CONTENIDO
1.
CONCEPTO Y DESARROLLO HISTÓRICO DE LA CROMATOGRAFÍA. CROM ATOGRAFÍA. ............................ ........................................ ....................... ............... .... 3
DESARROLLO HISTÓRICO. ........................... ......................................... ............................ ............................ ............................ ............................ ............................ ............................ ....................... ......... 3
2.
CONCEPTO DE FASE ESTACIONARIA Y MÓVIL. ......................... .................................... ...................... ...................... ....................... ....................... ............... .... 6
3.
CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS. ..................... ................................ ...................... ...................... ...................... .............. ... 6
CROMATOGRAFÍA DE GASES. ........................... ......................................... ............................ ............................ ............................ ............................ ............................ ............................ .................. .... 8
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS. ........................... ......................................... ............................ ............................. ............................. ............................ ............................ ......................... ........... 11
4.
MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS EN BASE AL FENÓMENO DE SEPARACIÓN. ..................... ................................ ................. ...... 14
UNIDAD IV METODOS CROMATOGRÁFICOS 1. CONCEPTO Y DESARROLLO HISTÓRICO DE LA CROMATOGRAFÍA. Desarrollo histórico.
La cromatografía es un poderoso método de separación que tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia. La cromatografía en columna fue denominada así, a principios del siglo XX por el botánico ruso Mikhail Tswett. Él empleó la técnica para separar varios pigmentos vegetales, tales como clorofilas y xantofilas, haciendo pasar disoluciones de estos compuestos a través de una columna de vidrio rellena con carbonato de calcio finamente dividido. Las especies separadas aparecían como bandas coloreadas en la columna lo que justifica el nombre que eligió para el método (del griego chroma que significa color y graphein que significa escribir). Las aplicaciones de la cromatografía han aumentado en gran manera en los últimos cincuenta años, debido, no sólo al desarrollo de nuevos y diversos tipos de técnicas cromatográficas, sino también a las necesidades crecientes, por parte de los científicos, de mejores métodos para la caracterización de mezclas complejas. El tremendo impacto de esto en la ciencia se confirmó al otorgarse el Premio Nobel de 1952 a A.J.P. Martin y R.L.M. Synge por sus descubrimientos en este campo. Más impresionante es, quizás, la lista de doce Premios Nobel concedidos entre 1937 y 1972, los cuales se basaron en trabajos en los que la cromatografía tenía un papel vital. Por este motivo, la cromatografía es un método muy utilizado y que permite la separación, identificación y determinación de los componentes químicos en mezclas complejas. Ningún otro método de separación es tan potente y de aplicación tan general como la cromatografía. Concepto.
Es difícil definir rigurosamente el término cromatografía, ya que se ha aplicado ese nombre a varios sistemas o técnicas. Sin embargo todos estos métodos tienen en común el uso de la fase estacionaria y una fase móvil, y las fases se basan en las diferencias de velocidad de migración entre los distintos componentes de la mezcla. “La cromatografía es una técnica en la cual los componentes de una mezcla se separan a
partir de las diferencias de velocidad a las que son transportados a través de una fase fija o estacionaria por una fase móvil gaseosa o líquida.”
Cromatograma y su interpretación.
Un cromatograma es un grafico que representa la respuesta del detector en función del tiempo. Muestra lo que podrá observarse cuando una mezcla y un componente desconocido se separan por cromatografía de gases. Los siguientes términos son los utilizados en un cromatograma típico y recomendados por la IUPAC:
Line Base Pico Cromatográfico Base del Pico Área del Pico Altura del Pico Ancho del Pico Ancho del Pico a la mitad de la Altura
Cromatograma
Altura del Pico. Medida que se efectúa, para cada pico de interés, desde la línea base hasta el máximo del pico.
Los errores de malas mediciones se pueden atribuir a: Insuficiente Resolución. Variaciones en la línea base. Picos extremadamente pequeños.
Las desviaciones en la línea base se pueden compensar por interpolación de ésta entre el principio y el final del pico. Área del Pico.
Existen varias técnicas para la determinación del Área de un Pico Cromatográfico Integración Manual
Métodos Geométricos Triangulación. En esta técnica se trazan líneas tangentes a cada lado del pico. La altura se mide desde la línea base hasta la intersección de las dos tangentes. El ancho se mide tomando la intersección de las dos líneas tangentes con la línea base. Luego se utiliza la fórmula A=1/2*Altura del Pico* Base del Pico. Las limitaciones de esta técnica están en el trazado de las líneas tangentes, un pequeño error al trazar las tangentes puede afectar la medida de la altura. Altura por ancho a la mitad de la Altura.
