Tổng Hợp Và Thử Tác Dụng Sinh Học Của Một Số Acid Hydroxamic Mang Khung 3-Methoxim-Isatin Hướng Ức Chế Histon Deacetylase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

-----  ------

LÊ THỊ THẢO

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 3-METHOXIM-ISATIN HƢỚNG ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI – 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

-----  ------

LÊ THỊ THẢO

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 3-METHOXIM-ISATIN HƢỚNG ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE LUẬN VĂN THẠC SỸ DƢỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ DƢỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 60720402 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. TS. Đào Thị Kim Oanh 2. PGS.TS. Nguyễn Hải Nam

HÀ NỘI – 2014

LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài “Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 3-methoxim-isatin hướng ức chế histon deacetylase”, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ của các thầy cô giáo, bạn bè và đồng nghiệp. Trƣớc tiên, tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS. Đào Thị Kim Oanh, PGS. TS. Nguyễn Hải Nam – những ngƣời thầy đã tận tâm hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện đề tài tại Bộ môn Hóa dƣợc – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội. Với lòng kính trọng và biết ơn, tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Huỳnh Kim Thoa – ngƣời Thầy đã tạo điều kiện cho tôi cơ hội đƣợc nâng cao kiến thức và có thời gian để thực hiện cơ hội đó. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên, các bạn sinh viên nhóm nghiên cứu Hóa dƣợc - Bộ môn Hóa dƣợc – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, các anh chị Khoa hóa học – Trƣờng đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Viện Hóa hợp chất thiên nhiên – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Trƣờng Đại học Quốc gia Chungbuk (Cheongji, Hàn Quốc) đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thực hiện đề tài này. Cuối cùng, xin gửi lời tri ân sâu sắc đến chồng, gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình học tập, làm việc và hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày 29 tháng 8 năm 2014

Lê Thị Thảo

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Trang

DANH MỤC HÌNH VẼ DANH MỤC BẢNG DANH MỤC SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ

1

Chƣơng 1. TỔNG QUAN

3

1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC)

3

1.1.1. Khái niệm HDAC

3

1.1.2. Phân loại HDAC

4

1.1.3. Mối liên quan giữa ung thƣ và sự hoạt động bất thƣờng của HDAC

5

1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC (HDACIs)

6

1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC

6

1.2.2. Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC

9

1.2.3. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC

9

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC

10

HƢỚNG ỨC CHẾ HDAC HIỆN NAY 1.3.1. Các nghiên cứu tổng hợp các acid hydroxamic trên thế giới

10

1.3.1.1. Thay đổi cầu nối

11

1.3.1.2. Thay đổi nhóm nhận diện bề mặt

16

1.3.2. Các nghiên cứu trong nƣớc

21

1.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP TỔNG HỢP ACID HYDROXAMIC

24

1.4.1. Tổng hợp acid hydroxamic từ ester

24

1.4.2. Tổng hợp acid hydroxamic từ acid carboxylic

25

Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP

26

NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU

26

2.2. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ

26

2.3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

27

2.3.1. Nội dung nghiên cứu

27

2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

28

2.3.2.1. Tổng hợp hóa học

28

2.3.2.2. Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết

28

2.3.2.3. Phương pháp phân tích cấu trúc

28

2.3.2.4. Phương pháp thử hoạt tính sinh học

29

2.3.2.5. Docking

31

2.3.2.6. Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất tổng hợp được

31

Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ

33

3.1. TỔNG HỢP HÓA HỌC

33

3.1.1. Tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin và dẫn chất (IIa-g)

33

3.1.1.1. Tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IIa)

34

3.1.1.2. Tổng hợp 5- fluoro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IIb)

34

3.1.1.3. Tổng hợp 5-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IIc)

34

3.1.1.4. Tổng hợp 5-bromoro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IId)

34

3.1.1.5. Tổng hợp 3-(methoxyimino)-5-nitro-2-oxoindolin (IIe)

35

3.1.1.6. Tổng hợp 3-(methoxyimino)-5-methyl-2-oxoindolin (IIf)

35

3.1.1.7. Tổng hợp 7-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IIg)

35

3.1.2. Tổng hợp ethyl-7-(3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat và dẫn

35

chất (IIIa – g) 3.1.2.1. Tổng hợp ethyl-7-(3-(methoxyimino)–2-oxoindolin-1-yl)heptanoat (IIIa)

