Tổng Hợp Và Thử Tác Dụng Sinh Học Của Một Số Acid Hydroxamic Mang Khung 5-Aryl-1,3,4-Thiadiazol Hướng Ức Chế Histon Deacetylase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ BÍCH LAN

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 5-ARYL-1,3,4-THIADIAZOL HƢỚNG ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ BÍCH LAN

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 5-ARYL-1,3,4-THIADIAZOL HƢỚNG ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ DƢỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 60720402 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

TS. Đào Thị Kim Oanh PGS.TS. Nguyễn Hải Nam

HÀ NỘI 2014

LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn tận tình và nhiều giúp đỡ quý báu của các thày cô, đồng nghiệp, gia đình và bạn bè. Từ tận đáy lòng mình, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự biết ơn sâu sắc tới TS. Đào Thị Kim Oanh và PGS.TS. Nguyễn Hải Nam, những ngƣời thày đã chỉ dẫn tôi tận tình và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em làm việc và thực hiện đề tài tại bộ môn Hóa dƣợc, đặc biệt các em Đỗ Thị Mai Dung và Lƣơng Xuân Huy, đã ủng hộ và giúp đỡ tôi rất nhiệt tình trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi cũng nhận đƣợc sự phối hợp và giúp đỡ từ các cán bộ làm việc tại Khoa Hóa – trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội, Viện Hóa học các hợp chất tự nhiên, Viện hóa học Việt Nam, Viện Khoa học và Công Nghệ Việt Nam, cùng toàn thể các thày cô trong các phòng, ban, thƣ viện. Tôi xin chân thành cảm ơn. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bè bạn – những ngƣời luôn sát cánh, động viên và khích lệ tôi trong cuộc sống và học tập. Hà Nội, ngày 30 tháng 08 năm 2014 Học viên

Trần Thị Bích Lan

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ......................................................................................................... 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN ....................................................................................... 2 1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC) .......................................................... 2 1.1.1. Khái niệm, phân loại ............................................................................. 2 1.1.2. Cấu trúc của HDAC .............................................................................. 3 1.1.3. Mối liên quan giữa ung thƣ và sự bất thƣờng hoạt động của HDAC ... 3 1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC ..................................................................... 4 1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC (HDIs) ............................................. 4 1.2.2. Cơ chế tác dụng .................................................................................... 6 1.2.3. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC .................................................... 6 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VỀ CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC ..................................................................... 7 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở TRONG NƢỚC VỀ CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC ............................................................................................................... 15 Chƣơng 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................... 19 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ............................................................................... 19 2.1.2. Hóa chất chính .................................................................................... 19 2.1.2. Các hóa chất và dung môi khác .......................................................... 19 2.2. THIẾT BỊ ................................................................................................... 19 2.3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 20 2.3.1. Nội dung nghiên cứu........................................................................... 20 2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................... 21

Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ....................................................... 26 3.1. NGHIÊN CỨU DOCKING ....................................................................... 26 3.2. TỔNG HỢP HÓA HỌC ............................................................................ 27 3.2.1. Tổng hợp chất N1-[5-(furan-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8hydroxyoctandiamid (Va) ............................................................................. 27 3.2.2. Tổng hợp chất N1-[5-(5-bromofuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8hydroxyoctandiamid (Vb)............................................................................. 31 3.2.3. Tổng hợp chất N1-hydroxy-N8-[5-(5-methylfuran-2-yl)-1,3,4thiadiazol-2-yl]octandiamid (Vc) ................................................................. 33 3.2.4.... Tổng hợp chất N1-hydroxy-N8-[5-(thiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2yl]octandiamid (Vd) ..................................................................................... 34 3.2.5. Tổng hợp chất N1-[5-(5-bromothiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]N8-hydroxyoctandiamid (Ve) ....................................................................... 36 3.2.6. Tổng hợp chất N1-hydroxy-N8-[5-(5-methylthiophen-2-yl)-1,3,4thiadiazol-2-yl]octandiamid (Vf) .................................................................. 37 3.2.7. Tổng hợp chất N1-hydroxy-N8-[5-(pyridin-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2yl]octandiamid (Vg) ...................................................................................... 39 3.2.8. Tổng hợp chất N1-hydroxy-N8-[5-(pyridin-3-yl)-1,3,4-thiadiazol-2yl]octandiamid (Vh) ..................................................................................... 40 3.2.9. Tổng hợp chất N1-hydroxy-N8-[5-(pyridin-4-yl)-1,3,4-thiadiazol-2yl]octandiamid (Vi)....................................................................................... 42 3.2. KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT .................................................................. 43 3.3. KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC ..................................................................... 44 3.3.1. Phổ hồng ngoại (IR) ............................................................................ 44 3.3.2. Phổ khối lƣợng (MS) .......................................................................... 46 3.3.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) ........................... 46 3.5. HOẠT TÍNH SINH HỌC .......................................................................... 50 3.5.1. Tác dụng ức chế HDAC ...................................................................... 50 3.5.2. Hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro .............................................. 51 Chƣơng 4. BÀN LUẬN ........................................................................................ 52

4.1. TỔNG HỢP HÓA HỌC ............................................................................ 52 4.2. KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC ..................................................................... 53 4.2.1. Phổ hồng ngoại (IR) ............................................................................ 53 4.2.2. Phổ khối (MS) ..................................................................................... 54 4.2.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) ........................... 55 4.3. HOẠT TÍNH SINH HỌC .......................................................................... 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................... 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AsPC-1: Tế bào ung thƣ tụy ngƣời 13 1

C - NMR: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C

H - NMR: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H

dd: Dung dịch HAT: histon acetyltranferase HDAC: Histon deacetylase H460: Tế bào ung thƣ phổi ngƣời HDI, HDIs: Histon deacetylase Inhibitor(s) IR: Phổ hồng ngoại MCF-7: Tế bào ung thƣ vú ngƣời MS: Phổ khối lƣợng MTT: (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid) NCI-H460: Tế bào ung thƣ phổi ngƣời NST: Nhiễm sắc thể PC-3: Tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến ngƣời Rt: khuấy đều SAHA: Acid suberoylanilid SKLM: Sắc ký lớp mỏng SW620: Tế bào ung thƣ đại tràng ngƣời TSA: Trichostatin A

DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng

STT 1

Bảng 1.1:

Các chất ức chế HDAC đang thử nghiệm trên lâm sàng

2

Bảng 1.2:

Tác dụng kháng các tế bào ung thƣ in vitro của N25 (IC50±SD [µM])

3

Bảng 1.3:

Hoạt tính ức chế HDAC các tuýp và tác dụng kháng tế bào ung thƣ in vitro của các dẫn chất amido-lactam ở vị trí 7 của khung SAHA

4

Bảng 1.4:

Các acid hydroxamic mang khung 5-phenyl-1,3,4thiadiazol-2-yl và độc tính trên một số dòng tế bào

5

Bảng 3.1:

Kết quả docking của các chất Va-i với HDAC8

6

Bảng 3.2:

Giá trị Rf và T0nc của các chất Va-i

7

Bảng 3.3:

Số liệu phân tích phổ IR của Va-i

8

Bảng 3.4:

Số liệu phân tích phổ khối lƣợng của các chất

9

Bảng 3.5:

Số liệu phân tích phổ 1H-NMR

10

Bảng 3.6:

Số liệu phân tích phổ 13C-NMR

11

Bảng 3.7:

Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp

12

Bảng 4.1:

Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ ngƣời in vitro

13

Bảng 4.2:

So sánh tác dụng kháng tế bào ung thƣ của Va-d, Vf-h với một số dẫn chất acid hydroxamic mang khung 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ HÌNH VẼ STT 1

Tên hình Hình 1.1:

Vai trò sinh học của các HDAC trong sinh lý tế bào ung thƣ

2

Hình 1.2:

Điều hòa sự phát triển và sống sót của tế bào bởi các chất ức chế HDAC

3

Hình 1.3:

Công thức cổ điển của HDI

4

Hình 1.4:

HDIs có cấu trúc acid hydroxamic

5

Hình 1.5:

Các acid phenylthiazol hydroxamic tƣơng tự SAHA

6

Hình 1.6:

Một số acid phenylthiazol hydroxamic

7

Hình 1.7:

Các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic

8

Hình 1.8:

Các acid isoxazol-hydroxamic

9

Hình 1.9:

Các triazol-hydroxamic

10

Hình 1.10:

Một số dẫn chất saccarin của acid hydroxamic mới

11

Hình 1.11:

Công thức một số dẫn chất amido-lactam ở vị trí 7 của khung SAHA

12

Hình 1.12:

Các acid hydroxamic mang khung benzothiazol, cầu nối 6 carbon

13

Hình 2.1:

Các dẫn chất hydroxamic mang khung 5-aryl1,3,4-thiadiazol dự kiến tổng hợp

14

Hình 3.1:

Mô hình tƣơng tác của Va, Vg và SAHA với HDAC8

15

Hình 4.1:

Phổ hồng ngoại của chất Vb

16

Hình 4.2:

Phổ khối lƣợng của chất Vb

17

Hình 4.3:

Phổ 1H-NMR dãn rộng của chất Vd

18

Hình 4.4:

Phổ 13C-NMR của chất Vb

19

Hình 4.5:

Kết quả phân tích Western blot của các chất Va-i

SƠ ĐỒ

Tên sơ đồ

STT 1

Sơ đồ 1.1:

Tổng hợp các acid isoxazol-hydroxamic

2

Sơ đồ 1.2:

Tổng hợp acid triazol-hydroxamic (4)

3

Sơ đồ 2.1:

Tổng hợp các dẫn chất hydroxamic mang khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol

4

Sơ đồ 3.1:

Quy trình tổng hợp chất Va

5

Sơ đồ 3.2:

Tổng hợp chất IIa

6

Sơ đồ 3.3:

Tổng hợp chất IIIa

7

Sơ đồ 3.4:

Tổng hợp chất IVa

8

Sơ đồ 3.5:

Tổng hợp chất Va

9

Sơ đồ 3.6:

Quy trình tổng hợp chất Vb

10

Sơ đồ 3.7:

Quy trình tổng hợp chất Vc

11

Sơ đồ 3.8:

Quy trình tổng hợp chất Vd

12

Sơ đồ 3.9:

Quy trình tổng hợp chất Ve

13

Sơ đồ 3.10:

Quy trình tổng hợp chất Vf

14

Sơ đồ 3.11:

Quy trình tổng hợp chất Vg

15

Sơ đồ 3.12:

Quy trình tổng hợp chất Vh

16

Sơ đồ 3.13:

Quy trình tổng hợp chất Vi

17

Sơ đồ 4.1:

Cơ chế phản ứng đóng vòng tổng hợp 2-amino5-aryl-1,3,4-thiadiazol

18

Sơ đồ 4.2:

Cơ chế hoạt hóa của CDI

ĐẶT VẤN ĐỀ Histon deacetylase (HDAC) là một nhóm enzym có ảnh hƣởng lên quá trình sao chép và biểu hiện gen. Các nghiên cứu cho thấy sự hoạt động bất thƣờng của HDAC là căn nguyên của nhiều bệnh ung thƣ [7,11,15,24]. Vì thế, việc tìm ra các thuốc có hoạt tính ức chế HDAC để điều trị ung thƣ đang là một hƣớng nghiên cứu đƣợc rất nhiều nhà khoa học quan tâm. Một trong các nhóm chất ức chế HDAC đƣợc tập trung nghiên cứu hiện nay là các dẫn chất acid hydroxamic. Nhóm chất này có hoạt tính ức chế mạnh, cấu trúc đơn giản dễ tổng hợp, trong đó acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) là chất đầu tiên đã đƣợc FDA phê duyệt sử dụng trong điều trị u lympho da tế bào T [31]. Tiếp tục thành công này, nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới vẫn đang nỗ lực tìm kiếm các dẫn chất mới tối ƣu hơn dựa trên phiên mẫu của SAHA và các chất đã tìm đƣợc. Tại Việt Nam, một số nghiên cứu thiết kế, tổng hợp các dẫn chất acid hydroxamic hƣớng ức chế HDAC đã và đang đƣợc thực hiện tại bộ môn Hóa Dƣợc – trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội. Các nghiên cứu này tập trung vào hai hƣớng: thay đổi cầu nối hoặc nhóm khóa hoạt động dựa trên khung của SAHA. Trong luận án tiến sĩ của tác giả Đào Thị Kim Oanh, dẫn chất mang khung benzothiazol với vai trò là nhóm khóa hoạt động thay cho nhân phenyl của SAHA và cầu nối 6 carbon cho hoạt tính rất đáng lƣu ý [3]. Ngoài ra, trong một công bố gần đây của tác giả Nguyễn Hải Nam và cộng sự, các dẫn chất acid hydroxamic mang khung 5-phenyl1,3,4-thiadiazol-2-yl với cầu nối 6 carbon cũng cho hoạt tính rất tốt [21]. Vì vậy, tiếp tục hƣớng nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành đề tài “Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 5-aryl-1,3,4thiadiazol hướng ức chế histon deacetylase” với hai mục tiêu: -

Tổng hợp đƣợc một số dẫn chất acid hydroxamic mang khung 5-aryl-1,3,4thiadiazol.

-

Thử tác dụng ức chế histon deacetylase và hoạt tính kháng một số dòng tế bào ung thƣ in vitro của các chất tổng hợp đƣợc.

1

-

Chƣơng 1. TỔNG QUAN

1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC) 1.1.1. Khái niệm, phân loại Histon là các protein cơ bản cấu tạo nên nhiễm sắc thể, trong đó bốn cặp histon (H2A, H2B, H3 và H4) tạo nên lõi protein của nucleosom. Các cặp histon lõi có 2 phần quan trọng: đuôi C nằm bên trong lõi và đầu N nằm bên ngoài nucleosom. Đầu amin này mang nhiều điện tích dƣơng nên tƣơng tác mạnh với phần phosphat mang điện âm trên phân tử ADN tạo nên cấu trúc nucleosom và các cấu trúc bậc cao hơn của nhiễm sắc thể. Việc tích điện dƣơng của histon mạnh hay yếu thông qua quá trình acetyl hóa đầu amin ở phần đuôi của histon. Ở dạng deacetyl hóa, histon tích điện dƣơng lớn, tƣơng tác điện tích với ADN mạnh làm đóng xoắn nhiễm sắc thể gây ức chế quá trình dịch mã và tổng hợp protein, ức chế sự biểu hiện gen. Ngƣợc lại, khi bị acetyl hóa, điện tích dƣơng bị trung hòa, nhiễm sắc thể đƣợc tháo xoắn, quá trình tổng hợp protein diễn ra và đặc tính của gen đƣợc biểu hiện. Trong tế bào, quá trình acetyl hóa này đƣợc điều hòa bởi 2 enzym: histon acetyltranferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC) [1, 13, 27, 29]. Histon deacetylase (HDAC) là nhóm gồm 18 enzym xúc tác cho sự di chuyển làm giảm bớt nhóm acetyl trên phần đuôi lysin của các protein histon H2A, H2B, H3 và H4 trong lõi nucleosom. Hiện nay, 18 HDAC khác nhau ở ngƣời đã đƣợc xác định, chia làm 4 nhóm [1, 5, 6, 27, 29]. -

Nhóm I: HDAC 1, HDAC 2, HDAC 3, HDAC 8 : Nằm ở nhân tế bào, có protein đích là các histon.

-

Nhóm IIa: HDAC 4, HDAC 5, HDAC 7, HDAC 9: Nằm ở nhân hoặc tế bào chất, có protein đích là các protein histon và không phải histon.

