BÀI 1: CHU ẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ THAO TÁC VÔ TRÙNG CÁC THIẾ T BỊ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG 1) Một số dụng cụ và thiế t bị phòng thí nghiệm vi sinh: Các dụng cụ thủy tinh: Ống nghiệm: được sử dụng để chứa môi trườ ng nuôi c ấy vi sinh vật, có nút bông gòn không th ấm nước hay nút b ằng nhựa chịu nhiệt.
Đĩa petri: gồm một nắp lớn và một đáy nhỏ úp lồng vào nhau, đường kính 8cm, 10cm, 12cm…
Ống hút (pipette) Ống hút có chia độ .
Micropipette (Pipetman).
Các dụng cụ bằng thủy tinh khác: Becher.
Bình cầu đáy bằng và đáy tròn.
Bình tam giác (erlen). Các dụng cụ, thiết bị khác:
Dây cấy: Dây cấy thẳng: sử dụng để cấy sâu hay ly trích vi sinh v ật trên môi trường đặ c. Dây cấy vòng: dùng c ấy ria vi sinh v ật trên mặt thạch hay phân lập vi sinh v ật trong môi trườ ng lỏng hoặc môi trường đặ c. Dây cấy thước thợ: dùng để cấy các loại nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn. Nhữ ng ng loại dây cấy này thườ ng ng làm bằng kim loại hkông b ị ôxy hóa ở nhiệt độ cao. Tủ ấm: dùng để ủ vi sinh v ật hoặc theo dõi s ự tăng trưởng của vi sinh vật.
Các dụng cụ bằng thủy tinh khác: Becher.
Bình cầu đáy bằng và đáy tròn.
Bình tam giác (erlen). Các dụng cụ, thiết bị khác:
Dây cấy: Dây cấy thẳng: sử dụng để cấy sâu hay ly trích vi sinh v ật trên môi trường đặ c. Dây cấy vòng: dùng c ấy ria vi sinh v ật trên mặt thạch hay phân lập vi sinh v ật trong môi trườ ng lỏng hoặc môi trường đặ c. Dây cấy thước thợ: dùng để cấy các loại nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn. Nhữ ng ng loại dây cấy này thườ ng ng làm bằng kim loại hkông b ị ôxy hóa ở nhiệt độ cao. Tủ ấm: dùng để ủ vi sinh v ật hoặc theo dõi s ự tăng trưởng của vi sinh vật.
Tủ cấy vô trùng:
Autoclave:
2) Các phương pháp khử trùng dụng cụ: a) Nguyên t ắc: Sau khi khử trùng cần đảm bảo: Sự vô trùng tuy ệt đối cho d ụng cụ và vật phẩm. Không làm thay đổi chất lượng mẫu vật. Bảo đảm an toàn tuy ệt đột cho mẫu vật. b) Các phương pháp khử trùng: Khi khử trùng bằng nhiệt, các t ế bào sinh dưỡng của vi sinh v ật bị tiêu diệt dễ dàng, trong khi các bào t ử vẫn còn t ồn t ại ở ngay nhiệt độ đó. Khả năng chị u nhiệt của vi sinh v ật phụ thuộc vào: Tính chất môi trườ ng. Số lượng t ế bào. Độ pH vật cần khử trùng. Do vậy, để khử trùng bằng nhiệt hiệu quả cần xác định ngưỡ ng nhiệt độ thấp nhất và khoảng thời gian ngắn nhất cần thiết để tiêu diệt toàn bộ vi sinh vật và bào t ử của chúng có trong d ụng cụ cần khử trùng. Có thể khử trùng bằng nhiệt khô hay nhi ệt ướt. Phương pháp nhiệ t khô: Khử trùng bằng t ủ sấy: được thực hiện trong t ủ sấy. Cách tiến hành: Đặt các dụng cụ đã được bao gói vào t ủ sấy. Bật công t ắc t ủ hoạt động.
Điều chỉnh thời gian và nhi ệt độ thích hợp (110oC để trong 2 -3
ngày). Tắt t ủ sấy, để nguội t ới 60oC rồi mở t ủ lấy dụng cụ ra. Tránh mở t ủ lấy dụng cụ khi nhiệt độ t ủ còn cao sẽ làm dụng cụ thủy tinh dễ vỡ. Các dụng cụ sau khi sấy mà gi ấy bao có hơi màu vàng là đạ t yêu cầu. Khử trùng bằng cách đốt que lửa nóng đỏ : Phương pháp này dùng để khử trùng que cấy, ống hút, đầu ống nghiệm, miệng bình tam giác sau khi l ấy nút bông ra. Cách khử trùng: Hơ dụng cụ trên ngọn lửa đèn cồn, đưa qua đưa lại đế n 3 – 4 lần. Với các dây mayxo ở đầu que cấy phải nung cho th ật đỏ hết chiều dài dây c ấy. Đợi dụng cụ nguội mới được sử dụng để tránh vỡ và vi khuẩn không bị tiêu diệt khi lấy giống. Khử trùng bằng sức nóng ướ t.