36

3.1.2.2.

ethyl-7-(5-fluoro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-

36

3.1.2.3. Tổng hợp ethyl-7-(5-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat

36

Tổng

hợp

yl)heptanoat (IIIb)

(IIIc) 3.1.2.4.

Tổng

hợp

ethyl-7-(5-bromo-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-

37

3.1.2.5. Tổng hợp ethyl-7-(3-(methoxyimino)-5-nitro-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat

37

yl)heptanoat (IIId)

(IIIe)

3.1.2.6.

Tổng

hợp

ethyl-7-(3-(methoxyimino)-5-methyl-2-oxoindolin-1-

37

3.1.2.7. Tổng hợp ethyl-7-(7-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat

37

yl)heptanoat (IIIf)

(IIIg) 3.1.3. Tổng hợp N-hydroxy-7-(3-methoxyimino-2-oxoindolin-1-yl)heptanamid và

38

dẫn chất (IVa-g) 3.1.3.2.

Tổng

hợp

N-hydroxy-7-(5-fluoro-(3-methoxyimino)-2-oxoindolin-1-

39

N-hydroxy-7-(5-cloro-(3-methoxyimino)-2-oxoindolin-1-

39

N-hydroxy-7-(5-bromo-(3-methoxyimino)-2-oxoindolin-1-

39

N-hydroxy-7-(3-(methoxyimino)-5-nitro-2-oxoindolin-1-

39

3.1.3.6. Tổng hợp N-hydroxy-7-(3-(methoxyimino)-5-methyl-2-oxoindolin-1-

40

yl)heptanamid (IVb) 3.1.3.3.

Tổng

hợp

yl)heptanamid (IVc) 3.1.3.4.

Tổng

hợp

yl)heptanamid (IVd) 3.1.3.5.

Tổng

hợp

yl)heptanamid (IVe)

yl)heptanamid (IVf) 3.1.3.7.

Tổng

hợp

N-hydroxy-7-(7-cloro-(3-methoxyimino)-2-oxoindolin-1-

40

yl)heptanamid (IVg) 3.2. KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT

41

3.3. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC

42

3.3.1. Phổ hồng ngoại (IR)

42

3.3.2. Phổ khối lƣợng (MS)

43

3.3.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân

43

3.3.3.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR

44

3.3.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR

45

3.4. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC

47

3.4.1. Thử tác dụng ức chế histon deacetylase

47

3.4.2. Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro

47

3.5. KẾT QUẢ DOCKING

47

3.6. ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ GIỐNG THUỐC CỦA CÁC CHẤT TỔNG HỢP