Métodos Mecánicos Planimétricos Corte y Pesada: Esta técnica requiere recortar el pico del cromatograma, luego pesarlo en una balanza analítica. El recorte y pesada depende mucho de la habilidad del operador. Pueden introducirse errores por cambios en la humedad del papel, la grasa de las manos del operador, homogeneidad del papel. Generalmente se recomienda utilizar una fotocopia del cromatograma para no destruir el original.
Integración Automática Electromecánica Electrónica
2. CONCEPTO DE FASE ESTACIONARIA Y MÓVIL. Una fase fija o estacionaria se refiere a que esta se encuentra posicionada en un lugar, ya sea una columna o en una superficie plana, mientras que la fase móvil se mueve sobre la fase estacionaria (ya que es inmiscible con esta) o a través de ella arrastrando consigo la mezcla de analitos. Esta fase puede ser un gas, un líquido o un fluido supercrítico. Las dos fases se eligen de tal forma, que los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueve lentamente con el flujo de la fase móvil: por el contrario, los componentes que se unen débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa o cuantitativamente (fig.1).
Fig. 1. Se observa la fase móvil y la estacionaria.
3. CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS. Los métodos cromatográficos se pueden clasificar de dos modos distintos. El primero de ellos se basa en la forma en que la base estacionaria y móvil se ponen en contacto.
Cromatografía en columna. Consiste en columnas huecas de longitud y diámetro variable en cuyo interior encontramos la fase estacionaria. La fase móvil se hace pasar por ellas ya sea por gravedad o por aplicación de presión.
Cromatografía plana. La fase estacionaria se encuentra sujeta por una placa plana o en papel y la fase móvil se desplaza por ella mediante capilaridad o influenciada por la gravedad. Esta a su vez se divide en : Cromatografía en papel. En la que el papel actúa como soporte de la fase estacionaria (cromatografía de partición). Cromatografía en capa fina. En la que un sólido actúa como fase estacionaria (cromatografía de partición), se extiende en una capa delgada sobre una placa, generalmente de vidrio.
Una clasificación más fundamental de los métodos cromatográficos se basa en el tipo de fase móvil y estacionaria, y en la clase de equilibrios implicados en la transferencia de los solutos entre las fases. Estos son:
Cromatografía de gases. Gas –liquido. Gas –solido. Cromatografía de líquidos. Liquido-liquido. Liquido- sólido. Intercambio iónico. Exclusión molecular. Cromatografía de fluidos supercríticos. Cualquier sustancia que se encuentre en condiciones de presión y temperatura superiores a su punto crítico.
La siguiente tabla establece una relación de las tres clases generales de cromatografía.
Tabla. Clasificación de los métodos cromatográficos en columna.
Es digno de mencionarse que solamente la cromatografía de líquidos puede llevarse a cabo en columnas o sobre superficies planas; por otra parte, tanto la cromatografía de gases como de fluidos supercríticos están restringidas a los procedimientos en columna, de tal manera que las paredes de la columna contienen la fase móvil. Cromatografía de gases.
La cromatografía de gases es una técnica cromatográfica que se emplea para separar compuestos orgánicos volátiles, siendo el método más rápido y sencillo para la identificación de los constituyentes de una mezcla. Implica el uso de una columna cromatográfica especial en cuyo inicio se inyecta la muestra vaporizada que se transporta a lo largo de la columna impulsada por una fase móvil gaseosa inerte. Los componentes de
Representación esquemática de un cromatógrafo de gases
dicha muestra se separan debido a las diferencias en su perfil de partición entre la fase móvil gaseosa y la fase estacionaria. Tipos de cromatografía de gases.
Dependiendo del estado de la fase estacionaria, podemos distinguir:
Cromatografía gas-liquido. La fase estacionaria es un líquido no volátil inmovilizado sobre la superficie de un soporte sólido inerte. La velocidad de migración de un analito está determinada por su distribución entre la fase liquida inmovilizada y la fase gaseosa. La temperatura, la volatilidad del analito y su solubilidad en la fase en la fase estacionaria son los factores que regulan su retención. Cromatografía gas – sólido. Se basa en la adsorción de sustancias gaseosas sobre superficies sólidas. Los coeficientes de distribución son generalmente mucho mayores que en el caso de la cromatografía gas – líquido. Debido a esto, la cromatografía gas – sólido es útil para la separación de especies que no se retienen en la anterior, tales como los componentes del aire, Sulfuro de hidrógeno, Disulfuro de carbono, Óxidos de Nitrógeno, Monóxido de Carbono, Dióxido de carbono y gases nobles.