-

Nhóm IIb: HDAC 6, HDAC 10 : Nằm ở tế bào chất, có đích là các protein không phải histon.

2

-

Nhóm III: Các protein điều hoà chuỗi thông tin 2 (SIRT): SIRT 1 – 7, chúng có ở bào tƣơng, ty thể và nhân.

-

Nhóm IV: HDAC 11 : Nằm ở nhân tế bào, có đích là các histon. Các HDAC nhóm I, II, IV đƣợc gọi là các HDAC “kinh điển” phụ thuộc vào

Zn2+ và bị ức chế bởi các chất tạo phức chelat với Zn2+ nhƣ các acid hydroxamic, thiol... Trong khi đó các HDAC nhóm III lại phụ thuộc vào NAD+ [6]. Thuật ngữ các chất ức chế HDAC thƣờng đƣợc dùng cho những chất có mục tiêu phân tử là các HDAC kinh điển và hiện đang đƣợc nghiên cứu trên lâm sàng [1, 6]. 1.1.2. Cấu trúc của HDAC Bằng phƣơng pháp kết tinh tạo tinh thể và chụp tia X ngƣời ta đã xác định đƣợc cấu trúc 3D của một số HDAC và các trung tâm xúc tác phản ứng deacetyl của chúng. Về cơ bản các HDAC có cấu trúc trung tâm hoạt động khá giống nhau, chúng đều gồm các phần cơ bản sau: + Ion Zn2+ là coenzym của HDAC nằm ở trung tâm xúc tác của chúng. Đây là thành phần tham gia liên kết mạnh nhất với phần đuôi histon bằng liên kết phối trí. Thông thƣờng các chất ức chế HDAC liên kết càng mạnh với Zn2+ thì tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào càng mạnh [12, 19, 28]. + Kênh enzym là nơi chứa đựng cơ chất và tham gia liên kết Van der Walls với cơ chất. Kênh này có cấu trúc dạng túi hình ống hẹp, đƣợc cấu tạo bởi các acid amin thân dầu đặc biệt là các acid amin có nhân thơm nhƣ: Phe, Tyr, Pro, His. Nó có cấu trúc khá linh động có thể thay đổi kích thƣớc để phù hợp với cơ chất và tham gia phản ứng deacetyl. Trên miệng túi có một vành nhỏ đƣợc tạo nên từ 1 vài vòng xoắn protein (phần vành sẽ tƣơng tác với nhóm nhận diện bề mặt của HDAC). Đối với các hợp chất acid hydroxamic chiều dài của kênh này là tối ƣu với khoảng 5-6 liên kết carbon [12, 28, 29]. 1.1.3. Mối liên quan giữa ung thƣ và sự bất thƣờng hoạt động của HDAC Nhƣ đã trình bày trong phần khái niệm, hoạt động của HDAC ảnh hƣởng tới sự tích điện trên phần đầu amin của histon, từ đó gây tác động lên quá trình phiên mã. Các sai lệch của quá trình phiên mã là một trong những nguyên nhân dẫn tới sự hình thành khối u [1]. Chẳng hạn, mối tƣơng quan giữa hoạt động của HDAC và sự

3

tạo thành khối u đƣợc thể hiện rõ nhất trong bệnh ung thƣ bạch cầu tiền tủy bào cấp tính (APL). Những nghiên cứu trên phạm vi rộng đã chỉ ra rằng sự ức chế phiên mã không thích hợp của HDAC là cơ chế phổ biến tạo ra các protein gây ung thƣ (oncoprotein). Ngoài ra trong các tế bào ung thƣ ngƣời ta còn thấy sự hoạt động quá mức của HDAC nhƣ ung thƣ buồng trứng (HDAC1-3), ung thƣ dạ dày (HDAC2); ung thƣ phổi (HDAC1, 3) [11, 24]. Các nghiên cứu có ý nghĩa thống kê đã chỉ ra rằng các HDAC liên quan đến nhiều giai đoạn điều hòa cơ bản của quá trình sinh học trong tế bào ung thƣ nhƣ chu trình tế bào, sự biệt hóa, sự chết tế bào theo chƣơng trình, kể cả sự di chuyển, sự xâm lấn và sự tạo mạch. Vai trò chức năng của các HDAC trong quá trình sinh học của tế bào ung thƣ đƣợc tóm tắt ở hình 1.1 [7, 11, 15, 24].

Hình 1.1: Vai trò sinh học của các HDAC trong sinh lý tế bào ung thư

1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC 1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC (HDIs) HDIs đƣợc chia thành 5 nhóm chính dựa trên cấu trúc hóa học: các acid hydroxamic, các peptid vòng, các acid béo, benzamid và các dẫn chất ceton. [9]

4

Bảng 1.1: Các chất ức chế HDAC đang thử nghiệm trên lâm sàng Chất

Cấu trúc

Chất

Cấu trúc

Các acid hydroxamic O

O

O

TSA (Trichostatin A)

NHOH

Oxamflatin

NHOH

H N

O S

N

O

O

Acid

H N NHOH

suberoylanilid

NVP-

O

LAQ-824

hydroxamic (SAHA)

CBHA (Acid mcarboxycinnamic

Acid

bishydroxamid)

sulfonamid hydroxamic

Scriptaid Peptid vòng O

Depsipeptid

HN

NH

S S

O

(FK-228)

CH3 O

H N

CH3 CH3

H3C

O HN

O

CH3 O

Acipidin

CHAP

Benzamid O O

MS-275

N H

H N

NH2

CI-994

N O

Các acid béo O

Acid valproic

Phenyl

ONa

OH

butyrat

5

O

Các dẫn chất ceton Trifluoromethyl

Alpha-

ceton

cetoamid

Mỗi nhóm có những hạn chế riêng: các acid hydroxamic là những chất bị chuyển hóa nhanh và ức chế không chọn lọc các HDAC; các benzamid và các acid béo có hiệu lực hạn chế, trong khi các peptid vòng có cấu trúc quá phức tạp và gây ra sự chảy máu khó chữa và FK-228 trong cấu trúc có một phần liên kết với kim loại có chứa lƣu huỳnh không mong muốn [4, 14]. 1.2.2. Cơ chế tác dụng Các chất ức chế HDAC có tác dụng chống ung thƣ do tác động lên nhiều giai đoạn quan trọng của chu trình tế bào làm mất sự điều hòa trong tế bào ác tính. Trong đó, yếu tố then chốt quyết định hoạt tính chống ung thƣ của HDIs là thúc đẩy sự biệt hóa, ức chế chu trình tế bào và thúc đẩy sự chết tế bào. Ngoài ra, hoạt hóa đáp ứng miễn dịch và ức chế tạo mạch cũng là vai trò rất quan trọng của HDIs, gián tiếp ức chế sự phát triển in vivo của khối u (hình 1.2) [2, 13].

Hình 1.2: Điều hòa sự phát triển và sống sót của tế bào bởi các chất ức chế HDAC

1.2.3. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC Các HDIs chia thành nhiều nhóm khác nhau nhƣng có một số đặc điểm chung về mặt cấu trúc gồm 3 phần chính [2, 8, 20]:

6

- Nhóm gắn với ion Zn2+ (Zinc binding group - ZBG) (A): tƣơng tác với ion Zn2+ tại trung tâm hoạt động của các HDAC nhƣ acid hydroxamic, các thiol, nhóm oaminoanilin của benzamid, mercaptoceton..., quyết định tính đặc hiệu và hiệu lực của HDIs. - Vùng cầu nối sơ nƣớc (B): thƣờng là những hydrocacbon thân dầu có thể tạo các liên kết Van der Waals với kênh enzym. - Nhóm khóa hoạt động (capping group) hay vùng nhận diện bề mặt (surface recognition group) (C): là các vòng thơm hoặc peptid vòng, thƣờng nằm trên bề mặt enzym.

Hình 1.3: Công thức cổ điển của HDI Cấu trúc tinh thể kết tinh của các HDAC liên kết với một số chất ức chế HDAC cho thấy phần A, B và một phần của C nằm trong túi enzym, làm lấp đầy khoảng trống trong lòng kênh enzym. Phần còn lại của nhóm khóa hoạt động C tƣơng tác với phần vành trên bề mặt miệng túi enzym. Nhóm nhận diện bề mặt C có thể liên kết với phần cầu nối thông qua một số liên kết peptid làm tăng khả năng phân cực và góp phần cải thiện dƣợc động học cho các chất ức chế HDAC. Việc nghiên cứu thiết kế cấu trúc các chất mới đều dựa trên cấu trúc cổ điển này. 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VỀ CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC Acid hydroxamic là nhóm chất ức chế HDAC đƣợc nghiên cứu rộng rãi nhất, với nồng độ ức chế nằm trong khoảng micromol đến nanomol. Trichostatin A ( (R)-TSA) là chất đầu tiên đƣợc phân lập từ Streptomyces hygroscopicus đã đƣợc chứng minh có tác dụng ức chế mạnh, đặc hiệu với HDAC (Ki=3,4nM), có tác dụng rất tốt trong việc làm giảm sự biệt hóa tế bào trong bệnh bạch cầu Friend, và đóng vai trò nhƣ chất ngăn cản sự di căn trong ung thƣ đại tràng. Tuy nhiên việc sản xuất ra TSA rất tốn kém với hiệu suất thấp (trải qua 20

7

bƣớc với hiệu suất 2%) nên việc nghiên cứu ra các chất ức chế HDAC thay thế TSA đang đƣợc nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Hiện nay, TSA chủ yếu đƣợc dùng làm chất đối chiếu trong nghiên cứu tìm ra HDIs mới [23]. Một chất ức chế HDAC đã đƣợc nghiên cứu tổng hợp thành công là acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA). Chất này đã đƣợc FDA phê duyệt sử dụng trong điều trị u lympho da tế bào T. SAHA làm tăng sự acetyl hóa của các histon H2B, H3 và H4, đồng thời thay đổi sự biểu hiện của một số gen dẫn đến sự chết tế bào theo chƣơng trình [31]. Bên cạnh đó, nhiều dẫn chất acid hydroxamic ức chế HDAC đang đƣợc nghiên cứu rộng rãi và đƣợc chia thành nhiều phân nhóm nhỏ (hình 1.4).

Hình 1.4: HDIs có cấu trúc acid hydroxamic Đặc điểm chung của các chất này là nhóm hydroxamic dễ tạo phức với Zn 2+ của HDAC nên ức chế không chọn lọc cả HDAC nhóm I, II và bị chuyển hóa nhanh [20, 30]. Chính vì vậy các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang nỗ lực tìm kiếm các dẫn chất mới dựa trên phiên mẫu TSA, SAHA và các chất đã tìm đƣợc. Dựa trên đặc điểm cấu trúc của các chất ức chế HDAC dẫn chất hydroxamic (hình 1.3), các

8

nghiên cứu có thể tiến hành thay đổi một trong 2 phần cấu trúc: nhóm khóa hoạt động (C), cầu nối (B). Sau đây là tổng kết một số nghiên cứu trên thế giới về thay đổi nhóm khóa hoạt động của các acid hydroxamic. Các nhà khoa học thuộc Viện nghiên cứu quân đội Walter Reed (Mỹ) đã thiết kế và tổng hợp hàng trăm dẫn chất acid hydroxamic mang hợp phần phenylthiazol thay thế vào vị trí của phenyl trong SAHA (1, hình 1.5) [10]. Một dẫn chất oxazol là WR301849 cũng đƣợc tổng hợp [17].

Hình 1.5: Các acid phenylthiazol hydroxamic tương tự SAHA Kết quả đánh giá tác dụng trên HDAC cho thấy dẫn chất WR301801 (1a) với nhóm khóa hoạt động là 3-aminophenyl-5-thiazolyl có tác dụng ức chế mạnh nhất với IC50 = 10,4 nM, mạnh hơn cả SAHA trên cùng thử nghiệm. Đồng phân vị trí của WR301801 là WR301826 (1b) (nhóm thế amino ở vị trí ortho) cũng có tác dụng mạnh tƣơng đƣơng SAHA [30]. Sử dụng hai chất WR301801 và WR301826 làm những chất dẫn đƣờng mới, nhóm nghiên cứu của Alan P. Kozikowski thuộc Đại học Illinois (Chicago, Mỹ) tiếp tục thiết kế dãy acid phenylthiazol-hydroxamic dẫn chất hóa dựa trên nhóm amino của vòng phenyl (hình 1.6) [16]. Kết quả cho thấy, khi nhóm amin thế trên vòng phenyl đƣợc acyl hóa bằng những nhóm cồng kềnh, tác dụng ức chế nhiều týp HDAC tăng. Tác dụng mạnh nhất thu đƣợc với dẫn chất 1a-5 (hình 10). IC50 của dẫn chất này với HDAC2, HDAC3 thấp dƣới mức 0,2 nM. Kết quả thử độc tính trên 5 dòng tế bào ung thƣ tụy công bố với 1a, 1b, 1a-2 cho thấy các dẫn chất này đều có IC50 nhỏ hơn 3 M [16].

9

Hình 1.6: Một số acid phenylthiazol hydroxamic Trong quá trình nghiên cứu các dẫn chất acid phenylthiazol-hydroxamic, nhóm nghiên cứu của Alan P. Kozikowski cũng đồng thời tiến hành thiết kế và tổng hợp một dãy các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic tƣơng tự SAHA (hình 1.7) [16]. Kết quả các dẫn chất biphenyl ức chế HDAC mạnh hơn SAHA trên 6 loại HDAC (HDAC1, 2, 3, 8, 10, 6). Khi gắn thêm nhóm -NH2 vào vị trí ortho trên vòng phenyl thứ 2 hoạt tính giảm song khi nhóm -NH2 này đƣợc acyl hóa bằng những nhóm aminoacyl cồng kềnh, tác dụng ức chế HDAC lại đƣợc tăng cƣờng. Điều này chứng tỏ phần nhận diện bề mặt của trung tâm hoạt động của HDAC có thể chấp nhận nhiều nhóm có kích thƣớc lớn. Kết quả này cũng gợi ý các tƣơng tác đƣợc tạo lập thêm từ những nhóm aminoacyl này với các acid amin tại vành của túi hoạt động đã làm tăng ái lực đối với HDAC của các dẫn chất. Một số acid biphenyl-hydroxamic cũng cho độc tính trên 5 dòng tế bào ung thƣ tụy thử nghiệm nhƣng tác dụng không tốt bằng các acid phenylthiazol hydroxamic.

Hình 1.7: Các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic Trong quá trình nghiên cứu các dẫn chất acid phenylthiazol-hydroxamic, nhóm nghiên cứu của Alan P. Kozikowski thuộc Đại học Illinois (Chicago, Mỹ) đã tổng hợp dẫn chất acid phenylisoxazol-hydroxamic WR301849 (hình 1.8) [17]. Dẫn chất isoxazol này có tác dụng ức chế các HDAC1, 3 và 6 rất mạnh với IC50 thấp đến 0,002 nM. Tiếp tục mạch nghiên cứu này, một số dẫn chất trong đó vòng isoxazol đƣợc đƣa vào vị trí ngay sát cạnh nhóm acid hydroxamic đã đƣợc thiết kế và tổng hợp (sơ đồ 1.1) [25].

10

Sơ đồ 1.1: Tổng hợp các acid isoxazol-hydroxamic * Tác nhân và điều kiện: (a) acid 7-heptynoic, POCl3, pyridin, -13oCrt, 30 phút; (b) ethyl clorooxamidoacetat, triethylamin, THF, rt, 16 h; (c) NH2OH.HCl, KOH, MeOH, rt, 15 phút.