49

Chƣơng 4. BÀN LUẬN

50

4.1. VỀ HÓA HỌC

50

4.1.1. Tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin và các dẫn chất (IIa-g)

50

4.1.2. Phản ứng tổng hợp dãy ester trung gian (IIIa-g)

50

4.1.3. Phản ứng tổng hợp dãy chất acid hydroxamic (IVa-g)

51

4.2. VỀ KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC

52

4.2.1. Phổ hồng ngoại

52

4.2.2. Phổ khối lƣợng

54

4.2.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân

55

4.2.3.1. Phổ 1H – NMR

56

4.2.3.2. Phổ 13C – NMR

61

4.3. VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC

64

4.3.1. Về tác dụng ức chế HDAC

64

4.3.2. Về tác dụng kháng tế bào ung thƣ in vitro

65

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

72

1. KẾT LUẬN

72

1.1. Về tổng hợp hóa học và khẳng định cấu trúc

72

1.2. Về hoạt tính sinh học

72

2. ĐỀ XUẤT

72

TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC PHỔ

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AsPC-1

Tế bào ung thƣ tụy

13

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C

C-NMR

DCM

Dicloromethan

DMF

Dimethylformamid

DMSO

Dimethyl sulfoxid

FDA

Cục quản lý dƣợc phẩm và thực phẩm Mỹ

HAT

Histon acetyl transferase

HDAC

Enzym histon deacetylase

HDACIs

Các chất ức chế HDAC

1

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H

H-NMR

IC50

Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào

IR

Phƣơng pháp phổ tử ngoại

LD50

Liều gây chết cho 50% số cá thể nghiên cứu

MCF-7

Tế bào ung thƣ vú

MeOH

Methanol

MS

Phổ khối lƣợng

NCI-H460

Tế bào ung thƣ phổi

NMR

Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân

PC-3

Tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến

SAHA

Acid suberoylanilid hydroxamic

SW620

Tế bào ung thƣ ruột kết

THF

Tetrahydrofuran

TLC

Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng

TSA

Trichostatin A

DANH MỤC HÌNH VẼ Tên hình

Trang

Hình 1.1: Sơ đồ cấu tạo nucleosom

3

Hình 1.2: Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC nhóm I, II, IV

4

Hình 1.3: Vai trò của HDAC trong sinh lý tế bào ung thƣ

5

H h 1.4: HDACIs có cấu trúc hydroxamat

10

Hình 1.5: Các dẫn chất thế 2’ của SAHA

12

Hình 1.6: Các dẫn chất -alkoxy của SAHA

12

Hình 1.7: Các dẫn chất 7-aminosuberoylamid hydroxamic acid

13

Hình 1.8: SAR của các dẫn chất acid hydroxamic hƣớng ức chế HDAC

14

Hình 1.9: Các dẫn chất amid ngƣợc của SAHA

14

Hình 1.10: Các dẫn chất có gắn thêm O, S vào cầu nối của SAHA

16

Hình 1.11: Các dẫn chất phenyl-hydroxamic tƣơng tự SAHA

16

Hình 1.12: Các aryl-hydroxamic tƣơng tự SAHA

17

Hình 1.13: Các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic

17

Hình 1.14: Các acid phenylthiazol hydroxamic tƣơng tự SAHA

18

Hình 1.15: Một số acid phenylthiazol hydroxamic

19

Hình 1.16: Dẫn chất acid phenylisoxazol-hydroxamic WR3018049

19

Hình 1.17: Dẫn chất 1,3,4-thiadiazol hydroxamic acid

19

Hình 1.18: Các dẫn chất 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol hydroxamic

20

Hình 1.19: Các dẫn chất 5-phenyl-1,3,4-oxadiazol hydroxamic

20

Hình 1.20: Cấu trúc N1-(2,5-dimethoxyphenyl)-N(8)-hydroxyoctandiamid

21

Hình 1.21: Cấu trúc các hydroxamic tƣơng tự SAHA với nhóm khóa hoạt động

22

benzothiazol Hình 1.22: Cấu trúc các hydroxamic tƣơng tự SAHA với nhóm khóa hoạt động

22

5-phenyl-1,3,4-thiadiazol Hình 1.23: Cấu trúc của các dẫn chất 3-oxim-isatin

24

Hình 3.1: Kết quả phân tích Western blot của các chất IVa – g

47

Hình 3.2: Kết quả docking của chất IVa và SAHA với HDAC8

48

Hình 3.3: Kết quả docking của chất IVa và SAHA với HDAC2

48

Hình 4.1: Hiện tƣợng hỗ biến của nhóm chức hydroxamic

53

Hình 4.2: Phổ hồng ngoại của chất IVa

54

Hình 4.3: Phổ khối lƣợng của chất IVa

55

Hình 4.4: Phổ 1H – NMR dãn rộng của IVa

57

Hình 4.5: Phổ 1H – NMR dãn rộng của IVg

58

Hình 4.6: Phổ cộng hƣởng từ 1H – NMR của 19e

59

Hình 4.7: Phổ cộng hƣởng từ 1H – NMR của IVe

59

Hình 4.8: a, Phổ 13C – NMR của chất IVf.

