh dưỡng; 2- Vật tiêu thụ; 3- Vật phân hủy; 4- Sản phẩm.

Điều đó cũng khiến vòng tuần hoàn m ột số nguyên tố này tàng nhanh, vòng tuần hoàn m ột sô nguyên tô khác lại chậm lai hoặc ngưng hoàn toàn rồi trở nên trạng thái “phi tuân hoàn” . Có học già đã đê ra thuyết vòng tuần hoàn vật chất liên quan đến những bệnh lưu hanh ở địa phương, chẳng hạn như bệnh Keshan được giải thích là bắt nguồn từ quá trình sinh địa hóa học thiếu selen.Vi sinh vật trong thiên nhiên phân bố rất rộng rãi, có các quá trinh trao đổi chất đa dạng, có hoạt tính enzym m anh mẽ. Do những biến hóa hỏa học đo vi sinh vật gây ra đêu có liên quan với nhau, cho nên vi sinh vật có vai trò quan trọng trong các vòng tuần hoàn sinh địa hóa học. Mối quan hệ tương hỗ giữa M ặt trời, các sinh vật có nhân thật đa bảo ,các vi sinh vật với các chất vô cơ, chất hữu cơ (O M ) có thể trình bày trong

2

hình trên.

23.4.1. Đặc điểm chung của vòng tuần hoàn sinh địa hóa học Năm 1902, nhà khoa học N ga Vladimir VeARNdsky (1863-1945) làn đàu tiên nêu ra thuật ngữ “sinh địa hóa học”. Từ lâu, tuần hoàn sinh địa hóa học vẫn được coi là m ột ữong các nội dung nghiên cứu hệ sinh thái, và được coi là m ột phần của vòng tuần hoàn vật chất. Mói đây có nhà khoa học coi đó là nội dung cốt lối của việc nghiên cứu sinh địa hóa học môi trường (environm ental biogeochemistry). 23.4.1.1. Đ ịn h nghĩa

Trong Sinh thái học, vòng tuần hoàn vật chất (cycle o f material) của hệ sinh thái thường được gọi là vòng tuần hoàn sinh địa hóa học (biogeochemicaỉ cycle) với nội dung là tiếp nhận chất đinh dưỡng khoáng từ khí quyển, nước và đất để tảng hợp thành chất hữu cơ, sau đỏ lại bị sử dụng, cuổi cùng bị phân giải để trở về môi trường phi sinh vật. Cũng có nhà khoa học cho rằng tuần hoàn sinh địa hóa học là tổng hợp của tuần hoàn sinh học (biological circulation) và tuần hoàn địa hóa học (geochemical circulation). Odum (1983) cho rằng: tuần hoàn sinh địa hóa học là tuần hoàn vật chất (chủ yếu là các nguyên tố đa lượng và nguyên tố dinh dưỡng) ữong sinh quyển, bao gồm các quá trình chuyên dịch, phản ứng, hấp thu, tiêu hóa và bài tiết. Chiras (1991) cho rằng: tuần hoàn sinh địa hóa học chỉ quá trình trao đổi của những nguyên tố hỏa học và m ột số thành phần phức tạp trong hệ thống sinh học, giữa các thành phần sinh vật trong hệ thống sinh thái và các thành phần phi sinh vật. Có thể thấy tuần hoàn sinh địa hóa học trong Sinh thái học nhấn mạnh đến tác dụng sinh học cùa các nguyên tố sống, nhưng trong khoa học m ôi trường lại nhấn m ạnh đến hiệu ửng môi trường của các thành phần phi sinh vật. 23.4.1.2. Các lo ạ i hình của tuần hoàn sình địa hóa học

Dựa theo các tiêu chuẩn khác nhâu có thê chia thành các loại hình khác nhau:

541

a- Có

thể chia tuần hoàn sinh địa

hóa

học thành

3

ỉoại hình: tuần hoàn nước

(w a te r

cycle), tuần hoàn khỉ (gazous cycle) và tuần hoàn kiểu trầm tích (sedimentery cycle). Tuần hoàn nước ỉại chia ra tuần hoàn ỉớn (nước tuần hoàn giữa ỉục địa và biển) và tuần hoàn nhỏ (tuần hoàn riêng biệt trong lục địa và biển).

H ì n h 2 3 .2 3 : T u ầ n h o à n n ư ớ c ( th e o J . G . B la c k ) .

Tuần hoàn khí chỉ sự tuần hoàn dưới các dạng phân tử khí: Ơ 2 , CO 2 , N 2 , CỈ2 ...V ật chất trong tuần hoàn k iể u trầm tích không có dạng khí, chủ yếu là các chất tích trữ trong đất, vật trầm tích v à đá. Loại tuần hoàn này tốc độ chậm hơn, nói chung khó điều khiển, dê chịu ảnh hưởng bởi hoạt động can thiệp của con người và khiến cân bằng tổng quát bị phá hoại. N hững cách phân chia nói trên chưa hoàn chỉnh, chẳng hạn như tu ần hoàn lưu hùynh thuộc tuần hoàn kiểu trầm tích, nhưng ừong tuần hoàn này cũng có các thể khí tồn tại như H 2 S, S 0 2.

b- Căn cử vào sự khác biệt về kho dự trữ và kho tuần hoàn, tuần hoàn sinh địa hỏa học cỏ thể chia thành:

542

- K iểu

tuần hoàn khí (gazous cycle), kho

- K iểu

tuần hoàn trầm

dự trữ là khí

quyển v à đại dương;

tích (sedim entary cycle), kho đự trữ là đất và nham thạch;

- Kiểu tuần hoàn quá độ (transitional typ), có đặc điểm của cả 2 loại tuần hoàn nói

trên. Cách phân chia này chủ yếu xét đến tác dụng metyl hóa các nguyên tố s , Si, As, Se, Pb, H g ... có m ột phần đặc điểm của tuần hoàn khí.

c- Căn cứ vào mức độ điểu khiển khác nhau tuần hoàn sinh địa hỏa học có thể chia thành hai hình thức: tuần hoàn hoàn chỉnh (perfect cycling) và tuần hoàn không hoàn chỉnh (im perfect cycling). Tuần hoàn hoàn chỉnh do kho đự trữ hữu hiệu của chất hóa học trong phân kho phi sinh vật rất lớn, đồng thời có nhiều cơ chể điều khiển ngược, nên dễ điều khiển và quản lý, như tuần hoàn khí nói trên. Do can thiệp của các hoạt động của con

người, tuần hoàn không hoàn chỉnh là phương thức chủ yếu của tuần hoàn sinh địa hóa học. Chẳng hạn trong quá trình khai thác và gia công thủy ngân, do coi thường cơ chế tuần hoàn không hoàn chỉnh, thủy ngân thường bị metyl hóa hình thành metyl thủy ngân (CH 3 Hg+), gây độc hại cho các sinh vật và gây ô nhiễm môi trường.

PAHs 9

.0.

1

C1* í

0

4

C ly

PCDDs Hình 23.24: Vài dạng hợp chất cacbon hữu cơ. d- Căn cứ vào sự khác biệt của các hóa chất, tuần hoàn sinh địa hỏa học có thế chia thành: -

Tuần hoàn của các nguyên tố đinh đưỡng, gồm tuần hoàn của nguyên tố đa lượng

và tuần hoàn của nguyên tố

VI

lượng;

543

-Tuần hoàn của nguyên tố độc hại, chủ yếu là các kim loại nặng và các nguyên tố

phóng xạ, như Hg, Pb, Cd, As, Ư238. .. - Tuần hoàn chất ô nhiễm hữu cơ, bao gồm các loại nông dược tổng hợp, H ydrocarbua dầu mỏ, Polychlorinatđ biphenyl (PCBs), Polycyclic arom atic hydrocacbon (PAHs), Polychlorinatd dibenzo-p-dioxins ( PCDDs) v .v ... - Tuần hoàn thứ cấp, đó là sự tuần hoàn tương đối so với các vòng tuần hoàn chính, như những tuần hoàn của các khí nhà kính như c o 23.4.1.3.

2

CH4>NO 2 , v .v ...

Các nguyên tổ tuần hoàn sình địa hóa học

Trong số hơn 90 nguyên tổ hóa học tồn tại trong thiên nhiên, có 26 nguyên tố cần cho sự sống, cho nên chúng được gọi là các nguyên tố m ang tính sinh vật

( b ả n g 2 3 .1 ) .

Theo nhu cầu của sinh vật, chúng được chia theo 3 nhóm: a- N guyên tố năng lượng (energy elements): hay nguyên tố cơ bản, gồm c , H, o , N, là thành phần cơ bản cấu tạo nên axit amin và protein m à sinh vật không thể thiếu được, chúng có thể chiếm trẽn 90% trọng lượng khô của tế bào.

Bảng 23.1: H à m lư ợ ng tru n g bình của các nguyên tố tro n g cơ th ể sinh vật và tro n g vỏ T rá i đất

Hàm lưọng tưong đối % Cơ thể sinh vật

Vỏ trái đất

Nguyên tố vì lượng

0

62

46,6

c

20

H

Nguyên tố đa lượng

Cơ thể sinh vậí

vỏ trải đất

Mn

vết

0,095

0,02

Fe

vết

5,63

10

0,02

Co

vết

vết

N

3

vết

Cu

vết

vết

p

1,5

0,105

Zn

vết

vết

s

1

0,205

B*

vết

vểt

K

1,5

2,09

Al*

vết

8,23

0,5

0,013

V*

vết

0,0135

Na

0,2

2,36

Mn*

vết

vết

Ca

0,1

4,15

I*

vết

vết

Mg

0,1

2,33

Si*

vểt

28,2

C)

-

*: Chỉ tồn tại trong cơ thể một ỉt sinh vật

544

Hàm lượng ttrừng đối %

b- N guyên tố đinh dưỡng đa lượng (macronutriens): gồm Ca, M g, p, K, s, Na v.v. ..Đ ó là những nguyên tổ mà sinh vật cần đến với số lượng khá lớn, nhưng ít hơn rât nhiều so vói nguyên tố năng lượng. c- N guyên tố dinh dưỡng vi lượng (mìcronutriens): gồm Cu, Zn, M n, M o, Co, Fe v .v ... Đó là những nguyên tố không thể thiếu được đổi với sự sống, nhưng vói nhu cầu rất í t Cũng có thể chỉ chia thành hai nhóm nguyên tổ đa lượng và nguyên tố vi lượng (bảng 23.1) Các nguyên tố đó chuyển hóa và di chuyển giữa các tầng nấc khác nhau của sinh quyển, thủy quyển, khí quyển, nhưng quá trinh chủ yếu vẫn là oxy hóa, khử, khí hóa, hóa rắn, hóa lỏng v .v .. . { b ả n g

2 3 .2 ) .

Bảng 23.2: Các quá trìn h cơ bản trong tuần hoàn sinh địa hóa học các nguyên tổ Quá trình

Nội dung

Oxyhôa

Phản ứng mất electron cùa nguyên tử một chất

Khừ

Phản ứng nhận elecừon cùa nguyên tử một chất

Khỉ hỏa

Phản ứng biến thành thể khí cùa một nguyên tố

Cổ định

Phản ứng cùa một nguyên tố từ thể khí biển thảnh không phải thể khí

Hòa tan

Phản ứng của một nguyên tố trong chất khó tan biến thành chất dễ tan trong nước

Kết tủa

Phản ứng của một nguyên tố trong chất dễ tan biến thành chất khó tan trong nước

ức chế hoạt động Khoáng hỏa

Quá trình một nguyên tố ữở thành một bộ phận của cơ thể sinh vật Quá trình một nguyên tổ trong cơ thể sinh vật trở thành chất vô cơ ngoài cơ thể

Các nhân tố chủ yếu ảnh hưởng đến tuần hoàn sinh địa hóa học của các nguyên tố bao gồm: - Tính chất hóa học của nguyên tố và phương thức được cơ thể sinh vật sử đụng. - Tốc độ sinh trưởng của sinh vật ảnh hưởng đến tốc độ di chuyển của nguyên tố trong phức hệ sinh thái sinh vật - phi sinh vật. - Tốc độ phân giải cùa cơ thể.

545

23.4.1.4, N hững đặc trưng cơ bản của tuần hoàn sinh địa hóa học Tuần hoàn sinh địa hóa học thường m iêu tả bằng các khái niệm (compartement),

n h ịp ỉư u th ô n g

kho

(pool), p h â n

kho

(flux rat). Đ ỏ cũng là những đặc trưng cơ bân của tuần

hoàn sinh địa hóa học.

Bảng 23.3: Đ ặc trư n g tuần hoàn sinh địa hóa học của các quyển (Theo Chameides

1 Quyển

Tổng lượng (tấn)

Khỉ quyến

Tấng khí quyển 5 X 109 Tầng đối lưu 4,5 X 109

Thủy quyển

+Bề mặt biển 1,1 X 10" +Biển sâu 1.3 X 1012 +Tổng lượng

1.4 X 10"

Nham quyển

+VỎ đất lục địa

2 X 1013 +Thổ nhưỡng 2 X Ỉ08

và

Perdue ,

1997)

Nhịp luru thông (tấn/năm)

Thời gian hỗn hợp Trong bán cầu- khoảng 0,1 Giữa bán cầu- khoảng 2

+Lưu lượng sông 4,0 x io 7 +Lượng mưa

+Vệt trầm tích

+Bề mặt biển khoảng 100

3,9 X 108

+Biển sâu khoảng 1000

4.3 X 108 +Trao đồi theo chiều thẳng đứng 7.3 X 10®

+Thổ nhưỡng khoảng 104

+Tốc độ phong hóa lục địa 2 X 104 +Tốc độ trầm tích 2 X 104

+VỎ lục địa khoảng 109

+Bốc hơi

+V 6 đất hải dựơng

7 X 10

Thời gian tuần hoàn (năm)

Sức sản xuất bậc nhất

(TgC/s)

+Trầm tích biển khoảng 108

Cơ thể sổng: Sinh quyển đất liền: khoảng 10 Xác chết: Sính quyển đất liền: khoảng 30 Tấn c/năm

2 X 1012 Sinh quyển

C ơ th ể số n g :

+Sinh quyển đất liền: 8,3 X 105 tấn c +Sinh quyển biển: 1,8 X 1 0 3tấn c X á c c h ể t:

+Lục địa: 1,5 X 10é tấn c +Biển 3 x l 0 6tấ nC

546

+Sinh quyển đẩt liền: GPP 9 , 6 X 104 N PP4.8 X 104 +Sinh quyển biển: Tầng mặt GPP: 4 X 104 Tầng mặt NPP: 0,4 x i o 4

+Sinh quyển biển: khoảng 75 Tý lệ C:H:0:N:P +Sinh quyển biển 830:1230:604:9:1 +Sinh quyển biển 106:179:68:16:1

Kho còn gọi là kho dự trữ, chi số lượng vật chất được hạn định bởi các đặc trưng lý, hỏa, sinh. Trong kho, số lượng những vật chất đó luôn luôn vượt hơn rất nhiều số ỉượng kết

hợp bình thường trong các hệ thống sống và thường chỉ được phóng thích dần dần từ trong kho. Ví dụ toàn bộ

c

trong biển gọi là kho cacbon biển, c o

2

trong khí quyển gọi là kho

C O 2.

Phân kho chủ yếu dùng trong phân tích mội trường, chúng gồm những “kho” với quy mô nhỏ hơn. Tốc độ di chuyển vật chất từ phân kho (hoặc kho) này đến phân kho

(hoặc kho) khác có thể diễn đạt bằng nhịp ỉưu thông (flow rat). Đó là lượng vật chất đi chuyển từ phân kho (hoặc kho) này đến phân kho (hoặc kho) khác ừ ong m ột đơn vị thòi gian nhất định. N gười ta còn sử dụng khái niệm nhịp chu chuyển

chu

chuyển (tum ove rat) và thời gian

(tum ove time):

Nhịp chu chuyển = Nhịp lưu thông/lượng chất hóa học trong kho đó. Thời gian chu chuyển = tổng số chất đinh dưỡng trong kho/ nhịp lưu thông. N hững vật chất khác nhau ừong các kho khác nhau sẽ có nhịp chu chuyển khác nhau, chẳng hạn thời gian chu chuyển của nước ừong khí quyển chỉ có 10,5 ngày, cũng có nghĩa là nước trong khí quyển m ỗi năm phải đổi mới 34 lần. N guyên tố Si ử o n g biển có thời gian chu chuyển là 8000 năm, thời gian chu chuyển của N a kéo dài tới 206 triệu năm . Các quyển khác nhau cũng khác về thời gian tuần hoàn hóa địa cầu sinh vật, về thông lượng.

H ình 23.25: Thành p h ầ n k h í quyển.

547

Từ nử a sau của thế kỷ 20, do sử dụng rộng rãi các loại phân hóa học, thuốc trừ sâu, thuốc kích thích, thêm vào đó tầng ozon bị phá hủy, rừng bị hủy họai, hiện tượng “tam hóa” (sa m ạc hóa, m ặn hóa, hoang m ạc hóa) đất đai, dẫn đến hệ thống sinh thái toàn cầu không ngừng xấu đi và dẫn đến tuần hòa bất lợi của m ột số nguyên tố hóa học..

23.4.2. Tuần hoàn sinh địa hóa học cửa những nguyên tổ CO' băn

c, H, o, N

là những nguyên tố cơ bản tạo ra vật chất sống, trong tuần hoàn sinh địa

hóa học chúng đều có xuất hiện pha khí, cho nên tuần hoàn rất nhanh và đều thuộc dạng tuần hoàn thể khí. 23.4.2.1. Vòng tuần hoàn cacbon

Cacbon là nguyên tố phi kim loại, chất lượng nguyên từ tương đối là 12,011. Nguyên tử

c

cỏ thể cùng với các nguyên tử

c khác hoặc

các nguyên tử H ,

o, N ,

p hình thành nên

các càu nối cacbon hoặc càu nối cộng hóa trị (covalent bond) bền vững, tạo thành bộ khung cho các phân tử hữu cơ phức tạp (protein, photpho lipit, hydrat cacbon, axit nucleic).

Hình 2ỉ .26: Vồng turn hoàn cacbotĩ (theo J.G.Black).

548

Carbonattrong các trầm tích

Carbon hữu cơ bị phân giải bỏi vi sinh vật

c

hữu cơ làm thức Sn chữ động vật

Hình 23.27: Vòng tuần hoàn c trong tự nhiên ( th e o M . K . C o w a n , K .P . T a la r o ).

Cacbon có thể tồn tại dưới các dạng khử, ví dụ như metan (CH 4 ) và các chất hữu cơ, cũng có thể tồn tại dưới dạng oxy hóa - ví dụ như c o và CO 2 . Chất khử (như hydro - m ột loại chất khử mạnh) vả chất oxy hóa (như O 2) có thể ảnh hưởng đến các phản ứng sinh học và hóa học liên quan đến cacbon. Trong quá trình phân giải chất hữu cơ có thể sản sinh hydro, nhất là khi lên m en trong điều kiện kỵ khí. N ếu hydro và m etan sinh ra, chúng có thể chuyển từ khu vực kỵ khí sang khu vực hiếu khí. Đây là cơ hội để oxy hỏạ hydro và metan. M etan trong khí quyển có tốc độ tăng lên khoảng 1% mỗi năm, từ m ức 0,7 ppm đã tăng lên đến l,6 -l,7 p p m (theo thể tích) trong vòng 300 năm qua. N guồn m etan này có nguồn gốc đa dạng.

549

K v k lú

f f le a k h i

Co đậih cacbon

CỐSnhcacbon

Hình 23.28: Vòng tuần hoàn cacbort cơ sở trong môi trường (theo L.M.Prescott và cộng sự). Nêu m ột cột nước chứa oxy nằm trên m ột vùng kỵ khí chứa vi khuẩn m etan thì metan sẽ bị oxy hóa trư ớc khi xâm nhập vào không khí. Trong nhiều trường hợp, như trong ruộng lúa không bị che phủ bời lớp nước chứa oxy thì m etan có thể trực tiếp thoát vào không khí, làm cho lượng chứa m etan trong không khí toàn cầu tăng lên. R uộng ỉúa, động vật nhai lại, m ỏ than, nhà m áy xử lý ô nhiễm , bãi rác và ao hồ đều là những nguồn quan trọng làm tăng m etan toong không khí. Các vi sinh vật kỵ khí ừ o n g ruột m ối (như M e ta n o b r e v ỉb a c te r )

550

cững có thể làm sản sinh metan.

B ảng 23.4:

Đ ặ c tr ư n g c ủ a c á c c ơ c h ấ t h ữ u c ơ p h ứ c tạ p ả n h h ư ở n g đ ế n s ự p h â n g iả i (d e c o m p o s itio n ) v à h a o tổ n (d e g r a d a tio n )

Hao tổn

Nguyên tể tản tại vói lượng lớn Cơ chất

Gốc ctf bản

Tinh bột

Glucoz

Liên kết (chỉnh)

P ( l- 4 )

+ + +

+ + +

-

-

p (1 ^ 3 )v à p

+

+

+

+

+

+

+

-

+ +

+

+

+

+

+

-

+

+

+

+

-

-

-

+

+-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-t-

+

+

+

a ( l —»6) Xenluloz Hemixenluloz

Glucoz Đường đơn C 6 và C5

( 1Phenylpropan

Lignìn Kitin

N-acetinglucozsamin

Protein Hydro cacbon

Axìt amin Aliphatic,Cyclic, Aromatic

6)

béo; một số chứa

-

o2

+ + +

c -c sc - 0 P (l-4 )

peptid

Glycerin, Axit Lipit

o

N

Không

+ + +

a (1 -4 )

H

p

Có Oí + + +

c

este

PvàN Sinh khối vi sinh vật các dạng photphodieste

Axit nucleic Bazơ purin, pyrimidin, đường,

và dây nối N-glycosiđic

photphat

Cacbon được cổ định thoạt đầu nhờ vi khuẩn lam, tảo lục, vi khuẩn quang hợp (như C h r o m a tiu m

và

C h ỉo r o b ìu m

) và các vi sinh vật tự dưỡng hóa năng hiếu khí. Việc hao tồn

chất hữu cơ chịu ảnh hưởng của nhiều nhân tố: (l)-S ự tồn tại các chất dinh dưỡng trong môi trường; (2)- Các điều kiện phi sinh học (pH, thế oxy hóa-khử, oxy, điều kiện thẩm

551

thấu); (3)- Sự tồn tại của quàn lạc vi sinh vật. Phần lớn các cơ chất hữu cơ phức tạp đều được vi sinh vật sử dụng. Các cơ chất này chửa đựng các chất dinh đưỡng cần thiểt cho sự sinh trưởng của vi sinh vật. Kỉtin, protein, sinh khối vi sinh vật và axit nucleic chứa nhiều nitơ. N ếu các cơ chất này đều được dùng để sinh trưởng, lượng nitơ dư thừa và các chất khoáng khác không được dùng để tạo sinh khối mới của vi sinh vật sẽ được thải vào môi trường và tham gia vào quá ừình khoáng hóa (mineralization). Đó là quá trình m à chất hữu có bị phân giải và lảm sản sinh ra các chất vô cơ đơn giản (như CO 2 , N H 4 +, CH 4 , H 2 ) Các cơ chất phức tạp khác chỉ chứa

c, H,

o , nếu được vi sinh vật sử dụng để sinh

trưởng thì vi sinh vật cẩn sử dụng thêm các chất dinh dưỡng khác từ m ôi trường để tổng hợp sinh khối, đó là quá trình cố định hóa (immobilization). M ối quan hệ của việc sử dụng các cơ chất này với oxy cũng rất lý thú. Ngoài hydrocacbon và lignin ra, đại đa số các cơ chất đều dễ bị hao tổn trong điều kiện có oxy hoặc không có oxy. Q uá ưình hao tổn hydrocacbon nhờ vi sinh vật là rất đặc biệt, nhất là với những hydrocarbo m ạch thẳng hay m ạch phân nhánh, đòi hỏi trước hết phải có sự xâm nhập cùa phân tử O 2 . Gần đây người ta phát hiện thấy sự hao tổn kỵ khí hydrocacbon với các chất oxy hóa là sulfat hay nitrat. Khi có m ặt sulfat thì các vi khuẩn thuộc chi D e s u ỉ/o v ib r io

hoạt động, sự hao tổn phát sính rất chậm và quần lạc vi sinh vật cần một thời

gian dài để tiếp xúc với các phức chất này. Sự hao tổn này cuối cùng sản sinh ra sulfit, chất này cùng tồn tại với dầu m ỏ ừong dạng “khí chua” (sour gazs). Lignin là m ột loại thành phàn kết cấu quan trọng trong vật liệu thực vật trưởng thành. Đó là loại cao phân tử vô định hình phức tạp m à cơ sở là các khối phenylpropan nói với các liên kết cacbon-cacbon và cacbon-eter. Chúng chiếm đến 1/3 ừọng lượng của gỗ. Đó là m ột trường hợp đặc biệt m à sự hao tổn sinh học (biodegrability) phụ thuộc vào O 2 có thể sử dụng.Sự hao tổn lignin thường không rõ rệt, vỉ phàn lớn nấm sợi làm hao tổn lignin tại chỗ

(in s itu

) chỉ có thể tác dụng trong điều kiện có O 2 , thông qua các enzym oxitaz làm giải

phóng ra các loại oxy hoạt động. Trong điều kiện không cỏ oxy, lignin khó bị vi sinh vật làm hao tồn, kết quả là làm tích lũy các vật liệu lignin, bao gồm sự hinh thành than bùn và đất ải (muck soils). V iệc lignin khó bị phân giải ữong điều kiện kỵ khí là điều rất quan trọng ữong ngành kiến trúc. Các cấu trúc xây đựng lớn trên đầm lầy thường đặt các tấm gỗ dưới m ặt nước v à xây vật kiến trúc ưên các đống gỗ ấy. N ếu duy tri điều kiện kỵ khí thì các kết cấu ấy rất ổn định. N hưng nếu m ặt nước hạ xuống thì các tấm gỗ sẽ m ục nát, các kết cấu kiến trúc cỏ thề b ị đe dọa. M ột trường hợp t jrcmg tự khác ỉà các nấm sợi có thể tăng cường sự hao tổ n thành gỗ của thuyền bè trong điều kiện hiếu khí. D ạ cỏ là m ột ví dụ khác về mối liên hệ giữa lignin v à oxy. Trong dạ cỏ hầu như không có oxy do đó khó có thể làm hao tổn thành phàn lignin ừong thức ăn. Sau khi sử đụng được phần đường và các hợp chất carbohydrat, thi phần còn lại trong phân trâu bò sẽ có tác dụng tốt trong việc cải tạo đất đai.

552

Tại nhiều khu vực hình thức làm hao tồn nhờ vi sinh vật là rất quan trọng. Chúng tham gia vào quá trình tích ỉũy các sản phẩm của dầu mỏ, sự hình thành các đầm lầy và bảo tồn các hiện vật lịch sử.Trong điểu kiện hiếu khí hoặc kỵ khí, lúc cơ chất hữu cơ bị vi sinh vật tác động hoặc khoáng hóa, sự có m ặt hay vắng m ặt của oxy cũng đều ảnh hưởng đến sự tích lũy các sàn phẩm cuối cùng. Trong điều kiện hiếu khí vi sinh vật làm hao tồn các chất hữu cơ phức tạp vả làm sinh ra các chất oxy hóa như nitrat, sulfat và CO 2 . N gược lại, trong điều kiện kỵ khí sẽ dễ dàng tích lũy các sản phẩm cuối cùng dạng khử, bao gồm ion amon, sulíĩt, và metan. Các dạng oxy hóa hay khử này nếu chúng còn lại trong môi trường hiếu khí hoặc kỵ khí đã hỉnh thành nên chúng thì thường chỉ

tr ở

thành các chất dinh dưỡng. Nếu

có sự hỗn hợp thì các loài oxy hóa sẽ đi chuyển về các khu vực cỏ tính khử nhiều hơn, còn các loài khừ sẽ đi chuyển về các khu vực có tính oxy hóa nhiều hơn. Trong những môi trường như vậy (nối với các chất oxy hóa và chất khử) sẽ có k hả năng sản sinh năng lượng ngoại sinh. Khi các chất oxy hóa và các chất khử này bị vi sinh vật tác động sẽ dẫn đến sự xúc tiến vòng tuần hoàn dinh dưõng.

H ìn h 2 3 .2 9 : Ả n h h ư ở n g c ủ a o x y đ ổ i v ớ i s ự p h â n g iả i c á c c h ấ t h ữ u c ơ ( th e o L .M .P r e s c o tí v à c ộ n g sự ).

553

Đặc điểm của vòng tuần hoàn cacbon là: - R ất nhiều kho

c

nhỏ (C dạng trong C 0 2 khí quyển, trong cơ thể sinh vật) chuyển

hóa với tốc độ nhanh, trong khi c trong kho c lớn (C hữu cơ trong m uối cacbonat và vật trầm tích) thì chuyển hóa với tốc độ chậm và tác động tới các kho

c khác.

- Tuần hoàn trong biển và trong đất liền tiến hành tương đối độc lập, giữa chúng có sự ừao đổi bằng CO 2 - Vi sinh vật có tác dụng to lớn khi khoáng hóa chất hữu cơ và phân giải c hữu cơ, nhưng có tác dụng rất nhỏ trong việc CO 2 . 23.4.2.2. Vồng tuần hoàn L ư u huỳnh

Lưu huỳnh (S) là nguyên tố lớn thứ 14 ừong vỏ Trái đất, phân tử lượng là 32,06. Giống như p, hàm lượng s ưong cơ thể khá thấp, chỉ vào khoảng 0,25% , nhưng lại là một thảnh phần quan trọng của chất nguyên sinh. Trong thiên nhiên hóa, từ hỏa ừị -2 đến + 6 , nhưng chỉ có

6

s

dạng oxy hóa hay gặp, xem

hlnh thành

8

dạng oxy

b ả n g 2 3 .5 .

Bảng 23.5: Các dạng lim huỳnh và các trạ n g th ả i oxy hóa ch in h (C harỉson vổ cộng sự, 1992)

Hóa trị -2

Khí quyển Thể khi

D ạng hạt

h 2 s ,r s h

0 +2 +4

Thâ/ quyến

RSSR c h 3 SOCH j

s 2o - \ so2

Thề nhưỡng

H2SsHS“t s 2, RS" RSSR

r s h ,o c s ,c s 2 -1

Nham quyển

SO 2 .H2O

H 2SO 3.

CH 2 SOOH

h s o 3-

S '\ HS" MS

Sinh quyển N h a m th ạ c h

S‘2 ,HgS

Cystein, Cystin,

FeS2 s*2 s8

'

so 2-3

S 0 23

+6

s c >2

H 2SO 4 N H 4H SO 4 ( N H 4) 2S 0 4

h 2so 4

CaS04

h so 4

CaS04.H A MgSCŨ

S 0 ‘24

N f t 2S 0 4

c h 2 so 3h G h i c h ú : R l à g ố c h y đ r o c a c b o n ( n h ư C H ì), M l à i o n k ừ n ỉ o ọ i

s nhẩt, là nguồn s lớn nhất trên ưái đất. Kho d ự trữ schính ờ nham quyển (như quặng sulfija, strầm tích và nhiên liệu khoáng). K hối lượng m uối sulfat hòa tan ứong nước biển cũng rất lớn. s còn tồn tại trong Trong các loại oxit, quặng sắt vàng (FeS2) chửa nhiều

554

khí quyển với các dạng khí H 2 S, SO 2 và sulfila metyl. C ơ thể sinh vật và chất hữu cơ chứa rất ít s (bảng

nhưng là nguồn s có tốc độ tuần hoàn nhanh.

1 0 .6 ),

B ản g 23.6:

K ho

s

tr o n g

Kho s

bề m ộ t t r ả i đ ấ t ( S c h l e s i n g e r ,

1997)

Hàm lượng/ X 1018 gS 2,8 X 10' 7 1280 7440 0,0085 0,0155 8720

Khí quyển Nước biển Đá trầm tích Thực vật ừên cạn Chất hữu cơ trong đất Tổng cộng

Oxy ho á ÌuHi huỳnh Khử sulfat (dồng ho á)

ụ e s u ụ o Y ie iv

' Lim huỹnhliũtico'

Quà trinli khoáng hođ vật ầ Ỉ t

Aìíeromonas Clostridium Desuựứvibro Desuựoiomacuĩun

íKỈỊịr sụlísit (dị hóa)

Oxyhoả sulfur ThìohadUus Beggìatoa :

Thioứtrix ■

V 4#: ; I , «>

m 4 ụ a itắ đ tiệ m W

hiểu kh i không sìnhơxỵ

I

Chlowbium iu m I Kỵ khi tiu m Ị Chromaảum

H ình 23.30: Vòng tuần hoàn lưu huỳnh cơ sở (theo L.M .Prescott và cộng sự).

555

Tuần hoàn s là m ột trong các vòng tuần hoàn phức tạp nhất của sinh quyển, vừa có tuần hoàn thể khí, vừa có tuần hoàn trầm tích, cho nên được coi thuộc dạng tuần hoàn quá độ. Trong tuần hoàn lưu huỳnh, Vi sinh vật xúc tác các quá trình oxy hóa và khử s dưới các hành thức khác nhau, thúc đẩy tuần hoàn sinh địa hóa học và đóng vai trò quan trọng hàng đầu. Quá trình cơ bàn của vòng tuần hoàn s là: tầng nham thạch sulfat và nhiên liệu hỏa thạch trong đất liền và trong đại dương bị phân hủy và phong hóa tự nhiên, cùng với sự phun ừào núi lử a . . .sẽ giải phóng H2 s, SO 2 vào khí quyển, s trong khỉ quyển thông qua tác dụng m ưa và trầm lắng m ột phần ừ ở về biển, phần khác trong đất biến thành muối sulfat dành cho thực vật hấp thu, là thành phần của một số axit amin, di chuyển trong chuỗi thức ăn. Chất bài tiết và xác động thực vật bị vi sinh vật phân hủy, s bị giải phóng ra, lại trở về đất hoặc qua các dòng chày trên mặt đất rửa trôi về sông hồ rồi tới biển và trầm tích ở đáy biển sâu. Do hàm lượng s trong thiên nhiên rất phong phú, nhu cầu của sinh vật đối với s không nhiều như đối với c , o , p, nên s rất ít khi ừ ở thành nhân tổ hạn chế đổi với sự sinh trưởng của cơ thể.

H ìn h 2 3 .3 1 : V ò n g tu ầ n h o à n lư u

556

huỳnh ( t h e o

J .G .B la c k ) .

Vi khuẩn quang hợp dùng hợp chất lưu huỳnh làm chất cho elecừon để chuyển hóa lưu huỳnh. Đó là chức năng của

T h io b a c iỉlu s

và các vi sinh vật tự dưỡng hóa năng tương

tự. Ngược lại, khi sulfat khuếch tán đến môi trường có trạng thái khử thì chứng sẽ tạo cơ hội cho những nhóm vi sinh vật khác tiến hành khử sulfat (sulfat reduction). Chẳng hạn, khi tồn tại m ột chất khử hữu cơ có thể sử dụng được thì vi khuẩn

D e s u ỉý o v ib r io

sẽ dùng

sulfat để làm chất oxy hỏa, sử dụng sulfat như chất nhận elecừon ngoại lai để hình thành sulíít tích lũy lại trong môi trường. Đó là ví dụ điển hình của quá trình khử dị hóa (dissimilatory reduction) và hô hấp kỵ khí. Ngược lại, việc khử sulfat trong quá trình sinh tổng hợp axit amin và protein được coi là một quá trình khử đồng hỏa (assimilatory reduction). N hiều vi sinh vật khác cũng được biết đến là ỉoại khử dị hóa lưu huỳnh nguyên tố, đó là

D e s u lfu a o m o n a s ,

cổ khuẩn ưa nhiệt, và cả các vi khuẩn lam ừong các trầm tích có

độ muối cao.Sulfit là m ột dạng trung gian quan trọng khác, nó có thể bị nhiều loại vi sinh vật khừ thành sulfit, đó là các vi khuẩn như A l t e r o m o n a s , Vi khuẩn

D e s u ỉ/o v ib r io

C lo s tr id iu m

và

D e s u lfo m a c u lu m .

thường được coi là loại kỵ khí bát buộc. Tuy nhiên các nghiên cứu

gần đây cho biết khi chúng tồn tại trong m ôi truờng có mức oxy hòa tan là 0,04% thì chúng cũng có thể đùng oxy để hô hấp. Ngoài ra, các vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh thuộc nhóm tự dưỡng quang năng rất quan trọng như

C h r o m a tiu m

và

C h ỉo r o b iu m

có thể tác động m ạnh trong điều kiện

kỵ

khí nghiêm

ngặt dưới chiều sâu của nước, m ột nhóm lớn các vi khuẩn khác nhau có thể thực hiện quang hợp hiếu khỉ không sinh oxy. (aerobic anoxyic photosynthesis). Trong môi trường nước biển và nước ngọt phát hiện thấy các vi khuẩn quang hợp hiếu khí không sinh oxy này sử dụng sắc tố bacteriochlorophyl a và carotenoit, chúng thường là thành phần chính cùa quần lạc vi sinh vật. Các chi chủ yếu là

E r y th r o m o n a s , R o z o c o c c u s , P o r p h y r o b a c te r

và

R o z o b a c te r .

Các thành phần “nhỏ” ứong vòng tuần hoàn lưu huỳnh có vai ữ ò quan trọng trong sinh học. M ột ví đụ điền hình ỉà dimtylsulfoniopopionat (DM SP), chúng được sử dụng bởi vi khuẩn phù du (bacterioplankton) như nguồn lưu huỳnh để tổng hợp protein, chuyển hỏa thành dim etylsulfit (DM S) - m ột chất lưu huỳnh bay hơi có thể ảnh hưởng tới các quá trình của khí quyển. Khi điều kiện pH và thế oxy hóa khử thích hợp, nhiều chuyển hóa quan trọng trong vòng tuần hoàn lưu huỳnh cũng không có sự

c ỏ th ể

thực hiện thông qua các phản ứng hóa học m à

gia của vi sinh vật. M ột ví dụ quan trọng cùa quá trình phi sinh học này

là sự oxy h ó a sulfit thành lmi huỳnh nguyên tố. N hững bước then chổt của vòng tuần hoàn s bao gồm các quá trinh sau đây:

557

a - Đ ồ n g h ó a lư u h u ỳ n h ;

B ó là quá trình vi sinh vật sử dụng sulfat và H 2 s tạo nên vật

chất của tế bào. Vi sinh vật ngoài một số rất ít có thể đồng hóa trực tiếp s, phần lớn phải đùng sulfat làm nguồn s . Sau khi chúng hấp thu sulfat sẽ khử thành sulíua, kết hợp với các chất của tế bào như protein, quá trinh đó được gọi là tác dụng khử sulfat chất đồng hóa.Tác dụng khử sulfat cần đùng tới năng lượng. Trước khi khử sulfat cần tiêu hao A TP để chuyển hỏa thành ađenosin 5 ’ photphosulfat (APS); tiếp theo phải tiêu hao A TP thứ 2 để chuyển hóa APS thành 3 ’ photphoadenosin 5 ’-photphosulphat (PAPS). Sau đó khử PAPS thành sulfit, rồi khử tiếp thành sulfit. Sulíít sinh ra được serin hấp thu, rồi tạo thành cystein. b- Tác dụng kh ử h n t hưỳnh

(desulphuration): chỉ quá trình protein và các chất hữu

cơ chứa s khác được vi sinh vật phân hủy phóng thích H 2 S. N hiều Vi sinh vật hoại sinh trong hồ có khả năng này, chẳng hạn các loài sống ừong những hồ nghèo dinh dưỡng như M y c o b a c te r iu m p h le i, M y c o b a c te r iu m filifo r m e ;

các loài sống trong những hồ giàu dinh

dưỡng như Pseudomonas fluorescens, Bacterium deỉìcatum V.V... Các loài tảo biển thường tổng hợp dim etylsulfoniopropionat (D M SP), dùng để điều tiết áp suất thẩm thấu tế bào. DMSP được vi sinh vật phân giải chuyển hỏa thành dim etylsulfit (DMS). D M S bay hơi vào khí quyển, rồi sẽ cùng với H 2 s dưới tác dụng của ánh sáng tạo thành sulfat:

H2 S/DMS -* s 20 '23 -►H2S04 Loài người đốt cháy các nhiên liệu chứa s , thải SO 2 ra khí quyển, hình thành khói axit. H2 SO 4 tan trong hơi nước, khiến cho pH nước m ưa từ trung tính giảm xuống còn 3,5, hỉnh thành nên

m ư a a x it,

gây ô nhiễm m ội trường vả làm nguy hại đến sức khỏe nhân loại..

c- T á c d ụ n g lư u h ó a

(sulphurication): Q uá trình hình thành H 2 SO 4 từ H 2 S, s , FeSƠ 4

gọi là lưu hóa hay oxy hóa lưu huỳnh (sulfua oxydation). Tham gia tác dụng lưu hóa cỏ vi khuẩn lưu hóa và vi khuẩn lưu hùynh. -

V i k h u ẩ n lư u h ó a :

N hữ ng loài thuộc chi

T h io b a c iỉlu s

có thể oxy hóa s hoặc sulfit

để thu năng lượng, sinh ra H 2 SO 4 , đồng hóa CO 2 và tổng hợp nên chất hữu cơ, thường bên trong tế bào không ch ứ a trữ các hạt lưu huỳnh, n h u

2 S + 3Ơ2 + 2H2O N a2 S 2O 3 +

2

—

*■

T h io b a c iỉlu s th io o x ita n s

chẳng hạn:

2H2SO4 + năng lượng

O 2 + H 2 O —►Na 2 S 0

4

+ H 2 SO 4 + năng lượng

H2S + O2 —* 2 H2O + năng lượng Vi khuẩn

T h io b a c ìlỉu s /e r r o o x y d a n s

có thể thu được năng lượng từ qua trình oxy hóa

FeSC>4 thành Fe 2 ( 8 0 4 ) 3 : 4 F e S 0 4 + 0 2 + H 2 S 0 4-> 2 Fe 2 (S 0 4) 3 + H 20

SS8

Vi khuẩn

T h io b a c illu s fe r r o o x y d a n s

chịu được axit m ạnh, Fe 2 (SƠ 4 )3 lại là chất dễ

hòa tan, vì vậy cỏ thể dùng vi khuẩn này để tách được đồng, sắt ra từ các dạng x ỉ quặng hay quặng nghèo: FeS + 7 Fe 2 (S 0 4) 3 +

8

H 20 - » 1 5 F e S 0 4 +

Cu2S + 2 Fe 2(S04)3

8

H 2 SO 4

2Cu SO4+ 4 FeS04 + s

Phương pháp tách quặng thông qua vi khuẩn được gọi là phương pháp

ỉu y ệ n k im ư ớ t,

các chất F e S 0 4>C 11SO 4 sinh ra sẽ qua các phưcmg pháp hiện đại để thu hồi lại kim loại. N goài ra, vi khuẩn lưu huỳnh màu lục và vi khuẩn lưu huỳnh m àu tía có thể quang hợp ừong điều kiện kỵ khí: C 0 2 + H2S -*• [C H2 0 ] +2S + 2 H20 (ánh sáng) 3 C 0 2 + 2S + 5H20

3[CH 2 0 ] + 2H 2 S 0 4

(ảnh sáng)

khuẩn ỈĨỈU huỳnh: c ỏ thể oxy hóa H 2S thành s và tích trữ hạt s trong tế bào. Khi môi trường thiếu H 2 S, chúng sẽ oxy hóa tiếp s thành H 2 S O 4 , nâng lượng sinh ra được -

Vỉ

dùng để cố định CO 2 : 2 H 2 S + O 2 —*►2S + 2 H 2 0 + năng lượng 2

S + 2 H 2 O —> 2 SO "24 + 4H+ + năng lượng

V i khuẩn lưu hùynh bao gồm 2 loại - vi khuẩn lưu huỳnh đạng sợi và vi khuản lưu huỳnh tự dưõng quang năng. d - T á c d ụ n g k h ử s u lfa t ( s u lfa t r e d u c tio n )

Tác dụng khử sulfat cỏ

2

dạng: dạng đồng hóa và dạng dị hóa. Tác dụng khử sulfat

dạng dị hóa là quả trình s hoặc sulfat dưới tác đụng của vi sinh vật được dùng làm thể nhận elecừon v à bị khử thành H 2 S. Ví dụ phẩy khuẩn

D e s u lfo v ib r io d e s u lfu a ic a n s

có thể sử

dụng glucoz và lactoz để khử sulfat:

c 6 H 12 0 6 + 3H2S04 2

6

C02 + 6 H2O + 3 H2S + năng lượng

CH 3 CHO H CO O H (axit lactic) + H 2 S 0 4 -*• 2 CH 3 COOH (axit axetic) + 2 CO 2 +

2 H 2O + H2S + năng lượng Trong phản ứng ừ ê n axit lactic oxy hóa không triệt để, làm tích lũy axit axetic.Trong các ống thóat nước thải bằng bê tông hoặc bằng gang, nếu có m ặt sulfat, đáy ổng thường do thiếu oxy sẽ sản sinh ra H 2 S. H 2 S sẽ nổi lên bê m ặt tầng nước thải, gặp oxy hòa tan, H 2 S bị vi khuẩn lưu huỳnh hoặc vi khuẩn sulfua hóa oxy hóa thành H 2 SO 4 và làm ăn m òn

559

đường ống. Trong thực tế có thể chống ăn mòn bằng cách duy trì dòng nước thài chảy thông suốt và nâng cao điện thế khử. e - S ự k h ử lư u

huỳnh t r o n g

th a n

s

Trong than thường có một lượng nhất định các hợp chất lưu huỳnh (chừ ưếu là hữu cơ và s trong quặng pyrit chứa sắt). Khi đốt than sẽ xuất hiện khói HỉS có hại, khí này tham gia vào các trận mưa axit, làm ô nhiễm đất và nước, phá hoại cân bằng sinh thái. VI vậy việc khử s và phân hủy s trong than là một vấn đề có ý nghĩa toàn cầu, Vi sinh vật phân giải s ữong quặng pyrit theo 2 phương thức: một là, trực tiếp oxy hỏa và làm hòa tan quạng; hai là, tác dụng gián tiếp theo cơ chế như sau: 2FeS2 + 702 + 2H20 — 2FeS04 +2 H2SO4 Vi sinh vật 2 FeSƠ4 +

Vi O 2 + H 2 S O 4 —*

F e2 (S Ơ 4 )3

+H 2O

Vi sình vật FeS2 + Fe2(S04)3 ■-* 3FeS04 +3S 2S + 302+ H2)

2 H2SO4

Vi sinh vật

shữu cơ ữong than chù yếu là hợp chất dạng thơm của Fe, và nhóm lipit chứa Fe, ừong đó chứa hàm lượng cao là DBT- dibenzothiophene. Vi sinh vật có hai phương thức phân giải DBT:một ỉà, tác dụng trực tiếp lên nguyên tử strong DBT; hai lồ, biến sthành H2SO4. Tham gia vào việc khử

s trong than cỏ nhiều nhỏm vỉ

sinh vật khổc nhau;

T h io b a c iỉlu s th io o x ita n s , T h ìo b a c illu s fe r r o o x ita n s , P s e u d o m o n a s , A lc a lig e n s , E s c h e r ic h ia c o ỉỉ, S u ỉ / o ỉ o b u s a x ừ o c a ỉ d a r i u s ...

1

II

ó 4

560

♦ HNT«

H ì n h 2 3 . 3 2 : Q u á t r ì n h p h â n h ú y D B T c h ứ a ỉ u v h ụ ỳ n h t r o n g th a n .

23,4.2.3. Vòng tuần hoàn n itơ

Cơ bàn của vòng tuần hoàn niter là quá trình Nitrat hóa (N itrification), Phản nitrat hóa (Denitrification) và c ố đinh nitơ (Nitơ fixation), N itơ chủ yếu tồn tại ở khí quyển, chiếm tới 78% trong khí quyển, trong sinh quyển chỉ chiếm 0,3% tổng khối lượng sinh vật. Muối vô cơ của nitơ (muốỉ amon, nỉtrat, nitrit) có độ hòa tan trong nước cao, dễ tham gia vào vòng tuần hoàn. Chất m ùn (humus) ữong đất ôn đới thông qua việc khoáng hóa từ từ mà chuyển biển thành N vô cơ. Vùng nhiệt đới do nóng và ẩm, tốc độ khoáng hóa nhanh, ít tích Ịũy chất mùn. Khí nitơ lồ khi trơ, m uốn m ở nổi N =N cần dùng nhiều năng lượng, chỉ

có một số ít sinh vật cổ định được Nitơ. Thông qua tia chớp phóng đ i ệ n , phun trào cùa núi lửa, cũng có thể cố định được một lượng ít nitơ, Ngoài ra cố định nỉtơ tại các nhà mnáy phận đạm hỏa học (tốn rất nhiều nang lượng) cũng có thể biến N ỉ thảnh m uối amon hoặc nỉtrat cimg cấp cho cây trồng. Khoảng 85% tác dụng cố định nitơ trên Trái đất là do vi sinh vệt cố định nitợ thực hỉện, trong đỏ 60% xẩy ra trên đất liền và 40% xẩy ra ở đại dương.Thực vật hắp thụ nitơ vô

Qơ

trong đẩt, chù yổu là nitrat để tổng hợp ra protein thực

vật, Động vật hấp thu protein thực vật để tổng hợp thành protein động vật, Xác động thực vật và chất bài tiết chứa nitơ được vi sỉnh vật phân hùy trở lại thành nitơ vô cơ, m ột phẩn được thựp vệt hắp thu, phần còn lại qua táe dụng cùa vị khuẩn phàn nitrat hóa biến thành khí nitơ trở về khí quyển.

561

Khù nitrat

Nitrat hoá (Niùvbacte Niùvaxus)

ẳonghoá

ĩ* híítt c

m ;

~f^~GeứbactermetaỉiÌKducens Ị Desuựotibro Cbstrũũum Dị hoá và khoáng hoa

... Nìtraỉhoá

Ợũừosomonas, Nitmsococcus)

Hình 23.33: Vòng tuần hoàn nìtơ cơ sở (theo L.M. Prescott và cộng sự). Vi sinh vật dị dường (heteroừophs) cũng có thể tiến hành niưat hóa, m ột số vi sinh vật dị dưỡng còn cỏ thể kết hợp quá ừ ìn h nitrat hỏa với quá ư ìn h phản n iừ at hóa kỵ khí, đó

là quá trình oxy hóa NH 4+ trong điều kiện mức oxy thấp và tạo ra N 2O và N 2. Trong điểu kiện thiếu oxy việc tồn tại quá ư ìn h oxy hóa ion amon (anam m ox là m ột thuật ngữ thương nghiệp) cho thấy quá trình nitrat hóa không chỉ là quá trinh hiểu khí. Vì vậy khi chúng ta tìm hiểu vòng tuần hoàn sinh địa hóa học, bao gồm cả vòng tuần hoàn nitơ, trong các sách trước kia những vòng tuần hoàn đơn giản đã không phản ánh chính xác các quá trình sinh địa hóa học. N itrat hỏa ỉà m ột quá trình hiếu khí , oxy hóa ion am on (NHU*) thành nitrit (NO 2 ), rồi sau đó oxy hóa thành nitrat (NỌ}*). Chẳng hạn, vi khuẩn thuộc các chi N itr o s o c o c c u s N ỉtr o b a c te r

N itr o x o m o n a s

và

đỏng vai trò quan trong trong giai đoạn trước, còn vi khuẩn thuộc chi

v à các vi khuẩn dị dưỡng hóa năng tương ứng sẽ thực hiện giai đoạn sau. Gan

đây người ta p hát hiện thấy vi khuẩn

N iừ o x o m o n a s e u tr o p h a

ừ ong phản ứng phản nitrat

hóa tương quan, sẽ dùng N O 2 làm chất oxy hóa, trong điều kiện kỵ khí oxy hóa ion amon thành nitrit và N O . N goài ra, quá trinh nitrat hóa dị dưỡng (heteroứophic nitrification) thực

hiện bời vi khuẩn và nấm đóng vai ưò quan trọng ừong những môi trường axit.

562 r

Đ ộng vật nguyên siuli vá ttộng vật

...ỷ d i

H ì n h 2 3 . 3 4 : V ò n g t u ầ n h o à n n i t ơ ( t h e o M . K . C o w a n , K .P . T a ỉe r o ) .

563

À

Q uá trình phản nitrat hóa (denitrification) đòi hỏi m ột loạt các điều kiện môi trường khác nhau. Đ ó là m ột quá trình dị hóa, thông thường do các vi khuẩn dị dưỡng như P s e u d o m o n a s d e n itr ijic a n s

thực hiện. Trong quá trình này nitrat sẽ là chất oxy hóa trong

điều kiện hô hấp kỵ khí, tuy vẫn có thể tích lũy nitrit, nhưng sản phẩm chủ yểu của quá trinh phản nitrat hóa là N 2 và N 2 O. N itrit rất hệ trọng đối với m ôi trường vì chúng có thể tạo ra các nhân tố gây ung th ư (carcinogenic) thuộc loại niừosam in. Sau nữ a là nitrit có thể bị chuyển hỏa thành am on do tác dụng khử dị hóa của nhiều loài vi khuẩn khác nhau, bao gồm các vi khuẩn

G e o b a c te r m e ta lỉir e d u c e n s , D e s u ỉ/o v ib r io

spp., và

C lo s tr id iu m .

Q uá trình đồng hóa n itơ íà việc sử đụng nitơ vô cơ làm chất dinh dưỡng và dùng

chúng để tạo Ta sinh khối mới của vi sinh vật. Vì ion amon đã bị khử cho nên chúng trực tiếp thâm nhập m à không cần tiêu hao nhiều năng lượng. Tuy nhiên lúc đồng hóa nitrat lại cần dùng nhiều năng lượng để khử. Trong quá trình này nitrit có th ể đirợc tích lũy như một loại sản phẩm trung gian. Sinh vật nhân nguyên thủy hiếu khí hay kỵ khí đều có m ột số loài có khả năng cố định nitơ, nhung khả năng này không cỏ ở các sinh vật nhân thực (eucaryotes). Trong điều kiện hiếu khí có khá nhiều loài vi sinh vật sống tự do tham gia vào quá trình này (A z i t o b a c t e r , là thuộc chi

A z o s p ir iliu m

C lo s tr id iu m .

). Trong điều kiện kỵ khí vi khuẩn cổ định nitơ quan trọng nhất

V i khuẩn lam , chẳng hạn như Ả n a b a e n a ,

O s c iỉỉa ío r ia ,

do cố định

nitơ đa ỉàm tăng nguyên tố n itơ trong m ôi trường nước. N goài ra còn có quá trình cổ định nitơ do quan hệ cộng sinh giữa thực vật v à vi sinh vật. Ví dụ sự cộng sinh của vi khuẩn nốt sần

(R h iz o b iu m , B r a d y r h iz o b iu m

thân gỗ, của vi khuẩn lam

) với cây bộ Đậu, của xạ khuẩn

À n a b a e n a a z o lla e

F r a n k ia

với nhiều cây

với bèo hoa đâu (A z o ỉ ỉ a ).

Quá trình cố đ ịnh nitơ đòi hòi phải có m ột chuỗi nối tiếp các bưởc khử. A m on - sản phẩm của quá trình nitơ - gia nhập ngay vào chất hữu cơ dưới dạng m ột amin. Các quá trình khử là rất m ẫn cảm với O 2 v à phải phát sinh trong điều kiện kỵ khí, ngay cả với các vi sinh vật hiếu khí. Sự bảo vệ cảc enzym cố định nitơ được thực hiện bởi nhiều cơ chể khác nhau, bao gồm c ả các rào cản vật lý, chẳng hạn như các dị bào tử (heterocysts) ở vi khuẩn lam. Trong hình 10.29 ta thấy v i sinh vật có thể oxy hóa N H í+ kỵ khí cùng với việc khử

NO2’ để làm sản sinh ra N2- đó là quá trinh oxy hóa amon thiểu oxy (anam ox process). Quá trình này có thể giúp loại bỏ n itơ trong nưởc thải ở các phân xuởng xử lý nước thải, làm giảm sự m ẫn cảm với n itơ ở các hệ sinh thái nước ngọt v à n uớc biển. Tập đoàn vi sinh vật phù du (planctom ycetes) đóng vai trò quan ữọng trong quá trình này.

564

H ì n h 2 3 . 3 5 : V ò n g t u ầ n h o à n n i t ơ t r o n g t ự n h i ê n ( t h e o J . G .B l a c k ) .

Lượng nitơ trong quá trinh tuần hoàn tính theo tỷ tấn (10ỉ5 g) được thống kê như sau: Trong khí quyển- 3 800 000; Trên lục địa: phản nitrat hóa - 0,12/nãm; xác hữu cơ - 300; am on do phân giải chất hữu cơ chuyển vào khí quyển - 0,075/năm; cố định sinh học - 0,14/năm; cố định công nghiệp - 0,036/nãm ; cố định do tia chớp - 0,004/năm; nitơ theo sông ra biển: NO3' 0,008/năm, N H / - 0,005/năm. Trong đại dương: cố định sinh học - 0,10/nãm; cố định do tia chớp- 0,004/năm; xác

hữu cơ - 550; chất vô cơ tạo thành do amon hóa và niưat hỏa- 577; phản nitrat hóa0,09/nãm; trầm tích: 0,00025NH4+/năm; 0,002 N/năm Q uá trình chuyển hóa nitơ hữu cơ thành muối am mon được gọi là quá ừình am on hỏa (amonification). Dưới tác đụng của vi sinh vật protein, axit am in, các b azơ nitơ sỗ bị thủy phân tạo thành axit amin.

Sau đó tiếp tục phân hủy tới N H 3 .

Protein

->

polypeptit

proteinaz

->

axit am in

polypeptitaz

565

Quá trình amon hóa có sự tham gia của nhiều enzym khác nhau, sau đây là một sổ ví dụ: D eam ination oxy hóa: RCH CO OH + 1/2 0 2

-ỳ

I

RCOCOOH + NH 3

deaminaz

NH 3

Deamination thủy phân: RCHCO O H + H 2 O I

RCHOHCOOH+NH3 deaminaz

NH3

Deamination khử:

RCHCOOH + 2 H -ỳ RCH2COOH+NH3 I nh

3

N H 3 giải phóng ra lại có thể bị vi sinh vật sử dụng. V iệc tiến hành tái đồng hóa amon (cố định sinh học) và am on hóa (khoáng hóa) có liên quan đến tỳ lệ C/N trong m ôi trường. Thông thường lúc N H 3 bị hạn chế thì quá trình cố định sinh học là chính, trong điều kiện ngược lại thì quá trình khoáng hóa lại là chủ yếu. N ếu tỷ lệ C/N bằng khoảng 20 thì quá trình cổ định sinh học và quá trình khoáng hóa đạt tới tỷ lệ lý luận bình quân.Trong sản xuất nông nghiệp khi bón phân tạo ra tỷ lệ C/N nhỏ hơn 20 thì quá trình khoáng hóa vượt quá quá trinh cố định sinh học. N gược lại, nếu tỷ lệ C/N cao hơn 20 thì quá trình cố định sinh học vượt quá quá trình khoáng hóa. Hai bước của quá trình niừ at hóa (nitrification) được trình bày như sau: N H ^ + 3/2 0 2 «— >N O 2 + H20 + H+ (-3)

(+3)

AGO’= -276kj.m or' NO

2

+ 1 /2

(+3)

0 2

«-----►N O *3

(+5)

AGO’= -7 3 k j.m o r‘

Các vi khuẩn nitrat hóa thường được thực hiện bởi các vi khuẩn tự dưỡng. Điển hình là các loài N itrosolobus m ultiform s, N iừosococcus oceanus, N iữosococcus mobilis, N itrospina gracili, N iữosovibrio tenuis, N itrobacter w inogradskyi, N itroxom onas europaea, N itrosospira brieusis...

Bảng 23.7: Đặc điểm của các loài vỉ khuẩn nitrat hóa điển hình Phương thức phân cắt

NOl'oxy

NH4+oxy hóa thành NCV

Hình thái tế bào

Kích thước, lim

Nitrosoỉobus Multiform

Hình lá

1,5 X 1,5

Noãn phân

Chu mao

Nitrosococcus Oceanus

Hình cầu

1,8 X 2,2

Phân cắt

Chu mao

Nitrosococcus Mobiỉis

Hình cầu

1,5 X 1,8

Phân cắt

Cực mao (mọc ở 2 đầu)

+

Nitrospira Gracilis

Hình que mỏng

(03-0,4) X (2,7-6,5)

Phân cắt

Không

+

Nitrosovibrio Tenuis

Hình dấu phẩy

(0,3-0,4) X

Phân cất

Cực mao

Nẩy chồi

Cực mao

+

Phân cắt

Cực mao

+

-

Phân cắt

Chu mao

-

+

Tên vi khuẩn

Nìừobacter Winogradskyi

H ìn h

Nitroxomonas Europaea Nìtrosospira Briensìs

quả lê

rm iA

Tiên mao

hoa thành NOa -

-

-

+ +

-

-

+

(1,1-3,0)

(0,6-0,8) X

-

(1,0-2,0)

Hình que

{0,8-0t9 )x (1,0-2,0)

Hình

xoắn

(0,3-0,4) X (1,0-5,0)

M ột số vi sinh yật dị dưỡng cũng có thể tiến hành nitrat hỏa nhưng chỉ thực hiện được giai đoạn 1 chứ không thể oxy hóa tiếp nitrit. Đó là nhiều loài thuộc các chi N o c a r d ia , A c h r o m o b a c te r , P s e u d o m o n a s , V ib r io , A s p e r g illu s , F u s a r iu m ...