Kết quả thử hoạt tính ức chế HDAC cho thấy một số dẫn chất trong các acid isoxazol-hydroxamic tổng hợp ức chế cả 5 tuýp HDAC1, 2, 3, 6 và 10 với IC50 trung bình khoảng 150 nM [25]. Tác dụng này kém hơn nhiều so với các acid phenylthiazol-hydroxamic (1) và acid biphenyl-hydroxamic (2). Có thể nhận xét, khi có mặt vòng isoxazol cạnh nhóm hydroxamic, nhóm khóa hoạt động là quinolin hoặc biphenyl không tối ƣu cho hoạt tính, trong khi hai dẫn chất với vòng 5phenylthiazol (3a, 3b) có tác dụng ức chế HDAC khá mạnh, gần tƣơng đƣơng SAHA (hình 1.8). Đây cũng là hai dẫn chất thể hiện độc tính tế bào mạnh nhất với IC50 thấp đến 1 µM. Điều ngạc nhiên là mặc dù 3b ức chế HDAC mạnh hơn 3a song 3a lại có độc tính tế bào mạnh hơn 3b [25]. Có thể sự có mặt của nhóm 3amino ở 3b đã làm giảm tính thấm qua màng tế bào của chất này, dẫn đến độc tính tế bào thấp hơn so với 3a. Có thể các dẫn chất acyl hóa của 3b sẽ cải thiện cả tác dụng trên HDAC và tế bào, tƣơng tự nhƣ với các dẫn chất acid phenylthiazolhydroxamic (1).

Hình 1.8: Các acid isoxazol-hydroxamic Cũng nhằm mục tiêu tìm ra cầu nối và nhóm khóa hoạt động thích hợp, các nhà khoa học tại Viện Parker H. Petit thuộc Viện Công nghệ Georgia đã thiết kế và tổng hợp dãy các dẫn chất hydroxamic chứa vòng triazol (4, sơ đồ 1.2) [17].

11

Sơ đồ 1.2: Tổng hợp acid triazol-hydroxamic (4). Tác nhân và điều kiện: (a) CuI, Hunig base, THF, rt; (b) dd NH2OH, KCN, THF/MeOH (1/1), rt. Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế HDAC cho thấy cầu nối giữa phần hydroxamic và triazol 5, 6C là tối ƣu. Tuy nhiên, không thấy có quy luật rõ ràng khi so sánh hai dẫn chất có cùng nhóm khóa hoạt động Ar và khác nhau về độ dài cầu nối. Với nhóm Ar cồng kềnh, dẫn chất 5C thƣờng có tác dụng ức chế HDAC mạnh hơn trong khi những chất có Ar nhỏ, dẫn chất 6C thƣờng biểu thị hoạt tính trên HDAC mạnh hơn. Khi so sánh với SAHA, rất nhiều dẫn chất triazol chứng tỏ có ái lực mạnh hơn với HDAC. In vitro, 4 dẫn chất 4t, 4v, 4y, 4w gây độc đối với dòng tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến của ngƣời DU145 với IC50 thấp nhất đến 2,25 µM, tƣơng đƣơng với SAHA (hình 1.9) [8].

Hình 1.9: Các triazol-hydroxamic Đã có nhiều nghiên cứu về các dẫn chất acid hydroxamic ức chế HDAC (các dẫn chất N-hydroxybenzamid, 1,3,4-thiadiazol và tetrahydroisoquinolin), gần đây, nhóm các nhà khoa học của Trung Quốc và Mỹ tiếp tục công bố kết quả tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một dãy các dẫn chất saccarin (1,2dihydrobenzo[d]isothiazol-3-1-1,1-dioxid) của acid hydroxamic mới (hình 1.10) [18].

12

Hình 1.10: Một số dẫn chất saccarin của acid hydroxamic mới Việc khảo sát độ dài cầu nối n=1-5 cũng cho thấy các dẫn chất có cầu nối 5C cho hoạt tính ức chế HDAC mạnh nhất. Đặc biệt các chất 5e, 5m, 5p ức chế HDAC tƣơng tự hoặc tốt hơn SAHA (với IC50 lần lƣợt là 0,152; 0,113; 0,096µM so với SAHA là 0,135µM). Các đánh giá sinh học sâu hơn cho thấy 5m có hoạt tính kháng các tế bào ung thƣ MDA-MB-231 (tế bào ung thƣ vú); PC-3 (tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến) và KG1 (tế bào ung thƣ bạch cầu nguyên bào tủy) mạnh nhất với IC50 = 4,34; 9,28 và 1,66 µM, tƣơng đƣơng SAHA [18]. Kết quả này gợi ý rằng các dẫn chất hydroxamat mang khung saccarin có thể là các chất dẫn đƣờng để phát triển các hoạt chất kháng ung thƣ mới. Một nhóm các nhà khoa học Trung Quốc khác cũng vừa đăng ký bằng sáng chế (số CN 103159646) cho một dẫn chất mới của SAHA là N1-(2,5dimethoxyphenyl)-N(8)-hydroxyoctandiamid (N25) [32]. Hoạt tính kháng ung thƣ của N25 mạnh hơn SAHA trên các dòng tế bào ung thƣ phổi H460, A549, H1299 và ung thƣ thần kinh đệm U251 (bảng 1.2).

13

Bảng 1.2: Tác dụng kháng các tế bào ung thư in vitro của N25 (IC50±SD [µM])

Một hƣớng thay đổi nhóm khóa hoạt động của SAHA đƣợc thực hiện bởi các nhà khoa học Italia (Maurizio Taddei và cộng sự, cuối năm 2013) bằng cách gắn các lactam-carboxyamid vào vị trí số 7 của khung suberoylanilid đã thu đƣợc kết quả rất đáng lƣu ý. Việc gắn lactam vào nhóm khóa hoạt động này đã tăng cƣờng đáng kể tác dụng in vitro. Nhiều dẫn chất đƣợc tạo ra có khả năng ức chế HDAC các tuýp với IC50 ở mức nanomol, thấp hơn SAHA hàng trăm lần, điển hình là 3 chất 6, 7, 8 (hình 1.11, bảng 1.3) [26].

Hình 1.11: Công thức một số dẫn chất amido-lactam ở vị trí 7 của khung SAHA Nghiên cứu tác dụng kháng tế bào ung thƣ (H460) cũng cho thấy các dẫn chất amido-lactam ở vị trí 7 của khung SAHA cho hoạt tính rất mạnh. Các dẫn chất thế ở vị trí meta-, para- và γ-lactam anilid ở vị trí 7 đều có độc tính cao với IC50

14

dƣới micromol, đặc biệt các chất 6, 7 và 8 có IC50 = 0.5 µM, thấp hơn SAHA hơn 60 lần (bảng 1.3) [26]. Bảng 1.3: Hoạt tính ức chế HDAC các tuýp và tác dụng kháng tế bào ung thư in vitro của các dẫn chất amido-lactam ở vị trí 7 của khung SAHA.

Nhìn chung, các dẫn chất SAHA chứa (S)-7-amino carboxylactam ức chế các tuýp HDAC với giá trị IC50 ở mức nano, cho thấy sự có mặt của vòng amid trên vùng khóa hoạt động có ảnh hƣởng đặc biệt lên ái lực với enzym. Sự biến đổi trên nhóm khóa hoạt động của SAHA này đã mang lại các chất có hoạt tính cực mạnh trên các HDAC nhóm I và II, đƣợc chứng thực thêm bằng khả năng kháng ung thƣ đầy hứa hẹn trên dòng tế bào thử nghiệm. Chất 6 có thể coi là một chất dẫn đƣờng hấp dẫn, với các biến đổi đơn giản nhƣng tạo đƣợc đƣợc một chất kháng ung thƣ mới hƣớng ức chế HDAC đầy triển vọng [26]. 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở TRONG NƢỚC VỀ CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC Tại Việt Nam, lần đầu tiên các nghiên cứu thiết kế, tổng hợp các chất ức chế HDAC và thử hoạt tính để sàng lọc tìm ra chất có hƣớng tác dụng kháng tế bào ung thƣ đã và đang đƣợc nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dƣợc, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội thực hiện. Luận án tiến sĩ của tác giả Đào Thị Kim Oanh đã tiến hành thay thế nhân phenyl của SAHA bằng khung benzothiazol với vai trò là nhóm khóa hoạt động (hình 1.12). Kết quả khảo sát độ dài cầu nối từ 2 – 6 carbon cho thấy với cầu nối 6C cho hoạt tính tối ƣu [3].

15

Hình 1.12: Các acid hydroxamic mang khung benzothiazol, cầu nối 6 carbon Kết quả thử độc tính tế bào in vitro cho thấy chất 9b, 9g có hoạt tính mạnh tƣơng đƣơng SAHA. Thậm chí trên 3 dòng tế bào SW620, AsPC-1 và NCI-H460, chất 9g có tác dụng mạnh gần gấp đôi so với SAHA, thể hiện ở giá trị IC50 = 0,32; 0,34; 0,39 µg/ml (tƣơng ứng với từng dòng tế bào) so với của SAHA là IC50 = 0,50; 0,69; 0,68 µg/ml. Thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến PC-3 in vivo với mô hình ghép dị chủng ở chuột trụi lông cho thấy chất 9g ức chế 49,00% sự phát triển của khối u tƣơng đƣơng SAHA (48,30%) (liều 30 mg/kg). Giữ nguyên cầu nối 6 carbon đã đƣợc khảo sát trong luận án trên, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dƣợc trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội tiếp tục hƣớng nghiên cứu thay đổi nhóm khóa hoạt động. Dãy dẫn chất acid hydroxamic mang khung 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl đã đƣợc thiết kế, tổng hợp và kết quả cũng cho hoạt tính rất đáng chú ý (bảng 1.4) [21].

16

Bảng 1.4: Các acid hydroxamic mang khung 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl và độc tính trên một số dòng tế bào

Chất

R

10a

Độc tính trên các dòng tế bào (IC50,* µM) SW620

MCF-7

PC3

AsPC-1

NCI-H460

H

0,70

1,80

0,88

2,71

1,07

10b

2-Cl

0,34

1,23

1,42

0,63

0,11

10c

3-Cl

0,45

1,23

1,76

1,10

1,94

10d

4-Cl

1,62

0,73

0,84

1,34

1,50

10e

4-F

3,58

8,05

2,92

1,88

4,79

10f

4-Br

0,72

1,27

0,83

0,08

1,42

10g

4-CH3

11,52

20,78

14,90

6,38

13,16

10h

4-OCH3

1,46

2,46

1,63

0,80

1,97

10i

4-N(CH3)2

6,61

6,67

7,35

7,16

8,18

10j

2-NO2

19,23

31,18

14,69

33,47

16,69

10k

4-NO2

26,71

76,25

25,57

76,25

76,25

10l

2,6-Cl2

16,21

16,29

15,18

14,95

14,38

10m

3,4-CH2OCH2-

1,89

2,15

2,54

3,04

3,34

10n

2,3,4-(OCH3)3

2,29

4,15

1,77

2,11

3,21

10o

3,4,5-(OCH3)3

4,31

3,50

1,89

6,02

10,20

3,70

6,82

4,31

3,66

2,77

SAHA

*Nồng độ của chất gây ra sự giảm 50% số lượng tế bào, số liệu được lấy trung bình ba kết quả với độ lệch dưới 10%. SAHA: acid suberoylanilid hydroxamic.

Nghiên cứu này đã tổng hợp đƣợc nhiều dẫn chất chất mang khung 5-phenyl1,3,4 thiadiazol có hoạt tính kháng tế bào ung thƣ mạnh. Các chất 10a-c có IC50 thấp hơn SAHA 3-20 lần trên các dòng tế bào thử nghiệm, còn 10d-f, 10m-o cũng cho hoạt tính thấp hơn hoặc tƣơng đƣơng SAHA. Các nghiên cứu trên cho thấy, việc giữ cầu nối 6C và thay nhân phenyl của SAHA bằng các dẫn chất vòng benzothiazol, 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol đều tạo ra đƣợc các chất có tác dụng kháng ung thƣ hiệu quả với hoạt lực mạnh hơn. Vì vậy,

17

đề tài này sẽ tiếp tục hƣớng nghiên cứu trên, thay khung 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol bằng khung 5-aryl-1,3,4-thidiazol và vẫn giữ nguyên cầu nối 6 carbon.

18

Chƣơng 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm là loại dành cho tổng hợp đƣợc nhập từ công ty Merck hoặc Sigma-Aldrich. Các hóa chất này đƣợc sử dụng trực tiếp không qua tinh chế thêm. Bao gồm: 2.1.2. Hóa chất chính Các aldehyd: Furan-2-carbaldehyd Pyridin-2-carbaldehyd Pyridin-3-carbaldehyd Pyridin-4-carbaldehyd Thiophen-2-carbaldehyd 5-Bromothiophen-2-carbaldehyd 5-Bromofuran-2-carbaldehyd

FeCl3.12H2O Acid suberic monomethyl ester Carbonyldiimidazol (CDI) Hydroxylamin hydroclorid Thiosemicarbazid 2.1.2. Các hóa chất và dung môi khác DMF

Aceton

MeOH

Acid acetic băng

n-Hexan

HCl

EtOH

NaOH

Dicloromethan

Nƣớc cất

2.2. THIẾT BỊ -

Bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml có nút mài, máy khuấy từ gia nhiệt, sinh hàn hồi lƣu, máy cất quay chân không, tủ lạnh, tủ sấy, pipet, phễu thủy tinh, giấy

19

lọc, cân phân tích, cân kỹ thuật, bình chạy sắc ký lớp mỏng (SKLM), chị thị màu vạn năng. -

SKLM tiến hành trên bản mỏng silicagel 60 F254 tráng sẵn.

-

Nhiệt độ nóng chảy (tonc) đƣợc xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện (Electrothermal digital).

-

Phổ hồng ngoại (IR) đƣợc ghi trên máy Perkin Elmer – USA tại bộ môn Hóa vật liệu – Khoa hóa – Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội.

-

Phổ khối lƣợng (MS) đƣợc ghi bằng máy khối phổ LC-MSD-Trap-SL (của Viện hóa học Việt Nam) và Agilent 6310 Ion Trap (của Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên).

-

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H - NMR) và carbon (13C - NMR) đƣợc ghi bằng máy Bruker AV-500 tại Trung tâm khoa học và công nghệ Việt Nam.

2.3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Nội dung nghiên cứu -

Khảo sát và tổng hợp 9 chất với công thức nhƣ sau:

Hình 2.1: Các dẫn chất hydroxamic mang khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol dự kiến tổng hợp STT 1

2

Chất Va

Vb

R

Tên N1-[5-(furan-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8hydroxyoctandiamid. N1-[5-(5-bromofuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2yl]-N8-hydroxyoctandiamid.

20

3

4

5

6

7

8

9

Vc

Vd

Ve

Vf

Vg Vh Vi

N1-hydroxy-N8-[5-(5-methylfuran-2-yl)-1,3,4thiadiazol-2-yl]octandiamid. N1-hydroxy-N8-[5-(thiophen-2-yl)-1,3,4thiadiazol-2-yl]octandiamid. N1-[5-(5-bromothiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol2-yl]-N8-hydroxyoctandiamid. N1-hydroxy-N8-[5-(5-methylthiophen-2-yl)1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid. N1-hydroxy-N8-[5-(pyridin-2-yl)-1,3,4thiadiazol-2-yl]octandiamid. N1-hydroxy-N8-[5-(pyridin-3-yl)-1,3,4thiadiazol-2-yl]octandiamid. N1-hydroxy-N8-[5-(pyridin-4-yl)-1,3,4thiadiazol-2-yl]octandiamid.