63

b, Phổ 13C – NMR dãn rộng của chất IVf Hình 4.9: Kết quả phân tích Western blot của 2 dãy chất 19a-g và IVa-g

64

Hình 4.10: Biểu đồ so sánh tác dụng kháng tế bào ung thƣ in vitro của các dẫn

67

chất IVa-g

DANH MỤC BẢNG Tên bảng

Trang

Bảng 1.1: Phân loại các chất ức chế HDAC

7

Bảng 1.2: Khả năng ức chế của một số HDACIs trên HDAC nhóm I, II, IV

8

Bảng 1.3: Hoạt tính ức chế HDAC và kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ

13

in vitro của các dẫn chất 7-aminosuberoylamid hydroxamic acid Bảng 1.4: Tác dụng kháng các tế bào ung thƣ in vitro của N25

21

Bảng 1.5: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro và tác dụng ức chế

23

enzym HDAC của các chất 18a-d Bảng 3.1: Kết quả tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin và dẫn chất

35

Bảng 3.2: Kết

7-(3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-

38

Bảng 3.3: Kết quả tổng hợp N-hydroxy-7-(3-methoxyimino-2-oxoindolin-1-

40

quả

tổng

hợp

ethyl

yl)heptanoatvà dẫn chất

yl)heptanamidvà dẫn chất Bảng 3.4: Giá trị Rf và Tnc của các chất IVa-g

41

Bảng 3.5: Kết quả phân tích phổ IR của các chất IVa-g

42

Bảng 3.6: Kết quả phân tích phổ khối lƣợng của các chất IVa-g

43

Bảng 3.7: Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các chất IVa-g

44

Bảng 3.8: Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các chất IVa-g

46

Bảng 3.9: Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất IVa-g theo quy tắc

49

Lipinsky Bảng 4.1: Bảng so sánh phổ cộng hƣởng từ 1H – NMR của 2 chất 19e và IVe

60

Bảng 4.2: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro của các chất IVa-g

66

Bảng 4.3: So sánh tác dụng kháng tế bào ung thƣ của 2 dãy IVa-g và 19a-g

69

Bảng 4.4: So sánh giá trị logP của các chất 19a-g và IVa-g

70

DANH MỤC SƠ ĐỒ Tê sơ đồ

Trang

Sơ đồ 1.1: Tổng hợp các dẫn chất -alkoxy của

24

Sơ đồ 1.2: Tổng hợp acid biaryl hydroxamic

25

Sơ đồ 1.3: Tổng hợp các acid phenylthiazol hydroxamic

25

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ phản ứng tổng hợp các dẫn chất mang khung 3-methoximisatin Sơ đồ 3.2: Sơ đồ phản ứng tổng hợp các chất IIa - g