Q uá trinh nitrat hóa chủ yếu là quá trình hiếu khí, thường xảy ra trong đất có pH trung tính, thoát nước tốt. Trong điều kiện kỵ khí hoặc trong điều kiện axit m ạnh rất hạn chể xảy ra quá trinh này. N itrat và nitrit do vi khuẩn oxy hóa thành, thực vật có thể hấp thu để tổng hợp ra các axit amin. Trong đất còn có m ột bộ phận nitrat được oxy hóa chậm chạp để trờ thành thành phân cùa chất m ùn. Vì ion amon mang điện tích dương, de bị các hạt đât sét mang điện tích âm hấp phụ, thông qua tác đụng nitrat hóa m à hình thành nên các ion n iưat và nitrit mang

567

điện tích âm, có thể di chuyển tự do trong dung dịch đất. N itrat ừong đất dễ bị nước mưa rửa trôi, theo dòng chảy tởi hồ, sông và biển, được sinh vật thủy sinh sừ dụng; hoặc bị rửa ừ ôi làm cho m ôi trường ngày càng thiếu oxy và dẫn tới tác dụng phàn nitrat hóa, tạo ra sự hao m òn nitơ của đất. Trong thực tiễn sản xuất phải bón phân N m ột cách khoa học, đồng thời phải dùng các chất ức chế quá trình nitrat hóa, như nitrapyrin, nhàm nâng cao hiệu suất phân bón, và ngăn ngừa nitrat từ các vùng đất màu m ỡ rửa trôi và làm ô nhiễm nguồn nước. Q uá trinh khử nitrat bao gồm khử niừat đồng hóa và khử nitrat dị hóa. -

K hử

niừat đ ồ n g

hóa

K hử nitrat đồng hóa là quá trình sinh học, sau khi nitrat được tể bào hấp thụ, sẽ khừ hình thành amon kết hợp vào vật chất tế bào. N hiều vi khuẩn, nấm và tảo cỏ khả năng khử

nitrat đồng hóa. Mục đích của quá trình này là sử dụng amon trong nitrat, mà không phái là chất nhận electron, cho nên hệ enzym khử niừat đồng hóa (gồm enzym khử nitrat đồng hóa và enzym khử nitrit đồng hóa) không bị ức chế bởi oxy khí quyển. -

K hử

nitrat

dị hóa

K hử nitrat dị hóa là quá trình sinh học sau khi nitrat được tế bào hấp thụ, được dùng làm chất nhận electron, qua đó khử thành anaon. Trong m ôi trường bùn bẩn, nước thải công nghiệp, hoặc trong dạ cỏ, đễ dàng sinh tác dụng khử nitrat đị hỏa. Trong quá trình này nitrat đóng vai trò chất nhận elecửon, cho nên tác đụng khử niừat dị hóa bị oxy ức chế. Khử nitrat dị hóa lại chia thành khử nitrat dị hóa dạng lên men và khử nitrat dị hóa dạng hô hấp. Đặc điểm khử nitrat dị hóa dạng lên men là không có sự tham gia của enzym két hợp m àng, cytocrom và photphoryl dẫn truyền electron, còn khử nitrat dị hóa dạng hô hấp thì ngược lại. N êu sản phẩm khử niử at dị hỏa dạng hô hấp ở thể khí như N 2 , N 2 O thỉ gọi là quá trình phản nitrat hỏa (denitrification). Trong quá trình phản nitrat hóa, nitrat qua tác dụng của các enzym khử niứat, enzym khử N O ..., lấy cytocrom làm chất nhận electron, cuối cùng bị khử thành N 2 . M ột khối lượng lớn N 2 N 2 O được phóng thích vào khí quyển. Vi khuẩn phản n itrat h ó a phổ biến nhất ừong thiên nhiên là chi chi

A ỉc a ỉig e n s ,

ngoài ra còn có các chi

M o r a x e lỉa ,

P a r a c o c c u s , T h ìo b a c iỉỉits , B a c illu s , M ic r o c o c c u s

và

V ib r io .

P seu d o m o n a s,

s p ir iỉỉu m ,

rồi đến

C o r y n e b a c te r iu m ,

Vi khuẩn phản n iừat hóa phần

lớn là các vi khúẩn kỵ khí không bắt buộc, khi trao đổi năng lượng có thể dùng oxy hoặc nitrat làm chất nhận electron cuối cùng. V iệc khử n iửat cỏ ý nghĩa nhất định trong việc sử dụng chất h ữu c ơ ữong đất, nhưng tác đụng phản nitrat h ỏa làm giải phóng khí N 2 0 , cỏ thể tham gia vào việc phá hủy tầng ozon của khí quyển.

23.4.2.4. Vòng tuần hoàn sắt Sắt (Fe) là m ột trong 10 nguyên tố có hàm lượng phong phú nhất trong vỏ trái đất, nhưng trong cơ thể chỉ có khoảng

0 ,0 0 2

%. s ắ t là thành phần quan ừọng của enzym sinh

học, là nguyên tố không thể thiếu của chất diệp lục, sắt phát huy chức năng quan trọng trong hô hấp, qụang hợp, ừong các phản ứng oxy hóa khử đối với nitơ. Trong thiên nhiên sắt chủ yếu tồn tại dưới dạng quặng sắt vàng (FeS 2 ) tồn tại trong thạch quyển, trong nước có ít hơn. sắ t tồn tại dưới 2 dạng oxy hóa Fe2+và Fe3+. Khi chịu ảnh hường của vi sinh vật, pH vả thể oxy hóa khử, 2 dạng đó có thể chuyển hóa lẫn nhau. Chì có sắt hóa trị 2 m ới được vi sinh vật hấp thu sử dụng, chuyển hóa thành các chất hữu cơ chứa sắt. Sắt

2,

sắt 3 và chất hữu cơ chứa sắt dưới tác dụng của vi sinh vật sẽ xẩy ra các

phản ứng oxy hóa, khử, thực hiện vòng tuần hoàn sinh địa hóa học của sắt

( h ìn h 2 3 .3 6 ).

H ỉếuklú pịH trung tình =* G allionela pH axit ~ Leptospiìlum , ThiohaciU usferrooxidans pH axit v à tt ã nòng= Suựolobus

Fkrribacteriwn ĩimnetiứim (kobữctermttứìỉiTeducènĩ

Qữữbacitr ’ DesuỊfbro7nonasaC«ioxidayiĩ

VÍC tự

qnang n ă n t

H ình 23.36: vỏng tuần hoàn s ắ t (theo L M .P resco tt và cộng sự).

569

Vi khuẩn G a lỉio n e ỉỉa

T h io b a c iỉỉu s fe r r o o x ita n s

thực hiện quá ừình trong điều kiện axit. Vi khuẩn

rất hoạt động trong điều kiện trung tính. Còn vi khuẩn

S u l/o ỉo b u s

lại thực hiện

quá trình trong điều kiện axit và ưa nhiệt. Trong tài liệu trước đây còn nhắc đến hai chi vi khuẩn oxy hóa sắt khác là

S p h a e r o tìỉu s

và L e p t o t h r i x . Hai chi này được các nhà nghiên cứu

không chuyên về V i sinh vật học gọi là

v i k h u ẩ n sắ t.

Thực ra đó là các vi khuẩn dị dưỡng

hóa năng sinh trường ư ê n cơ chất hữu cơ trong điều kiện oxy h óa h ó a học ion sắt

2

thành

ion sắt 3 (hình thành kết tủa sắt không tan). Gần đây người ta phát hiện thấy có những vi sinh vật oxy hóa Fe2+ dùng niừat làm chất nhận electron. Qưá trình này phát sinh trong vật trầm tích dưới nước với lượng chứa oxy rất thẩp. Có thể là có m ột con đường khác trong môi trường tích lũy rẩt nhiều sắt oxy hóa khi mức oxy rất thấp. V iệc khử sắt thực hiện trong điều kiện kỵ khí và sẽ dẫn đến việc tích lũy sắt 2. Tuy nhiên rất nhiều vì sinh vật trong quá trình trao đồi chất của m inh cỏ thể khử m ột lượng nhỏ sắt. Việc khử phần lớn sắt được thực hiện bởi những vi sinh vật hô hấp sắt đặc biệt (specialized iron-respiring), như là các vi khuẩn s u lfu a r e d u c e n s , F e r r ib a c te r iu m ỉim n e tìc u m

và

G e o b a c íe r m e ta ỉỉir e d u c e n s ,

S h e w a n e lla p u fr e fa c ie n s .

G e o b a c te r

Chúng lấy ion sắt

làm chất oxy hóa và thu được năng lượng từ chất hữu cơ để sinh trưởng. N goài việc khử các ion sẳt 2 tương đối giản đơn, có m ột số vi khuẩn từ hóa

(magnetite) như Aquaspirìỉỉum magnetotacticum có thể đem sắt ngoài tế bào chuyển hóa thành oxit sắt khoáng từ tính hỗn hợp hóa tn ( Fe 3 Ơ 4 ) và tạo thành kim chỉ nam bên trong tế bào. Ngoài ra, vi khuẩn khử sát dị hóa cũng có thể tích lũy sắt từ tính (m agnetite) như m ột sản phẩm bên ngoài tế bào. Trong các vật ừ ầm tích có thể gặp các quặng sắt từ tính dưới dạng các hạt, các hạt này giống như các hạt tìm thấy trong tế bào vi khuẩn. K ết quả nghiên cứu này cho thấy vi khuẩn có những cống hiến lâu dài trong các vòng tuần hoàn sắt. C ác gen m a hóa việc tổng hợp sắt từ tính (m agnetite) đã được clone hóa vào các vi khuẩn khác và làm sinh ra các vi khuẩn mới m ẫn cảm với từ tính. N hững vi khuẩn từ tính (m agnetotactic bacteria) hiện nay được gọi là

V i k h u ẩ n từ tin h -c ầ n k h ỉ

(magneto-aerotactic bacteria). Chúng có thể lợi dụng

từ trường để chuyển d ịch đến những đầm lầy cỏ mức oxy thích hợp hom với các chức năng của chúng. K hoảng m ười m ấy năm gần đây người ta đã phát hiện thấy những vi sinh vật m ới, quang hợp không sinh oxy, có thể sử dụng ion sắt 2 để làm chất cung cấp electron. Do đỏ các vi khuẩn oxy hóa sắt n hư

G e o b a c te r

và

Shew aneU a

sinh ra ion sắt toong các vùng

kỵ khí sáng (lighted anaerobic zones) được xác định là khử sắt trên cơ sở dinh dưỡng hóa năng và tạo thành m ột vòng tuần hoàn sắt oxy hóa/khử kỵ khí b ắt buộc. Khi pH trung tính, sắt 2 trong không khí tự phát oxy hóa thành kết tủa hợp chất sắt 3, nhưng khi pH là axit thì sự oxy hóa đỏ rất chậm, vi khuẩn oxy hóa sắt ưa axit xúc tiến quá trình nói ư ên, hình thành nên chẩt lắng tủa m àu nâu và tiếp tục axit hóa chất sinh ra:

570

Fe2+ + 1/402 + H+-> Fe3+ + I/ 2 H 2 O Fe3++ 3H20 -» Fe(OH ) 3 + 3 H+ Phản ứng chung là: Fe2+ + l / 4 0 2 + 5/2 H 20 -» Fe(OH ) 3 + 3 H + Oxy hóa và lắng đọng sắt thường có sự liên hệ với nhau, vi sinh vật oxy hóa và lắng đọng săt bao gôm: vi khuân oxy hóa săt ưa axií

ự h io b a c iỉỉu s fe r r o o x ita n s , F e r r o b a c illu s

ferrooxitans, Ferrobacillus sulfooxiians, Sulfolobus, Leptospiriỉlus khuẩn sắt và nấm pH trung tính Peỉopỉoca,

Hyphomicrobium,

và

M etaỉỉogenium ) ,

vi

(S id e r o c o c c u s , P ỉa n c to m y c e s , C a u ỉo c o c c tís , N a u m a h n ie ỉỉa ,

Peđomỉcrobium,

Xạ

khuẩn,

Ochrobium

tectum,

Sỉderrocapsa, Thiopedia, Cỉonothrix, Crenothrix, Pỉanktomyces, Galỉìoneỉla, Toxothrix, Achoỉeplasma, Popỉlaspora, Aureobaxitium, Cryptococcus, Conìothyrìium...). G a ỉĩio n e ỉỉa fe r u g in e a

thuộc nhóm vi khuẩn sắt tự dưỡng hóa năng, trung tính, kỵ khí

bắt buộc hoặc vi hiếu khí, chỉ có thể dùng Fe2+ làm thể cung cấp electron. Chúng có thể thông qua chu trình Calvin để thu nhận CƠ 2 , hình thành nên những tảng ư ầm tích lớn hydroxìt sắt trong nước: 2

H 2 SO 4 + 3H20 + 2 Ca CO 3 + I/ 2 O 2 -> 2 Fe(OH ) 3 + 2 C aS 0 4 + 2 C 0 2 4

FeCƠ 3 + 6 H 2 O

+ O 2 —+ 4

F e (0 H ) 3 + 4 CƠ 2 + năng lượng

Do năng lượng thu được từ oxy hóa sắt 2 thành sắt 3 rất ít, vi khuẩn sắt (chi nhóm vi khuẩn oxy hỏa sắt

2

thành sắt 3) lại cần đến năng lượng đó để tổng hợp vật chất tế bào, cho

nên chúng cần oxy hóa rất nhiều sắt để duy ừ ỉ sự sổng. Khi vi khuẩn sát sống trong ống nước bằng gang,thường do nước mang tính axit nên hòa tan sắt thành sắt 2. Dưới tác dụng cùa vi khuẩn sắt, Fe2+ không ngừng chuyển thành Fe3+ (ri sắt), tích lũy tại trên thành ống, cuối cùng có thể dẫn đến việc ống nước bị tắc. Khai thác than béo và đồng tại những vùng mỏ lộ thiên, thường làm cho quặng sất vàng (FeS2) bộc lộ ra ngoài không khí, gặp

0 2

sẽ xẩy ra phản ứng oxy hóa chậm chạp, tạo

ra điều kiện axit, gọi là phản ứng khởi thủy. Ion sắt 2 , sản phẩm của phản ứng này, dưới tác dụng của vi khuẩn lưu huỳnh sẽ , oxy hóa sắt 2 thành sắt 3. Dưới điều kiện axit, sát 3 sẽ hòa tan và có thể phản ứng với quặng sắt vàng và oxy hóa quặng sắt vàng thành ion sắt

2

và ion sulfat. Ion sắt 2 hình thành lại bị vi khuẩn oxy hóa thành ion sắt 3 và lại phản ứng với quặng sắt, phản ứng oxy hóa này được tăng tốc, gọi là vòng tuần hoàn tăng trường (propagation cycle). Do đó quặng sắt vàng sẽ bị oxy hỏa không ngừng, liên tục và nhanh chỏng. Đ ây là nội đung của quá trình thu hồi Fe và Cu ở các khu xỉ quặng hay ở các quặng nghèo. Do vi khuẩn oxy hỏa quặng sắt vàng cho nên khu mỏ này hay thải ra nước khoáng mang tính axit, gây ô nhiễm m ôi trường xung quanh. Vi khuẩn khử sắt 3 thành sắt 2 là phương thức chủ yếu để hòa tan sắt ưong thiên nhiên. Trong đầm chua, dầm lầy, vật trầm tích ờ các đáy hồ thiểu oxy, sắt 3 thường bị vi

571

khuẩn khử thành sắt 2. N hững vi khuẩn đó bao gồm m e g a te r ìu m , E s c h e r ic h ia

B a c illu s

coỉì,

m e s e n te r ic u s ,

B a c ittú

p o ỉy m y x a ,

B a c illu s

c ir c u ĩa n s ,

P seudom onas

B a c illu s

a e r u g in o s a ,

P r o t e u s v u l g a r i s , A c h r o m o b a c t e r i c h t h y o d e r m i s , S t a p h y l o c o c c u s ....

Ngoài việc khử sắt trực tiếp, một số vi sinh vật còn có thể nhờ việc sinh ra metylat và

s dưới điều kiện kỵ khí để khử sắt 3. C ơ chế khử sắt này hiện nay còn chưa rõ, nhưng đâ có một số nghiên cứu chứng tỏ, giảm pH và Eh của môi trường sẽ có lợi cho việc khử oxit sắt. N ăm 1975, học giả M ỹ R.P.Blakem ore phát hiện được xoắn khuẩn từ tính M a g n e to ta c tic s p ir illu m

từ bùn đáy biển Bắc Mỹ.

Vì đa số sắt tồn tại ừong các quặng rắn, rất khó tan trong nước, cho nên thường chỉ có sắt 2 mới được thực vật hấp thu. Vi sinh vật hấp thu và sử dụng sắt đôi lúc cũng trở thành nhân tố hạn chế đối với sự sinh trưởng của thực vật. 23.4.2.5. Vòng tuần hoàn M a n g a it (M n)

Càng ngày người ta càng chú ý đến vòng tuần hoàn m angan (Mn)

Hiếu khi

Hình 23.37: Vòng tuần hoàn Mangan (theo L.M.Prescoư và cộng sự).

Vòng tuần hoàn M n liên quan đến việc chuyển hóa ion M n2+ thành M nƠ 2 (tương đương với ion M n4+), quá trình này liên quan đến suối nước nóng, bùn nóng và là m ột phần quan trọng của việc thấm ướt đá (rock vARNishes). Vai ữ ò chù yếu trong việc oxy hóa Mn2+ là các vi khuẩn

‘'Metaỉỉogenium

L e p to th r ix , A r th r o b a c te r , P e d o m ic r o b iu m

và m ột chi chưa biết rõ là

Vi khuần Shewaneỉỉa, Geobacter và các sinh vật đinh dưỡng hữu cơ hóa

năng có thể hỗ trợ việc hoàn thành quá trình khử M n 23.4.5.6. Vòng tuần hoàn photpho (P)

Phốtpho (P) là nguyên tố nhiều thử 10 của Trái đất, nguyên tử lượng là 30,975. H.Brand phát hiện ra p từ năm 1669. Năm 1688 B.Albinus phát hiện thấy p trong cơ thể thực vật; năm 1771 K.W .Schelle phát hiện thấy p ừong ữ o của bột xương và lần đầu tiên chứng thực sự tồn tại của chúng trong cơ thể sống. M ặc dù lượng p trong cơ thể chỉ vào khoảng 1%, nhưng do p là m ột thành phần của axit nucleic, của ATP, m etionin...cho nên chúng có chức năng quan trọng ừong các quá trĩnh dự trữ năng lượng, chuyển hóa lipit và trao đổi hydrat cacbon.. Trong thiên nhiên p tồn tại ở 4 trạng thái oxy hóa: -3, 0, +3, +5, bao gồm PH 3 (hóa trị -3), p nguyên tố (thường ở dạng

P4,

hóa ừ ị 0), axit pHotphorous và các đẫn xuất (H 3 PO 3 ,

H 2PO 3', H PO 32' hóa trị +3) ,axit photphoric và các dẫn xuất(H 3 PƠ 4 , H 2 PO 4 H PO 4 2' PO 4 3' hóa trị +5). Trong tất cả hợp chất chứa p, chỉ có hóa trị +5 là ổn định, chúng hình thành các hợp chất tồn tại ừong thiên nhiên. Vòng tuần hoàn p thực chất là sự chuyển hóa lẫn nhau giữa các m uối photphat. Trong nông nghiệp, vì hàm lượng p trong đất không cao, p hình thành qua phân hủy nhờ vi sinh vật không đủ cung cấp, cho nên p Ưong đất thường trở thành yếu tổ hạn chế yêu cầu sinh trưởng của cây trồng. Photpho cỏ thể chia thành 3 loại: p vô cơ hòa tan, p vô cơ không tan v à p hữu cơ. Vi sinh vật chù yếu tham gia các quá trình tuần hoàn p nhờ hòa tan p hừu cơ, chuyển hóa p khó tan thành dạng hòa tan, và chuyển hóa p vô cơ thành p hữu cơ. Sự khoáng hóa của p hữu cơ là quá trình chuyển hóa từ p hữu cơ thành p vô cơ ở dạng hòa tan. Quá trình này chủ yếu xảy ra trong đất, cũng có trong nước. M ột số vi khuẩn và nấm cỏ thể sinh ra enzym phytaz làm hòa tan phytat (axit phytic) v à giải phóng ra axit photphoric... Thuộc về nhóm này có

A s p e r g illu s , P e n ic iỉlìu m , R h ừ o p u s ,

C u n n in g h a m ia ,

A r th r o b a c te r , S tr e p to m y c e s , B a c illu s ...

Axit phytic (phytat) + nước —* Inositol + 6 PO43'

573

H ìn h 2 3 .3 8 : V ò n g tu ầ n h o à n p h o t p h o (th e o J .G .B la c k ) .

Một số vi khuẩn và nấm có thể sinh ra nucleaz và nucleotitaz, trước tiên thủy phân axit nucleic thảnh núcleotit, rồi từ nucleotit giải phóng ra axit photphoric, như vi khuẩn B a c illu s m e g a te r iu m

var. p h o t p h a t ỉ u m ,

P s e u d o m o n a s ...

A xit nucleic. + Ĩ1H 2 O —►n N ucleotit —►N ucleosid —►P O 4 3'

Có một số vi khuẩn và nấm có thể sinh ra photphatidaz (photpholipaz), thủy phân photphatíd (photpholipite) thành axit béo, glycerin và axit photphoric, chẳng hạn như vi khuẩn

B a c illu s

cereus,

B a c illu s

m y c o id e s ,

B a c illu s

a s te r o s o p u s ...ĩìề

phân giải lecitin

(lecithine) vi sinh vật sinh ra enzym lecitinaz (lecithinaz):

Lecitin + 3 H2O -* 2 axit béo + glycerin + colin (cholin) + PƠ43’ Trong quá trinh vi sinh vật phân giải p hữu cơ, một phần p dùng cho trao đổi chất của bản thân, phần còn lại được giải phỏng ra dưới dạng axit photphoric. K hi tỷ lệ

p hữu cơ < 200 sẽ. cỏ axit photphoric giải phóng ra, khi tỷ lệ sẽ bị vi sinh vật đồng hóa; khi tỷ lệ

c/p từ 200 -

c/p của

300 thỉ toàn bộ p

c/p > 300 thi axit photphorìc không nhừng bị tiêu dùng

hết, còn phải hấp th u thêm từ m ôi trưởng. N ếu việc bón phân hữu cơ có trị số c / p cao sẽ

dẫn đến việc cạnh ứanh giữa thực vật và vi sinh vật về nguồn thức ăn photpho.

574

Tính hòa tan ừong nước của

H 2PO 4"

H P O 4 2'

PƠ 4 3' giảm đần theo thứ tự. p trong

nhiều sinh cảnh tồn tại dưới dạng muối Ca, Fe, Li, AI không tan, do đó hạn chế việc hấp thu của thực vật và vi sinh vật. Tác dụng hữu hiệu hóa p chỉ nhờ thông qua tác đụng của các vi sinh vật hòa tan m uối photphat không tan. Có thể có

4

phương thức hòa tan sau đây:

- Sản sinh axit hữu cơ, thúc đẩy sự hòa tan p. Chẳng hạn như axit fulvoic và photphat sắt có thể hình thành nên phức chất ổn định, lảm giải phóng ra các photphat không tan. - Sàn sinh axỉt vô cơ, thúc đẩy p hòa tan. Vi sinh vật tự dưỡng có thể thông qua quá trinh nitrat hóa sinh ra axit nitric, thông qua quá ừình sulfat h óa sinh ra axit sulfuaic, làm thúc đẩy sự hữu hiệu hóa của p trong đất. - Vi sinh vật khi phân giải chất hữu cơ sẽ sinh ra nhiều CO 2 tan trong nước, làm hình thành ra HCO 3 ' và H 2 C 0

3

chúng làm xúc tiến sự phân hủy các khoáng thạch chứa p, xúc

tiến sự hòa tan của các photphat Ca, photphat Fe. - Trong điều kiện kỵ, vi sính vật có thể khử Fe3+ thành Fe2+, thúc đẩy việc giải phóng axit photphoric. Do vi sinh vật có khả năng đồng hóa p rất cao, cho nên phần lớn p hữu cơ trong đất nằm trong tế bào các vi sinh vật đất. Trong nước , khi có đủ p cũng sẽ dẫn đến sự sinh trưởng

quá m ức

của tảo.

M ặc dù photphat thường không bị khử bởi vi sinh vật, nhưng trong điều kiện kỵ khí, nếu thiếu sulphat, nitrat thì photphat vẫn có thể bị khử để làm chất nhận electron. PH 3 dễ bay hơi, không ồn định trong không khí, tuổi thọ trung bỉnh chi có 1 ngày, gặp oxy sẽ tự bổc cháy tạo ra ngọn lửa màu xanh lam. Ở gần các nghĩa địa và đầm lầy, có nhiều chất hữu cơ bị phân giải, có khi sinh ra khí PH3( gặp oxy sẽ tự bốc cháy, sau đó lại đốt cháy cả khí m etan, dân ta thường gọi là hiện tượng “m a chơi” . H 3 P 0 4-> h 3 p o 3 - > h 3 p o 2 - > p h 3 Ngoài PH 3 ra p không tồn tại dưới dạng thể khí nào khác, cho nên tuần hoàn p thuộc dạng tuần hoàn trầm tích điển hình

(h ìn h 2 3 .3 5 ).

p chủ yếu tồn tại dưới 2 dạng: dạng nham

thạch và dạng m uối hòa tan. Thực vật và vi sinh vật chỉ có thể sử dụng p vô cơ hòa tan, chuyển hóạ chúng thành p hữu cơ và cung cấp cho động vật. Sau khi động thực vật chết, xác của chúng sẽ bị vi sinh vật phân giải, p quay trở lại đất. Photphat hòa tan trong đất bị nước m ưa rửa ừ ô i xuống sông, biển, được tảo và các loài thực vật thủy sinh hấp thu, hòa nhập vào chuỗi thức ăn. Khi thực vật thủy sinh chết đĩ, xác bị phân hủy, m ột lần nữa p hữu cơ lại chuyển hóa thành p vô cơ, m ột phần tiếp tục tham gia vòng tuần hoàn, phần còn lại trầm tích xuống đáy hình thành các mỏ photphat. Photphat bị phong hóa và bị loài người khai thác tại các nhà m áy sản xuất phân lân.

575

Do tuần hoàn p là vòng tuần hoàn không hoàn toàn, trầm tích nhiều xuống đáy biển, trừ những biến đổi địa chất nâng đáy biển thành đất liền, còn thì ít có cơ hội được giải phóng. Do ảnh hưởng của hoạt động không hợp lý của con người, như bón phân p quá m ức, thải ra nhiều nước bẩn chứa p, sẽ làm phá vỡ sự cân bàng giữa p tuần hoàn và p trầm tích, làm cho lượng p tham gia vào vòng tuần hoàn ngày m ột ít đi, vả trở thành m ột nhân tố hạn chế hoạt động sống trên Trái đất. 23.4.5.7. Các vòng tuần hoàn khác và m ối quan hệ với nhau

Vi sinh vật có thể dùng các loại kim loại khác làm chất nhận electron. Các kim loại như europium (Eu), tellurium (Te),selenium (Se) và rhodium (R h) đều có thể bị khử. Nhóm ví sinh vật chủ chốt có thể khử các kim loại này là các vi sinh vật tự dưỡng quang năng hữu cơ

(photoorganotroph),

R h o d o p seu d o m o n a s.

chẳng

hạn

như

R h o d o b a c te r ,

R h o d o s p ir iỉlu m

Đối với selenium đù có tác dụng m ạnh là các vi khuẩn

s tu tz e r i, T h a u e r a s e ỉe n a tis

và

W o ỉìn e ỉla s u c c in o g e n s .

và

P seudom onas

Các quá trình khử này sẽ làm giảm

bớt độc tính của kim loại Sự chuyển hóa photpho nhờ vi sinh vật trước hết là từ các dạng đơn giản chuyển thành các dạng phức tạp (hóa trị +5), bao gồm polyphotphat tìm thấy trong các hạt dị nhiễm sắc (m etachrom atic granules), M ột loại sản phẩm đặc biệt (có thể do vi sinh vật sinh ra) là photphin (P H 3) với hóa trị -3. Chất này được giải phóng ra từ đầm lầy, đất, hải dương và có thể cháy ừ o n g không k h í , có thể kèm theo sự cháy của metan. c ầ n nhấn mạnh là, chúng ta đã giới thiệu riêng rẽ chức năng tuần hoàn của s , p, Fe, M n nhưng ừong quá trinh trao đổi chất của đa sổ vi sinh vật thì chúng Hên hệ với nhau thông qua việc sử dụng chung các chất oxy hóa (oxydants) v à các chất khử (reductants). Chẳng hạn, m ột số vi sinh vật khử sulfat có thể dùng H 2 hoặc chất hữu cơ để khử Fe3+ và cũng cỏ thể oxy hóa s nguyên tố khi có m ặt M n (IV ) làm chất nhận elecừon. Trong điều kiện kỵ khí, vi khuẩn Đ e s u ỉ/o b u lb u s p r o p ỉo n ic u s

chuyển M n (IV) thành sulfat tạo thành sự liên kết s và Mn

trong sự tuần hoàn kỵ khí. Gần đây B .Schinck và M. Friedrich đã m iêu tả m ột cặp năng lượng độc đáo. Họ đã phân lập được m ột loại vi khuẩn tự dưỡng vô cơ (lithoautotrophic)từ các ừầm tích kỵ khí có thể liên kết sự oxyhỏa phosphit ( P 0 35') thành photphat (PO 4 3') với việc khử sulfat thành H 2 S. Schinck và Friedrich cho rằng vòng tuần hoàn năng lượng này có thể đã phát huy tác đụng trong thời kỳ đầu của Trái đất.

Bảng 23.8: N h ữ n g v ỉ dụ về tác dạng tương h ỗ vi sinh vật-kim lo ạ i và n h ũ n g ảnh hưởng tương quan với vi sinh vật và các động vật m áu nóng

Tác dụng tương bỗ (interaction) và chuyển hóa (transform ation) Nbóro lảm ỉoại

Kim loại

Vi sinh vật

Đ ộng vật m áu nóng

Kim loại quý hiếm

Ag Au Pt

Vi sình vật cỏ thể khử ion kim loại thành dạng nguyên tố.Kim loại dạng ion mức thấp đua vào môi trường sẽ có hoạt tính kháng vi sinh vật

Nhiều loại trong số các kim loại này cỏ thể khử thành dạng nguyên tố và không đi qua được rào chấn máu-não. Việc khử Ag có thể dẫn đến lắng đọng bất hoạt trên da

Kim loại có thể hình thành liên kết Cacbon-Kim loại ổn định

As

Vi sinh vật có thể chuyển dạng vô cơ vả hữu cơ thành dạng metyl hóa, một số trong đỏ ở mức cao dinh dưỡng h ư ớ n g tớ i sự tích lũy sính học (bioaccumulate)

Một số hình thức metyl hỏa cùa kim ỉoại có thể xuyên qua rào chắn tnáu-não, gây nên các hiệu ứng lên hệ thần kinh hoặc gây tử vong

Trong dạng ion nồng độ cao các kim loại này có thê trực tiếp ức chế vi sinh vật.Chúng thường được s ử dụng làm nguyên tố vi lượng ở nồng độ rất thấp

Kim loại ở tnức độ caobị thanh lọc khỏi cơ thế các động vật bậc cao nhờ phàn ứng với protein huyết tương và các ca chế khác.Nhiều kim loại nà^ cũng được dùng làm nguyên to vi lượng ở nồng độ rất thấp.

Các kim loại khác

Hg Se

Cu Zn Co

23.4.5.8. V i sinh vệt và độc tính cũa kim loại

Ngoài các kim loại như Fe, M n ...đổi với vi sinh vật cơ bản là vô hại, còn hàng loạt các kim loại là có nhiều tác dụng độc hại khác nhau đối vởi vi sinh vật và các động vật máu nóng. Vi sinh vật có vai trò quan trọng trong việc làm biến đổi sự độc hại của các kim loại này. K im loại là m ột nhóm khá rộng, trong đó các

k im ỉo ạ i n ặ n g

không đi qua được rào

cản máu-não của các động vật m áu nóng nhưng lại có ảnh hưởng rất rõ rệt lên vi sinh vật. Vi sinh vật cũng cỏ thể khử dạng ion của kim loại thành dạng nguyên tổ. N hóm th ứ hai là cảc kim loại hay á kim (metalloids) m à vi sinh vật có thể m etyl hóa để chuyển thành các sản phẩm dễ di động hom - kim loại hữu cơ (organometals). M ột sổ kim loại hừu cơ có thể xuyên qua rào cản máu-não vi vậy ảnh hưởng đến trung khu thần kinh của các động bật m áu nóng. K im loại hữu cơ chứa những dây nối cacbon - kim loại, đó là đặc trưng dễ nhặn biết của chúng

577

Hình 23.39; Vòng tuần hoàn thủy ngân (Hg) (theo.L.M.Prescott và cộng sự). V òng tu ần hoàn thủy ngân (Hg) có ý nghĩa đặc biệt quan trọng. N ó có nhiều đặc trưng vể các kim loại được m etyl hóa. N hiều thế kỷ qua các hợp chất thủy ngân đã được ứng dụng rộng rãi ữ o n g công nghiệp, v ấ n đề này đã được Lew is C arroll đề cập đến trong cuốn A lice in th e W onderland. Lúc đó H g được dùng để định hình mũ, vi sinh vật đã làm m etyl hóa m ộ t số thủy ngân v à sinh ra độc hại hơn cho người sản xuất mũ. M ột lượng lớn H g được dùng trong công nghiệp đào thải xuống biển làm cho vịnh M inam ata ở tây-nam N hật B ản đã bị trúng độc ữ ên diện rộng. H g vô cơ lắng đọng trong bùn ở đáy vịnh bị vi khuẩn

D e s u ỉ/o v ỉb r io

metyl hóa. D ạng H g bị m etyl hóa có khả năng

bay hơi và tan trong lipit và làm cho nồng độ H g không ngừng tăng lên Ưong chuỗi thức ăn (thông qua quá trình

m ở r ộ n g s in h h ọ c -

biomagnification). N gười ăn phải nguồn thực phẩm

sơ cấp (cả) sẽ bị rối loạn nghiêm trọng hệ thống thần kinh,Trong rất nhiều hồ nước ngọt ở Canada và m iền trung- bắc H oa K ỳ cũng xảy ra những tình trạng tương tự, ở đó rất nhiều xưởng bột giấy đ ã dùng các hợp chất H g để khống chế sự sinh trư ớng của vi sinh vật. Thậm chí hàng chục năm sau cá trong các hồ ở vùng h ạ lưu các xưởng b ộ t giấy này cũng không có thể dùng để ăn. N hỏm kim loại thứ ba tồn tại dưới dạng íon gây độc hại trực tiếp cho vi sinh vật v à các kim loại này có thể ảnh hưởng đến cả các sinh vật bậc cao.. Tuy nhiên, nếu không tiếp xúc trong thòi gian quá dài hoặc tiếp nhận quá nhiều thì protein huyết tương cỏ thể tác dụng vởì các ion này và giúp bài xuất khỏi cơ thể. Chỉ trong trưởng hợp vói liều lượng tương đối cao thì kim loại này m ới có thể gây chết người. V ới nồng độ thấp nhiều loại kim loại này được sử dụng như các nguyên tố v i luợng. Sự m ẫn cảm khác nhau của các sinh vật bậc cao và vi sinh vật đối với kim loại đ ã là cơ sở để tạo nên các

578

phương pháp phòng thổi (antiseptic) từ cách đây trên 150 năm. Tuy vi sinh vật dễ phát sinh sức đê kháng với các kim loại nặng nhưng trong m ột số ứng dụng y học người ta nhận thấy dùng có lợi hcm so với dùng chất kháng sinh, ví dụ như dùng hợp chất của bạc chống vi sinh vật đê chữa trị các vết thương, hay dùng trong các ống dò (catheters). 23.5. TÁ C DỤNG T Ư Ơ N G H Õ CỦA V I SIN H V Ậ T V Ở I C Á C C H Á T GÂ Y Ô N H IẺ M M Ô I T R Ư Ờ N G

23.5.1. Hiệu ứng sinh thái học của các chất gây ô nhiễm Có thể lấy tình hình ở Trung Quốc để làm ví dụ. Theo uớc tính của các chuyên gia, những tổn thất hàng năm của Trung Quốc do ô nhiễm môi trường gây ra đạt tới 283 tỷ nhân dân tệ (NDT). Chỉ tính riêng ô nhiễm nước cũng đã gây ra tổn thất tới 50 tỷ NDT. Theo “N hật báo Phương Đông” (Hong Kong) thì từ thập niên 60 của thể kỷ trước đến nay, trong 432 con sông lớn nhỏ có đặt hệ thống giám sát môi trường của Trung Quốc thì có tới 80% đã bị ô nhiễm ở các mức độ khác nhau, trong đó những đọan sông lớn chảy qua các đô thị chiểm 20%, các sông nhánh bị ô nhiễm chiếm 60%. Trong 2800 hồ ở TQ, nơi nào nhận nuớc thài đô thị, đa số đều xuất hiện hiệii tượng vượt m ức dinh dưỡng. Do khai thác quá mức nước ngầm, khu vực Bắc Kinh - Thiên Tân xuất hiện lún sụt tới 1,5-2,0 m trên diện tích lớn. Nước ngầm ở độ sâu 38 m ừong vùng địa hình dung nham thuộc Quế Lâm, kim loại nặng đã vượt chi tiêu tới 10-20 lần. Tổn thất do ô nhiễm khí quyển tạo ra ước tới khoảng 20 tỷ NDT. Do đốt than, do khí thải công nghiệp và do khí thải xe hơi từ các đô thị mà các khí SƠ 2 , c o . .. trong không khí và các hạt nhỏ huyền phù độc hại đẩ bao phủ kín bầu trời các đô thị. Ô nhiễm không khí đã gây ra tỷ lệ chết do ung thư phổi ở nhiều thành phố đã tăng đến 0,02% , vùng bao phủ m ưa axit trong toàn quốc đã tăng lên đến 30%. Tất cả những tổn thất đó cộng lại đạt tới 20 tỷ NDT. N hững tổn thất đo phá hoại m ôi trường sinh thái tự nhiên ước tính đạt tới 200 tỷ NDT. Tỷ lệ che phủ rừng năm 1949 là vào khoảng 30%, nhưng tới năm 2004 chỉ còn không tới 10% Thảo nguyên cũng bị thoái hóa nghiêm ừọng, diện tích bị sói m òn tăng lên tói 155

X

104 km2, chiếm 16% diện tích cả nước. Từ thế

kỷ 19 đến nay, m ức độ công nghiệp hóa ngày càng tăng, làm cho hàm lượng chất ô nhiễm hữu cơ công nghiệp trong mồi trường đẵ tăng lên vượt bậc. Con người đã thải ra một khối lượng lớn các chất thải công nghiệp hóa học, thuốc in nhuộm , cũng như chất thải của các sản phẩm công nghiệp đưa vào môi trường, như thuốc trừ sâu, dung môi, chất dẻo, dược phẩm. Do những chất thải đó có thành phần phức tạp, độc hại với người và các sinh vật khác, lượng chất thải lại lớn và trên diện tích rộng cho nên là loại chất ô nhiễm hữu cơ có tác hại nghiêm ừọng nhất đối với môi trường.

579

2 3 .5 .1 .1 . H i ệ u ứ n g s ì n h t h á i c ủ a c á c c h ẩ t ô n h i ễ m h ữ u c ơ n h ă n tạ o

Hợp chất hữu cơ tổng hợp bao gồm các chất hữu cơ đễ bay hơi (V O Cs), các chất hữu cơ không bay hơi (NVOCs), các sản phẩm phụ tiêu độc(DBPs), các hydrocacbon thơm đa vòng (PAH S) . .. Chất hữu cơ tổng hợp bao gồm tới trên 60.000 loại khác nhau. Chất hữu cơ tổng hợp nhân tạo, đa số là độc hại, trong đó VOCs là nguy hiển nhất, vì khi tiếp xúc với nước chứa V O C s , các chất nảy có thể thấm qua da, càng độc hại hơn khi người tắm ở những nơi có các chất này. Ở H oa Kỳ các chất hữu cơ tổng hợp bị liệt kê vào danh sách các chất gây ô nhiễm cao nhất bị hạn chế sử đụng gồm những chất gây ung thư chủ yếu sau đây: -

T r ih a ỉo m e ta n

(THM ), sinh ra bcá phản ứng giữa chất hữu cơ và Clo dư thừa trong

nước, yêu cầu hàm lượng không được vượt qua 0,1 mg/L. -

T e tr a c h lo r o c a c b o n ,

tồn tại trong các chất tẩy rửa dầu công nghiệp, trong các dung

môi làm lạnh, trong ngành hun sấy, yêu cầu hàm lượng không được vượt quá 0,005 rag/L. -

B enzen,

có m ặt trong chất tẩy rửa, dung m ôi hữu cơ, yêu càu hàm lượng không

được vượt quá 0,05 mg/L. -

T r ic ỉo r o e ta n ,

tồn tại trong các chất tẩy rửa dầu, dung m ôi hữu cơ, thuốc trừ sâu, yêu

cầu hàm lượng không được vượt quá 0,002mg/L. quá

C ỉo r o e ta n ,

0 ,0 0 2

-

dùng trong việc chê tạo cao su nhân tạo, yêu cầu hàm lượng không vượt

mg/L.

D ib r o m o e ta n

(EDB), dùng làm chất phụ gia xăng dầu, thuốc trừ sâu, yêu cầu hàm

lượng không được vượt quá 0,005 mg/L. -

D ib r o m o c ỉo r o p r o p a n

(DBCP), dùng trong nông nghiệp, gây vô sinh và ung thư,

yêu cầu hàm lượng không được vượt quá

0 ,0 0 2

mg/L.

23.5.1.2. H iệ u ử ng sinh th á i của thuốc B V T V đ ổ i với m ô i trư ờ ng

Thuốc bảo vệ thực vật (B V TV ) hay còn gọi là nông được rất cần cho sự phát triển nông nghiệp hiện đại. Thuốc B V TV thông qua nhiều con đường đi vào đất, làm ô nhiễm môi trường đất ngày càng nghiêm trọng. Tuy nhiên, do tác dụng tự làm sạch của đất (như bay hơi, khuếch tán, pha loãng, hấp phụ, phân giải) m à có thể giảm bớt m ức độ ô nhiễm. Nhưng nểu thuốc B V TV đi vào đẩt với số lượng v à tốc độ vượt quá khả năng tự làm sạch cùa đất, tức vượt quá dung lượng m ôi trường của đất thổ nhưỡng, thỉ sẽ d ẫn đển việc đất bị ô nhiễm thuốc. Thuốc B V TV hằng năm ở Trung Q uốc đùng tới 500 nghìn tấn, thuốc trừ sâu chiếm 70% , trong đó thuốc trìr sâu là lân hữu cơ có độc tính cao chiếm tới trên 70% trong số các loại thuốc trừ sâu. Sự ô nhiễm thuốc B V TV của đất không những làm thay đổi chức năng và kết cấu bình thường của đất, m à còn làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và

phát triển của thực vật, từ đỏ qua chuỗi thức ãn mà ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người. Trong nông nghiệp sử đụng nhiều thuốc trừ sâu và thuốc trừ bệnh không những làm ô nhiễm nông phẩm m à còn làm ô nhiễm nghiêm trọng m ôi trường. Ví dụ chim ăn những nông phẩm bị ô nhiễm thì tỷ lệ đẻ trứng sẽ giảm, vỏ trứng mỏng đi, nếu nghiêm trọng có thể dẫn đến tuyệt chủng. Nhiều loại thuốc trừ sâu, trừ bệnh không những gây ra hiệu ứng cấp tính gây chết người, còn sinh ra những tai biển lâu dài như gây ung thư, gây dị dạng, gây đột biến gen... 23.5.1.3. H iệ u ứng sinh th á i của dầu mỏ đối vởi m ô i truớ ng

Các chất dầu mỏ khi xâm nhập vào môi trường, do những cơ chế sinh học và phi sinh học (chủ yếu là oxy hóa quang hóa học), dần dần được phân hủy. N hiều nghiên cứu chứng tỏ, trong các yếu tố làm sạch ô nhiễm dầu mỏ trong thiên nhiên, thì vi sinh vật cùng đóng vai ừ ò quan trọng. Vùng tưới tiêu Thẩm Dương-Phủ Thuận ờ Trung Quốc có trên 13.333 ha ruộng lúa, suốt 40 năm qua chủ yếu tưới bằng nước thải của xưởng lọc dầu chứa dầu mỏ, nhưng vẫn chưa phát hiện thấy có lượng dầu tích lũy và những tác hại cụ thề. N guyên nhân chủ yếu do tác dụng phân giải của hệ sinh thái vi sinh vật trong vùng tưới tiêu đã bị ô nhiễm dầu mỏ. M ặt biển bị ô nhiễm dầu mỏ (nhu tai nạn võ tàu chứa dầu, rò ri d ầ u . ..) cũng gây ô nhiễm dầu mỏ. Ổ nhiễm dầu mỏ đều gây nguy hại cho môi trường, và cần tiến hành các biện pháp phân giải sinh học. Dầu m ỏ là m ột hỗn hợp phức tạp gồm khỏang 200-300 loại hợp chất, gồm các hydrocacbon mạch thẳng, mạch vòng, mạch thơm và những hợp chất phi hydrocacbon. Tính chất phân hủy sinh học của dầu mỏ tùy thuộc vào chùng loại và kích cỡ phân tử hydrocacbon của chúng. Chuỗi n-alkane có độ dài trung bình (C | 0~C

24)

dề bị phân hủy

nhất, hydrocacbon m ạch ngắn đối với nhiều vi sinh vật là độc hại, nhưng lại đễ bay hơi. Hydrocacbon m ạch càng dài, tính đề kháng sinh học càng tăng,

về loại hỉnh hydrocacbon,

mạch thẳng dễ phân hủy hơn mạch vòng; hyđrocacbon không no dễ phân hủy hơn hydrocacbon no; m ạch thẳng dễ hơn mạch phân nhánh; phân nhánh càng nhiều.vi sinh vật càng khỏ phân hủy, cuổi chuỗi có nguyên tử cacbon bậc 4 thi lại càng khỏ khăn hơn; hydrocacbon thơm m ạch vòng rất khó hoặc không thể phân hủy được. 23.5.1.4. H iệ u ứng sinh th á i của các chất ô nhiễm hữ u cơ tro n g nước

N ước thải sinh hoạt thành thị và nưởc thải của các nhà m áy dùng chất hữu cơ làm nguyên liệu thường chứa rất nhiều chất hữu cơ cao phân tử là thành phần của sinh vật cũng như các sản phẩm trao đổi chất trung gian, đỏ là hydratcacbon, protein, lipit, axit amin, axit béo v .v .. .N hững chất này tuy không độc nhưng dễ được vi sinh vật phân hủy hơn, cũng do

đỏ tiêu hao nhiều oxy hòa tan trong nưởc gây nguy hại tới môi trường.

581

Ô nhiễm phenol trong nước chủ yếu là từ các nguồn nước thải chứa phenol, chẳng hạn từ xưởng luyện than cốc, xưởng khí than, xưởng lọc dầu, xường chưng cất gồ, xưởng nhựa tổng hợp, xưởng tổng hợp xenluloz, xưởng sản xuất các loại như thuốc nhuộm, dược phẩm, hương liệu, thuốc BVTV, sợi thủy tinh, sơn, chất diệt khuẩn, thuốc thử hóa học... Phenol là chất ô nhiễm gây độc nhưng độc tính tưong đối thấp. Hợp chat phenol gây độc cho cá, nếu trong thịt cá có mùi kerozn là hậu quả của việc nhiễm độc phenol. ô nhiễm dầu m ỏ nguy hại đến chất lượng nước cũng như sinh vật thủy sinh. Dầu nổi trên m ặt nước có thể lan tỏa nhanh chóng, hình thành váng dầu, làm ngăn cản mặt nước tiếp xúc với không khí, ỉàm giảm oxy hòa tan. Dầu m ỏ chứa chất gây ung th ư hydrocacbon thơm đa vòng (polycyclic aromatic hydrocacbon), tích tụ qua cơ thể sinh vật thủy sinh rồi ảnh hưởng tới sức khỏe con người. 2 3 .5 ,1 .5 , H i ệ u ứ n g s i n h t h á i c ủ a c á c c h ấ t ô n h i ễ m t h ể r ắ n

Các chất ô nhiễm thể rắn tùy nhu cầu khác nhau, trường hợp khác nhau, ở những nước khác nhau, m à m ang những ý nghĩa khác nhau. N ói chung đó là các rác thải rắn hay thể bùn sàn sinh tò những hoạt động sản xuất, lưu thông và tiêu thụ trong xã hội, không còn có giá trị sử dụng và bị loại thải. Chất thải rắn có thể là rác thải thành thị, rác thải công nghiệp và rác thải nông nghiệp, N hững chất này vừa là rác thải, nhưng cũng có thể là nguồn tài nguyên có thể khai thác. Chất thải rắn có những đặc tính sau đây: - Tính vô chủ: sau khi bị loại thải, không còn thuộc về ai, đặc biệt là đối với rác thải thành thị. - Tính phàn tán: sau khi bị vứt bỏ sẽ nằm rải rắc nhiều ncâ, cần phải thu gom lại. - Tính nguy hại: gây bất lợi cho sản xuất và cho sinh hoạt v à gây nguy hại đến sức

khỏe con người. - Tính hai m ặt, rác thải độc hại có thể x ử lý để trở thành những nguồn tài nguyên quý giá. Chất thài nguy hại đến m ôi trường liên quan đến tính chất và sổ lượng. N ấu ở mức nhât định sẽ không gây nguy hại tới m ôi trường, ở nông thôn trên khắp thế giới người ta tiến hành ủ phân các chất thải hữu cơ, không gây ra bất cứ vấn đề m ôi trường nào. Khi chất thài rắn tích tụ đến m ức độ nhất định sẽ sinh ra ô nhiễm m ôi trường. N goài yếu tố số lượng, tính chất của chất thải rắn cũng quyết định m ức độ nguy hại của chúng. Rác xây đựng là chất thải không độc hại, dù lượng có lớn, cũng khồng gây ô nhiễm và nguy hại đến m ôi tnrờng. Pin, đèn ống h ỏ n g ... đù lượng không lớn, nếu vứ t tùy tiện, sẽ gây ô nhiễm nghiêm trọng và nguy hại đến m ôi trường. D o đó, khi x ử lý chất thải rắn, phải nắm vững về sô lượng và m ức độ cần xử lý. N hấn mạnh quá m ức độc tính và số lượng chất thải rắn sỗ

làm tăng giá thành xử lý và ảnh hưởng đến khả năng khống chế ô nhiễm môi trường. Trên thực tế mức độ khống chế ô nhiễm rác thải rắn liên quan mật thiết đến trình độ phát triển kinh tế của đất nước cững như mức sống của dân chúng. N hiều chất thải rắn là những chất thải cỏ hại, nếu xử lý không thỏa đáng, những hóa chẩt độc hại và vi sinh vật gây bệnh trong đó có thể thông qua vòng tuần hoàn vật chất và nước ngầm m à đi vào hệ sinh thái nhân loại,làm gây hại đến cơ thể người, đồng thời phá hoại môi trường sinh thái, dẫn đến những sự thay đổi sinh thái khó có thể đảo ngược. Một số chất gây ô nhiễm có thể bay vào khí quyển, một số khác nhiều hơn xâm nhập qua tiếp xúc, ăn uống , qua nguồn nước bị ô nhiễm m à đi vào cơ thể người.

23.5.2. Tác dụng tương hỗ giữa vỉ sinh vật và chất gây ô nhiễm môi trường Trong điều kiện thiên nhiên, sự phân hủy chất ô nhiễm cùa vi sinh vật có 2 phương thức: một là trực tiếp sử dụng chất đó làm cơ chất sinh trưởng, khi phân hủy chất đó sẽ thu được năng lượng và các nguyên liệu tự thay thế để duy trì sự sổng. Đổi với quá trình trao đổi chất của vi sinh vật chì nhằm mục đích thu được năng lượng và ảnh hưởng của môi trường đối với con đường, sản phẩm cuối cùng, tốc độ của quá trinh đỏ, hiện đã có nhiều hiểu biết sâu sắc. Đ ã có những ứng dụng rộng rãi trong việc xử lý sinh học các chất gây ô nhiễm. Trong thiên nhiên các chất gây ô nhiễm chịu các tác dụng vật lý, quang hóa, hóa học, sinh học để phân hủy và chuyển hóa, Có những chất chuyển hóa nhanh, có những chất chuyển hóa rất chậm. Có những hạt thóc vẫn còn tồn tại trong các K im tự tháp Ai Cập tới mấy nghìn năm. Đó là do điều kiện môi trường tổi tăm, khô ráo, không thích hợp để cho vi sinh vật phát triển, do đó tốc độ phân hủy cực chậm. Nhiều nghiên cứu chứng tỏ, trong nước và đất, tác dụng sinh học là cơ chế phân hủy chính, m à vỉ sinh vật lại đỏng vai trò hàng đầu ứ o n g phân hủy sinh học. Nếu dùng đúng cách để loại bỏ, khống chế hoặc giảm thiểu hoạt tính của vi sinh vật thì tốc độ phân hủy, chuyển hóa vật chất sẽ chậm đi rất nhiều. N gược lại, nếu tạo môi trường thích hợp cho vi sinh vật phát triển sẽ xúc tiến nhanh chóng quá trình phân hủy và chuyển hóa các chất gây ô nhiễm. 23.5.2.1. Tiềm lực to lớn phẫn hủy các chất gây ô nhiễm của v i sinh vật bắt nguồn từ đ ặ c đ iể m c ủ a c h ú n g - V i s i n h v ậ t c ó t h ể (íc h n h ỏ , b ề m ộ t lở n , tố c đ ộ tr a o đ ổ i c h ấ t n h a n h :

Lấy vi khuẩn làm ví dụ, nếu xểp được 3000 trực khuẩn nối tiếp nhau m ới có được chiều đài của 1 hạt gạo.Phải có 2 nghln tỷ vi khuẩn mới có bình quân lg.V ới thể tích vật thể càng nhỏ, diện tích bề mặt của tất cả các đơn vị càng lớn. Rõ ràng, diện tích bề mặt của quần thể vi sinh vật lớn hơn rất nhiều so với bất kỳ loài sinh vật khác.

583

-

V i s i n h v ậ t c ó c h ủ n g l o ợ i n h iề u , p h ầ n b ổ r ộ n g k h ắ p , lo ạ i h ì n h t r a o đ ổ i c h ấ t ỉạ i rẩ t

đa dạng:

N hờ có các loại hình trao đổi chất cực kỳ đa dạng, làm cho hầu hết các chất hữu cơ trong thiên nhiên đều bị vi sinh vật phân hủy. Cho đến nay chúng ta đã biết có đến vài trăm ngàn chất gây ô nhiễm m ôi trường, trong đó đa số là các chất hữu cơ. Tất cả các chất gây ô nhiễm hữu cơ, có thể chia thành 3 loại: loại có thể phân hủy sinh học, loại khó phân hùy sinh học và loại không có thể phân hủy sinh học. Có thể nói, hầu hết các chất hữu cơ tồn tại trong thiên nhiên đều có thể bị vi sinh vật phân hủy. Có những loài vi khuẩn như P se u d o m o n a s c e p a c ia

có thể phân hủy trên 90 loại chất hữu cơ khác nhau, chúng có thể sử

dụng bất kỳ m ột trong những chất đó làm nguồn cacbon và năng lượng duy nhất để tiến hành trao đổi chất. M ột ví dụ khác, metyl thủy ngân rất độc với sinh vật, nhưng chủng vi khuẩn

các

P seu d o m o n a s

K62 lại có thể phân hủy và chuyển hóa thành Hg nguyên tổ.

- Nhờ có năng lực biến dị mạnh, nên nhiều Ví' sinh vật cổ khả năng phân hủy được c h ấ t hữu c ơ c a o p h â n t ử t ổ n g h ợ p nhân t ạ o . Hơn nửa thế kỳ nay, chất hữu cơ tổng hợp nhân tạo ồ ạt ra đời, đó là các thuốc trừ

sâu, thuổc trừ cỏ, chẩt tẩy rửa, chất tạo dẻo.. .M ột trong những m ục đích ban đầu khi sáng chế ra những chất đó là đòi hỏi phải có tính ổn định cao. Bởi vậy khi vi sinh vật tiếp xúc vói những chất đó, lúc đầu không phân hủy được là dễ hiểu. Do vi sinh vật có các loại hình trao đổi chất cực kỳ đa dạng và có năng lực biến dị m ạnh, cho nên đã phát hiện thấy những vi sinh vật có thể phân hủy được nhiều loại chất hữu cơ tổng hợp nhân tạo, thậm chí cả những chất mà trước đây cho là không thể phân hủy được.Từ các chủng biến đị có thể chọn ra được những chủng có khả năng phân hủy cao các chất gây ô nhiễm , và có thể sử dụng nguyên lý đỏ để thuần hóa định hướng, nhằm chọn ra những chủng vi sinh vật có hiệu suất phân hủy cao các chất gây ô nhiễm vốn khó hoặc không phân hùy được. -

V i s i n h v ậ t c ổ h ệ t h ố n g đ i ề u c h ỉ n h c á c e n z y m p h â n h ủ y v à n ă n g l ự c p h â n h ủ y g ọ i là

P ỉa s m id

Vi sinh vật tổng hợp ra các enzym m en phân hủy, các enzym này vừa m ang tính đặc hiệu, lại vừ a có tính chuyển đổi. Vi sinh vật có thể linh hoạt thay đổi con đường điều khiển và trao đổi chất cùa chúng, cùng m ột lúc cỏ thể sinh ra các loại enzym khác nhau để thích nghi với những m ôi trường khác nhau, giúp phân hùy và chuyển hóa các chất gây ô nhiễm trong m ôi trường. Plasm id là phân tử A D N dạng vòng trong tế bào vi khuẩn, là vật ehất di

truyền ngoài nhiễm sắc thể. Plasmid phân hủy ma hóa cho cổc gen cỏ thể giúp vi khuẩn tạo ra các enzym chủ chổt trong quá trình phân hủy sinh học. Plasm id đề kháng giúp vi khuẩn đề kháng được với nhiều chất kháng sinh và hóa chất độc hại như thuổc trừ sâu, kim loại nặng. Sự hiện diện của plasm id không ảnh hưởng đến sự sinh trựởng, p h át triển của tế bào chủ, nhưng khi gặp độc chẩt, plasm id bằng sản phẩm enzym của m ình sỗ m ang lại nhiều ưu

thể lựa chọn cho tế bào chủ. Bằng công nghệ gen, có thể chuyển plasm id giữa các tế bào khac loài, những tế bào tiếp nhận plasmid sẽ đồng thời nhận được những tính trạng do plasmid đó mang lại. Nhiều nghiên cứu cho biết, sự phân hủy sinh học đối với nhiều hợp chất độc, nhất là các loại hydrocacbon thơm phức tạp, đều có sự tham gia của plasmid. Việc di chuyển plasmid có tính chất phân hủy khác nhau từ tế bào cho sang tể bào nhận, có thể tạo nên những vi khuẩn chứa nhiều plasmid, có thể tham gia xử lý đồng thời xử lý nhiều thành phần trong nước thải và chất thải rắn. 23.5.2.2. S ự trao đỗi chất chung của vi sinh vật giúp m ở rộng phạm v i tác dụng đ ố i với cá c c h ẩ t ô n h iễ m h ữ u c ơ k h ỏ p h â n h ủ y

Sự trao đổi chất chung là một hình thức tác dụng khác của vỉ sinh vật đối với chất hữu cơ. Trao đổi chất chung của vi sinh vật được nêu lên sớm nhất từ năm 1959 bời Leadbeter và Foster. Họ phát hiện hiện thấy vi khuẩn metan

( P s e u d o m o n a s m e ta n ỉc a )

có

thể oxy hóa etan (ethane, CH 3 CH 3 ) thành etanol, acetalđehid nhưng lại không sử dụng được etanol làm cơ chất để sinh trưởng. Hai ông đã gọi hiện tượng này là sự oxy hóa chung, với định nghĩa là khi tồn tại cơ chất sinh trưởng, vi sinh vật oxy hóa những chất không phải cơ chất sinh trưởng, có nghĩa là vi thuẩn metan đã sừ dụng những cơ chất sinh trưởng dễ phân hủy ngoài etan để làm nguồn c và nguồn năng lượng. Trong quá trình sinh trưởng chúng đã sinh ra những enzym không đặc hiệu, vừa có thề oxy hóa cơ chất sinh trường, vừa có thể oxy hóa etan. Etan không phải là cơ chất sinh trưởng, nhưng dưới tác dụng của oxydaz không đặc hiệu đã bị oxy hóa thành etanol và acetaldehid. Quá trinh oxy hóa chung của etan không tách rời được với những enzym chủ chốt không đặc hiệu do vi khuẩn m etan sinh ra, nhưng lại không thể cung cấp cho vi khuẩn metan năng lượng cần thiểt để duy trì sư sống và nguyên liệu cần thiết cho trao đổi chất, v ề sau Jensen đã mở rộng nội dung này và đề ra khái niệm

tr a o đ ổ i c h ấ t c h u n g .

Ông cho rằng, khi tồn tại những

cơ chất sinh trưởng, hoạt tính của vi sinh vật sẽ tăng cường, sự phân hủy của vi sinh vật đối với những chất không phải cơ chất sinh trưởng, không kể là oxy hóa hay khử, đều là tác dụng trao đổi chất chung. Trao đổi chất chung không những chi sự phát triển cùa tế bào khi có mặt cơ chất sinh trường, đổi với các chất không phải cơ chất sinh trường, m à còn bao gồm sự chuyển hóa của vi sinh vật ờ trạng thái hô hấp nội nguồn khi cơ chất sinh trường bị tiêu hao hểt đối với các chất không phải cơ chất sinh trưởng. Trao đổi chất chung của vi sinh vật có thể tồn tại trong những tình huống như sau: - N hờ phân hủy các chất hữu cơ khác m à thu được năng lượng v à nguồn c.

- Thông qua việc hợp tác với vi sinh vật khác mà tạo ra sự trao đổi chất chung, thực hiện việc phân hủy các chất gây ô nhiễm.