-

Khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp đƣợc

-

Thử tác dụng ức chế HDAC và hoạt tính kháng một số dòng tế bào ung thƣ (in vitro) của các chất tổng hợp đƣợc

2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.2.1. Nghiên cứu Docking Sau khi thiết kế dãy dẫn chất, để nghiên cứu sơ bộ tƣơng tác của các chất với HDAC, chúng tôi đã tiến hành docking cho các chất tổng hợp đƣợc với HDAC8 [12]. Cấu trúc HDAC8 đƣợc lấy từ ngân hàng dữ liệu protein (Protein Data Bank (PDB)) (PDB ID: 1T69). Cấu trúc của HDAC8 có điểm tƣơng đồng cao với HDAC4 với điểm DALI Z (Z-score điểm đánh giá độ giống) = 40,4 và điểm r.m.s.d (root-meansquare deviation, độ lệch) = 2,1Å, thứ tự acid amin giống nhau (46%) và là HDAC của động vật có vú đầu tiên có cấu trúc không gian đƣợc nghiên cứu kỹ nhất. Chúng tôi thực hiện kiểm soát thử nghiệm lắp ghép của các chất vào HDAC8 bằng chƣơng trình AutoDock Vina [22]. Tiếp theo chúng tôi dự đoán năng lƣợng

21

của sự tƣơng tác liên kết của các chất tổng hợp đƣợc với HDAC8 từ sự lắp ghép trên. Nghiên cứu docking đƣợc thực hiện tại Phòng Nghiên cứu cấu trúc Đại học Quốc gia Seoul, Hàn Quốc. Kết quả đƣợc minh họa bằng hình ảnh docking và số liệu dự đoán tƣơng tác. 2.3.2.2. Tổng hợp hóa học  Tổng hợp 9 chất mục tiêu theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 2.1: Tổng hợp các dẫn chất hydroxamic mang khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol a) Thiosemicarbazid, ethanol, đun hồi lưu; (b) FeCl3.12H2O; c) Acid suberic monomethyl ester, CDI, DMF; d) NH2OH.HCl, MeOH, NaOH.

 Dùng TLC để theo dõi quá trình tiến triển của phản ứng. 2.3.2.3. Kiểm tra độ tinh khiết Nhiệt độ nóng chảy: Đo bằng máy đo điểm chảy nhiệt điện (Electrothermal digital). Sắc ký lớp mỏng: Dùng để theo dõi quá trình phản ứng, xác định thời điểm kết thúc phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm sau khi tinh chế.  Sắc ký lớp mỏng đƣợc tiến hành trên bản mỏng silicagel 60 F254 tráng sẵn, hoạt hóa ở 110oC trong 30 phút. Hệ dung môi tùy thuộc vào đặc điểm của từng chất. Mẫu thử đƣợc hòa tan trong dung môi thích hợp. Chấm khoảng 2l.  Để bản mỏng trong bình sắc ký đã bão hòa dung môi ở nhiệt độ phòng, cho dung môi chạy khoảng 8 cm.  Quan sát kết quả dƣới đèn tử ngoại ở bƣớc sóng 254 nm.

22

2.3.2.4. Xác định cấu trúc Sử dụng các phƣơng pháp phổ IR, MS, NMR (1H và

13

C) để xác định cấu

trúc của các chất tổng hợp. 2.3.2.5. Thử hoạt tính sinh học * Thử hoạt tính ức chế HDAC: Phân tích dựa trên Western blot, đƣợc tiến hành tại khoa Dƣợc, ĐH Chungbuk, Hàn Quốc. Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp đƣợc đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong các tế bào ung thƣ. Phân tích dựa trên Western blot có thể khẳng định đƣợc tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng. Nguyên liệu và nuôi cấy tế bào: Các tế bào ung thƣ đại tràng SW620 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng RPMI (bổ sung L-glutamin, 10% huyết thanh bào thai bò (fetal bovine serum)), gọi là môi trƣờng nuôi cấy hoàn chỉnh (complete medium). Tất cả tế bào đƣợc ủ ở 37 C với 5% (w/v) CO2 và 95% (w/v) không khí. Trƣớc khi sử dụng, các mẫu thử nghiệm dạng bột đƣợc hòa tan trong dimethylsulfoxid (DMSO) để tạo dung dịch gốc nồng độ 10 mg/ml. Các dung dịch gốc sau đó đƣợc pha loãng bằng môi trƣờng nuôi cấy hoàn chỉnh để tạo các dung dịch làm việc ở nồng độ 1 g/ml và 10 g/ml. Phân lập histon và Western Blot Tế bào SW620 (khoảng 1 x 106) đƣợc ủ với mẫu thử trong 24 giờ, song song làm mẫu trắng (tế bào không ủ với mẫu thử). Sau đó, các tế bào đƣợc xử lý và rửa bằng dung dịch muối có bổ sung đệm phosphat. Tế bào đƣợc ly giải trong dung dịch đệm [20 mM Tris-HCl (pH 7,5); 150 mM NaCl; 1 mM Na2EDTA; 1 mM EGTA; 1% triton; 2,5 mM Na pyrophosphat; 1 mM -glycerophosphat; 1 mM Na3VO4; 1 g/ml leupeptin], ủ trong đá 15 phút. Hỗn dịch đƣợc ly tâm và phần dịch đƣợc thu hồi để tiến hành điện di trên gel. Histon đƣợc điện di qua gel SDSPAGE 10% và chuyển vào màng PVDF. Các màng đƣợc ủ qua đêm cùng kháng thể 1 là kháng acetyl histon H3, kháng acetyl histon H4 (Milipore), tiếp theo ủ với kháng thể 2 là kháng thể IgG thỏ liên hợp peroxidase của ngựa trong 2 giờ. Các dải

23

có phản ứng dƣơng tính đƣợc phát hiện nhờ sự phát quang đã đƣợc tăng cƣờng. Các thí nghiệm đƣợc làm lặp lại ít nhất 3 lần một cách độc lập. * Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro: Thử độc tính tế bào in vitro đƣợc thực hiện tại Khoa Dƣợc, Trƣờng Đại học Chungbuk, Hàn Quốc theo phƣơng pháp MTT và giá trị IC50 đƣợc tính theo phƣơng pháp GraphPad Prism. Dòng tế bào thử nghiệm: SW620 (tế bào ung thƣ đại tràng ngƣời), MCF-7 (tế bào ung thƣ vú ngƣời), AsPC-1 (tế bào ung thƣ tụy ngƣời), PC-3 (tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến ngƣời). Các dòng tế bào ung thƣ đƣợc lấy từ Ngân hàng tế bào ung thƣ của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng RPMI bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò). Độc tính tế bào của các chất đƣợc thử bằng phƣơng pháp MTT theo các bƣớc sau: - Chuẩn bị: Các tế bào ở pha logarit đƣợc trypsin hóa và phân tán vào hỗn dịch đơn tế bào trong môi trƣờng RPMI bổ sung 10% FBS và điều chỉnh đến nồng độ khoảng 1,5.104 đến 3,5. 104 tế bào, sau đó chia đều vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng 200 µl. Các đĩa sau đó đƣợc ủ ở 37oC trong điều kiện 5% CO2. Sau 24 giờ ủ, các mẫu thử đƣợc chuẩn bị trong 20 µl môi trƣờng RPMI bổ sung 10% FBS từ dung dịch gốc 10 mg/mL trong dimethyl sulfoxid (DMSO) rồi thêm 2 µl mẫu thử vào các giếng ở nhiều nồng độ khác nhau, các đĩa này sau đó đƣợc ủ thêm 48 giờ. Tất cả các mẫu đƣợc chuẩn bị sao cho nồng độ cuối cùng của DMSO không quá 0,1%. - Tiến hành thử: Sau khi ủ 48 giờ, thêm vào mỗi giếng 20 µl thuốc nhuộm MTT (3(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid) với nồng độ MTT là 5 mg/mL trong muối đệm phosphat - PBS. Các đĩa đƣợc ủ thêm 3 giờ ở 37oC trong điều kiện 5% CO2. Tiếp theo, mỗi giếng đƣợc cho 100µl dung dịch DMSO, để 5 phút cho MTT formazan đƣợc hòa tan. Độ hấp thụ đƣợc đọc ở bƣớc sóng 510 nm. - Tính kết quả: Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó độ hấp thụ giảm đi 50% so với nhóm chứng (trắng âm tính là giếng chỉ thêm môi trƣờng nuôi cấy): kết

24

quả cuối cùng là giá trị trung bình của 4 lần đo độc lập với giá trị độ hấp thụ khác nhau không quá 5%. Giá trị IC50 đƣợc tính dựa trên phần mềm GraphPad Prism.

25

Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. NGHIÊN CỨU DOCKING Để tìm hiểu sơ bộ về khả năng tƣơng tác của các chất với mục tiêu phân tử là các HDAC, chúng tôi nghiên cứu và dự đoán năng lƣợng liên kết các chất trong thiết kế với trung tâm hoạt động của HDAC8. Kết quả năng lƣợng liên kết dự đoán đƣợc trình bày trong bảng 3.1. Bảng 3.1: Kết quả docking của các chất Va-i với HDAC8

Năng lƣợng tƣơng tác (kcal/mol)

STT

Chất

1

Va

-6.9

2

Vb

-7.1

3

Vc

-6.9

4

Vd

-6.8

5

Ve

-6.6

6

Vf

-6.8

7

Vg

-6.9

8

Vh

-6.4

9

Vi

-6.4

SAHA

-4.4

R

Nhận xét: Cả 9 chất thiết kế đều có năng lƣợng liên kết với trung tâm hoạt động của HDAC8 (-7,1 đến -6,4 kcal/mol) thấp hơn SAHA (-4,4 kcal/mol) chứng tỏ các chất này có ái lực với HDAC8 mạnh hơn SAHA. Điều này phù hợp với

26

hƣớng thiết kế tìm kiếm các chất có tác dụng ức chế HDAC nên chúng tôi tiếp tục tiến hành tổng hợp và thử tác dụng sinh học của dãy chất. Dƣới đây là hình ảnh minh họa bằng mô hình tƣơng tác của các chất với HDAC8 của chất Va, Vg (hình 3.1).

Hình 3.1: Mô hình tương tác của Va, Vg và SAHA với HDAC8 Chú thích: SAHA (màu vàng); Va (màu xanh dương), Vg(màu vàng nâu); Ion Zn2+ (màu xám)

3.2. TỔNG HỢP HÓA HỌC 3.2.1. Tổng

hợp

chất

N1-[5-(furan-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8-

hydroxyoctandiamid (Va) Chất Va đƣợc tổng hợp theo sơ đồ 3.1.

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất Va

3.2.1.1.

Tổng hợp chất IIa

Tổng hợp 2-(furan-2-ylmethyliden)hydrazincarbothioamid (IIa) từ furan-2carbaldehyd (Ia) đƣợc thực hiện bằng phản ứng ngƣng tụ với xúc tác là acid hữu cơ, tiến hành theo sơ đồ 3.2.

27

Sơ đồ 3.2: Tổng hợp chất IIa Tiến hành phản ứng: Cho 0,18ml (2mmol) furan-2-carbaldehyd (Ia) và 0,2180g (2,4mmol) thiosemicarbazid vào bình cầu 50 mL. Thêm 20 ml dung môi EtOH tuyệt đối và 2 giọt acid acetic băng làm xúc tác. Đun hồi lƣu và khuấy 300 vòng/phút trong 4h. Thu sản phẩm: Cất thu hồi dung môi bằng máy cất quay ở nhiệt độ 400C sau đó thêm 15 mL nƣớc cất để tủa sản phẩm. Lọc và rửa tủa 3 lần bằng 15 mL nƣớc cất. Sấy khô tủa ở 600C (trong khoảng 24h). Kết quả:  Cảm quan: Bột tinh thể màu trắng .  Hiệu suất: 90,5% (0,3059g).  T0nc: 165-1670C.  Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,66. Toàn bộ sản phẩm IIa đƣợc dùng để thực hiện bƣớc tiếp theo của quá trình tổng hợp chất Va. 3.2.1.2.

Tổng hợp chất IIIa

Thực hiện việc tổng hợp chất 5-(furan-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-amin (IIIa) từ IIa bằng phản ứng đóng vòng nội phân tử. Quá trình tổng hợp đƣợc thực hiện theo sơ đồ 3.3 [33].

Sơ đồ 3.3: Tổng hợp chất IIIa Tiến hành phản ứng: Cân 1,14g (3 mmol) muối sắt FeCl3.12H2O, hòa tan bằng 3 mL dung môi EtOH trong bình cầu 50 mL, gia nhiệt đến hồi lƣu. Đồng thời cân 0,1690g (1

28

mmol) chất IIa, hòa tan bằng 20 mL dung môi EtOH tuyệt đối trong cốc có mỏ, đun nóng khoảng 70ºC. Đổ dung dịch chất IIa từ cốc có mỏ vào bình phản ứng, tiếp tục đun hồi lƣu và khuấy 300 vòng/phút. Kết thúc phản ứng sau 3 giờ. Thu sản phẩm: Cất thu hồi bớt dung môi bằng máy cất quay ở nhiệt độ khoảng 400C trong 2 phút sau đó pha loãng hỗn hợp phản ứng bằng nƣớc cất. Kiềm hóa hỗn hợp bằng khoảng 10 mL dung dịch NaOH 30% (kiểm tra bằng giấy quỳ). Chiết 3 lần bằng cloroform (mỗi lần 5-10 mL), thu lớp dƣới. Gộp dịch chiết của 3 lần chiết lại với nƣớc muối bão hòa. Cất thu hồi dung môi của dịch chiết bằng máy cất quay ở nhiệt độ 400C đến khi hết dung môi, thu sản phẩm IIIa. Sấy sản phẩm ở 600C trong 4h. Kết quả:  Cảm quan: Bột kết tinh màu vàng nhạt.  Hiệu suất: 72,1% (0,1204g).  T0nc: 196-1970C.  Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,54. 3.2.1.3.

Tổng hợp chất IVa

Chất methyl 8-{[5-(furan-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]amino}-8-oxooctanoat (IVa) đƣợc tổng hợp từ chất IIIa bằng phản ứng acyl hóa của chất IIIa với acid suberic monomethyl ester. Quy trình tổng hợp đƣợc thực hiện nhƣ sau:

Sơ đồ 3.4: Tổng hợp chất IVa Tiến hành phản ứng: Cho 0,1620g (1 mmol) 1,1’-carbonyldiimidazol (CDI) và 1mL (1 mmol) acid suberic monomethyl ester vào bình cầu 50mL. Thêm 3mL dung môi DMF. Hoạt hóa trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi hỗn hợp trong bình phản ứng đã

29

hoạt hóa đủ thời gian, cho 0,1670g (1 mmol) chất IIIa vào bình phản ứng, gia nhiệt lên 600C, khuấy 300 vòng/phút trong vòng 24h. Thu sản phẩm: Làm lạnh bình phản ứng bằng nƣớc đá. Đổ từ từ 15 mL dung dịch HCl loãng, lạnh vào bình phản ứng, vừa đổ vừa lắc. Để yên 15 phút. Lọc và rửa tủa 3 lần bằng 15 mL dung dịch acid HCl loãng, lạnh. Sấy tủa ở 600C trong 24h. Kết quả:  Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng hơi hồng.  Hiệu suất: 57,0% (0,1921g).  T0nc: 228-2300C.  Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,72. 3.2.1.4.