33

Sơ đồ 3.3: Sơ đồ phản ứng tổng hợp các chất IIIa - g

36

Sơ đồ 3.4: Sơ đồ phản ứng tổng hợp các chất IVa-g

38

Sơ đồ 4.1: Cơ chế phản ứng thế ái nhân alkyl tạo IIIa-g

50

Sơ đồ 4.2: Phản ứng thế ái nhân acyl

51

Sơ đồ 4.3: Cơ chế phản ứng tổng hợp acid hydroxamic IVa-g từ ester

51

33

ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thƣ là bệnh khó có thể điều trị khỏi mặc dù đã có những tiến bộ vƣợt bậc trong y học trong hai thập kỷ qua. Theo ƣớc tính và thống kê của tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hàng năm có khoảng 9 – 10 triệu ngƣời mắc ung thƣ mới và một nửa trong số đó chết vì căn bệnh này. Chỉ tính riêng năm 2012 đã có 8,2 triệu ngƣời chết vì ung thƣ, đây trở thành căn bệnh gây tử vong nhiều nhất trên Thế giới [51]. Để giảm thiểu tỷ lệ tử vong trong ung thƣ, việc phòng và điều trị ung thƣ đóng vai trò vô cùng quan trọng. Với những tiến bộ trong y học, di truyền học và sinh học phân tử thế kỷ 21, đặc biệt khi tìm ra bản đồ gen ngƣời, điều trị ung thƣ đã có những bƣớc tiến mới trong phẫu thuật, xạ trị, điều trị hóa chất và gần đây nhất là điều trị ung thƣ hƣớng đích. Phƣơng pháp điều trị này có hiệu quả hơn và ít gây độc hơn so với các phƣơng pháp điều trị ung thƣ đã có trƣớc đó. Mục tiêu phân tử trong điều trị ung thƣ hƣớng đích bao gồm các enzym đặc hiệu, protein hoặc thụ thể khác nhau có liên quan đến sự phát triển tế bào ung thƣ, ví dụ nhƣ: proteasome, telomerase, histon deacetylase, hoặc protein kinase,... [12]. Nghiên cứu thuốc điều trị ung thƣ hƣớng đích hiện nay chủ yếu ở giai đoạn tiền lâm sàng, một số đang trong giai đoạn lâm sàng và số ít đã đƣợc FDA phê duyệt đƣa vào điều trị. Trong số đó, histon deacetylase (HDAC) là mục tiêu phân tử đem lại nhiều kết quả khả quan khi nghiên cứu, thiết kế và thử nghiệm lâm sàng các thuốc tác dụng hƣớng ức chế enzym này [5, 8, 33, 50]. Acid suberoylanilid hydroxamic (Vorinostat, Zolinza®) là chất ức chế HDAC đầu tiên đã đƣợc FDA cấp phép trong điều trị u lympho tế bào T dƣới da [37]. Bên cạnh đó, một số chất ức chế HDAC khác cũng đã đƣợc nghiên cứu và đang đƣa vào thử nghiệm lâm sàng nhƣ NVP-LAQ824, MS-275, cyclodepsipeptid FK-228,... Đáng ngạc nhiên, các chất ức chế HDAC thử nghiệm có hiệu quả điều trị cao và độc tính thấp đối với tế bào lành tính [33], vì thế hiện nay chất ức chế HDAC trở thành mục tiêu hấp dẫn và mang đầy tính khả quan trong công cuộc nghiên cứu tìm ra chất chống ung thƣ của các công ty dƣợc phẩm và các tổ chức chính phủ.

1

Tại Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, chúng tôi đã tiến hành thiết kế công thức và tổng hợp các chất ức chế HDAC. Trong các chất đã tổng hợp, nghiên cứu về hoạt tính sinh học của một số dẫn chất acid hydroxamic hƣớng ức chế histon deacetylase đã cho thấy có hoạt tính tốt trên tế bào ung thƣ trong thử nghiệm in vitro, đặc biệt là một số dẫy chất mang khung benzothiazol [1, 40, 41], 3-oximisatin [4]. Với mong muốn đem lại nhiều ứng viên lâm sàng để tìm ra thuốc điều trị ung thƣ mới, theo hƣớng nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 3-methoxim-isatin hướng ức chế histon deacetylase” với mục tiêu: 1. Tổng hợp N-hydroxy-7-(3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanamid và một số dẫn chất. 2. Thử tác dụng ức chế histon deacetylase và hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro trên một số dòng tế bào ung thƣ của các chất tổng hợp đƣợc.

2

Chƣơ g 1. TỔNG QUAN 1.2.

HISTON DEACETYLASE (HDAC)

1.2.1. Khái niệm HDAC Histon – một phần của cấu trúc nhiễm sắc thể, là các protein cơ bản giàu acid amin nhƣ lysine, arginin, đƣợc chia thành 5 nhóm chính (H1, H2A, H2B, H3, H4) [26]. Các cặp histon lõi (H2A, H2B và H3, H4) có 2 phần quan trọng: đuôi C nằm bên trong lõi và đầu N nằm bên ngoài nucleosom. Phần đầu N tận của histon, đặc biệt H3, H4 là nơi diễn ra rất nhiều quá trình biến đổi khác nhau trong phiên mã nhƣ acetyl hóa/deacetyl hóa lysin, methyl hóa lysin và arginin, phosphoryl hóa serin và ubiquinin, sumoyl hóa lysin [52].