Đun sôi trong nướ c: Phương pháp này đượ c sử dụng khi cần khử trùng nhanh các dụng cụ: kim tiêm, dao, kéo, k ẹp, cốc… Cách tiến hành: Dùng nước sạch đổ ngập dụng cụ. Đun sôi từ 10’ đến 1h. Đun cách thủy ở nhiệt độ thấp (phương pháp khử trùng Pasteur): Phương pháp này được dùng để khử trùng nhanh các thực phẩm dễ biến tính ở nhiệt độ cao. Cách tiến hành: Đun nóng môi trườ ng lên 65 – 70oC trong 15 – 30’. Phương pháp này chỉ có tác dụng ức chế vi sinh v ật không có bào t ử. Hấp cách quãng 100oC (phương pháp Tyndal): Phương pháp này dùng để khử trùng một số loại môi trường nuôi cấy men bánh mì, men gia súc, m ốc làm nước chấm… Cách khử trùng: Hấp ở 100oC t ừ 30 – 40’. Lấy ra để t ủ ấm 24h để cho bào t ử vi khuẩn phát triển.
Hấp môi trường lần thứ hai ở 100oC trong 30 – 40’ tiêu diệt các bào t ử vừa nảy mầm. Lặp lại quá trình này 3 -4 l ần. Kết quả: môi trườ ng vừa được khử trùng vừa được đảm bảo không thay đổi chất lượng. Khử trùng bằng hơi nướ c bão hòa áp su ất cao (autoclave): Phương pháp này đượ c thực hiện trong nồi hấp vô trùng ở áp suất cao. Đó là thiết bị làm bằng kim loại có tính chịu nhiệt cao có khả năng tự động điều chỉnh nhiệt độ và thời gian. Nguyên t ắc hoạt động: Làm tăng nhiệt để khử trùng các vật bằng hơi nước dướ i áp suất lớn hơn áp suất khí quyển. Khi áp suất tăng làm nhiệt độ tăng nhờ hệ thống van rất chặt chẽ. Cách sử dụng: Chuẩn bị cácdụng cụ chứa môi trườ ng cần khử trùng. Cho 3 lít nướ c cất vào nồi hấp rồi kiểm tra mức nước cho phù hợp. Lần lượt đưa các dụ ng cụ, môi trườ ng cần hấp vào bên trong nồi. Đóng chặt nồi hấp. Điều chỉnh kim đồng hồ thời gian và áp su ất về vị trí mong muốn. Cắm phích điện. Bật công t ắc khử trùng nồi hấp, nồi sẽ báo hiệu bằng còi. Gạt công t ắc khử trùng về vị trí “dry”. Chờ kim chỉ áp suất về “0” mới mở nắp nồi lấy dụng cụ ra. Rút phích điện. Ghi nhãn ngày – tháng – năm vào dụ ng cụ sau khi khử trùng. Chú ý: để đảm bảo an toàn và hi ệu quả của việc khử trùng, người thực hiện cần phải:
Kiểm tra lại nồi hấp trước khi sử dụng. Thực hiện đúng quy trình hướ ng dẫn. Tránh cung cấp điện đột ngột để không gây vỡ dụng cụ, nguyên li ệu hoặc gây nổ nguy hiểm. Trực tiếp theo dõi quá trình khử trùng cho đến khi k ết thúc và ngắt điện.
Định k ỳ kiểm tra chất lượng đồng hồ áp k ế và van an toàn. Tóm lại, phương pháp khử trùng bằng hơi nước bão hòa ở áp suất cao là phương pháp phổ biến và hiệu quả nhất trong các phương pháp khử trùng nhờ khả năng tiêu diệt các t ế bào sinh dưỡng lẫn bào t ử của vi sinh vật. Khử trùng bằng sự lọc: Sử dụng cho môi trườ ng lỏng, trong, có độ nhầy yếu, không chịu được nhiệt độ cao hơn 60oC. Cho môi trường đi qua mộ t màng lọc xốp có đường kính lỗ nhỏ hơn đường kính vi khu ẩn. Khi đó, vi khuẩ n sẽ bị giữ lại trên màng lọc còn dung dịch đi qua sẽ vô trùng. Màng l ọc thường là màng
cellulose. Diệt trùng bằng bức xạ:
Tia t ử ngoại: bức xạ thường dùng nhất là tia UV. Dòng tia UV ti ệt trùng không khí phòng b ệnh viện, phòng vô trùng. Tia UV ch ỉ khử trùng bề mặt mà không thấm sâu vào bên trong m ẫu vật. Tia âm cực: diệt trùng các dụng cụ giải phẫu, thuốc, thực phẩm, tia âm cực có thể tiêu diệt các vật đã cho vào bao gói kín.