585

- N hờ sự tổng hợp cảm ứng do các chất làm sinh ra hệ enzym tương ứng, sinh ra tác dụng trao đổi chất chung. Sự tồn tại của ưao đổi chất chung đã tăng cường mạnh m ẽ khả năng phân hủy sinh học đối với các chất khỏ phân hủy. V í dụ, m ột số thuốc trừ sâu khó phân hủy, không giúp ích gì cho sự sinh trưởng của vi sinh vật, nhưng thông qua trao đổi chất chung của nhiều nhóm vi sinh vật m à có thể phân giải từng phần hoặc toàn bộ thuốc trừ sâu đó. Chẳng hạn sự trao đổi chất chung giữa các vi khuẩn

và

A e r o b a c te r a e r o g e n s

H ydroom eonas

sp. giúp

chuyển hóa D D T thành sản phẩm trung gian rồi bị phân hủy tiếp bởi các vi sinh vật khác. Điều đó cho thấy trong thiên nhiên quá trình ừao đổi chất chung có ý nghĩa cực kỳ quan trọng trong quá trình phân hủy các chất khó phân hủy. N hững vi sinh vật đã được phát hiện thấy có quá t ì n h trao đổi chất chung gồm có: sp.,

A c h r o m o b a c te r

A r th r o b a c te r

B a c illu s m e g a te r iu m , B a c illu s

sp.,

M ic r o c o c u s

N o c a r d ia

sp.,

P seu d o m o n a s

c e r ific a n s ,

sp,,

sp.,

B r e v ỉb a c te r iu m

M ic r o c o c c u s ,

P s e u d o m o n a s flu o r e s c e n s ,

sp.,

n ìg e r ,

A s p e r g illu s

sp.,

ch ro o cco cu m ,

sp.,

H yd ro o m eo n a s

F la v o b a c te r iu m

M ic r o b a c te r iu m P e n e c iỉìu m

T r ic h o d e r m a v ìr iđ e , V ib r io

A z o to b a c te r

sp.,

N o c a r d ia

m e ta n ìc a ,

sp., X a n t h o m

onas

e r y th r o p o lis ,

P seu d o m o n a s

p u d ita ,

sp,.

Sự trao đổi chất chung không những nêu lên m ột vấn đề mới về cơ chế oxy hóa sinh học mà còn được coi như m ột kỹ thuật sinh hóa được ứng dụng trong việc phân hủy sinh học các chất thải thuộc nhóm hợp chất thơm . Hanne, Jaakko, W oods, M ary ... đa sử dụng nguyên lý trao đổi chất chung tồn tại trong nồi phản ứng kỵ khí, thông qua việc thêm nhừng cơ chất sơ cấp để xử lý nước thải chứa clorophenol, giúp loại bỏ được chất độc khỏ . phân hủy này. 23.5.2.3. Tác dụng p h â n h ủy sinh hỏa học n h ờ vì sinh vật

Phân hủy sinh học là sự phân hủy chất gây ô nhiễm bàng sinh vật, m à trong đó vi sinh vật đóng vai ừ ò ỉớn nhất, cho nên còn có thể gọi là phân hủy vi sinh vật. Vi sinh vật thông qua hoạt động ừao đổi chất của m ình để thể hiện tác dụng phân hủy sinh hóa học trong m ôi trường qua các m ặt sau đây: a - Q u á tr ìn h o x y h ó a :

- Oxy hóa rượu: — C H 2 OH —►CH 3 CH 2 O H (etanoỉ) —►CH 3 COOH (axit axetic). Â r th o b a c te r

oxydans

thì tiến hành phản ứng CH 3 CH 2 O H CH 2 OH (propanediol) —»

CH 3 CHOH COO H (axit lactic) - Oxy hóa alđehit: như C H 3 CHO (acetalđehit) —> CH 3 C O O H (axit axetíc); tiến hành bởi

P s e u d o m o n a s a e r u g in o s a .

- Oxy hóa gốc m etyl: như C 6 H 5 CH 3 (toluen) —►C 6 H 5C O O H (axit benzoic); tiến hành bởi

586

P s e u d o m o n a s a e r u g in o s a .

- Oxy hóa amon: nhu am on (NH3‘) —>N itrit (NO 2 ); do

N itr o x o m o n a s

- Oxy hóa axit nitrit: N itrit ( N 0 2 ) -> N itrat (NO 3 "); do - Oxy hóa lưu huỳnh: Lưu huỳnh ( S) —►Sulfat (SO 4 "); do

tiến hành.

N ìtr o b a c te r

tiến hành.

T h ìo b a c iỉlu s th ìo o x ìta n s

tiến hành - Oxy hóa sắt: Fe 2 +—»Fe3+ ; đo

T h ìo b a c ỉỉìu s fe r r o o x ita n s

tiến hành.

b- Quá trình khử: - Khử gốc eten (ethene.etylen): —CH—CH— *—CH 2—CH 2—, nhu axit fumaric —►axit succinic, do

E s c h e r ic h ia c o ỉi

tiến hành.

- K hử rượu: =CH—OH— —> =C ỈÍ 2 như CH 3 CHOHCOOH (axit lactic) —> CH 3 CH 2 COOH -

(axit

propionic),

đo

C lo s tr id iu m

p r o p io n ỉc u m

tiến

hành.

K hử nitrat:N itrat (NOa)—>amon (NH 3 ); nhiều vi sinh vật đất có thể tiến hành phản

ứng này. - K hử sulfat: H 2 SO 4 —

; do vi khuẩn

D e s u ỉ/o v ib r io

tiến hành.

—CH 2—COOH —*■CH 3 , như quá trình

c - Q u ả tr ìn h k h ử c a r b o x y l (d e c a r b o x y la tio n ):

khử carboxyl trong axit succinic —» axit propionic.

d e s u lju a ic a n s

P r o p io n ìb a c te r iu m p e n to s a c e u m

có thể

tiến hành phản ứng decarboxyl đối với axit succinic. d - Q u á tr ìn h k h ử a m in (d e a m in a tio n ):

=CH—NH 2 —

*

=CH 2 +N H 3 , như khử alanin

dưới tác dụng của B a c i ỉ ỉ u s p u t r i f i c u s có thể khử amin để thành axit propionic. e - Q u á tr ìn h th ủ y p h â n :

nhu thủy phân các este, nhiều vi sinh vật đất tiến hành phản

ứng này. /-

Q u ả tr ìn h e s te h ỏ a :

axit carbocynic với alcool xẩy ra phản ứng este hỏa: R—COOH

+ R*—OH —►R—COOR" + H 2 o , như nấm men

H a n e n u ỉa a n o m a ỉa

có thể chuyển biến axit

lactic thành este ỉactat. g-

Q u ả tr ìn h m ẩ í n ư ớ c :

thành acrolein, vi khuẩn

—CH 2—CHOH—>—CH=CH—(-H2 Ồ, như chuyển từ glycerin

B a c iỉỉu s

h - P h ả n ứ n g tr ù n g h ợ p :

tién hành phản ứng này.

—CHO + CH 3 CHO—>CHOH—CO CH 3 như từ glycerine

thành acrolein (acryladehit), m ột số nấm men có thể trùng hợp aldehit thành 3-carbocyl metyletyl keton. ì- Q u ả

tr ìn h

am on

hỏa:

c = 0 -> = C H -N H 2, như phản ứng am on h óa của axit

pyruvic tạo thành alanin dưới tác dụng của một sổ nấm men. k-

Q u ả tr ìn h a c e ty ỉ h ó a (a c e ty iiz a tio n )-.

acetyl hóa.

N hư

C lo s tr id iu m k ỉu y v e r y

cỏ thể có tác dụng

Với các chất hữu cơ phức tạp quá trình phân hủy sinh học (biođegradation) có thế xảy ra bằng phương thức loại bỏ ion halogen (dehalogenation), thủy phân làm cắt mạch (fracm entation) và vô cơ hóa (mineralization)

'.(.'tì (c)

M in e r a liz a t io n

v

i

(a ) D e h a ỉo g e n a tio n .

23.5.2.4. N h ữ n g yếu tố m ô i trư ờ n g ảnh hưởng đến sự p h ân hủ y của v i sinh vật đ ố i với chất gẫy ô nhiễm a - H o ạ i tin h tr a o đ ổ i c h ấ t c ủ a v i s ìn h v ậ t

Bản thân hoạt tính ưao đổi chất của vi sinh vật là yểu tố chủ yếu nhất đối với việc phân hủy chất gây ô nhiễm . N hững vi sinh vật khác nhau sẽ có những phản ứng khác nhau đối với cùng m ột chất hữu cơ hoặc kim loại nặng. Trong pha logarit, vi sinh vật có tốc độ sinh trưởng nhanh nhất, trao đổi chất và có hoạt tính m ạnh nhất. Bản chất của từng loài vi sinh vật quyết định phương hướng và m ức độ phân hủy từng hợp chất. Trong vùng đất và nước có nhiều hydrocacbon, những vi sinh vật sử dụng được hydrocacbon sẽ chiếm ưu thế, đó là kết quà của sự tích lũy tự nhiên. b - T in h th íc h ứ n g c ủ a v i s in h v ậ t

Vi sinh vật có vật chất di truyền đơn giản, có kiểu trao đổi chất đ a dạng, cho nến có tính thích ứng và tính thuần hóa rất cao. Q ua quá trình thích ứng, vi sinh vật có thể dùng chất mới tổng hợp được để kích thích việc tổng hợp những enzym cần thiết cho sự phân

hủy. H oặc do vi sinh vật bị đột biến mà tạo ra hệ enzym mới. N ói chung, kết cấu quần lạc vi sinh vật không ngừng phát triển và thay đổi theo điều kiện của m ôi trường mới. c - K ế t c ấ u h ó a h ọ c v à k íc h th ư ớ c p h â n tử c ủ a c h ấ t g â y ô n h iễ m

Thông thường các hydrocacbon mạch thăng đễ bị phân hủy hơn so với các hydrocacbon m ạch vòng, hydrocacbon không no dễ bị phân hủy hơn so với các hydrocacbon no. Khi c trên m ạch chính bị các nguyên tố khác thay thế, vi sinh vật sẽ khó oxy hóa hơn, tức là nguyên tử khác trên mạch chính khỏ được vi sinh vật sử đụng hơn so với cacbon, trong đó ảnh hưởng của o là rõ ràng nhất, rồi đến s và N. Hợp chất m ả mỗi nguyên tử c trên m ạch ít nhất giữ được 1 liên kêt C-H thi ít cản trở hơn đối với sự oxy hóa sinh học. Khi các gốc H trên nguyên tử c đều bị thay thế bằng gốc alkyl hoặc gốc thơm, tức là nguyên tử c bậc 4, thì không dễ bị vi sinh vật phân hủy. Kích thước phân tử ảnh hưởng rất lớn đến khả năng phân hủy sinh học. Với các họp chất cao phân từ khả năng phân hủy sinh học bị giảm. Các chất tẩy rửa bắt đầu được sản xuất từ năm 1954, về sau ngày càng m ở rộng phạm vi ứng dụng, không những ừong sinh hoạt m à cà ừong nhiều ngành cồng nghiệp như công nghíêp xenluloz, dệt, giấy, thực phẩm , da, tẩy rửa kim loại... Sau thập niên 50 của thế kỷ 20, sản lượng chất tẩy rửa trên thế giới tăng mồi năm lên tới hàng chục triệu tấn, vậy m à không thấy chúng tăng lên rõ rệt trong đất cũng như trong cơ thể động thực vật. Điều đổ chứng tỏ chúng được chuyển hóa, loại trừ nhanh trong môi trường, chủ yếu nhờ tác đụng của vi sinh vật, và cũng do sử dụng các chất tẩy rửa có cấu trúc phù hợp cho sự phân hủy của vi sinh vật. d - C ả c y ế u tổ k h á c tr o n g m ô i tr ư ờ n g :

Đó là cổc yếu tố nhiệt độ, độ ẩm, pH, oxy, chất đinh dưỡng và sự cạnh ừ an h giữa các loài. Ảnh hưởng của nhiệt là rất rõ rệt đổi vói hoạt tính cùa từng loại enzym. Trong những môi trường có nồng độ oxy thấp (như ao hồ, đầm lầy, đất ngập n ư ớ c...) hoạt động của vi sính vật kỵ khí sẽ chiểm ư u thể. Phương thức hô hấp liên quan m ật thiết đến điện thể oxy hóa khử, khi điện thế oxy hóa khử càng thấp, thuốc trừ sâu

666

(hexachloro-cyclohexane)

và các dẫn xuất của nó phân hủy càng nhanh.

23.5.3. Sự chuyển hóa và phân hủy của vi sinh vật đối với các chất ô nhiễm hữu cơ 23.5.3.1, Sự chuyển hỏa và phân hủy của vi sinh vật đối với các chẩt ô nhiễm hữu cơ thiên nhiên a- Sự phân hủy của vi sinh vật đổi với chất hữu cơ cao phân từ nguồn gỗc sinh học

Nước thải đô thị cũng như nước thải của các ngành công nghiệp có sinh vật là nguyên liệu, thường chứa rất ngiều chất hữu cơ cao phân tử có nguồn gốc sinh học và các sồn phảm trao đồi chất trung gian của chúng (hydratcacbon, protein, lipit, axit amin v.v...). Những chất này tuy không độc và nói chung, đễ bi vi sinh vật phân hủy, nhưng cũng từ đó 589

tiêu hao oxy hòa tan ư o n g nước, gây hại đến môi trường, làm tôm cá chết và gây ra sự thối rữa. - Phân hủy polyxaccarit Polyxaccarit khi bị vi sinh vật phân hủy, thường do enzym ngoại bào thủy phân thành

đơn chất Tồi do enzym nội bảo thủy phân tiếp. X enluloz là thành phần chính thành tể bào thực vật, chiếm 35 — 60% ữọng lượng thực vật vả là chất ô nhiễm hữu cơ lớn nhất trong thiên nhiên. C ellulaz của vi sinh vật gồm 3 loại khác nhau: Ci

c xvà

p-glucozsidaz. Enzym Cl thủy phân xenluloz thiên nhiên chưa

bị cắt ngắn. Enzym Cx còn gọi là P-1,4- glucanaz, cắt ngắn tiếp các polyoz và oligooz đẵ được cắt ngắn. Dưới tác dụng của vi sinh vật phân giải xenluloz hiếu khí, glucoz có thể oxy hóa triệt để thành CO 2 và nước. Dưới tác dụng của vi sinh vật phân giải xenluloz kỵ khí, glucoz cỏ thể lên m en butyric, sinh ra axit butyric, butanol, axit axetic, etanol, CO 2 , H2. Các vi sinh vật phân hủy xenluloz gồm các vì khuẩn hiếu khí như Cytophaga, Cellvibribrio, C ellulom onas...,vi khuẩn kỵ khí như C lostridium otnelianskii, Clostridium thermocellulazum,

nấm

có

Trichoderm a,

A spergillus,

Penicillium ,

Stachybotrys,

Therm oascus....

H ì n h 2 3 .4 0 : c ẩ u tr ú c c ủ a x e n lu io z (th e o J . W .L e n g e le r v à c ộ n g s ự ),

Tinh bột chia thành tinh bột m ạch thẳng (am yloz) và tinh bột m ạch nhánh (am ylopectin) Đom vị glucoz trong tinh bột m ạch thẳng nối với nhau bằng liên kết a-1,4 glucozsid; tin h bột m ạch nhánh ngoài liên kết a-1,4 còn có liền kết a-1,6 glucozsid. Trong tinh bột thiên nhiên có 10-20% là tinh bột mạch thẳng, còn lại là tinh bột m ạch nhánh. Tinh bột là nguồn năng lượng và nguồn

c quan ừọng

của nhiều loài vi sinh vật dị dưỡng, chúng

sinh enzym am ylaz thủy phân tinh bột thành m antoz và glucoz, rồi đi vào trong tế bào để vi sinh vật sử dụng.

H ì n h 2 3 . 4 ỉ : T i n h b ộ t v à c á c e n z y m t h ù ý p h â n t i n h b ộ t. ( T h e o 3. w , L e n g e l e r

A m ylaz của V i

sinh vật có

4

và c ộ n g

loại:

s ự ).

a-amylaz,

p-amylaz,

Iso-amylaz

và

Glucozamylaz.Tinh bột dưới tác dụng cộng đồng cửa 4 loại m en trên, có thể thủy phân hoàn toàn thảnh glucoz. Trong các hydrat cacbon có cẩu trúc tương tự tinh bột còn có glycogen, pullulan, cyclodextrin..Để tạo thành pullulan cần có enzym pullulanaz. Để tạo thành cyclodextrin cần có enzym cyclodextrin glucozyl tiansferaz. Rất nhiều vi sinh vật có khả năng phân giải m ạnh mẽ tinh bột, đó là vi khuẩn

B a c illu s , P s e u d o m o n a s , A th r o b a c te r ,

A c h r o m o b a c ie r A g r o b a c te r iu m , C lo s tr id iu m a m y ỉo ỉy tic u m , C lo s tr id iu m a m y lo b a c te r

và rất

nhiều chi nấm sợi khác nhau. Propectin là chất keo thiên nhiên không tan ừong nước, là thành phần chính trong chất gian bào của thực vật bậc cao. Propectin là loại cao phân tử polyanionic chủ yếu do các acid D -galacturonic nối với nhau qua liên kết a -(l,4 ) D-galacturonic axit, ngoài ra còn có các gốc đường rham noz, tiếp nối bằng liên kết (1,2) D-rhamnoz. Propectin bị thủy phân thành pectin hòa tan nhờ enzin propectinaz.Pectin hòa tan dưới tác dụng của pectinmetyl esteaz (pectaz) bị thủy phân thành axit pectinic rồi thủy phân tiếp thành các hợp chất đơn giản được vi sinh vật hấp thụ.

591

H em ieellulose

Li

pprtin

H ìn h 2 3 .4 2 ; c ẩ u tạ o c ủ a p e c ti n

và h e m i x e n l u l o z s .

M ô thực vật chửa rất nhiều hem ixenluloz, chỉ đứng sau xenluloz, chiếm tới 25-40% ừong cây m ột năm và 25-35% trong cây cây gỗ. H em i-xenluloz là chất trùng hợp cao phân tử cùa nhiều loài pentoz và hexoz, ngoài glucoz còn cỏ xyloz, m annoz, galactoz, rhamnoz và arabinoz. Thường chứa 500-3000 đường đơn trong khi xenluloz có tới 7000-15 000 gốc glucoz. Có loại hem ixenluloz chỉ do 1 loại đường đơn tạo nên, như polyxyloz, polygalactoz, polym annoz; có những hem ixenluloz do nhiều loại dường đơn, axit mannuronic, axit galacturonic tạo nên. So với xenluloz, hem ixenluloz dễ bị vi sinh vật phân hủy hom. D o thành phần khác nhau, nên các loại enzym phân hủy cũng khác nhau. Lignin là chất trùng hợp cao phân tử của nhỏm hợp chất thơm , có rất nhiều trong mô thực vật hóa gỗ và k ẽ h ở gỉữa các sợi xenluloz trên thành tế bào, có tác dụng làm tăng cường độ bền cơ học. K ết cấu lignin rất phức tạp, lấy vòng benzen làm hạch tâm, trùng hợp từ m ột hoặc'nhiều chất thơm và có nhảnh propane, đồng th ài thưởng kết hợp với các loại poiyoz.

H ì n h 2 3 . 4 3 : c ẩ u t r ú c c ù a i i g n i n v à c á c t h à n h p h ầ n c ấ u t ạ o c ù a li g n in . (T h e o J . W .L e n g e le r v à c ộ n g sự ).

Lignin ỉà thành phần khó phân giải nhất của thực vật, thường do vi khuẩn phân hủy lignin thành nhóm chất thơm, rồi đo nhiều vi sinh vật phân giải tiếp. Tốc độ phân giải linin rất chậm và cỏ m ột phần rất khỏ phân giải. Các nghiên cứu chứng tỏ, chất mùn có thành phấn kểt cẩu gỉổng lỉgnin,được cho là từ các hợp chất thơm sinh ra trong quá trình phân giải lignin tái trùng hợp m à thành. Các loại vỉ sinh vật phân giải hoàn toàn ỉỉgnin các loài nẩm, vi khuẩn, trong đổ nấm đóng vai trò chủ yếu. Các loại nấm m ũ thưỉmg phá hủy Ịignin mạnh mẽ là Phanerochete chrysosporium, Đerkanđera adusta, Thametes versicolor, Pleurotus ostreatus, D ichom ỉtus squalens, Ceriporriopsis subvermispora... Ngòai ra còn có m ột số xạ khuần, vi khuẩn cũng có năng

593

lực phân hủy lignin, nhưng thường sử dụng enzym nội bào. Chúng thường thuộc các chi như Streptom yces, A rthrobaeter, M icromonaspora, Nocardia, Clostridium , Pseudomonas, A cinetobacter, Bacillus... M ô hình thường dùng để nghiên cứu việc phân giải lignin là nấm Phanerochete chrysosporium . Chất béo trong cơ thể động, thực vật chủ yếu gồm lipit, lipoid và chất sáp. Glycerin là sản phẩm thủy phân của chất béo. Vi sinh vật sừ dụng axit béo thông qua quá trình p-oxy hóa, phân hủy thành nhiều axit axetic, sau đó oxy hóa thành CƠ 2 - Trong điều kiện không thoáng k h í , axit béo khó phân hủy m à thường tích lũy lại. Các vi sinh vật phân hủy chất béo phần lớn là vi khuân hiếu khí thuộc các chi như Pseudom onas, Mycobacterium, A chromobacter, Bacillus.... M ột số vi sinh vật có khả năng loại trừ các độc tố nấm (mycotoxin). Hiện đã biết tới trên 100.000 loài nấm, trong đó có khoảng 400 loài có sản sinh các độc tố. Đ ộc tố nấm làm ô nhiễm ngũ cốc, cây lấy dầu v à các nông phẩm khác. Đây là mổi hiểm nguy toàn cầu đối yới sự an toàn của thức ăn g ia súc, g ia cầm .. Đ ộc tố nấm còn trực tiếp hoặc gián tiếp gây ô nhiễm thực phẩm , làm ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Phương pháp tốt nhất để ưánh nguy hại của độc tố nấm là tạo ra các giống đề kháng đối với các nấm sinh độc tố. H iện nay, việc tạo giống lúa m ì và ngô kháng nấm bệnh đã có tiến bộ vượt bậc, nhưng vẫn chưa có giống nào mang tính đề kháng hoàn toàn. Cải tiến các khâu thu hoạch, dự trữ, chế biến cũng là phương pháp có lợi để hạn chế nấm sợi phát triển và sinh độc tổ. Ngoài ra dùng hóa chất để x ử lý nông phẩm cũng là m ột phương pháp khả thi. Ví dụ, người ta đã tìm thấy khoảng 100 hợp chất có thể ửc chế việc sản sinh ra aíìatoxin.

A f la to x in B ỉ v à B ĩ .

O c h r a to x in A

và B .

F u m a g iU in

Hình 23.44: Một số ỉoạỉ độc tổ nấm quan trọng. D ùng vi sinh vật để phân hủy độc tố nấm để khử độc tố nấm cũng là m ột phương pháp có ích. Scott đã đùng 3 chủng nấm men khác nhau khi lên men có bổ sung độc tổ nấm và nhận thấy có thể giảm bớt được 28% độc tố fumagillin A và 17% fumagillin B do A s p e g iỉỉu s fu m ig tu s

sinh ra, giảm bớt được 13% ochratoxin do

A s p e r g illu s o c h r a c e u s

sinh

ra, hấp thu được 21% ochratoxỉn nhưng chưa hấp thu được fumagillin. V ào thập kỷ 60 của thế kỷ 20, Cieglar đã phảt hiện thấy trên 1000 loài vi sinh vật có khả năng phân giải Aílatoxin do nấm

A s p e r g illu s fla v u s

F ỉa v o b a c te r iu m B - Ỉ 8 4

và

A s p e r g illu s p a r a g itic u s

sinh ra. Trong đó chùng

có loại trừ aflatoxin một cách triệt để.

b - V i s in h v ậ t p h â n h ủ y c á c h ợ p c h ấ t h yd ro c a c b o n

Hydrocacbon bao gồm rất nhiều chất có phân tử lượng từ 16 (tnetan) đến khoảng 1000. Trong đó có chất ở thể khí (metan, ethane, propane, butane, acetylene, etylen, propyne...), thể lòng bay hợi (xăng, benzen, toluen), cũng có ở thể rán (parafin). Chúng thuộc về các nhóm, lần lượt thuộc các nhóm alkanes, d e fin e s, acetylenes, hydrocacbon thơm (arene), hydrocacbon alicyclic. Dầu m ỏ là hỗn hợp phức tạp của nhiều loại hydrocacbon v à m ột ít chất hữu cơ khác. Một m ẫu dầu m ò điển hình, gồm tói 200-300 loại hydrocacbon khác nhau. Sinh vật cũng tổng hợp được nhiều loại hydrocacbon, như chất sáp trên iá cây là loại hýdrocacbon C 25 C3 3 , carotenoit tổng hợp bởi thực vật bậc cao, tảo và vi khuẩn quang hợp cũng thuộc loại hydrocacbon không bão hòa. Biểu bì cùa côn trùng, chất tiết ờ da động vật có vú cũng có chứa hydrocacbon. Có loài lipoid của vi sinh vật chứa hydrocacbon m ạch dài. D o đỏ, chất béo trong xác động, thực vật, vi sinh vật, trong nước thải của các nhà m áy chế biển thực phẩm, nhà m áy thuộc đ a ... cũng là những nguồn hydrocacbon. Đồng thời trong các đầm lầy, ruộng nước nước bần, dạ cỏ của động vật nhai lại, luôn luôn diễn ra quá trình phân hủy kỵ khí chất hữu cơ sinh ra iríetan.

595

H ì n h 2 3 .4 5 : S ự p h â n h ủ y s i n h h ọ c ( b i o d e g r a d a t i o n ) c á c a l k a n ( t h e o . M . M a i e r v à c ộ n g s ự ).

Hình 23.46: Sự phân hủy sinh học aĩken (theo.M.Maỉer và cộng sự).

596

Dưới đây là m ột số ví dụ về các quá trình phân giải các hợp chất hydrocacbon nhờ vi sinh vật: - Oxy hóa metan:

- Oxy hóa etan, propan, butan: có thể thông qua m ột số vi khuẩn sử dụng m etan làm nguồn năng lượng và nguồn

c, biến

etan, propan, butan thành các axit hoặc keton tương

ứng, chúng sẽ phân hủy tiếp nhờ nhiều loại vi sinh vật khác nhau. - Oxy hóa các hydrocacbon bậc cao Oxy ban đầu của chúng cỏ thể cỏ 3 con đường: sinh ra axit cacbonxylic; sinh ra axit dicacbonxylic; sinh ra keton. Trong đó con đường thứ nhất hay gặp nhất. - O xy hóa alkan mạch thẳng: một số ví dụ:

Oxy hóa hydrocacbon m ạch vòng không có goc metyl ở đầu:

597

H ì n h 2 3 . 4 7 : S ự p h â n g i à i a l k a n v ò n g t h ơ m ( t h e o A i. A A l t e r v à c ộ n g s ự ) .

598

- Phân giải alkan vòng thơm: - Phân giải alkan thơm đa vòng:

Vi sinh vật có khả năng phân hủy qua trao đổi chất rất m ạnh mẽ, đa dạng hóa và với tốc độ nhanh cho nên được coi là con đuờng quan trọng nhất để khử hydrocacbon thơm đa vòng. Chủ yếu có 2 kiểu trao đổi chất: - Hyđrocacbon thơm đa vòng

ỉà nguồn c vả năng lượng đuy nhất.

- Hydrocacbon thơm đa vòng tiến hành cùng ừao đồi chất với các chất hữu cơ khác, chuyển hóa chất ô nhiễm thành những sản phẳm cuối cùng ổn định và không độc hại (như nước, CƠ 2 , rượu và axit đơn giản, sinh khối vi sinh v ậ t...). 23,5.3.2. S ự p h â n h ủ y và chuyển hỏa của v ỉ sinh vật đổi vớ i các hợp chất hữ u cơ tồng h ợ p n h â n tạ o a-

Phân

hủy

nhờ

vi

s in h

vật

các

hợp

c h ấ t P o ỉy c h ỉo r in a td

b ip h e n y ls

(P C B s )

PCBs là những hợp chất clo hữu cơ tổng hợp nhân tạo, dùng làm chất ổn định, đã được ứng dụng rộng rãi (trong đầu bôi ươ n, đầu cách điện, chất tăng độ dẻo, chất tải nhiệt, sơn, mực in..). PCBs độc đối với da, gan, thần kinh, xương, còn là m ột nhân tố có thể gây ung thư. PCBs rất ổn định, khó phân hủy trong m ôi trường. Bài viết đầu tiên về khả năng phân hủy nhờ vỉ sinh vật đối với PC B s được phát biểu vào năm 1974, đỏ là bài viết về các vi sinh vật phân lập từ đất cỏ khả nâng phân hủy PCBs. Năm 1978, m ột nhà khoa học N hật đa phân lập được 2 chủng vi khuẩn phân hủy PCBs từ mẫu bùn lấy m ột hồ ở W isconsin (Hoa Kỳ), đỏ là

A ỉc a lig e n s

sp. v à

A c in e to b a c te r

sp.

Chúng đều cỏ thể sinh enzym chuyển hóa PCBs thành diphenyl và clorobiphenyl, rồi hấp thu sau khi chuyển qua các đạng trung gian catechol. V i sinh vật vừa phân hủy được những chất PCBs, vừa sử đụng chúng ừo n g để trao đồi .chất. Các nhà khoa học đã gây đột biến đối với chùng vi khuẩn t S e r r a tia s p ., B a c illu s

P seudom onas

sp.,

sp để thu được các chùng cỏ khả năng khoáng hỏa PCBs thành C 0 2

vả nưổc.

599

Chit tnmggian càterhol

* d m trinh TCA'

Mr*

M—

Hình 23.48: Sự đồng hóa p-cỉorobiphenyì sau khi phân hủy từPCBs. (theo.MMaỉer và cộng sự), b - P h â n h ủ y n h ờ v i s in h v ậ t đ ổ i v ớ i c á c c h ấ t h o ạ i đ ộ n g b ề m ặ t

Thành phần cơ bản chất tẩy rửa là các chất hoạt động bề m ặt tổng hợp nhân tạo. Căn cứ tình trạng điện ly của các chất hoạt động bề m ặt trong nước, có thể chia thành 4 loại: dạng cation, dạng anion, dạng phi ion và dạng điện giải lưõng cực. Chất hoạt động bề mặt anion được ứng dụng phổ biến nhất, m à trong đỏ m uối alkyl benzen sulfonat (ABS) được dùng nhiều nhất.

Cấu trúc của ABS C hất h o ạt tính bề m ặt đầu tiên là ABS phi tuyến tính, gốc m etyỉ ư ê n m ạch nối alkyl ứ ờ ngại cho phân hủy sinh học. ABS trong nước có thể tồn lưu trên 600 giở. Đ ể cho chất hoạt động bề m ặt đễ bị phân hủy sinh học hơn, người ta đã chuyển kết cấu chúng thành dạng alkyl benzen sulfonat m ạch thẳng (Linear alkyl benzen sulfonat, LA S), nhờ vậy mà tốc độ phân hủy sẽ nâng cao rất nhiều. Hiện nay chất hoạt động bề m ặt chủ yếu ỉà các chất LAS.

HsC—(C H s^C H — CHỵ—(CH2)ỹ-CH3

0

sor Na+ ( jc f y - 6 - 9 )

Cẩu trúc của LA S N gười ta đã phân lập được từ đất, nước, bùn hoạt tính các vi sinh vật sử dụng các chất hoạt động bề m ặt làm nguồn c và nguồn năng lượng duy nhất, chủ yếu gồm những loài trong các chi

P seudom onas,

P ỉe s io m o n a s , X a n th o m o n a s , A lc a lig e n s ,

N o c a r d i u m . A z o t o b a c t e r ...Chi A z o t o b a c t e r ,

ngoài loài

A z o to b a c te r

M ic r o c o c c u s ,

b e ije r in s k iiy

những loài tích cực tham gia phân hủy các chất hoạt động bề mặt. Nuôi cấy

đều là

A z o to b a c te r

từ

nguồn nước bẩn có chứa chất hoạt động bề mặt có ý nghĩa rất lớn, vì nhờ cố định N trong khí quyển, trong nước sẽ có thêm N hữu cơ, xúc tiến các vi sinh vật khác phát triển làm nâng cao tốc độ phân hủy chất tẩy rửa. Nhiều nghiên cứu cho thấy các chủng sp. và

B a c iỉỉu s

A ỉc a ỉig e n c e s

sp. mang tính chuyên hóa cao và có hiệu suất phân hủy cao đối với LAS

nên thường được ứng dụng để xử lỷ cảc nguồn nước bị chất hoạt động bề m ặt gây ô nhiễm. Từ mỏ dầu người ta đã phân lập được chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy chất natri dodecylbenzen sulfonat (SDS) ở nhiệt độ thấp và có hiệu suẩt phân hùy cao. Lâm Lực (Trung Quốc) từ vùng đất bị ô nhiễm dầu mỏ đa phân lập được 2 chủng W e e k s e lla 6

P a w u s o n in a s

52 và

. Hai chủng này cỏ thể dùng acetae am on làm nguồn N, ở 30°c, pH 7 và rất ít

glucoz, vẫn có thể làm sạch chất hoạt tính bề m ặt phi ion hóa AE-9. K hả năng phân hủy cùa vi sinh vật đổi với các chất hoạt động bề mặt phụ thuộc vào sự tồn tại của plasmid, những gen quyết định các enzym liên quan đến phân hủy LAS đều nằm ừ ê n plasmid.

C ẩ u tr ú c c ù a S D S .

601

c- Phăn hủy nhờ vi sinh vật đổi với chất dẻo C hất dẻo là loại cao phân tử tổng hợp nhân tạo đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới. N hững m ành vụn chất dẻo đo mang tính trơ sinh học, sẽ tồn tại lâu dài trong môi trường, hình thành m ối nguy hại lâu dài. M ột số chủng vi nấm , vi khuẩn, xạ khuẩn cỏ khả năng phân hủy các chất dẻo tổng hợp.. Chúng thực hiện qua 3 phương thức: - Tác dụng lý sinh— sự sinh tnrởng của tế bào vi sinh vật gây phá hủy cơ học tới vật dụng bẳng chất dẻo. - Tác dụng hóa sinh— sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật tác động lên chất dẻo. - Tác dụng trực tiếp do enzym — vi sinh vật sinh ra những enzym có tác động lên thành phần cao phân tử của chất đèo, dẫn đến sự phân giải oxy hóa. Chất dẻo bị ánh sáng làm lão hóa (quang giải) trước thì sau đó sẽ dễ bị phân hủy sinh học hơn nhiều. Trong đất, nhiều vi sinh vật cỏ thể sử dụng được những m ẩu vụn chất dẻo qua quang giải để sử dụng như nguồn thức ăn c , chủ yểu là các vi nấm thuộc chi Aspergillus. Ngoài việc nghiên cứu phân hủy vi sinh vật đối với chất dẻo người ta chú ý nhiều hơn đến việc sử dụng vi sinh vật để sản xuất ra các loại chất dẻo dễ bị phân hủy trong tự nhiên. Chất đèo sinh học có tên thương phẩm là Biopol đã được sản xuất từ vi khuẩn ưa kiềm Alcaligens eutrophus. Chúng sử dụng CH 2 O v à axit hữu cơ làm nguyên liệu để tổng hợp ra polyhydrocacbon este (phân tử gồm m ột chuỗi dài CHO). Thay đổi điều kiện môi trường của vi khuẳn có thể chế tạo ra m ột loạt các biopol cao phân tử với độ cứng, độ dẻo, độ dai khác nhau.V iện nghiên cứu Hóa học thuộc Đại học công nghiệp Tokyo,đà nghiên cứu thay đổi m ôi tn rờ n g dinh dưỡng của A lcaligens eutrophus để bắt chúng tổng hợp ra loại chất dẻo này. Đại học M adison (H oa K ỳ) đã tách được từ A lcaligens eutrophus 3 gen điều khiển việc sản sinh, chuyển các gen này vào vi khuẩn Escherichia coli khiến chúng tổng hợp ra được polyhydrocacbon este. M ột nghiên cứu ờ Đại học M ichigan (Hoa Kỳ) đã chuyển gen từ A lcaligens eutrophus vào thực vật (nhóm rau cải), khiến cây cải cũng chế tạo được ra chất dẻo này. Theo dự đoán đến cuối thế kỷ 21 loại chất dẻo đễ bị phân nhủy này sẽ được sản xuất rộng lởn từ cây trồng. d - P h â n h ủ y n h ờ v i s in h v ậ t đ ổ i v ớ i th u ố c b ả o v ệ th ự c v ậ t

N hững vì sinh vật phân hủy được thuốc bảo vệ thực vật gồm cỏ vi khuẩn, xạ khuẩn, vi nấm và tào. Trong số này có chi vi khuẩn Pseudom onas là đáng chú ý hơn cả. Pseudom onas có thể phân hủy được DDT, m alation, phorat, diazinon, parathion-metyl, parathion, 2,4D , dalapon, sim azin... Công ty N ew castle (H oa K ỳ) thông qua việc nuôi cấy trên m ôi trư ờng làm giàu đã phân lập từ đất được chủng Psedom onas putida cỏ thể phân hủy được vinclozoUn. K hi vinclozolin tan trong đất sẽ bị phân hủy nhanh chóng. Tiêu Hoa

602

Thắng (Trung Quốc) từ đất của xưởng thuốc trừ sâu đã phân lập được chủng Pseudomonas sp. WS5 có thể phân hủy được tới 75% methamidophos với nồng độ 1000 m g/L ừong vòng 18 giờ. Bacillus sp. có thể phân hủy được DDT, parathion - m etyl, parathion... Thi Quốc Hàm (Trung Quốc) phân lập từ đất chủng Bacillus sp. có thể phân hủy được aldicarb.... Flavobacterium: phân hủy được nhiều loại thuốc BVTV như m alathion, parathion, parathion-metyl, diazinon, 2,4-D ....V ương N gân Thiện (Trung Quốc) phân lập được từ ruộng bông chủng Flavobacterium sp. P3-2 có thể phân hủy m ạnh mẽ đốí với parathionmetyl và isocarbophos,.... N hiều vi khuẩn thuộc chi Alcaligens cỏ thể phân hủy được không ít loại thuốc B V T V ....N gu V ân Long (Trung Quốc) từ nước thải xưởng sản xuất thuốc BVTV đã phân lập được chủng Alcaligens sp.Ỳ l 1 có thể phân hủy được khá nhiều loại thuốc BVTV khác nhau, như parathion, parathion-metyl, phenỉtothion... Ngoài ra, các vi khuẩn có thể phân hủy thuốc BVTV còn tìm thấy ở nhiều chi khác như A rthrobacter, Brevibacterium, Sarcina, S treptococcus...Các chi vi nấm có khả năng phân hủy thuốc BVTV gồm có Aspergillus,

Penicillium,

Rhizopus,

Trichoderma,

Fusarium ,

AlteARNria,

Cephalosporium, M ucor, Gliocladium, Neurospora, Rhizobium v.v ...T h i Quốc Hàm (Trung Quốc) đã phân lập được từ đất những chùng thuộc các chi Penicillium , Mucor, Aspergillus ... có thể phân hủy được chlorbenzuron N.3. ô n g cũng đã nghiên cứu cơ chế và con đường phân hủy của Penicillium đối với chlorbenzuron. Lưu N gọc Hoán (Trung Quốc) đã phân lập được chủng thuộc loài Aspergillus oA RNtus từ đất bị nhiễm lâu dài methamidophos có hoạt tính phân hủy cao đối với methamidophos, tỷ lệ phân hủy cao nhất có thể đạt tới 83%. Rõ ràng là vi sinh vật có khả năng phân hủy thuốc BVTV tồn tại khắp nơi.Tuy nhiên có loại bị phân hủy nhanh ( như

2 ,4 - Đ ) n h ư n g

cũng có những chất hầu như

không bị phân hủy (như 2,4,5-T)

Hình 23.49: Tốc độ phân hủy của 2,4-D và 2,4,5-T. 603 Á

2,4-D (axit 2,4-dichlorophenoxyaxetic) là chất diệt cỏ có hiệu suất cao, ít lưu lại ừong đất, phân hủy tương đối nhanh, chu kỳ bán hủy chỉ vào khoảng vài ngày hoặc vài tuần. Có hơn 10 loài vi khuẩn thông qua 2 hoặc 3 con đường khác nhau để phân hủy 2,4-D. V i sinh vật có thể phân hủy 2,4-D gồm cỏ:

A c h r o m o b a c te r , A r th r o b a c te r , P se u d o m o n a s,

C o r y n e b a c te r iu m , F la v o b a c te r iu m , N o c a r r d ìa , A s p e r g illu s , P e n ìc ilỉỉu m

...

D alapon (natri a ,a - dichloropropionate) là thuốc trừ cỏ dễ tan ừong nước, ít lưu lại trong m ôi trường, chu kỳ bán hủy là 15-45 ngày. N hững vi sinh vật có loài dùng dalapon làm nguồn c (nhóm sử dụng sơ cấp) có loài sử đụng sản phẩm trao đổi chất của các loài trên (nhóm sử dụng th ứ cấp) .DDT (D ichloro-D iphenyl-Tricloroetan) là thuốc trừ sâu có thể tồ n lưu lâu dài khổ nguy hiểm, chu kỳ bán hủy là trên nửa năm. D D T được tổng hợp từ năm 1874, đến năm 1939 thì phốt hiện ra khả năng diệt côn trùng và v ì vậy đã được sừ dụng rộng rãi ttong những năm đầu của Thế chiến II để điệt m uỗi truyền bệnh sốt rét và các côn trùng gây bệnh khác. Sau thế chiến II người ta đã sử đụng rộng rãi D D T để trừ sâu hại cây trồng. N hờ các nghiên cứu vè D D T m à P.H .M ủller đã được nhận giải thưởng N obel vào năm 1948. năm 1962 Rachal C arson cảnh báo k hả năng gây ung th ư của các thuốc trừ sâu tồn tại lâu dài trong thiên nhiên nh u D D T v à người ta đã gần như đã loại bò thuốc trừ sâu này. Đ ã có những bằng chứng cho thấy

A e r o b a c te r a e ro g e n s, H y d r o o m e o n a s

sp. có thể thồng

qua trao đổi chất m à chuyển hóa D D T thành các hợp chất đơn giản hơn sau đó tiếp tục được vi sinh vật phân hủy tiếp.

Cẩu trủc cùa DDT.

604

cẩu trức cùa 2.4D và 2,4,5T.

Sau đỏ tiếp tục được vi sinh vật phân hủy tiếp. Các vi sinh vật phân hủy m ạnh mẽ DDT còn có

B a c illu s , N o c a r d a , S tr e p to m y c e s .

Trong thiên nhiên, có rất ít những loài vi sinh vật phân hủy

2 ,3 ,4

-T., Chakrabartyk

khi phân lập vi khuẩn phân hủy 2,3,4-T đã thêm nhiều loại vi sinh vật chứa plasm id phân hủy CAM, TOL,SAL, pA C 21, pAC23. Sau khi nuôi cấy chung 8-10 tháng, đã chọn lọc được chủng

P se u d o m o n a s p u tỉd a

A C 110 có khả năng phân hủy 2,3,4-T với hiệu suất cao.

Trong tế bào của chúng cỏ chứa nhiều plasmid như pDG3, pDG4. N hiều vi khuẩn chuyển đổi plasm id trong

6

tuần có thể phân hủy 2,3,4-T từlOOOml/L xuống chỉ còn 500mg/L.

R.G.Haugland tiến hành đung hợp giữa vi khuẩn A ỉc a ỉỉg e n s e u tr o p h u s

P seu d o m o n a s

p u tid a A C M ữ O

và

JMP134 cho hiệu suất phân hủy 2,4,5-T cao. Khi chuyển plasm id của

chủng JM P13 sang chủng AC 1100, thu được chủng vi khuẩn tái tổ hợp R H J1, có thể cùng một lúc phân hủy cả 2,4-D và 2,3,4-T.

605

Chương 24

VI SINH VẬT TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC

Nước chiếm 7/10 diện tích bề m ặt Trái đất, ừong đó 97,2% tổng lượng nước toàn

cầu là nước biển phân bố ở các đại đương. Lượng nước biển ước khoảng 13 000 X 1014 m3. Do có thể tích lớn như vậy nên nước biển thường không bị ô nhiễm , ngoại trừ vùng nước biển nằm ven bờ, nơi có hoạt động của con người, Phần nước còn lại là nước ngọt nằm trong lục địa, phân bố ở sông, suối, hồ, chòm băng địa cực, nước ngầm ... M ặc dù nước ngọt chiếm m ột phần rất nhỏ nhưng chúng lại có tầm quan ữọng thiết yếu vì là nguồn nước được sử dụng trong sinh hoạt. Ở nhiều nơi, nước ngọt đang bị ô nhiễm do các chất thải của sản xuất công nghiệp, sản xuất nông nghiệp và sinh hoạt, gây ảnh huở ng nghiêm ư ọ n g tới m ôi trường. M ôi trường nước biển v à nước ngọt là nơi sống của nhiều loại vi sinh vật. Các vi sinh vật này m ang nhiều đặc tính đặc trưng để thích nghi với m ôi trường sống đặc biệt này.

24.1. MÔI TRƯỜNG NƯỚC Trong m ôi trư ờng nước luôn tồn tại các chất khí, chất rán v à chất hòa tan. Sự chuyển động không ngừng củ a các chất làm cho nồng độ vật chất ờ từng vùng nước nhất định luôn thay đổi. Đ iều này đã tạo ra những đặc điểm rất đặc trưng cho quần thể vi sinh vật nước. V i sinh vật sống trong nước có thể nhanh chóng đáp ứng với sự biến động của m ôi trường v à luôn tìm đến những vùng nước thích hợp nhất. Q uần x ã vi sinh vật sống trong nước bị điều khiển bởi những chuyển động và hòa trộn của các chất đinh dưỡng, oxi và chất thải. Chẳng hạn như ở các hồ sâu và đại dương, chất hữu cơ ờ bề m ặt thường láng xuống đáy, đo đó vùng nước ở đáy rất giàu chất dinh dưỡng. V i sinh vật phân bổ ở dưới đáy sẽ phân hủy các chất hữu cơ thành các sản phẩm bao gồm chất khí v à chất hòa tan. Các chất này sẽ di chuyển lên ừ ên và thúc đẩy hoạt động của các vi sinh vật ở đó. H iện tượng tương tự có thể thấy ỏ các hồ nông phì dưỡng, màng sinh học - biofilm , thảm vi sinh vật, tuy nhiên khoảng chênh lệnh gradien nồng độ giữa các m ôi trường này rất nhỏ, ‘chỉ tính bằng Ịim.

606

Các môi trường nước, như đại đương, hồ, sông, trong cơ thể, trong đ ấ t . p h â n biệt về thể tích và diện tích bề mặt. Ngoài ra, môi trường nước còn khác nhau về độ pH (acid, kiềm hay trung tính) và nhiệt độ (dao động từ -15°c đến 113°C). T.D. Brock và cộng sự đã phát hiện vi khuẩn

T h e r m u s a q u a tic u s

trong suối nước nóng tại Công viên quốc gia Yellow Stone,

vi khuẩn này là nguồn sản xuất ra enzim vật ưa nhiệt độ cao như

Taq

P y r o ỉo b u s fu m a r ii

polymerase dùng cho phản ứng PCR. Vi sinh

thì được phân lập từ các rãnh thuỷ nhiệt ở thềm

đại dương. Rãnh thủy nhiệt lả những vết nứt trên bề mặt Trái đất mà tại đó có dòng nước nóng phun ra. Ở đảy đại dương, rãnh thủy nhiệt có đặc trưng là phun ra khỏi đen chứa các chất khoáng có hàm lượng lưu huỳnh và các hợp chất của lưu huỳnh cao. Đây là m ột trong các nguồn khai thác của các nhà nghiên cứu, nhàm phục vụ cho các mục đích thực tiễn, khoáng chất. Do các đặc trưng của môi trường nước và vi sinh vật nước nên việc phân lập và nuôi cấy vi sinh vật nước trong phòng thí nghiệm gặp rất nhiều khó khàn. Chính vi vậy nên nhiều vi sinh vật biển vẫn là điều bí ẩn đối với con người. Vi sinh vật nói chung và vi sinh vật biển nói riêng cỏ khả năng sinh ra các chất có hoạt tính sinh học và là đối tượng nhất là y học. M ột số chất kháng sinh mới tìm thấy có nguồn gốc từ nước (hình 24.1). Hiện tại, nhiều kỳ thuật mới đang được áp dụng để thu mẫu vi sinh vật m à không gây stress về nhiệt độ và áp suất. Các nhà khoa học Nhật và M ỹ đã thiết kế các thiết bị đặc biệt để có thể nuôi cấy các vi sinh vật sinh trưởng ờ áp suất

1000

atm.

H ìn h 2 4 . ỉ : M ộ t s ổ c h ấ t h ó a tr ị li ệ u c ó n g u ồ n g ố c t ừ b iể n .

(a) Goniodomỉn A - tác nhân chổng nấm nhóm macrolide; (b) Didemnin B - tác nhân chống ung thư và virut.(Theo Prescott-Harỉey-Kỉein, 2002). H ầu hết các chất khảng sinh hiện sử dụng thường là cỏ nguồn gốc từ vi sinh vật đất, chủ yếu từ xạ khuẩn (Actìnomycetes), rồi đến từ nấm và vi khuẩn Gram dương. Hơn 100 sản phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật đã được dùng làm chất kháng sinh, tác nhân chổng ung thư và sản phẩm phục vụ nông nghiệp. Trong những năm gần đây, do nhu cầu tỉm kiếm các hợp chất mới sử dụng trong y học ngày càng tăng, nên vi sinh vật biển đang ngày

607

càng được quan tâm . M ột số các hợp chất m ới được tìm thấy là các vật chất chuyển hóa của vi tảo. N goài ra, người ta cũng quan tâm đến việc nuôi cấy các vi sinh vật biển cộng sinh, chẳng hạn n hư vi khuẩn lam Prochloron cộng sinh với các vật chủ lớn có thể nhìn thấy bằng m ắt thường. M ột loạt các hợp chất đáng chú ý khác vóả nguồn gốc chưa rõ ràng đã được tìm thấy. R ất nhiều hợp chất được cho là có nguồn gốc từ vi sinh vật nhưng cần tiến hành nghiên cứu thêm để làm sáng tỏ điều này. N hiều nhả sinh học nhận thấy rằng các vi sinh vật biển có thể cung cấp các hợp chất có hoạt tính sinh học rất đặc trưng, như chất độc, m à ở các vì sinh vật đất không thể có. Các nhà khoa học đang cổ gắng tìm hiểu kỹ hơn quần x ã vi sinh vật biển nhàm ứng dụng trong y học hiện đại. Tuy nhiên nghiên cứu trên đối tượng vi sinh vật biển là thử thách lỏn cho các nhà khoa học, vì không dễ dàng gì để có thể nuôi cấy các vi sinh vật này ừ ong phòng thí nghiệm. G ần đây m ột số các hợp chất mới cỏ hoạt tính sinh học đã được tìm ra. G oniodom in A, là tác nhân chống nấm chứa vòng m acroliđe, dược tách chiết từ G oniođom a (G onyaulax) sp. D idem nin B, tác nhân chống virut và ung thư, cũng được tách chiết từ Prochloron

( h ì n h 2 4 .2 ) .

Hình 24.2: Vi khuẩn lam Prochloron.

24.1.1. Các loại khí trong môi trường nước 24.1.1.1. O xì

O xi thường được khuếch tán vào nước từ khí quyển. V ùng nước ở càng xa bề mặt hoặc xa bong bóng khí (air bubble) thì tốc độ khuếch tán của oxi vào nước càng thấp. Chính vì vậy m ôi trư ờng nước là m ôi trường có tổc độ khuếch tán oxi thấp (low oxy diffusion envứonm ent). T ốc độ khuếch tán của oxi vào hầu hết m ôi trường nước chỉ bằng khoảng 1/4000 tốc độ khuếch tán của oxi trong khí quyển (hinh 24.3). Phần oxi khuếch tán trong nước được gội là oxi hòa tan.

Vi sinh vật

"V\ > 1 f r ,,

Môi trường Enzym ho hấp tế bào

Ranh giới với bề mặt bong bóng

1Ũ0.Ũ&)

ỉ Ic x

1,000

Không khí

Nước

Tê bảo

'1 100

%

V

Mòi tnrờng lỏng

Í0

Ranh giới với tế bào

! I

L

Nồng độ tại vị trí enzym

ai Tốc độ khuếch tán của oxi

Hình 24.3: Sự khuếch tán của oxi trong nước. Oxi khuếch tán với tốc độ nhanh trong không khỉ vờ tốc độ chậm trong nước

1/4000 tốc

độ trong không khỉ). Mũi tên lớn chi lốc độ khuểch tán trong không khỉ. Màu đậm nhạt thể hiện nồng độ oxi. Sau khi khuếch tản qua không khi, oxi sẽ vượt qua ranh giới giữa không khi và nước, sau đó khuếch tản vào nước với tốc độ chậm (mũi íên nhỏ). Từ nước, oxi sẽ vượt qua màng tế bào đế liếp

xúc

với enzym nội bào.

N ồng

độ oxi (ppm - phần

tr iệ u ) đ ư ợ c

thể hiện bằng

tỳ

lệ logarit,

lượng oxi có mặt ở vị trí của enzym có thể it hơn ỉ/1 000 000 lượng oxi trong không khí. (Theo Prescott-Harỉey-Kỉein, 2002). Độ tan của oxi trong nước phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Ở nhiệt độ cao và áp suất thấp, tốc độ khuếch tán và độ hòa tan của oxi giảm đáng kể (bảng 24.1). Vì tốc độ khuếch tán của oxi ữ o n g nước bị hạn chế, nên nếu như tốc độ sử dụng oxi của vi sinh vật lớn hơn tốc độ khuếch tán của oxi thì sẽ hình thành các vùng nước có lượng oxi thấp (hypoxic) hay thiểu oxi (anoxic). V ùng nước này sẽ là nơi sống và phát triển của các vi sinh vật kị khí quang đưỡng và hóa dưỡng. N gược lại nếu vi sinh vật sống trong m àng nước cực mỏng hay gần vùng có không khí thi môi trường này là môi trường khuếch tán oxi nhanh (high oxy diffusion environm ent), giống như trong đất.

609

B ả n g 24.1: Ả

n h h ư ở n g c ủ a n h i ệ t đ ộ v à đ ộ c a o đ ế n n ồ n g đ ộ o x i h o à t a n ( r n g /L ) ( T h e o P r e s c o tt-H a r le y -K le in , 2 0 0 2 )

Độ cao 50 vởi mặt biển (m) Nhiệt độ (°C)

0

1000

2000

3000

0

14,6

12,9

1 0 ,2

5

1 2 ,8

1 1 ,2

11,4 9,9

10

11,3

8 ,8

15 25 30 35 40

1 0 ,0

9,9 8,9

9,1

8 ,1

8 ,2

7,3

7 ,5

6 ,6

7,1 6,4 5,9

6,9

6 ,1

5,4

7,9

8,9 7,9 7,1 6,4 5,8 5,3 4,9

2 4 . 1 . 1 . 2 . C a c b o n i c ( C O 2)

CO 2 là loại khí chủ yếu th ứ hai, đóng vai trò quan trọng ừ o n g các quá trình hóa học và sinh học. Chúng tham gia vảo sự kiểm soát pH m ôi trường. Trong dung dịch đệm yếu, pH được duy trì ổn định trong m ột phạm vi nhất định nhờ thay đồi tỷ lệ giữa H C 0 3\ H 2 CO 3 và C O 2 (hình 24.4). N ước cất không đệm có pH khoảng từ 5,0 đến 5,5; được quyết định bởi lưọrng CO 2 hòa tan trong nước cân bằng với không khí. N gược lại, đối với nước có đệm ở pH 8 , CO 2 hấp thu từ không khí vào nước sẽ tồn tại chủ yếu ở dạng HCO 3 " (hình 24.4). Khi vi sinh vật tự dưỡng Jrong nước (chẳng hạn như tảo) sử dụng C 0 2 thì sẽ làm tăng pH của nước.

5.9

a.a

lũ

ta

S.0

1ŨUQ

pH

Hình 24.4: Mối liên hệ giữa pHvấ c o 2 hòa tan.

610

pH môi trường chịu cmh hường cùa hàm lượng C 02 hòa tan và tỳ lệ của C 02 so với ion HCO/ và CO} '. (Theo Prescott-Harìey-Kỉein, 2002). 2 4 .1 .1 .3 , N i t ơ , h y d r o v à m e t a n

M ột số loại khí khác cững đóng vai trò quan trọng trong m ôi trường nước là nitơ, hyđro và m etan (CH 4 ). Khí nitơ được vi khuẩn cố định nitơ sử dụng. K hí hydro vừa là khí thải và vừa là cơ chất quan trọng cho m ột số vi sinh vật. Tỉnh tan trong nước của ba loại khí này khác nhau, trong đó CH 4 có tính hòa tan thấp nhất. N gay sau khi được sinh ra từ môi trường kị khí, m etan sẽ khuếch tán lên trên và đi vào khí quyển. Do đó mà CH 4 là m ột khí thải lý tưởng vì có thể nhanh chóng loại bỏ chúng ra khỏi m ôi trường nước, tránh hiện tượng tích lũy chất thải gây độc như trường hợp chất thải là axit hữu cơ và am oniac (NH3).

24.Ỉ.2. Chất dinh dưỡng trong môi trường nước N ồng độ chất dinh dưỡng trong môi trường nước rất đa dạng, có thể là rất thấp tính theo fig chất hữu cơ/lít cho đến rất cao giống như ừong m ôi trường nuôi cấy ở phòng thí nghiệm (g/L). N ồng độ chất dinh dưỡng'cao thường xuất hiện ở các môi trường ô nhiễm, tại các nhà máy xử lý nước thải... Sự thay đổi nồng độ chất dinh dưỡng có thể dẫn sự thay đổi quần xã vi sinh vật sống ờ đó, có thể chuyển từ vi sinh vật thích ứng nồng độ dinh dưỡng cao sang vi sinh vật thích ứng nồng độ dinh dưỡng thấp và ngược lại. Tốc độ thay đổi nồng độ chất dinh dưỡng cũng rất đa dạng. Ỏ đại dương rộng lớn, để thay đổi nồng độ chất dinh dư&ng cần hàng ừ ăm hoặc có khí hàng nghìn năm. N gược lại, ở các vùng đầm lầy và cửa sông thi tốc độ thay đổi lại khá nhanh, chính vi vậy cửa sông là nơi sống của quần xã vi sinh vật rất phức tạp thích ứng nhanh chóng với sự thay đổi nồng độ chất dinh dưỡng. Cột W inogradsky, do nhà khoa học người N ga Sergei N ikolaievich W inogradsky phát minh, dùng để chứng m inh mối tương tác của ví sinh vật và građien nồng độ ừong môi trường nước (hình 24.5). Cột là bình thủy tinh hình trụ, bên trong chứa 3 lớp: lớp đáy là bùn (lấy từ đáy hồ hoặc sông) đã bổ sung Na 2 S 0 4, N a 2 C 0 3 và giấy vụn; lớp giữa là bùn thô và lớp trên cùng là nước (lấy ờ hồ hoặc sông). Cột được đậy kín và để gàn ánh sáng (tạo điều kiện cho quá trình quang hợp). Lúc đầu số lượng vi sinh vật không nhiều, sau một thời gian ( 2

- 3

tháng) thỉ sổ lượng vi sinh vật tăng lên rất nhiều, m ỗi loại vi sinh vật phát

triển m ạnh m ẽ ờ m ột khu vực nhất định trong bình.

Thành phần:

Y ~

"Nước

Vi sinh vật và phản ứng chính:

Vùng màu:

f

Nước ỊVAu ntiar (giàu02)

Tào Tà cát và vi khuẩn lam

Tảo và vi sinh vật oxi hóa HiS Beggiơtoa Thiobacìllus Thiothrix

W § M Ê Ê { 'ì

Quang dị dưỡng: Rhođospiriỉỉum Rhodopseudomonas

Bùn

) í‘

Chromatium Chlorobium

Cellulose -> sản phẩm lên men (Clostridium) Sản phẩm + S042‘-> H2S (Desulfovibrio)

Bùn, SO42', COj2\ giấy (cellulose)

Hình 24.5: Cột Winogradsky. Mô hình vi mô mô tà mối liên hệ giữa vi sinh vật và chất dinh dưỡng theo gradien nồng độ thảng đứng. Sàn phẩm lên men và s 2' đỉ chuyển từ vùng dưới lên, oxỉ đi chuyển từ trên xuống. Mô hình này giống hồ cỏ ỉởp lẳng cặn giàu dinh dưỡng. Ảnh sáng được cung cấp tới vùng kị khí phía dĩỉới giúp cho vi sinh vậí quang dưỡng ờ đỏ phát triển. (Theo Prescotị-Harỉey-Klein, 2002). Ở đáy cột, xenluloz ờ dạng giấy vụn bị nhóm vi khuẩn sản phẩm lên m en. Vi khuẩn

D e s u ỉfo v ib r io

C lo s tr id iu m

phân hủy thành

sử dụng sản phẩm lên m en làm chất khử, SO 4 '

làm chất oxi hóa và sinh ra sàn phẩm phụ là H 2 S. H 2 S sẽ khuếch tán lên vùng nước bên trên, tạo nên gradien nồng độ H 2 S trong cột. Tiếp theo là sự phát triển m anh mẽ của vi khuẩn quang tự duõng kị khí

C h ỉo r o b iu m

và

C h r o m a tiu m

, do đó tạo vùng cỏ màu xanh

ôliu (olive) và tím . V i khuẩn quang tự dường này sử đụng H 2 S là chất khử cho điện tử, CO 2 (từ N a 2 C Ơ 3 ) là nguồn cacbon. Bên trên là lượng phong phú của các vi khuẩn tía không lưu huỳnh thuộc chi

R h o d o s p ir iu m

và

R h odopseudom ona.