Hình 1.1. Sơ đồ cấu tạo nucleosom [52] Histon có thể tồn tại ở một trong hai dạng đối lập nhau là acetyl hóa hoặc deacetyl hóa. Các enzym đóng vai trò trong sự chuyển đổi này là histon acetyl transferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC) [13, 50]. Histon acetyl transeferase (HAT) xúc tác chuyển nhóm acetyl từ acetyl coenzym A đến liên kết với nhóm ε-amino của lysine ở phần đầu N của histon, sự chuyển đổi này xảy ra nhiều hơn trên histon H3 và H4. Sự acetyl hóa histon làm tháo xoắn nhiễm sắc thể bằng cách trung hòa điện tích dƣơng của phần đầu N của histon, do vậy làm giảm ái

3

lực của histon với phần điện tích âm trên ADN [45]. Ngƣợc lại, histon deacetylase (HDAC) xúc tác việc loại bỏ nhóm acetyl của lysin ở phần đầu N của histon, dẫn đến nhiễm sắc thể bị đóng xoắn và ức chế quá trình phiên mã [18]. 1.1.2. Phân loại HDAC HDAC đƣợc bảo tồn trong quá trình tiến hóa và biểu hiện trong tổ chức của các sinh vật từ đơn bào nguyên thủy cho tới loài ngƣời. Hiện nay, 18 HDAC đƣợc tìm thấy và chia thành 4 nhóm: I, II, III và IV [13, 35]. HDAC nhóm I, II, IV là những enzym phụ thuộc Zn2+ và bị ức chế bởi các chất tạo phức chelat với Zn2+ [50], khác với các HDAC nhóm III có cơ chế hoạt động phụ thuộc cofactor NAD+. Các HDAC đều có trung tâm hoạt động gồm 2 phần chính: ion Zn2+ là coenzym của các HDAC và kênh enzym dạng túi hình ống. Cấu trúc túi rất linh động, có thể biến đổi để phù hợp với chiều dài của các cơ chất khác nhau. Trên miệng túi có 1 vành nhỏ đƣợc tạo nên từ 1 vài vòng xoắn protein, phần vành này sẽ tƣơng tác với nhóm nhận diện bề mặt của HDAC [25, 49].

Hình 1.2. Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC nhóm I, II, IV [25] (Ion Zn2+ biểu thị là hình tròn màu tím) HDAC không chỉ điều hòa các protein histon mà rất nhiều protein không histon cũng bị ảnh hƣởng bởi hoạt tính của các HDAC. Thuật ngữ các chất ức chế HDAC để chỉ các chất có khả năng ức chế HDAC “kinh điển” nhóm I, II và IV [9] – mục tiêu phân tử mà các nghiên cứu điều trị ung thƣ hƣớng đích đang tiến hƣớng đến.

4

1.1.3. Mối liên quan giữa u g thƣ và sự hoạt động bất thƣờng của HDAC Hoạt động của HDAC ảnh hƣởng tới quá trình acetyl hóa histon. Do đó, sự mất cân bằng trong hoạt động của enzym này có thể dẫn tới những thay đổi trong cấu trúc của NST và sự rối loạn điều hòa phiên mã các gen tham gia vào điều khiển chu trình tế bào, phân hóa và/hoặc gây chết tế bào, do đó dẫn đến ung thƣ [13]. Sự gia tăng bất thƣờng của HDAC1 và/hoặc HDAC2 và/hoặc HDAC6 đƣợc quan sát trong một số bệnh ung thƣ tạng đặc nhƣ ung thƣ tiền liệt tuyến, ung thƣ dạ dày, trực tràng, ung thƣ vú và ung thƣ não cũng nhƣ các bệnh lý ác tính về máu (bệnh bạch cầu tủy bào cấp, bạch cầu tế bào B, bệnh u lympho tế bào T ngoại vi, bệnh u lympho tế bào B) và bệnh u lympho da tế bào T. Việc tìm ra các cơ chất của HDAC là các protein nhƣ p53, GATA1, GATA2, E2F, Rb, Bc16, Gli1,… liên quan đến xu hƣớng gây ung thƣ và tiến triển của bệnh ung thƣ đã khẳng định vai trò của HDAC trong ung thƣ [16], chúng có liên quan đến nhiều giai đoạn điều hòa cơ bản của quá trình sinh học trong tế bào ung thƣ nhƣ chu trình tế bào, sự biệt hóa, sự chết tế bào theo chƣơng trình trình kể cả sự xâm lấn, sự di chuyển và sự tạo mạch [20, 28, 48, 50].