Tổng hợp chất Va

Chất N1-[5-(furan-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8-hydroxyoctandiamid (Va) đƣợc tổng hợp bằng phản ứng giữa chất IVa với hydroxylamin hydroclorid. Tổng hợp chất Va đƣợc thực hiện nhƣ sau:

Sơ đồ 3.5: Tổng hợp chất Va Tiến hành phản ứng: Cho 0,1690g (0,5 mmol) chất IVa và 0,33g (5 mmol) hydroxylamin hydroclorid vào bình cầu 50 mL, thêm 20 mL dung môi MeOH, dùng siêu âm để tạo hỗn dịch đồng nhất. Đặt bình phản ứng trong hỗn hợp nƣớc đá và muối ăn, duy trì nhiệt độ dƣới 00C, khuấy 300 vòng/phút. Hòa tan 0,40g (10mmol) NaOH trong 5 ml nƣớc cất trong ống nghiệm và làm lạnh xuống dƣới 00C trong hỗn hợp nƣớc đá muối. Đổ dung dịch NaOH vào bình phản ứng, giữ nhiệt độ dƣới 00C, phản ứng kết thúc sau 1giờ. Theo dõi tiến

30

trình phản ứng và xác định thời điểm kết thúc bằng cách dùng dung dịch FeCl3 và TLC, cụ thể làm nhƣ sau: -

Acid hóa khoảng 0,1 mL hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch HCl loãng trên

khay sứ, sau đó nhỏ 1 giọt dung dịch FeCl3 5%, xuất hiện màu đỏ vang chứng tỏ đã có acid hydroxamic đƣợc tạo ra. -

Acid hóa khoảng 0,1 mL hỗn hợp phản ứng, kiểm tra TLC với pha động

DCM : MeOH (9:1). Kết thúc phản ứng khi ester ban đầu đã hết. Thu sản phẩm: Acid hóa hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch HCl loãng, lạnh điều chỉnh pH về khoảng 4-5 (kiểm tra bằng giấy quỳ vạn năng). Để qua đêm sau đó lọc và rửa tủa 3 lần bằng 15 mL dung dịch HCl loãng. Sấy tủa ở 600C trong 24h. Kết quả:  Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng.  Hiệu suất: 51,2% (0,0865g).  Kiểm tra bằng TLC và xác định cấu trúc (kết quả cụ thể đƣợc trình bày trong bảng 3.1 và phần 3.3).  T0nc: 198-2010C. 3.2.2. Tổng

hợp

chất

N1-[5-(5-bromofuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8-

hydroxyoctandiamid (Vb) Chất Vb đƣợc tổng hợp theo sơ đồ 3.6.

Sơ đồ 3.6: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất Vb

31

3.2.2.1.

Tổng hợp chất IIb

Tổng hợp chất IIb từ 0,3500g (2 mmol) chất 5-bromofuran-2-carbaldehyd (Ib) đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIa. Kết quả nhƣ sau: 

Cảm quan: Sản phẩm thu đƣợc là bột kết tinh màu trắng.



Hiệu suất: 85,0% (0,4216g).



T0nc: 171-1740C.



Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,65.

3.2.2.2.

Tổng hợp chất IIIb

Tổng hợp chất 5-(5-bromofuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-amin (IIIb) từ 0,2480g (1 mmol) chất IIb đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIIa. Kết quả nhƣ sau: 

Cảm quan: Bột kết tinh màu vàng nhạt.



Hiệu suất: 70,3% (0,1729g).



T0nc: 192-1940C.




3.2.2.3.

Tổng hợp chất IVb

Tổng

hợp

chất

methyl

8-{[5-(5-bromofuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-

yl]amino}-8-oxooctanoat (IVb) từ 0,2460g (1 mmol) chất IIIb đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IVa. Kết quả của quá trình nhƣ sau: 

Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng ngà.



Hiệu suất: 62,9% (0,2617g).



T0nc: 210-2120C.




3.2.2.4.

Tổng hợp chất Vb

Tổng hợp chất đích N1-[5-(5-bromofuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8hydroxyoctandiamid (Vb) từ 0,2080g (0,5 mmol) chất IVb đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất Va. Kết quả của quá trình nhƣ sau: 

Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng.

32



Hiệu suất phản ứng: 52,0% (0,1084g).



T0nc: 200-2030C.



Kiểm tra bằng TLC và xác định công thức (kết quả cụ thể đƣợc trình bày trong bảng 3.1 và phần 3.3).

3.2.3. Tổng hợp chất N1-hydroxy-N8-[5-(5-methylfuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol2-yl]octandiamid (Vc) Chất Vc đƣợc tổng hợp theo sơ đồ 3.7.

Sơ đồ 3.7: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất Vc

3.2.3.1.

Tổng hợp chất IIc

Tổng hợp chất IIc từ 0,2220g (2 mmol) chất 5-methylfuran-2-carbaldehyd (Ic) đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIa. Kết quả nhƣ sau: 




Hiệu suất: 86,6% (0,3170g).



T0nc: 169-1710C.




3.2.3.2.

Tổng hợp chất IIIc

Tổng hợp chất 5-(5-methylfuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-amin (IIIc) từ 0,1830g (1 mmol) chất IIc đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIIa. Kết quả nhƣ sau: 




Hiệu suất: 71,0% (0,1285g).



T0nc: 186-1890C.




33

3.2.3.3.

Tổng hợp chất IVc

Tổng

hợp

chất

methyl

8-{[5-(5-methylfuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-

yl]amino}-8-oxooctanoat (IVc) từ 0,1810g (1 mmol) chất IIIc đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IVa. Kết quả của quá trình nhƣ sau: 




Hiệu suất: 58,8% (0,2064g).



T0nc: 199-2020C.




3.2.3.4.

Tổng hợp chất Vc

Tổng hợp chất đích N1-hydroxy-N8-[5-(5-methylfuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol2-yl]octandiamid (Vc) từ 0,1800g (0,5 mmol) chất IVc đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất Va. Kết quả của quá trình nhƣ sau: 







T0nc: 178-1810C.




3.2.4. Tổng hợp chất N1-hydroxy-N8-[5-(thiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2yl]octandiamid (Vd) Chất Vd đƣợc tổng hợp theo sơ đồ 3.8.

Sơ đồ 3.8: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất Vd

34

3.2.4.1.

Tổng hợp chất IId

Tổng hợp chất IId từ 0,19mL (2mmol) chất thiophen-2-carbaldehyd (Id) đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIa. Kết quả nhƣ sau: 




Hiệu suất: 86% (0,3182g).



T0nc: 170-1720C.




3.2.4.2.

Tổng hợp chất IIId

Tổng hợp chất 5-(thiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-amin (IIId) từ 0,185g (1 mmol) chất IId đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIIa. Kết quả nhƣ sau: 

Cảm quan: Bột kết tinh màu vàng nâu.



Hiệu suất: 70,0% (0,1281g).



T0nc: 182-1840C.




3.2.4.3.

Tổng hợp chất IVd

Tổng hợp chất methyl 8-oxo-8-{[5-(thiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2yl]amino}octanoat (IVd) đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IVa. Kết quả của quá trình nhƣ sau: 

Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng .



Hiệu suất: 60,3% (0,2120g).



T0nc: 196-1980C.




3.2.4.4.

Tổng hợp chất Vd

Tổng hợp chất đích N1-hydroxy-N8-[5-(thiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2yl]octanediamid (Vd) từ 0,1775g ( 0,5 mmol) chất IVd đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất Va. Kết quả nhƣ sau: 







T0nc: 177-1780C.

35



Kiểm tra bằng TLC và xác định cấu trúc (kết quả cụ thể đƣợc trình bày trong bảng 3.1 và phần 3.3).

3.2.5. Tổng hợp chất N1-[5-(5-bromothiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8hydroxyoctandiamid (Ve) Chất Ve đƣợc tổng hợp theo sơ đồ 3.9.

Sơ đồ 3.9: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất Ve 3.2.5.1.

Tổng hợp chất IIe

Tổng hợp chất

IIe từ 0,24ml (2 mmol) chất 5-bromothiophen-2-

carbaldehyd (Ie) đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIa. Kết quả nhƣ sau: 




Hiệu suất: 90,1% (0,4757g).



T0nc: 175-1770C.




3.2.5.2.

Tổng hợp chất IIIe

Tổng hợp chất 5-(5-bromothiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-amin (IIIe) từ 0,2640g (1 mmol) chất IIe đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIIa. Kết quả nhƣ sau: 




Hiệu suất: 68,5% (0,1795g).



T0nc: 187-1900C.




36

3.2.5.3.

Tổng hợp chất IVe

Tổng hợp chất methyl 8-{[5-(5-bromothiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2yl]amino}-8-oxooctanoat (IVe) từ 0,2620g (1mmol) chất IIIe đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IVa. Kết quả của quá trình nhƣ sau: 




Hiệu suất: 55% (0,2376g).



T0nc: 203-2050C.




3.2.5.4.

Tổng hợp chất Ve

Tổng hợp chất đích N1-[5-(5-bromothiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8hydroxyoctandiamid (Ve) từ 0,2240g (0,5 mmol) chất IVe đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất Va. Kết quả của quá trình nhƣ sau: 







T0nc: 181-1830C.




3.2.6. Tổng

hợp

chất

N1-hydroxy-N8-[5-(5-methylthiophen-2-yl)-1,3,4-

thiadiazol-2-yl]octandiamid (Vf) Chất Vf đƣợc tổng hợp theo sơ đồ 3.10.

Sơ đồ 3.10: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất Vf

37

3.2.6.1.

Tổng hợp chất IIf

Tổng hợp chất

IIf từ 0,22ml (2 mmol) chất 5-methylthiophen-2-

carbaldehyd (If) đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIa. Kết quả nhƣ sau: 




Hiệu suất: 89,2% (0,3550g).



T0nc: 173-1760C.




3.2.6.2.

Tổng hợp chất IIIf

Tổng hợp chất 5-(5-mehtylthiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-amin (IIIf) từ 0,1990g (1 mmol) chất IIf đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIIa. Kết quả nhƣ sau: 




Hiệu suất: 71,3% (0,1405g).



T0nc: 183-1840C.




3.2.6.3.

Tổng hợp chất IVf

Tổng hợp chất methyl 8-{[5-(5-methylthiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2yl]amino}-8-oxooctanoat (IVf) từ 0,1970g (1mmol) chất IIIf đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IVa. Kết quả của quá trình nhƣ sau: 




Hiệu suất: 56,7% (0,2081g).



T0nc: 200-2030C.




3.2.6.4.

Tổng hợp chất Vf

Tổng

hợp

chất

đích

N1-hydroxy-N8-[5-(5-methylthiophen-2-yl)-1,3,4-

thiadiazol-2-yl]octandiamid (Vf) từ 0,1915g (0,5 mmol) chất IVf đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất Va. Kết quả của quá trình nhƣ sau: 





38



T0nc: 179-1800C.




3.2.7. Tổng

hợp

chất

N1-hydroxy-N8-[5-(pyridin-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-

yl]octandiamid (Vg) Chất Vg đƣợc tổng hợp theo sơ đồ 3.11.

3.2.7.1.

Sơ đồ 3.11: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất Vg Tổng hợp chất IIg

Tổng hợp chất IIg từ 0,19mL (2mmol) chất pyridin-2-carbaldehyd (Ig) đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIa. Kết quả nhƣ sau: 




Hiệu suất: 91,5% (0,3294g).



T0nc: 183-1850C.




3.2.7.2.

Tổng hợp chất IIIg

Tổng hợp chất 5-(pyridin-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-amin (IIIg) từ 0,1800g (1mmol) chất IIg đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIIa. Kết quả nhƣ sau: 




Hiệu suất: 69,0% (0,1228g).



T0nc: 193-1950C.




39

3.2.7.3.

Tổng hợp chất IVg

Tổng

hợp

chất

methyl

8-oxo-8-{[5-(pyridin-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-

yl]amino}octanoat (IVg) đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IVa. Kết quả của quá trình nhƣ sau: 




Hiệu suất: 59,1% (0,2057g).



T0nc: 221-2230C.




3.2.7.4.

Tổng hợp chất Vg

Tổng hợp chất đích N1-hydroxy-N8-[5-(pyridin-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2yl]octandiamid (Vg) từ 0,1772g ( 0,5 mmol) chất IVg đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất Va. Kết quả nhƣ sau: 







T0nc: 209-2110C.




3.2.8. Tổng

hợp

chất


yl]octandiamid (Vh) Chất Vh đƣợc tổng hợp theo sơ đồ 3.12.

Sơ đồ 3.12: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất Vh

40

3.2.8.1.

Tổng hợp chất IIh

Tổng hợp chất IIh từ 0,19mL (2mmol) chất pyridin-3-carbaldehyd (Ih) đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIa. Kết quả nhƣ sau: 




Hiệu suất: 88,4% (0,3182g).



T0nc: 185-1880C.




3.2.8.2.

Tổng hợp chất IIIh

Tổng hợp chất 5-(pyridin-3-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-amin (IIIh) từ 0,1800g (1mmol) chất IIh đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIIa. Kết quả nhƣ sau: 




Hiệu suất: 68,5% (0,1219g).



T0nc: 191-1940C.




3.2.8.3.

Tổng hợp chất IVh

Tổng

hợp

chất

methyl


yl]amino}octanoat (IVh) đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IVa. Kết quả của quá trình nhƣ sau: 




Hiệu suất: 57,4% (0,1998g).



T0nc: 218-2200C.




3.2.8.4.

Tổng hợp chất Vh

Tổng hợp chất đích N1-hydroxy-N8-[5-(pyridin-3-yl)-1,3,4-thiadiazol-2yl]octandiamid (Vh) từ 0,1772g ( 0,5 mmol) chất IVh đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất Va. Kết quả nhƣ sau: 







T0nc: 207-2100C.

41




3.2.9. Tổng

hợp

chất


yl]octandiamid (Vi) Chất Vi đƣợc tổng hợp theo sơ đồ 3.13.

3.2.9.1.

Sơ đồ 3.13: Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất Vi Tổng hợp chất IIi

Tổng hợp chất IIi từ 0,19mL (2mmol) chất pyridin-4-carbaldehyd (Ii) đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIa. Kết quả nhƣ sau: 




Hiệu suất: 87,8% (0,3161g).



T0nc: 186-1880C.




3.2.9.2.

Tổng hợp chất IIIi

Tổng hợp chất 5-(pyridin-4-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-amin (IIIi) từ 0,1800g (1mmol) chất IIi đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIIa. Kết quả nhƣ sau: 




Hiệu suất: 70,8% (0,1260g).



T0nc: 194-1970C.




42

3.2.9.3.

Tổng hợp chất IVi

Tổng

hợp

chất

methyl


yl]amino}octanoat (IVi) đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IVa. Kết quả của quá trình nhƣ sau: 




Hiệu suất: 57,0% (0,1984g).



T0nc: 222-2250C.




3.2.9.4.

Tổng hợp chất Vi

Tổng hợp chất đích N1-hydroxy-N8-[5-(pyridin-4-yl)-1,3,4-thiadiazol-2yl]octandiamid (Vi) từ 0,1772g ( 0,5 mmol) chất IVi đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất Va. Kết quả nhƣ sau: 







T0nc: 206-2080C.




3.2. KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT Độ tinh khiết các chất Va-i đƣợc kiểm tra bằng TLC và đo nhiệt độ nóng chảy (Tonc) của chúng. 