V i khuần quang dị dưỡng này sử

dụng chất hữu cơ là nguồn cho điện tử và thường hoạt động ở vùng có nồng độ s 2* thấp hơn. Ở phần trên cùa cột, có m ặt cả oxi (do khuếch tán từ trên xuống) và H 2 S, là nơi hoạt

612

động của các ví sinh vật thích nghi khác, như vi khuẩn

B e g g ia to a

và

T h ỉo th r ỉx ,

chúng sử

dụng hợp chất lưu huỳnh dạng khử (H 2 S) là chất khử và oxi là chất oxi hóa. Phần trên cùng là nơi sổng của tảo cát và vi khuẩn lam. Vi sinh vật trong cột hoạt động tích cực m ột chiều vì nguồn chất khử ban đàu (xenluloz) lả có hạn. Khi dùng hết chất khử này, toàn bộ thành phần trong cột sẽ chuyển sang dạng oxi hóa, do đỏ mà vi sinh vật quang dưỡng phụ thuộc s 2" và các vi khuẩn kị khí khác sẽ không còn khả năng tồn tại trong hệ sinh thái vi mô này.

24.1.3. Chu trình dinh dưỡng trong môi trường nước Sinh vật phù du (plankton) là quần xã vi sinh vật sống trôi nổi trong nước, gồm 2 loại: thực vật phù du (tảo, vi khuẩn lam) và động vật phù du (vi khuẩn dị dưỡng, động vật nguyên sinh). H ầu hết chất hữu cơ trong lớp nước bề mặt có nguồn gốc từ hoạt động quang tổng hợp, chủ yếu do thực vật phù du. Vi khuẩn ỉam

Synechococcus

là thực vật phù du rất

phổ biến, m ật độ của chúng có thể lên tới 104 đến 105 tế bào/m L ở bề m ặt nước. Loại vi khuẩn lam siêu nhỏ này có thể chiếm tới

20

- 80% tổng số sinh khối thực vật phù du.

Sình vật 'bậc cao

I

Động vật phủ du

ĩ

Động vật nguyên sinh

- > v A

: ;' ĩ f c

CO2 và chất khoáng

Kitov Phospho

Hình 24.6: Sơ đồ vòng dinh dưỡng của vi sinh vật trong nước (màu đỏ). 613

Ở vòng này phần lớn chất hữii cơ là do thực vật phù du tổng hợp được qua quá trình quang hợp, sau đó được giải phóng dưới dạng chất hữu cơ hòa tan (DOM). Chất hữu cơ hòa tan được vi khuẩn sử dụng, chuyển thành chất hữu cơ không tan (POM). Động vật nguyên sinh sẽ tiêu hóa một phần vi khuẩn. Sau khi tiêu hóa, một phần chất dinh đường trong vi khuẩn và động vậí nguyên sinh bị khoáng hóa và quay trở ỉọi vòng dinh dưỡng vì sinh vật nhờ hoạt động của thực vật phù du. Do đó, chì một phần nhỏ chất d i n h dưỡng là sẵn có cho sình vật bậc cao sử dụng. Mũi tên chỉ hướng đi của chất dinh dưỡng và vị trí phân bố cùa sinh vật trong vòng, N - nitơ, p - photpho. (Theo Prescott-Harỉey-Kỉein, 2002). Trong quá trình sinh trưởng và cố định CƠ 2 thành hợp chất hữu cơ, thực vật phù du thu nhận nguồn nitơ và photpho từ nước. Thành phần chất dinh dưỡng ữ ong nước ảnh hưởng tới tỷ lệ cacbon: nitơ: photpho (C: N: P) trong thực vật phù du, tỷ lệ này gọi là tỷ lệ Redfield (đặt theo tên nhà sinh học biển A lfred c . Redfield). K hi chất dinh dưõng dồi dào, tỷ lệ C: N: p ở hầu hết thực vật phù du lã 106:16:1. Tỷ lệ R edíĩeld đóng vai trò quan trọng ừong theo dõi quá trinh động học của các chất dinh dưõng (nhất là sự khoáng hóa và sự cố định các chất) v à ừ o n g nghiên cứu các nhân tố hạn chế sinh trưởng vi sinh vật (nhất là sự m ẫn cảm của quá trình quang hợp đối với việc bổ sung nitơ, lưu huỳnh và sắt từ khí quyển vào nước). Khi thực vật phù du phát triển thì chất hữu cơ cố định được nhờ quá trình quang hợp sẽ đi vào vòng dinh dưỡng vi sinh vật (thực vật phù du còn được gọi là sinh vật sản xuất) (hình 24.6). V òng dinh dưõng vi sinh vật (m icrobial loop) là chu trình dinh dưỡng xảy ra trong quần thể vi sinh vật. Chất hữu cơ cố định được sau đỏ sẽ được sử dụng và trở lại dạng CO 2 v à chất khoáng. C ụ thể là chất hữu h òa cơ tan (DOM ) (axit am in , đường, axit hữu cơ, axit n u c le ic ...) do thực vật phù đu giải phóng ra sẽ là nguồn thức ăn cho vi khuẩn dị dưõng. N hư vậy, chất hữu cơ hòa tan đã được chuyển thành chất hữu cơ không tan (POM ) (các đại phân tử tham gia cấu trúc tế bào như thành tế bào, m àng tế b à o ... )• V i khuẩn dị dưõng lại là nguồn thức ăn của sinh v ật ăn m ồi có kích thước lớn hơn như động vật nguyên sinh, động vật đa bào. C O 2 và chất khoáng có nguồn gốc từ sinh vật ăn m ôi lớn sẽ quay trở lại vòng dinh dưỡng vi sinh vật nhờ hoạt động của thực vật phù dư. Sự quay vòng nhanh chóng của chất dinh dưỡng giữa sinh vật sản xuất và sinh vật bậc cao hơn như cá làm giảm đáng kể năng suất sinh học của hệ sinh thái. N ghiên cứu cho thấy ở m ôi trường nghèo đinh dưõng thi nguồn cacbon bị thất thoát lớn hơn là ờ m ôi trường phì dưỡng. V òng đinh dưỡng vi sinh vật hoạt động m ạnh mẽ nhất ứ ong m ôi trường hiếu khí vì ở đó có sự phát triển của cả vi khuẩn quang hợp và sinh vật bậc cao. Khi có quá nhiều chất hữu cơ trong nước, nước thườ ng có m ùi khó chịu do hoạt động cùa vi sinh vật kị khí, điều này ức chế sự tồ n tại củ a sinh vật bậc cao như cá. Liệu pháp chính là phải hạn chế nguồn

614

hữu cơ đầu vào, khôi phục đần tình trạng môi và cá.

tr ư ờ n g ,

tạo điều kiện sống sót cho động vật

Các khu nuôi động vật, đặc biệt là những nơi gần cửa sông và ven biển là m ôi trường có nguồn chất hữu cơ phong phú, do đó ảnh hưởng tới nồng độ oxi và hoạt động của vòng dinh dưỡng vi sinh vật. Hàng năm, ở các cơ sở nuôi gia súc bò, lợn và gia cầm ở M ỹ và các nơi khác trên Thế giởi thải ra khoảng í triệu tấn phân chuồng.

24.2. QUẰN XÃ VI SINH VẬT NƯỚC Nước cung cấp m ôi trưởng sống và hoạt động cho rất nhiều vi sinh vật (bảng 24.2). Đa dạng vi sinh vật nước do nhiều yểu tố tạo nên, bao gồm: loại chất dinh dưỡng, nồng độ chất dinh dưỡng, nồng độ oxi, sự có mặt của các chất oxi hoá và chất khử ừong môi trường nước. Thêm vào đó, khi ánh sáng xuyên tới vùng nước kị khí bên dưới sẽ tạo điều kiện cho m ột số vi sinh vật đặc biệt có khả năng quang hợp phát triển. Trong phần này sẽ trình bày về những trường hợp đặc biệt của vi sinh vật thích nghi với môi trường nước. B ản g 24.2:

S i n h v ậ t n h â n s ơ th ư ờ n g g ặ p ở m ô i tr ư ờ n g n ư ớ c b iề n v à n ư ớ c n g ọ t. ( T h e o P r e s c o tt-H a r le y -K ỉe ỉn , 2 0 0 2 )

Nhóm

Chi

Nhóm

Chi

Quang tự dưỡng

C h ĩo r o b iu m

Hóa tự dưỡng

B la s to b a c te r

C h ỉo r o h e r p e to n

C a u lo b a c te r

C h r o m a tỉu m

F le x ib a c te r

P e ỉo d ic ty o n

F le x ith r ix

T h io d ỉc ĩy o n

G e m m o b a c íe r

T h io p e d ia

H y p h o m ic r o b iu m L e u c o th r ix

Sphaerotiỉus Quang dị dưỡng

C h ỉo r ọ ỷ ĩ e x u s

Hóa dị dưỡng

B e g g ia to a

H e ỉio b a e te r iu m

G a ỉỉio n e ỉla

H e ìio th r ix

T h ìo p ỉo c a

R h o d o c y c lu s

T h io th r ix

R h o d o m ic r o b iu m

T h io v u h tm

R h o d o p seu d o m o n a s R h o d o s p ir ilỉu m

M ột trong những khám phá hấp đẫn nhất gần đây là sự tồn tại của m ột số lượng lớn vi khuẩn siêu nhỏ ừong m ôi trường nước, nhất là nhóm qua màng lọc có kích thước lỗ là 0,2 um).

S p h in g o m o n a s

S p h in g o m o n a s

(cỏ thể dễ dàng đi

có thể tích tể bào khoảng 0,08

Ịjm3, chiếm đại đa số trong môi trường nước (và trong đất), m ật độ của chứng có thể lên tới

615

10 12 - 10 13 tế bào/gam hoặc m L nước, chiếm m ột phần đáng kể trong tổng sinh khối trong m ôi trường. C húng có thể sử dụng nhiều loại hợp chất hữu cơ khác nhau và có thể phát triển trong m ôi trường nghèo dinh dưỡng. Do có kích thước nhỏ bé nên lượng thức ăn chúng tiêu thụ cũng rất ít. Đặc tính này giúp cho

có thể sống sót trong rất

S p h in g o m o n a s

nhiều loại m ôi trường khác nhau. M ột loại vi sinh vật biển khác thường khác là vi khuẩn

T h io m a r g a r ìta n a m ỉb ie n s is ,

tên của chúng có nghĩa là “Hòn ngọc lưu huỳnh của N am bia” (sulfiia pearl o f Nambia). N gười ta tìm thấy vi khuẩn này ở ngoài khơi N am ibia, bờ biển phía Tây của Châu Phi. Bên trong tế bào vi khuẩn chứa rất nhiều hạt lưu huỳnh dự trữ m àu trắng (hình 24.7). Vi khuẩn này được coi là vi khuẩn lớn nhất hành tinh. Đường kính trung bình của tế bào từ 100 - 300 (im (đôi khi lớn tới 750 (am). Vi khuẩn này sử dụng S ' 2 là chất khử và N O 3 ' là chất oxi hoá. Chúng thường sống trong lớp bùn giàu s 2' dưới đáy biển. Vậy chúng thu nhận nguồn NƠ 3 ‘ bàng cách nào? Khi xảy ra bão, lớp nước biển phía ừên chứa N O 3 ' sẽ trộn lẫn với lóp bùn ở đáy. Vi khuẩn này nhanh chóng thu lấy N O 3 " vào ừong tế bào và dự trữ trong các không bào lớn, các không bào này cỏ thể chiếm tới 98% thể tích tể bào. N ồng độ NO 3 ’ trong không bào có thế đạt tới 800 mM. Các hạt lưu huỳnh được phân bố ở m ép tế bào, nằm ngay dưới màng sinh chất. Khi không có bão, vi sinh vật sử dụng lượng N C V dự trữ. Các vi sinh vật đặc biệt này đóng vai trò quan trọng trong vòng tuần hoàn lưu huỳnh và nitơ tại môi trường sinh sống của chúng. C húng giúp loại bỏ các khí độc trong nước, tạo môi trường thân thiện cho cá v à các động vật biển khác phát triển.

H ìn h 2 4 .7 : V ỉ k h u ẩ n lớ n n h ẩ t h à n h tin h T h ỉo m a r g a r ita n a m ib ie n s ỉs , T ể b à o c ỏ đ ư ờ n g k i n h t r u n g b ì n h t ừ ỉ 0 0 - 3 0 0 fs m ( đ ô i k h i l ở n t ở i 0 , 7 5 m m ) , g ấ p 1 0 0 l ầ n k í c h th ư ớ c c ù a v i k h u ẩ n th ô n g th ư ờ n g . V i k h u ẩ n đ ộ c b iệ t n à y s ử d ụ n g

nõng lượng và 2002).

N O i

s2'

(ở lớp nước phía trên) là chất nhận điện tử.

t ừ lẳ n g c ặ n ở đ á y ỉà n g u ồ n

(T h e o

Prescott-Harìey-Kleỉn,

Hĩnh 24.8: Vi khuẩn Thỉopìoca. Thiopỉoca là sình vật khác thưởng, chủng có khả nâng thu nhận 2 nguồn vật chất có vị trí phân bố riêng biệt (S2' từ bùn và NO ị từ lớp nước bên trên) (a) Từng bó vì khuẩn nằm giữa bề mặt hiểu khí và bùn kị khí bên dưới; (b) Tể bào Thiopỉoca chứa các hạt lưu huỳnh ở đầu nhọn. (Theo Prescott-Harìey-Kỉein, 2002). M ột kiểu thích nghi quan trọng của vi sinh vật trong nước là có khả năng sử dụng các nguồn vật chất nằm ở các vị trí khác nhau hay ở cùng vị trí nhưng trong m ột thời gian rất ngán (trong cơn bão). M ột trong những vi khuẩn có khả năng thu nhận các nguồn chất nằm ở các khu vực khác nhau lả

T h io p ỉo c a

spp. Vi khuẩn

T h io p ỉo c a

sống thành bó

được

bao

quanh bời m ột vỏ chung (hình 24.8). Chúng được tìm thấy ở bài ngầm ngoài bờ biển Chile,

đây là vùng nước có nồng độ oxi thấp nhưng nồng độ NO 3' cao và tiếp giáp với bùn ờ đáy có nồng độ s 2’ cao. Tế bào vi khuẩn có đường kính từ 15 - 40 |am và dài khoảng vài cm, do vậy mà chúng cũng là m ột trong những vi khuẩn lcm nhất hành tinh, c ấ u trúc dạng sợi giúp chúng có thề trượt sâu xuống 5 -1 5 cm trong lớp bùn giàu s 2*bên dưới dể thu nhận s 2\ M ột số vi sinh vật lại thích nghi với nơi sống ở bề mặt nước. Đ ây là các vi sinh vật không chuyển động Sphaerotữus và chi

C a u ỉo b a c te r

và

bacteria) ưa khí như

L e u c o th r ix ,

H y p h o m ic r o b iu m . F le x ith r ix

và

và vi khuẩn sinh sản nhờ nảy chồi thuộc

Ngoài ra, m ột loạt các vi khuẩn trượt (gliding

F le x ib a c te r

có thể trượt trên bề m ặt nước để thu nhận

chất hữu cơ. Đây là các vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, mặc đù đôi khi chúng cũng có thể thực hiện quá trình phản nitrat hóa như trường hợp cửa

H y p h o m ìc r o b iu m .

N goài ra, vi khuẩn

cũng có thể hình thành các khuẩn lạc trên m ặt nước, tạo điều kiện cho các vi sính vật khác bám vào, dẫn đến sự hình thành màng sinh học có cấu trúc phức tạp. Vi nấm (m icrofungi) thường sống ở đất, quà, thức ăn; ngoài ra chúng còn sinh trưởng ừong môi trường nước ngọt và m ôi trường nước biển. Nấm sính bào tử động thích nghi với

617

m ôi trường nước, bao gồm C h y tr id ia ỉe s

O o m y c e te s

( sinh sàn vô tính bằng bào tử động 2 roi) và

(sinh sản vô tính bằng bào tử động 1 roi). N ấm

C h y ír id ia ỉe s

đóng vai trò quan

trọng trong m ôi trường vì chúng thực hiện quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ chết. Chúng cũng gây bệnh lùn ở khoai tây và ký sinh ở động vật không xương sổng, đặc biệt là giun tròn v à m uỗi. N goài ra nhiều nấm C h y tr ìd ỉa ỉe s

C h y tr ỉd ìa ỉe s

còn làm chết tảo. G ần đây nấm

được tìm thấy trong tế bào da của động vật lưỡng cư. Sự ký sinh này làm cho

ếch vả cóc bị chết ở nhiều nơi trên Thế giới như Mỹ, ú c , và Trung Mỹ. N ấm thuộc loài

I

B a tr a c h o c h y tr ỉu m d e n d r o b a tid is

C h y tr id ia le s

là m ột trong những nấm chủ yếu làm chết ếch.

T n r a c n a e tu m

A a to tp o a

L a m o n /ltn

O tỲ M tữ tp a r a

A c tín o ề p o r *

(a)

(b) H ìn h 2 4 .9 : C á c n ấ m c ó k h ả n ă n g h ìn h th à n h b à o t ử d ư ớ i n ư ớ c . N ấ m n ư ớ c n à y g i ữ v a i t r ỏ q u c m t r ọ n g t r o n g p h â n h ủ y c á c c h ấ t h ữ u c ơ p h ứ c tạ p , n h i r l á c â y

r ơ i ở s u ố t h ồ . C h ú n g h ìn h th à n h b à o t ứ đ ín h đ ặ c b iệ t (4 b à o t ừ đ in h c h ụ m đ ầ u ), (a ) c ấ u tr ú c b à o t ử đ ỉn h ; (b ) S ợ i n ấ m đ â m s â u v à o t r o n g l ả đ a n g b ị p h â n h ủ y . B à o t ử m ớ i đ ư ợ c h ìn h th à n h , g ià i p h ó n g v à o n ư ở c , b ả m v à o b ề m ặ t lá , l ặ p l ọ i c h u t r ì n h ( T h e o P r e s c o t t - H a r ỉ e y - K ỉ e i n , 2 0 0 2 ) .

M ột nhóm nấm quan trọng khác là nấm sợi có khả năng hình thành bào tử dưới nước gồm cả nấm thuộc nhỏm

H y p o m y c e te s .

N ăm 1942

c.T. Ingold đã tim thấy m ột loại nấm

hình thành cấu trúc bào tử đính đặc biệt (4 bào tử đính xếp chụm đầu (tetraradiate)) (hỉnh 24.9a). Sinh thái của các nấm nước này rất thú vị. Sợi nấm sinh dưỡng đâm sâu vào và phân hùy lá, bào từ đính được hình thành bên ngoài lá từ sợi sinh dưỡng (hình 24.9b). Sau đó bào tử sẽ phát tán nhờ nước, thường xuất hiện ở bọt nước bề m ặt. Khi tiếp xúc với ỉá

cây, bào tử bám vào và phát triển thành sợi nấm. Loại nấm có kiểu thích nghi độc nhất này có ý nghĩa lớn trong quá trình phân huỷ hợp chất hữu cơ, đặc biệt là lá cây. Các côn trùng nước thường chỉ ăn lá có nấm mọc bên ừong nghĩa là lá đã được sơ chế. M ột trong những phát hiện đáng chú ý là sự tồn tại của nhóm vì sinh vật đặc biệt đó là vi khuẩn cổ (Archaea). B ằng phương pháp so sánh chuỗi rARN (thành phần bảo thủ ữong quá trình tiến hóa), người ta xác định được có khoảng

1 /3

sinh vật phù du siêu nhỏ ở

đại dương (tế bào có kích thước nhỏ hom 2 Ịim) là vi khuẩn cổ. Vi khuẩn cổ là nhóm tể bào nhân sơ đặc biệt, bề ngoài giống vi khuẩn nhưng m ột số thành phần cấu tạo và rA RN lại gần vói tế bào nhân thật hơn. N hiều vi khuẩn cổ sống được trong điều kiện bất lợi như suối nước nóng, rãnh thủy nhiệt đáy biển, nơi có nồng độ muối cao và độ axit cao.

5|im H ìn h 2 4 .1 0 : P h á t h iệ n v i k h u ẩ n c ố b ằ n g p h ư ơ n g p h ả p s ử d ụ n g đ ầ u d ò . Đ ầ u d ò đ á n h đ ẩ u h ụ ỳ n h q u a n g đ ư ợ c s ử d y n g đ ể p h á t h iệ n v i k h u ẩ n c ố ( h ìn h tr ê n ) tr o n g tổ n g s ố t ế b à o n h â n s ơ ( h ì n h d ư ớ i ) ở m ẫ u n ư ớ c b i ề n s â u b ằ n g k ỉ n h h i ể n v i. ( T h e o P r e s c o t t - H a r l e y - K ỉ e i n ,

2002). V i khuẩn cổ và vi khuẩn phù du có mặt trong cả môi trường nước ngọt, nước biển và ở đảy đại dương. Sử dụng kỹ thuật FISH có thể phát hiện các nhóm vi khuẩn khác nhau trong cùng m ột mẫu. Trong kỹ thuật này, đầu dò (đoạn ngắn A D N ) đặc hiệu đổi với từng loại (vi khuẩn cổ và tế bào nhân sơ tổng số) được đánh dấu bởi các m àu huỳnh quang khác nhau, sau khi lai tại chỗ (in situ) với phân tử đích, đầu dò sẽ được phát hiện bằng các bước sóng kích thích khác nhau (hình 24.10). M ật độ vi khuẩn nhiều hom ở vùng bề m ặt, nhưng từ độ sâu

100

m ứ ở xuống đáy thì vi khuẩn cổ chiếm ưu thế (hình 24.11). N hìn chung, hơn

90% các tể bào bát m àu thuốc nhuộm và có thể được phát hiện bằng cách sử đụng các đầu dò và bước sóng khác nhau.

619

Hình 24.11: Sự phân bố của vi khuẩn cổ ớ đại diỉơng. Vi khuẩn cổ vò vi khuẩn phân bố tới đọ sâu 3400 m ở Thải Bình Dương, đáng chủ ý ĩà vi khuẩn cổ chiếm một phần lớn trong sổ các sinh vật phù du siêu nhó quan sát đirợc ở vùng ngay dirới bể một. (Theo Prescott-Harỉey-Kìein, 2002). Môi trường nước còn có chứa m ột ỉượng lớn virưt. Các virut có mật độ cao hơn 10 lần so với vi khuẩn và hầu hết virut sống trong nước là thực khuẩn thể. Các virut phù du là một phần quan trọng của quần xã vi sinh vật biển. Chúng có thể gây ánh hưởng tới hoạt động cùa vòng đinh dưỡng vi sinh vật và tham gia vào sự chuyển gen ngang giữa các vi khuẩn và điều khiển sự đ a dạng của quần xã vi sinh vật. Vi sinh vật luôn chuyển động v à luôn được bổ sung vảo môi trường nước. Vi sinh vật biển cỏ thể đi vào khí quyển v à quay trở lại biển tại vị trí khác nhờ sự chuyển động không ngừng của không khí. V i sinh vật ở sông có thể di chuyển hàng ngàn dặm từ vùng núi cao đến đại dương. Ở các hồ, sự tháo nước v à bổ sung nước có thể xảy ra. Ở đại dương, chuyển động v à tuần hoàn của nước có thể xảy ra qua hàng thế kỉ. V i sinh vật bám trên xác động vật và cá có thể chuyển động cùng cơ chất của chủng. Đôi khi, các xác động vật lớn như cá voi sẽ lắng xuống thềm đại dương sâu hàng ngàn mét. X ác cá voi nằm ở thềm đại dương, tạo cơ hội cho các động vật ăn thịt và vi sinh vật phát ưiển. Q uá trình phân hủy xác cá voi được chia làm nhiều giai đoạn (hình 24.12).

620

Vật chat có thế di chuyến đi rát xa trong môi trường mrớc. Chất dinh dường và vi sinh vật có thể được chuyển đến khu vực mà bình thường chúng không có mặt, tạo ra ốc đảo với quần xã vi sinh vật bị biến đổi. (ơ) Giai đoạn ăn thịt cùa sinh vật di cư (0 - 6 tỉ' ~Tg); (b) Giai đoạn phát triển cùa vi sinh vật

(a

hóa tự dưỡng ( 1- 2 năm); (c) Giai đoạn phái triền cùa sinh vật cơ hội. (Theo Prescott-Harley-Kỉein, 2002). Giai đoạn đầu là quá trình ăn thịt của các sinh vật di cư, kéo dài khoảng từ 0 2

6

tháng. Giai đoạn 2 kéo dài 1 -

nãm, trong đó s 2' được giải phóng từ xương tạo điều

kiện cho sinh trưởng của vi sinh vật hoá tự dưỡng. Sau 2 (b

3 năm, là giai đoạn phát triển m ạnh của các sinh vật cơ hội. Các giai đoạn này dẫn đến sự tăng lên liên tục lượng sinh vật ở đại dương, đặc biệt là cảc vi sinh vật ở các nơi khác. Bụi và lắng cặn từ các vùng đất ở xa liên tục rơi vào nirớc và băng, đây là kết quả của gió và bão. Thông qua các quá trình vận chuyển nhờ khí quyển, các vi sinh vật

(c

thường xuyên chuyển động xuyên suốt các vùng trên Trái

Hình 24.12: sổ phận cùa xảc cá voi ờ đáy đại dương.

đất, Nghiên cứu gàn đây cho thấy vi sinh vật phân lập trong các lắng cặn ở đáy biển sâu giống với vi sinh vật

sống trên bề m ặt đất. M ột ví dụ khác là bụi từ vùng Sahara của Châu Phi dẫn đến sự phá hủy của rặng san hô vùng Caribbea, điều này xảy ra là do nấm và tảo trong đất có khà năng trôi đạt trong khí quyển tới các vùng khác nhau trên Trái đất. 24.3. M Ô I T R Ư Ờ N G N Ư Ớ C B IẺ N Môi trường nước biển ở đại dương chiếm 97,2% tổng lượng nước toàn cầu. Đại dương có độ sâu khá lớn, phần nước ở độ sâu 1000 m trở xuống chiếm 75% thể tích đại đương. N ơi sâu nhất của đại dương là 11 000 m. Phần nước dưới độ sâu 100 m thường có nhiệt độ ổn định là 3°c. Cứ xuống sâu 10 m thì áp suất nước biển tăng 1 atm, ở nơi sâu nhất của đại dương áp suất có thể đạt tới sấp xỉ 1000 atm. M ôi trường nước biển còn được đặc trưng bởi độ m ặn (3,3 - 3,7%). Sự hòa ưộn và chuyển động của nưóc biển là đo thủy triều, dòng chảy, chuyển động nổi lên theo nhiệt độ, g ió ... Vi sinh vật sống trong môi trưèmg nước biển chịu tác động cùa áp suất, có thể thấy được mổi tương quan giữa vi sinh vật và áp suất (hình 24.13). M ột số vi khuẩn có khả năng

621

tồn tại ưong phạm vi dao động án suất từ 0 - 400 atm, tuy nhiên chúng thường phát triển tốt nhất ở áp suất khí quyển. N hiều vi khuẩn sinh truởng tố t ở áp suất cao v à được gọi là vi s in h v ậ t ư a á p

(barophile).

V i s in h v ậ t ư a á p tr u n g b ìn h

(moderat barophỉle) sinh trưởng tốt

nhất ở 400 atm , tuy nhiên chúng có thể tồn tại ở 1 atm.

V i s in h

vật ưa ảp

cực đoan

(extrem e barophile) chi có thể phát ừ iển ở áp suất cao. Sự thay đổi áp suất có ảnh hưởng rất lớn tới các quá trình sinh học của vi sinh vật như phân bào, lắp ráp tiên m ao, tổng hợp A D N , vận chuyển chất qua m àng, sinh tổng hợp p ro tein ... Các protein hình thành kênh vận chuyển vật chất ờ m ảng thường hoạt động có hiệu quả ở m ột áp suất nhất định. V i sinh vật biển còn chịu ảnh hưởng của ánh sáng. N gười ta chia đại dương thành 2 vùng: vùng có ánh sáng (có thể quang hợp) và vùng không có ánh sáng (không thể quang hợp). H ầu hết chất dinh dưỡng ở đại dương xuất hiện trong vùng nước từ bề m ặt tới độ sâu 300 m. Đây là vùng ánh sáng có thể xuyên tới, ở đây có sự phát triển của thực vật phù du (tảo và vi khuẩn lam). Sinh khối thực vật phù du từ từ rơi xuống đáy đại dương trông giống như “tuyết biển”. C huyến đi này của thực vật phù du thường kéo dài ít nhất m ột tháng. Chỉ có 1 % chất hữu cơ cỏ nguồn gổc quang tổng hợp tới được thềm đại dương, phần còn lại bị phân huỷ ứ ong quá trình roá xuống. N guồn dinh dưỡng tại đáy đại dưomg rất hạn chế vì vậy đây là vùng tồn tại các vi sinh vật có khả năng phát triển trong điều kiện nghèo dinh dưỡng.

E 3

‘S ‘p Q

H ìn h 2 4 .1 3 : S ự p h â n b ố c ủ a v i s in h v ậ t v à á p s u ẩ t ở m ô i tr ư ờ n g b iể n , S ự p h â n b ố c ủ a v i s in h v ậ t d ự a v à o k h ả n ă n g c h ịu ả p s u ẩ t ở c á c đ ộ s â u k h á c n h a u : c h ịu áp, u a á p , c ự c ư a á p . Ả p s u ẩ t c a o n h ấ t là Ị 1 0 0 a tm ở n ơ i s â u n h ấ t c ủ a đ ạ i d ư ơ n g . Ả n h s ả n g c h i x u y ê n q u a ĩ ở p n ư ở c m ò n g ở v Ù T ỉg s á n g . ( T h e o P r e s c o t t - H ơ r ỉ e y - K l e i n , 2 0 0 2 ) .

622

Chu trình cacbon ở trong môi trường biển vẫn chưa được nghiên cứu kỹ, tuy nhiên một điều rõ ràng là vi sinh vật có ảnh hưởng lớn tới chu ừình cacbon ở đây (hỉnh 24.14). Phần lớn cacbon hữu cơ tan có tuổi trung bình dự đoán là hơn 1000 năm. Chẩt hữu cơ ở đáy biển cũng có độ tuổi tương tự. Ngoài cacbon hữu cơ tan, m ột lượng khổng lồ cacbon tồn tại dưới dạng tinh thể m etan hydrat trong lắng cặn đại dương. Ở thềm đại dương có độ sâu dưới 500 m, ừong m ôi trường nhiệt độ thấp và áp suất cao, phân tử nước kết tinh tạo dạng

tổ

ong bền vững và khép kín để giữ khí metan bên trong,

cỏ

tới 10 000

tỉ X

1000 kg

cacbon tồn tại dưới dạng kết tính metan hydrat trên toàn Thế giới (gọi là m ỏ m etan hydrat), gấp 80 000 lần nguồn khí tự nhiên dự trữ hiện nay trên Thế giới. Chu trình nitơ và lưu huỳnh cũng đóng vai trò quan trọng ứong m ôi trường nước biển và tác động lớn đến các quá trình ở mức độ toàn cầu. Hàm lượng nitơ trong nước biển thường dao động, ở vùng nước biển chứa nồng độ oxi thấp thì sẽ xảy ra hiện tượng phản nitrat hóa (sử dụng N O 3 ' và N O 2 ' là chất oxi hỏa và giải phóng nitơ vào khí quyển) đẫn đến làm giảm tỷ lệ N: p ừong nước. Ngược lại, sự cố định nitơ xảy ra m ạnh mẽ sẽ làm tăng lượng nitơ trong nước. Điều này cho thấy nitơ chứ không phải photpho đã hạn chế các hoạt động sinh học trong m ôi trường biển. Chu trình lưu huỳnh ở đại dương cũng có tác động lớn đến các quá ư ình ở m ức độ toàn cầu. Dimetylsulfite (DM S), được tổng hợp bởi tảo, có thể được giải phóng vào khí quyển và chiếm 90% tổng sổ hợp chất chứa lưu huỳnh bay hơi trong chu trình. Khi D M S bị oxi hoá thì sản phẩm cuối của chúng có thể ảnh hưởng đến độ axit của khí quyển cũng như nhiệt độ Trái đất và sự hình thành mây. N hư trình bày ở trên, tinh thể metan hydrat được tìm thấy ở điều kiện nhiệt độ thấp và áp suất cao ở nhiều đại dương. M ột số vi khuẩn ưa lạnh có khả năng sử dụng tinh thể metan hydrat, sau đó lại là nguồn thức ăn cho

H e s io c a e c a m e ta n ic o ỉa .

Trong quần xã vi

khuẩn phức tạp ở đại dương, vi khuẩn cổ là sinh vật thực hiện quá trinh chuyển hoá CH 4 trong điều kiện nồng độ hydro thấp và cỏ m ặt SO 4 2'. Đây là quá trinh phần hủy CH 4 (ngược vởi quá trinh sinh C H Ạ M ột phần lớn m ôi trường nước biển được bao phủ bởi băng. Ở vùng địa cực vào m ùa đông thì lớp băng này bao phủ 7% bề mặt Trái đất. Vi sinh vật có khả năng sinh trưởng ở vùng nằm giữa băng và nước biển (hình 24.15). N gười ta phát hiện thấy m ột lớp vi sinh vật ở phần dưới tảng băng nơi tiếp giáp với nước biển. Các vi sinh vật có m ặt ở đây thuộc các chi P s y c h r o fle x u s , ỉc e o b a c te r , P o ỉib a te r

và

P o ia r o m o n a s , M a r in o b a te r ,

P s y c h r o m o n a s a n ta r tic u s .

623

Khíquyỉn

Hấp thu và giâĩ phóng co* Thời gian irở tại khi quyển Ngày-tháng

K ẵm - th ế kỳ

H ì n h 2 4 . 1 4 : C h u t r ì n h c a c b o n ở đ ạ i d it ơ n g . V i s in h v ậ t ở đ ạ i d ư ơ n g tá c đ ộ n g đ ế n c h u tr ìn h c a c b o n to à n c ầ u v à m ố i liê n h ệ g iữ a đ ạ i d ư ơ n g v à k h i q u y ế n . H ầ u h ể t s ụ b i ể n đ o i c ù a c a c b o n x ả y r a ở v ù n g n ư ớ c b ề m ặ t, c h ấ t h ữ u c ơ k h ô n g t a n ( P O C ) , c h ẩ í h ữ u c ơ h ò a t a n (D O C ') v à m e t a n h y d r a t ỉ à n g u ồ n c a c b o n c h í n h ờ đ ợ i d ư ơ n g . Đ ạ i d ư ơ n g c ò n c h ứ a H C O / v à C O ĩ h ò a ta n c ỏ n g u ồ n g ố c t ừ k h i q u y ể n . M e ta r ị h y d r a t k íc h th íc h s ự p h á t tr iể n c ủ a m ộ t s ố d ạ n g v i s in h v ậ t v à s â u b ă n g n h iề u c h â n . (T h e o P r e s c o tu H a r le y - K ỉe in , 2 0 0 2 )

Do Sự bổ sung chất hữu cơ từ đất liền nên sổ lượng vi sinh vật tổng số ở vùng bờ biển nhiều

hơn

là ở vùng giữa biển. Sự gia tăng dân số và m ở rộng thành thị tại các khu

vực ven biển đã dẫn đến hiện tượng ô nhiễm. Ở vùng nước ven biển (như biển Baltic, cừa biển Long Island Sound, vịnh Chesapeake và Đ ịa Trung Hải), do hạn chế trong hòa ưộn với các phần khác cùa đại dương nên có dấu hiệu tích lũy nhiều chất hừu cơ v à vi sinh vật có hại. Điển hình là quá trình ô nhiễm ảnh hưởng đển động vật có vỏ ở các vùng biển bị đô thị hóa. Vài năm trước đây, động vật có vỏ có thể đánh bát được khá đễ dàng sau những trận mưa. Tuy nhiên hiện nay thi cần phải chờ khoảng 1 tuần sau m ưa mới có thể đánh bắt

đê loại bỏ các vi sinh vật gây ô nhiễm. Điều này tác động đển đời sống của cư dân sống nhờ đánh bắt động vật có vỏ.

Hình 24.15: Vi sinh vật trong lớp băng ở biển. Thỏi băng lấy từ Nam Cực tiếp giáp với nước biển. Dài tối (mũi tên) là quần xã vi sinh vật. (Theo Prescott-Harỉey-Kỉein, 2002). Ở vịnh M exico, tại châu thổ sông M ississippi, việc giải phóng chất dinh dưỡng từ các thành phố vào sông thúc đẩy sự phát triển của vi khuẩn và làm cạn kiệt oxi. Điều này tạo nên “vùng chết”, đó là vùng không có oxi, diện tích vùng này rất lớn có thể lớn hơn bang New Jersey của Mỹ. Khi nồng độ oxi giảm xuống, động vật có vỏ không thể sống sót, dẫn đến phá huỷ nền kinh tế của các vùng sổng nhờ vào nuôi hải sản. M ột vấn đề khác liên quan đến nước biển là sự phát triển m ạnh mẽ của tảo hay còn gọi là hiện tượng “nở hoa” của tảo. Hiện tượng này xảy ra trong điều kiện nước phì dưỡng và khí hậu phù hợp (ẩm, nắng, yên tĩnh). Trong điều kiện nêu trên thi tảo hoặc vi khuẩn lam phát triển mạnh mẽ dẫn đển hiện tượng nở hoa (hiện tượng này thường xuất hiện theo chu kỳ ở biển và hồ). Khi xảy ra sẽ làm giàm chất lượng nước vỉ nưỏc thường có váng, mùi khỏ chịu và không còn thích hợp cho mục đích giải trí và thậm chí còn nguy hiểm cho đánh cá, du thuyền và bơi lội. Trường hợp xấu nhất là sự nở hoa của tảo độc, còn gọi là “thuỷ triều đỏ” (red tit). Sự xuất hiện của thuỷ triều đỏ ở Thái Bình D ương ngoài bờ biển trung tâm California đã làm cá heo bị chết hàng loạt. Loại tảo chính gây nên sự thiệt hại lớn cho động vật biển này là

P s e u d o - n i t z s c h i a (,h ì n h 2 4 . 1 6 ) .

Động vật trung gian chính là cá cơm

biển. Cá cơm ăn tảo, tảo chứa lượng lớn chất độc thần kinh neurotoxin, axit domoic. Cá heo ăn phải cả cơm nhiễm độc sẽ bị chết.

625

Hình 24.16: Tảo Pseudo-nitzschia. Ngoài hiện tượng thủy triều đỏ, tảo còn gây ra m ột sổ vấn đề khác. V í dụ điển hình là loại tảo có roi

P fie s te ia p is c ỉc ỉd a

(hình 24.17), loại tảo này tiết độc tố gây tê liệt và chết cá

ờ vùng biển từ tiểu bang M aryland sang phía N am cùa b ờ biển Đại Tây D ương của Mỹ. Ngoải ra, nếu người tiếp xúc với độc tố này sẽ bị chóng m ặt và m ất trí nhớ.

p fle s te ia

có

m ột chu trình sống vô cùng phức tạp, bao gồm 24 giai đoạn. Ổ giai đoạn té bào sinh dưỡng có roi (flagellated vegetative cell), khi cá bơi về phía tảo, tảo sẽ tấn công cá. ra ít nhất

2

chất rất độc:

1

chất làm cá bị choáng,

1

P fie s te ia

sinh

chất gây thương tích cho cá (hình

24.18). Loại tảo có roi này trư ớc đây sử dụng các loại tảo khác là thức ăn chính, nhưng đến nay thì lả kẻ tiêu diệt cá, lươn, cua, v à các động vật khác. Việc tăng nồng độ chất dinh dưỡng trong nước được cho là nguyên nhân làm tăng sự phát triển của tảo.

H ì n h 2 4 .1 7 : T ả o p / i e s t e i a p is c ic id a .

626

Hình 24. ỉ 8: Thương tích ớ cá do Pfiesteia gây nên.

vết thitơng ở cả mòi dầu (menhaden) ỉà do sự ký sinh cùa tảo Pfiesteia pìscicida.

Chú ý:

người cũng bị mẫn cám với chất độc, chất độc gây chóng mặt, mẩt tri nhớ vò hư hòng chức năng vận động (cho nên cần phải đeo găng tay dầy). (Theo Prescott-Hctrley-Kỉeìn, 2002). Vi sinh vật trong nước biển còn chịu tác động của quá trinh chuyển động của không khí ở mức toàn cầu. Sự chuyển động cùa bụi đất trong khí quyển v à các hoạt động sản xuất công nghiệp ảnh hường đến sinh trưởng và tỷ lệ Redfield của thực vật phù đu. Ở phía Bắc Thái Bình Dương, nguồn sắt trong nước rất hạn hẹp, nguồn sắt được bổ sung vào nước qua quá trình sa m ạc hoá hay còn gọi là thoái hoá đất (desertification) và các cơn bão bụi ở vùng trung tâm Châu Á. Ngược lại, ở phía Bắc Đại Tây D ương thì nguồn nitơ bị hạn chế, nguồn ni tơ được bổ sung từ khí quyển do hoạt động của con người. Tỷ lệ N : p ở vùng nước đáy biển Bắc Đại Tây D ương đang tăng lên và làm thay đổi tỷ lệ Redfield của thực vật phù du.

24.4. MÔI TRƯỜNG NƯỚC NGỌT Môi trường nưỏc ngột nằm ừong đất liền tồn tại ở hai dạng chính: lỏng và đỏng băng. Môi trường đóng băng thường được coi như là sa mạc của vi sinh vật, tuy nhiên điều này không chính xác vì m ột số loại vi sinh vật vẫn có khả năng phát triển. M ôi trưởng lỏng rất đa dạng về đặc tính vật lý và hỏa học, điều này ảnh hưởng đến các thông số của vi sinh vật sổng ở đó. M ồi trường nước ngọt dạng lỏng được chia thành 2 loại: động (sông, suối, cửa sông, kênh) và tĩnh (ao, hồ, đầm lầy, hệ thống nước đóng kín). M ôi trường nước ngọt khác với m ôi trường nước biển ở rất nhiều điểm.

24.4.1. Hồ và ao Hồ và ao là m ôi trường nước ngột thuộc hệ tĩnh, đa dạng về độ sâu (có thể từ vài m ét đến 1000 m) và diện tích bề m ặt (có thể từ vài m 2 đến 100 000 m2). N goài ra hồ và ao còn da dạng về dòng chảy của nước, sự tích lũy chất dinh dưỡng, sự sẵn có cùa nguồn ánh sáng, sự hòa trộn của các cột nước. H ồ được chia thành 2 khu vực chính: gần bờ v à giữa

627

hồ. M ặc dù nước ở hồ là dạng tĩnh, tuy nhiên vẫn nhận thấy quá trình động học của hồ đo dòng chảy vào và ra, sự hòa trộn do gió và do thay đổi nhiệt độ. M ột số hồ chứa nước mặn như Great Salt Lake ở Utah. M ột sổ hồ có thành phàn hóa học rất đặc biệt như giàu M gSƠ 4 , N a 2 B 4 Ơ 7 hay N aH C Ơ 3 . Ở phần này chù yếu tập trung vào các hồ nước ngọt thường gặp. D inh dưỡng trong m ỗi hồ là khác nhau, m ột số hồ nghèo chất dinh dưõng còn số khác thì giàu chất đinh dưỡng (hình 24.19). Hồ nghèo dinh dưỡng thì nước tồn tại ờ dạng hiếu khí quanh năm , sự thay đổi nhiệt độ theo m ùa không dẫn đến hiện tượng phân lớp theo nồng độ oxi. N gược lại, ở hồ giàu dinh dưỡng, chất hữu cơ kểt tủa xuống đáy. N ước ờ hồ này được phân lớp theo nhiệt độ, lớp nước ấm bên trên là vùng hiếu khí còn lớp nước lạnh bên dưới là kị khí. G iữa

2

lớp nước này tồn tại m ột vùng có nhiệt độ thay đổi rất

nhanh gọi là vùng biến nhiệt (thermocline). Tại đây ít khi xày ra sự hòa Ưộn giữa 2 ỉớp nước. Vào m ùa xuân và thu, lớp nước hiếu khí bên trên và lớp nước kị khí bên dưới sẽ thay đổi vị trí do nhiệt độ và ừọng lượng riêng thay đổi, dẫn đến có hiện tượng hòa trộn giữa

2

lớp nước. Sau khi xảy ra sự hòa trộn thì các vi khuẩn và tảo có khả năng di chuyển theo các cột nước và tìm môi trường sống thích hợp nhất cho chúng. Khi bổ sung m ột lượng lớn chất dinh dưỡng vào hồ, hiện tượng phì dường xuẩt hiện và thúc đẩy sự sinh trường của thực vật, tảo và vi khuẩn. Trong hồ, nguồn nitơ và photphat luôn bị hạn chế nên việc bổ sung hợp chất chứa nitơ và photphat vào hồ sẽ gây ảnh hường lớn tới hệ thống nước ngọt này. Tùy thuộc vào thể tích của hồ v à tốc độ bổ sung chất dinh dưỡng m à thời gian để hồ trờ thành giàu dinh dưỡng có thể rất nhanh hoặc sau vài thế kỷ.

(b)

628

Hô có nông độ dinh dưỡng khác nhau, từ nghèo đến rất giàu dinh dưỡng, (a) Hồ nghèo dinh dưỡng có nông độ oxi bão hòa và sỏ lượng vị sinh vật hạn chế; (b) Hồ giàu dinh dưỡng chia 3 ỉởp: lớp nước hiếu khí, lớp nước kị khí vò lẳng tụ ờ đáy. Vỉ sinh vật quang dưỡng hcu huỳnh sổng ớ lớp nước kị khỉ. (Theo Prescott-Harỉey-Kỉem, 2002). Neu bổ sung photphat vào nước nghèo dinh dưỡng, vi khuẩn lam sẽ là vi khuẩn chính trong quá trình tích lũy chất dinh dưỡng, thậm chí ngay cả khi không bổ sung nguồn nitơ. Đó là do m ột số vi khuẩn lam, nhất là A n a b a e n a ,

N o s to c

và

năng cố định nitơ ờ điều kiện hiếu khí. Ngoài ra, vi khuẩn lam

C y lin d r o s p e r m u m ,

O s c iỉỉa to r ìa

có khả

có khả năng sử

dụng H2S là chẩt cho điện tử để quang dưỡng, do vậy chúng có thể cố định nitơ ngay cả trong điểu kiện kị khí. Thậm chí ngay cả khi nitơ và photphat cùng được bổ sung thì vi khuẩn lam vẫn có khả năng cạnh tranh với tảo.Vi khuẩn lam hoạt động tốt hơn ờ pH kiềm (8,5 - 9,5) và ở nhiệt độ cao (30 - 35°C). Tảo nhìn chung thích họp vói pH trung tính và nhiệt độ thấp hom vi khuẩn lam. Vi khuẩn ỉam cũng có thể làm tăng pH môi trường bằng cách sử dụng c c >2 vói tần suất cao dẫn đến môi trường không còn phù hợp cho tảo phát triển. Ngoài cơ chế nêu trên, vi khuẩn lam còn cạnh tranh vói tảo bằng nhiều cơ chế khác. Nhiều vi khuẩn lam sản sinh hydroxamat, chất này sẽ bám vào sắt làm cho chất khoáng quan trọng này sẽ không còn sẵn có để phục vụ sự sinh trưởng cùa tảo nữa. Vi khuẩn lam còn có khả năng kháng các sinh vật ăn mồi vì chúng có khả năng sinh chất độc. Ngoài ra, một số vi khuẩn lam tổng hợp hợp chất gây mùi ỉàm giảm chất lượng nước uống. Cả vi khuẩn lam và tảo đều đóng góp phần rất

lớ n

vào hiện tượng “nở hoa”, nhất là ở

hồ giàu đinh dưỡng. H iện tuợng này có thể kéo dài trong nhiều năm cho đến khi chất dinh dưỡng bị lấy ra khỏi hồ hoặc lắng xuống đáy. Để cải thiện tình huống này có thể tiến hành nạo vét, lấp kín lớp kết tủa hoặc bổ sung chất gây lắng tụ để thúc đẩy quá trình kết tụ xuống đáy. 24.4.2. S ô n g v à s u ố i Sông và suổi là m ôì truờng khác với hồ và ao vì sự chuyển động của các thành phần trong đó chủ yếu là theo chiều ngang. Sự phân lớp theo chiều thẳng đứng là rất hạn chế. Sông thường không sâu, chi vài mét, tuy nhiên có m ột số sông có vùng trũng sâu tới 50 m. Thể tích của sông và suối phụ thuộc vào mùa. Hầu hết vi sinh vật ở m ôi trường này tồn tại trên mặt nước, chỉ trừ m ột số sông lớn thì vi sinh vật có thể tồn tại lơ lửng ừong nước. Chất đinh dưỡng ừ ong sông và suối có nguồn gốc từ hoạt động quang hợp của các vi sinh vật tự dưõng {hình 24.20a) hoặc từ bên ngoài như từ vùng đất ở

2

bên bờ, lá cây, và các chất hữu

cơ từ bên ngoài rơi vào (hình 24.20b). Vi sinh vật hoá hữu cơ dưỡng ờ sông và suối sẽ chuyển hoá chất hữu cơ và cung cấp năng lượng cơ sở cho hệ sinh thái. Trong hầu hết

629

trường hợp, lượng chất h ữ u cơ được bổ sung vào sông và suối thường không lớn hơn năng lực oxi hoá chất hữu cơ của vi sinh vật, đo đó sông và suối luôn duy trì trạng thái sạch. N ăng lực chuyển hoá chẩt hữư cơ của vi sinh vật ờ sông và suối là có hạn. Nếu đưa quá nhiều chất h ữ u c ơ vào sông và suối sẽ dẫn đến hiện tượng nước thỉếu oxi. H iện tượng này xảy ra ở sông và suối chảy qua vùng thành phố v à khu nông nghiệp. V iệc đưa chất thải sinh hoạt chưa được xử lý hoàn chỉnh hoặc chất dinh dưỡng từ m ột vị trí nhất định nào đó vào sông dẫn đến ô nhiễm , thì ô nhiễm này được gọi là ô nhiễm từ điểm nguồn (point source o f pollution). V iệc bổ sung các chất hữu cơ từ các điềm này sẽ gây ra những thay đổi rất đặc trưng và đoán trước được về số phận của quần xã vi sinh vật và nguồn oxi (hình 24.21). V í dụ điển hình của ô nhiễm không từ điểm nguồn (non-point source o f pollution) là ô nhiễm do dòng chảy từ cánh đồng và trại nuôi, đó là hiện tượng “n ở hoa” của tảo ờ m ôi trường nước giàu dinh dưỡng.

H ì n h 2 4 . 2 0 : N g u ồ n c h ấ t h ữ u c ơ ở s ô n g v à s t iổ ì . C h ẩ t h ữ u c ơ c ỏ t h ể đ ư ợ c tổ n g h ạ p tr o n g n ư ớ c h a y t ừ b ê n n g o à i đ ư a v à o . (a ) N g u ồ n h ữ u c ơ t ự t ổ n g h ợ p tr o n g n ư ớ c n h ờ q u ả tr ìn h q u a n g h ợ p ; (b ) N g u ồ n h ữ u c ơ t ừ b ể n n g o à i đ i v à o s ô n g v à s u ố i. (T h e o P r e s c o tt-H a r le y -K ìe ìn , 2 0 0 2 ).

K hi hạn chế nguồn chất dinh dưỡng bổ sung, tảo sẽ sinh trưởng và sử dụng khoáng chất được giải phóng từ các chất hữu cơ. T ảo thực hiện quang hợp và giải phóng oxi vào ban ngày và tiến hành hô hấp vào ban đêm , dẫn đến hiện tượng thay đổi nồng độ oxi trong ngày. Cuối cùng thi lượng oxi đạt trạng thái bão hoà, nghĩa là két thúc quá trình tự làm sạch.

Song song với việc bổ sung chất dinh dưỡng, việc loại silic (Si) ra khỏi m ôi trường này thông qua việc xây đập hoặc nạo vét đáy sông ỉàm ảnh hưởng đến hệ sinh thái ờ sông, suối. Điển hình như việc xây dựng đập tại “cổng sắt” trên sông D anube (nằm trên biển Black Sea 600 dặm) dẫn đến việc giảm lượng silic xuống còn 1/60 của lượng silic trước đây. Việc giảm lượng silic dẫn đến kiềm chế sinh trưởng của tảo silic vì tỷ lệ silic/NCV bị thay đổi (silic cần cho sự hình thành vỏ của tảo silic). Chính vì vậy, tảo silỉc ở biển Black Sea không thể phát triển và cố định chất dinh dưỡng. Kết quả là lượng N O 3 ' tăng 600 lần và xuất hiện sự phát triển không ngừng của tảo độc. Vì thế, sự cân bằng của sông có thể bị thay đổi m à khó có thể tính trước được khi xuất hiện các con đập (cỏ hcm 36 000 con đập trên Thế giới và còn nhiều nữa đang được xây dựng ở Trung Quốc), đẫn đến tác động lên các hoạt động của vi sinh vật nước và foàn bộ hệ sinh thái. Chính vì ảnh hưởng xẩu của các con đập dối với hệ sinh thái nên người ta đang cố gắng làm thùng cấu trúc này để các quá trình tự nhiên ữong nước xảy ra bình thường, tạo điều kiện cho cá di cư lên bên ừên, nơi m à chúng mất cơ hội tồn tại hàng thập kỷ nay.

Nguồn nhiễm

Oxi tan % bão

Đảp ứng của vi sinh vật

Sính trưởng của vỉ sinh dịđưOng Giải phỗng chất khoáng Sinh trưởng của ’táo

Dòng chảy (thời gian/khoảng cách so với điểm nguồn)

H ì n h 2 4 .2 1 . Đ ư ờ n g c o n g o x i h ò a t a n . K h i b ể s u n g c h ấ t d in h đ ự ỡ n g , v i sin h v ậ í v à h o ạ t đ ộ n g c ù a c h ủ n g c ó th ể tạ o g r a d ie n n ồ n g đ ộ th e o k h ô n g g ia n v à th ờ i g ia n . V i d ụ đ iể n h ìn h là đ ư ờ n g c o n g đ i x u ổ n g c ù a o x ì g â y r a d o c h ấ t th ả i h ữ u c ơ đ ư ợ c đ u a v à o h ệ th ố n g s ô n g s ạ c h . S a u g ia i đ o ạ n t ự là m s ạ c h , q u ầ n x ã q u a n g d u & n g s ẽ p h á t tr iể n m ạ n h m ẽ v à h ìn h th à n h s ự th a y đ ổ i n ồ n g đ ộ

OXK ( T h e o

P r e s c o tt-H a r ỉe y -K ỉe in , 2 0 0 2 ).

24.4.3. Vi sinh v ật tro n g lớp băng nước ngọt N ước ngọt là thành phần của sông băng và những tảng băng lớn ở vùng Bắc Cực và N am Cực. M ặc dù cách xa nơi ở của con người, khu vực này cũng đóng vai trò quan trọng vì là nơi sống của vỉ sinh vật, đảng chủ ý nhất là các hồ sâu đỏng bâng ở vùng Bắc Cực. M ột ví đụ quan trọng là hồ M cM urđo Dry Valley, có lớp băng dày 3 -

6

m, lắng tụ do gió

m ang tới nằm trong các lớp băng khác nhau. Khi mùa hè tới, băng tan, vùng ỉắng tụ là nơi vi sinh vật phát triển. Con người rất quan tâm đến vi sinh vật sống trong băng ờ Bẳc Cực và N am Cực. Liệu chúng là những quần thể cô lập và khác biệt? M ột trong những nơi sống đóng băng đáng chú ý là ở m ặt hồ V ostok ở Nam Cực. Lớp băng dày 3600 m năm bên ừên có tuổi đời 420 000 năm , điều này chứng tỏ hồ đã nằm dưới lớp băng này từ 500 000 đến 1 000 000 năm. J ừ đấy xuống sâu 120 m băng nữa mới là hồ. Hồ có kích thước tương tự như hồ O ntario, nhưng sâu hơn, độ sâu của hồ là 500 m. Các nhà khoa học đang tích cực tìm kiếm và nghiên cứu vi sinh vật sống trong môi trường đóng băng nước ngọt lâu đời nảy. 24.5. N Ư Ớ C VÀ S ự T R U Y É N B Ệ N H Nước là môi trường tiềm ẩn nhiều tảc nhân gây bệnh, vấn đề này đã được con người nhận thức từ rất lâu. D ần chứng là vua A lexdander (356-323 trước CN) đã dùng bình bàng bạc để đựng nước, do đó có thể phòng tránh hiệu quả m ột số bệnh có nguồn gốc từ nước. Ngoài ra, lịch sử còn ghi chép lại về trường hợp tác nhân gây bệnh trong nước uổng gây ảnh hưởng xấu tới sửc khỏe cùa người nông dân thời đế chế La m ã (27 trước CN). M ặc dù nhận thức về sự có m ặt của tác nhân gây bệnh trong nước đã được phả cập từ rất lâu, nhưng hiện nay nước thải chưa qua xử lý vẫn thường xuyến được đưa vào nguồn nước mà con người sử dụng. Đê bảo vệ sức khỏe cộng đồng, nước thải cần được tiến hành xử lý trước khi đưa vào nguồn nước tự nhiên.

24.5.1. Tác nhân gây bệnh trong nước và quá trình lọc nước Vi khuẩn và động vật nguyên sinh là tác nhân gây bệnh chủ yếu có m ặt trong nước. Khi chúng ta sử dụng nước chưa xử lý hoàn chỉnh cho mục đích giải trí (như bể bơi, công viên n ư ớ c...) hoặc ăn đồ hài sản chưa nấu chín thì sẽ có nguy cơ bị nhiễm bệnh. Bệnh truyền nhiễm từ nước có thể gây hậu quả nghiêm trọng cho cộng đồng, nhất là những người bị bệnh thoả hiệp m iễn dịch (im m unoìogicaỉly com prom ised individual).

24.5.1 A. Tác nhân gây bệnh tồn tại trong nước M ột số tác nhân gây bệnh quan trọng có m ặt trong nước được trình bày ở bảng 24.3. Tác nhân gây bệnh có thể là vi khuẩn, virut, hoặc động vật nguyên sinh ( G i a r d i a , C r y p t o s p o r i d i u m , C y c l o s p o r a . . .) M ột bệnh nghiêm trọng do động vật nguyên sinh gây ra làm cho T hế giới quan tâm là bệnh viêm m àng não sơ cap đo am ip (prim ary amebic m eningoencephalitis). Thủ phạm của

632

bệnh này là N a e g ỉ e r i a f o w l e r i , N . a e r o b i a và N . i n v a d e s . Khi nhiễm vào cơ thể, chúng sẽ tân công vào hệ thân kinh trung ương. Bệnh này thường xuyên xuất hiện ở trẻ em và thanh niên, đôi tượng hay đi bơi ở hô hoặc hay đi lướt ván. Sau khi xâm nhập vào cơ thể qua đường mũi, động vật nguyên sinh sẽ tiến tới não và gây viêm não. Bệnh có nguy cơ tử vong. Động vật nguyên này phát triển tốt ở nước ấm và nước nóng từ nhà máy công nghiệp. B ảng 24.3:

T á c n h â n g â y b ệ n h tồ n tạ i tr o n g n ư ớ c

( T h e o P r e s c o tt-H a r le y -K le in , 2 0 0 2 )

Sinh vật Vi k luân Aeromonas hydrophiỉa Campylobacter

Helicobacter pylori L e g io n e lla

pneumophila Leptospira Mycobacterium P seudom onas

Nơi sống

Đặc điểm đặc ỉrưng

Tự do

Liên quan đến bệnh viêm dạ dày-ruột, viêm mô bào ... Nguyên nhân chính của bệnh tiêu chảy, thường có mặt ở gia cầm chế biến, đặc trưng là vi ưa khí (microaerophile) Có thề gây viêm dạ dày typ B, loét dạ dàymột, ung thư tuyến dạ dày Phát hiện thây ờ cột ông làm lạnh, máy bay hơi nước, máy cô đặc, vòi hoa sen ... Gây chảy máu, vàng da Quả trình điều trị phức tạp Gày nhiễm tai và các bệnh liên quan cho người đi bơi Phổ biến ờ nhiều loại nước

Chìm, động vật

Tự d o ,... Tự do, động vật nguyên sinh Động vật Động vật, tự do Tự do

a e r u g in o s a

Salmonella enteriditis

Đường tiêu hỏa của động vật Tự do Tự do ở nước ven biển

Vibrio cholera Vibrio parahaemolyticus Động vật, môi trưởng Yersinia enterocolitica Động vật n ịuyên sinh Khu vực thải bùn cống Acanthamoeba Cryptosporidium

Nhiều loài động vật nuôi và hoang dẳ

C y c lo s p o r a

N ư ớc,...

c a y e ta n e n s is

G ia r d ia ỉa m b lỉa

Hải ly, cừu, chó, mèo

N a e g le r ia fo w l e r i

Nước nóng, bể bơi, hồ

Tỉm thấy ờ nhiều loại nước và ở cửa sông Gây tiêu chảy cho người ăn động vật có vỏ Gây viêm dạ dày-ruột Gây bệnh viêm não hạt đo amip, viêm giác mạc và loét giác mạc Gây viêm ruột non kết cấp, nghiêm trọng với người bị thỏa hiệp miễn dịch, bào nang kháng với chất tẩy trùng hóa học, không mẫn cảm với kháng sinh Gây tiêu chảy kéo dài (trung bình 43 ngày), tự hồi phục ở vật chù bình thường, mẫn cảm khi xừ lý tức thời với Bactrim Nguyên nhân chính gây tiêu chảy vào đầu mùa xuân, quan trọng ở nước lạnh vùng núi Hít vào dường mũi, nhiễm vào thần kinh trung ương, gây bệnh viêm màng não sơ cấp do amip

633

24.5.1.2. Quy trình làm sạch nước

Nước chưa xử lý

' v

L àm m ềm (k h ứ C a , M g)

'

k ■.