PHƯƠNG PHÁP LÀM MÔI TRƯỜNG
Làm môi trường để thực hiện việc phân lập, nhân giống, giữ giống vi sinh vật, đồng thời để nuôi cấy và nghiên c ứu các đặc điểm sinh học của chúng.
1) Nguyên t ắc của việc chế t ạo môi trường: Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và kh ả năng đồng hóa các chất dinh dưỡng của t ừng loại vi sinh v ật. Để đảm bảo về sự cân bằng áp suất thẩm thấu giữa môi trườ ng và t ế bào vi sinh vật nên cần điều chỉnh t ỷ lệ và nồng độ các chất trong thành phần môi trườ ng. Đảm bảo các điều kiện hóa lý c ần thiết cho các hoạt động trao đổ i chất của vinh vật. pH thích hợp. Không có ch ất độc hại.
Vô trùng. Phân loại: Người ta dựa trên các cơ sở khác nhau để phân loại môi trường. Căn cứ theo thành phần và nguồn gốc: gồm 3 loại:
Môi trường t ự nhiên: có thành phần là các sản phẩm t ự nhiên như trứng, sữa, khoai tây, d ịch chiết nấm men, đường, cám. Thành phần hóa học của loại môi trường không được xác đị nh chính xác do sự không ổn định của sản phẩm t ự nhiên. Môi trường t ổng hợp: chứa các chất hóa học mà thành phần của chúng được xác định và định lượ ng một cách cụ thể, chính xác. Môi trường bán t ổng hợp: chứa cả chất hóa học lẫn sản phẩm t ự nhiên.
Căn cứ theo tính chất lý học: gồm 3 loại: Môi trường lỏng: thành phần môi t rường này không ch ứa agar và thường được sủ dụng để nghiên cứu quá trình t ổng hợp của vi sinh vật. Môi trường đặc: môi trườ ng này ch ứ 1,5 – 2% agar hoặc 10 – 20% gelatin. Môi trường này đượ c sử dụng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lí vi sinh v ật. Môi trường bán l ỏng: chỉ chứa 0,3 – 0,7% agar. Căn cứ vào công d ụng: gồm các loại sau: Môi trường cơ bả n: thích hợp cho nhiều loại vi sinh v ật khác nhau. Môi trường chọn lọc: là môi trường đả m bảo cho sự phát triển ưu thế của một loài hay một nhóm loài vi sinh v ật xác định nào đó. 2) Các bước chế t ạo môi trường dinh dưỡ ng:
Môi trườ ng Hasen:
Glucose: 50g.
Pepton: 10g.
K2HPO4: 3g/l.
MgSO4: 3g/l.
Agar: 20g/l (+/-).
Nước cất đủ 1 lít.
pH = 6. Môi trườ ng GPA:
Glucose: 50g.
Agar: 20g/l (+/-).
Dịch chiết khoai tây/ giá đủ 1 lít (500g khoai tây g ọt vỏ/ cắt thỏi/ nấu k ỹ với 1 lít nướ c trong 2 giờ. Lọc/ thêm nước cho vừa đủ 1 lít). Trong bài thự c hành, chúng ta s ử d ụng môi trườ ng GPA.
Pha chế:
Cân, đong thậ t chính xác t ừng thành phần môi trường và pha chế theo đúng trình tự hướng dẫn trong tài li ệu. Môi trường lỏng: cân, đong các chấ t rồi cho hòa tan vào nướ c cất. Môi trường đặ c: Cân agar rùi hòa tan vào nướ c. Đun trên bếp, khuấy đều tay cho đế n khi agar tan h ết vào trong dung dịch dung dịch trở nên trong. Điều chỉnh độ pH của môi trường (nếu cần):
Trong bài, ta sử d ụng môi trườ ng t ự nhiên t ừ nướ c chiế t khoai tây nên không cần điều chỉ nh pH. Muốn điều chỉnh độ pH của môi trường ngườ i ta dùng HCl 10% hay NaCl 10%. Ngòai ra, có thể dùng một số hóa chất khác như: H3PO4, H2SO4, KOH, NaHCO3, Na2CO3… Muốn kiểm tra độ pH của môi trường ta nên dùng máy đo pH (pH – metre). Phương pháp này nhanh nhạy và cho độ chính xác cao. Trong phòng thí nghi ệm, có thể dùng chỉ thị màu xanh bromotomol hay gi ấy quỳ đề đo pH. Phương pháp này tiệ n lợi, nhanh nhưng không độ chính xác cao. Phân phối môi trườ ng vào dụng cụ: Người ta thường phân phối môi trườ ng vào ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác. Trình t ự phân phối gồm các bước sau:
Môi trường cần được đun cho hóa chấ t lỏng rồi đổ vào các dụng cụ. Tay trái giữ dụng cụ chứa môi trườ ng. Tay phải k ẹp nút bông kéo ra. Nhanh tay rót môi trườ ng vào dụng cụ và đậy nút bông lại.