TLC đƣợc tiến hành trên bản mỏng silicagel 60 F254 tráng sẵn, quan sát dƣới

đèn tử ngoại ở bƣớc sóng 254 nm. Hòa tan trong dung môi DMF và sau đó khảo sát với các hệ dung môi triển khai. Kết quả thu đƣợc trên các sắc ký đồ đều thấy một vết rõ, gọn khi soi dƣới ánh sáng đèn tử ngoại. 

Đo nhiệt độ nóng chảy: 9 chất sau khi đƣợc tinh chế bằng cách kết tinh lại

đều có dạng tinh thể rắn đƣợc đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện (Electrothermal digital). Nhiệt độ nóng chảy và giá trị Rf đƣợc tóm tắt trong bảng 3.2.

43

Bảng 3.2: Giá trị Rf và T0nc của các chất Va-i

R

Hqui trình

T0nc (0C)

Rf Hệ DCM : MeOH (9:1)

STT

Chất

1

Va

19,0%

198-201

0,47

2

Vb

19,5%

200-203

0,45

3

Vc

19,8%

178-181

0,50

4

Vd

20,0%

177-178

0,52

5

Ve

17,6%

181-183

0,55

6

Vf

18,4%

179-180

0,51

7

Vg

20,3%

210-211

0,46

8

Vh

17,7%

207-210

0,51

9

Vi

18,7%

206-208

0,45

3.3. KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC Để khẳng định chắc chắn cấu trúc của các chất tổng hợp đƣợc, chúng tôi đã tiến hành đo phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lƣợng (MS) và phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR). 3.3.1. Phổ hồng ngoại (IR) Phổ hồng ngoại của các chất đƣợc ghi trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật làm viên nén KBr ghi trong vùng 4000-600 cm-1. Các phổ đồ có ở phụ lục.

44

Bảng 3.3: Số liệu phân tích phổ IR của Va-i

STT

Chất

1

Va

2

Vb

3

Vc

R

νO-H 3350

3416

Số sóng ứng với dao động hóa trị (cm-1) νC-H νC-H νN-H νC=O (-CH2;(benzen)

3152

νC=C

CH3)

2923 2865 2853

1637 1673

1567 1504 1465 1561 1499 1464

3245 3158

3025

2931 2858

1690 1638

3158

3032

2925 2856

1718 1694

1567 1552

1674 1637

1563 1461 1436

4

Vd

3361

3154

2931 2854

5

Ve

3411

3143

2933 2730

1692 1631

1565 1450

6

Vf

7

Vg

8

9

3163

3035

2914 2853

1692 1642

1612 1573

3231

3161

3022

2930 2855

1693 1667

1557 1435

Vh

3251

3155

3008

2911 2852

1695 1638

1576 1554

Vi

3265

3139

3009

2852

1701 1646

1602 1547 1441

Nhận xét: Số liệu phân tích phổ IR hoàn toàn phù hợp với các tài liệu tham khảo cũng nhƣ cấu trúc dự kiến của các chất Va-i cụ thể nhƣ sau: Các chất đích Va-i đều cho dữ liệu phổ phù hợp với các nhóm chức dự kiến trong công thức: Vùng 1612-1435 cm-1 đặc trƣng cho dao động C=C của vòng thơm, vùng 1718-1637 cm-1 đặc trƣng cho dao động C=O của nhóm carbonyl, vùng 30353008 cm-1 đặc trƣng cho dao động C-H trong vòng benzen, vùng 3361-3139 cm-1 đặc trƣng cho N-H và 3400 cm-1 cho O-H.

45

3.3.2. Phổ khối lƣợng (MS) Bên cạnh phƣơng pháp đo phổ IR, phƣơng pháp đo phổ khối lƣợng ở chế độ không phân mảnh ESI giúp khẳng định thêm cấu trúc của các chất tổng hợp đƣợc. Kết quả phân tích phổ MS trình bày trong bảng 3.4. Bảng 3.4: Số liệu phân tích phổ khối lượng của các chất

Chất

R

M

m/z

1

Va

338

337 [M-H]-

2

Vb

417

416 [M-H]-

3

Vc

352

351 [M-H]-

4

Vd

354

353 [M-H]-

5

Ve

433

432 [M-H]-

6

Vf

368

367 [M-H]-

7

Vg

349

348 [M-H]-

8

Vh

349

348 [M-H]-

9

Vi

349

348 [M-H]-

Nhận xét: Số liệu phổ MS ở bảng 3.4 cho thấy rằng các chất khảo sát đều có pic phân tử có số khối đúng bằng số khối dự kiến. 3.3.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) Để khẳng định chắc chắn hơn cấu trúc, chúng tôi tiến hành ghi phổ 1H-NMR và 13C-NMR của 9 chất tổng hợp đƣợc. Kết quả phổ 1H-NMR đƣợc trình bày trong bảng 3.5 và trong phụ lục.

46

Bảng 3.5: Số liệu phân tích phổ 1H-NMR

Chất

δ (ppm) (500 MHz, DMSO-d6)

R

10,35 (1H, s, NH); 7,93 (1H, s, H5”); 7,18 (1H, d, J = 3,0 Hz, H3”); 6,72 (1H, s, H4”); 2,47-2,48 (2H, t, J = 7,5Hz, 2H-7); Va

1,92-1,95 (2H, t, J = 7,5Hz, 2H-2); 1,58-1,61 (2H, t, J = 6,5 Hz, 2H-6); 1,47-1,49 (2H, t, J = 6,5Hz, 2H-3); 1,26-1,28 (4H, m, 2H-4, 2H-5). 12,70 (1H, s, NH); 10,33 (1H, s, NH); 7,23 (1H, d, J = 3,5 Hz,

Vb

H3”); 6,83 (1H, d, J = 3,5 Hz, H4”); 2,47-2,49 (2H, m, 2H-7); 1,92-1,95 (2H, m, 2H-2); 1,57-1,61 (2H, m, 2H-6); 1,45-1,51 (2H, m, 2H-3); 1,26-1,28 (4H, m, 2H-4, 2H-5). 12,64 (1H, s, NH); 10,36 (1H, s, NH); 7,04 (1H, d, J = 3,0Hz, H3”); 6,32 (1H, d, J = 3,0 Hz, H4”); 2,47-2,48 (2H, t, J = 7,0Hz,

Vc

2H-7); 2,36 (3H, s, CH3); 2,18 (1H, t, J = 7,5Hz, CH2); 1,93 (1H, t, J = 6,0Hz, CH2); 1,58-1,60 (2H, m, 2H-6); 1,46-1,48 (2H, m, 2H-3); 1,20-1,34 (4H, m, 2H-4, 2H-5). 12,65 (1H, s, NH); 10,34 (1H, s, NH); 8,67 (1H, s, OH); 7,75 (1H, d, J = 4,5 Hz, H5”); 7,69 (1H, d, J = 2,5 Hz, H3”); 7,19 (H,

Vd

s, H4”); 2,47-2,48 (2H, t, J = 7,0Hz, 2H-7); 1,92-1,95 (2H, t, J = 7,0Hz, 2H-2); 1,58-1,60 (2H, t, J = 6,0Hz, 2H-6); 1,47-1,49 (2H, t, J = 6,5Hz, 2H-3); 1,26 (4H, m, 2H-4, 2H-5). 12,68 (H, s, NH); 10,33 (1H, s, NH); 7,53 (1H, s, H3”); 7,30 (H,

Ve

d, J = 2,5Hz, H4”); 2,46-2,48 (2H, m, 2H-7); 1,90-1,93 (2H, t, J = 6,5Hz, 2H-2); 1,57 (2H, m, 2H-6); 1,46 (2H, m, 2H-3); 1,24 (4H, m, 2H-4, 2H-5). 12,57 (1H, s, NH); 10,34 (1H, s, NH); 7,45-7,46 (1H, d, J = 3,5 Hz, H3”); 6,87-6,88 (1H, d, J = 2,5 Hz, H4”); 2,45-2,48 (5H, m,

Vf

CH3, 2H-7); 1,92-1,95 (2H, t, J = 7,5Hz, 2H-2); 1,57-1,60 (2H, m, 2H-6); 1,46-1,49 (2H, m, 2H-3); 1,26-1,27 (4H, m, 2H-4, 2H-5).

47

12,73 (1H, s, NH); 10,44 (1H, s, NH); 9.12 (1H, d, J = 1,5Hz, H6”); 8,69 -8,70 (2H, OH, H5”); 8,32 (1H, d, J = 8,0Hz, H3”); 7,57 (1H, dd, J = 5,0Hz, J = 8,0Hz, H4”); 2,50-2,52 (2H, m, 2H-

Vg

7); 1,92-1,95 (2H, t, J = 7,0Hz, 2H-2); 1,58-1,62 (2H, m, 2H-3); 1,45-1,51 (2H, m, 2H-6); 1,25-1,27 (4H, m, 2H-4, 2H-5). 12,62 (1H, s, NH); 10,35 (1H, s, NH); 8,67 (2H, OH, H6”); 8,19 (1H, d, J = 7,5Hz, H4”); 7,98 (1H, t, J = 7,0Hz, H5”); 7,51 (1H, s, H2”); 2,50-2,48 (2H, m, 2H-7); 1,92-1,95 (2H, t, J = 7,0Hz,

Vh

2H-2); 1,59-1,62 (2H, t, J = 6,5Hz, 2H-3); 1,47-1,50 (2H, t, J = 6,5Hz, 2H-6); 1,20-1,27 (4H, m, 2H-4, 2H-5). 12,85 (1H, s, NH); 10,42 (1H, s, NH); 8,71 (3H, OH, H2”, H6”); 7,90 (2H, H3”, H5”); 2,50 (2H, 2H-7); 1,94 (2H, 2H-2); 1,60

Vi

(2H, 2H-3); 1,48 (2H, 2H-6); 1,26 (4H, 2H-4, 2H-5).

Nhận xét: Sự có mặt của các proton phù hợp với công thức của 9 chất Va-i. Trên phổ đồ có các pic đặc trƣng của các proton trong cả phần khung 5-aryl-1,3,4thiadiazol và proton của các nhóm chức, nhóm thế. Phổ 13C-NMR đƣợc trình bày trong bảng 3.6 và trong phụ lục. Bảng 3.6: Số liệu phân tích phổ 13C-NMR

Chất

Công thức

δ (ppm) (125 MHz, DMSO-d6) 171,66 (C5’); 169,10 (C8); 157,66 (C1); 152,38 (C2’);

Va

145,17-145,31 (C5”-C2’’); 112,52 (C3”); 110,75 (C3”); 34,80 (C7); 32,19 (C2); 28,21-28,25 (C3-C6); 24,40-24,93 (C4-C5).

Vb

171,71 (C5’); 169,13 (C8); 157,82 (C1); 151,33 (C2’); 147,07 (C2”); 124,45 (C5”); 114,59 (C3”); 113,57 (C4’’); 34,81 (C7); 32,21 (C2); 28,25-28,21 (C3-C6); 24,41-24,94 (C4-C5).

48

174,47 (C5’); 171,64 (C8); 157,15 (C1); 154,60 (C2’); 152,54 (C5’’); 143,57 (C2”);

Vc

108,85-112,03 (C3”-C4”);

34,81 (C7); 33,63 (C2); 32,21 (C3); 28,19 (C6); 24,31-24,95 (C4-C5); 13,38 (CH3). 171,61 (C5’); 169,10 (C8); 157,79 (C1); 156,10 (C2’); 132,32 (C2”); 129,00-129,11 (C5’’-C3”); 128,39 (C4”);

Vd

34,80 (C7); 32,21 (C2); 28,20-28,28 (C3-C6); 24,45-24,96 (C4-C5). 171,68 (C5’); 169,08 (C8); 158,08 (C1); 155,25 (C2’); 134,04 (C2”); 131,71-129,61 (C3’’-C4”); 114,73 (C5”);

Ve

34,79 (C7); 32,20 (C2); 28,27-28,22 (C3-C6); 24,95-24,43 (C4-C5). 171,58 (C5’); 169,18 (C8); 157,40 (C1); 156,2 (C2’), 142,97(C2”), 129,91(C5”), 129,10(C3”), 126,83(C4”), 34,81

Vf

(C7); 32,23 (C2); 28,28 (C3); 28,23 (C6); 24,47-24,97 (C4C5); 15,09 (CH3). 171,71 (C5’); 169,12 (C8); 163,48 (C1); 160,03 (C2’);

Vg

119,81-149,92 (C2”-6”); 34,89 (C7); 32,21 (C2); 28,2728,24 (C3-C6); 24,95-24,41 (C4-C5). 172,19 (C5’); 169,56 (C8); 159,39 (C1); 151,64 (C2’); 147,88 (C2”-C6”); 134,85(C3”); 127,00-124,80 (C4”-C5”);

Vh

34,89 (C7); 32,21 (C2); 28,27-28,24 (C3-C6); 24,95-24,41 (C4-C5). 171,86 (C5’); 169,10 (C8); 159,52 (C1); 150,70 (C2’-C2”C6”); 137,20 (C4”); 120,79 (C3”-C5”); 34,83 (C7); 32,19

Vi

(C2); 28,27-28,21 (C3-C6); 24,42-24,95 (C4-C5).

Nhận xét: Sự có mặt của các tín hiệu cộng hƣởng hạt nhân carbon phù hợp với công thức cấu tạo của 9 chất Va-i. Trên phổ đồ, các pic đặc trƣng của các carbon trong cả phần khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol và carbon của các nhóm chức, nhóm thế.

49

3.5. HOẠT TÍNH SINH HỌC 3.5.1. Tác dụng ức chế HDAC Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp đƣợc đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong các tế bào ung thƣ. Phân tích dựa trên Western blot có thể khẳng định đƣợc tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng. Thử nghiệm đƣợc tiến hành tại khoa Dƣợc, ĐH Chungbuk, Hàn Quốc. Kết quả ức chế HDAC của các chất đƣợc trình bày trong bảng 3.7.

Bảng 3.7: Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp

Tác dụng ức chế HDAC (1µM)

Chất

Va

+

Vf

-

Vb

+

Vg

+

Vc

-

Vh

+

Vd

+

Vi

+

Ve

-

SAHA*

+

Chất

R

R

(+): Có tác dụng ức chế; (-): Không ức chế; (*): Chuẩn dương tính

50

Tác dụng ức chế HDAC (1µM)

3.5.2. Hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro Thử độc tính tế bào in vitro đƣợc thực hiện tại Khoa Dƣợc, Trƣờng Đại học Chungbuk, Hàn Quốc theo phƣơng pháp MTT. Dòng tế bào thử nghiệm: SW620 (tế bào ung thƣ đại tràng ngƣời), MCF-7 (tế bào ung thƣ vú ngƣời), PC-3 (tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến ngƣời), AsPC-1 (tế bào ung thƣ tụy ngƣời). Kết quả giá trị IC50 của các chất trên 4 dòng tế bào đƣợc trình bày trong bảng 4.1 phần 4.3.

51

Chƣơng 4. BÀN LUẬN 4.1. TỔNG HỢP HÓA HỌC Các acid hydroxamic mang khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol đƣợc tổng hợp theo quy trình 4 bƣớc. Ở bƣớc đầu tiên, các thiosemicarbazon IIa-i đƣợc tạo nên bằng cách ngƣng tụ các benzaldehyd Ia-i với thiosemicarbazid. Phản ứng xảy ra dễ dàng và đạt hiệu suất cao. Bƣớc thứ 2, phản ứng tạo vòng nội phân tử của các chất IIa-i với tác nhân FeCl3 tạo thành các dẫn xuất 2-amino-5-aryl-1,3,4-thiadiazol (IIIa-i) [33]. Trong phản ứng này, tác nhân oxi hóa (ví dụ các acid Lewis nhƣ FeCl3, NH4Fe(SO4)2,...) đóng vai trò quan trọng.