"* 1

'ứ

L àm tro n g

ĩ\

"1 3 *

Sục khí Oxi hóa hóa học Trao đổi ion Lắng tụ

ì

ĩ ’

Khứ mùi và vi

§1

XL

' "v$\

"%

Tẩy trùng

■ ĩf%

Kết tủa hóa học: -H òa trộn -K ế t bông , í - Lằng -TV._ T ra o đ ổ i io n

ýi r 1 :%*.I}.: J 1

■■■•-t

ru.-. =v

:;ịfN :

J

Két bông hóa học:

-H òatrộn

“ 7_ - K ết bông -L ă n g L ọc

v>.=
7

'' ■ '■ ^

í

’

I X ụckhí Oxi hỏa hò,a ^

ráp 0“

’

.■ /

^ Phóng X,

Ozon Clo

2 4 .2 2 : Q u y tr ìn h tạ o n ư ớ c u ổ n g . T ù y th u ộ c v à o c h ấ t lư ợ n g n ư ớ c b a n đ ầ u m à s ử d ụ n g p h ư ơ n g p h á p x ử lý th ic h h ợ p . Đ á n g c h ú ỷ là ở b ư ớ c t ẩ y tr ù n g , n ế u x ử l ý b ằ n g c ỉo th ì c ó t h ể tạ o s á n p h ẩ m p h ụ , tr o n g đ ó c ổ tr ìh a lo m e ta n (T H M ) là c h ấ t c ô ti ề m n ă n g g â y u n g th ư . (T h e o P r e s c o tt- H a r ỉe y - K le in , 2 0 0 2 ).

Q uy trinh làm sạch nưởc giữ vai ừ ò quan ứọng ừ o n g kiểm soát tác nhắn gây bệnh ừong nước. Q uy trình làm sạch nước gồm nhiều bưóc khác nhau tuỳ thuộc m ức độ và kiểu ô nhiễm của nước đầu vào (hình 24.22). Chẳng hạn như nếu nước đầu vào có nồng độ kim loại sắt và m angan cao thi cần phải tiến hành sục khí, oxi sỗ kết hợp với kim loại này tạo

634

sản phẩm kết tủa, chất kết tủa sẽ lắng xuống đáy. Tại các nhà m áy cấp nước, nước phải được xử lý qua ít nhất 3 - 4 bước trước khi được cung cấp cho người dân sử dụng. N ếu nguon nước đầu vào chứa nhiều chất lơ lửng (suspended material) thì đẩu tiên phải đưa vào bể lắng, tại đây cát và các chất lơ lửng có kích thước lớn sẽ lắng xuống đáy. Sau đó nước từ bể này được trộn với hoá chất như như phèn và vôi bột rồi chuyển sang bể láng tụ. Ở bước này, vi sinh vật, chất hữu cơ, chất độc và chất lơ lửng có kích thước nhỏ sẽ bị loại khỏi nước. Q uá trình này gọi là kếi tụ hay kết bông (coagulation). Sau quá trình kết tụ, nước được chuyển sang hệ thống ỉợc (hình 24.23). Phương pháp lọc nhanh qua cát (phương pháp lọc lý học) có thể loại bỏ các chất không tan và các kết tụ có kích thước rất nhỏ. Bước này có thề loại bỏ được 99% vi khuẩn có trong nước. Cuối cùng nước được xử lý với một số chất tẩy trùng. Trước đây clo thường được sử dụng, tuy nhiên hiện nay ozon đang dần dần thay thế clo vì m ột số lý do. Lượng clo đùng ừong xử lý rất lớn, nồng độ clo còn lại trong nước sau xử lý là 0,2 - 2 mg/L. Ngoài ra, khi clo kết hợp với chất hữu cơ thường tạo ra sản phâm tẩy trùng như trihalometan (THM), nhiều nghiên cứu cho thấy THM là chất có thể gây ung thư.

ing nối H ì n h 2 4 .2 3 . H ệ t h ố n g l ọ c n ư ớ c . P h ư ơ n g p h á p lọ c v ậ t lý là b u ớ c q u a n tr ọ n g tr o n g x ử c á t đ iể n h ìn h c h o th ẩ y c ả c lớ p c á t

và đ ả

/ý n ư ớ c

u ố n g . M ặ t c ắ í c ù a h ệ th ố n g lọ c

s ỏ i. ( T h e o P r e s c o t t - H a r l e y - K l e ì n , 2 0 0 2 ) .

Phương pháp làm sạch nước nêu trên có thể loại bỏ hoặc làm bất hoạt m ột cách hiệu quả các vi khuẩn gây bệnh và coliform. Tuy nhiên, việc sử dụng các chất hóa học gây kết tụ, lọc nhanh qua cát và tẩy trùng hóa học thường không ổn định và không hiệu quả đối với việc khử bào nang khỏi nước.

G ia r d ỉo .

G ia r d ia ỉa m b ia ,

kén trứng

C r y p to s p o r id iu m

,

C y c ỉo s p o r a

và virut ra

là tác nhân gây bệnh tồn tại trong nước phổ biến nhất ở Mỹ. Đ ộng vật

nguyên sinh này do Leeuwenhook tìm thấy đầu tiên ở phân người năm 1681, chúng tồn tại ở 2 dạng: dạng sinh dưỡng và dạng bào nang.

G ia r d ỉa

gây bệnh tiêu chảy, thường gặp ở trẻ

em ở các nước đang phát triển. N guyên nhân mác bệnh chủ yếu là do sừ dụng nước suối

635

chưa xử lý hoặc nước sinh hoạt không đạt tiêu chuẩn. Bào nang

G ia r d ia

có kích thước

khoảng 7 - 1 0 x 8 - 1 2 I^m, để loại bỏ bào nang phài tiến hành phương pháp lọc chậm qua cát (phương pháp lọc sinh học). Ở hệ thống này, tốc độ nước chảy qua cát rất chậm và trên bề m ặt cát tồn tại m ột lớp vi sinh vật. Khi nước chảy qua hệ thống, vi sinh vật gây bệnh trong nước (bảng 24.3) sẽ bám vào lớp vi sinh vật sẵn có và bị loại khỏi m ôi trường nước. Trong những năm gần đây, động vật nguyên sinh tượng được quan tâm nhiều hơn là G ia r d ia

G ia r d ia .

C r y p to s p o r id iu m

ừ ở thành đối

Vì ký sinh trùng này có kích thước nhỏ hơn

nên việc loại bỏ chúng ra khỏi nước là khó khăn hơn. Trong nước

C r y p to s p o r id iu m

tồn tại dưới dạng kén hợp tử, khi vào cơ thể chúng sẽ phát triển ở đường

dạ dảy-ruột v à dẫn đển gây tiêu chày. Động vật nguyên sinh khác gây bệnh cho người là C o c c id ia

và có kích thước lớn hơn là

C y c ỉo s p o r a .

C r y p to s p o r id iu m , C y c ỉo s p o r a

nang chứa 2 bào tử động (có 4 bào tử động trong kén hợp tử).

Chúng thuộc bộ

có 2 nang bào, mỗi

C y c ỉo s p o r a

gây bệnh tiêu

chảy tự khỏi, thường kéo dài từ 19 đến 43 ngày và có thể kèm theo cả chỏng mặt, nôn, đau bụng và sốt. Ngoài ra, trong quy trình tạo nước uống cần phải lưu ý đến việc loại bò virut ra khỏi nước. Quá trinh kết tụ và lọc có thể làm giảm 90-99% lượng virut có m ặt ữong nước. Để tiếp tục xử lý số virut còn lại người ta dùng hóa chất, nâng pH , quang oxi hóa, kết quả là loại bỏ được 99,9% số virut. Tuy nhiên, không m ột phương pháp nào được coi là hoàn thiện cho việc loại bỏ virut. N gười ta đang xây dựng nên chuẩn m ực m ới về virut. Thực khuẩn thể có thể dễ đàng nuôi cấy và kiểm ừ a, hiện đang được sử dụng là chi số của sự nhiễm virut. N ếu quá trình tẩy trùng làm giảm ỉượng virut đáng kể theo hệ số log thỉ lượng virut có khả năng gây b ện h cho người sẽ bị giảm đến m ức cho phép.

24.5.2. Đánh giá nước về mặt vệ sinh Để đánh giá nước về m ặt vệ sinh cần kiểm tra sự có m ặt của các vi sinh vật gây bệnh trong nước. K iểm soát và phát hiện các vi sinh vật chỉ thị và gây bệnh là m ột phần chủ yếu của vi sinh vật y học. V i khuẩn sổng trong đường tiêu h ỏa nhỉn chung không sống sót được trong m ôi trư ờng nước, chúng bị áp lực về điều kiện sinh lý v à dần đần m ất khả năng hĩnh thành các khuẩn iạc ở m ôi trường đặc hiệu v à chọn lọc. T ốc độ chết của chúng phụ thuộc vào nhiệt độ, ánh sáng m ặt ườ i, các quần thể vi khuẩn v à thành phần hóa học của m ôi trường nước. N gư ời ta đ ã xây dựng quy trình phục hồi các coliform bị stress trước khi đưa chúng sang m ôi trường nuôi cấy đặc hiệu và chọn lọc. R ất nhiều bệnh do virut, vi khuẩn, động vật nguyên sinh gây ra cổ nguồn gốc từ nước bị nhiễm phân. T uy nhiên không phải tác nhân gây bệnh nào cũng có thể phát hiện trực tiếp được. Do vậy, các nhà vi sinh vật m ôi trường học đang tìm kiếm sinh v ật chỉ thị v à sử dụng

636

chúng như chỉ sô đánh giá cùa sự ô nhiễm nước bởi các tác nhân gây bệnh cho người. Để được chọn là sinh vật chỉ thị thì vi sinh vật cần phải thỏa m ãn các tiêu chí sau: 1.

Vi khuẩn chỉ thị phù hợp cho phân tích các loại m ẫu nước khác nhau: nước m ấy,

nước sông, nước ngầm, nước dự trữ, nước dùng cho giải trí, nước biển và

nước thải. 2.

Sự có m ặt của vi khuẩn chị thị phải luôn đi cùng vói sự cỏ m ặt của tảc nhân gây bệnh đường ruột.

3.

Vi khuẩn chi thị phải sống sót lâu hơn bất cứ tác nhân gây bệnh đường ruột nào, kể cả tác nhân có khả năng sống lâu nhất.

4.

Vi khuẩn chỉ thị không có khả năng nhân lên trong nước ô nhiễm và không tạo ra giá trị tăng giả.

5.

Quy trình kiểm tra vi khuẩn chỉ thị phải rất đặc trưng (vi sinh vật khác sẽ không tạo kết quả dương tính). Ngoài ra, phương thức kiểm tra phải cỏ độ nhạy cao và phát hiện được mật độ rất thấp của vi khuẩn chi thị.

6

.

7. 8

.

Phương pháp kiểm tra phải dễ tiến hành. Vi khuẩn chi thị không gây hại gì cho con người. M ật độ vi khuẩn chỉ thị trong nước ô nhiễm phải liên quan đến tới m ức độ ô nhiễm phân.

Tuy nhiên coliform là hỗn hợp cùa các vi khuẩn mà nguồn gốc có thể không phài là từ đường ruột. Để khắc phục điều này, người ta đã xây dựng các phương pháp để kiểm tra fecal coliform, đây là các coliform cỏ nguồn gốc từ đưcmg ruột của động vật máu nóng, chúng có thể phát triển ở nhiệt độ tởi hạn cao hơn (44,5°C). Để kiểm tra sự có m ặt coliform và fecal coliform, m ột số phương pháp đơn giản và đặc hiệu được xây dựng, bao gồm kỹ thuật m àng lọc (M embrane Filtration) và kiểm tra có - không (Presence - A bsence) để phát hiện coliform và phương pháp cơ chất đặc trưng Colilert để phát hiện coliform và Coliform, bao gồm cả E n te r o b a c te r ia c e a e .

E . c o ìi.

E s c h e r ic h ia c o ỉi,

là thành viên của họ vi khuẩn đường ruột

Các vi khuẩn này chiếm 10% tổng sổ vi sinh vật sống ờ đường ruột

của người và động vật. Coliform là vi sinh vật chỉ thị phổ biến trong kiểm tra chất lượng thức ăn và chất lượng nước. So với hầu hết các vi khuẩn gây bệnh đường ruột, coliform có khả năng sống lâu hơn. N ếu trong m ột thể tích nước nhất định (100 mL) không phát hiện thấy vi khuần chị thị đường ruột này thì có thể dùng làm nước uống hoặc nước sinh hoạt.

637

v?2«t a% M Krvi.Q nM «rurR0«tan0 Qvtfsne.1 rpj flTtttfVpa

TTT1 Ủ 5 ống với 10 mL mẫu,5 ống với 1 mL mẫu,5 ống với 0,1 mL mẫu

Sĩch nafe^ijt%i3fitoajMQ^urvftrvptosir Jp Cu

Ống âm tính (không có khí) để thêm 24h nữa Khống tạo khí -> không cỏ colifoim

ủ 24h ± 2h ở âm

dương

tính

tính

Dương tính trong phép thử sơ bộ được nuôi cấy trong dung dịch lactose màu lục sáng ừong 48h ± 3 hờ 35°c

ọp

+

Cấy vạch từ ống đương tính sang đĩa thạch chứa môi trưởng Levine’s EMB hay LES Endo, ủ ờ 35°c trong 24h±2h

•a *§• ệ ẽ

1 3

Sau 24h, kiểm tra sự hình thành khỉ

Sau 24 h nuối cấy, nhuộm Gram. Nếu vỉ khuẩn là Gram (-), hlnh que không bào tử, tạo khi từ lactose thỉ phép thử hoàn thiện là dương tính. Cấy truyền khuần lạc coliform sang ống môi tnrỉmg thạch nghiêng và ống môi trường lỏng lỏng. H ìn h 2 4 .2 4 : P h ư ơ n g p h é p M P N . K ỹ th u ậ t lê n m e n n h iề u b ư ớ c n à y đ ư ợ c s ử d ụ n g tr o n g m ộ t th ờ i g ia n d à i đ ể k iể m tr a v ệ s in h

n ư ớ c . Ở p h é p t h ừ s ơ b ộ , t h ể t í c h k h á c n h a u c ù a m ẫ u đ ư ợ c n u ô i c ẩ y t r o n g d ị c h n u ô i c ấ y c h ứ a la c to z . Ở p h é p t h ử k h ắ n g đ ịn h , ổ n g d ư ơ n g t í n h s i n h k h í đ ư ợ c c ấ y v à o d ị c h n u ô i c ấ y c h ú a l a c t o z v à m ậ t; ổ n g d ư ơ n g t í n h c ò n đ ư ợ c s ử d ụ n g đ ể t í n h s ố ỉ ư ợ n g t h ư ờ n g g ặ p n h ấ t. P h é p t h ử h o à n t h i ệ n n h ằ m x á c đ ịn h t r ự c t i ế p s ự c ó m ặ t c ủ á v i k h u ẩ n c o li fo r m , h (g iò ). ( T h e o P r e s c ó t í - H a r ỉ e y - K l e i n , 2 0 0 2 ) .

Một sô loài thuộc nhóm coliform gồm p n e u m o n ia e .

E . c o ỉi, E n te r o b a c te r a e r o g e n s

và

K ỉe b s ỉe ỉỉa

Coliform là các vi khuẩn kị khí tuỳ tiện, Gram âm, không sinh bào tử, hình

que, vi khuẩn này lên m en lactoz ở 3 5°c và giải phóng khí ữ ong vòng 48 giờ. Phương pháp gốc để xác định coliform trong nước là phương pháp xác định số lượng thường gặp nhất, hay còn gọi là phương pháp M PN (most probable number) ( h ì n h

2 4 .2 4 ) .

H ìn h 2 4 .2 5 : K h u ẩ n ỉạ c c o lifo r m v à e n te r o c o c c u s . M à n g lọ c c h o p h é p k iể m tr a n h a n h c h ỏ n g s ự c ỏ m ộ t c ủ a c o lifo r m , f e c a l c o lifo r m v à f e c a l e n t e r o c o c c u s t h ô n g q u a v i ệ c s ử d ụ n g c á c m ô i t r ư ờ n g k h á c n h a u , (a ) C o l i f o r m t r ê n m ô i t r ư ờ n g E n d o ; (b ) F e c a l c o n f o r m t r ê n m ô i t r ư ờ n g m u ồ i m ộ t c h ứ a t h u ố c n h u ộ m x a n h a n i l i n ; ( c ) F e c a l e n íe r o c o c c n s

ưên

m ôi

tn r ờ n g

chứa

a z it

và

chất

nhận

đ iệ n

tử

nhân

tạ o

TTC

( 2 ,3 ,5 -

tr ip h e n y h e tr a z o liu m c lo r it) n h ằ m q u a n s á t k h u ẩ n lạ c r ô h ơ n . (T h e o P r e s c o tí- H a r ỉe y - K le in , 2 0 0 2 ).

Kỹ thuật m àng lọc đã ừ ở nên phổ biến và là phương pháp được ưa chuộng để đánh giá đặc tính nước về m ặt vi sinh vật

(h ìn h 2 4 .2 5 ).

M ẫu nước được chảy qua m ột m àng lọc

(kích thước lỗ là 0,45 |im ) để giữ vi khuẩn ở màng. Sau đó chuyển m àng lọc sang bề m ặt m ôi trường răn hoặc m iếng đệm thấm m ôi trưởng lỏng. Việc sử đụng m ôi trường phù hợp cho phép phát hiện nhanh chỏng coliform tổng số, fecal coliform hoặc các fecal streptococcus

(S tr e p to c o c c u s

sổng trong đường ruột của động vật) thông qua sự xuất hiện

các k h u in lạc đặc trang, c ỏ thể chuyển m ẫu nước sang m ôi trưởng phục hồi (ít chọn lọc hơn) hoặc ở nhiệt độ ít gây stress hơn, trước khi đưa sang nuôi cấy trên m ôi trường chọn lọc. Chẳng hạn như ủ màng lọc 2 giờ với miếng đệm thẩm dung dịch lauryl sulfat theo quy trình LES Endo. Quy trình này thích hợp với m ẫu nước x ử lý với clo (clo thường gây stress cho vi sinh vật). Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp lọc qua m àng được tóm tắt trong

b ả n g 2 4 .4 .

Phương pháp này thường được ảp dụng rộng rãi đối với các m ẫu nưóc

không chứa nhiều vi sinh vật nền (tức vi sinh vật không phải coliform ), chất láng cặn hay kim ỉoạỉ nặng.

639

Phương pháp đom giản hon để phát hiện coliform và fecal coliform là phương pháp có - không (P-A ). Đ ây là phương pháp cải tiến từ phương pháp M PN. T hể tích m ẫu lớn hơn (100 m L) được ủ ừ o n g 1 bình nuôi cấy chứa m ôi trường lactoz, lauryl tryptoz và chất chỉ thị tím brom ocresol. N guyên lý của phương pháp P-A là trong 100 mL nước không được chứa coliform . N ếu dương tính thì sẽ hình thành axit trong ong (xuất hiện màu vàng). B ản g 24.4:

ư u đ iể m v à n h ư ợ c đ iể m c ủ a k ỹ th u ậ t m à n g lọ c tr o n g đ á n h g iá c h ẩ t lư ợ n g n ư ớ c về m ặ t vi s ìn h v ậ t (T h e o P r e s c o tt-H a r ỉe y -K le ỉn , 2 0 0 2 )

Ư u đ iểm

Ốn định Chỉ gồm một bước Màng lọc có thể chuyển sang các loại môi trường khác nhau Thực hiện trên một thể tích mẫu lớn để tăng độ nhạy Tiết kiệm thời gian Có khả năng hoàn thành quá trình lọc tại chỗ Không tốn kém so với phương pháp MPN Nhược điểm Nước có độ đục cao sẽ hạn chế kích thước mẫu Quần thể vi khuẩn không phải coliform iớn vì sinh trưởng nhanh Kim loại và phenol cỏ thể hẩp thu trên màng lọc và ức chể sinh trưởng Đe phát hiện coliform và

E . c o ỉi

có thể sử dụng phương pháp cơ chất đặc trưng

Colilert. ] 00 m L m ẫu nước được đư a vào m ôi trường đặc hiệu chứa chất đinh dưỡng là nifropheny 1-p-D -galactopyronoz

(O N PG)

và

4-m etylum belliferyl-

p

0-

-D-glucuronide

(MUG). N êu có m ặt coliform , m ôi trường sẽ chuyển sang m àu vàng trong vòng 24 giờ ở 35°c do sự thủy phân O N PG dẫn đến giải phóng ơ-nitrophenol (hình 24.26). Để phát hiện E , c o ỉi>

kiểm ứ a m ôi trư ờng bằng tia ƯV để phát hiện m àu huỳnh quang. N ếu có

E . c o li,

M UG bị biến đồi, sinh ra sản phẩm cỏ m àu huỳnh quang. N êu kết quả âm tính với coliform , thì nước có thể được sử dụng. Chuẩn m ực về độ sạch của nước hiện nay là không chứa coliform và fecal coliform , N ếu có m ặt coliform thì phải kiểm tra sự cỏ m ặt của fecal coliform và

E . c o ỉi.

H iện nay người ta đ ã dùng các phương pháp sinh học phân tử để phát hiện coliform trong nước v à các m ôi trư ờng khác như thức ăn. Đ oạn m ồi cho gen m ã hoá rARN 16S (thành phần bảo thủ trong quá ữ ìn h tiến hỏa) đã được đưa vào sử dụng. B ằng kỹ thuật này, người ta có thể phát hiện được 1 đơn vị hình thành khuẩn lạc (C FU ) của đương với 1 tể bào

640

E . c o ỉi)

E . c o ỉi

(tương

trong 100 mL nước. Trước khi thực hiện phản ứng PCR

(Polymeaz Chain Reaction) cân tiến hành bước làm giàu trong

8

giờ. Phương pháp này cho

phép phân biệt được chủng không gây bệnh và chủng tiết độc tố đường ruột, chẳng hạn như chủng

E .c o ỉi

0 1 5 7 : H7 sinh độc tố shiga.

Hình 24.26: Phương pháp cơ chất đặc tnmg Colìỉert. Đây là phương pháp đơn giản được sử dụng để phát hiện coỉì/orm và fecal coliform trong 100 mL mẫu nước. Môi trường sừ dụng ONPG and MUG là cơ chẩt đặc trưng, (a) Đối chứng; (b) Màu vàng do có mặt coỉì/orm; (c) Màu huỳnh quơng do có mặt fecal conform (khi chiếu tia ƯV). (ĩheo Prescott-Harỉey-Kìein, 2002). ở Mỹ, đã có hẳn m ột quy đinh hướng đẫn về chất lượng nước uống về mặt vi sinh vật, bao gồm cả chuẩn mực về coliform, virut, và

G ia r d ia .

N ếu sử dụng nước bề mặt

không qua lọc, m ỗi ngày phải thực hiện test kiểm tra coliform khi thấy nước bị đục. Một loại vi sinh vật chi thị khác là fecal enterococcus, vi khuẩn này đang càng ngày càng đuợc sử dụng làm chỉ thị cho ô nhiễm phân trong nước lợ và nước biển. Trong nước mặn, tốc độ chết của vi khuẩn này chậm hom là các fecal coliform , đo đó m à chúng trở thành sinh vật chỉ thị đáng tin cậy cho ô nhiễm. 24.6. X Ử LÝ N Ư Ớ C T H Ả I Nước thải công nghiệp (nhà máy chế biến thức ăn, nhà máy hóa dầu, nhà máy hóa học, nhà m áy dệt nhuộm ...), nông nghiệp và sinh hoạt chứa m ột lượng lớn chất hữu cơ. Việc xả trực tiếp nước thải vào nguồn nước tự nhiên của Trái đất

sẽ

gây ô nhiễm nghiêm

trọng. Chính vì vậy cần phải thực hiện quy trình xử lý nước thải để loại bỏ các chất hữu cơ đến m ức thấp nhất có thể trước khí đưa nước trở lại sông, suối... Để duy trì m ột xã hội phát triển bền vững và khỏe mạnh thì m ột trong những nhân tố quan trọng cần thực hiện là xử lý các nước thải mang tác nhân gây bệnh. Thực tế là việc

MI

ứng dụng phương pháp x ử lý nước thải sinh hoạt hiện đại, cùng với khử trùng bằng clo, đã làm giảm đáng kể sự lây lan bệnh tật ưên Thế giới. N ếu như hệ thống x ử lý nước sinh hoạt ngừng hoạt động trong m ột số truờng hợp bất khả kháng như thảm họa tự nhiên hay nội chiến thì sẽ xuất hiện trở lại các bệnh đã không tồn tại từ lâu như là dịch tả.

24.6.1. Kiểm tra chất lượng nguồn nước Trong xử lý nước thài, để đánh giá quả ừình loại bỏ cacbon khỏi nước, người ta có thể sử đụng m ột số phương pháp. Sự loại bỏ cacbon được đánh giá bàng các chỉ số: 1) cacbon hữu cơ tổng số (total organic cacbon, TOC), 2) nhu cầu oxi hóa học (chemical oxy dem and, C O D ) và 3) nhu cầu oxi sinh học hay sinh hóa (biochem ical/ biological oxy dem and, BOD). Cacbon hữu cơ tổng số TOC được xác định thông qua quá trình oxi hóa các hợp chất hữu cơ ở điều kiện nhiệt độ cao và bão hòa oxi. Tất cả cacbon có m ặt trong chất hữu cơ sẽ được chuyển thành CO 2 , CO 2 sinh ra đuợc định krợng bằng máy phân tích phổ hông ngoại. N hu cầu oxi hóa học CO D là lượng oxi cần để oxi hóa hoàn toàn chât hữu cơ có m ặt trong nước nhờ tác nhân hóa học. Các tác nhân

0X1

hỏa m ạnh sử dụng để xác định COD gồm kali

perm anganat, sen sulfat, kali iodat hay kali đicrom at đã được sử dụng để xác định COD. Trong đó, kali dicrom at (K 2 Õr2 Ơ 7 ) là có hiệu quả nhất: tương đổi rẻ, dễ dàng tinh chế và có khả năng gần như oxi hóa hoàn toàn mọi chất hữu ca. Phản ứng oxi hóa chất hữu cơ của K 2 Cr 2 Ơ 7 được tiển hành ư o n g điều kiện axit (thường bổ sung

H 2 S O 4 ).

Thực chất, COD là

lượng oxi có ừ o n g K 2 Cr 2 Ơ 7 đã dùng để oxi hoá chất hữu cơ ừ o n g nước. Chl số COD được sử dụng rộng rãi để đo gián tiếp lượng chất hữu cơ có trong nước với đơn vị đo COD là mg/L, tức là khối lượng oxi cần tiêu hao trên m ột lít đung dịch. Chỉ số COD và TOD cung cấp thông tín về nguồn chất hữu cơ tổng sổ gồm cả chất hữu cơ m à vi sinh vật có thể hay không thể phân hủy. Trong khi đó, nhu cầu oxi sinh học BOD là lượng oxi cần cung cấp để oxi hoá các chất hữu cơ trong nước bời vi sinh vật.

Bảng 24,5. Yêu cầu của thi nghiệm xác đ ịn h BOD (Theo P re sco tí-H a rỉe y-K ỉeiìt, 2002)

Thảnh phần dư lại sau quá trình ù Nitơ Photpho Sắt Yếu tố vi lượng Vi sinh vật __ _____________________ O xi______________

Thành phần sử đựng hết sau quá trình ủ Chất hữu cơ

642

Phương pháp xác định BOD được hình thành năm 1930 và đã được thay đổi đôi chút để phù hợp hon. Phương pháp xác định BOD là phương pháp đo lượng oxi hòa tan m à quần thể vi khuẩn dị dưỡng sử dụng để oxi hóa các chất hữu cơ trong điều hiện không có ánh sáng, ở 20°c, ừong thời gian nhất định (thường là 5 ngày nên gọi là B O D 5). Khi tiến hành đo nguồn oxi vi sinh vật sử dụng, cần phải cung cấp m ột lượng oxi bão hòa để không hạn chế quá ừình oxi hóa các chất dinh dưỡng (bảng 24.5). Đ ể đạt được điều này, càn phải pha loãng nước thài để sao cho nồng độ oxi trước phản ứng là > 2 mg/L và sau phản ứng là > 1 mg/L. Tuy nhiên, trong phản ứng xác định BOD, oxi còn được sử dụng để phân hủy hóa học và biến đổi các dạng nitơ hữu cơ và vô cơ (nitơ oxy demand, NO D ). Điển hình là sự biến đổi N H 3 thành các dạng nitơ khác (NO 2 ", NO3") nhờ quá trình nitrat hóa. Đê ức chế quá trình này, người ta thường bổ sung chất ứng chể

2

-chloro- 6 ~(trìchlorometyl) pyridin

(nitrapyrin), khi đó chỉ số BOD được kí hiệu là cBOD (cacbonaceous BOD). Các chỉ số TOD, COD và BOD cung cấp các thông tin khác nhau nhưng bổ trợ về nguồn cacbon trong m ẫu nước. Lưu ý là các chỉ số này chỉ cung cẩp thông tin về nguồn cacbon và quá trình loại bỏ cacbon ra khỏi nước. Ngoài ra thông tin về các chất khoáng khác như NCV, PO 4 3', SO 4 2' và quá ừình loại bỏ chúng ra khỏi nước cũng vô cùng quan trọng vì các chất khoáng nảy có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng của tảo và vi khuẩn lam trong hồ, sông và biển, góp phần vào hiện tượng phì dưỡng ở đó. Chính vì vậy, khi xử lý nước thải cần phải tiến hành loại bỏ không chỉ chất hữu cơ hòa tan m à còn phải loại trừ cả các chất dinh dưỡng vô cơ, song song với việc gây bất hoạt và loại bỏ các tác nhân gây bệnh.

24.6.2. Quy trình xử lý nước Khi chất hữu cơ được thải vào hồ và sông thỉ tại đây sẽ xảy ra quá trình tự làm sạch hiếu khí (aerobic self-purification). Người ta đã vận dụng hiện tượng tự nhiên này trong xử lý nước, tuy nhiên ừong điều kiện nhân tạo thì các quá trình tự nhiên sẽ được thúc đẩy mạnh mẽ. N gười ta đã sử đụng các bể lớn và thiết kế sao cho có thể kiểm soát quá trình trao đổi khí và hòa trộn nhằm định hướng các quá trình xảy ra trong đó, thúc đẩy sự phân hủy các chất hữu cơ. N goài ra có thể làm sạch nưởc bằng cách sử đụng các đầm lầy, quần xã thủy sinh vật tự nhiên (và các vi sinh vật liên quan) ở đó sỗ tiến hành sử dụng các chất hữu cơ hòa tan. N hững quy trình này rất hữu hiệu trong giảm thiểu sự xuống cấp nguồn nước và trong tiêu diệt các tác nhân gây bệnh cho con người. Quy trình x ử lý nước thải truyền thống bao gồm 3 bước chính: xừ lý cấp 1, x ử lý cấp 2 và xử lý cấp 3 (bảng 24.6)

643

B ả n g 24.6:

C á c b ư ớ c c h ỉn h tr o n g x ử ỉỷ c h ấ t th ả i

(T h e o P r e s c o tt-H a r le y -K ie ỉn , 2 0 0 2 )

Bưóc xử lý

Q uá trình

Cấp 1

Loại bỏ các chất dạng hạt không tan nhờ: lắng tụ, bổ sung vôi và các tác nhân gây lắng tụ khác vả quy trình lý học khác'

Cấp 2

Loại bỏ sinh học các chất hữu cơ: Lọc nhỏ giọt Bùn hoạt hóa Phá Hệ thống sục khí Phân hủy kị khí

Cấp 3

Loại bỏ sinh học các chất dinh dưỡng vô cơ Loại bỏ hóa học các chất dinh dưỡng vô cơ Loại bỏ hay bất hoạt virut Loại bỏ các nguyên tố vi lượng

Hình 24.27: Sự hình thành bong. 644

V ì s in h v ậ t đ ó n g v a i tr ò q u a n tr ọ n g tr o n g h ệ b ù n h o ọ t h ó a . H o ạ t đ ộ n g c ù a h ệ th ố n g x ử l ý p h ụ

thuộc vào sự hình thành bóng lẳng tụ ('ạ) Nếu nhà máy vận hành không đúng quy cách sẽ hình thành các bông không hoàn chinh và chậm lắng; (b) Nguyên nhân có thể ỉiên quan đển độ thông k h ỉ th ấ p , H ị S , c ơ c h ấ t h ữ u c ơ c ó t í n h a x it . C á c b ô n g n à y k h ỏ l ắ n g x u ố n g đ á y v ì c ẩ u t r ú c l ỏ n g l è o h a y k h ô n g đ ặ c . K ế t q u ả ỉ à c á c c h ấ t h ữ u c ơ v ẫ n c ó m ặ t t r o n g n i ỉ ớ c đ ã x ừ lý , l à m g ì à m c h ấ t l ư ợ n g n tr ớ c . ( T h e o P r e s c o t t - H a r ỉ e y - K l e i n , 2 0 0 2 ) .

X ử lý cấp 1 là bước đầu tiên trong quy trình xử lý nước thải và có thể loại bỏ khoảng từ 20 - 30% lượng BO D không tan bàng phương pháp vật lý. Ở bước này, chất không tan bị loại bỏ qua quá trình sàng lọc, kết tủa (đối với các hạt nhỏ) và để lắng ừong các bể. Phần vật chất rắn lắng xuống đáy gọi là bùn (sludge) X ử ]ý cấp 2 được tiến hành sau xử lý cấp 1 nhàm loại bỏ các chất hữu cơ tan n h ờ quá trình phân hủy sinh học. Ở bước này có khoảng 90 - 95% BOD tổng số và nhiều vi khuẩn gây bệnh bị loại bỏ khỏi nước. Trong điều kiện hiếu khí, vi sình vật sử đụng chất hữu cơ (và cà chất khoáng) và biến đổi thành sinh khối vỉ sinh vật và CO 2 . K ết thúc quá trình sinh trưởng, vi sinh vật sẽ kết tụ và tạo cấu trúc bông (floe structure) rồi lắng xuống đáy. N hững bông hoàn chính (dạng đặc) lắng xuống đáy nhanh, bông không hoàn chỉnh (lỏng lẻo, chứa nhiều vi sinh vật dạng sợi) lắng xuống đáy chậm hơn

{ h ìn h 2 4 .2 7 ) .

Nguyên nhân của việc hình thành cẩu trúc bông không hoàn chỉnh là do sự thay đổi đột ngột của nhiệt độ, pH, thiếu dinh dưỡng, có m ặt kim loại độc cũng như sự phát triển mạnh mẽ của vi khuẩn dạng sợi (filamentous microbe). Vi khuẩn dạng sợi, như S p h a e r o íiỉu s , T h io th r ix

và m ột số sình vật dạng sợi khác, phát triển m ạnh trong điều kiện

nồng độ oxi hòa tan thấp, thiếu dinh dưỡng, nồng độ s 2' cao. Chúng tham gia hình thành các bông với khả năng lắng tụ rất hạn chế, do đó làm giảm chất lượng nước đầu ra vì không loại bỏ được hoàn toàn chất hữu cơ khỏi nước. Đ ể loại trừ vi khuẩn dạng sợi, người ta xử lý bùn với clo hay H 2 O 2 trước khi đưa bùn trở lại hệ thống (chất này sỗ tiêu diệt vi khuẩn dạng sợi m ột cách cỏ chọn lọc). Hệ thống bùn hoạt hóa hiếu khí liên quan đến dòng chảy ngang của các chất và quả trình tái sử dụng bùn (sinh khối vi sinh vật sau quá trình phân hủy và sử đụng chất hữu cơ) (hình 24.28a). Phương pháp này được sừ dụng rộng rãỉ ở Mỹ. N ước từ bể x ử lý cấp 1 được bơm vào bể xử lý cấp 2 và hòa trộn với bùn giàu vi khuẩn (gọi là bùn hoạt hỏa). Khí hoặc oxi được bơm vào để kích thích sự sinh trường của vi khuẩn và sự phân hủy chất hữu cơ. Sau đó nước chứa vi khuẩn được đưa vào bể lẳng thứ cẩp, nước ở bề m ặt sẽ được hút ra và bùn

ở

đốy (bùn thứ cấp) được loại bỏ. M ột phần bùn thử cấp được đưa trở lại vào hệ thống

bùn hoạt hóa. s ổ lượng tác nhân gây bệnh sẽ giảm xuống đáng kể ừ o n g bùn hoạt hóa do sự

phát triển của vi sinh vật đối kháng và do bị hấp thụ ừong bùn thứ cấp (đa bị loại bò). Hệ thống bùn hoạt hỏa liên quan đến việc tái sử dụng m ột lượng lớn vi sinh vật, đo đỏ có thể oxi hóa m ột phần rất lớn chất hữu cơ trong thời gian ngắn. H ệ thống bùn hoạt hóa được thiết kế rất linh động để cố thể điều chỉnh tốc độ trộn và tỷ lệ chất hữu cơ. Ở hệ thổng tốc độ chậm (tỷ lệ chất hữu cơ đầu vào/sinh khối vi sinh vật thấp), vi sinh vật phảt triển chậm

Ố45

và bị đói, do đó dòng chảy đầu ra có lượng chất hữu cơ tan còn lại thấp. Ở hệ thống tốc độ nhanh (tỷ lệ chất hữu cơ đầu vào/sinh khối vi sinh vật cao), vi sinh vật phát triển nhanh, do đó sẽ phân hủy nhiều chất hữu cơ tan ừong cùng một thời gian, tuy nhiên dòng nước đầu ra có chất lượng thấp vì vẫn còn nhiều chất hữu cơ tan. Ngoài ra để hạn chế lượng bùn hình thành, người ta có thể tiến hành sục khí liên tục và lâu dài ưong các bể lớp, kể cả khi chất hữu cơ hòa tan đã biến đổi hết thành vi sinh vật. Trong điểu kiện đó sẽ xuất hiện hiện tượng tự tiêu của vi sinh vật, điều này sẽ dẫn đến việc giải phóng vào nước các chất khoáng m à vi sinh vật hấp thu. H ình thức x ử lý này gọi là phương pháp sục khí lâu dài { h ì n h 2 4 . 2 8 c ). Vi sinh vật dị dưỡng sinh trưởng trên mát đá

Nước từ bể xử lý cắp 1

Nước từ bề xử ]ý

Thiết bi sục

Ống phân phối nước

Bế sục khí Bể lảng thửcẩp Nước sau xử Iv

(a)

Xử lý chát hữu cơ nhờ vi sinh vật lơ lửng

Bủn thải thửcổp

Nưóc sau xử lý vả màng sinh hoc

(b) Thiết bj sục

Nưởctừ bẻxửlÝ

Vi sinh vật sử dung chất hữu cơ tan di sinh trưởng

(c)

Vi sinh vật tự phân giải, giải phỏng chát

Nước sau xử lý vả chất khoáng

khftAn*

H ìn h 2 4 .2 8 : C á c h ìn h th ú c x ử l ỷ h iể u k h ỉ n ư ớ c t h ả i c ấ p 2 : ( ạ ) B ù n h o ạ t h ó a . S i n h k h ố i v i s i n h v ậ t ( b ù n ) t ồ n t ạ i ở d ạ n g ì ơ l ừ n g đ ể s ử d ụ n g h i ệ u q u à o x i, c h ẩ t d i n h d ư ờ n g , s a u đ ó m ộ t p h â n s i n h k h ổ i đ ư ợ c tá i s ử d ụ n g ; (b ) L ọ c n h ỏ g iọ t. N ư ớ c th à i c h á y q u a b ề m ộ t r ắ n (v iê n sỏ i, h ạ t n h ự a ) c ỏ p h ù ỉớ p m à n g s in h h ọ c , k h i n itớ c c h à y q u a , c h ấ t h ữ u c ơ s ẽ b ị b iế n đ ổ i th à n h lớ p m à n g s i n h h ọ c m ớ i v à C O ĩ, s a u đ ỏ c h u y ể n s a n g b ể lắ n g t h ứ c ắ p ; (c ) S ụ c k h i lâ u d à i K h i đ ư ợ c s ụ c liê n tụ c k é c ả k h i v i s in h v ậ t đ ã n g ừ n g s in h tr ư ở n g (s ụ c k h í lầ u d à i d ẫ n đ ể n v i

646

sinh vật tự tiêu). Chẩt khoáng mà vi s i n h vật hấp thu sẽ được giải phóng khi xày ra hiện tượng này. (Theo Presco tt-Harỉey-Kỉeìn, 2002). Sau quá trình xử lý hiếu khí sẽ thu được m ột lượng lớn sinh khối vi sinh vật dưới dạng bìm thứ cấp. B ùn thứ cấp chứa nhiều loại chất hừu cơ và cả những chát khó phân hủy. Để xử lý bùn này người ta sử dụng hệ thống x ử lý kị khí. Phân hủy kị khí đuợc thực hiện trong các bể kín có kích thước lớn, không có khí. Quá trình này diễn ra liên tục, bùn thứ cấp luôn được đưa vào bể, bùn sau xử lý luôn được đưa ra. Sản phẩm của quá trình là khí metan, khí này sẽ theo đường ống ra ngoài đùng để sưởi ấm và sản xuất điện. Quá trình phân hủy kị khí bao gồm 3 bước: ( 1 ) lên men các thành phần của bùn để tạo thành các axit hữu cơ như axetat; (2 ) sản sinh cơ chất như axetat, C 0 2 và hydro cho vi khuẩn sinh metan; (3) sản xuất m etan nhờ vi khuẩn sình metan (bảng 24.7). Đ ể đạt hiệu suất cao, phải duy trì hydro ờ nồng độ thấp. N ếu có sự tích lũy hydro và axit hữu cơ sẽ dẫn đến ức chế quá trình sinh metan, làm ngưng trệ hoạt động trong bể kị khỉ.

Bảng 24.7: Các phản ứng trong phân hăy chất hữu cơ kị khỉ (Theo Prescotí-Harley-Kteỉn, 2002) Giai đoạn Lên men

Cơ chất

Sàn phẩm

Vi sinh vật chính

Polyme hữu cơ

Butyrat, propionat, lactat, succinat, etanol, axetat, H2, C 0 2

C lo s tr id iu m B a c te r o id e s P e p to s tr e p to c o c c u s P e p ío c o c c u s E u b a c te r ỉu m L a c to b a c illu s

Phản ứng sinh axetat

Butyrat, propỉonat, iactat, succỉnat, etanol

axetat, H2, C 0 2

S y n tr o p h o m o n a s S y n tr o p h o b a c te r A c e to b a c te r iu m

Phản ứng sinh metan

Axetat

CH4 và CO2

M e ta n o s a r c in a M e ía n o th r ix

H2 vàH C 03'

CH4

M e ta n o b r e v ìb a c te r M e ta n o m ỉc r o b iu m M e ta n o g e n iu m M e ta n o b a c te r iu m M e ta n o c o c c u s M e ia n o s p ir iilu m

647

Phân hủy kị khí có rất nhiều ưu điểm. H ầu hết sinh khối vi sinh vật tạo ra ở bước xử lý hiếu khí được đùng để sản xuất khí metan. Sau xử lý, thể tích bùn giảm đáng kể và có thể dễ dàng làm khô. Tuy nhiên, kim loại nặng và các chất ô nhiễm m ôi trường khác thường rất cô đặc trong bùn. Đ iều này có để gây ảnh hưởng lâu dài đến m ôi trường và sức khỏe con người nếu đưa bùn khô này vào đất hoặc nước. Bùn hình thành sau phân hủy kị khí trước khi thải ra đất hoặc nước có thể được xừ lý tiếp trong điều kiện hiếu khí ưong các nhà máy x ử lý nước thải. Q uá ừ ìn h này sẽ loại trừ các tác nhân gây bệnh còn lại và oxi hóa các chất có mùi khó chịu như N H 3 và H 2 S thành dạng không mùi. Ngoài ra,

x ử lý c ấ p 2

có thể tiến hành bằng phương pháp sử dụng m àng lọc sinh học

nhỏ giọt (trickling filter) {hình 2 4 . 2 8 b ) . N ước thải được bơm vào lớp thềm lọc chứa các hạt sỏi hoặc chất rắn khác (ceram ic, than đá, nhựa), ư ê n bề m ặt cùa vật chất rắn có phủ lớp màng sinh học. Q uần xã vi sinh vật ở bề m ặt sẽ phân hủy các chất thải hữu cơ thành sinh khối vi sinh vật tiếp tục bám vào bề mặt. Khi lớp m àng dày nên thì lượng oxi cung cấp cho phần vi sinh vật nàm phía trong m àng sẽ giảm đáng kể. Do đó lớp m àng sinh học sẽ bị bong ra khỏi bề m ặt, v à hỉnh thành m àng mới. Lọc sinh học nhỏ giọt tốc độ chậm sẽ loại bỏ được 85% BOD. X ử lý c ẩ p 3

được tiến hành sau xử lý cấp 2. M ục tiêu của bước này là loại bỏ các tác

nhân gây ô nhiễm như chất hữu cơ không thể phân hủy bàng phương pháp sinh học (như polychlorinatd biphenyls), kim loại nặng và chất khoáng. N goài ra, đây là bước rất quan ừọng để loại bỏ các hợp chất chứa nitơ và photpho (gây hiện tượng phì dưỡng). Chất ô nhiễm hữu cơ có thể được loại bò nhờ hệ thống lọc cacbon hoạt hóa. Photpho thường đuợc kết tủa dưới dạng photphat canxi hoặc photphat sắt (bằng cách bổ sung vôi bột). N itơ có

thể đuợc loại bỏ dưới dạng khí bay hoi như NH 3 khi nâng pH cao lên. NH 3 cỏ thể xử lý với clo, tạo họp chất dìchloam in, sau đó được biến đổi thành khí nitơ. Trong m ột số trường hợp, có thể sử dụng các quá trình sinh học để loại bô n itơ và photpho. Đ ối với nitơ, đó là quá trình phản nitrat hóa, nitrat tạo ra trong điều kiện hiếu khí được sử dụng làm chất nhận điện từ trong điều kiện nồng độ oxi thấp, chất hữu cơ là nguồn cung cấp năng lượng cho phản ứng này. Sản phẩm chính của sự khử nitrat là khí N 2 và N 2 O. Đ ể loại bỏ photpho, người ta ổp dụng điều k iện hiếu khí và kị khí nối tiếp nhau, cuối cùng photpho sẽ tích lũy ữong sinh khối vi sinh vật chuyên hóa dưới dạng như chuỗi photphat. X ử lý cấp 3 thường tốn kém và chỉ được sử dụng trong truờng đặc biệt để không gây hủy hoại hệ sinh thái.

Xử lý cẩp 3 liên quan đén một chuỗi các quá trinh xử lý kị khí và hiếu khí, thường được ký hiệu là AA O (kị khí-thiếu khí-hiếu khí). Toàn bộ quá trinh gồm 3 bước: (1) xử lý kị khí (Anaerobic) các chất thải; (2) xử lý thiểu khí (Anoxic) cổ bổ sung nitrat để thúc đẩy quá trình phản nitrat hổa; (3) trước khi đưa vào môi trường, xử lý trong điều kiện hiếu khí (Oxỉc).

648

Làm trong cơ Đầu vào

Loại bỏ chất rắn láng tụ (a)

Dòng chảy thẳng đứng (thấm)

Dòng chày thẳng đứng Dòng chảy thẳng đứng

iấÍÈiílltsẾÌlỊằ 1

Loại bỏ chẩt rán lơ lửng, BOD, nitơ và phospho hữu cơ

Loại bỏ P04 BOD, phản nitrat hoá

(b)

(c)

Làm sạch nhờ thực vật ngập Loại bỏ nitơ và phospho vô cơ, tăng 0X1

(f)

(e)

Hinh 24.29: Đầm lầy nhân tạo dùng trong xứ lý nước thái. Hệ thống gồm nhiều giai đoạn, dừng đề ỉoạì bò chất hữu cơ vđ photpho, Thực vật lởn trôi nổi tự do (b, c, e) như bèo tấm và bèo tây; thực vậi lởn ngập một phần trong nước (đ) như có may; thực vật ngập hoàn toàn dưới một ntỉởc (Ị) như cò nước. Đầm lầy cỏ thể được thiết kế để thúc đầy quá trình phản nitraỉ hỏa và khù kim loại. (Theo Prescott-Harĩey-Klein, 2002). M ột kiểu xử lý nước thải rất đặc biệt, đang được ứng dụng rộng rãi là dựa ừên mô hình đầm lầy.

Đ ầ m ĩầ y

là nguồn sinh thái tự nhiên và là m ột m ôi trường nước quan trọng.

Đầm lầy thông thường sâu không quá 1 m, là nơi thực vật rất phát triển, ngoài ra đầm lầy còn là nơi sống cùa m ột số loài động vật. Gần đây m ô hình đầm lầy đang được quan tâm sử dụng như là phương pháp xử lý các đòng chảy nước thải ở m ức độ thứ cấp. Mặc dù cả đầm lầy tự nhiên và nhân tạo được sử dụng cho mục đích này tuy nhiên gần đây thỉ đầm lầy nhân tạo được sử dụng phổ biến hơn. Hoạt động sinh học điễn ra ừong đầm lầy là mạnh mẽ hcm hầu hết các hệ sinh thái khác, vì vậy sự biến đổí chất ô nhiễm thành chất vô hại hoặc chất dinh dưỡng cần cho sinh trường của thực vật có thể xảy ra ở tốc độ nhanh, rất cỏ lợi nếu ứng dụng xử lý nước thài thành phố. Hệ thống đầm lầy nhân tạo sử dụng thực vật trôi nổi tự do, thực vật ngập m ột phần hay hoàn toàn trong nước như trong hình 24.29. Các thực vật thủy sinh này cung cấp chất dinh dưỡng cho vùng xung quanh rễ tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển. Đối với thực vật ngập m ột phần trong nước, vùng xung quanh rễ có thể đuy trì trạng thái kị khí, do đỏ

D e s u l/o v ìb r ỉo

sử dụng chất hữu cơ quanh rễ làm nguồn

năng lượng tồng hợp H 2 S, nhờ đó giữ lại kim loại. Hệ thống thực vật ngập m ột phần ưong nước được ứng dụng rộng rãi trong xử lý nước ở các mỏ bỏ không. H ầu hết các đầm lầy nhân tạo ở M ỹ sử dụng sậy hoặc cỏ may, tuy nhiên thực vật thủy sinh như bèo tấm hoặc bèo tây cũng được sử dụng. Các loại thực vật thủy sinh khác nhau và vi sinh vật có liên

649

quan được sử dụng trong hệ thống nhằm loại bỏ các chẩt hữu cơ, chất dinh dưỡng vô cơ và kim loại khỏi nước. Các đầm lầy nhân tạo cũng đang được sử dụng để x ử lý hệ thống thoát nước của các m ỏ axit ở rất nhiều nơi trên Thế giới và chất thải công nghiệp nồng độ cao. Phương pháp x ử lý đon giản khác là x ử lý dòng chảy ở bề m ặt đất (surface flow soil treatm ent). Trong phương pháp này, nước thải được chảy qua m ột cánh đồng đã ừ ồng cây hoặc cầy xới, tại đây xảy ra quá trình phân hủy chất hữu cơ nhờ hoạt động của vi sinh vật hiếu khí. Phương pháp n ày được ứng dụng rộng rãi, đặc biệt là ngày càng được ứng dụng ở vùng nông nghiệp chăn nuôi kín. C hăn nuôi bò, gia súc, lợn, hoặc gia cầm là những hoạt động dẫn đến ô nhiễm nghiêm trọng nguồn nước, đặc biệt là khi chúng diễn ra ở gần cửa sông và vùng ven biển. 24.7. N Ư Ớ C N G Ầ M V À H Ệ T H Ố N G x ử L Ý G IA Đ ÌN H N ước ngầm là nguồn nước chày ưong m ạch kín ờ dưới m ặt đất và là nguồn nước vô cùng quý báu, hiện đang được sử dụng rộng rãi.‘'N guồn nước ngầm ờ M ỹ cung cấp nước uống cho ít nhất

100

triệu người. Ở các vùng nông thôn và ngoại ô, ngoài hệ thống phân

phổi nước đô thị, thì 90 - 95% nước uổng có nguồn gốc từ nước ngầm. Chính vì tầm quan ữ ọ n g của nguồn nước ngầm nên ngưòi ta đã tập trung nghiên cứu nhằm hiểu biết sâu hơn về vi sinh vật và các quá trình đo vi sinh vật thực hiện ừong môi trường nước ngầm . H iện nay, các nhà khoa học đang rất cố gắng đự đoán tác động của quá trình ô nhiễm đến chất lượng nước ngầm về m ặt hóa học và vi sinh vật học. Trong quá trình chảy dưới m ặt đất, v i sinh vật gây bệnh v à chất hữu cơ hòa tan thấm qua đất và được giữ lại trong lớp cát m ịn, đất sét và vật chất h ữ u cơ. V i sinh vật và cà động vật nguyên sinh có m ặt ở đây sẽ sử dụng các tác nhân gây bệnh bị bắt giữ làm thức ăn. K ết quả là số lượng quần thể vi sinh vật còn Ịại trong nước giảm đáng kể. V iệc xử ỉý nước v à chất thải sinh hoạt, nhất là chất thải khu vệ sinh là vấn đề vô cùng quan trọng. N êu nguồn chất thải này ngấm vào nước ngầm thi sẽ làm ô nhiễm nghiêm ừ ọng nguồn nước uống. C hính vì vậy hệ thống x ử ỉý gia đình bao gồm bể tự hoại kị khí và cánh đồng ỉọc h iếu khí đ ã đuợc xây dựng

{ h ì n h 2 4 . 3 Ơ ),

Trong b ể tự hoại truyền thống xảy

ra quá trùih làm lỏng v à p h ân hủy các chất thải nhờ hoạt động củ a các v i sinh vật kị khí. N ước và chất th ải được đư a vào bể (bê tông, kim loại, sợi thủy tỉnh). Tại đây m ỡ và dầu nổi lên ữ ê n bề m ặt, chất rắn lắng xuống đáy, xảy ra quá trình phân hủy kị kh í v à hinh thành bùn. Thông thườ ng nưóc thải được giữ trong bể khoảng 24 - 72 giờ, sau đó thì được chảy ra cánh đồng lọc. C ánh đồng lọc hiếu khí giữ lại các chất hữu c ơ và v i sinh vật, tạo điều kiện cho quả trình

0

X1 hóa sinh học. Cánh đồng lọc chứa hệ thống các ổng nhỏ có đục lỗ

nằm ư o n g lớp đá m ẹ ngay dưới bề m ặt đất. Phần bùn còn lại trong bể được định kỳ đưa đến các nhà m áy x ử lý chất thải. N êu thời gian tồn tại cùa chất thải trong bể quá ngắn (dòng chảy quá nhanh hoặc bùn quá nhiều) thỉ dẫn đến hiện tượng chất rắn chưa được phân

650

hủy hoàn toàn đã chúyển sang cánh đồng lọc. Q ua quá trình tích lũy, cánh đồng lọc có thể bị tăc bởi các chât chưa phân hủy này và trở nên kị khí, do đó sẽ không có quá trình oxi hóa sinh học xảy ra. Trong trường hợp bị ngập nước thì cánh đồng lọc cũng sẽ biến thành vùng kị khí, do vậy quá trình xử lý tại đây sẽ không còn hiệu quả nữa. Nước thải

H ì n h 2 4 .3 0 : H ệ t h ố n g x ử lý b ề t ự h o ạ i.

Hệ thống hao gồm bể tự hoại và cánh đồng lọc hiểu khí. (Theo Prescoii-Harìey-Klein, 2002). N ếu nước trong bể tự hoại bị tràn ra ngoài và lóp đất bên dưới có hiện tượng tiêu nước nhanh thi sẽ gây nên vấn đề vô cùng nghiêm trọng. N ước thải sẽ đi xuống lớp đá vụn và sỏi thô nằm bên dưới, tại đây không thể thực hiện quá trình x ừ lý hữu hiệu như là ở cánh đồng lọc hiếu khí. Đ iều này dẫn đến ô nhiễm nước giếng với tác nhân gây bệnh và sự ỉây lan bệnh. Ngoài ra, photpho từ chất thải có thể không được giữ lại m ột cách hiệu quả và gây ồ nhiễm nuớc ngầm. N ước ngầm ô nhiễm với photpho ngấm vào ao, hồ và sông, dẫn đến hiện tượng phì đường. Ngoài ra, vùng đất dưới bề mặt còn có thể bị ô nhiễm bởi các lý dò khác, chẳng hạn như chôn lấp bùn hoạt hóa và bùn bể tự hoại không hợp pháp, loại bỏ các chất độc không đứng quy cách, dòng chảy từ sản xuất nông n g h iệp ... Tất cả các nguồn trên đều góp phần gây ô nhiễm

nước

ngầm với các chất hóa học và vi sinh vật. N goài ra, phưcmg pháp bơm

nước thải vào giếng gây nhiều tranh cẫi về ảnh hưởng của chúng Ưong tương lai xa. Rất nhiều chất ô nhiễm nằm sâu dưới bề m ặt có thể tồn tại rất láu và ảnh hưởng tới chất lượng của nước ngầm trong m ột thời gian đài. Nhiều nghiên cứu đirợc tiến hành đẻ tìm cách xử lý nước ngầm tại chỗ. Vi sinh vật và hoạt động của chúng đóng vai trò quan trọ rg trong các liệu pháp xử lý nước này.

651

C hương 25

VI SINH VẬT HỌC THựC PHẨM

Hình 25. ỉ: Những bể chứa ỉởn được dùng cho sản xuất rượu vang. Quá trình lên men được tiến hành trong những thùng để hở như vậy trong những vùng có khí hậu ôn hòa. Sau khi hoàn (hành lèn men, rượu sẽ được vận chuyển đến những thùng lởn để tích trữ và ủ tiếp. (Theo Prescott-Harley-Klein, 2002). Thực phẩm , vi sinh vật và con người cỏ mối liên hệ m ật thiết hết sớc thú vị với nhau từ rất lâu, trước khi cỏ cả sự ghi chép lại của sử sách. Thực phẩm không chỉ có giá trị dinh dưõng đối với con người m à còn là m ôi trường nuôi cấy lý tưởng cho sự sinh trưởng của vi sinh vật. Lên m en bằng v i sinh vật cỏ thể dẫn tới khả năng bảo quản thực phẩm thay vi làm hỏng thực phẩm .

652

Ví sinh vật học thực phẩm (Food Mỉcobiology) là chuyên ngành khoa học có liên quan giữa Vi sinh vật học và Công nghiệp thực phẩm. Chuyên ngành này nghiên cứu: - Nghiên cứu quy luật hoạt động của vi sinh vật với các thực phẩm có ỉiên quan. - Nghiên cứu phương pháp sử dụng các vi sinh vật có ích để chế biến thực phẩm. - Nghiên cứu phương pháp khống chế các vi sinh vật có hại, phòng ngừa sự hư hỏng cùa thực phẩm. - N ghiên cứu các phương pháp kiểm tra vi sinh vật ừong thực phẩm , góp phần xác định các tiêu chuẩn an toàn thực phẩm. Vi sinh vật có thể được sử dụng để biến thực phẩm thô thành thực phẩm được ưa thích như: phomat, dưa chua, sữa chua, chao (đậu phụ nhự), xúc xích, mắm, nước mắm, tương, bún, bánh phở, bánh m en .... Rượu, bia và các các sản phẩm từ rượu khác (g iấm ...) cũng được tạo ra thông qua quá trình lên men của vi sinh vật. Ngược lại, thực phẩm cũng đỏng vai trò như m ột phương tiện truyền bệnh. Sự phát hiện, kiểm soát m ầm bệnh và các vi sinh vật làm hỏng thực phẩm hiện đang là những vấn đề được quan tâm của ngành Vi sinh vật vật học thực phẩm . Trong toàn bộ chuỗi vận chuyển thực phẩm, từ người sản xuất tới người tiêu thụ , vi sinh vật có thể ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng thực phẩm và sức khỏe của con người. Xét về m ặt lợi ích, những thực phẩm giàu chất dinh dưõng là rất cần thiết cho mọi người. Sự sinh trưởng của vi sinh vật ữong thực phẩm có thể dẫn tới hoặc là giúp bảo quản an toàn hoặc là làm hỏng thực phẩm. Điều này phụ thuộc vào m ối liên quan giữa vi sinh vật và điều kiện bào quản thực phẩm. Các vi sinh vật gây bệnh có thể nhiễm vào bất cứ thời điểm nào trong toàn bộ quá trình chế biến, vận chuyển thực phẩm.

25.1. SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT TRONG THựC PHẲM Thực phẩm cung cấp chất dinh dưỡng cho chúng ta, nhưng cũng đồng thời là môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng của vi sinh vật. Sự sinh trưởng của vi sinh vật được kiểm soát bằng các yếu tố cỏ liên quan đến chính thực phẩm hay các yếu tố bên ửong và m ôi trường nơi thực phẩm được bảo quản, hoặc là những gì m à được m iêu tả như các yếu tổ bên ngoài, được chỉ ra ừong

s ơ đ ồ 2 5 . 1.

N hững nhân tố bên trong hay những nhân tố liên quan đến thực phẩm bao gồm: pH, độ ẩm hoạt tính của nước, thế oxi hóa khử, cấu trúc vật lí của nước, sự có m ặt của chất dinh dưỡng và khả năng có m ặt của các tác nhân kháng vi sinh vật tự nhiên, c ỏ n nhân tố bên ngoài hay môi trường bao gồm: nhiệt độ, độ ẩm tương đối, sự cỏ m ặt của C 0 2, 0 2, sổ lượng và chủng loại vi sinh vật có trong thực phâm.

653

H ? n đ ? i theoth?i gian C ảcn h ân t? di?ukhi?n

_ T r?ngtháil__________Tr?ngthái2 i i 7i d ? , d ? i t a t u o n g d ? i,k h í,

B ênngpài ^ M

f C ốc v i s iĩih

v?t Bên trong

1 [

( I visuih v T t^ y n W ^

^

.