Equipamiento
Todos los elementos necesarios para realizar la cromatografía de gases están integrados en un dispositivo llamado cromatógrafo de gases, que consta de:
Suministrador de fase móvil gaseosa. El gas portador se mezclará con la muestra vaporizada impulsándola por el interior de la columna cromatográfica. Los gases más empleados son: nitrógeno, helio, argón y dióxido de carbono. Puerto de inyección. Inyector. Dispositivo que permite la introducción de la muestra vaporizada en la corriente de gas portador. El método más común de inyección implica el uso de una microjeringilla que inyecta la muestra líquida o gaseosa a través de un septo de goma de silicona en una cámara de vaporización instantánea situada en la cabeza de la columna. Al inyectar con microjeringillas el sistema debe asegurar, que la muestra se vaporice en la cabeza de la columna sin distorsión del gas portador y que la muestra ocupe la mínima longitud posible de la columna. Esta cámara normalmente está a unos 50 ºC por encima del punto de ebullición del componente menos volátil de la muestra para asegurar la vaporización total de la muestra. Columna cromatográfica. Tanto el material de construcción de las columnas cromatográficas como su longitud varían, pudiendo ser de acero inoxidable, vidrio, sílice fundida o teflón y abarcando una altura de 2-60 m. A la hora de seleccionar el tipo de columna se deben tener en cuenta varios parámetros como son el diámetro interno de la columna, el espesor de la fase estacionaria, el tipo de muestra, el tipo de fase estacionaria y la longitud de la columna. La
temperatura óptima de la columna depende del punto de ebullición de la muestra y del grado de separación requerido.
Horno. Dispositivo de regulación de la temperatura en cuyo interior se dispone la columna. La temperatura óptima de la columna depende del punto de ebullición de la muestra y del grado de separación requerido. Detector. Dispositivo situado a la salida de la columna que permite medir de una manera continúa una propiedad física del gas portador, que se modifica ampliamente con la presencia de muy pequeñas concentraciones de la sustancia a analizar. Su función básica es producir respuestas muy rápidas a pequeñas concentraciones de soluto.
Características ideales de un detector en cromatografía de gases son: 1. Sensibilidad adecuada. En general, las sensibilidades de los detectores actuales se encuentran en el intervalo de 10−8 a 10−15 g de analito/s. 2. Una respuesta lineal para los analitos que se extienda a varios órdenes de magnitud. 3. Buena estabilidad y reproducibilidad. 4. Un intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente hasta al menos 400 °C. 5. Un tiempo de respuesta corto que lo haga independiente del caudal. 6. Alta fiabilidad y fácil manejo. 7. Respuesta semejante para todos los analitos, o por el contrario, una respuesta selectiva y altamente predecible para una o más clases de analitos. 8. No ser destructivo de la muestra. Los más comunes en CG comercial son:
Detectores de conductividad térmica (TCD). Es totalmente universal y muy sencillo, aunque no es muy sensible. Se emplea básicamente en el análisis de gases. Su baja sensibilidad impide usarlo con columnas capilares. Los gases que salen de la columna entran en un compartimiento en el que se encuentra un filamento caliente, cuya temperatura depende de la capacidad del gas que le rodea en disipar calor, esto es, su conductividad térmica. En el momento en que se eluye de la columna un compuesto con diferente conductividad térmica un compuesto con diferente conductividad térmica que el gas portador, la temperatura del filamento varía, y por tanto su resistencia eléctrica, que es registrado en forma de aumento o disminución de la corriente.
Detectores de ionización de llama (FID).
Es el más usado, debido a que es
prácticamente universal para los compuestos orgánicos, donde es bastante sensible y tiene un comportamiento excelente. Los gases que efluyen de la columna son introducidos en una llama formada por H 2 y aire cuya conductividad eléctrica está
permanentemente registrada. En el momento es que un compuesto de carbono se eluye de la columna, se quema y durante la reacción de combustión se generan electrones y otras especies cargadas que alteran la conductividad eléctrica de la llama. Detector de nitrógeno-fósforo. Consiste básicamente en un detector de ionización de llama que porta un alambre de platino recubierto de NaOH o silicato de rubidio, los más modernos, que incrementa la volatilidad de compuestos que contienen nitrógeno, fósforo, halógenos, sulfuro, arsénico, estaño y plomo, produciendo un incremento en la corriente de ionización y con ello un aumento de respuesta de los componentes de la muestra que contienen esos elementos.