Chú ý: Đố i v ớ i ố ng nghi ệm:
Nếu dùng môi trườ ng làm th ạch nghiêng thì lượng môi trườ ng cần được phân phối chiếm 1/4 thể tích của ống nghiệm.
Nếu làm thạch lỏng thì lượng môi trườ ng cần được phân phối 1/3 thể tích ống nghiệm. Đố i v ớ i bình c ầu hay bình tam giác: lượng môi trường đượ c phân phối chiếm 1/2 đến 1/3 thể tích bình. Các thao tác phân phối phải nhanh, g ọn, khéo léo để môi trường không dính lên mi ệng dụng cụ hoặc nút bông và vi ệc phân phối cần thực hiện xong trước khi môi trườ ng bị đông đặc. Làm thạch nghiêng, đổ thạch và đĩa petri:
Làm thạch nghiêng: cần tiến hành ngay sau khi kh ử trùng môi trườ ng vừa k ết thúc và môi trường chưa đông đặ c. Đổ thạch vào đĩa petri : Toàn bộ quy trình đổ thạch vào đĩa petri đề u thực hiện trong t ủ cấy vô trùng. Chú ý:
Thao tác đổ thạch phải hết sức khẩn trương và khéo léo để hạn chế sự nhiễm khuẩn. Mặt thạch phải phẳng, nhẵn có độ dày khoảng 2mm. Thông thườ ng cứ 1/4 lít môi trường có thể phân phối được 22 – 25 đĩa petri. Khử trùng môi trường: Sau khi phân phối môi trườ ng vào dụng cụ, bao gói c ẩn thận, viết nhãn (tên môi trườ ng; ngày, tháng khử trùng…). Khử trùng bằng autoclave nhi ệt độ 171oC. Trong thời gian 2 – 3 giờ, nếu nhiệt độ thấp hơn thì khử trùng nhiều lần hoặc thời gian nhiều hơn. Bảo quản và kiểm tra môi trườ ng: Môi trường chưa dùng cần đượ c bảo quản ở chỗ mát, hạn chế tác dụng của ánh sáng, nhi ệt độ t ừ 0 – 5oC và không để môi trường bi khô.
Trước khi sử dụng, để kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường, người ta thường đặ t chúng vào t ủ ấm 37oC, trong 2 – 3 ngày. Sau lấy ra quan sát, lo ại bỏ các ống có vi sinh v ật phát triển và chỉ sử dụng những ống nghiệm. những đĩa petri có môi trường đạ t yêu cầu.
BÀI 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP CÂY CHUYỀN VÀ PHÂN L ẬP VI SINH V ẬT PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤ Y VI SINH V ẬT 1) Khái niệm: Quá trình nuôi c ấy vi sinh v ật gồm hai khâu: nuôi và c ấy.
Nuôi: là quá trình đảm bảo và duy trì những điều kiện thuận lợi nhất cho sự họat động và phát triển của vi sinh v ật. Cấy: là những thao tác chuy ển vi sinh v ật t ừ môi trường đang số ng sang môi trường thuận lợi hơn cho sự phát triển của chúng. Hai khâu này gắn bó với nhau trong quá trình nghiên c ứu và ứng dụng vi sinh v ật. 2) Nguyên t ắc: Mọi thao tác nuôi c ấy đều phải thực hiện trong điề u kiện vô trùng để tránh nhiễm khuẩn. Môi trường và d ụng cụ nuôi c ấy phải được khử trùng. Duy trì các điề u kiện thuận lợi để vi sinh v ật phát triển. 3) Phân loại: Cấy giống t ừ môi trường lỏng sang môi trườ ng lỏng. Cấy giống t ừ ống thạch nghiêng sang ống thạch nghiêng. Cấy giống t ừ ống thạch nghiêng sang môi trườ ng lỏng. 4) Các phương pháp cấ y: Cấy giống t ừ ống thạch nghiêng sang môi trườ ng lỏng:
Phương pháp cấ y chuy ển môi trườ ng l ỏng sang môi trườ ng l ỏng
Dán nhãn ghi: tên gi ống vi sinh v ật + ngày c ấy.