^

O ácvi sinh f

v?thi?ncó TbànhphTn, 1r?ngthái ảnh, lý

1

các nhân t? bên lìg p à ự 7 hayđ? i q u ? n x ã v i

V i# ]J [ *

N

[ H H?nd?icácriânt?bênti ?nd?icácriânt?bênti00ẩTg ẩTg]] >• y

H ì n h 2 5 .1 : C á c n h ã n t ổ b ê n t r o n g v à b ê n n g o à i à n h h ư ờ n g l ê n s ự s ì n h t r ư ở n g c ủ a v i s i n h v ậ t t r o n g th ụ c p h ẩ m . (T h e o P r e s c o tt-H a r ỉe y -K ỉe in , 2002%

25.1.1. Các nhân tổ bên trong (Intrinsic factors) Các thành phần cấu tạo nên thực phẩm là những nhân tổ then chốt bên trong ảnh hưởng tớì sự sinh trưởng của vi sinh vật, N êu như m ột thực phẩm về cơ bản có chứa cacbohydrat thì sự phá hỏng ít đẫn tới việc sinh ra các m ùi khó chịu. Vì thế các thực phẩm như bánh mỳ, m ứt, hay m ột số hoa quả đầu tiên bị hòng đo sự phát triển của nấm. Ngược lại, khi thực phẩm chứa m ột lượng lớn là protein hay chất béo (như thịt hay bơ) thì sự phá hỏng có thể tạo ra m ột lượng lớn m ùi khó chịu. Chỉ cần nghĩ tới trứng thối ỉà đủ hiểu chuyện này. Sự phân giải protein và phân giải kị khí của protein đã tạo ra m ột lượng lớn mùi hôi thổi của các hợp chất như ínđol, skatol, các am in cadaverin hữu cơ. Sự phân hủy của các thực phẩm chứa các chất béo cũng tương tự như thế. Chẳng hạn nhu sự sản sinh các chuỗi axit b éo ngắn từ chất béo làm cho bơ bị ôi và khó chịu. Đ ộ pH của thự c phẩm cững là m ột ừ ong các tiêu chí quan Ưọng. N ếu pH thẩp sẽ thích hợp hem cho sự sinh trường cùa nấm m en và nấm sợi. N ếu pH trung tính hay kiềm, như trong thịt th ì vi khuân sẽ chiếm ưu thế. Sự phá hòng thực phẩm phụ thuộc vào cơ chất chỉnh có m ặt trong đó. Sự có m ặt của nước cũng ảnh hưởng tới sự xâm nhập của vi sinh vật ừong thực phẩm . Làm khô thực phẩm , có thể khổng chế hoặc có thể loại bỏ quá trinh phá hủy thực phẩm . Sự có m ặt của nước được đo bằng đại lượng hoạt độ của nước (aw). Đại lượng này đuợc tính bằng tỉ lệ giữa độ ẩm tương đổi ừong không khl trên m ột dung địch kiểm ừ a so với tỉ lệ đỏ của nước chưng cất. K hi thêm vào thực phẩm m ột lượng lớn m uối hay đường

thì hâu hết các vi sinh vật đều bị loại nước do hiện tượng co nguyên sinh (plasm olysis) và không thể sinh trưởng được nữa B ản g 25.1:

{ b ả n g 2 5 .2 ) .

S ự k h á c b iệ t tr o n g q u ả tr ìn h là m h ỏ n g c á c lo ạ i th ự c p h ầ m (T h e o P r e s c o tt-H a r ỉe y -K le in , 2 0 0 2 )

Cơ chất

Tên thực phẩm

Các phản ứng hỏa học

Pectin

Hoa quả

Phân giải pectin

Metanol, axit uronic (làm mất cấu trúc về hình thái và dề bị thổi nhũn)

Protein

Thịt

Phân giải protein và nhóm amin

Axit amin, peptid, amin, H2 S, inđol (gây đắng, chua, gây nhớt, mùi khó chịu)

Carbohydrat

Các thực phẩm chứa tinh bột

Thủy phân tinh bột và lên men

Axit hữu cơ, COỉ, rượu... (làm chua và axit hóa)

Lipit

Bơ

Thủy phân, phân hủy axit béo

Glyxerol, axit béo hỗn họp (tạo mùi ôi, gây đắng).

B ảng 25.2:

Các sản phẩm điển hỉnh và tác dụng của chúng

M ố i ỉiê n h ệ g iữ a h o ạ t đ ộ c ủ a n ư ớ c tố i th iể u v ở ỉ c á c n h ó m v ỉ s in h v ậ t tr o n g

q u ả tr ìn h tà m h ỏ n g th ự c p h ẩ m . (T h e o P r e s c o tt-H a r le y -K le in , 2 0 0 2 )

Các vi sinh vật Nhóm Cảc vi khuẩn làm hỏng thực phẩm Các nấm men làm hỏng thực phẩm Các nấm mốc làm hỏng thực phẩm Các vi sinh vật đặc trưng: Closứidium botulinum, typ E

a*

Các vi sinh vật

0.9 0 . 88 0 . 80

Nhỏm Các vi khuẩn ưa mặn Các nấm mốc ưa khô hạn Các nấm men ưa thẩm thấu

0. 97 0. 97 0. 96 0. 96

Pseudomonas spp. Acinetobacter spp. Escherichia coli Enterobacter aerogens Bacillus subtilis Clostridium botulinum, typ A, B

0. 95 0.95 0. 94

Candida utỉlis Vibrio parahaemolyticus

0. 94 0. 94

Botrytis cinerea Rhizopus stolonifer

0.93 0. 93 0.93

Mucor spinosus

Các vi sinh vật đặc trưng: Candida scottii Trichosporon pullulant Candida zeylanoides Geotricum candiđum Trichothecium spp Byssochlamys nivea Staphylococcus aureus AlteARNria citri Pencillium patulum Eurotium repens Aspergillus conicus Aspergillus echinulatus Zygosaccharomyces rouxii Xeromyces bisporus

0. 75 0.61 0.61 0. 92 0.91 0. 90 -0.90 -0.90 -0.87 0 . 86 0. 84 0.81 0.72 0.70 0. 64 . 62 0.51

0

655

N gay trong những điều kiện ngược lại, vi khuẩn ưa áp và ưa khô cũng có thể phá hỏng thực phẩm . Vi khuẩn ưa áp (osm ophilic) sinh trưởng tốt nhất ưong m ôi trường có áp suất thẩm thấu cao, trong khi đó vi sinh vật ưa khô (xerophilic) chỉ thích hợp với môi trường có aw thấp và không thể sinh trưởng ừong điều kiện có aw cao. Thế oxi hóa khử của thực phẩm cũng có thể ảnh hưởng tới sự phá hỏng thực phẩm. Khi m ột sản phẩm thịt, đặc biệt là nước luộc thịt, thường có thế oxi hóa khử thấp. Những sản phẩm này sẵn là m ôi trường lý tưởng cho sự sinh trưởng của vi khuẩn kị khí, bao gồm cả

C lo s tr id iu m .

Cấu trúc vật lí của thực phẩm cũng có thể ảnh hưởng đến tiến trình và phạm vĩ làm hỏng thực phẩm . Sự xay nhỏ và phối ừ ộn thực phẩm như xúc xích và

h a m b u rg er

không chỉ

làm tăng diện tích bề m ặt thực phẩm , làm biến đổi cấu trúc tế bào m à còn góp phần làm tăng cơ hội nhiễm vi sinh vật vào thực phẩm. Điểu này có thể làm cho thực phẩm hư hỏng nhanh hơn nếu những thực phẩm đó không được bảo quản m ột cách thích hợp, Rau xanh và hoa quả có lớp vỏ ngoài có thể bảo vệ chúng khỏi hư hỏng. Thường những vi sinh vật gây hư thực phẩm cỏ loại enzym đặc hiệu giúp chúng thâm nhập qua lớp vỏ và m àng bảo vệ, đặc biệt là sau khi hoa quả và rau đã bị khô héo. N hiều loại thực phẩm có chứa các chất kháng khuẳỉĩ tự nhiên, bao gồm cả enzym và những phức chất ức chế hóa học. C um arin được tìm thấy ứ ong hoa quả và rau xanh cho thấy sự hoạt động như chất kháng khuẩn. Sữa bò và trứng cũng có chứa chất kháng khuẩn. Trứng giàu Lyzozym , có thể phân giải thành tế bảo vi khuẩn G ram dương. M ột số thực phẩm đáng lưu ý khác có hoạt tính kháng vi sinh vật như nước sốt cay được dùng khi ăn sò sống và các loại hải sản khác. N ước sốt làm bằng hạt tiêu và các loại nước sốt cay từ hạt tiêu đỏ dường n hư luôn có m ột lượng nhất định các chất kháng vi sinh vật. Thảo m ộc và gia vị thườ ng có m ột lượng chất kháng vi sinh vật đáng kể; nhìn chung vi khuẩn nhạy cảm h ơ n so với hầu hết các nấm . N gải đắng và hương thảo cũng là những loại gia vị có chứa nhiều n hất chất kháng vi sinh vật. Hợp chất aldehit và phenol được tìm thấy trong cây quế, cây m ù tạc, cây kinh g iớ i... N hững hợp chất này kìm hăm sự sinh trưởng của vi sinh vật. T hực phẩm quan trọng khác có khả năng ức chế các vi sinh vật Ịà tỏi, chứa chất allincin, v à cây đinh hương có chứa eugenol. T uy nhiên, những gia vị này cũng có thể ch ứ a những sinh vật m ang m ầm bệnh và làm hỏng thực phẩm . Coiiform, c e r e u s , C l P e r fr in g e n s

và

S a lm o n e lla

B.

có thể phát hiện thấy trong h ầu hết các gia vị. Các vi

sính vật có thể bị loại bỏ hoặc giảm bớt khi k h ử trùng bằng etylen oxit. Phương pháp này có thể loại bò thực phẩm.

S a lm o n e lla

khỏi gia vị và giảm tới 90% các vi sinh vật thường làm hư hỏng

Trà xanh và trà đen chưa lên men có hoạt tính kháng vi sinh vật tốt hơn sau khi lên men do có chứa thành phần polyphenol. N hững loại trà đó hoạt động chống lại vi khuẩn, virut, nam và có thể có cả đặc tính chống ung thư. a. C á c n h â n tổ b ê n n g o à i (E x tr in s ic F a c to r s )

N hiệt độ và độ ẩm tương đối là những nhân tố bên ngoài quan trọng có ý nghĩa quyết định việc thực phẩm có bị hỏng hay không. Ở độ ẩm tương đối cao, sự sinh trưởng của vi sinh vật bắt đàu trở nên nhanh hơn, thậm chí ngay cả ở nhỉệt độ thấp (ừong tủ lạnh, kho lạnh) m ột số vi sinh vật vẫn có thể phát triển. Khi thực phầm khô được bảo quản trong môi trường ẩm ướt, sự hấp thụ hơi ẩm có thể xảy ra ữên bề m ặt thực phẩm , có thể cho phép vi sinh vật sinh trưởng. Không khí bên ừong thực phẩm được bảo quản cũng rất quan trọng. N ồng độ CƠ 2 khi vượt quá giới hạn có thể làm giảm độ pH của dung dịch, dẫn đến ngăn cản sự sinh trường của vi sinh vật. Bảo quản thịt ở không khí có CO 2 cao hạn chế được vi khuẩn Gram âm, dẫn tới m ột quần thể chiếm ưu thế bời các L a c t o b a c i ì ỉ u s , Bằng cách sử dụng nguyên liệu đóng gới hiện đại cùng vói công nghệ chân không, lượng không khỉ bên ứong các thực phẩm đóng gói sẽ được kiểm soát. Không khí xung quanh thực phẩm chứa CO 2 từ 60% trở lên thỉ vi nấm phá hỏng thực phẩm sẽ không phát triển được. M ột lượng O 2 được giữ lại vì nếu tất cả khỉ O 2 bị loại khỏi thì những loại ua lanh như

C lo s tr id iu m g a s ig e n s e

có thể sinh trưởng được. Loại vi sinh vật này có thể sinh

khí ừong vòng 14 ngày ở 2°c, đẫn tới việc thực phẩm đóng gói bị phình to ra.

25.2. SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT VÀ QUÁ TRỈNH LÀM HỎNG THựC PHẨM Vì thực phẩm lả nguồn dinh dưỡng dồi dào, cho nên nểu có điều kiện bên trong và bên ngoài thích hợp, vi sinh vật sinh sẽ sinh trưởng nhanh chóng, biến những thực phẩm bổ dưỡng và ngon m iệng trở nên có vị chua, có mùi hôi hay được bao phủ bởi nấm. Sự sinh trưởng của vi sinh vật trên thực phẩm có thể dẫn tới sự thay đổi dễ nhìn thấy bởi các màu sắc phong phú do vi sinh vật sinh ra. M ột ữong những thống báo nổi tiếng về chuyện này đa được công bố tò năm 1263. Năm 1870, Bartolomeo Bizio m iêu tả loại vi khuẩn là tác nhân của hiện tượng tạo màu này. Đó là vi khuẩn

S e r r a tìa m a r c e sc e n s.

Thịt và những sàn phẩm bơ, với giá trị dinh dưỡng cao, chửa các carbohydrat dễ sử dụng, lipit và protein, là điều kiện lý tưởng cho vi sinh vật phát triển. Phân giải protein và thổi rữa là kết quả điển hình của sự phá hỏng thực phẩm ở cảc nguyên liệu giàu protein đó. Khi sữa không được tiệt trùng, quá trình làm hỏng sữa sẽ ừ ả i qua 4 bước, sự sản xuất ra axỉt bời

L a c to c o c c u s ỉa c tìs

subsp.

la c tis

có liên quan đển sự sinh trưởng của vi sinh vật

chịu được axit. N ấm m en và nấm sợi đo có khả năng phân giải các axit lactic tích tụ làm

657

cho lượng axit giảm đì. C uối cùng, các vi khuẩn phân giải protein bát đầu hoạt động, dẫn tới phá hủy m ùi vị thực phẩm . Sữa đó ban đầu m ờ đục, cuối cùng có thể trở nên trong suốt ( h ìn h 2 5 .2 ).

H ì n h 2 5 .2 : Q u á tr ìn h là m h ỏ n g c á c s à n p h ẩ m s ữ a . S ữ a tư ơ i (b ê n tr á i)

vò

s ữ a b ị v ó n c ụ c (b ê n p h ả i). S ữ a v ó n c ụ c d o tr á i q u a 4 g ia i đ o ạ n tự

n h iê n c ủ a c á c v i s in h v ậ t là m h ỏ n g s ữ a . K ể t q u ả ỉà tạ o r a c á c c ụ c s ữ a v à d ịc h s ữ a . (T h e o P r e s c o ttH a r le y - K ỉe in , 2 0 0 2 ).

So vởi thịt và b ơ sữa, hầu hết hoa quả, rau xanh có ít protein và lipit hom nên sẽ bị hư hỏng theo kiểu khác. R au xanh b ị h ư hỏng là đo vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn gây thối E r w in ia c a r o to v o r a

tiết enzym thủy phân cacbohydrat. Khí thế oxi hóa khử cao và thiếu

điều kiện khử cho phép thì vi khuẩn hiếu khí và hiếu khí không b ắt buộc sẽ tham gia vào quá trình phân hủy. V i khuẩn dường như không đóng vai trỏ quan trọng trong sự phá hỏng ban đầu của h ầu h ết ừ á i cây m à chỉnh là vi nấm . N hững loại nấm này tiểt enzym và xâm nhập qua lớp vỏ bảo vệ b ê n ngoài. V iệc làm h ư hỏng cũng xảy ra tương tự như vậy với những sản phẩm từ cam quýt được chế biến đông lạnh. N hững sản phẩm này dường như ít hoặc không trải qua xử lý, việc làm hỏng chính do

L a c to b a c illu s

thơm của diacetyl. N ấm m en

và

L e u c o n o s to c

S a cch a ro m yces

và

gây ra, những vi khuẩn này tạo mùi

C a n d id a

cũng cỏ thể làm hỏng nước ép

trái cây. N ước ép trái cây cô đặc có hoạt độ của nước giảm (aw = 0.

8

đến 0. 83), và khi giữ

trong tủ lạnh khoảng -9°c, chúng có thể được bảo quản trong m ột thời gian dài. Tuy nhiên,

658

khi nước ép cô đặc được pha loãng với nước có chửa vi sinh vật, hoặc là nước ép được bảo quản trong vật chứa rửa không sạch thì sẽ bị hư hỏng. Tương tự như vậy, vi sinh vật trong nước ép cô đặc làm lạnh có thể bắt đầu quá trinh làm hỏng sau khi thêm nước vào. Nước ép dùng ngay cũng xuất hiện các vấn đề khác, như giá trị aw đủ cao sẽ cho phép vi sinh vật sinh trưởng. Điều này đặc biệt đúng khi cất giữ nước ép ở nhiệt độ lạnh. M ặc dù có thể dùng biện pháp khử trùng, nhưng hầu hết những người tiêu dùng nhạy cảm với sự m ất vị thơm ngon tự nhiên do khử trùng gây ra.

Hình 25.3: Sự làm hỏng thực phẩm. Khi thực phẩm không được bảo quản thích hợp, các vi sinh vật có thề gây hư hông. Ví dụ: (a) bánh mỳ, (b) ngô (Theo Prescott-Harley-Klein, 2002). Vi nấm là vấn đề đặc biệt của cà chua. Thậm chí khi chỉ thấy vết thâm tím nhẹ nhất trên vò cà chua, nhưng nếu bóc ra, sẽ thấy sự sinh trưởng của nấm. N hững chi nấm được gặp thường xuyên bao gồm

A ỉte A R N r ia , C ỉa d o s p o r iu m , F u s a r iu m

và

S te m p h y ỉiu m .

Sự sinh

trưởng của chúng ảnh hưởng tới chất lượng của sản phẩm cà chua, bao gồm nước ép cà chua và nước sốt cà chua nấm. Vi nấm có thể sinh trưởng nhanh trên những hạt ngũ cốc nếu bảo quản trong điều kiện ẩm ướt

(h ìn h 25.

5). Sự xâm nhập của

C la v ic e p s p u r p u r a

vào hạt gây ra sự nhiễm độc

ergotin. Chất gây ảo giác alkaloid được sinh ra bời nấm này có thể dẫn tới biến đổi tập tính, phát triển không đầy đù, và có thể chết nếu ăn phải hạt bị nhiễm khuẩn. Các tác nhân gây ung thư từ nấm bao gồm các aflatoxin v à các fum onisin. Aflatoxin được tạo ra ở hầu hết các sản phẩm quả và hạt ẩm ướt thông thường. A flatoxin được phát hiện vào năm I960, khi nhiễm độc bởi nấm

1 0 0 ,0 0 0

con gà tây chết do ăn phải bột xay lạc (đậu phộng) bị

A s p e r g illu s fla v u s .

N hững hợp chất vòng phẳng hai chiều xen vào giữa

axit nucleic v à hoạt động như m ột đột biến dịch khung' chất gây ung thư. Đ iều này xảy ra đầu tiên trong gan, chủng được chuyển sang dạng dẫn xuất không ổn định.

659

Động vật, sau khi tiêu hóa thức ăn có aílatoxin BI và B2 sẽ biến đổi các chất này tạo thành aflatoxin MI và M2 (x e m h ì n h 2 5 . 4 ) . Nếu gia súc ăn phài những thực phẩm bị nhiễm aflatoxin này thì chúng cũng thể tồn tại trong sữa và các sản phẩm bơ sữa. Neu có cách sàng lọc nhanh aflatoxin trong ngũ cốc, ta có thể hạn chế sự xuất cảng các các loại ngũ cốc có nguy cơ bị nhiễm. Các loại aflatoxin chủ yếu và dẫn xuất của chúng cỏ thể được tách dễ dàng ra bởi sắc ký bản mỏng và có thể nhận biết được dưới ánh sáng của tia uv đo đặc tính phát huỳnh quang. Không chỉ có trong ngũ cốc, chúng còn được tìm thấy ở bia, coca, nho khô, và đậu tương xay khô.

o

o

0

o

H ì n h 2 5 . 4 : M ộ i s ổ l o ạ i Ạ Ị Ỉ a t o x in . K h i A s p e r g illu s f l a v u s v à m ộ t s ố n ấ m k h á c s in h tr ư ở n g tr ê n th ụ c p h ẩ m ,c h m g c ó th ể tạ o r a a f l a t o x i n g ã y u n g th ư . N h ữ n g c h ấ t n à y c ỏ 4 c ẩ u t r ú c c ơ b à n . ( a ) t h i ế t k ể đ á n h d ấ u d ự a t h e o m à u s ẳ c c ủ a h ợ p c h ấ t d ư ớ i tia c ự c tím s a u k h i tá c h t ù h ạ i v à tá c h c h iể t n h ờ s ắ c ký . H ợ p c h ẩ í B ị v à B ị p h á t h u ỳ n h q u a n g m à u x a n h d a tr ờ i v à h ợ p c h ẩ t G I v à G 2 c ó m à u x a n h

aflatoxin M được tìm thấy trong sữa động vật khi ăn phái aflatoxin typ B. K le ỉn , 2 0 0 2 ).

660

lá

c â y . (b ). H a i l o ạ i

(T h e o

Prescott-Harỉey-

Cuối cùng, điều quan trọng là lượng aflatoxin được vô tình đưa vào qua đường tiêu hỏa của ca thể. Khẩu vị đối với một số loại khẩu phần ăn có vẻ cỏ liên quan tới sự phơi nhiễm aílatoxin: trung bình aílatoxin được đưa vào theo kiểu thực đơn điển hỉnh của người châu Âu là 19 ng/ngày (nanogram), trong khi đó cho thực đơn của người Viễn Đông được ước tính là 103 ng/ngày. Độ nhạy cảm với aflatoxin có thể bị ảnh hưởng do phơi nhiễm bệnh từ trước. Người ta đã phát hiện thấy những người bị viêm gan B nếu bị nhiễm aílatoxin thì có nguy cơ mắc ung thư gan cao hơn gấp 30 lần so với những người viêm gan B mà không phơi nhiễm aflatoxin.

COOH

COOH

Hình 25.5: cẩu tt'ucfumonisin. {Theo Prescoít-Harỉey-Kỉem, 2002). Các fiunonisin do nẩm Fusarium moniliforme sinh ra, lần đầu tiên được phân lập được vào năm 1988, chất này gây nên bệnh viêm chất trắng não ngựa, phù phổi ở lợn, ung thư thực quản ở người. Fumonisin hoật động bằng cách phá vỡ sự tổng hợp, trao đổi chất của các shipgolipit, những hợp chất hoạt động hóa sinh quan trọng có ảnh huởng lên chức năng của tế bào. Có ỉt nhất 10 ỉoại fumonisin khác nhau, cấu trúc cơ bản,của fiimonisin FBI và FB2 được minh họa ở hình 25.5. Ngũ cốc và những thực phẩm chứa ngũ cốc như bột ngũ cốc, bột yến mạch thô, thường hay bị nhiễm Fusarium moniliforme. Fumonisin do nấm này sinh ra sẽ ức chế tổng hợp ceramid, một enzym thiết yếu trong việc sử dụng thích hợp các chất béo trong tế bào. VI thế điều quan trọng là phải bảo quản những sản phẩm này trong điều kiện khô, làm cho nấm không thể phát triển được.

Vi sinh vật nhân chuẩn có thể tổng hợp các chất độc khác thậm chí còn mạnh hơn cà aílatoxin và fumonisin. Chất độc từ tào nhiễm bệnh cho cá, ảnh hưởng cao hơn đến sức khỏe của động vật biển trong chuỗi thực phẩm; chúng cũng có thể làm nhiễm bệnh đển động vật thủy sinh có vỏ cứng (shellfish) và cá vây (fin fish), cuối cùng được tiêu thụ bởi con người. Hầu hết các chất độc được tạo ra bởi tảo giáp (dinoflageilates), và một vài tảo cát (diatoms). Những bệnh chủ yếu của người do hậu quả từ chất độc của tào trong những sàn phẩm từ biển bao gồm chứng mất trí nhớ (amnesic), tiêu chảy, nhiễm độc thần kinh từ động vật thân mềm. {bảng 25. 3). B ản g 25.3:

C á c tr iệ u c h ứ n g đ ộ c c ủ a m ộ t s ố tả o b iể n

(T h e o P r e s c o tt-H a r ỉe y -K le in , 2 0 0 2 )

Hội chứng

NguyỄn nhân

Vector truyền

Loại độc tố

bệnh

Ngộ độc do bọn ký sinh ờ

Aỉexandrìum spp.

Động vật thân

nhỏm Động vật thân mềm

Gymnodỉnium spp.

mềm

Saxitoxin

Pyrodinium spp. Ngộ độc thần kinh do Động

Gymnodìnium breve

vật thân mềm Ngộ độc cá

Brevitoxin

Động vật thân mềm

Gambierdiscus toxicus

Ciguatoxin

Cá bám ờ mạch đá ngầm

Hội chứng quên vì ngộ độc do

Pseudonitzchia spp.

Động vật thân mềm

mềm Dinophysìs spp.

Động vật thân

Động vật thân mềm

Prorocentrum spp.

mềm

Hội chứng Estuary

Pfiesteia piscicidơ

Nước

Hội chứng ỉa chảy do ăn phải

Domoic axit

Động vật thân

Dinophysistoxin

Chưa biết

Hầu hết, những phức chất độc từ tảo biển là bền nhiệt, thưởng gây ra hiệu ứng hệ thống thần kinh ngoại biên, xảy ra thường trong vòng lgiờ sau khi ăn phải.

Hình 25,6: Các độc tổ tảo biển. Cẩu trúc hỏa học của các độc tổ tảo biển tác động tới con gười khi dùng các sản phầm hài sản hoặc nuớc: a. Satitoxin, b. Brevìtoxon, c. ciguatoxin, d. okadaic axit, e. domoic axit. (Theo Prescott-Harìey-Kỉeỉn, 2002). 25.3. PHÒNG CHỐNG HƯ HỎNG THựC PHẨM (Controlling Food spoilage) Cùng với sự khởi đầu của ngành nông nghiệp, sự giảm phụ thuộc vào săn bắn, hái lượm thì nhu cầu bảo quản thực phẩm dư thừa cũng ưở nên vô cùng quan ừọng để tồn tại. Việc sử dụng muối để bảo quản thịt và sản xuất phomat từ sữa đã được thực hiện rất sớm, từ khoảng 3000 năm trước Công nguyên ở vùng Cận Đông. Sản xuất các loại rượu vang, bảo quản cá với thịt băng cách xông khói cũng rất phổ biến trong thời gian này. Mặc dù có truyền thống lâu đời để bảo quản thực phẩm khỏi bị hư hỏng nhưng đến tận thế kỉ XIX thì sự phả hỏng thực phẩm do vi sinh vật mói được nghiên cứu kỹ càng. Năm 1857, Louis Pasteur đã gây dựng nên thời kì mới của ngành Vi sinh vật học Ổng chi ra ràng vi sinh vật là nguyên nhân gây ra hư hỏng sữa. Công trình nghiên cứu của Pasteur trong suốt những 60 cùa thế kỷ XIX đã chứng minh rằng nhiệt độ có thể được sử dụng để khổng chế các vi sinh vật gây hư hỏng các loại rượu vang và bia. Các loại thực phẩm có thể được bảo quản bằng nhiều phương pháp khác nhau (bảng 25.4). Điều đỏ rất cần thiết để loại bỏ hay là giảm thiểu các quần thể gây hư hỏng cùng với các vi sinh vật gây bệnh và để giữ lại giá trị của thực phẩm để đóng gói và bảo quản. Sự nhiễm bẩn thường xảy ra sau khi một gói hay một hộp thực phẩm được mờ ra khá lâu trước khi nó được sử đụng. Điều này tạo cơ hội lý tưởng cho sự sinh trưởng và lây lan các mầm bệnh.

663

Bảng 25.4: Cảc phương pháp cơ bản trong bảo quản thực phẩm Quá trình

Phương pháp Loại bỏ vi sinh vật

Tránh tạp nhiễm vi sinh vật, lọc, ly tâm

Nhiệt độ thấp

Bảo quản lạnh

Nhiệt độ cao

Làm bất hoạt một phần hoặc hoàn toàn các vi sinh vật (khử trùng Pasteur, đóng hộp)

Giảm hoạt độ nước

Loại bỏ nước, lạnh khô, thêm muối hoặc đường.

Bảo quản nhờ hóa chất

Bổ sung các chất ức chế đặc hiệu như: axit hữu cơ, nitrat, sulfua dioxit

Phóng xạ

Sử dụng các tia gamma và u v

ứ c chế các vi sinh vật gây hỏng nhờ vi sinh vật

Bồ sung vào thực phẩm các chất như bacteriocin do vi khuẩn sinh ra để loại trừ các vi sinh vật gây hư hỏng

25.3.1. Loại bỏ các vj sinh vật Các vi sinh vật có thể được loại bỏ khỏi nước, rượu vang, bia, nước ép hoa quả, các loại đồ uống nhẹ, và các chất lỏng khác bằng cách lọc. Cách này có thể làm giảm hoặc loại bỏ hoàn toàn vi sinh vật. Sử dụng màng lọc và ly tâm có thể đạt được hiệu quả tối đa. Đối với bia, người ta lọc chứ không khử trùng Pasteur nhăm giữ được hương vị tự nhiên cùa bia.

25.3.2. Nhiệt độ thấp Làm lạnh ở nhiệt độ 5°c sẽ ngăn cản sự sinh trưởng của vi sinh vật, mặc dù với sự bảo quản tối ấy thì nhóm ưa lạnh và nhóm chịu lạnh thậm chí vẫn sinh trưởng và làm hư hỏng thực phẩm. Sự sinh trưởng chậm của vi sinh vật ờ nhiệt độ dưới - 10°c đã được nghiên cứu, đặc biệt với nước ép hoa quả , kem, và một vài loại trái cây. Nhiệt độ thấp làm giảm số lượng của nhiều vi sinh vật nhưng không dẫn đến giảm đáng kể ờ tổng số quàn thể vi sinh vật.

25.3.3. Nhiệt độ cao Kiểm soát quần thể vi sinh vật trong các loại thực phẩm bằng phương pháp dùng nhiệt độ cao có thể làm hạn chế một cách đáng kể sự lây lan bệnh tật và hư hỏng thực phẩm. Lần đầu tiên quá trinh này được Nicholas Appert sử dụng vào năm 1809 khi cung cấp mọt phương pháp an toàn để bảo quản thực phẩm, đặc biệt là khi tiến hành đóng hộp sản phẩm thương mại {hình 25. 7).

Việc vận chuyển và cung cấp thực phẩm cho một lượng lớn binh sĩ đã gặp nhiều khó khăn. Do nhu cầu phài dự trữ thực phẩm trong điều kiện tác chiến và khí hậu khẳc nghiệt đã khiến cho chính phủ Pháp ừao giải thưởng 12. 000. 000 ửans vào năm 1975 cho người nào nghĩ được cách giữ được thực phẩm còn tốt trong điều kiện chiến trường. Cuối cùng giải thưởng được trao cho Nicholas Appert, một người thợ làm kẹo, do ông tìm ra cách đưa thịt và các sản phẩm khác vào dụng cụ, đóng kín lại rồi gia nhiệt. Nhờ thể sản phẩm được giữ ổn định được rất lâu. Mặc đù đã có công trình nghiên cứu đi trước của Leuwenhoek, nhưng Appert không có khái niệm gì về vi sinh vật để giúp cho việc giải thích tính hiệu quả cùa quy trình cùa mình. Dụng cụ của ông là những bình thuỳ tinh lớn, bít kín bằng nút bần và keo cá. Bằng sự quan tâm và sự chú ý đặc biệt để mô tả tỉ mỉ, ông có khả năng làm nóng các chai này trong nước đun sôi để tạo ra thực phẩm có thể bảo quản trong vài năm. Công trình của Appert lả cơ sở quan trọng cho những nghiên cứu sau Louis Pasteur.

Hình 25.7: Một quy trình đổng hộp. Kiểm soát cảc vi sinh vậtỊà một bước rổt quan trọng vổ bảo quản thực phẩm. Ngựời công nhân đổ đậu vào trong một bể lởn, sạch đề làm súp rau. Sau khi làm xong súp thì cho vào các hộp. Môi hộp có thể được ỉàm nóng, rồi hàn kin. Quá trình diễn ra ở nhiệt độ từ 11 0 - Ỉ2Ỉ°C để tiêu diệt các vi sinh vật gây hư hỏng đồ hộp.

Hình 25.8: Bào quản thực phẩm bằng đong họp. Kỹ thuật này được sứ dụng rộng rãi và rất hiệu quả. Đóng hộp không đủng cổ thể gây ra hư hòng hộp.

Thực phẩm đỏng hộp được đun nóng ừong các thùng đặc biệt ờ nhiệt độ 115°c trong khoảng thời gian từ 25 đến hơn 100 phút, thòi gian chính xác và nhiệt độ phụ thuộc vào bản chát cùa thực phẩm. Đôỉ khi đóng hộp không giết chết tất cả các vi sinh vật, mà chỉ các sinh vật làm hỏng thực phẩm (chảng hạn như giữ lại các vi khuẩn không có khả năng sinh trưởng do tính axit của thực phẩm). Sau khi xử lý nhiệt các hộp được làm nguội nhanh , thường là bàng nước lạnh. Sự diệt vi sinh vật theo phương pháp tiệt trùng Pasteur đòi hỏi phải làm nóng thực phẩm tới nhiệt độ không cao lăm nhưng đủ giết chết phần lớn các vi sinh vật gây bệnh và làm giảm tối đa các sinh vật gây hư hòng thực phẩm. Trong quá trình chế biến sữa, các loại bia và các loại nước ép hoa quả bằng nhiệt độ thấp thỉ giữ ở nhiệt độ 62. 8°c trong vòng 30 phút. Cảc sản phẩm cũng cỏ thể được giữ ờ 71°c trong 15 giây, một

665

nhiệt độ cao, quy trình ngắn. Sữa có thể được xử lý ở 125°c trong 2 giây vói quy trình nhiệt độ siêu cao. Quy trình ngắn đưa đến kết quả là hương vị tăng và hạn sử dụng được kéo dài. Mặc cho những cố gắng để loại trừ các vi sinh vật làm hư hỏng thực phẩm trong quá trình đỏng hộp, nhưng đôi khi những thực phẩm đỏng hộp vẫn bị hư hỏng nặng (hình 25.8). Điều này có thể do thực phẩm bị hư từ trước khi đỏng hộp, sản xuất dưởi tiêu chuẩn ữong quá trình đóng hộp và sự rỉ nước ô nhiễm vào hộp trong thời gian làm mát. Thực phẩm hư hỏng có thể bị biến đổi về những đặc tính như màu sắc, kết cấu, mùi vị, và hương vị. Các axit hữu cơ, các sulfit, và các khí (đặc biệt là CƠ2 và H 2S) cỏ thể được tạo ra. Đổi với sự hư hỏng do axit hỏa, không tạo thành khí và hộp thực phẩm không bị căng phồng ra, nhưng đồ chứa bên trong thì bị chua vì có mặt các axit sinh ra do lên men. Neu các vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm do tạo ra khí, thì cả đáy cùa hộp cũng bị phình lên. Axit trong các thực phẩm cỏ độ axit cao cỏ thể phản ứng với sắt của hộp để giải phóng ra hydro và hình thành chỗ lồi khí hydro. Sự tạo ra hydro sulfit bởi Desulfoto macuỉum có thể gây ra sulfiia độc. Sự loại nước, chẳng hạn như làm lạnh khô để tạo ra các loại thực phẩm đông lạnh, hiện nay là một cách thức rất phổ biến để loại trừ sự sinh trưởng của vi sinh vật. Quy trình hiện đại này nhiều khi được thay thế cho các quy trinh cũ trong đó ngũ cổc, thịt, cá, và các loại trái cây được làm khô.

25.3.4. Bảo quăn bằng phương pháp hoá học Rất nhiều các chất hoá học có thể được sử đụng để bảo quản các loại thực phẩm, và những chất này được quy định nghiêm ngặt bởi Cơ quan Quản lý Thuốc và Thực phẩm Mỹ (the Ư. Food and D rug Administration) và được liệt kê vỉ là được công nhận về mặt an toàn, hoặc bởi GRAS (bàng 25. 5).

s

Chủng bao gồm các axit hữu cơ đom giản, sulfit, etylen oxit natri nitrit, và etyl formate. Các chất hoá học này ảnh hưởng tới các vi sinh vật bàng cách làm bất hoạt một vài yếu tổ quan trọng của tế bào. Chẳng hạn, chúng có thể phá huỷ màng sinh chất, hay làm biến tính nhiều loại protein cùa tế bào. Nhiều hợp chất khác cản trở chức năng của axit nucleic, do đó đã ức chế tế bào sính trưởng. Hiệu quả của các hoá chất dùng để bảo quản còn phụ thuộc vào pH cùa thực phẩm. Chẳng hạn, natri propionat hầu như có hiệu quả ở pH thấp, khi chúng về cơ bản không bị phân ly và có khả năng được các lipit của vi sinh vật thu nhận. Các loại bánh mỳ, với giá trị pH thấp của chúng, có thể được bảo quản bới natri propionate. Các chất bảo quản hoá học còn được sử dụng đổi với các sản phẩm ngữ cốc, bơ sữa, rau và trái cây. Natri nitrit là một chất hỏa học được sử dụng để bảo quản dăm bông, nước sốt, thịt muối và các loại thịt xông khói do có thể ức chế sự phát triển của C l o s t r i d i u m botuỉinum và ức chế các bào tử nảy mầm. Điều này giúp chúng ta khỏi bị ngộ độc và giảm thiểu múc độ hư hỏng cùa thực phẩm. Ngoài việc giữ cho thịt khỏi bị hư hỏng,

khi niưit phân giải thành axit nitric, phản ứng với sắc tố heme còn làm cho thịt có màu đỏ. Nitrit hiện nay được thêm vào với một lượng rất nhỏ, và có thể sẽ không sử dụng chúng. Bảng 25.5: Các nhỏm hóa chất chính sử dụng trong bảo quản thực phẫm Các chất bảo quán

Nồng độ cao nhất

Hiệu quả tới các vi sinh vật

Propionic axit /propionats

0.32

Nấm sọi

Bánh mỳ, bánh ngọt, bơ, ức chế trong quá trình nhào bột

Axit sorbic/sorbats

0.2

Nấm sợi

Bánh mỳ, bánh ngọt, bo, ức chể trong quá trình nhào bột

Benzoic axit/benzoats

0. 1

Nấm men, Nấm sợi

Bơ thực vật, hoa quả đầm, nước táo, sốt cà

Parabensa

0. 1

Nấm men, Nấm sợi

CácHoại bánh quy, đồ uổng không chứa cồn, hoa quả dầmt salat

SCựsuIíĩt

200-3ooppm

Côn trùng, vi sinh vật

R! đường, hoa quả khô, rượu vang, nước chanh

Natri diaxetat

700ppm

Gia vị, các loại hạt

Etylen /propylene oxit Dehitroaxetic axit Natri nitrit Caprylic axit Etyi formate

0.32

Nấm men, Nấm mốc, sâu hại Nấm mổc Côn trùng Clostridia Nấm mốc Nấm men, Nấm mốc

65ppm 120ppm 50-200ppm

Thực pbầm

Bánh mỳ Dẳu tây, bỉ ngô Các sản phẩm từ thịt Đóng gói bơ Hoa quả khô, các loại hạt

.........................

25.3.5. Sự bức xạ Sự bức xạ, cả sự ion hoá lẫn không ion hoá, đều cỏ một lịch sử đáng chú ý liên quan đến bảo quàn thực phẩm. Bức xạ tia từ ngoại được sử dụng để kiểm soát các quần thể vi sinh vật trên bề mặt các thiết bị phòng thí nghiệm và thiết bị xử lý thực phẩm, nhưng nó không thể xuyên sâu vào thực phẩm. Phương pháp chủ yếu được sử dụng cho sự khử trùng thực phẩm bằng bức xạ là chiếu tia gamma từ một nguồn Coban 60. Sự bức xạ điện từ có khả năng xuyên thấu rất mạnh và phải được sử dụng với các thực phẩm ẩm ướt bởi lẽ sự bức xạ này tạo ra các peroxit từ bên ừong các tế bào vi sinh vật, dẫn đến sự oxi hoá các thành phần tể bào mẫn cảm. Quá trình chiểu xạ thực phầm được đặt theo tên của Nicholas Appert (radappertization), có thể tăng hạn sử dụng của thực phẩm biển, .các loại trái cây và rau xanh. Để tiệt trùng các sản phẩm thịt thường sử dụng từ 4. 5 đển 5. 6 megarad. Deinococcus radiodurans là một trong số các vi khuẩn kháng bức xạ mạnh, chúng có cấu

667

trúc thành tế bào phức tạp và mô hình sinh trưởng bộ bốn. Ohúng cỏ một sức chống chịu rất mạnh với liều lượng bức xạ cao, mặc dù là cơ chế này hiện vẫn còn chưa được hiểu rõ.

25.3.6. ứ c chế bằng các sản phẩm của vỉ sinh vật Ngày càng có sự tăng cường sử dụng các bacteriocin (chất diệt vi khuẩn do vi khuẩn sinh ra) để bào quản thực phẩm. Bacteriocin là các protein diệt khuẩn, chúng liên kết với các vị trí đặc hiệu trên tế bào, ảnh hường tới tính nguyên vẹn và chức năng của màng tế bào. Sản phẩm được phê chuẩn hiện nay là nisin. Nisin được sản xuất từ một số chủng Streptococcus ỉactỉs, m ột protein phân tử nhỏ k ị nước, không độc đối với con người v à tác động chủ yếu lên vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là Enterococcus /aecaỉis. Nisin có thể được đặc biệt sử dụng trong các thực phẩm có độ axit thấp để tăng sự bất hoạt Clostridium botuỉinum trong quá trình đóng hộp và ức chế sự nảy mầm của các bào tử sổng sót. Bacteriocin hoạt động bằng cách làm tiêu hao lực đẩy proton (PMF) của một số vi khuẩn mẫn cảm. Những hợp chất này có rất nhiều tên, phụ thuộc vào các sinh vật sản sinh ra chủng. Bacterỉocin hoạt động bằng sự hình thành các rãnh ưa nước trên bề mặt củã một số vi khuẩn mẫn cảm, giải phóng các phân tử có khối lượng thấp; điều này xảy ra giống như sự ức chế tổng hợp peptidoglican, tác động giống như chất tẩy rửa lên màng sinh chất. Bổ sung bacteriocin vào các loại thực phầm như phomat sẽ làm giảm số lượng vi khuẩn Listeria monocytogens từ 2 đến 3 lần đối với phomat đã được bảo quản 180 ngày. Các hợp chất tương tự cũng đã tim thấy ứong các sinh vật nhân chuẩn.

25.4. CÁC BỆNH DẢN ĐẾN TỪ THựC PHẨM (Food-borne Diseazs) Các bệnh dẫn đến từ thực phẩm có ảnh hưởng toàn cầu. Ở Hoa Kỳ, theo thông tin gần đây từ Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh (the Centers of Diseazs Control and Prevention), các bệnh liên quan đến thực phẩm hàng năm xảy ra tới 76 triệu ca, trong số đỏ chỉ có 14 triệu ca biết được tác nhân gây bệnh. Trong số này, có 325 000 ca phải vào viện và ít nhẩt có 5 000 ca tử vong mỗi năm. Từ năm 1942, số lượng các mầm bệnh đâ biết sinh ra trong thục phẩm tâng lên hơn năm lần. Đó có phải là những vi sinh vật mới hay không? Trong hầu hết các trường hợp, những mầm bệnh này là các tác nhân đơn giản mà chủng ta có thể mô tả được, dựa vào sự hiểu biết về sự đạng vi sinh vật. Hiện nay, được biết các virút Norwalk, vi khuẩn Campylobacter jejuni và Salmonella là các nguyên nhân chỉnh gây bệnh từ thực phẩm. Ngoài ra, vi khuản Escherichia coỉi 0157:H7 vả Listeria là các tác nhân gây bệnh liên quan đến thực phẩm rất đáng chủ ỷ. Có hai loại cơ bản về bệnh ỉiên quan đến thực phẩm là: bệnh lây nhỉễm từ thực phẩm và sự nhiễm độc thực phẩm. Tất

cả các loại bệnh sinh ra từ thực phẩm này lại đều liên quan đến vấn đề vệ sinh. Cho dù là lây truyền qua nước hay qua thực phẩm thì con đường phân - miệng vẫn là chủ yếu. Chảng

hạn như vòi rửa, côc chén, và thớt cũng đóng một vai trò nhất định trong con đường lây nhiễm phân - miệng. 25.4.1. Sự lây nhiễm từ thự c phẩm (Food-borne infection) Sự lây nhiêm từ thực phẩm có liên quan đến các mầir* bệnh sinh trường bên trong vật chủ, bao gồm sự xâm chiếm vào các mô và hoặc giải phóng các chất độc. Các bệnh chù yếu thuộc loại này được tóm tẳt trong bảng 25. 6. Bang 25.6: Một số bệnh nhiễm khuẩn sinh ra từ thực phẩm 1 Thò'i gian tồn tại Nguồn thực phẩm Bệnh Vi sinh vật trong thực phẩm và các đặc tính Bệnh do Salmonella

s. typhinmrinm, s. erỉteritidis

8—48 giờờtliịt Enterotoxin và Cytotoxin

Gia súc, cá, trứng, Các sân phẩm bơ sữa

Bệnh tiêu chảy do Arcobacter

Ârcobacter buizleri

Tiêu chày cấp, chửng co ruột hồi quy

Bệnh do Campylobacter

Campylobacterjejuni

Tinrờng từ 2-10 ngày Hầu hết các độc tố là bền nhiệt

Bệnh do Listeria

L. monocytogens

Bất định, liên quan đến viêm màng não, sảy thai

Sản phầm thịt, đặc biệt là thịt lợn, sữa

Escherichia coli

E. coỉi, gồm cà serotyp 0157:H7

24-72 giờ

Thịt bò tái, sữa chưa tiệt trùng

24-72 giờ

Sản phấni cùa trứng, bánh pudding

Bệnh do Shigella

Shigella sonnet, jiexneri

s.

Các sản phẩm thịt, đặc biệt là sàn phẩm gia súc Sữa, thịt lợn, các sàn phẩm gia súc, rurớc

Bệnh do Yersinia

Yersinia enterocoỉitỉca

16—8 giờ Một số độc tổ bền nhiệt

Sữa, các sản phẩm thịt và phomát

Tiêu chảy do Plesiomonas

Pỉesiomonas shigeỉỉoides

1-2 giờ

Động vật thân mềm chưa chế biến.

Vibrio parahaeinolyticus

Vibrio parahaemoỉyticus

16—4S giờ

Hải sàn, động vật thân mềm

Bệnh nhiễm khuẩn Salmonella do sự hấp thụ nhiều loài Salmonella, đặc biệt là s. typhimurium và s. enteritidis. Viêm dạ dày ruột (gastroenteritis) là căn bệnh nguy hiểm liên quan tới các loại thực phẩm như là các loại thịt, trứng, cùng với các triệu chứng nặng

669

xảy ra sau một thời gian ủ bệnh ngấn, khoảng 8 giờ. Sự lây nhiễm Salmonella cỏ thể tăng lên do nhiễm bẩn từ các công nhân trong các nhà máy, cừa hàng. Campylobacter jejuni được coi là một trong những nguyên nhân đẫn đến viêm dạ dày ruột cấp tính ở người và có thể liên quan tới mọi lứa tuổi. Mầm bệnh quan trọng này thường được truyền từ các sản phẩm gia cầm không hoặc chưa được nấu chín. Chẳng hạn, sự lây truyền thường xảy ra khi các dụng cụ của bếp ăn vả các hộp chứa được sử dụng để chế biến thịt gà và sau lại sủ dụng để làm salat. Chỉ khoảng 10 tế bào Campylobacter jejuni sống cũng có thể đẫn đến tiêu chảy. Ngoài ra c. jejuni còn được truyền từ sữa chưa được xử lý và chúng đã được tìm thấy trong rất nhiều loại thịt đỏ. Nấu chín kĩ thực phẩm giúp chống lại sự lây nhiễm các bệnh. Bệnh do Listeria gây ra bởi Listeria monocytogens vẫn còn là đáng quan tâm, chẳng hạn như sự bùng phát bệnh xảy ra ờ Nam California vào năm 1985. Sự bùng phát này xảy ra đo khử trùng không đúng theo phương pháp Pasteur đối với sữa đùng trong sản xuất phomat kiểu Mexico, ít nhất 86 trường hợp lây nhiễm bệnh , trong đó 58 trường hợp cỏ liên quan đến các cặp mẹ và con, 47 người đã tử vong. Sự kiện này đã được phát hiện nguyên nhân là đo rò ri các hộp trong quy trình khử trùng theo phương pháp Pasteur. Các lỗ rò rỉ này đã cho phép các vi khuẩn lọt vào bên trong sữa chưa được xử lý rồi nhiễm vào sữa trước khi sản xuất phomat. Hiện nay, Eschirichia coỉi được coi là vi khuẩn gây bệnh từ thực phẩm đáng được lưu tâm. E. coli 0157:H7với kháng nguyên đặc hiệu thân (O) và kháng nguyên ỉông (H), được cho là đã nhận các gen độc, gây tiêu chảy từ Shigeỉỉa làm cho chúng cỏ khả năng gây ra bệnh mới. Chủng này được phát hiện đầu tiên vào năm 1982, hiện nay đa được nghiên cứu rất kỹ. Mầm bệnh lan truyền qua con đường phân - miệng với liều gây nhiễm chỉ khoảng 500 vi khuẩn. Bệnh tiêu chày ra máu do E. coỉi đã được tìm thấy ở các sản phẩm thịt như hamburger, xúc xích Ý, trong các đồ uổng nưỏc ép trái cây không được khừ trùng theo phương pháp Pasteur, trên các loại hoa quả, rau xanh và ở cả nước giếng chưa được xử lý, Tháng 8 năm 1997, khoảng 1,1 tấn hamburger đã bị thu hồi do một xí nghiệp chế biến thịt đã để nhiễm E. coli 0157:H7. Vài năm sau, một em bé đã tử vong ở Denver, Colorado sau khi uống phải nước trái cây khồng được khử trùng theo phuctng pháp Pasteur. Nhìn chung, ừẻ em là những người dễ mẫn cảm với loại mầm bệnh này. Phòng chống nhiễm E. coĩi 0157:H7 vào thực phẩm là điều vô cùng quan trọng từ khâu sản xuất cho đến khâu tiêu thụ. vấn đề vệ sinh phải được kiểm tra kĩ càng trong các lò mổ lớn, nơi đễ xảy ra sự tiếp xúc giữa thịt với phân. Thậm chí các loại trái cây và rau xanh cũng cần phải được quân lý một cách cẩn thận khi nhập khẩu vì có thể gây ra bùng phát bệnh. Tránh làm nhiễm khuẩn thực phẩm .qua tay và cảc dụng cụ, làm sạch thởt thái và các đồ đùng một cách thích hợp để làm giảm tổi đa sự lây nhiễm. Có thể giảm thiểu nguy cơ này bàng cách tiêu diệt các mầm bệnh bằng tia gamma, một phương pháp bảo quản thực phẩm sẽ được sừ dụng rộng rãi.

670

Một tác nhân lây nhiễm khác đang là mối lo láng toàn cầu trong vấn đề an toàn thực phâm là prion, tác nhân gây ra bệnh Creuzfeldt —Jakob (CJD). Đây là một nhóm bệnh gây thoái hoá dan dân thân kinh được gọi là bệnh xốp não, xuất hiện ừong các trang trại nuôi bò và được gọi là bệnh bò điên. Hiện nay, do xảy ra nhiều bệnh CJD mới ở người nên lệnh câm nhập khâu thịt bò đã được ban hành ở rất nhiều khu vực. Phương thức chủ yếu lây truyên CJD giữa các động vật là do sử dụng các mô động vật có vú làm thức ăn cho động vật nhai lại. Hiện tại còn nhiều khó khăn ữong việc phát hiện những sản phẩm động vật bị cấm được dùng làm thức ăn cho động vật nhai lại. Thực phẩm được vận chuyển và tiêu thụ ờ trạng thái không nấu là nguồn chính gây nên sự lây nhiễm các bệnh. Đáng lưu ý hơn khi tiếp xúc với nước bị nhiễm bẩn tại bất cứ thời điểm nào của việc sản xuất và tiêu thụ. vấn đề này trở nên cấp bách hơn khi sự luân chuyển ngày càng tăng các sản phẩm tiêu thụ trên khắp thế giới, đặc biệt là các sản phẩm sống sẽ làm gia tăng sự lây nhiễm bệnh.

Hình 25.9. Phát hiện viruí dựa trên phương pháp nuôi cạy và phương phâp phân tứ. _ X J í'ĩ S T ’■ t r M , f uíỉ ^ ° Ỉt/J! Th/m P5 ĩkht ù f khả L CứCí ĩnmẩt ^ ; thì S vân ậl chi năng tạo thành vệt tan

Hình 25. ÌO. Cyclospora cayetạnemỉs, một dọng nhiêm qmn trọng ở thực phâm chưa chê biến. Cycĩospora cayetanensis thường CÓmột ở nưởc <>•*■ «V nhiẽT òi thêphan lập đ w c Z „ g Z : phẩm bị nhiễm do CÓchửa một nang họp tử với hào tư nang. bar-5fm.-

kiểm tra được sự có mội của nucleic axit. Cỏ linh lăng, các loại hạt đậu, cải xoong, đậu xanh, mù tạt, hạt đậu nành bị nhiễm bẩn có thể là các nguồn chủ yếu gây ra thương hàn và dịch tả. Các loại động vật biển thân mềm và một sổ loài cá cũng là những mối lo lắng đáng kể trong vấn đề an toàn thực phẩm. Nước thải chưa được xử lý có thể lây nhiễm vào các khu vực cá sinh trưởng, thêm nữa các mầm bệnh từ nước rihư Vibrio phổ biến trong các

671

nguồn nước ở các tháng ấm áp. Các loại virut cũng là vấn đề nan giải. Sò là loài lọc được khoảng vài lít nước mỗi ngày, từ đó dẫn đến sự tập trung tiềm tàng của ít nhất 100 loại virut đường ruột khác nhau. Phương pháp RT —PCR có thể dùng để phát hiện ARN của các virut trong sò. Tuy vậy, sự hạn chế của các kỹ thuật sinh học phân tử để phân biệt giữa các phân tử lây nhiễm và không lây nhiễm lại là một vấn đề lớn. Chẳng hạn, xử lý u v có thể bất hoạt rất nhiều ARN của virut mà không cần phải loại trừ tín hiệu RT —PCR cho dù các virut không còn tái sính trong môi trường thích hợp nữa. (hình 25. 9). Các cơn mưa lớn ờ những vùng động vật thân mềm sinh sống có thể gây ra sự lan tràn mầm bệnh. Sự vận chuyển các sản phẩm nông nghiệp thô bàng đường hàng không đang là vấn đề đáng được lưu tâm. Một ví dụ điển hình là việc xuất khẩu quả mâm xôi từ Trung Mỹ vào Hoa Kỳ và Canada đã gây ra sự bùng phát nhiễm độc Cycỉospora cayetanensis, một loại động vật nguyên sinh đơn bảo gây tiêu chảy ờ người. Loài sinh vật này có chu trinh sống phức tạp, so với Giardia và Cryptosporidium, những loài lây nhiễm ngay sau khi rơi vào phân, thì Cycỉospora không lập tức lây nhiễm; sự hình thành bào tử và sự trưởng thành cần 12 tiếng sau khi giải phóng khỏi cơ thể.

25.4.2. Sự nhiễm độc từ thực phẩm (Food-borne Intoxications) Sự sinh trường của vi sinh vật trong thực phẩm có thể dẫn đến ngộ độc thực phẩm, các triệu chứng ngộ độc được biểu hiện ngay sau khi tiêu hoá thực phẩm. Chất độc được tạo ra ừong thực phẩm có thể liên kết với các tể bào vi sinh vật hoặc có thể được giải phóng ra khòi tể bào. Hầu hết các chủng Staphylococcus aureus gây viêm ruột có liên quan đến sự tổng hợp các ngoại độc tố. Do một số protein chịu được nhiệt nên việc đun nóng không thể đáp ứng được vẩn đề an toàn thực phẩm một cách triệt để. Tác động của các độc tố rất nhanh nên triệu chửng bệnh thường xảy ra ữong vòng 2 đến 6 giờ. Khoang mũi của người là nơi lưu chứa các s. aureus, thông thường vi khuẩn này được truyền từ tay người này sang người khác rồi lây nhiễm vào thức ăn. Sự sinh trưởng và tạo ra các độc tố ruột thường xảy ra khi thực phẩm bị nhiễm khuẩn để ở nhiệt độ phòng ứong vài tiếng. Ba loại trực khuẩn Gram dương là nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm là Clostridium botuỉinum, Clostridium perfringens và Bacillus cereus. Thực phẩm bị nhiễm Clostridium perfringens ngày càng ưở nên phổ biến. Những vi sinh vật này sính ra các ngoại độc tố, khi sinh trường đến mức 106 vi khuẩn ưên một gam thực phẩm hoặc cao hom mới dẫn đến khả năng gây bệnh. Chúng thường cư trú ở đất trồng trọt, nước, thực phẩm, chất điều vị và ở đường ruột. Các tế bào hình thành bào tử trong đường ruột. Độc tố ruột là một loại protein đặc biệt, được tạo ra trong suốt quá trình hình thành bào tử. Độc tố ruột có thể được phát hiện trong phân cùa người bị nhiễm độc. Thực phẩm nhiễm độc c. per/ringens rất phổ biến và xảy ra sau khi sản phẩm thịt được hâm nóng. Nếu thực phẩm

672

được làm nguội từ từ thì sự sinh trưởng của vi sinh vật có thể xảy ra. Ở 45°c, sau khi bắt đầu sinh trường 3 giờ, độc tố ruột có thể được phát hiện ra. Hàng loạt các triệu chửng: tiêu chảy, b u ồ n nôn, và co rút bụng có thể xảy ra ừong vòng 8 đến 16 tiếng. Khoai tây bỏ lò được bọc trong các giấy nhôm có thể là môi trường tốt cho các vi sinh vật gây bệnh, thậm chí ngay cả sau khi rửa sạch thì khoai tây vẫn có c. botuỉinum do chúng tồn tại trong đất từ trước. Nếu khoai tây bọc trong giấy nhôm không được cấp đủ nhiệt trong quá trình nướng thì các Clostridium vẫn có thể sống sót và nhanh chóng tạo độc tố sau khi bỏ ra khỏi lò. B. cereus cũng là mối lo lắng cho các thực phẩm chửa tinh bột. Chúng có thể gây ra hai loại bệnh khác nhau phụ thuộc vào loại độc tố sinh ra: một loại gây nôn và buồn nôn với thời gian ủ bệnh từ 1 đến 6 giờ, còn một loại thì gây ỉa chảy với thời gian ủ bệnh từ 4 đến 16 giờ. Loại gây nôn thường xuất hiện trong cơm, trong khi loại gây ia chảy lại xuất hiện nhiều loại thực phẩm khác nhau. 25.5. PHÁT HIỆN CÁC TÁC NHÂN GÂY BỆNH SINH RA TỪ T H ự C PHẢM Một vấn đề chính trong việc duy tri an to à n thực phẩra ỉà việc cần th iế t phải nhanh chóng tìm ra các vi sinh vật để hạn chế sự bùng phát, lây lan ừong cộng đồng. Quá trình này rất quan trọng do sự phân phối lan tràn các nguồn thực phẩm dễ ôi thiu. Các kĩ thuật nuôi cấy vi sinh đạt tiêu chuẩn có thể đòi hỏi hàng ngày đến hàng tuần để phát hiện một cách chắc chắn về các mầm bệnh. Việc phát hiện thường phức tạp do sự tồn tại của các mầm bệnh ít hơn so với các vi sinh vật bản địa. Hơn nữa, thành phần cấu tạo hóa học và vật lí khác nhau của thực phẩm có thể làm cho việc phân ỉập ừở nên khỏ khăn. Kĩ thuật kháng thể huỳnh quang, kỹ thuật ELISA, kỹ thuật miễn địch phóng xạ cho kết quả được công nhận. Những kĩ thuật này có thể được sử dụng để phát hiện ra lượng nhỏ các kháng nguyên gây bệnh đặc hiệu. Các kĩ thuật sinh học phân từ cũng được sử dụng thêm trong việc phát hiện các vi sinh vật gây bệnh. Các phương pháp này cho 3 mục đích: (1) phát hiện sự cỏ mặt của mầm bệnh một cách đặc hiệu; (2) phát hiện các loại virut không thể sinh trưởng một cách thuận lợi (3) phát hiện các mầm bệnh sinh trưởng chậm hoặc không thể nuôi cấy. Các mầm bệnh hiện nay cỏ thể được nhận điện bởi trình tự baza ADN và ARN với các mẫu dò đặc hiệu, thường từ 14 đến 40 bazơ. Chúng có thể được tạo nên nhờ các endonucleaz giới hạn hoặc bằng tổng hợp hóa học trực tiếp. Các mẫu dò được đánh dấu bằng cách kết hợp với các marker enzym, các đồng vị, hoặc phát quang/huỳnh quang. Ưu điểm chính trong việc sử dụng phương pháp này đỏ là độ đặc hiệu và tốc độ tìm kiểm các vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy.