Sơ đồ 4.1: Cơ chế phản ứng đóng vòng tổng hợp 2-amino-5-aryl-1,3,4-thiadiazol Bƣớc thứ 3, ghép nối IIIa-i với acid suberic monomethyl ester sử dụng CDI nhƣ một tác nhân hoạt hóa tạo ra IVa-i.

52

Sơ đồ 4.2: Cơ chế hoạt hóa của CDI Thực hiện bƣớc này dụng cụ phải khô hoàn toàn, các hóa chất và dung môi phải khan nƣớc do CDI dễ phân hủy dẫn đến không còn khả năng hoạt hóa acid monomethyl suberic nếu tiếp xúc với nƣớc. Bƣớc cuối cùng, phản ứng giữa ester IVa-i với hydroxylamin trong môi trƣờng kiềm cho ra sản phẩm cuối cùng Va-i. Để tránh phân hủy ester thành acid carboxylic bởi dung dịch NaOH đậm đặc, cần làm lạnh hỗn dịch IVa-i và NaOH trƣớc khi cho vào bình phản ứng. Phản ứng cũng cần thực hiện ở nhiệt độ thấp và thời gian ngắn để tránh phân hủy nhóm amid. Lƣợng NaOH phải dƣ để chuyển hết NH2OH.HCl thành NH2OH tan và đảm bảo acid hydroxamic tạo thành tan hết trong dung dịch phản ứng. 4.2. KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC 4.2.1. Phổ hồng ngoại (IR) Dữ liệu về phổ hồng ngoại của 9 chất tổng hợp đƣợc trình bày trong mục 3.3.1 và phổ đồ trong phần phụ lục. Chúng tôi tập trung phân tích phổ vùng nhóm chức để xác định sản phẩm tạo ra với các nhóm chức đặc trƣng. - Trên phổ đồ của một số chất (Vc, Ve) có thể quan sát thấy vân hấp thụ của dao động hóa trị O-H acid mạnh và tù (3400 cm-1). - Trong cấu trúc có 2 liên kết –NH-CO- nên phổ đồ của cả 9 chất đều xuất hiện 1-2 vân hấp thụ của dao động hóa trị N-H amid cũng nhƣ vân hấp thụ của dao

53

động hóa trị C=O amid. Các dao động νN-H có số sóng từ 3361-3139 cm-1, các dao động νC=O có số sóng từ 1718-1638 cm-1. - Phần cầu nối alkyl của các chất tổng hợp đƣợc cũng cho thấy sự có mặt trên phổ đồ với dao động hóa trị CH2 từ 2730-2933 cm-1. - Trên phổ đồ của các chất cũng quan sát thấy dao động hóa trị của các liên kết C=C vòng thơm từ 1602-1435 và C-H vòng thơm từ 3025-3008 cm-1. Việc quan sát đƣợc các vân hấp thụ đặc trƣng của các nhóm chức –OH, NH, –C=O và cầu nối alkyl cho thấy phản ứng tạo acid hydroxamic đã xảy ra. Chúng tôi tiếp tục phân tích các dữ liệu phổ khối lƣợng và phổ cộng hƣởng từ hạt nhân để khẳng định chắc chắn cấu trúc của các chất đã tổng hợp đƣợc. Dƣới đây là hình ảnh minh họa phổ hồng ngoại của chất Vb.

Hình 4.1: Phổ hồng ngoại của chất Vb 4.2.2. Phổ khối (MS) Các chất tổng hợp đƣợc đƣợc đo phổ khối lƣợng ở chế độ không phân mảnh ESI (-). Trên phổ đồ của mỗi chất đều xuất hiện một pic ion cƣờng độ mạnh, có số khối bằng [M-H]- đúng với từng chất (dữ liệu mục 3.3.1 và phụ lục). Dƣới đây là hình ảnh minh họa phổ khối lƣợng của chất Vb.

54

Hình 4.2: Phổ khối lượng của chất Vb 4.2.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) Để khẳng định chắc chắn cấu trúc, ngoài phổ hồng ngoại và phổ khối lƣợng, 9 chất đã tổng hợp đƣợc đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H, 13C. Dữ liệu phổ đƣợc trình bày trong mục 3.3.1 và phổ đồ ở phần phụ lục. Kết quả phổ đồ của cả 9 chất đều thể hiện sự có mặt của các dị vòng và cầu nối alkyl với đầy đủ tín hiệu proton và carbon. * Về phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H (1H-NMR)

- Các chất đều có cấu trúc chứa nhóm hydroxamic và liên kết amid nên quan sát thấy sự có mặt của proton –NH (δ = 10,33-12,85 ppm), -OH acid (δ = 8,67-8,71 ppm). H của –NHCO- vị trí 7 cộng hƣởng ở trƣờng yếu nhất với độ dịch chuyển hóa học trong khoảng 12,57-12,85 ppm, do hiệu ứng hút điện tử của vòng thiadiazol làm hạt nhân bị giảm sự chắn tại chỗ. H của –NH trong nhóm chức hydroxamic –NHOH linh động hơn trong môi trƣờng DMSO nên cộng hƣởng ở trƣờng mạnh hơn (δ = 10,33-10,42 ppm). Các proton này linh động và dễ bị trao

55

đổi hoặc hỗ biến nên ở một số chất không cho tín hiệu của proton trong –NH, -OH trên phổ đồ (Va, Vb, Vc, Ve, Vf). - Một nhóm các proton quan trọng trong cấu trúc của dãy chất là các proton mạch nhánh. Cả 9 chất đều thể hiện đủ số proton mạch nhánh với độ dịch chuyển trong khoảng 1,20-2,52 ppm. Các chất Vc, Vf có nhóm CH3 gắn trên dị vòng nên cho tín hiệu 3H dạng singlet ở vị trí 2,36-2,48 ppm. - Trên phổ đồ của dãy chất cũng quan sát đƣợc đầy đủ các proton trong dị vòng gắn với vòng thiadiazol. Ở dẫn chất dị vòng furan (Va-c), các proton thơm dao động trong khoảng 6,32-7,93 ppm; ở dẫn chất dị vòng thiophen (Vd-f), khoảng này là 6,87-7,75 ppm và đối với dị vòng pyridin (Vg-i) là 7,51-9,12 ppm. Dƣới đây là hình ảnh minh họa phổ 1H-NMR của chất Vd.

Hình 4.3: Phổ 1H-NMR của chất Vd

56

* Về phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C (13C-NMR) Phổ 13C-NMR có ƣu điểm là toàn bộ carbon trong phân tử các chất đều cho tín hiệu đƣợc tách rõ ràng dạng mũi tên đơn do đƣợc đo ở dạng phổ 13C khử hoàn toàn tƣơng tác spin-spin. - Hai carbon của khung thiadiazol (C2’, C5’) có độ dịch chuyển hóa học trong khoảng 171,58-172,19 ppm và 151,33-160,03 ppm. - Hai carbon trong nhóm carbonyl (C=O) (C1’, C8’) có độ dịch chuyển trong khoảng 157,15-169,65 ppm. - Các carbon trong dị vòng cũng đƣợc quan sát rõ: Dị vòng furan có 4C dao động trong khoảng 108,85-154,60 ppm, dị vòng thiophen có 4C dao động từ 114,73-142,97 ppm, dị vòng pyridin có 5C dao động từ 120,79-150,70 ppm. - Phần cầu nối alkyl cho tín hiệu cộng hƣởng của carbon trong khoảng 24,31-34,89 ppm. - Vc, Vf có thêm nhóm thế CH3 gắn trên dị vòng có dao động ở vị trí 13,3815,09 ppm. Dƣới đây là hình ảnh minh họa phổ 13C-NMR của chất Vb.

Hình 4.4: Phổ 13C-NMR của chất Vb

Từ những kết quả biện luận các loại phổ đồ, chúng tôi khẳng định đã tổng hợp đƣợc 9 chất có cấu trúc đúng nhƣ dự kiến và sản phẩm tinh khiết.

57

4.3. HOẠT TÍNH SINH HỌC Để hỗ trợ trong quá trình thiết kế cấu trúc và tìm hiểu khả năng gắn vào trung tâm hoạt động trên enzym HDAC của các chất, chúng tôi tiến hành nghiên cứu docking 9 chất Va-i. So sánh mô hình tƣơng tác với HDAC8 của các chất Va-i và SAHA có thể thấy phần cầu nối giữa nhóm khóa hoạt động và nhóm gắn với Zn2+ của 9 chất cũng nhƣ của SAHA có cấu trúc tƣơng đối giống nhau. Nhƣ vậy cầu nối với độ dài 6C của các chất tổng hợp đƣợc có nhiều khả năng đƣa đƣợc nhóm -NHOH tiến gần ion Zn2+ giống nhƣ SAHA. Bên cạnh đó, năng lƣợng liên kết của các chất Va-i với trung tâm hoạt động của HDAC8 đƣợc dự đoán từ -7,1 đến -6,4 kcal/mol, nghĩa là đều thấp hơn SAHA (-4,4 kcal/mol), chứng tỏ các chất có ái lực với HDAC8 mạnh hơn SAHA. Có thể sự thay đổi nhóm nhận diện bề mặt đã làm tăng lực liên kết của các chất với phần vành của enzym HDAC8. Tóm lại, kết quả docking cho thấy các chất Va-i phù hợp với hƣớng thiết kế cấu trúc nhằm tìm kiếm những chất có khả năng ức chế HDAC. Trên cơ sở đó chúng tôi đã tiếp tục tiến hành tổng hợp hóa học và thử tác dụng sinh học. Bƣớc đầu nghiên cứu hoạt tính sinh học, các acid hydroxamic tổng hợp đƣợc (Va-i) đƣợc đánh giá khả năng ức chế HDAC ở nồng độ 1M. Kết quả ở hình 4.5 cho thấy Va, Vb, Vd, Vg ức chế enzym rõ rệt tƣơng tự chất chuẩn dƣơng tính SAHA. Vh, Vi thể hiện tác dụng ở mức độ yếu và rất yếu, còn Vc, Ve, Vf hầu nhƣ không ức chế enzym HDAC. Kết quả thu đƣợc gợi ý rằng: 1) Các dị vòng (gắn vào vòng thiadiazol) đều cho khả năng ức chế HDAC mạnh, 2) Việc gắn thêm các nhóm thế vào dị vòng không thích hợp để ức chế enzym (gắn 5-Br, 5-CH3 vào thiophen hoặc 5-CH3 vào furan làm mất hẳn hoạt tính), 3) Tác dụng của dẫn chất pyridin phụ thuộc vào vị trí của N (N của pyridin càng xa vị trí gắn, khả năng ức chế HDAC càng giảm).

58

Hình 4.5: Kết quả phân tích Western blot của các chất Va-I (nồng độ thử 1 M)

Để có thể gây ra độc tính với tế bào ung thƣ, các chất phải thấm đƣợc qua màng sinh học tiếp cận với HDAC. Vì thế, chúng tôi tiếp tục tiến hành thử độc tính tế bào in vitro của 9 chất đã tổng hợp. Kết quả cho ở bảng 4.1. Bảng 4.1: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư người in vitro

Chất

R

KLPT SW620

IC50 (M)* MCF-7 PC-3

AsPC-1

Va

338

0,29

0,60

0,42

0,34

Vb

417

0,25

0,31

0,46

0,43

Vc

352

0,65

0,39

0,60

0,88

Vd

354

0,29

0,35

0,45

0,28

Ve

433

>20

>20

>20

>20

Vf

368

0,46

0,39

0,43

0,86

Vg

349

0,57

0,52

0,47

0,32

Vh

349

0,60

0,37

0,91

1,05

Vi

349

3,57

3,01

6,03

4,32

264

1,91

6,34

4,28

3,60

SAHA

*Nồng độ của chất gây ra sự giảm 50% số lượng tế bào, số liệu được lấy trung bình ba kết quả với độ lệch dưới 10%. SAHA: acid suberoylanilid hydroxamic.

Kết quả thử trên 4 dòng tế bào ung thƣ (SW620 (tế bào ung thƣ đại tràng ngƣời), MCF-7 (tế bào ung thƣ vú ngƣời), PC-3 (tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến

59

ngƣời), AsPC-1 (tế bào ung thƣ tụy ngƣời)) cho thấy tất cả các chất tổng hợp đƣợc

(trừ Ve) đều có độc tính mạnh trên cả 4 dòng tế bào thử nghiệm (IC50 từ 0,25-6,03 M), đặc biệt: - Trên dòng tế bào ung thƣ đại tràng (SW620), Va, Vb, Vd thể hiện tác dụng mạnh hơn SAHA 6-7 lần (với giá trị IC50 lần lƣợt là 0,29; 0,25 và 0,29 M, so với SAHA là 1,91M). - Cả Vb-d,Vf, Vh và Vi đều có giá trị IC50 trên MCF-7 từ 0,31-0,39M, mạnh hơn SAHA (6,34M) 16-20 lần. - Khả năng ức chế tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến (PC-3) của Va, Vb, Vd, Vf, và Vg mạnh hơn SAHA 9-10 lần (với IC50 từ 0,42-0,47M, so với SAHA 4,28M). - Tác dụng kháng tế bào ung thƣ tụy (AsPC-1) của Va, Vd, Vg (với IC50 từ 0,28-0,34M) cũng mạnh hơn SAHA 10-12 lần (IC50=3,60M). Kết quả này khá tƣơng đồng với kết quả thử tác dụng ức chế enzym HDAC: Ve không ức chế enzym HDAC có tác dụng gây độc tế bào kém nhất với IC50>20M trên cả 4 dòng tế bào, Vi cho IC50 cao hơn hẳn các chất còn lại 5-15 lần. Tuy nhiên, với các chất Vc, Vf, dù tác dụng ức chế HDAC không quan sát đƣợc ở nồng độ 1M trên mô hình thử nghiệm Western Blot nhƣng cho vẫn cho tác dụng kháng tế bào ung thƣ tƣơng đối mạnh. Đây là một kết quả thú vị cần đƣợc nghiên cứu thêm. Nhƣ vậy, các acid hydroxamic mang khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol tổng hợp đƣợc (Va-d, Vf-i) đều cho hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro mạnh. Việc gắn nhóm thế có hiệu ứng đẩy điện tử (5-CH3) vào dị vòng làm giảm nhẹ hoạt tính của dẫn chất: chẳng hạn với dẫn chất vòng furan, Vc (gắn thêm CH3) làm giảm tác dụng trên trên SW620, AsPC-1 hơn 2 lần so với Va (không có nhóm thế), thể hiện ở giá trị IC50 = 0,65; 0,88M (tƣơng ứng trên từng dòng tế bào) so với Va là IC50 = 0,29; 0,34M; kết quả tƣơng tự với dẫn chất 5-CH3 trên dị vòng thiophen. Gắn nguyên tử halogen với hiệu ứng hút điện tử (5-Br) gây ra các tác động khác nhau tùy thuộc vào dị vòng. Đối với dị vòng furan, nhóm thế hút điện tử (Br) không ảnh hƣởng nhiều thậm chí làm tăng nhẹ hoạt tính: IC50 trên SW620, MCF-7, PC3,