Một tay cầm hai ống nghiệm: một ống giống và một ống môi trường. Tay còn lại cầm que cấy và đốt đỏ dây cấy trên ngọn lửa đèn cồn để khử trùng. Dùng ngón út và ngón áp út rút nút bông c ủa ống giống ra.
Hơ nóng khử trùng miệng ống nghiệm. Đợi que cấy nguội, đưa que cấy vào ống nghiệm lấy khuẩn lạc trong ống giống. Rút que cấy ra và ti ến hành cấy chuyển trong ống môi trườ ng. Khử trùng lại phần không khí nơi miệ ng ống nghiệm rồi đậy nút
bông. Khử trùng lại que cấy sau khi s ử dụng.
Cấy giống t ừ ống thạch nghiêng sang ống thạch nghiêng: Phương pháp này để cấy chuyển các vi sinh v ật hiếu khí: Sử dụng que cấy vòng tiến hành các thao tác theo đúng trình tự nêu trên.
đã
Thực hiện việc cấy giống vào ống thạch nghiêng bằng các thao tác tiếp theo: Hòa giống ở đầu que cấy vào giọt nước ở đáy ống nghiệm. Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu: hình ch ữ chi, vòng xo ắn, vạch ngang song song.
M ột số kiể u cấ y trên ố ng thạch nghiêng
5) K ế t quả của việc nuôi cấy: Sau khi nuôi ở thời gian và nhi ệt độ thích hợp cho mỗi loại vi sinh v ật, ta thấy: Trong môi trườ ng lỏng: vi khu ẩn phát triển sẽ làm đục môi trườ ng. Trong môi trường đặ c ở thạch nghiêng: Nấm men, vi khu ẩn phát triển sẽ t ạo thành vệt nổi trên mặt thạch trong hay trắng đục. Nấm mốc sẽ t ạo nên nh ững sợi mảnh t ừ vết cấy.
PHÂN L ẬP GIỐNG VI SINH V ẬT 1) Khái niệm: Phân lập vi sinh v ật là quá trình tách riêng các loài vi sinh v ật t ừ quần thể ban đầu và đưa về dạng thuần khiết. Đây là một khâu có ý nghĩa rấ t quan trọng trong vi ệc nghiên c ứu và ứng dụng vi sinh v ật. Vi sinh v ật ở dạng thuần khiết là gi ống vi sinh v ật được t ạo ra t ừ một t ế bào ban đầu.
Trong thiên nhiên ho ặc trong các vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường t ồn t ại ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau. Mu ốn nghiên cứu về hình thái, sinh lý, lý hóa ho ặc sử dụng vào thực tiễn một loài nào đó thì cầ n phải đưa chúng về dạng thuần khiết. 2) Nguyên t ắc: Tách rời các t ế bào vi sinh v ật
Nuôi cấy các t ế bào trên trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau.
3) Phương pháp phân lậ p vi sinh vật: ỹ thuật hộ p ria (ria bốn góc) để t ạo Trong bài thự c hành, ta sử d ụng k khuẩ n l ạc đơn. Có thể dùng thao tác cấ y tr ải, đổ đĩa. Kỹ thuật hộp ria:
Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng thu gi ống. Ria các đường trên đĩa petri chứa môi trườ ng thích hợp (ria chữ T và tia bốn góc). Sau m ỗi đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy (nhằm loại bỏ các vi sinh v ật còn dư, dính trên que cấ y) và làm nguội trước khi thực hiện đường ria tiếp theo.
Các kiểu ria trên mặt thạch
k ết quả thí nghi ệm: -
Các t ế bào VSV bị tách riêng rẽ,sau thời gian nuôi c ấy t ạo thành các khuẩn lạc trên nền thạch Phương pháp này giúp phân lậ p và t ạo thành dòng thuần,có ý nghĩa đặc biệt trong công vi ệc t ạo giống trong sinh hoc.