673

•ft

»*

•«

»* **»

mt ■*

99 #»«<**»»

* mmé-ểmm-mmmm*ềft?mrnẹ•»«»••»•» • #*«*«••»«•#«»»»•*«•«#»•*»«•«•••»«••«»«•• «»•■&*«**»«•••*»«*»«#»#♦#»*• *«••»•! *»*•«•* w##see#s«ww*»é#«4»**•«»»#»#••#«»#**#*•» I ft '7f ."»m> » * i i » » • » « * * « • » t i » M> » § • > » ■ » ii9*m«**«M*>i»«i «#«**** »***«*«• •*»*«« fettdft * * * * * ■ * « * í ề« * * * * • » « » * • • # * w « « # -•• « » * » * « • * * • • « ■ * * » • « » « * • » • « • • « ■»«#•••»»* ••••««i»i» ?«"«»'»9*«*aB«C-*«-£««»S4S • » * : * • ft* »B • • « « « * < ) •

«*«#*#*••••••»•♦#»*»*«»*«•»*• •*•*«•»»*•• *»

**« *» **» ••

«a*

*•«

*•«

4«»«

4Í* *.*» *# » •# « •* *•%►••»* * * « » » » * • ♦ • * # * • * * » • • *«»«« • **« $•*««*«**•«##*«•*« *«*••##**•#** *% mm*m éề*m iint9«••»•«•••*»«*■»»»««#»**<»•««•» *«* mm m **» #»*»•«* ******* •«•* ••• »33» » « » » * * • • « • 0 • • • « » « « 9 « * » * * « « * # • * •

» * * # * * « * • • « • • * * »»«»■»• • » • » * • • • * * « • # * « « • •# ** ••*« *» » *» **•» « **•« •*•*« *» *» » *• * • * • • •

*««•* #*»»# ***»•««*»**»»m*»■•*»«♦•*•«*» - 4*4*«»*«•-•*«•-*«««*<*• ft* * * • * « * • • .

*M0*»*••#* *•«&««•$«»***•«« ***** »#«»*»• •##■«'*$Pie* ***•*»• *#*•••

Hình 25.11: Các mẫu dò phân tử và các vi sinh vật thực phẩm. Ngày nay, các kĩ thuật sinh học phân tử được sử dụng nhiều trong các phân tích vi sinh vật học thực phẩm. Anh phỏng xạ tự chụp của cùa một mẫu dò Listeria monocytogens được gắn phỏng xạ dựa vào 100 mói trường Listeria. Chi có môi trường nuôi cấy Listeria monocytogens cho trình tự tương ứng và liên kết với mẫu dỏ ADN, sẽ làm tối các phim của ảnh phổng xạ tự chụp, còn các loài Listeria khác không phản ứng với mẫu dò. (Theo Prescott-Harỉey-Kleìn, 2002). Trong ví dụ này, một hệ thống màng kẻ ô kị nước đã được sử dụng. Các môi trường Listeria monocytogens là môi trường gắn phóng xạ nhờ đó chúng liên kết với các mẫu dò, ưong khi đó các loài Listeria khác không có sự liên kết này. Một ví dụ khác về việc sử dụng các kĩ thuật sinh học phân tử trong phát hiện E. coỉi. E. colỉ 0 1 57:H7 được phân tập và xác định bàng các môi trường chọn lọc, các bộ kit phát hiện nhanh (xem hình 25. 12), các kỹ thuật nhận diện nhanh dựa trên các mẫu đò, hay các mẫu dò huyết thanh đặc hiệu và kĩ thuật PCR. Các kĩ thuật này cũng đa được mở rộng cho phép tìm ra một số tể bào đích trong các quẩn thể lớn các vi sinh vật. Ví đụ như, băng việc sử dụng PCR, có tới 10 tế bào E. coỉi sinh độc tố có thể được phát hiện ra trong một quần thể 105tế bào được phân lập từ các mẫu phomat mềm. Nhờ vào hệ thống PCR, có thể phát hiện được 2 đơn vị hinh thành khuẩn lạc cùa 1Salmonella từ 24 đến 48 giở, trong khi đổ phải mất 3 đến 4 ngày nuôi cấy mới có thể khẳng định được sự có mặt của Salmonella. Đe cải thiện độ nhạy và làm tăng tốc độ của phương pháp này, một bước lảm giàu sẽ thường xuyên được sử dụng trước khí dùng tới PCR.

674

Hình 25.12: Một bộ thử kít nhanh để phát hiện Escherìachia coỉỉ 0157: H7 sau quá trình sinh trưởng trong môi trường ỉàm giàu. (Theo Prescott-Harley-Kleirỉ, 2002). Hiện nay, PCR đang được sử dụng để phát hiện nhanh các nhân tổ gây bệnh sinh ra từ thực phẩm. Các nghiên cứu gần đây cho thấy việc xây dựng nên các sản phẩm PCR đặc hiệu có từ 159 đển 1223 cặp bazơ phân tách một cách riêng rẽ ưong quá trình điện di có thể phát hiện ngay ra Campylobacter jejuni vả Arcobacter butzleri trong cùng một mẫu trong vòng 8 tiếng.

Call numlMr (du por PCR assay)

Hình 25. ỉ 3: Phươngpháp dò iìm mầm bệnh dựa trên PCR. So sánh độ nhạy của phưcmg pháp PCR với quá trình sinh trướng trong việc kiểm tra Salmonella agona. Hệ thong Probaỉia™ PCR cô thể tìm được 2 đơn vị hình thành khuẩn ĩọc cùa tác nhãn gây bệnh (2 CFU). (Theo Prescoít-Harỉey-Klein, 2002).

675

Một tiển bộ chính trong việc tìm ra các nhân tố gây bệnh thực phẩm là việc sử dụng đoạn ADN gây bệnh đã được tiêu chuẩn hóa, hoặc “in đấu nhân tổ gây bệnh từ thực phẩm”. Trung tâm kiểm soát và ngăn ngừa bệnh tại Mỹ (CDC) đã thành lập một chương trình mới, có tên là PulseNet, trong đó phương PFGE (pulsed-field gel electrophoresis) được sử dụng để kiểm tra các mẫu ADN khác biệt của từng loại vi khuẩn gây bệnh. Với phương pháp đồng nhất này, có thể th ấ y được mối liên hệ giữa các nhân tổ gây bệnh, sự bùng phát bệnh ở các nơi khác nhau trên thể giới với các nguồn thực phẩm đặc trưng. Tài liệu thu thập trên toàn thể giới đang được sử dụng trong FoodNei, một mạng lưới giám sát nhạy bén, để theo dõi 9 loại bệnh chính từ thực phẩm. Bằng việc sử dụng phương pháp của FoodNet có thể biết được tiến trình và nguyên nhân lây nhiễm trong vài ngày chứ không phải là vài tuần. Ví dụ, sự bùng phát Shigeỉỉa của 3 vùng khác nhau ở Bắc Mỹ đã lan đến tận cây mùi tây Mexico do ô nhiễm nguồn nước tưới tiêu. Chương trình này đà dẫn đến sự thiết lập nhanh chóng mối liên hệ về mặt dịch tễ học và sự giảm đì gàn đây các bệnh sinh ra từ thực phẩm. 25.6. VI SINH VẬT HỌC CÁC T H ự C PHẢM LÊN MEN (Microbiology of Fermented Foods) Từ hàng nghìn năm qua, lên men lả phương thức chính để bảo quản thực phẩm. Sự sinh trưởng vi sinh vật, các quần thể tự n h iê n h o ặ c lây nhiễm gây ra các thay đổi về mặt hóa học và vật lý học của sản phẩm. Quá trình lên men cũng được sử dụng để tạo nên mùi vị và hương thơm cho thực phẩm. Các phương pháp lên men chính đã sử dụng trong vi sinh vật thực phẩm là lên men lactic, propionic và etanol. Những quá trình lên men này được tiến hành trong một phạm vi rộng.

25.6.1. Các loại sữa lên men (Fermented Milks) Trên thế giới, có ít nhất 400 loại sữa lên men khác nhau. Quá trình lên men này được tiến hành do các vi khuẩn sinh axit lactic ưa ấm, ưa nhiệt. 25.6.1.1. ưa ẩm (Mesophilic) Trong quá trình lên men sữa ở các vi sinh vật ưa ấm, axit được tạo ra dẫn đến sự biến tính protein. Để thực hiện quá trinh này, người ta thường bổ sung vào sữa giống khởi động mong muốn, ủ chúng ở điều kiện nhiệt độ tối ưu (20°C-30°C), sau đó ngăn cản sinh trưởng của vi khuẩn bàng việc làm lạnh. Chủng Lactobacillus, spp và Lactococcus ỉactis được nuôi cấy để tạo hương vả tạo axit. Lactococcus lactis subsp. diacetiỉactis có khả năng chuyển hóa xitrat ttong sữa thành điacetyl, chất này làm nên hương vị bơ đặc biệt của sản phẩm cuối cùng.

676

Bảng 25.7: Các sản phầm lên men từ sữa Loại

Các ví dụ điển hình

Lên men lactic Ưa ấm

Sữa chiết xuất sau quá trình sản xuất bơ Nuớc sữa cấy Lăngofll Tetmjolk Ymer Sữa chua, laban, zabadi, labneh, skyr Nước sữa Bungari Biogarde, Biỉĩghurt Sữa axitophilus, yakult Cultura-AB

Ưa nhiệt Dùng để điều trị

Lên men lactic cùa nấm men

Kefir, koumiss, sữa ưa axit nấm men

Lên men lactic cùa nấm sợi

Viili

2 5 .6 .1 .2 . ư a n h i ệ t ( T h e r m o p h i llỉ c )

Quá trình lên men được tiến hành ở nhiệt độ 45 °c. Một ví dụ điển hình của dạng lên men này là sàn xuất sữa chua. Sữa chua được tạo ra nhờ sử dụng giống khởi động là s. thermophỉỉus và L. bulgarỉcus theo tỷ lệ 1:1. Sự phổi hợp hài hòa 2 chủng vi khuẩn này, trong đó axit được tạo ra nhờ Streptococcus, còn hương liệu lại được tạo ra nhờ Lactobacillus sẽ tạo ra sản phẩm cuối là sữa chua có chứa 109 vi khuẩn trên 1 gam.

H ình 25.14: Bifidobacterium.

677

25.6.1.3. Chữa bệnh (Therapeutic) Các loại sữa lên men được cho là có nhiều hiệu quả chữa bệnh. Sữa Axitophilus được sản xuất nhờ Lactobacillus axitophiliiS. Vi khuẩn này có thể biến đổi quần thể vi sinh trong ruột già, tiêu hóa. Nhiều loại vi sinh vật trong sản phẩm lên men bơ sữa trở nên ổn định trong các quần thể vi sinh đường ruột, và một số loại xuất hiện có các đặc tính kháng khuẩn. v ề bản chất của việc bào vệ sức khỏe vần chưa thực sự rò ràng, nhưng có thể do khả năng kích thích sự hấp thu lactoz, qua đó giảm cholesteol, và các hoạt động chống ung thư. Nhiều Lactobacillus có các hợp chất chống sự tạo thành u trong các thành tế bào của chúng. Như vậy, chế độ ăn bao gồm các vi khuẩn s in h a x it lactic, đặc biệt L . axitophiỉus, có thể đóng góp vảo việc kiểm soát ung thư ruột kết. Một nhóm đáng chú ý khác được sử dụng ừong lên men sữa là bifidobacteria. Bifidobacterium là các trực khuẩn Gram đương, không sinh bào từ, có dạng chùy hoặc hinh chữ chi ở tận cùng (hình 25. 14). Bifidobacteria không di động, kị khí, và lên men lactoz cùng các loại đường khác thành axit axetic và axit lactic. Chúng cư trú đặc biệt trong ruột người và được phát hiện từ nám 1906. Nhiều đặc tính có lợi của vi khuẩn này là duy trì sự cân bàng bình thường trong ruột, và cải thiện khả năng chịu lactoz, có các hoạt tính chống ung thư; giảm thiểu nồng độ cholesteol ừong mảu. Thêm vào đó, một số giả thiết cho rằng chúng kích thích sự hẩp thu canxi và tổng hợp phức hệ vitamin B. Nhóm vi khuẩn này cũng được cho là có khả năng làm giảm và ngăn cản sự bài tiết các rotavirut, một nguyên nhân gây ra bệnh tiêu chảy ờ trẻ nhỏ. Các sản phẩm sữa lên men hiện nay đang có rất nhiều loại trên thế giới {hình 25. ỉ 5).

H ìn h 25.15: M ộ t s ổ sản p h ẩ m b ơ sữ a trên thị trường.

25.6.ỉ.4. Các sản phẩm lactic từ nấm men (Yeast Lactic) Sản phẩm đặc trưng của quá trình lên men lactic nhờ nấm men là kefir, chứa trên 2% etanol. Kiểu lên men đuy nhất này có nguồn gốc từ núi Caucaz. Quá trinh này phụ thuộc vào việc sử dụng “các hạt” kefir trong quá trình nuôi cấy. Những hạt này đông lại thành từng tảng cazin có chứa nấm men, vi khuẩn sinh axit lactic, và các vi khuẩn sinh axit axetic (hình 25. 16). Trong quá ừình lên men, các hạt này được đưa vào sữa tươi sau đó được thu hồi lại ở giai đoạn cuối của qúa trình lên men.

Hình 25. ỉ 6: Các hạt kefir được sử dụng đề ù sữa, (Theo Prescott-Harỉey-Kiein, 2002). * Yakult - từ phát minh đểtí cuộc sống Tiến sĩ Minoru Shirota (1899-1982) có một phát minh quan ừọng vào năm 1930, đó là việc phân lập và nuôi cẩy được một chửng vi khuẩn thuộc loài Lactobacillus casei và về sau được mang tên là chủng Lactobacillus casei Shirota. Vì tác dụng đặc săc của chủng vi khuẩn này mà từ năm 1935 TS. Minoru Shirota đã sáng tạo ra loại sữa chua giúp hỗ ừợ sức khỏe mang tên Yakul.

679

Giáo sư Minoru Shirota Đây là một chùng vi khuẩn lactic thuộc nhóm lên men lactic đồng hình, Gram dương, không sinh bào tử và đáng lưu y là có thể phát triển ừong một phạm vi nhiệt độ rất rộng, từ 15 đến 41°c. Khác với nhiều chùng vi khuẩn lactic khác ở chỗ chúng đề kháng mạnh mẽ với địch vị ở đạ dày (độ acid rất cao) và dịch mật cùng các enzim tiêu hóa khác, do đó đến được ruột non và phát triển được trong ruột non. Rất nhiều vi khuẩn lactic khác đã bị tiêu diệt khi tiếp xúc vói dịch vị và dịch mật. Nghiên cứu của Kobayashi (1974) xác minh trong dịch vụ nhân tạo sau 3 giờ vi khuẩn Shirota vẫn giữ được nồng độ tới 1 000 000 tế bào /ml, còn trong dịch mật sau 3 giờ vẫn tồn tại được tới ừên 33%. Nghiên cứu của Touhy et al. (2007) chứng minh nếu uống mỗi ngày 2 lọ (65ml) Yakult trong 3 tuần thì sau 7 ngày mật độ vi khuẩn này trong phân vẫn còn rất cao (ừên 10 triệu/g) và mật độ này duy trì suốt 3 tuần liền.Nghiên cứu của Tanaka et al. (1994) chứng minh sau khi sử dụng Yakult đã xét nghiệm thấy nhỏm vi khuẩn cỏ ích {Lactobacillus và Bifidobacterium) tìm thấy ứong phân đã táng lên 3 lần, ứong nhóm vi khuẩn có hại (Enterobacteria) lại giảm đi tới 5 lần. Nghiên cứu ở 246 trường hợp các tác giả Nhật Bản thấy sau khi sự dụng Yakult tình trạng táo bón được cải thiện tới 80,1% và khi nghiên cứu ở 428 trường hợp khác lại thấy tình trạng tiêu chảy đã được cải thiện tới 82,2%.Nghiên cứu của David Candy et al. (2001) cho thấy sử dụng Yakult đã làm cải thiện rõ rệt sự hấp thu của ruột biểu hiện ở việc tăng nồng độ các muối khoáng trong nước tiểu. Vi khuẩn Shirota giúp phục hồi khu hệ vi sinh vật (microflore) đường ruột đã bị hủy hoại sau một đợt điều trị bằng thuổc kháng sinh. Chúng còn có tác dụng thúc đẩy nhu động của ru ộ t, giúp nhuận ừàng, hạn chế tác đụng hình thành và tích lũy các chất gây thối rữa ruột. Chúng điều hòa hệ miễn dịch của cơ thể, giúp phục hồi chức năng miễn dịch đã suy giảm ở những người nghiện thuốc lá, hạn chế tác động dị ứng với những người mẫn cảm với phấn hoa dẫn đến viêm mũi. Chúng còn tạo nên sự cân bàng muối và cải thiện các triệu chứng viêm kết ruột non ờ những trẻ em bị hội chứng ruột ngắn.

680

Lactobacillus casei Shirota

Chúng làm tăng đáng kể hoạt tính của các tế bào NK (natural killer) ở những bệnh nhân bị viêm tủy sống do nhiễm virus HTLV , tức là những người mắc bệnh HAM/TSP . Đặc biệt là nếu sử dụng thường xuyên sản phẩm chứa vi khuẩn này sẽ làm giảm nguy cơ bị ung thư bàng quang và ức chế sự phát triển của các khối u ở ruột, Nghiên cứu ở Malaysia cho thấy sử đụng thường xuyên Yakull đã có tác dụng ức chế rõ rệt sự hình thành và tích lũy các chất gây hoại tử ruột. Nghiên cứu của Ishikawa et al. (2005) cho thấy sử dụng Yakult sau 4 năm đã giảm được tới 35% nguy cơ tái phát các khối u ở ruột. Nghiên cứu của Ohashi et al. (2002) xác nhận sử dụng Yakult đã làm giảm tới 50% nguy cơ phát triển ung thư bàng quang. Vi khuẩn này còn giúp ngăn ngừa những biến chứng gây nhiễm sau khi phẫu thuật dạ dày, ruột...Những phát hiện mới được công bổ ngày 27/4/2011, trên trang web trực tuyến của Journal of Nutrition (của Anh) cho biết: việc sử dụng thường xuyên Yakult cho người già sống trong một Trại dưỡng lão đã làm giảm việc sốt vỉ viêm đường ruột do nhiễm Novovirus (Nagata Satoru, Yamashiro Yuichiro et al.)- Có thể hiểu sâu hơn về các tác dụng quý giá này qua các công trình nghiên cứu được công bố ở các Tạp chí khoa học (như Preventive Medicine,40, 2005, 589-594; Cli.Diagn.Lab.Immunol., Vol. 11, No.4,2004; J.Nutrition, 0022-3166/07,2007; Aliment Pharmacol. Ther., 17, 429-435,2003; J.Pediatr. Gastroenteroi.Nutr.,Vol.23,4,2001, Vol 32 (4): 506-508, 2001 và Vol.42, 2, 2006; Can.J. Gastroenterol.,Vol.l7, 11,2003; Appl.Environ. Microbiol., Vol.70, 1, 518-526; European Journal of clinical nutrition. 52: 899*907, 1998; J Pediatric Gastroenterology and Nutrition. ; Biosci. Biotechnol. Biochem., 64 (12), 2706-2708,2000; Clinical and diagnostic laboratory immunology; Vol. 11, No. 4, p.675-679, 2004; Urol. Int., 49, 125129, 1992; The BLP Study Group. Eur Urol.;27(2): 104-9, 1995; Int J Cancer. Sep. 20;116(5):762-7,2005)... Công ty Yakult ngày càng hoàn thiện công nghệ với những dây chuyền tự động hóa đảm bảo tuyệt đội vô trùng và tạo ra những lọ sữa chua nhỏ dung tích chỉ có 65ml, nhưng mỗi lọ có chứa tới 6,5 tỉ vi khuẳn L.casei Shirota ở dạng sống. Sản phẩm Yakult đã được xác nhận bởi Bộ Sức khỏe-Lao động-Phúc lợi của Chính phủ Nhật Bản. Yakult Honsha là

681

công ty tiên phong trong lĩnh vực probiotics và là một trong những công ty hàng đầu ở Nhật Bản. Kể từ khi Yakult có mặt trên thị trường vào năm 1935 cho đến nay, công ty Yakult Honsha đã có hơn 75 năm kinh nghiệm nghiên cứu. Và hiện tại Yakult đã lan rộng khắp toàn cầu và mỗi ngày có khoảng 28 triệu chai Yakult được tiêu thụ ừên 32 quốc gia và vùng lãnh thổ. Yakult Honsha đang kinh doanh 3 dòng sản phẩm chính - thực phẩm và thức uống, dòng mỹ phẩm và dược phẩm. Công ty Yakult nhanh chóng xây dựng n h à máy ở khắp các nơi trên thế giới (Nhật Bản; Đài Loan ; Brazil; Hồng Kông ;Thái Lan-; Hàn Quốc; Philippines; Singapore; Mexico; Indonesia; Ausừalia; Hà Lan; Bì; Pháp, Luxembourg; Tây Ban Nha; Anh; Đức; Argentin;U Ru Goay, Canada; Belize; Los Angeles; Quảng Châu; New York; Malaysia; New Zealand; Ireland;Thượng H ả i; Áo; Bắc Kinh; Italia; Brunây; Ấn Độ và Việt Nam ( từ năm 2007). Yakult Việt Nam được thành lập vào ngày 26/06/2006, với tổng vốn đàu tư ưên 400 tỉ đồng đo sự góp vốn của công ty Yakult Honsha (80%) và tập đoàn Danone của Pháp (20%). Yakult Việt Nam bắt đầu kinh doanh vào tháng 08 năm 2007. Hiện sản phẩm Yakult đã có mặt ở hầu hết các siêu thị và các cửa hàng bán lẻ khắp các tỉnh thành Việt Nam. Tôi đã có dịp đến thăm nhà máy Yakult đặt tại khu công nghiệp Việt Nam Singapore - huyện Thuận An - tỉnh Bình Dương, với tổng diện tích là 24000 m2. Đến tháng 1-2010, nhà máy Yakult đã đạt được tiêu chuẩn HACCP và ISO 22000: 2005. Tôi thật vui mừng khi thấy nước ta đã có thêm một nhà máy Công nghiệp vi sinh vật với một công nghệ hoàn hảo, với những sản phẩm có chất lượng cao được kiểm nghiệm chặt chẽ và cỏ tác dụng rất tốt cho những người có cơ hội thường xuyên sử dụng. Các bạn muốn tham quan có thể liên hệ qua các số điện thoại: 08 39321550 và 0650 3769246. Yakult không chi là thực phẩm chức năng có nhiều tác đụng hỗ trợ sưc khỏe mà còn là một thứ nước giải khát rất ngon. Hầu như nhiều tỉnh thành ở phía Nam đều đã có mặt sản phẩm này. Nhờ xử lí tốt chất thài công nghiệp mà ngày ngày 5-6*2011, tại Bình Dương Cty TNHH Yakult Việt Nam duợc xếp vào hạng Màu xanh lá cây. Đỏ là doanh nghiệp có tổng số điểm từ 80100 điểm (số điểm được đánh giả theo các tiêu chí- Tiêu chí đánh giá tuân thù pháp luật về bảo vệ môi trường ; tiêu chí đánh giá tuân thủ các quy chuẩn, tiêu chuẩn môi trường ; tiêu chí đánh giá tuân thủ về hồ sơ quản lý môi trường và các vấn đề liên quan khác). Nhằm phục vụ khảch hàng ờ khu vực miền Bắc được chu đáo hơn, chi nhánh Yakult tại Hà Nội đã chính thức đi vào hoạt động vào tháng 5-2011 tại địa chỉ: 120 Phạm Văn Đồng, quận Cầu Giấy - Hà Nội. Điện thoại: 04 37921250,04 37921251.

25.6J. 5. Lên men lactic từ nẩnt sợi Quá trình lên men lactic từ nấm mổc tạo ra loại sữa Phần Lan độc nhất có tên là viili. Sữa được để trong cốc sau đó ừộn với hỗn hợp nấm Geotrichium candidum và vi khuẩn lactic. Kem nổi lên trên bề mặt, sau khi ủ ở 18 đến 20°c trong 24 giờ, nồng độ cùa axit lactic đạt tới 0. 9%. Nấm tạo thành một màng nhung phủ lên trên sản phẩm cuối cùng, và cũng có thể tạo thành một lớp ở phía dưới hoa quả để bổ sung thêm hương vị.

Bảng 25.8: Các loại phomaí và các vỉ sinh vật được sử đụng để sản xuấtphomat Phomat (Nguồn gốc)

Các vỉ sinh vật tham gia Giai đoạn ban đầu

Giai đoạn cuổi

Lactococcus ỉactis L. cremoris, L. diacetyỉactỉs, s. thermophtíiỉs, L. buỉgaricus s. thermophiỉus, L. bulgaricus

Leuconostoc cremoris

Lactococcus ỉactỉs, L. cremoris L. ỉactìs, L. cremoris

Penicilỉỉum camemberti, p. Cữĩiđìdum, Brevỉbacterium linens PeniciUium camembertì, Brevibacterium linens

Phomat bán mềm Blue, Roquefort (Pháp) Brick, Muenster (Mỹ)) Limburger (Bỉ)

Lactococcns ỉactis, L. cremorỉs L. ỉactìs, L. cremoris L. ỉactis, L. cremoris

Penicillium roqueýortỉ

Phomat cứng, ủ chín Cheddar, Colby (Anh) Swiss (Thụy Sì)

Lactococcus ỉactis, L cremoris L. ỉactìs, L. helveticus, s. thermophiỉus

Lactobacillus cazi, L. pìantarum Propionibacterium shermartiìâ P. jreudenreichii

Phomat rất cứng, ủ chín Parmesan (Ỷ)

Lactococcus ìactis, L. cremoris, s. thermophiỉus

Lactobacillus buỉgaricus

Phomat mềm, chưa ủ chín Cottage Cream Mozzarella (Ý) Phomat mềm, ủ chín Brie (Pháp) Camembert (France)

Brevibacterium linens Brevibacterium linens

25.6.2. Sản xuất phomat Phomat là một trong sổ thực phẩm lâu đời nhất đã ỉàm ra được cách đây gần 8000 năm. Có khoảng 2000 loại phomat khác nhau được sản xuất trên thế giới và khoảng 20 loại thông dụng {bàng 25. 8 và hình 25. 17). Các loại phomat thường được phân loạỉ dựa trên kết cấu hoặc độ rắn như: phomat mềm (phomat, kem, phomat mềm của Pháp), phomat bán mềm (Muenster, Limburger, phomat xanh), phomat cứng (cheddar, Colby, Thụy Sỹ), hoặc rất cứng (Parmesan). Tất cả các loại phomat là két quả của sự lên men axit lactic từ sữa, quá trình này làm cho các protein sữa đông tụ và hình thành nên sữa đông. Rennin, một loại từ dạ đày bê, hiện nay đa được sản xuất bởi các vi sinh vật nhờ kĩ thuật di truyền, được

683

sử dụng để thúc đẩy quá trình hình thành sữa đông. Sau khi sữa đông được hình thành, đun nóng rồi ép để loại bỏ nước, sau đó bổ sung muối và làm chín {hình 25. ỉ 8).

Hình 25.18: Sản xuất phomat Cheddar. Cheddar là một ỉàng cùa nước Anh, được lấy tên để đặt cho ìoại phomat mà nhiều nơi trên thể giới sản xuất (Theo Prescotí-Harỉey-Kỉein, 2002).

■■ c" t \\ 'Vv '

&SSỈ.:

•,

V-/I

^

- --

•ỉ-'* '

'

■' i r ■-.-'Ị ế *-'■-ViJ

,-

■

//Ỉrt/ỉ 25.7 7; Các loại phomat.

684

Hàng loạt các sàn phẩm phomat được sản xuất trên thế giới bằng cách sử dụng vi sinh vật (ạ) Phomat Gouda và cheddar được nhận ra bằng đặc điểm riêng biệt do ỉớp màng và lớp sáp đò phù trên bề mặt. (b) Phomat Roquefort có dạng vụn, vùng có màu tối là do peniciỉỉium sinh trưởng, (c) Phomat Thụy Sỹ, ỉoạì phomat cứng cỏ chứa các lỗ do tạo thành CƠ2 từ quả trình lên men cùa vi khuẩn Propionibacterỉum. (đ) Phomat Brie (trải) và phomat Limburger (phải) ỉà loại phomat m ềm , k h i c h ỉn tr ê n b ề m ộ t c ó s ự s in h tr ư ở n g c ủ a P e n ic ilỉiu m c a m e m b e r ti (B r ìe ) v à B r e v ib a c te r iu m

linens (Limburger). (e) Phomat dạng kem (thường được phết vào bánh), là ỉoại phomat không đnực ủ chín, chúng được bán ngay sau khi tạo thành sàn phẩm.

Sữa đông có thể được đóng gói để làm chín mà không cần bổ sung vi sinh vật. Quá ừình ủ sữa đông để sản xuất phomat Roquefort thường được bổ sung nấm sợi Penicillium roqueforti trước công đoạn cuối cùng. Đôi khi bề mặt cùa phomat được hình thành tại thời điểm bắt đầu của việc làm chín ví dụ, phomat Camembert được bổ sung bào từ của nấm sợi Peniciỉỉỉum camembertỉ. Độ cứng cuối cùng của phomat một phần quyết định thời gian làm chia Các loại phomat mềm được làm chín chỉ trong 1 đến 5 tháng, trong khi đó phomat cứng cần từ 3 đến 12 tháng, vả loại rất cứng thì từ 12 đến 16 tháng như Parmesan. Quá trình làm chín cũng là yếu tố quyết định chất lưựng của phomat Thụy Sỹ. Sự tạo khí nhờ Propỉonibacterium góp phần tạo nên hương vị cuối cũng như hình thành các lỗ và tạo mắt của phomat. Một vài loại phomat được ngâm trong nước muối để kích thích sự phát triển của một số loại vi khuẩn và nấm đặc thù; Limburger là một loại phomat như vậy. 2 5 .6 .3 . T h ị t v à c á

Bên cạnh sự lên men của các sản phẩm phomat, nhiều sản phẩm khác như thịt, đặc biệt là xúc xích cũng có thể được lên men: thịt lợn hun khói, xúc xích mùa hè, xúc xích Ý, xúc xích ngắn, xúc xích Lebanon, nước mắm (được tạo thành bởi vi khuẩn BacìUus ưa mặn), izushi và katsuobushi. Pedỉococcus cerevỉsiae và Lactobacillus pỉantarum hầu hết có liên quan đến quá trình lên men xúc xích. Izuzhi là sản phẩm lên men cá tươi, gạo và rau xanh bời vi khuẩn Lactobacillus spp; katsuibushi là kết quả của sự lên men cùa cá ngừ nhờ vi khuẩn Aspergillus gỉaucus. Cả hai loại lên men thịt này đều có nguồn gốc từ Nhật Bản. 25.6.4. Sản xuất đồ uổng chứa cồn Nhiều nguồn thực vật có chứa hàm lượng cacbonhydrat phong phú được sử dụng để sàn xuất đồ uống chứa cồn. Chẳng hạn, nước nho ép được sử đụng để lên men rượu vang. Người ta sù dụng phương pháp diệt khuẩn Pasteur hoặc dùng sulfua dioxit, sau đỏ bổ sung các vi sinh vật mong muốn vào nước nho ép đê lên men. Ngược lại, trước khi ngũ cốc và các nguồn tinh bột khác được sử dụng cho sản xuất rượu, hợp chất cacbonhydrat phải được thủy phân. Các hợp chất này được trộn với nước và 685

được ử, quá trinh này được gọi giai đoạn đường hóa (mashing). Sau đó, những nguyên liệu không tan được loại ra để tạo thành hèm rượu - một đung dịch trong có chứa đường được lên men. Nhiều thủ thuật được sử đụng ưong việc kiểm soát sự thủy phân protein và cacbonhydrat để tạo ra hương vị mong muốn của sản phẩm cuối cùng. 2 5 .6 .4 .1 . R ư ợ u v a n g v à S â m b a n h

Sự sản xuất rượu vang bắt đẩu bằng việc thu thập nho, ép lấy dịch, rồi lên men nhờ các vi sinh vật, tiếp đến là giai đoạn bảo quản và làm chín rượu (hình 25.19). Rượu vang (vin) là rượu lên men không chưng cất từ nước ép nho (hay sau này mở rộng ra là nước chiết xuất bằng đường một số ỉoại hoa quả khác). Rượu vang tuỳ loại mà có nồng độ êtanol thay đổi từ 8% đến 13%. Không có nước nào (trừ một sổ công ty ở nước ta!) có chuyện bổ sung cồn (etanol nồng độ cao) làm rượu vang để điều chỉnh nồng độ êtanol lên 12-13% (giúp bảo quản được ổn định). Cát tnrõc chẽ Wen

Bitnđoì ònhhọc

Xứlýnlw>

KhArtràkC Bò' rrn g nám m en

Loạỉbd tạpiử dẫn (ic VI *tnh

vàl numgtnuon

Lén m en đph Hèm

Tạo edmnóltử l ỉ Ỉ D (

Loqỉbò n ả n iu m

C hỡváo thràig Lênrom iaalếiladk

LoạỉtiònÉtimm Time trữ

TạoỈHTODcvịđặc trong củaitapiú&a

enftasmg

Dcn{dui

H ình 25.19: Q uả trìn h làm rư ợ u vang (Theo Prescott-H arỉey-K ỉein, 2002).

686

Tât cả dịch nho ép đều có màu trắng, do đó để làm rượu vang đỏ thì vỏ nho phải được tiếp xúc với nước ép trước khi lẽn men để các hợp chất tạo màu được chiết ra từ vỏ. Rượu vang có thể được tạo thành bằng cách sừ dụng vi sinh vật có sẵn ữong vò nho. Hỗn hợp tự nhiên cùa vi khuẩn và nấm men có thể tạo thành những sản phẩm lên men không mong muốn. Để tránh vấn đề này, có thể xử lý nước ép nho với sulfua đioxit và bổ sung chủng Saccharomyces cerevisiae hoặc s. elipsoideus đã lựa chọn. Sau khi ủ, nước ép được lên men từ 3-5 ngày ở nhiệt độ 20-28ơC. Tùy theo mức độ chịu cồn của từng chủng nấm men, sản phẩm cuối cùng cỏ thể chửa tò 10 -18% rượu etanol. Sự làm trong và tạo hương vị xảy ra trong suốt quá trình làm chín rượu. Một phần quan ừọng của quá trình sàn xuất rượu là việc lựa chọn để tạo ra rượu vang khô (dry wine - không chứa đường tự do) hay là rượu vang ngọt (sweeter wine - chứa một lưọmg đường tự do). Việc này có thể được kiểm soát khi điều chinh nồng độ ban đầu của đường trong nước nho ép. Trong sản xuất rượu vang ngọt, với hàm lượng đường cao hơn, rượu sẽ tích lũy do đó kìm hãm sự lên men trước khi đường được sử đụng hoàn toàn. Trong suốt thòi gian lên men cuối cùng của giai đoạn làm chín, những hợp chất có mùi thơm thường được tích lũy và tạo ra hương vị của rượu. Sự sinh trưởng của vi sinh vật trong suốt quá trình lên men tạo ra chất lắng cặn, sau đó được loại bỏ trong quả trình chát rượu. Công đoạn này có thể được tiến hành ở thời điểm rượu đã được lên men và chuyển vào chai hoặc thùng để làm chín, hoặc thậm chí sau khi rượu đã được đóng chai. Nước Pháp nổi tiếng với rất nhiều loại rượu vang mang tên các vùng ừồng nho như Bordeaux, Alsace, Bergerac, Mâcon, Beaujolais, Côtes đu Rhone, Coteaux du Lyonnais, Clairette de Die, Anjou, Touraine, Corse, Jura và Champagne. Ngoài rượu vang của Pháp cũng còn có nhiều loại v a n g nổi tiếng của các nước khác. Có thể kể đến vang Kendall Jackson của vùng California / Mỹ (giá 12-220 USD/chai), vang Vĩtiano của vùng Lazio / Ý (giá 9-30 USD/chai, vang Kendal-Jackson của New Zealand (giá 13-160 ƯSD/chai), vang Santa Cristina của vùng Toscana /Ý (giá 7-12 ƯSD/chai), vang Monte Anticio cũng của vùng Toscana/Ý (giá 9-22 USD/chai), vang Ruca Malen của Argentina (giá 5-10 USD/chai), vang Borgo Maddalena của vùng Nimis/Ý (giả 13-30 USD/chai)... Các loại rượu vang này gần đây được mua bán rất nhiều qua mạng Internet. Champagne (Sâm banh) là rượu vang nổi tiếng đã được sản xuất cả tại nhiều nước khác. Riêng vùng Champagne (Pháp) sản xuất mỗi năm 200 triệu chai. Napoléon Bonaparte đã từng có câu nói nồi tiếng: "Khi thẳng t r ậ n ta u ổ n g Champagne để ăn mừng, khi thua trận ta uổng Champagne để iụ an ùi mình ", Đặc b iệ t, Champagne là loại ruợu sủi bọt và nổ mạnh khi mở nút (được gọi là Sparkling Wine). Chất lượng cao của rượu Champagne quyết định bởi nhiều nhân tố: loại nho ừáng Chardonnay, nho đỏ Pinot Noir,

687

Pinot Meunier, lên men hai lần - một lần trong các thùng lớn làm bằng gồ sồi có nút bật lên bật xuống kêu rầm rập (để cho CƠ2 thoát ra mà không cho O2 lọt vào) và mộtlần trong các chai thành dầy và cắm ngược lên giá gỗ có xoay bàng tay theo cácđộ nghiêngkhác nhau. Cả nấm men sẽ lắng dầu ở đầu cổ chai, sau đỏ có thiết bị mở và đóng nắp thật nhanh để làm bật cặn ra. Cuối cùng đóng chặt lại bằng nút bần (liège), khí CO2 (gas) trong chai Champagne là CO 2 sinh ra trong quá trình lên men lâu dài chứ không phải CO2 nén từ ngoài vào như cái gọi là Sâmbanh sản xuất tại nhà máy... phân đạm Bắc Giang.Lượng bọt tiêu chuẩn phải khoảng 56. 000. 000 bọt trong 1 chai! (750ml). Trước khi uống cần chuẩn bị ly cao (để bọt có đường đi dài từ đáy cốc lên miệng). Rót rượu vào ly không nên rót quá nửa ly và phải chuẩn bị chậu chứa nửa nước đá, nửa nước để ngâm chai 20-30 phút. Độ rượu của Champagne thường chỉ ở mức 12% mà thôi. Các chữ v s , VSOP, VVSOP trên nhãn chai là biểu thị thời gian bảo quản lâu dài của rượu Champagne ( Very superior, Very Superior Old Pale, Very, Very superior Old Paỉe). Giá một chai 22 năm tuổi hiện nay là khoảng 300 euros (khoảng 5,6 triệu đồng). Rượu sâm banh tự nhiên được sản xuất bằng cách duy trì lên men trong chai để tạo ra rượu vang sủi tăm tự nhiên. Những chất cặn lắng tập trung ở phần cổ chai, sau khi cổ chai được đảo ngược một cách cẩn thận, rồi làm lạnh, sau đó nút chai được mở để đổ những chất cận bã đã tích tụ. Các chai này được rót đầy lại bằng sâm banh đã lọc trong từ chai đã được đổ chất cặn bã ra, và sản phẩm sẵn sàng cho đóng hộp cuối cùng và dán nhãn. Champagne. Bánh men là một sáng tạo độc đáo của nhân dân ta (và một số nước Đông Nam Á khác). Trong bánh men thuốc bắc (phổi trộn bột với một sổ thuốc bắc) hay men lá (phối trộn với một số loại lá cây được lựa chọn theo kinh nghiệm) luônluôn

thuộc chi

Saccharomycopsis có khả năng chuyển bột thành đường và một là nấm men thuộc chi Saccharomyces có khả năng chuyển đường thành rượu. Rượu Sake cũng là một loại rượu không chưng cất nổi tiếng của Nhật. Công nghệ sinh học của Nhật cỏ thể coi như bát đầu từ các ngíhiên cứu về rượu sakê và người đi tiên phong là nhà khoa học Jokichi Takamin. Phần đọc thêm : Mốc màu hoa cau mà nhân dân ta thường dùng để làm tương là một loài nấm sợi có tên khoa học là Aspergillus oryzae. Đây cũng chính là loài mà người Nhật dùng để đường hóa gạo khí làm nrợu Sake. Jokichi Takamin sinh ngày 3-10-1854 tại

688

Takaoka nhưng sớm được chuyển đến sống ở Kanazwa. Bố ông là thầy thuốc Seiichi, còn mẹ ông- bà Yukìko, lớn lên từ một gia đình làm rượu sake.

Từ nhỏ Jokichi đã học giỏi các môn Ngôn ngữ và Khoa học. Năm 16 tuổi ông vào học Trường trung học y tế ở Osaka. Hai nãm sau Jokichi chuyển lên học Hóa học ở Đại học Khoa học và Công nghệ Tokyo. Năm 24 tuổi Jokichi được gửi sang Scotland để làm nghiên cứu sinh tại Đại học Glasgow. Chẳng bao lâu anh đã nói thạo tiếng Anh và say mê nghiên cứu về sản xuất phân bón hóa học. Trở về Nhật ông iàm việc tại Bộ Nông nghiệp và Thương mại với mong muốn đưa được công nghệ phương Tây về Nhật. Anh được cử sang New Orleans (Hoa Kỳ) để làm cuộc triển lãm về bông. Anh trọ tại nhà Đại tả Ebenezer Hitch và vì thế mà có chuyện yêu cô con gái ô n g Đại tá này- cô Caroline Field Hitch. Trở về Nhật Bản ông được cử iàm Chù nhiệm Văn phòng cấp Bằng sáng chế và Nhãn hiệu hàng hóa. Vì công việc mà ông có dịp trở lại Hoa Kỳ trong hai năm. Đám cưới được thực hiện tại New Orleans vào mùa hè năm 1887. Trong tuần trăng mật họ đã đến Nam Carolina và thăm nhà máy phân bón hóa học tại đây. Sau đó Takamin đến Washinton để nghiên cứu về luật cấp bàng sáng chế ở Hoa Kỳ và rồi trở về Nhật. Ông đã thành công trong việc xây dựng Nhà máy superphotphat đầu tiên ở Nhật dưới sự đầu tư của Công ty phân bón hỏa học Tokyo. Đôi vợ chồng trẻ sống gần nhà máy và họ sinh ngay ba năm đôi được hai cậu con trai. Tình trạng kinh tế trở nên khó khăn và gia đình Takamìn phải quay trở lại Hoa Kỳ. Đây là thời gian Takamin chuyển hướng chú ý sang công nghệ sản xuất cồn-rượu. Thời đó để đường hóa tinh bột lúa mỳ và ngô ở phương Tây người ta dùng mầm đại mạch (malt), trong khi đó ở Nhật lại dùng loại nấm sợi mà ta gọi là mốc tương. Cơm đâ cho mọc loại mốc này ở Nhật gọi là Kọịi. Hoạt tính men 0 trong Koji cao hơn nhiều so với trong mầm đại mạch. Với sự ùng hộ của Công ty Liên hiệp Whiskey (Whiskey Trust),Takamin đã đưa công nghệ dùng K.oji vào các nhà máy sản xuất rượu Whisky và bia ở Chicago và Peoria (bang Illinois). Hoạt tính cùa Kọji 689

làm cho quá trình đường hóa rút ngắn lại và giá thành rẻ hơn rõ rệt. Nhưng thật rủi ro cho Takamin, các nhà máy sản xuất mầm đại mạch ở vùng này đã không hoan nghênh sáng kiến này của ông (!). Một sự kiện lạ lùng có thể do sự kỳ thị chủng tộc gây nên, nhà máy nơi ông làm việc bị cháy trụi (!)và gia đình ông trở nên khánh kiệt. Họa vô đơn chí, ông bị bệnh gan cấp tính và phải mổ cấp cứu tại Chicago. Đỏ là thời gian bi kịch nhất đối với gia đình ông. Caroline phải đi bán tranh ảnh và đồ thủ công để lo bữa ăn cho gìa đình. Cũng may là Takamin rất chóng bỉnh phục và có lại ngay tinh thần lạc quan. Năm 1894 ông lấy được bàng sáng chế về quá trình sản xuất men đường hóa (Proces o f making diastatic) và được thưởng tiền. Đấy là u s Patent sổ 252. 823, trình bầy phương pháp phương pháp nuôi nấm sợi Aspergiỉỉus trên cám và dùng cồn để chiết xuất ra men amylaz (men đương hóa tinh bột). Sau đỏ Takamin đã chứng minh được men này có thể ứng dụng trong y học và ông nhận được Bằng sở hữu trí tuệ về men của ông do Parke, Davis & Công ty (ở Diừoit, Michigan) sản xuất vởi tên gọi là men Taka-diastaz. Parke và Davis quảng cáo men này trợ giúp tiêu hóa tinh bột, chữa bệnh khó tiêu. Sản phẩm bán rất chạy và Takamin trở thành cố vấn của Công ty. Nên biết rằng lịch sử ngành Sinh hóa học {Biochemistry) gắn liền với lịch sử nghiên cứu. Mặc dầu nghề làm tương ở Việt Nam và nghề làm sake ở Nhật Bản đã có từ lâu đời ,nhưng việc chiết rút ra enzym và sản xuất chế phẩm enzym thì Takamin là người đi tiên phong. Mãi ba năm sau (1897) Eduard Buchner mới chiết xuất từ tế bào nấm men (yeast cells) enzym xúc tác quá trình chuyển hóa đường thành rượu etanol. Hiện nay nhân loại đã biết tới trên 2000 enzym khác nhau và có trên 200 loại đã thu được dưới dạng tình thể tinh khiết. Sau chiến công này được sự giúp đỡ của Parke và Davis, Takamin đã đưa được gia đỉnh về New York và lập một Phòng thí nghiệm riêng cho mình ở đường 103 Đông Manhattan. Tại đây ông tiếp tục có nhiều phát minh mới, ừong đó có việc khám phá ra các nội tiết tố, đặc biệt là Adrenalin do tuyến thượng thận sinh ra. 2 5 .6 .4 .2 . B i a v à c á c l o ạ i r ư ợ u b ìa

Bia là nước giải khát cỏ độ rượu thấp (chứa 2,5-8% êtanol). Vì không, qua quá trình chưng cất nên bia còn chứa nhiều vitamin và nếu uống ờ mức độ vừa phải thi có lợi cho sức khoẻ. Bia làm từ đại mạch và hoa bia (hop“ Humuỉus ỉupuỉis). Mầm đại mạch có chứa men đường hoá tinh bột còn hoa bia có nhiều tác dụng mà khó có gì thay thế được (tạo độ đắng, tạo hương bia, giúp kết tủa và hạn chế nhiễm khuẩn). Bia và các đồ uống chứa cồn sừ dụng các loại ngũ cốc như lúa mạch, lúa mì và lúa gạo. Phức hợp tinh bột và protein trong các loại ngũ cốc cân được biến đồi để thành những hợp chất cacbonhydrat và axit amin đơn giản dễ sử dụng hơn. Quá trình này được minh họa trong hình 25. 20, bao gồm: sự nảy mầm của các hạt lúa mạch và quá trình hoạt hóa các để sản xuất mạch nha. Mạch nha sau

đó được trộn với nước và một sổ ngũ cốc khác, hỗn hợp này được chuyển đến nồi cháo để thủy phân tinh bột thành dạng carbohydrat dễ sử dụng. Ở đây chúng được xử lý nhiệt cùng với hoa hublon , được bổ sung vào nồi cháo để ngăn chặn sự làm hỏng của vi sinh vật. Các hublon còn cung cấp mùi thơm và ừợ giúp Ưong quá trình gạn các cặn vẩn. Trong bước gia nhiệt này, các enzym thủy phân bị bất hoạt, eác cặn vẩn được loại bỏ, và được ủ với chùng nấm men mong muốn.

Hạtlúaniạđi

Gỉải phóng các enzyme phân giải Cíirbtmhyđrate

điYỢc làin âìni

và rây num

Làm khô và nghiên

Đuờiig hóa

Hoạt dộng cùa enzyme-giải phóng mnltose, dextrin, Ịttotôtt

Bố sung lioublon

ức chế các vi sinh vạt gầy liòi\g, bất hoạt

Xừ lý nhiệt trong két ù

---- ■enzyme, tạo

BỐsimg náin men

*

luTottgvỊtừ

houblon Lên men

Lênnim etlianol

Tàng trữ

Đống gói

Hoàn thiện lurơngvị mối cùng I

I

H ình 25. 20: Sản xu ẩ t bia ( Theo Prescott-Haríey-Kỉein, 2002).

691

H ình 25.21: Lên men bia.

Hầu hết các loại bia được lên men nhờ nấm men chìm Saccharomyces carlsbergensìs, và được làm lắng xuống đáy thùng sau khi lên men. Hương vị của bia còn chịu ảnh hưởng bởi một lượng nhỏ các sản phẩm glyxerol và axit axetic. Các nấm men chìm được lên men ở pH từ 4, 1 đến 4, 2 và đòi hỏi từ 7 đến 12 ngày íẽn men (hình 25. 2Ỉ). Với các nấm men nồi như Saccharomyces cerevisiae, quá trình lên men thường ở pH dưới 3, 8. Bia tươi tạo thành, ủ chín, bổ sung thêm CƠ2 sau đó được đóng chai. Bia có thể được tiệt trùng ở 140°F (60°C) hoặc tiệt trùng nhờ màng lọc để giảm thiểu những thay đổi về hương vị. Ở nhiều nơi có nhiều cách để làm tăng sự hấp dẫn đối với các loại bia đặc sản. Braumeisters địa phương phát triển các sản phẩm duy nhất với phương pháp và thành phần làm bia đặc biệt. Các tên lạ thường được đặt cho những sáng tạo này. 25.6.4.3. Rượu chưng cất ~ Rượu mạnh (Distilled Spirits) Các loại rượu có nồng độ etanol cao trên 20% đều là rượu có qua chưng cất. Có rất nhiều loại rượu chưng cat (distilled liquor). Ví dụ Scotch whiskey làm từ đại mạch; whiskey Ailen làm từ đại mạch, tiểu mạch, mạch đen, yến mạch, whiskey Canada làm từ mạch đen; Bourbon làm từ ngô; Gin làm từ ngũ cốc, quả thông, h ồ i...; Rhum làm từ nước mía hay rỉ đường mía; Aquavit làm từ ngũ cốc hay khoai tây, tạo hương từ cây Carum; Vodka làm từ ngũ cốc hay khoai tây; Tequila (Mescal) làm từ nước ép lõi cây Agave tequilana; Brandy làm từ hoa quả; Kirschwasser làm từ nước ép anh đào; Applejack làm từ nước ép táo; Cognac làm từ nho trắng ở vùng Cognac (Pháp).

692

Rượu mạnh chưng cất được sản xuất nhờ quá trình chế biến các sản phẩm lên men rượu. Dịch lên men được chưng cất, các thành phần đễ bay hơi được ngưng tụ lại tạo thành sản phẩm cỏ nồng độ cồn cao hơn bia. Rye và Bourbon là những đại điện của rượu Whiskey. Nguyên liệu sàn xuất Rye chứa ít n h ấ t 51% lúa mạch đen, còn nguyên liệu Bourbon chứa ít nhất 51% bột ngô. Whiskey Scotlen được làm đầu tiên từ lúa mạch. Thông thường, người ta sử dụng dịch nghiền hạt ủ chua, và bổ sung thêm chủng Lactobacillus deỉbrueckiì lên men lactic đồng hình. Sự tạo thành axit sẽ làm giảm pH của dịch đến 3, 8 từ 6 đến 10 giờ, nhờ đó hạn chế được sự phát triển của những vi sinh vật không mong muốn. Vodka và rượu làm từ ngũ cốc thường được sản xuất bàng cách chưng cất. Gin là một loại vodka có hương vị rất độc đáo do được bổ sung thêm quả Đỗ thông (jiniper berries). Rượu cẩm và Rượu cơm nếp là hai sản phẩm lên men xốp (solid fermentation) ăn cả cái lẫn nước rất được ưa chuộng ở nước ta. Rượu cần cũng là sản phẩm lên men xốp giữa cơm nếp và trấu trong bình gốm sứ và phía trên có gài lá cây và nút kín. Khi lên men xong có thể cắm cần tre vào và vừa đổ nước sạch vào vừa hút rượu ra qua cần tre. Người ta say mê rượu nhưng cũng rất say xỉn vỉ rượu. Ở Đức hiện có khoảng 4,3 triệu người mắc chứng bệnh nghiện rượu (rối loạn hành vi và tâm thần), trong đó có 30% là phu nữ. N ăm 2000 ở Đ ức đã có tới 16000 người chết... vì nrợu(!), ữ ong đó có 9. 550 trường hợp chết do xơ gan, hậu quả trực tiếp của nghiện rượu. Con số này đến năm 2004 đã tăng lên tới 40.000 người chết vì rượu (17.000 trường hợp do xơ gan). Hơn nữa ở Đức hàng năm có khoảng 2.200 trẻ sơ sinh bị khuyết tật do mẹ lạm dụng rượu. Những con số thống kê ở các nước khác cũng không kém kinh khủng. Ngoài xơ gan, người nghiện rượu có thể đẫn đến các hậu quả nguy hiểm khác như giãn tĩnh mạch thực quản, chảy máu dạ dày, viêm tuỵ, động kinh, ung thư thực quản, viêm cơ tim, đễ bị viêm phổi và lao, rối loạn chức năng não và nhiều bệnh thần kinh khác.

25.6.4.4. Sản xuất bánh ntỳ Bánh mỳ là một trong những thực phẩm cổ xưa nhất của loài người, được sản xuất nhờ sự có mặt của một số vi sinh vật. Sử đụng nấm men làm nở bánh mỳ đã được miêu tả một cách kỹ lường từ thời Ai Cập cổ đại. Một lò bánh mỳ được khai quật ở Kim tự tháp Giza, được biết đã cỏ tữ năm 2575 trước Công nguyên. Người ta ước tính lò bánh mỳ này đã cung cấp cho khoảng 30000 người mỗi ngày. Các mẫu bánh mỳ từ 2100 năm trước Công nguyên được trưng bày trong Bảo tàng tại Anh. Trong quá trinh làm bánh, sự sinh trường của nấm men xảy ra trong điều kiện hiếu khí, dẫn đến làm tăng lượng khí CƠ2 và tích lũy rượu ở mức tối thiểu. Quá trình lên men bánh mỳ bao gồm một số bước: a, Ị3amylaz có mặt trong bột ẩm sẽ giải phóng đường mantoz và saccaroz từ tinh bột. Sau đó, chủng nấm men bánh mỳ Saccharomyces cerevisiae, cỏ chứa một số enzym maltaz, invectaz, và zytaz, được đưa vào. CO2 được tạo ra nhờ nấm men lên men sẽ tạo thành các khoang trống ừong bánh mỳ, và một lượng nhỏ sản phẩm của quá trình lên men góp phần vào hương vị đặc trưng của bánh mỳ. Thông thường, những người làm bánh chi thêm lượng nấm men vừa đủ cho phép chúng tăng trưởng trong 2 giờ, thời gian tăng trưởng càng lâu sẽ ảnh hưởng đến chất lượng bánh mỳ do xuất hiện các vi sĩnh vật không mong muốn. Bằng cách sử dụng tập hợp các vi sinh vật, những người làm bánh có thể tạo ra những loài bánh mỳ đặc biệt như lả bánh mỳ chua. Nấm men Sacckaromyces exiguous, cùng với một sổ loài Lactobacillus tạo ra vị chua và mùi thơm đặc trưng của loại bánh mỳ này.

25.6.5. M ột số loại thực phẩm lên men khác Một số loài thực vật có thể được dung để iên men, xem bảng 25. 9. Đậu phụ nhự (chao) được tạo thành nhờ lên men đậu phụ- một sản phẩm từ dạng dung dịch đậu nành được làm đông tụ lại nhờ điểm đẳng điện thích hợp khi thêm nước chua vào.

694

Bảng 25.9: Thực phẩm lên men được tạo thành từ hoa quả, raut đậu, và một số chất khác Thực phẩm

Nguyên liệu thô

Vi sinh vật

Khu vực

Café

Hạt café

Envinỉa dissoìvens, Saccharomyces spp.

Brazil, Congo, Hawaii, Ấn Độ

Gari

Bột sắn

Corynebacterỉum manihot, Geotrichum spp.

Tây Phi

Kenkey

Ngô

Aspergillus spp., Peniciỉỉiỵm spp. , Lactobacillus, yeasts

Ghana, Nigeria

Kimchi

Cài bắp và một số ỉoạỉ rau khác

Vi khuẩn lactic

Hàn Quốc, Triều Tiên

Miso

Đậu tương

Aspergillus oryzae, Zygosaccharomyces rouxiị

Nhật Bản

Ogi

Ngô

Lactobacillus plantarum, Lactococcus ỉactỉs, Zygosaccharomyces rouxii

Nigeria

Oliu

Olỉu xanh

Leuconostoc mesenteroides, Lactobaciỉỉus planiarum

Nhiều nước

Ontjom

Bánh lạc ép

Neurospora sitophila

Indonesia

Peujeum

Bột sắn

Nấm mốc

Indonesia

Dưa góp

Dưa chuột

Pediococcus cerevisiae, L. plantarum

Nhiều nước

Poi

Khoai sọ

Vi khuẩn ỉactic

Hawaii (Mỹ)

Sauerkraut

Bắp cải

L. mesenteroides, L. plantarum

Nhiều nước

Nước đậu

Đậu tương

Aspergillus oryzae or A. soyae, z. rouxii, Lactobacillus delbrueckii

Nhật Bản

Sufu, Chao

Đậu tương

Mucor spp.

Trung Quổc, Việt Nam

Tao-si, Đậu xị

Đậu tương

A. oryiae

Philippines

Tempeh

Đậu tương

Rhizopus oỉigosporus, R. oryzae

Indonesia, Tân Guinea, Surinam

695

Để tiến hành quá trình lên men này, phần đậu phụ được cắt ra thành từng khoanh nhỏ rồi ngâm vào trong một dung dịch muối và axit xitric, sau đó các khối này được xử lý nhiệt để khử trùng bề mặt của chúng, Acitinimucor eỉegans và một số chủng Mucor khác được bổ sung thêm. Khi hệ sợi nấm trắng phát triển, các khối này, lúc này được làm chín ừong rượu gạo muối. Tại Việt nam đậu phụ được lót giấy bản rổi để tro bếp lên trên, lại lót giấy bàn và phủ tro bểp. Tro sẽ hút bớt nước trong các miếng đậu phụ. Sau đó lấy ra rắc lên các mặt từng viên đậu phụ bột nấm men thuốc bắc và để cho nấm sợi Rhizopus hay Mucor mọc ừắng như lông thỏ. Để lên men để biến protein trong đậu phụ chuyển thành axit amin. Sau đó nhúng các mặt vào muối bột. Sợi nấm sẽ tan hết do hiện tượng co nguyên sinh. Sau cùng cho vào lọ có ngâm rượu và có noi thêm cả ớt. Có loại chao đô do được cấy thêm nấm Monascus purpurius. Loại chao này không chỉ có màu đẹp mà còn cỏ thêm hương vị đặc biệt. Sản phẩm này được hoàn tất đối với một số món ăn ở nhiều vùng phía Tây thế giới. Sản phẩm phổ biến khác là tempeh, một loại bột đậu tương được lên men nhờ Rhizopus (hình 25. 22). Đây là sản phẩm ở đảo Java (Indonesia) và có tên là Tempe. Loài nấm sợi thường được sử dụng là Rhizopus oỉigosporus. Người ta rửa đậu tương và ngâm ữong nước 1 giờ, đun trong 2 giờ. Ngâm ữong nước ấm 12 giờ để làm trương hạt đậu lên. Lấy ra, bóc vỏ đậu. Đun sôi để diệt các vi sinh vật phát triển khi ngâm. Chuyển sang một bình khác và để cho ráo nước. Trộn đậu tương với bột bánh men, lên men 20 phút ở 30°c để cho sợi nấm mọc quanh bề mặt, gói lại trong lá chuối, để chỗ giâm mát trong 24 giờ, lấy ra để ra chỗ sáng và thoáng trong 24 giờ.

Tempeh.

Đậu tương đã chuyển thành tempeh. Tại Indonesia tempeh có nhiều loại và dùng để chế biến thành các món ăn khác nhau. Các loại thường gặp ở nước này là Tempebongkrèk, Tempe bosok, Tempe gembus, Tempe gódhỏng, Tempe goreng, Tempe mendoan, Tempe kedeỉai, Tempe murni, Tempe oncom.... Đáng lưu ý là ừong tempeh có một lượng chứa đáng kể vitamin B I2. Nato (Nattõ) theo Bách khoa thư mờ Wikipedia là một món ăn truyền thống của Nhật Bản làm từ hạt đậu tương lên men. Nó cỏ màu nâu, mùi khó ngửi, vị bùi và đậm, có nhiều chất dịch rất nhớt và dính. Natto được các nhà khoa học kết luận là có rất nhiều chất dinh dưỡng. Cùng với nước tương miso, nattõ là một trong những nguồn chất đạm quan trọng ở Nhật Bản thời phong kiến khi mà người ta không ăn thịt các loài thú và chim. Nattõ có thể bát nguồn từ vùng chân dãy núi Himalaya tại Vân Nam lan tỏa ra bên ngoài. Nattõ được

truyền đến Nhật Bản lúc nào, hiện chưa thể xác minh. Hiện nay, nó được nhiều người Nhật ưa thích, nhất là vùng Kantõ và vùng Tohoku. Nattõ được ăn như thức ăn kèm vớỉ cơm, hoặc nấu thành soup, hoặc làm nhân sushi cuộn, thậm chí làm cả spagetti và soba. Còn có loại nattõ sấy khô đóng bao để ăn như một món snack. Người ta chọn các hạt đậu tương nhỏ, ngâm nước Ưong vòng một ngày cho mềm ra, đem luộc thật chín, rồi làm cho lên men. Cách làm cổ truyền là gói đậu tương đã xử lý như ừên vào các túm rơm để lợi dụng vi khuẩn B. subtỉlỉs natto trong đó làm lên men đậu tương. Ngày nay, người ta sử dụng một thứ men gọi là kosõkin để bắt đầu quá trình lên men khoảng 24 giờ trong môi trường nhiệt độ chừng 40°c. Quả trình lên men này sẽ biến các protein trong hạt đậu tuơng thành axít amin, một chất bổ.