Aplicaciones en la cromatografía de gases.
La cromatografía de gases se puede aplicar a gases y a cualquier compuesto que pueda ser volatilizado o convertido en un derivado volátil. Se utiliza ampliamente en el análisis de distintos tipos de muestras en laboratorios:
Medioambientales: para el análisis de de los numerosos contaminantes orgánicos del aire, el agua corriente y las aguas residuales. Clínicos, farmacéuticos, bioquímicos y forenses: para anali zar fármacos. Alimentarios: para analizar muchos sabores y especias. Petroquímicos: para el análisis de los derivados del petróleo tales como gasolina, gasoil y aceites.
Cromatografía de líquidos.
Dentro de los tipos de cromatografía que se han desarrollado, y englobada dentro de las cromatografías cuya fase móvil está constituida por un líquido, destaca la Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC, High Perfomance Liquid Chromatography), también denominada de Alta presión. Esta técnica de separación y análisis consiste en hacer pasar una muestra líquida o sólida disuelta en un disolvente adecuado junto con una fase líquida móvil por una columna cromatográfica. Esa columna se caracteriza por encontrarse muy empaquetada, por lo que es necesario ejercer elevadas presiones para que el proceso no se alargue excesivamente en el tiempo.
La separación de los componentes de la mezcla se efectúa gracias a interacciones de éstos con la fase móvil y estacionaria. Dependiendo del tipo de columna y de la interacción de los solutos con la fase estacionaria podemos distinguir:
Cromatografía de adsorción líquido-sólido. Cromatografía de reparto líquido-líquido. Cromatografía de intercambio iónico. Cromatografía de exclusión molecular.
Equipamiento.
El disolvente elegido ha de ser compatible con la muestra a analizar y ofrecer unas buenas características de separación, para ello pueden utilizarse eluciones isocráticas, un solo disolvente o una mezcla fija de ellos, o variar su composición a lo largo del proceso en las llamadas eluciones con gradiente. En ambos casos se necesitan depósitos adecuados para albergar los disolventes. Generalmente, estos reservorios se encuentran asociados a una serie filtros y mecanismos de eliminación de gases que excluyen posibles partículas y gases que pueden afectar al proceso cromatográfico obstruyendo la columna y/o alterando los registros. Estos reservorios van a parar a una cámara de mezcla de disolventes y un sistema de bombeo capaz de generar elevadas presiones. Esta bomba se caracteriza por trabajar con amplios rangos de flujo, proporcionar una velocidad de flujo adecuada y reproducible, amortiguar los pulsos de presión y ser resistentes a la corrosión y químicamente inertes. El sistema de bombeo más utilizado es el de pistón recíproco o vaivén, que consiste en una pequeña cámara cilíndrica que se llena del disolvente y se vacía por oscilación de un pistón. La asociación de una nueva bomba de pistón que opera desfasada con la primera evita en gran medida las pulsaciones. Aún así, muchos de los equipos llevan asociados atenuadores de pulsos. Los disolventes impulsados por la bomba han de ser introducidos a la columna cromatográfica gracias a un sistema de inyección. Anticipando a ésta, encontramos la llamada precoluma o guardacolumna, columna de menor longitud pero con las mismas características que la columna (mismo material empaquetado y misma fase estacionaria) que tiene como objetivo protegerla de la contaminación y alargar su vida media. Las columnas suelen estar fabricadas en acero inoxidable. Poseen una longitud de 3-30 cm, un diámetro interno de –10 mm y partículas empaquetadas de 5- 10μm lo que les confieren un número de platos de 40.000-60.000 por metro. Estas columnas pueden
adoptar tamaños menores, junto con su material empaquetado, en las llamadas microcolumnas, de mayor eficiencia. La fase estacionaria en HPLC presente en la columna se ha caracterizar por ser estable y resistente a altas presiones. Generalmente estos rellenos suelen ser inorgánicos como partículas de sílice, alúmina (óxido de aluminio, Al2O3) o vidrio. En el caso de cromatografía líquido-líquido la fase estacionaria es una película líquida que reviste el material empaquetado. En la salida de la columna podemos encontrar un dispositivo de detección que nos identificará los solutos presentes en la fase móvil. Han de ser sensibles a pequeñas variaciones, deben tener un mínimo ruido y deriva, rápida respuesta en un amplio rango lineal y ser insensibles a cambios de flujo y temperatura. Dependiendo de la naturaleza de la muestra el dispositivo de detección elegido variará. Los detectores empleados comúnmente son aquellos que miden la absorción de radiación UV/visible o bien los detectores electroquímicos (amperométrico, conductimétrico o potenciométrico). Otros detectores usados pueden ser aquellos que registran el índice de refracción o fluorescencia pero encuentran mayores problemas ya que pueden ser menos precisos y el soluto analizado puede no presentar las características más adecuadas para su detección.