BÀI 3: QUAN SÁT VÀ PHÁT HIỆN VI SINH V ẬT B ẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM 1) Nguyên t ắc: Sử dụng thuốc nhuộm có khả năng thẩm thấu qua màng t ế bào và k ết hợp với các thành phần khác nhau c ủa t ế bào t ạo thành những hợp chất màu đặc trưng bền vững. Tùy theo mục đích nghiên cứ u và khả năng bắt màu khác nhau của các thành phần t ế bào mà chọn loại thuốc nhuộm và cách nhu ộm cho phù hợp. Có hai cách nhu ộm chính: Nhuộm đơn: chỉ dùng một loại thuốc nhuộm trên một tiêu bản. Nhuộm kép: dùng đồ ng thời hai hay nhi ều loại thuốc nhuộm trên một tiêu bản. 2) Thao tác thực hành: a) Cách làm tiêu bản cố định: Các đặc điể m c ủa tiêu bản c ố đị nh: Quan sát tiêu bản cố định là một phương pháp phổ biến trong nghiên cứu vi sinh v ật vì nó có nh ững ưu điể m sau: Thao tác tuy phức t ạp nhưng tiêu bả n có màu s ắc đẹp, giữ được lâu. Không sợ lây nhiễm khi làm vi ệc với vi sinh v ật gây b ệnh. Cho phép ta quan sát rõ hình d ạng, cấu t ạo của t ế bào cũng như dễ dàng đếm số lượng t ế bào. Cách làm tiêu bản: Làm vết bôi: Đặt một giọt nước sạch vào giữa phiến kính, sau đó dùng que cấy đã khử trùng lấy một vòng que cấy vi sinh vật cho vào gi ọt nước và dàn đều ra (1 – 2 cm). Trường hợp nuôi cấy trên môi trườ ng lỏng, thì dùng pipet để lấy dung dịch nghiên cứu. Hơ khô phiến kính đã có vi sinh vậ t trên ngọn lửa đèn cồn hoặc để khô t ự nhiên ta được một vết mờ trên phiến kính gọi là vết bôi. Chú ý:
Lượng vi sinh v ật lấy vừa phải.
Vết bôi tròn, g ọn, thật mỏng.
Cố định vết bôi:
Việc cố định vết bôi nhằm các mục đích sau: Giết chết vi sinh v ật để chúng bắt màu và an toàn khi ti ếp xúc (nếu là vi sinh v ật gây bệnh). Gắn chặt vi sinh v ật vào phiến kính để lúc nhuộm không b ị rửa trôi. C ố đị nh bằng nhi ệt: (trong bài ta s ử d ụng cách cố định bằng nhiệt, có thể dùng cách cố định bằng hóa chấ t). Dùng k ẹp gỗ để k ẹp phiến kính, hơ qua lạ i trên ngọn lửa đèn cồ n 2 – 3 lần (chừng vài ba giây), tránh không để tiêu bản quá nóng. b)
Phương pháp nhuộm đơn: Các loại thuốc nhuộm thường dùng để nhuộm đơn:
Fuchsin.
Xanh metylen.
Tím gentian.
Đỏ trung tính. Trong bài sử d ụng xanh metylen hay Fuchsin.
Nhỏ thuốc nhuộm lên tiêu bản đã cố định.
Để yên trong 1’. Rửa nhẹ bằng nước cất t ới khi nào thấy nước rửa chảy qua vết bôi không còn màu nữa (3 lần). Để tiêu bản khô dần. Khi tiêu bản khô hẳn, nhỏ một giọt dầu soi kính, và đem đi quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100.
c)
Phương pháp nhuộm kép: Nguyên t ắc c ủa vi ệc nhuộm kép: Các cấu trúc khác nhau, th ậm chí các phần khác nhau của một cấu trúc thường có tính ch ất hóa học, lý học cũng như khả năng bắt màu khác nhau. Việc sử dụng đồng thời các loại thuốc nhuộm trên cùng một tiêu bản cho phép ta có thể quan sát và phân biệt các cấu trúc dễ dàng hơn.
Phương pháp nhuộm Gram:
Nguyên t ắc:
Dựa trên khả năng bắt màu của t ế bào chất và màng t ế bào với thuốc nhuộm tím tinh thể và iot mà hình thành nên hai lo ại phức chất khác nhau. Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên không bị rữa trôi khi xử lý bằng cồn. Vi sinh v ật có phức chất này thuộc loại Gram dương.
Loại phức chất thứ hai không còn gi ữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lí bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. Vi sinh v ật có loại phức chất này thuộc Gram âm. Cách tiến hành:
Để yên trong 1’. Nhỏ lugol (để yên trong 30”, để giữ màu của tím tinh thể). Rửa sơ bằng nướ c cất. Tẩy cồn (nhúng qua c ồn 3 lần, dung dịch cồn sẽ rửa sạch thuốc nhuộm không gắn k ết, vi khuẩn gram dương g iữ lại màu tím, vi khuẩn gram âm mất màu). Để khô t ự nhiên hoặc sấy. Bổ sung Fuchsin (trong 1’). Rửa sạch bằng nước cất. Đợi tiêu b ản khô, nhỏ một giọt dầu soi kính và đem quan sát dướ i kính hiển vi ở vật kính 100. Quan sát dưới kính hiển vi: Vi khuẩn gram dương: tím. Vi khuẩn gram âm: h ồng.