Hình 25.22: Các sản phẩm từ đậu tương được lên men. Đậu xị (Douchi, Daosi) là loại đậu đen lên men nhờ nấm Aspergillus oryae. Người ta luộc chín đậu tương rồi bao bằng một lớp bột mì có trộn sẵn với bào từ của nấm sợi Aspergillus oryae. Lên men để p h â n hủy protein thành các axit amin sau đó làm khô và bảo quản trong lọ, trong hộp giấỹ...ở Nhật Bản đậu xị được gọi là kanjU cũng còn gọi ỉà touchi. Sản phẩm này cũng tương tự như Ogiri và Iru- các loại đậu lên men ở châu Phi. Tại Việt Nam đậu xị thường được dùng khi kho cá. 697

Đậu xị Sauerkraut, hay dưa cải bắp được làm từ cải bắp thái nhỏ, để khô như minh họa ứong hình 25.23. Thông thường hỗn hợp vi sinh vật tự nhiên có ừong cải bắp được sừ dụng để lên men. Nồng độ muối từ 2,2 đển 2,8% sẽ hạn chế sự sinh trưởng của các vi khuẩn Gram âm trong khi đỏ lại thuận lợi cho các vi khuẩn sinh axit lactic. C íc lntóv cli* l>i«k ------------

Ạt lôấi 4ỈÌ aidilior

Cải bẳp tươi Tía bớt

Cẳt nhỏ Bổ sưng muối Hạn chế các VSVgây thổi Lên men 20-30 ngày

Chế biến và đóng gói

Loại nước trong oải bắp Tạo thành axit ỉactic

Hình 25.23: Các biỉớc sàn xuất Sauerkraut (Theo Prescott-Harỉey-Kỉeinẩ2002). 698

Các vi sinh vật chủ yếu trong quá trình tạo thành sản phẩm này là Leuconostoc mesenteroides và Lactobacillus pỉantarum. Hoạt động của cầu khuẩn sinh axit lactic thường ngừng lại khi nồng độ axit đạt 0,7 đến 1%. Tại thời điểm này Lactobacillus pỉatarum và Lactobacillus brevis vẫn tiếp tục hoạt động. Nồng độ axit cuối cùng thường từ 1,6 đen 1,8, trong đó sản phẩm đạt tiêu chuẩn có chứa nồng axit lactic từ 1,0 đến 1,3%.

Lactobacillus pỉantarum.

Dưa chua, cà muối là thức ăn lên men truyền thống ở Việt Nam. Chưa biết dưa chua, cà muối xuất hiện ở nước ta từ bao giờ, nhưng có lẽ cũng từ xa xưa lâu lắm rồi. Dưa chua, cà muối là thức ăn rất rẻ tiền, dành cho mọi tầng lớp nhân dân (Sớm trưa dưa muôi cho qua bữa/ Chợ bủa trầu chè chả dám mua) nhưng lại mang hồn dân tộc (Tương cà là gia bản) và không thể thiếu được ngay cả trong các mâm cỗ ngày Tết ( T h ị t mỡ, dưa hành, câu đối đỏ). Chúng ta đâu có ít loại dưa chua, cà muối, Có thể muối rau cải, rau cần, bắp cải, cải cù, su hào, cà rốt, đu đủ xanh, quả sung, hành cù, củ kiệu, dọc mùng, ngó sen, hoa súng, súp lơ, hoa điền điễn, dưa chuột, dưa gang, dưa hồng, giá đỗ, hành tây, cần tây, cần ta, tỏi tây, rau muốn, măng tre, măn nứa, ớt ngọt, cà bát, cà tím, cà pháo, xơ mít (nhút)... Cách làm cũng thật đơn giản và rất khoa học. Có loại dùng để ăn ngay trong thời gian ngắn ta thường gọi ìà muối xổi. Muối xổi cũng đựa vào quá trình lên men lactic nhưng gần đây cỏ sự cải tiến bằng cách ngâm với giấm (axít axêtic 5%) hay nước ép chanh (axít xitríc) cùng với một ít đường, muổi... Dưa cải muối thường được làm bằng cách phơi nguyên liệu trong bóng mát cho héo (thoát bớt nước) sau đó cắt nhỏ hay thái mòng. Cho vào vại sành , thêm nước muối (đối với 3kg cải xanh thường dùng 2 lít nước đun với 50g muối và lOOg đường). Đợi nguội đến khoảng 50°c thì mới cho vào với cải. Thêm nước cho ngập hết cải và chèn lên bàng một vỉ tre, trên vỉ ừe chặn bằng một cục đá đã rửa sạch (hay một vật liệu khác bằng sành đù nặng). Nước phải ngập cao hơn vỉ tre khoảng 5cm Khi tiếp xúc với nước muối các chất

699

dịch trong từng tế bào rau cải sẽ thoát ra ngoài theo nguyên tắc chênh lệch áp suất thẩm thấu. Các nhà khoa học gọi đó là hiện tượng co nguyên sình (plasmolysis). Đe xúc tiến nhanh hơn sự lên men lactic có thể thêm một ít nước đưa cũ. Để ức chế các vi khuẩn gây thối người ta thường thêm một ít hành vào vại. Sau vài ngày, khi dưa đủ chua là có thể dùng được, ngoài ra người ta còn thay đường bàng một ít khúc mía đã gọt bỏ vỏ và cắt nhỏ. Muối cà pháo, cà bát, cà tím cững tương tự như cách ừên và điều chỉnh thời gian sao cho vừa đủ chua, đủ giòn. Khi muối dưa hành thường dùng các nguyên liệu theo tỷ lệ như sau: hành-lkg; đường- 200g; muối-200g; tro bếp- 400g; giấm ăn-500ml; vôi-lOOg. Hành tách nhỏ ra nhưng không cất rễ. Hòa tro với nước thành dịch hơi sền sệt và ngâm ừong 2 ngày. Rửa sạch tro đưa hành vào dung dịch nước muối hơi mặn và ngâm trong 12 giờ. Rửa lại hành cho sạch. Cho tiếp hành vào nước vôi loãng và ngâm trong 12 giờ. Lấy hành ra, rừa sạch rồi cắt bỏ rễ và bóc vỏ rồi rửa lại cho sạch. Ngâm hành vào dung dịch nước đun với muối có thêm đường, giấm (đã để nguội vừa phải). Muối ừong 7 ngày thì hành vừa đủ chua và có thể ăn được. Muốn để lâu hơn thì thay bằng nước muối-đường- giấm mói. Hành phải đạt yêu cầu trắng, thơm, hết hăng, chua giòn, mặn vừa phải. Nước muối phài ngập hành như khi muổi dưa cải. Với cải cay thường thêm nguyên liệu lả hành lả, hành tím và ớt sừng đỏ. Với giá thì thường muối với và rổt và hành lá. Với bắp cải trắng (thái nhỏ) thì thường thêm cần nước, rau răm, hành lá, hành tím, ớt. Với kiệu thường chọn củ to và trắng, cắt bỏ rễ và lá, ngâm nước vôi (hay nước ứo bếp) 24 giờ, bóc vò ngoài, xả nước lạnh và phơi cho héo bớt. Chần qua nước sôi rồi vớt ra cho ráo nước. Không cần muối như với hành mà chi cần ngâm trong giấm, đường, muối cho vừa. Thường với lkg kiệu cần dùng khoảng 150g muối, 30g giấm và lOg đường. Với loại món ăn nhanh như kiệu còn có Dưa góp với các nguyên liệu theo tỷ lệ như sau: đu đủ xanh- 200g, cà rốt- lOOg, dừa già 50g, hạt sen-100g, khế chua- 70g, gừng non-50g, riềng non-50g, ớt tươi- 1Og, chanh 20g, giấm-20g đường cát-50g, nước mắm và muối-vừa đủ. Cùi dừa phải thái mỏng, hạt sen phải thông tâm và tách đôi. Các nguyên liệu khác phải thái miếng mỏng, bóp muối, rửa sạch rồi vắt ráo. Ớt phải thái chỉ. Hòa đường, nước mắm vào nước đun sôi để nguội, vắt chanh và thêm giấm rồi quấy đều trước khí cho các nguyên liệu khác vào. Điều chinh nước mắm cho vừa ngon rồi ngâm cho đủ ngấm. Thường ăn kèm với các món quay, rán. Kim Chi là thực phẩm lên men truyền thống rất nổi tiếng ờ Triều Tiên, Hàn Quốc. Hàn Quốc có tới 187 loại Kim Chi khác nhau. Kim Chi được La Tinh hóa thành Gimchi hay Kimchee. Tôi hỏi nhà khoa học Trung Quốc là Kim Chi cỏ phải là chữ Hản không thi được ưả lời là không phải. Kim Chi người Hàn Quốc gọi là Hangeoul, trước đây là

700

Chimchae, xuất phát từ chữ Hán là Trầm Thái-Rau ngâm. Nghe nói Kim Chi đã có mặt ở nước này từ cách đây khoảng 2600-3000 năm. Đó là loại thức ăn được muối chua từ các loại nguyên liệu thực vật và thường rất cay. Bạn bè quốc tế được tham quan Bảo tàng Kim Chi tại trung tâm thủ đô Seoul. Tại đây m ọ i người được phát tạp-dề, găng nilon, dao , thớt, bàn mài và nguyên liệu để tự tay làm Kim Chi. Nguyên liệu là Cải thào đâ được ngâm ừong nước nóng cho mềm, sau đó được nhồi vào trong từng lá một hỗn họp ừộn từ củ cải sát thành sợi mỏng, rau càn, xì dầu, muối, bột ngọt, ớt bột, gừng, tỏi, hành, đường, tôm tép khô... Sau khi để lên men lactic trong các chum, hũ bằng sành thì chi sau 2 ngày là ăn được. Với người Hàn Quốc thì có thể nói là họ mê Kim Chi và nhu một đạo giáo, họ tôn sùng Kim Chi đến mức ừong suốt đời không bữa ăn nào có thể thiếu được Kim Chi. Xứ sở Sông Hàn này còn thường được gọi là Xứ sở Kim Chì. Theo một phân tích chính thức thì Kim Chi cũng chẳng có giá trị dinh dưỡng gì đáng kể (ừong lOOg Kim Chi có chứa 88,4g nước; 32 Kcal; 2g protein; 1,3 g hydrat cacbon; 0,6g lipit; 1,2 g chất xơ; 0,5g chất khoáng; 0,03mg vitamin B l; 2,1 mg vitamin B3, 0,06mg vitamin B2; 21mg vitamin C; 492 IU (đơn vị quốc tế) vitamin A... Tuy nhiên người ta lại chứng minh Kim Chi là một trong 5 loại thực phẩm có lợi

nhất

cho

sứ c khỏe

(!), nhất là hồ trợ cho tiêu hóa và., .chống ung thư (!).

Cũng lại cỏ những nghiên cứu khác cho rằng Kim Chi vì chứa nhiều niừit nên nếu ăn nhiều sẽ gây ung thư. Còn có các chứng minh ở Đại học Seoul cho rằng Kim Chi được chiết xuất ra có thể chữa được cúm gia cầm ... Cỏ, ngô thái nhỏ và một số thực phẩm tươi cho động vật khác, nếu được giữ ừong điều kiện kị khí ẩm ướt, sẽ trải qua sự lên men lactic hỗn hợp, tạo ra loại thức ăn ủ xilô cho gia súc cỏ mùi vị thơm ngon. Nhiều nước người ta dùng hàm bằng bê tống hoặc thùng bằng thép để ù loại thực phẩm này. Sự tích lũy các axit hữu cơ trong các hầm ủ có thể là nguyên nhân gây hư hỏng nhanh chóng loại thực phẩm này. Ở Việt Nam ủ xanh thức ăn xanh (nhất là thân ngô) ứong các hầm cỏ lót màng chất dẻo sau đó lại phù màng chất dẻo lên trên và đắp đẩt kín lên trên là một phương pháp thích hợp để bảo quản thức ăn xanh cho trâu bò trong mùa khan hiếm thức ăn. Quá trình lên men lactic còn được sử dụng trong quá trình chế tạo bún và bánh phở với nguyên liệu là bột gạo. Nem chua là sử dụng quá trình lên men lactic để làm chín thịt sống và bì lợn (gói trong lá chuối). Tôm chua cũng là một đặc sản nổi tiếng của nước ta được chế tạo nhở quá trình lên men lactic tôm sống để nguyên cả vỏ và bảo quản trong các chai thủy tinh cùng với bột ớt.

701

Mè cũng là một sản phẩm lên men dùng làm chất điều vị cho một số món ăn. Người ta cho lên men cơm nguội nhờ tác động của vi khuẩn lactic, glucoznic và một sô động vật nguyên sinh Nhút là quá trình lên men lactic với nguyên liệu là xơ mít Miso (kanjỉ\ hiragana) hay tương Nhật là một loại gia vị, thực phẩm quen thuộc của người Nhật Bản, rất giống với Tương của người Việt, Doenjang của người Triều Tiên hay Huáng jiàng (Hoàng tương) của người Trung Quốc. Theo Bách khoa thư mở Wikipedia thì Mi so được làm chủ yếu từ đậu tương (đậu nành) cùng với gạo, lúa mạch rồi cho lên men trộn cùng với muối và kojikin- nấm Aspergillus. Sản phẩm lên men sau cùng là một loại sốt đặc sánh dùng để làm tương, nước sốt; để muối rau cải hay thịt các loại; hoặc nấu chung với nước dùng Dashi để tạo ra món canh miso Misoshiru hay súp miso, một món ăn không thể thiếu đối với người Nhật, vốn giàu protein, vitamin và các khoáng vi lượng, miso đỏng một vai trò rất quan trọng trong nền ẩm thực Nhật nói chung và văn hoá, lịch sử của quốc gia này nói riêng. Miso được dùng phổ biến khắp nước Nhật, trong cả nền ẩm thực truyền thống lẫn hiện đại, và đang dần chinh phục nền ẩm thực thế giới. Miso đặc trưng với vị mặn, nhưng kèm theo đó là mùi thơm và hương vị của riêng từng vùng; tuỳ thuộc vào thành phần nguyên liệu và phương pháp chể biến, lên men, Điểm khác biệt đó giữa các vùng cỏ thể kể đến như: độ mặn, ngọt, đặc sánh, màu sắc, hương thơm và độ ngọt riêng (của củ quả tạo nên), mùi rau thơm...

Tương trắng, đò và đen Để làm tương miso, đầu tiên ngưòi ta nghiền nhỏ đậu nành và ưộn đều với muối; tiếp đển chuẩn bị thành phần gạo, lúa mạch; những thành phần này, người ta nấu chín, sau đó trộn đều với fcoji (nấm sợi Aspergillus mọc trên cơm). Tiép đến ỉả trộn chung đậu nành

702

với gạo, lúa mạch đã chuẩn bị; rồi đưa vào phòng, ủ ở nhiệt độ khoảng 30°c. Thời gian ù sẽ quyêt định đến cách phân loại tương miso: Ư từ 1-2 tháng, sẽ cho tương miso trắng, ủ 4-5 tháng, cho ta tương miso đỏ. Và ủ trên 1 năm cho ta tương miso đen. Sau thời gian ủ, mè tương sẽ được lẩy ra sử dạng. Tuy nhiên, người ta sẽ không dùng hết tương đã ủ, mà họ sẽ bỏ đi lớp mặt không dùng được. Các nghiên cứu khảo cổ học cho thấy, miso đã được làm từ thời kỳ Jõmon. Từ thời kỳ Nara, thứ mà mô tả giống như miso đã được ghi chép lại. Mỉso thòi xưa cũng được làm từ đậu nành, nhưng men khuẩn kộịi chưa được sừ dụng tích cực nhu thời nay. Tài liệu cổ cũng cho biết từ thời kỳ Heian, miso được sử dụng như gia vị. Vào thời Kamakura, người Nhật có tập quán bữa cơm gồm com, cá khô, một chút raiso và rau xanh. Đến thời Muromachi, miso được làm bằng đậu nành nguyên hạt (không nghiền nhuyễn), gần giống món nattõ. Các tì khâu (sư, chú tiểu) thời Muromachi, nghĩ đến việc xay đậu nành thành chất nhão, sản sinh ra một cách thức nấu ăn mới, dùng tương miso làm hương vị cho các món ăn khác. Thời đó, miso được làm ở khăp nơi, và không chỉ còn là gia vị mà đã thành một thứ thực phẩm dự trữ. Đến thời Chiến Quốc (1467-1603), miso trở thành một nguồn dinh dưỡng quý phân phối cho binh lính. Các vị tướng thời này có chính sảch khuyển khích sàn xuất miso hẳn hoi. Miso thời Sengoku được xác định là đã giống như miso thời nay. Sang thời kỳ Edo, việc sản xuất miso rất phát triển. Mỗi địa phương có những bí quyết làm miso riêng và cỏ đặc trưng về hương vị riêng. Từ thời kỳ hiện đại hóa, miso dần dàn được sàn xuẩt theo phương pháp công nghiệp là chủ yếu. Miso làm tại gia đình ít dần đi. Hiện tồn tại hai giả thuyết về nguôn gổc của miso. Một cho rằng nó được du nhập từ Trung Quốc vì cho đến thời kỳ Edo, miso vẫn được gọi là hishio, viết là Tương theo chữ Hán. Thuyết khác cho rằng nỏ là sản phẩm độc đáo đo Nhật Bản tự phát triển. Lại có thuyết dung hợp cả hai giả thuyết trên. Miso có rất nhiều loại. Cơ quan Tiêu chuẩn Nông Lâm Nhật Bản phân các miso thành 4 nhóm: Kome miso (miso gạo) bao gồm các loại miso mà nguyên liệu chính là đậu nành và gạo; Mugi miso (miso lúa mạch) bao gồm các loại miso mà nguyên liệu chính là đậu nành và đại mạch hoặc khỏa mạch; Mame miso (miso đậu) bao gồm các loại miso mà nguyên liệu chính chỉ gồm đậu nành; Chõgõ miso (miso hỗn hợp) bao gồm các loại miso mà nguyên liệu chính là đậu nành và thêm một hoặc vài nguyên liệu nữa. Trong 4 nhóm, thì kome miso là loại phổ biển hơn cà. Mugi miso chỉ chiếm chưa đầy 11% tổng sản lượng miso. Hương thơm, mùi VỊ, cách phối trộn, cũng như cho thêm các thành phần đặc biệt vào

703

tương truyền thống... đã góp phần biến đổi miso, gây ra khác biệt theo vùng và theo thời vụ làm miso. Nguyên liệu, nhiệt độ, thời gian lên men, lượng muối, các loại kõji, và bể chứa (hay thùng, vại) cũng tạo nên khác biệt. Cách phân loại phổ biển nhất với miso đậu nành là: Shiromiso, "miso trắng’1 (thật ra có màu vàng); Akamiso, "miso đỏ"; Kuromiso, "miso đen"; Hatchomiso. Loại trắng và đỏ (shiromiso & akamiso) là loại miso căn bàn được sử dụng khắp nơi, trong và ngoài nước Nhật. Ở phía Đông vùng Kantõ, nơi có thủ đô Tokyo, shiromiso rất được ưa chuộng; phía Tây vùng Kansai, nơi tọa lạc các thành phổ lớn Osaka, Kyoto và Kobe, cư dân ưa thích loại hatchomiso nâu sậm, còn akamiso thì được chuộng ở

Vạiu tương..

vùng Tokai. Nguyên liệu thô để sản xuất tương miso: đậu nành, lúa mạch, gạo, kiều mạch, hạt kê, lúa mạch đen, tiểu mạch, hạt cây gai dầu và mè, cùng nhiều thứ khác, v ề sau, các nhà sản xuất đến từ các quốc gia khác lạỉ cho ra đời các sản phẩm miso làm từ ngô, đậu Ắn, rau dền, đậu Azuki, và quinoa. Thời gian ủ tương kéo dài ít nhất năm ngày đến khoảng vài năm. Hiện tại, chúng ta rất khó phân biệt được một hệ thống đồ sộ các loại tương miso, chỉ tạm phân loại theo độ mịn, màu sắc, hương vị và lớp đáy như sau: mugi từ lúa mạch; tsubu từ bột mì/lúa mạch; akữ màu đỏ; hinshu: một loại gạo màu nâu đậm; genmai từ gạo lứt, ngoài ra còn có awaz\ moromi; nanban; inaka; taima từ hạt gai dầu; sobamugi từ kiểu mạch; hadakamugi từ lúa mạch đen; meri thực phẩm của các nhà sư; gokoku từ năm loại ngũ cốc.. .Nhiều vùng có thay đổi cách làm dựa theo cách làm căn bản. Ví dụ như đậu nành dùng trong tương miso Sendai được nghiền nát hom miso đậu nành binh thường. Các loại miso có thêm nguyên liệu là gạo (gồm miso shinshu và shirò) được gọi chung là kome miso. Tương là một loại nước chấm lên men thịnh hành trong ẩm thực Việt Nam. Tương được làm từ gạo nếp đồ xôi, đậu tương, nước sạch, muối. Những địa phương làm tương nổi tiếng là Bần và phố Hiến (Hưng Yên), Cự Đà (Hà Tây), Nam Đàn (Nghệ An).. Mỗi địa phương có một bí quyết làm tương riêng, nhưng những nét chung trong cách làm là như sau: Rang đỗ tương lên cho có mùi thơm rồi xay nhỏ hoặc giã cho vỡ nhỏ (tùy theo từng địa phương m à độ nhỏ khác nhau). Sau đó đem ngâm nước muổi cho mềm và lên men nhờ vi khuẩn chịu mặn, thường thuộc chi BaciUus..

704

Gạo nấu thành cơm rồi đem ủ lên mổc vàng hoa cau. Để tránh nhiễm nấm Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin (gây ung thư) hiện nay các nhà khoa học khuyên các nhà làm tương sừ dụng các gói bào tử nấm sợi Aspergillus oryzae đã được chọn lọc (có hoạt tính cao và không sinh độc tố, do các cơ quan khoa học cung cẩp) Khi đã lên mốc và thành phẩm có mùi thơm ngọt rồi thì cho ngâm cùng đỗ. Hỗn hợp được cho vào vật đựng (chum vại) kín và ngăn được ánh sáng. Đem phơi nắng nhiều ngày để lợi dụng nhiệt năng của ánh sáng mặt trời làm cho tương tiếp tục lên men và ngấu chín. Tương dùng để chấm rau, đậu hoặc để nấu với các thức ăn khác. Tục ngữ có câu: Nát như tương; Dưa La, cà Lảng, nem Báng, tương Bần, nước mắm Vạn Văn, cá rô Đầm Sét; Nhút Thanh Chương, Tương Nam Đàn; Tương cà ỉà gia bản; Anh đi anh nhớ quê n h à /n h ớ canh rau muống nhớ cà dầm tương/nhớ ai dãi nắng dầm sương... ' Nước mắm là đặc sản của Việt Nam, Quá trình chế tạo nước mắm là quá trình thủy phân protein của cá thành dung dịch chứa nhiều axit amin và các peptid phân tà nhỏ. Enzym proteinaz dùng để phân giải protein chủ yếu lấy từ ruột cá nhưng cũng có sự tham gia của một số vi khuẩn ưa mặn hay chịu mặn. Đặc biệt có một số vi khuẩn có tác đụng tạo nên hương thơm đặc trưng của nước mám mà còn chưa được nghiên cứu nhiều. Làm nước mắm ở quy mô nhỏ thường dùng các vại to gọi là phồm, ưông giống chum, cao ưên Ị,5m nhưng miệng và đáy rộng hơn chum. Mỗi phồm thường chứa được ưên 100 kg cá. Gần đáy phồm có một lỗ ừòn để gản với nõ. Nõ là một đoạn ngọn tre có mắt, được đục lỗ, bịt lại bằng thanh ừe tròn nhỏ giống n h ư chiếc đũa. Đây là nơi rút nước mắm ra khi đã ngấu chín. Cuối xuân, đầu hè người ta cọ rửa các phồm rồi phơi nẳng cho khô. Chuẩn bị sẵn vài ba thúng muối (loại muối được sàn xuất trước đó ít nhất 1 năm). Khi có cá thì chọn loại cá nục (cả đổm) loại 5-6con/lkg, rửa sạch cá bằng nước muối, để ráo nưởc thi xếp vào phồm. Cứ một lớp cá lại một lớp muối. Khi đầy thì đậy nắp lại. Sáng có nắng thi mở ra phoi, chiếu sắp tắt nắng thì đậy nắp lại. Sau khoảng 10 tháng thỉ rang thính bằng gạo lứt và đổ vào. Thường sau 2 năm thi bắt đầu rút nước mám cốt. Nới lòng thanh tre tròn nhỏ ra để ri nước mắm vàng quổnh ra. M ỗi ngày chỉ thu từ mồi phồm được khoảng 1 lít nước m ắm cốt.

Nước mám ấy mới thật sự là ngon. Khi không còn rỉ nước mắm ra nữa thì đổ nước muối vào, khuẩy lên và thu được loại nuớc mám chất lượng thấp hon, thường dùng để nấu nướng. Thương hiệu nước măm Phú Quốc đã bị Thái Lan chiếm đoạt mà ta chưa lấy lại được mặc dầu nước mắm Phú Quốc của ta ngon hom hẳn nước mám Thái Lan. Vì muối ức ché hoạt tính của enzym proteinaz chó nên muốn cải tiến quy trình sản xuất nước mắm cỏ thể thủy phân không muối ờ nhiệt độ 40-50°C và xay nhỏ cá ra trước khi cho lên men. Nưởc mắm cải tiến cỏ thề có đạm amin khá cao nhưng không thể có mùi vị và hương thơm như nưởc mắm sản xuất theo phương pháp cổ truyền.

Mắm tôm, mắm tép cũng là sản phẩm lên men xốp với điều kiện có muối dưới tác dụng của enzym proteinaz của ruột tôm tép và của một số ví khuẩn chịu mặn. Quá trình lên men cần dài ngày và sản phẩm có độ mặn khá cao. Giấm là sản phẩm lên men từ rượu loãng (5-10% etanopl) hay từ bia, Người ta thường cho thêm quả chuối chín hay quả hồng khô vào để nhiễm vỉ khuẩn Acetobacter từ thiên nhiên vào. Cũng có thể cấy “cái giấm” (sinh khối Acetobacter) từ mẻ lên men trước sang mẻ lên men sau. Đây là một quá trình oxy hóa nhưng theo thói quen vẫn gọi là “lên men”. Quá trinh sản xuât thường dùng các chum sành có bề mặt thoáng và được đậy kín miệng bằng vải. Nồng độ axit axetic trong giấm thường vào khoảng 5-7%. Thạch dừa (nato đe coco) được sản xuất từ nước đừa (cỏ thêm đường) theo phương pháp lên men bề mặt và cỏ cấy bàng vi khuẩn Acetobacter xyỉinum. Rửa sạch sinh khối rồi đóng vào các chai lọ bằng nhựa, khử trùng ở nhiệt độ không quá cao. 25.7. VI SINH VẬT LÀ NGUỒN T H ự C PHẨM VÀ T H ự C PHẨM BÓ SUNG (M icroorganism as Foods and Food Amendments) Bên cạnh những vi sinh vật hoạt động trong quá trình lên men như là các tác nhân biển đổi về vật lý và sinh học thì bản thân chúng cũng có thể được sử dụng nhu một nguồn thực phẩm. Sự đa dạng của ví khuẩn, nấm men và nhiều loại nấm ăn có thể được dùng như là nguồn thực phẩm cho người và động vật. Có rất nhiều loại nấm ăn đã được nuôi trồng rộng rãi ở Việt Nam: Nấm rơm (còn gọi là Nấm rạ, Thảo cô) cỏ tên khoa học là Voỉvarielỉa voỉvacea (Bull, ex Fr.) Sing, thuộc họ Pluteaceae, bộ Agaricales, lớp phụ Hymenomycetidae, lớp Hymenomycetes, ngành phụ Basidìomycotina, ngành Nấm thật- Eumycota, giới NấmMycota hay Fungi (1). Cũng có tài liệu cho răng loài nấm rơm thuộc họ Amanitaceae (2). Nấm rơm có nguồn gốc từ các vùng mưa nhiều, có nhiệt độ cao ở khu vực nhiệt đới và á nhiệt đới. Nhân dân nhiều nước Châu Á biết ãn nấm rơm từ cách đây rất lâu nhưng việc chủ động nuôi trồng nấm rơm chỉ bắt đầu có ở Trung Quổc từ cách đây trên 200 năm. Việc nuôi trồng nấm rơm về sau phát triển cả ở nhiều nước khác như Việt Nam, Malaixia, Myanma, Philippin, Thái Lan, Nhật Bản, Singapo, Triều Tiên, Đại Hàn, Mađagatsca, Nigiêria... Sản lượng tươi của nấm rơm được sản xuất ra trên toàn thế giới là trên 250. 000 tấn (1995), riêng Trung Quốc đã íà 150. 000 tấn (chiếm 60% sản lượng của thế giới). Trước đây nấm rơm Voỉvarỉeỉỉa voỉvacea (Bull, ex Fr.) Sing, đâ từng mang các tên khác như Agaricus vohacea Bull. (1785), Amanita virgata Prs. (180), Voỉvaria voỉvacea Quel. ( ỉ 886), Volvaria virgata Quel. (1873) Volvariopsis voỉvacea Murr. (1917)... Cho đến nay người ta đã miêu tả 5 loài nấm rơm có thể dùng để ă n ., đó là:

706

1 - Vữỉvarieỉỉa voỉvacea

(Bull,

ex Fr.) Sing

2 - Voỉvarỉeỉla volvacea

(Bull,

ex Fr.) Sing var. masseei Sing

3 - Voỉvarieỉla volvacea

(Bull,

ex Fr.) Sing var. hemii Sing

4 -Voỉvariella esculenta (Mass) Sing, còn gọi là Voỉvarỉelỉa bresadolae Sacc. and Trott. 5 - Voỉvarỉeỉỉa dipỉasia (Berk et Curt.)Sing

Nấm rơm Nấm sò (còn gọi lả nấm Bào ngư, nấm Hưcmg chân ngán, nấm Bình cô, (Oyster Mushroom) gồm nhiều loài thuộc chi Pleurotus, họ Pleurotaceae (có không ít tài liệu xếp chi Pỉeurotus vào họ Tricholomataceae), bộ Agaricales, ỉớp phụ Hymenomycetidae, lớp Hymenomycetes, ngành phụ Basidiomycotina ,ngành Nấm thật- Eumycota, giới nấmMycota hay Fungi. Nấm sò thuộc về một chi cỏ tới 50 loài khác nhau. Tuy nhiên chỉ có khoảng 10 loài được nuôi trồng. Đó là các loài sau đây: 1). Nấm sò màu hồng đào (Pink Oyster Mushroom). Tên khoa học là Pỉeurotus salmoneostraminus L. Vass. 2). Nấm sò Hoảng Bạch (Branched Oyster Fungus). Tên khoa học là Pỉeurotus cornucopiae (Paul ex Pers) Roll. 3). Nấm sò Kim Đỉnh (Citrine Pleurotus). Tên khoa học là Pleurotus citrinopỉleatus Sing. 4). Nấm sò A nguỵ (Ferule Mushroom). Tên khoa học là Pleurotus/eruỉae Lenzi.

707

5). Nấm sò tím (Oyster Mushroom). Tên khoa học là Pỉeurotus ostreatus (Jacquin. Fr.) Quél. 6). Nấm sò phiến hồng, nấm sò đỏ pháo (Pink Gill Oyster Mushroom). Tên khoa học là Pỉeurotus rhodophylỉus Bres. 7). Nấm sò cuống dài, nấm sò màu tro (Long - stalked Pleurotus). Tên khoa học là Pỉeurotus spodoleucus (Fr.) Fr. 8). Nấm sò Đài Loan, nấm sò ưa nóng (Cystidi ate Pleurotus, Abalone Pleurotus). Tên khoa học là Pleurotus cystìdiosus o . K. Miller. 9). Nấm sò viên bào (Angels Wings). Tên khoa học là Pỉeurocybeỉla porrigens (Pers.: Fr) Sìng. Tuy thuộc chi khác nhưng vẫn trong họ nấm sò (Pleurotaceae) và có hình giống vò sò. 10). Nấm sò Phượng vĩ, nấm sò có vòng, nấm sò Himalaya, nấm sò Ẩn Độ (Phoenixtail Mushroom). Tên khoa học là Pỉeurotus sajor - caju (Fr) Sing. Ngoài 10 loài nấm sò nói ứên còn thường gặp Nấm sò sồi (Pleurotus dryinus), nấm sò trơn phẳng (.Pỉeurotus ỉevìs), Nấm sò nhân lớn (Pìeurotus tuber - regiumX Nấm sò thần Prômêtê (Pỉeurotus prometherus), Nấm sò Phiếm bạch (Pỉeurotus pantoỉeuceus), Nấm sò Lông thô (Pỉeurotus hìrtus), Nẩm sò Florida (Pỉeuroíus Jloridanus), Nấm sò Hoàng Bá (Pìeurotus phelỉodendri), Pỉeurotus subgỉaber, Pỉeurotus ìmportatus, Pleurotus woermannii V . V ... Theo ý kiến của một số nhà Nấm học thì các Pleurotus ostreatus. loài Pỉeurotus sau đây chỉ là tên khác của Nấm sò tím (Pỉeurotus ostreatus): p. sapidus, p. chrysophyỉlus, p. cornucopiae, p. cornucopioides, p . p a r th e n o p e iu s , p . o p u n tỉa e , p . c o ỉu tn b in u s , p . s a ỉỉg n u s , p . p u lm o n a r iu s , p . c o n v iv a r u m .

Nấm sò Pleurotus dryinus còn có tên khác là p. cortỉcatus, p. pomeỉi. Nấm hương (Đông cô, Hương cô, Shiitake, Black Forset Mushroom, Japanese Mushroom, Chinese Mushroom) có tên khoa học là: Lentìnuỉa edodes (Berk.) Pegler. Trước đây Nấm hương còn mang các tên khoa học khác như: Lentinus edodes, Cortineỉỉus shiitake, Cortineìỉus edodes, Cortineỉỉus berkeỉeyanus, Armilỉaria edodes...

708

Nâm hương thuộc họ Tricholomataceae, bộ Agaricaless, lớp phụ Hymenomycetidae, lớp Holobasidiomycetes (hoặc Homobasidiomycetes hay Eubasidiomycetes), ngành phụ Basiđiomycotina, ngành Nấm thật-Eumycota, giới Nấm -Mycota hay Fungi. Ngoài loài Nấm hương chủ yếu này còn có 2 loài Nấm hương ăn được khác cùng thuộc chi Lentinus. Đó là Nấm hương da hổ (Scaly Mushroom) - Lentìmts tigrnus (Bull) Fr. và Nâm hương da (Scaly Lentines) - Lentinus ĩepideus Fr. Còn có một số loại Nấm hương ăn được nhưng thuộc các chi khác, không phải chi Lentinus. Có thể kể đến Nấm hương tím (Falsse Blewit) - Sepìsta per sonata (Fr. ex Fr) Sing, Nấm hương màu thịt (Pink Lepista) - Lepsita irina (Fr) Bigelow, Nấm tử đinh hương (Blewit, Wood Blewit, Naked Mushroom) - Lepistanuda (Bull, ex Fr.) Coote, Nấm hương mặt hoa (Sordid Lepista) - Lepista sordida (Fr) Sing, Nấm hương trắng (nấm Bạch hương, Abbescent Lepista) - Lepista caespitosa (Bres) Sing.

hentinuĩa edodes. Nấm mõ (còn gọi là Nấm trắng - White mushroom, nấm Paris - Champignon de Paris, Champignon de couche) là tên chung để chỉ các nấm ăn được thuộc chi Agaricaceae, bộ Agaricales, lớp phụ Hymenomyce - tidae, lớp Hymenomycetes, ngành phụ Basidiomycotina, ngành Nấm thật - Eumycota, giới Nấm - Mycota hay Fungi. Các loài nấm mỡ ăn được gồm có: - Nấm mỡ song bào (nấm mỡ phổ biến, Common Cultivated Mushroom): Agaricus bisporus (Lange) Sing, còn có tên là Agaricus brunnescens Peck. - Nấm mỡ xuân (nấm mồ thành thị, Spring Agaricus, Urban Agaricus): Agaricus bitorquìs (Quél.) Sacc. - Nấm mỡ tứ bào (Meadow Mushroom, Pink Doffon, Field Mushroom): Agaricus campestris L. ex Fr. - Nấm mỡ ruộng (nấm mồ ngựa, House Mushroom): Agaricus arvensis Schaeff ex Fr.

709

Jk

- Nấm mỡ đỏ tía (nấm tử cô, Blood Red Mushroom): Agaricus rubeỉỉus (Gill.) Sacc. - Nấm m õ chày trắng (Albescent Mushroom): Agaricus nivescens Moller. - Nấm mỡ hai vòng đất rừng (nấm mỡ song hoàn, Eastern Flat - topped Agaricus): Agarỉcus placomyces Peck. - Nấm mờ lâm sinh (nấm mỡ bạch lâm, Silvan Mushroom, Wood Mushroom): Agaricus sỉỉvỉcola (ViH) Sacc. - Nấm mõ đất rừng (Nấm mỡ gỗ nâu, nấm mỡ lâm địa, Brown Wood Mushroom): Agaricus siỉvaticus Schaeff. ex Fr. - Nấm mỡ vẩy đỏ gạch (Reddish Psalliota): Agaricus subrufescem Peck. - Nấm mỡ mặt nháp (Villatic Mushroom): Agarỉcus viỉỉatỉcus Brond. - Nấm mỡ hoàng tử (nấm mõ vẩy nâu tím, nấm mờ đại tử, the Prince Mushroom): Agaricus augustus Fr. Trên thực tế chỉ có 3 loại đầu là được nuôi ưồng rộng rãi trên thế giói. Nấm mỡ (Agaricus bỉsporus) được coi là một trong có loài nấm quan ừọng sử dụng tiếp như một nguồn thực phẩm. Nấm lớn là sinh vật bậc cao nhưng khi nuôi cấy dạng sợi thì chúng vẫn được coi là vi sinh vật và phải đùng các kỹ thuật nuôi cấy vô khuẩn khi nhân giống chúng trước khi đưa vào sản xuất lớn. v ề các kỹ thuật nuôi trồng từng loại nấm ăn ( và nấm dược liệu) có thể xem trong sách Công nghệ nuôi trồng nấm (Nguyễn Lân Dũng, NXB Nông nghiệp, Tập ỉ và 2).

Các vi sinh vật khác cũng có thể được sử dụng trực tiếp làm nguồn thực phẩm hoặc là một nguồn dược phẩm bổ sung và do đó còn được gọi là protein đom bào (single-cell protein). Một trong số nhiều quần thể vi sinh vật đóng vai ưò là nguồn thực phẩm bổ sung đó là vi khuẩn lam spiruỉina. Đây là một ỉoại vi sinh vật cỏ hình xoắn sống trong nước mà

710

người ta quen gọi là Tảo xoăn với tên khoa học là Spiruỉina platensìs. Thực ra đây không phải là một sinh vật thuộc Tảo (Algae) vì Tảo thuộc nhóm Sinh vật có nhân thật (Eukaryotes), spirulina thuộc Vi khuẩn lam (Cyanobacteria), chúng thuộc nhóm Sinh vật có nhân sơ hay nhân nguyên thủy (Prokaryotes). Những nghiên cứu mới nhất lại cho biết chúng cũng không phải thuộc chi spirulina mà lại là thuộc chi Arthrospira. Tên khoa học hiện nay của loài này là Arthrospira platens is, thuộc bộ Oscilatoriales, họ Cyanobacteria (http://www, cyanotech. com/ spirulina/ spirulina specs. html).

Ta quen gọi ỉà Tảo xoắn Spirulina, cũng không sao. vấn đề quan trọng là sinh khối của chúng rất giàu dinh dưỡng và cỏ nhiều tác dụng chữa bệnh nên đã được nuôi ừồng ở quy mô công nghiệp và được sản xuất dưới dạng viên để phòng chống nhiều loại bệnh tật. Nhân dân nhiều vùng ở Mexico và châu Phi từ lâu đã quen sử dụng Spirulina làm thức ăn bổ sung. Nó được gọi dưới tên là Ballerina. Spirulina thích hợp với môi trường kiềm cho nên từ lâu đã phát triển tự nhiên trong các hồ ờ thung lũng Rift (Đông Phi) hay ờ Cộng hòa Chad. Chúng chịu được độ pH rất cao nên trong những môi trường đặc biệt như vậy hầu như không nhiễm tạp bời các loài sinh vật khác, người dận chỉ việc đặt vài trên cát, đổ nước hồ lên rồi phơi nắng là thu được sinh

711

khối Spirulina. Đáng chú ý là ở chỗ sinh khối này chửa tới 62% protein với đủ các loại axit amin cần thiết cho nhu cầu dinh dưỡng của cơ thể. Ngoài ra còn chứa phong phú vitamin B | 2. Beta-caroten , xanthophyll và nhiều nguyên tố khoáng. Các nhả khoa học đã phân lập thuần chủng để tiến hành nuôi cấy chúng ở quy mô công nghiệp nhằm tạo ra các viên nén Spirulina. Hàng ừiệu người ừên thế giới đã dùng thường xuyên các viên nén này như một loại thuốc bổ dưỡng cao cấp. Tuy nhiên để tạo điều kiện đủ độ kiềm ưong môi trường nuôi cấy spirulina người ta cần dùng tói khá nhiều natri bicacbonat. Như vậy sẽ rất tốn kém. Thật may, thiên nhiên đã tạo ra ở Vân Nam (Trung Quốc) một hồ lớn có độ kiềm cao, VI vậy tại đây đã cỏ một xường lớn chuyên sản xuất Viên nén SpiruJina phục vụ rộng rãi cho nhu cầu trong nước và xuất khẩu.

Việt Nam may mắn cũng có một nguồn nước có độ kiềm cao, đó là nguồn nước suối Vĩnh Hảo ở Bình Thuận. Công trình nghiên cứu tại Vĩnh hảo được triển khai bởi một Đề tài cấp nhà nước do c ổ GS Nguyễn Hữu Thước chủ ưỉ và hiện nay được Công ty cổ phần nước khoáng Vĩnh Hảo đang sản xuất dưới dạng viên nén với công suất tới 8-10 tấn / năm. Tuy có lượng chửa protein rất cao nhưng mỗi ngày chi dùng có 6-10 viên (mỗi viên 0,3g) thì cũng chả nghĩa lý gì. Không giống như người dân ở Chad dùng Spirulina để nấu cháo ăn với sổ lượng lớn hàng ngày. Vậy thì giá trị đích thực của viên spirulỉna là ở chỗ nào?

Phân tích các viên nén Spirulỉna thường được sản xuất tại Hawaii người ta nhận thấy hàm lượng protein > 52%; beta-caroten> 1600mg/kg; tổng số carotenoits> 3500mg/kg; phycocyanin (thô)> 10% (www. cvanotech. com). Tỷ lệ từng axit amin ừong sinh khối Spirolina được Chen Tiannfeng (Jinan Univ.) xác định như sau (mg/g):Asp-54,12; Glu81,43; Ser-23,71; Arg-28,17; Thr-32,88; Gly-23,63; Ala-30,49; Pro-17,12; Val-20,81, Met9,56; SeMet- 0,26; Ile-20,50; Leu-32,70; Phe- 18,87; Cys+CysH- 11,26; Lys-19,82; His5,90; Tyr-13,21. Nhiều nghiên cứu cho biết sinh khối Spirulina có thành phần canxi spirulan, là chất cỏ tác dụng ức chế sự phát triển nhiều loại virut , kể cả HIV. Sinh khối này còn làm hạ lượng chứa cholesteol ưong máu. Thảnh phần phycocyanin có tác dụng oxy hóa nên làm ức chế độc tố gan hepatotoxin. spirulina có tác dụng nâng cao tính miễn dịch, nâng cao sức đề khảng của cơ thể. Nghiên cứu của R. Kozlenko và cộng sự (www. spirulina. com/SPLNews96. htmP đã chứng minh Spirulina có tác dụng ngăn cản sự xâm nhập của virut qua màng tế bào. Các nghiên cứu của nhiều nhà khoa học đã chứng minh khả năng ức chế ung thư của sinh khối hay dịch chiết của Spirulina (M. Babu et a l., 1995; L. Lisheng et al. 1991; Pang Qishenet al. , 1998). Spirulina có tác dụng kích thích sự tăng nhanh các tế bào hồng cầu bạch càu và nâng cao khả năng miễn dịch của cơ thể (M. A. Qureshi et al. /1995, 1996). Tác dụng phả biến của việc sử dụng thường xuyên các viên nén Spirulina là giảm khả năng ung thư, nâng cao tính miễn địch, ức chế virut, chống lão hóa và làm giảm nếp nhăn, làm giảm colesterol máu, hạn chể các tai biến về tim mạch...

Ngăn cản sự xâm nhập của virut.

Kích thích sự hình thành hong cầu và bạch cầu.

Clolla cũng là ioại tảo được sản xuất công nghiệp để làm dược phẩm bổ sung protein và vi tamin cho người. Thường đùng phương pháp nuôi cấy trong các bể cỏ dòng chảy lưu động nhờ các cánh khuấy chạy bằng điện.

713

Nấm men có sinh khối giàu protein và vitamin nên cũng được sản xuất để làm dịch tự phân giàu axit arain dùng ừong y học hoặc để làm sinh khối bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Nguồn cacbon để sản xuất sinh khối nấm men có thể là rỉ đường mía hay rỉ đường củ cải đường. Tuy nhiên gần đây người ta đã tìm được các chủng nấm men đồng hóa được các hợp chất hydrocacbon trong khí thiên nhiên. Nguồn cacbon này rè hơn và có thể cho phép xây dựng các nhà mảy lớn sản xuất sinh khối nấm men phục vụ chăn nuôi. Tại Pháp có một dược phẩm mang tên Uhralevure dùng để chữa bệnh rối loạn tiêu hóa sau khi dùng kháng sinh. Chủng nấm men được sử đụng mang tên Saccharomyces Bouỉardii. Đây là tên thương phẩm vì ưong chi Saccharomyces không có tên loài nấm men này.

Nấm men và sản phẩm Uỉtralevure. Các vi sinh vật như Lactobacillus và Bifidobacterium đang đuợc phát triển nhanh chóng dưới dạng probiotic, đó ỉà sự bổ sung các nhóm vi sinh vật có lợi vào chế độ ăn góp phần bảo vệ sức khỏe vượt qua giá trị dinh dưõmg cơ bản. Những thực phẩm bổ sung này có thể được gọi là các chất phụ ừợ trong chế độ ăn uống có bản chất ỉà vi sinh vật (microbial dietary adjuvants). Trước đây, nhiều công bổ về giá trị của probiotic đã không dựa trên cơ sở khoa học nên không chứng minh được vai ứò cùa probiotic. Tuy nhiên, ngày nay, điều đỏ đã thay đổi, nhiều công trình khoa học đã chứng minh được. Ví dụ, các nhà khoa học đã tạo ra một hệ thống mô phỏng hệ vi sinh vật trong ruột non của người (hệ thống SHIME), để rõ hơn về hiệu quả của các sinh vật probiotic.

714

Bifidobacterium longum

Thêm vào đó, sự nhận thức đúng đắn về vai ừò của các chất oỉìgosaccharid hay còn gọi là prebiotic, chúng chưa được tiêu hóa cho đến khi vào trong ruột già. Sự kết hợp của các prebiotic và các vi sinh vật probiotic được mô tả như một hệ thống cộng sinh (symbiotic system). Sự kết hợp này có thể đẫn đến sự tăng lượng axit butyric và axit propionic, cũng như sự tăng lên của Bifidobacterium trong khu hệ đường ruột ờ người. Butryrat đặc biệt đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy hiệu quả của probiotic đối với các quá trình trong ruột. Probiotic cũng đă được sử dụng thành công ở gia cầm, Gần đây, USD A đã chỉ định chủng Baciỉĩus subtìlis làm probiotic cho gà. Khi bổ sung Bacillus subtilìs cho gà sỗ làm tăng trọng lượng cơ thể và tăng cường chuyển hóa thức ăn. Người ta cho rằng, dùng probiotic sẽ làm giảm nhu cầu sử dụng kháng sinh đối với các sản phẩm gia súc và giảm mức độ gây bệnh ờ các trang ưại. Salmonella có thể được kiểm soát bằng cách phun một hỗn hợp 29 loại vi khuẩn đã được cấp bằng sáng chế, phân lập từ manh tràng của gà. Khi chúng tự ria lông, những con gà con sẽ tiêu hóa hỗn hợp vi khuẩn, thiết lập một cộng đồng vi sinh vật chức năng trong manh ừảng và qua đó giới hạn sự sinh trưởng của Salmonella ừong ruột, quá trình này được gọi là sự loại trừ cạnh tranh. Năm 1998, sản phẩm nảy, được gọi là PREEMPT™, được Cục Quản lý Thực phẩm và Thuốc (FDA)chấp nhận cho sử dụng ở Mỹ. Các chất điều vị cũng ià sản phẩm lên men nhờ vi sinh vật. Mỳ chính hay Bột ngọt chính là natri glutamat. Nguồn axit glutamic được tạo ra nhờ quá trinh sinh tồng hợp dư thừa của một sổ chủng vi khuẩn (Corynebacterium gỉutamicum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium pekinensis, Corynebacterium crenaíum...) Sàn lượng hiện nay có thể đạt tới 150g aciod glutamic/1 lit dịch lên men (!). Nhiều nhà máy liên doanh với nước ngoài với quy mô lớn (Vedan, Ajinomoto, Mi won..) đã được xây dựng ở Việt Nam và sản phẩm không chi đáp ứng được nhu cầu trong nước mà còn xuất khẩu được rất nhiều ra nước ngoài. Các lời đồn đại ăn bột ngọt có hại cho sức

715

khỏe đều không có đủ cơ sở khoa học. Tổ chửc FAO của Liên hiệp quốc cho biết dùng dưới 6g/ ngày (ít ai dùng nhiều như vậy) là an toàn. Tuy nhiên theo cố GS Nguyễn Văn Chuyển (Đại học nữ Tokyo) thì không nên dùng bột ngọt cho ừẻ em đang ăn bột vì có hại cho sự phát triển của chúng (và chúng cũng không có nhu cẩu dùng chất điều vị). Một số sản phẩm Siêu bột ngọt cũng bắt đầu được đưa vào sản x u ấ t dựa ửên sự chuyên hóa các bazơ nucleic được tổng hợp nhờ vi sinh vật. H ( / s
Na+

NH2 Công thức của bột ngọt- Na glutamat

Corynebacterìum gỉutamicum. Một sản phẩm khác dùng ừong chế biến thực phẩm là gôm xantan (Xanthan Gum) cũng được sản xuất ở quy mô công nghiệp nhờ vi khuẩn Xanthomonas campestris. Sản lượng sản phầm này ở Hoa Kỳ đạt tới trị giá mỗi năm ừên 500 triệu USD. Axit xitric (hay axit limonic- CéHgC^) được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm cũng là một sản phẩm lên men nhờ vi sinh vật. Quá trình lên men bề mặt được thực hiện bởi nấm sợi Aspergillus n ig e r .

Hiện này người ta đa chuyển sang phương

p ũ p lên men chim. Nguàn cacbon thuòng đuọc sử 716

Xamhomũnas campesíris.

dụng là ri đường (molasses). Gần đây đã có nước tiến hành sản xuất thảnh công axit xitric từ nguồn hydrro cacbon và vi sinh vật được dùng là nấm men Candida lypolìtìca.

Vi nấm Aspergillus niger.

Mục LỤC Lòi nóì đầu........................................ .................................................................................3 Chương 13. DINH DƯỠNG CỦA VI SINH VẬT 13.1. YÊU CÀU DINH DƯỠNG CỬA VI SINH VẶT...................................................................5 13.2. CÁC LOẠỊ HÌNH DINH DƯỠNG CỬA VI SINH VẶT......................................................23 13.3. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY (Culture medium)....................................................................26 13.4. SựHÁP THU CÁC CHẮT DINH DƯỠNG Ở VI SINH VẬT.............................................36

Chương 14. SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIẺN CÙA VI SINH VẬT 14.1. ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG ........................................................................................47 14.2. XÁC ĐỊNH s ự SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT........................................................ 54 14.3. NUÔI CÁY LIÊN TỤC VI SINH VẬT ........... .......... v..................................................... .60 14.4. ẢNH HƯỜNG CỦA CÁC NHÂN TỚ MÔÍ TRƯỜNG ĐẾN s ự SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT.................................................... ............ ...................... ......................63 14.5. Sự SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT TRONG MÔI TRƯỜNG T ự NHIÊN................ 82 Chương 15. ứ c CHÉ VI SINH VẬT BẢNG CÁC TÁC NHÂN VẬT LÝ VÀ HÓA HỌC 15.1. ĐỊNH NGHĨA THUẬT NGỮ.............................................................................................. 87 15.2. CÁC PHƯƠNG PHAP t i ê u d i ệ t VI SINH VẬT................................... ......... ..... ......... 88 15.3. CÁC ĐIÊU KIỆN ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUÀ CÙA CÁC NHÂN TÒ KHÁNG VI SINH VẬT........................................................... ....... ............. ............................................90 15.4. S ử DỤNG CÁC PHƯƠNG PHÁP VẬT LÝ ĐẺ KHÓNG CHẾ VI SINH VẬT.................. 91 15.5. Sử DỰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC ĐẺ KHỐNG CHÉ VI SINH VẬT................... 98 15.6. ĐÁNH GIÁ HIỆU L ự c CỦA CÁC TÁC NHÂN KHÁNG VI SINH VẬT...................... 104

Chương 16. KHÁI NIỆM CHUNG VÈ TRAO ĐỎI CHÁT Ở VI SINH VẬT 16.1. NÂNG LƯỢNG......................................................................................................................106 16.2. ENZYM.................................... ................................v............................................................119 16.3. TÍNH CHÁT VÀ Ý NGHĨA CỦA VIỆC ĐIỀU CHÌNH TRAO ĐỐI CHẤT................... 127 16.4. KHƯ TRÚ TRAO ĐỒI CHẤT (Metabolic Channeling)................................................... 128 16.5. ĐIÈU HÒA HOẠT TÍNH ENZYM.................................................................................. 130 16.6. SẢN XƯẤT MỘT SỐ AXIT AMIN NHỜ VI SINH VẬT....................................................137

Chương 17. GIẢI PHÓNG VÀ BẢO TOÀN NĂNG LƯỢNG Ở VI SINH VẬT 17.1. ĐẠI CƯƠNG VÊ TRAO ĐỎI CHÁT.................................................................................154 17.2. Sự PHÂN GIẢI GLUCOZ THÀNH PYRUVAT............................................................... 159 17.3. l Ến m e n ................................................................................................................................. 166 17.4. CHƯ TRÌNH AXIT TRICACBONXYLIC......................................................................... 171 17.5. SỤ' VẬN CHUYẾN ELECTRON VÀ PHOTPHORYL HÓA OXY HÓA........................... 173 718

17.6. HÔHÁP KỴ KHÍ.................................................................................................................... 183 17.7. S ự PHÂN GIẢI CÁC HIDRAT CACBON VÀ CÁC POLYME D ự TRŨ NỘI BÀ O..... 185 17.8. PHÂN GIẢI LIPỈT...................................................................................................................188 17.9. PHÂN GIÂI PROTEIN VÀ AXỈT AMIN.............................................................................. 189 17.10. OXI HÓA CÁC PHÂN TỬ HỮU c ơ ...................................................................................190 17.11. QUANG HỢP........................................................................................................... 194

Chương 18, sử DỤNG NĂNG LƯỢNG TRONG SINH TỎNG HỢP Ở Ví SINH VẬT 18.1. CÁC NGUYÊN TẲC ĐIÊU CHỈNH SINH TỎNG HỢP...................................................... 205 18.2. CỐ ĐINH QUANG HỢP CO: ................................................................................................ 208 18.3. TÓNG HỢP CÁC ĐƯỜNG VÀ POLISACCHARIDE.......................................................... 211 18.4. S ự ĐỎNG HÓA PHOTPHORUS, LUXJ HUỲNH (SULFUA) VÀNITƠ (NITƠ) VÔ C Ò ................. .................................................................... . .....................................213 18.5. TÔNG HỢP CÁC AXIT AM IN ............................................................................................. 222 18.6. CÁC PHẢN ÚNG BỐ SƯNG................................................................................................. 225 18.7. TÔNG HỢP CÁC PURIN, PYRIMIDIN VÀ NUCLEOTIT......................... ;.....................227 18.8. TÔNG HỢPLIPỈT.................................................................................................................. 230 18.9. TỎNG HỌP PEPTỈDOGLYCAN........................................................................................... 233 18.10. CÁC KIÊU TỐNG HỢP THÀNH TÉ BÀO.........................................................................236

Chương 19. MÓI QUAN HỆ GIỮA VIRUT VÀ TẾ BÀO 19.1. NHỮNG KHÁI NIỆM c ơ BẢN............................................................................................ 238 19.2. GIỚI THIỆU TÓM TẮT QUÁ TRÌNH NHÂN LÊN CỬA MỘT SÓ VỈRUT ĐIÊN HÌNH............................. ........................................................... ............ ............ ................... 262 19.3. NUÔI CÁY VIRUT ĐỘNG VẬT........................................................................................... 247 19.4. VIRUT VÀ ƯNG THƯ........................................................................................................... 300 Chương 20. DI TRƯYỂN HỌC VI SINH VẬT 20.1. MỞ ĐÀU................................................................................................................................. 287 20.2. ƯU THẾ CÙA CÁC ĐÓI TƯỢNG VI SINH VẬT................................................................. 314 20.3. CÁC ĐẶC ĐIỀM CỬA DI TRUYỀN HỌC VI SINH VẬT............................................... 316 20.4. CÁC ỬNG DỤNG THỰC T Ê ............... !............................................................................... 319 20.5. BIẾN DỊ Ở VI SINH VẶT...................................................................................................... 327 20.6- DI TRUYỀN HỌC VI KHUẦN................................................................................. ......... 344 20.7. DI TRUYỀN HỌC VIRUT................................................................................................ 377 20.8-DI TRUYỀN HỌC VI NẤM VÀ VI TẢO.......................................................................... 403

Chương 21. VI SÍNH VẬT VÀ MIỄN DỊCH HỌC

21.1. HAI LOẠI MIẼN DỊCH......................................................................................................... 422 21.2. CHÁT SINH MIỄN DỊCH VÀ KHÁNG NGUYÊN.............................................................. 433 21.3. CÁC Cơ QUAN CỬA HỆ MIẺN DỊCH................................................................................ 436 21.4. KHÁNG THÊ.............................................................................................................................. '... !.... 21.5. CÁC TÉ BÀO THAM GIA VÀO ĐÁP ỦNG MIỄN DỊCH.................................................. 447 21.6. KHÁNG NGUYÊN PHÙ HỢP MÔ (MHC)........................................................................... 464 719

21.7. THỤ THẺ TÈ BÀO T ...............................................................................................................466 21.8. MIỄN DỊCH BỆNH LÝ............................................................................................................ 471 21.9. CÁC PHAN ỨNG HUYÊT THANH..................................................................................475

Chương 22. SẢN XUẤT VÀ s ử DỤNG VACXIN 22.1. LỊCH S Ử .......................................................................................:................................ ........477 22.2. VACXIN............................................................................... ........................................... 480 22.3. TIÊU CHUẨN CỦA VACXIN............................................................................................484 22.4. PHÂN LOẠI VACXĨN..................................................................................................... 486 22.5. PHÓI HỢP VACXIN.......................................................................................................... 487 22.6. PHÁT TRIÊN VACXIN................................ .....................................................................488 22.7. TIÊM CHỬNG VÀ NHỮNG s ự CÓ SAU TIỆM CHỦNG.............................................;...499 22.8. TR1ÊN VỌNG CỦA CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VACXIN................................................... :.507

Chương 23. SINH THÁI HỌC VI SINH VẬT 23.1. KHÁI NHIỆM CHUNG............................. ....... ................................................................. 513 23.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u SINH THÁỈ HỌC VI SINH VẬT...................................516 233. QUAN HỆ SINH THÁI HỌC CỦA VI SINH VẶT VỚI CÁC NHÓM VI SINH VẬT..............................................................................:.....................................................522 23.4. TUÂN HOÀN SINH ĐỊA HÓA HỌC CÁC NGUYÊN..!.................................................... 539 23.5. TÁC DỰNG TƯƠNG HÒ CỬA VI SINH VẶT VỚỈ CÁC CHẤT GÂY Ô NHIỄM MÔI TRƯỜNG..........................................................................................................................579

Chương 24. VI SINH VẬT TRONG MÔÍ TRƯỜNG NƯỚC 24.1. MỒI TRƯỜNG NƯÓC........................................................................................................606 24.2. QUẢN XÃ VI SINH VẬT NƯỚC....................................................................................615 24.3. MÔI TRƯỜNG NƯÓC B1ÉN................................................................................... ....... 621 24.5. MÔI TRƯỜNG NƯỚC NGỌT............................................................................................ 627 24.6. XỬ LÝ NƯỚC THẢI........................................................................................................... 641 24.7. NƯỚC NGÀM VÀ HỆ THÔNG x ử LÝ GIA ĐÌNH.......................................................... 650

Chương 25. VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM 25. 1. SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT TRONG THựC PHẨM.......................................... 653 25.2. SINH TRƯỞNG CỬA VỊ SINH VẬT VÀ QUÁ TRÌNH LÀM HỎNG THựC PHÁM....657 25.3. PHÒNG CHÓNG H ư HỎMG THỰC PHẢM (Controlling Food Spoilage)..........................663 25.4. CÁC BỆNH DẪN ĐẾN TỪ THỰC PHẨM (Food-borne Diseazs)......................................668 25.5. PHÁT HIỆN CÁC TÁC NHÂN GÂY BỆNH SINH RA TỪTHựC PHẨM........................673 25.6. VI SINH VẬT HỌC CÁC THỰC PHẨM LÊN MEN............................................................. 676 25.7. VI SINH VẬT LÀ NGUỒN THựC PHẨM VÀ THỤC PHÂM BÒ SUNG........................ 706 MỤC L Ụ C .............................................................................................................................................718

t w*

720