Representación esquemática de un cromatógrafo de líquidos.
Actualmente, el más utilizado es el espectrómetro de masas que presenta unos límites de detección buenos y nos proporciona información tanto cuantitativa como cualitativa que permite identificar fácilmente al analito. El principal problema que encuentra el acoplamiento de la espectrometría de masas a la cromatografía líquida es la incompatibilidad de la fase móvil líquida con las condiciones de alto vacío de espectrómetro, que no permite recibir los grandes volúmenes de disolvente que acompañan al analito. El uso de columnas de menor diámetro y menor caudal, junto a los últimos avances en espectrometría de masas, han permitido generalizar el uso de este tipo de detectores.
4. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS EN BASE AL FENÓMENO DE SEPARACIÓN. Estas son a partir del mecanismo de interacción del soluto con la fase estacionaria.
Cromatografía de adsorción. Es aquella que presenta como fase estacionaria un adsorbente sólido, ya sea sílice o alúmina, donde el analito compite con la fase móvil por los sitios de la superficie y su retención se debe a las fuerzas de adsorción. La única variable que altera el coeficiente de partición de los analitos es la composición de la fase móvil. Este tipo de cromatografía se usa para separa compuestos orgánicos insolubles y relativamente no polares con pesos moleculares de menor de 5000 D. No ofrece ninguna ventaja especial sobre la cromatografía líquido-líquido a excepción del análisis de isómeros. Se usa para separar esteroides, diversos fármacos, aceites naturales, pigmentos vegetales, vitaminas hidrosolubles, etc. Cromatografía de intercambio iónico. Consiste en hacer pasar una fase móvil liquida sobre una fase estacionaria que presenta grupos iónicos en su superficie de modo que los iones de signo opuesto quedaran retenidos por fuerzas electroestáticas. Cromatografía de exclusión molecular. La separación de los solutos en esta técnica se basa en la capacidad del analito de penetrar en los poros de la matriz de la columna, de modo que si la molécula es de un tamaño mayor al poro no experimentan retención y viajan a la velocidad de la fase móvil, mientras que las que sean menores al límite de inclusión de la columna entrarán en la matriz y su tiempo de retención será mayor. El material utilizado para esos empaques son partículas de sílice o una red de polímeros que generen poros uniformes de tamaños que van desde 50-4.000 y 50-1.000.000 Å, respectivamente. Cromatografía de afinidad. Emplea interacciones específicas entre una clase de moléculas de soluto y una segunda molécula unida covalentemente a la fase estacionaria.
Cromatografía de reparto o partición. Esta técnica se basa en el reparto de los solutos o analitos sobre fases móvil y estacionaria líquidas, inmiscibles entre sí. La separación selectiva de éstos se debe al diferente grado de solubilidad en las diferentes fases. El equilibrio de repartición entre ambas viene expresado en términos de una constante llamada coeficiente de reparto (K), cuyo valor depende de, para una fase estacionaria fija, generalmente sílice, y una fase móvil determinada, de la naturaleza del analito, lo que origina diferencias en la retención. La temperatura ha de ser controlada durante el proceso ya que puede alterar la solubilidad del analito, y por tanto alterar el coeficiente de reparto. Cromatografía de exclusión (o de geles). El sólido es un gel formado por polímeros no iónicos porosos que retienen a las moléculas de soluto según su tamaño.
Comparación de HPLC y CG.
Eficaz, muy selectivo y ampliamente aplicable Uso de muestras pequeñas Método no destructivo Adaptación al análisis cuantitativo
Ventajas de la técnica HPLC.
Separación de muestras no volátiles y térmicamente inestables Aplicación a iones inorgánicos.
Ventajas de la técnica CG.
Rápida Alta resolución Acoplamiento fácil con espectrometría de masas
Bibliografía. Skoog,West, Holler, Crounch. Principios de Análisis Instrumental. 5° edición. Mc-GrawHill. 2001. México. Pag. 741-742, 762, 789, 833. http://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Gas.htm http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/manchi//alim/TRABAJOS0809/trabajo4.pdf www.itescam.edu.mx/principal/sylabus/fpdb/.../r23185.DOC