Sau khi cố định tiêu bản, nhỏ tím tinh thể lên trên phiến kính.
Nhận xét: Phương pháp nhuộm đơn: dùng để khảo sát hình thái và cách sắp xếp của VSV biết được giống VSV o Ưu điểm : dễ thực hiện trong phòng thí nghi ệm, o nhược điể m: không phân bi ệt được t ế bào sống và chết. - phương pháp nhuộm kép:cho ta biết được cấu trúc màng t ế bào của -
VSV
BÀI 4: CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢ NG VI SINH V ẬT 1) Phương pháp định lượ ng trực tiế p: Mật độ vi sinh v ật đơn bào có k ích thướ c lớn như nấ m men, t ảo… có thể xác định bằng cách đếm trực tiếp bằng buồng đếm trên kính hi ển vi. Quy trình đế m trực tiếp cho phép xác đị nh nhanh chóng m ật độ vi sinh vật trong mẫu nhưng phương pháp này có mộ t số nhược điểm là không phân biệt giữa t ế bào sống và t ế bào chết, dễ nhầm lẫn t ế bào vi sinh vật với các hạt vật thể khác trong mẫu, khó đạt độ chính xác cao, không thích h ợp cho huyền phù vi sinh v ật có mật độ thấp. Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu: Cấu t ạo buồng đếm hồng cầu: Buồng đếm thườ ng là một phiến kính dày 2- 3mm có m ột vùng đĩa đếm nằm giữa phiến kính và đượ c bao quanh bởi một rãnh. Đĩa đế m thấp hơn bề mặt của phiến kính khoảng 1/10 m, có hình tròn vì thế khi được phủ lên bằng một lá kính thì độ sâu của đĩa đếm sẽ đồng đều nhau. Vùng đĩa
đếm có diện tích 1mm2 và được chia thành 25 ô vuông l ớn có diện tích mỗi ô là 1/25 mm2 và 400 ô vuông nh ỏ hơn, mỗi ô có di ện tích 1/400 mm2.
C ấ u t ạo buồng đế m hồng cầu
Khi thực hiện quan sát và đế m vi sinh vật, phải pha loãng mẫu cần đếm sao cho mỗi ô lớn của buồng đếm có khoảng 50 – 200 t ế bào vi sinh vật. Để đạt được độ pha loãng như vậ y cần phải ước lượng đượ c số t ế bào vi sinh vật trong mẫu, đồng thời phải thử vài lần trong quá trình pha loãng. Đặt một giọt mẫu được pha loãng vào vùng đếm trên buồng đếm. Chỉnh thị trường sao cho một thị trường chứa trọn một ô lớn. Đếm số t ế bào hiện diện trong một ô lớn. Sau đó, chỉ nh thị trường tìm một ô lớn khác. Đếm số t ế bào của ít nhất năm ô lớ n. Lấy trị số trung bình. Cách tính mật độ t ế bào như sau: Mật độ t ế bào =
(TB/ml).
a: t ổn g số t ế bào trong năm ô l ớn đại diện. H ệ số pha loãng của môi trườ ng bằng ngh ịch đảo nồng độ 10-n. Cách tiến hành:
Dịch mẫu đem đi pha loãng thích hợ p. Hút một ít dịch mẫu nhỏ lên hai rãnh c ủa buồng đếm.
Đậy lamelle.
Đếm dưới kính hiển vi (ở vật kính 10 hay 40).
Chú ý:
Không được đếm bốn cạnh của một ô gây sai s ố rất lớn. Phải vortex kĩ trướ c khi tiến hành pha loãng hoặc đếm do các t ế bào vi sinh v ật có thể bị lắng đọng.
-
k ết quả thí nghiệm:
đếm tượng trưng 5 ô theo hang chéo thu đượ c số VSV 2) Phương pháp định lượ ng gián tiế p: Phương pháp đo độ đục: Là phương pháp gián tiếp xác đị nh mật độ vi sinh vật. Định lượng mật độ t ế bào thông qua đo độ đục bằng máy đo độ quang ở các bước sóng 550 – 610nm. Phương pháp xác định mật độ t ế bào theo độ đục có thể được dùng để so sánh mức độ tăng trưởng của hai hay nhi ều chủng vi sinh v ật trong môi trường lòng. Phương pháp này ch o k ết quả nhanh chóng và thường đượ c ứng dụng trong theo dõi ho ặc nghiên cứu đặc trưng tăng trưở ng của các chủng vi sinh v ật trong phòng thí nghi ệm hoặc trong sản xuất. Tuy nhiên, không thích hợp dùng trong kiểm nghiệm vi sinh v ật. Nguyên t ắc: Khi một pha lỏng có chứa nhiều phần t ử không tan t ạo thành một hệ huyền phù có độ đục bởi các phần t ử hiện diện trong môi trường lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng t ới. Tế bào vi sinh v ật là một thực thể, khi hiện diện trong môi trường cũng làm cho môi t rường đục. Định lượ ng gián ti ếp thông qua độ đục. Dựa vào đườ ng chuẩn. Cách tiến hành: Xây dựng đường chuẩn: Lấy dịch mẫu, pha loãng ở các nồng độ khác nhau Đo độ đục ở bước sóng 610nm. Ghi nhận k ết quả. Đếm trực tiếp bằng buồng đếm. Dựng đườ ng chuẩn mật độ t ế bào theo độ quang.