60

AsPC-1 của Vb gắn Br so với Va lần lƣợt là 0.25 và 0,29M; 0,31 và 0,60M; 0,46 và 0,42M; 034 và 0,43M. Trong khi, gắn 5-Br vào dị vòng thiophen (Ve) lại làm giảm hẳn hoạt tính (IC50>20M) so với Vd (không có Br). Có thể dự đoán rằng các nhóm thế trên vòng khiến cho cấu trúc phân tử của các chất trở nên cồng kềnh hơn và thay đổi sự phân bố điện tử trong vòng tạo hiệu ứng không gian làm cản trở, hoặc giảm lực liên kết của nhóm khóa hoạt động (vòng thơm) với kênh enzym của HDAC. Nguyên tử halogen (Br) khi gắn vào dị vòng furan và thiophen có thể làm giảm hoặc mất hoàn toàn khả năng liên kết hydro của dị tố trong vòng với phần vành (có thể là một yếu tố quan trọng với hoạt tính) gây tăng hoặc mất hoạt tính của dẫn chất. Tùy loại dị vòng để lựa chọn nhóm thế tạo ra sự phân bố điện tử và cấu trúc không gian phù hợp. Dị vòng pyridin nhìn chung có hoạt tính yếu hơn dị vòng furan và thiophen. Khả năng tác dụng của dị vòng pyridin phụ thuộc vào vị trí gắn vòng: N càng xa mạch nhánh tác dụng càng giảm (Vg có N ở vị trí ortho có IC50 trên PC3, AsPC-1 nhỏ hơn Vh (có m-N) 2-3 lần, và nhỏ hơn 5-7 lần IC50 của Vi (có p-N) trên cả 4 dòng tế bào thử nghiệm). So sánh hoạt tính của một số acid hydroxamic mang khung 5-aryl-1,3,4thiadiazol đã tổng hợp đƣợc (Va-i) với một số acid hydroxamic mang khung 5phenyl-1,3,4-thiadiazol đã công bố trên tạp chí Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry của tác giả Nguyễn Hải Nam và nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dƣợc trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội (bảng 4.1) [21] cho thấy nhìn chung các dẫn chất dị vòng cho hoạt tính tốt hơn vòng phenyl. Chẳng hạn, dẫn chất của dị vòng pyridin: Vh tác dụng mạnh hơn dẫn chất phenyl (10a) gần 5 lần trên MCF-7 (IC50(Vh) = 0,37M, IC50(10a) = 1,80M), Vg mạnh hơn 10a hơn 8 lần trên AsPC1 (với IC50 lần lƣợt là 0,32M và 2,71M). Có thể sự gia tăng các nguyên tố dị vòng (O, S) trong nhóm nhận diện bề mặt của 9 dẫn chất 5-aryl-1,3,4-thiadiazol mới tổng hợp đƣợc làm tăng tƣơng tác Van der Waals hoặc hydro của các chất với các acid amin trên miệng túi enzym HDAC, từ đó tăng cƣờng hoạt tính.

61

Bảng 4.2: So sánh tác dụng kháng tế bào ung thư của Va-d, Vf-h với một số dẫn chất acid hydroxamic mang khung 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol

MCF-7

IC50 (M) PC-3

AsPC-1

Va

0,60

0,42

0,34

Vb

0.132

0.191

0.179

Vc

0.139

0.211

0.311

Vd

0,35

0,45

0,28

Vf

0.144

0.159

0.316

Vg

0,52

0,47

0,32

Vh

0,37

0,91

1,05

Chất

R

10a

H

1,80

0,88

2,71

10b

2-Cl

1,23

1,42

0,63

10c

3-Cl

1,23

1,76

1,10

10d

4-Cl

0,73

0,84

1,34

10e

4-F

8,05

2,92

1,88

10f

4-Br

1,27

0,83

0,08

10g

4-CH3

20,78

14,90

6,38

10m

3,4-CH2OCH2-

2,15

2,54

3,04

6,34

4,28

3,60

SAHA

Nhìn chung, ngoại trừ Ve, 8 chất đã tổng hợp đƣợc đều bộc lộ tác dụng kháng ung thƣ rất tốt. Ngoài những qui luật chung đã đƣợc rút ra hoặc dự đoán, khả năng tác dụng của từng chất còn tùy thuộc vào từng dòng ung thƣ khác nhau (chẳng hạn, Va tác dụng trên SW620, PC3 mạnh hơn Vd, Vg, nhƣng yếu hơn trên MCF-7, AsPC-1 …). Điều này có thể phụ thuộc vào cấu trúc của từng loại tế bào ung thƣ,

62

loại và số lƣợng HDAC cũng nhƣ mức độ ảnh hƣởng của HDAC trên từng loại bệnh lý khác nhau.

63

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. KẾT LUẬN Từ những kết quả nghiên cứu trên có thể rút ra một số kết luận nhƣ sau:  Tổng hợp và khẳng định cấu trúc Đã tổng hợp đƣợc 9 dẫn chất acid hydroxamic mới:



N1-[5-(furan-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8-hydroxyoctandiamid (Va).

 N1-[5-(5-bromofuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8-hydroxyoctandiamid (Vb).

 N1-hydroxy-N8-[5-(5-methylfuran-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid (Vc).

 N1-hydroxy-N8-[5-(thiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid (Vd).  N1-[5-(5-bromothiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]-N8-hydroxyoctandiamid (Ve).

 N1-hydroxy-N8-[5-(5-methylthiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid (Vf).

 N1-hydroxy-N8-[5-(pyridin-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid (Vg).  N1-hydroxy-N8-[5-(pyridin-3-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid (Vh).  N1-hydroxy-N8-[5-(pyridin-4-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octandiamid (Vi). Đã khẳng định cấu trúc các chất tổng hợp đƣợc bằng phân tích các dữ liệu phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR.  Thử hoạt tính sinh học - Thử tác dụng ức chế HDAC bằng phân tích Western blot cho thấy các chất Va, Vb, Vd, Vg, Vh, Vi có hoạt tính ở nồng độ 1M. - Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro theo phƣơng pháp MTT cho thấy 8 chất Va-d, Vf-i có tác dụng mạnh trên cả 4 dòng tế bào thử nghiệm với IC50 = 0,25-6,03 M, trong đó Va, Vd có hoạt tính tốt nhất với IC50 = 0,280,60M.

64

2. KIẾN NGHỊ Kết quả nghiên cứu cho thấy các dẫn chất acid hydroxamic mang khung 5aryl-1,3,4-thiadiazol là các chất kháng ung thƣ rất triển vọng. Với kết quả này, chúng tôi xin kiến nghị: - Tiến hành thử độc tính của các dẫn chất Va-i trên các tế bào ung thƣ khác. Qua đó đánh giá các kết quả thu đƣợc làm cơ sở cho việc thử tác dụng in vivo. - Nghiên cứu tổng hợp thêm các dẫn chất mang khung 5-aryl-1,3,4thiadiazol khác hoặc thay thế khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol bằng các nhóm đẳng cấu điện tử và vòng thơm khác, và thử tác dụng sinh học của chúng.

65

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Hải Nam (2010), Liên quan cấu trúc và tác dụng sinh học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 2. Nguyễn Hải Nam (2012), Một số mục tiêu phân tử và ứng dụng trong nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung thư hiện nay, tr. 103-186, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 3. Đào Thị Kim Oanh (2013), Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học một số dẫn chất acid hydroxamic hướng ức chế enzym histon deacetylase, tr. 106-110, Luận án tiến sĩ, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Hà Nội. 4. Nguyễn Đình Triệu (2001), Các phương pháp phân tích vật lý và hóa lý, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. TIẾNG ANH 5. Ajamian F. et al. (2004), "Selective regulation of class I and class II histone deacetylases expression by inhibitors of histone deacetylases in cultured mouse neural cells", Neuroscience Letters, 365(1), p. 64-68. 6. Annemieke

J.M.,

et

al.

(2003),

"Histone

deacetylases

(HDACs):

characterization of the classical HDAC family", Biochem. J. , 370, p. 737–749. 7. Bradbury R.H. and Angibaud P. (2007), Cancer: Topics in medicinal chemistry, Springer Berlin, New York. 8. Chen P. C. et al. (2008), “Synthesis and structure-activity relationship of histone deacetylase (HDAC) inhibitors with triazole-linked cap group”, Bioorg. Med. Chem. Lett., 16, p. 4839-4853. 9. Dokmanovic M. and Marks P.A (2005), “Prospects: Histone deacetylase inhibitors”, Journal of Cellular Biochemistry, 96, p. 293-304. 10. Dow G.S. et al. (2008), “Antimalarial activity of phenylthiazolyl-bearing hydroxamate-based histone deacetylase inhibitors”, Antimicrobial agents and chemotherapy, 52, p. 3467-3477. 11. Edward S. and Douglas W.C. (2000), "Histone deacetylases, transcriptional control, and cancer", Journal of Cellular Physiology, 184(1), p. 1–16.

12. John R.S. and Collegues A. (2004), "Structural Snapshots of Human HDAC8 Provide Insights into the Class I Histone Deacetylases", The Journal of Structure, 12(7), p. 1325-1334. 13. Johnstone R.W. (2002), "Histone-Deacetylase Inhibitors: Novel Drugs for the Treatment of Cancer", Nature Reviews Drug Discovery, 1(4), p. 287-299. 14. Jones P. et al. (2006), "A series of novel, potent, and selective histone deacetylase inhibitors", Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 16(23), p. 5948-5952. 15. Khosravi-Far R. et al. (2008), "Programmed cell death in cancer progression and therapy, Advances in experimental medicine and biology", Springer: Berlin, 615. 16. Kozikowski A.P. et al. (2008), “Chemistry, biology and QSAR studies of substituted biaryl hydroxamates and mercaptoacetamides as HDAC inhibitors – Nanomolar-Potency inhibitors of pancreatic cancer cell growth”, ChemMedChem, 3, p. 487-501. 17. Kozikowski A.P. et al. (2008), “Use of the Nitrile oxide cycloaddition (NOC) reaction for molecular probe generation: A new class of enzyme selective histone deacetylase inhibitors showing picomolar activity at HDAC6”, J. Med. Chem., 51, p. 4370-4373. 18. Leiqiang H. et al (2014), “Design, synthesis and preliminary bioactivity studies of 1,2-dihydrobenzo[d]isothiazol-3-one-1,1-dioxide hydroxamic acid derivatives as novel histone deacetylase inhibitors”, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 22, p. 1529–1538. 19. Ma X. et al. (2009), "Identification of LIV1, a putative zinc transporter gene responsible for HDACi-induced apoptosis, using a functional gene screen approach", Mol Cancer Ther, 8(11), p. 3108-16. 20. Marson C.M et al. (2007), “Structure-activity relationships of aryloxyalkanoic acid hydroxamides as potent inhibitors of histone deacetylase”, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 17, p. 135-141.

21. Nam NH et al (2013), “Synthesis, bioevaluation and docking study of 5substitutedphenyl-1,3,4-thiadiazole-based

hydroxamic

acids

as

histone

deacetylase inhibitors and antitumor agents”, J Enzyme Inhib Med Chem. 22. Olson A.J. and Trott O. (2010), “AutoDock Vina: Improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization and multithreading”, J. Comput. Chem 31, p. 455-461. 23. Ruijter de A.J. et al. (2003), “HDACs: Characterization of classical HDAC family”, J.Biol.Chem., 370, p. 737-749. 24. Seto E. and Glozak M.A. (2007), "Histone deacetylases and cancer", Oncogene, 26, p. 5420-5432. 25. Tapadar S. et al. (2009), “Isoxazole moiety in the linker region of HDAC inhibitors adjacent to the Zn-chelating group: Effects on HDAC biology and antiproliferative activity”, Bioorg. Med. Chem. Lett., 19, p. 3023-3026. 26. Taddei M. et al (2013), “Lactam based 7-amino suberoylamide hydroxamic acids as potent HDAC inhibitors”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 24, p. 61–64. 27. Yang X.J. and Seto E. (2007), “HATs and HDACs: from structure, function and regulation to novel strategies for therapy and prevention”, Oncogene, 26, p. 5310–5318. 28. Vannini A. (2004), "Crystal structure of a eukaryotic zinc-dependent histone deacetylase, human HDAC8, complexed with a hydroxamic acid inhibitor", Proceedings of the National Academy of Sciences, 101(42), p. 15064-15069. 29. Verdin E. (2006), Histone deacetylases transcriptional regulation and other cellular functions, Cancer drug discovery and development, SpringerLink, Humana Press: Totowa, N.J. 30. Witt O., Deubzer H.E., Milde T., Oehme I. (2009), “HDAC family: What are the cancer relevant targets?”, Cancer Letters, 277, p. 8-21. 31. Zang C. et al. (2005), “Selective induction of apoptosis by histone deacetylase inhibitor SAHA in cutaneous T-cell lymphoma cells: Relevance to mechanism of therapeutic action”, J. Invest. Dermatol, 125, p. 1045-1052.

32. Zhang S. et al (2014), “A Novel Suberoylanilide Hydroxamic Acid Histone Deacetylase Inhibitor Derivative, N25, Exhibiting Improved Antitumor Activity in both Human U251 and H460 Cells”, Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 15 (10), p. 4331-4338. 33. Koutentis P.A. and Constantinides C.P. (2008), Comprehensive Heterocyclic Chemistry III, Elsevier Ltd., p591.

PHỤ LỤC Phụ lục 1-1 đến 1-9: Phổ IR của các chất Va-i Phụ lục 2-1 đến 2-9: Phổ MS của các chất Va-i Phụ lục 3-1 đến 3-9: Phổ 1H-NMR của các chất Va-i Phụ lục 4-1 đến 4-9: Phổ 13C-NMR của các chất Va-i

Phụ lục 1-1: Phổ hồng ngoại của chất Va

Phụ lục 1-2: Phổ hồng ngoại của chất Vb

Phụ lục 1-3: Phổ hồng ngoại của chất Vc

Phụ lục 1-4: Phổ hồng ngoại của chất Vd

Phụ lục 1-5: Phổ hồng ngoại của chất Ve

Phụ lục 1-6: Phổ hồng ngoại của chất Vf

Phụ lục 1-7: Phổ hồng ngoại của chất Vg

Phụ lục 1-8: Phổ hồng ngoại của chất Vh

Phụ lục 1-9: Phổ hồng ngoại của chất Vi

Phụ lục 2-1: Phổ khối lƣợng của chất Va

Phụ lục 2-2: Phổ khối lƣợng của chất Vb

Phụ lục 2-3: Phổ khối lƣợng của chất Vc

Phụ lục 2-4: Phổ khối lƣợng của chất Vd

Phụ lục 2-5: Phổ khối lƣợng của chất Ve

Phụ lục 2-6: Phổ khối lƣợng của chất Vf

Phụ lục 2-7: Phổ khối lƣợng của chất Vg

Phụ lục 2-8: Phổ khối lƣợng của chất Vh

Phụ lục 2-9: Phổ khối lƣợng của chất Vi

Phụ lục 3-1: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất Va

Phụ lục 3-2: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất Vb

Phụ lục 3-3: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất Vc

Phụ lục 3-4: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất Vd

Phụ lục 3-5: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất Ve

Phụ lục 3-6: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất Vf

Phụ lục 3-7: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất Vg

Phụ lục 3-8: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất Vh

Phụ lục 3-9: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất Vi

Phụ lục 4-1: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất Va

Phụ lục 4-2: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất Vb

Phụ lục 4-3: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất Vc

Phụ lục 4-4: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất Vd

Phụ lục 4-5: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất Ve

Phụ lục 4-6: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất Vf

Phụ lục 4-7: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất Vg

Phụ lục 4-8: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất Vh

Phụ lục 4-9: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất Vi

Tổng Hợp Và Thử Tác Dụng Sinh Học Của Một Số Acid Hydroxamic Mang Khung 5-Aryl-1,3,4-Thiadiazol Hướng Ức Chế Histon Deacetylase

Recommend Documents