Để tiến hành đo mẫu: ta làm tương tự như trên, pha loãng dị ch mẫu sao cho OD l ọt vào đường chuẩn rồi t ừ đó suy ra được mật độ t ế bào. Kết quả thí nghiệm: Mẫu ban đầu: OD = 1,94. Tiến hành pha loãng:
M ẫu
1 2 3 4 5
M ẫu
OD 0,62 1,00 1,12 1,44 1,55
Đếm trực tiếp bằng buồng đếm: OD 0,62 1,00 1,12 1,44 1,55
1 2 3 4 5
Pha loãng 10 lần 5 lần 3 lần 2,5 lần 2 lần
S ố t ế bào vi sinh v ật 208 495 573 1293 1501
Dựng đường chuẩn:
Log (t ế bào vi sinh v ật) 2,318 2,695 2,758 3,112 3,176
) B T ( g o L
3.5 3 2.5
y = 0.9368x + 1.7382 R² = 0.9958
2 1.5 1 0.5 0 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8 OD
Đồ th ị Log(t ế bào vi sinh v ật) theo độ đục OD
Nhận xét:
Phương pháp này cho kế t quả nhanh chóng, chính xác. Tuy nhiên, cần quan tâm đế n một số thao tác có thể gây sai số cho phương pháp: Thao tác pha loãng mẫu (thao tác chậm, pha loãng không chính xác, vortex không kĩ… ). Thao tác đo độ đục (thao tác cầm cuvette, thao tác chậm làm t ế bào vi sinh v ật bị lắng, vortex không kĩ…). Sai số do máy đo. Sai số khi đếm trực tiếp trên buồng đếm.
Phương pháp đếm số khuẩn lạc:
Nguyên t ắc: Một t ế bào có thể phân chia theo cấp số nhân cho đến khi hình thành khuẩn lạc có thể trông thấy được. Đây là cơ sở của việc định lượ ng t ế bào trên thạch đĩa, bởi vì số lượng khuẩn lạc sinh ra t ừ một thể tích giống vi sinh vật nhất định chỉ số lượng t ế bào sống trong thể tích giống đó. Thông thường t ất cả t ế bào ở pha tăng trưởng hay giai đoạ n sớm của phage ổn định đều có khả năng hình thành khuẩ n lạc. Vì vậy, số lượng khuẩn lạc đếm được gần như tương đương với số lượng t ế bào sống. Cách tiến hành:
Dịch mẫu pha loãng theo n ồng độ thích hợp. Trình t ự pha loãng
như sau:
Nhỏ vào đĩa petri đã chuẩ n bị môi trường thạch đĩa (0,1 – 1ml dung dịch mẫu). Trải đền bằng que trải (để khô trước khi đem ủ ).
Ủ mẩu (2 – 3 ngày). Đếm số khuẩn lạc mọc trên mặt thạch.
Công thức tính số t ế bào: Số t ế bào sống = X . k . 10 -n X: số khuẩ n l ạc trên đĩa petri. K = 1/m : (m là s ố ml dung d ịch đổ trên đĩa petri 0,1 – 1ml). H ệ số pha loãng bằng ngh ịch đảo nồng độ 10-n.
Tỉ lệ t ế bào sống: (% t ế bào sống) = (t ế bào sống/t ế bào) . 100%.
Nhận xét: Ưu điểm:
Cho phép xác định t ế bào sống. Định lượ ng chọn lọc vi sinh v ật. Có thể nhận dạng được khuẩn lạc đặc trưng. Nhược điểm: Mất nhiều thời gian. Không xác định được t ế bào yếm khí hoặc hiếu yếm khí. Mất một lượng t ế bào dính trên que trải. Dễ bị nhiễm khuẩn, gây k ết quả không chính xác. Khuẩn lạc mọc cạnh tranh hoặc trong môi trường gây khó đế m.