Hình 1.3. Vai trò của HDAC trong sinh lý tế bào ung thƣ [50] Nhƣ vậy ức chế quá trình phiên mã đƣợc điều hòa bởi sự gia tăng HDAC và có thể kiểm soát ung thƣ bằng cách ức chế hoạt động của HDAC, chính điều này đã mở ra tƣơng lai mới hứa hẹn hơn cho điều trị ung thƣ hƣớng đích.

5

1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC (HDACIs) 1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC Trichostatin (TSA) là dẫn chất hydroxamat tự nhiên đầu tiên có tác dụng ức chế trực tiếp HDAC đƣợc Yoshida và cộng sự phát hiện ra năm 1990 với tác dụng chống nấm. Sau đó, dựa vào những hiểu biết về mối liên quan giữa HDAC và ung thƣ đồng thời xác định đƣợc cấu trúc 3D của các HDAC, một số dẫn chất ức chế HDAC đã đƣợc nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng để ứng dụng trong điều trị ung thƣ [36]. Năm 2006 và 2009, SAHA (Vorinostat®, Merck) và Depsipeptid (Istodax®, Celgene) đã đƣợc FDA cấp phép dùng trong điều trị u lympho tế bào T dƣới da. Cho tới nay, nhiều HDACIs đƣợc tìm thấy có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp với cấu trúc đa dạng. Dựa vào những cấu trúc hóa học này, HDACIs đƣợc chia thành 5 nhóm: các acid hydroxamic, các peptid vòng, các acid béo, benzamid và các dẫn chất ceton (bảng 1.1). Mỗi nhóm HDACIs có những hạn chế riêng.Các acid hydroxamic là những chất bị chuyển hóa nhanh và ức chế không chọn lọc các HDAC. Các benzamid và các acid béo có hiệu lực hạn chế. Dẫn chất ceton dễ bị khử hóa trong huyết tƣơng. Trong khi các peptid vòng có cấu trúc phức tạp, khó tạo thành về mặt hóa học, gây ra sự chảy máu khó chữa và FK-228 trong cấu trúc có một phần liên kết với ion Zn2+ có chứa lƣu huỳnh không mong muốn [24]. Khi nghiên cứu về hoạt tính của HDACIs trên các HDAC kinh điển, các nhà khoa học nhận thấy hoạt tính sinh học của các HDACIs phụ thuộc vào khả năng liên kết với túi enzym và khả năng tạo phức với ion Zn2+ ở phần đáy kênh của các chất này. Do HDAC đƣợc bảo vệ trong túi enzym, hầu hết các HDACIs đều không thể ức chế chọn lọc riêng một HDAC nào, chúng có thể ức chế tất cả các HDAC hoặc ức chế đồng thời nhiều thành viên HDAC khác nhau (bảng 1.2).

6

Chất

Bảng 1.1.Phân loại các chất ức chế HDAC [18] Cấu trúc Chất Cấu trúc Các acid hydroxamic O

TSA (Trichostatin A)

O

O NHOH

Oxamflatin

NHOH

H N

O S

N

O

Acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA)

OH

O H N NHOH

O H N

NVP-LAQ824

NHOH N

O

HN

O

CBHA (Acid mcarboxycinnamic bishydroxamid)

Acid sulfonamid hydroxamic

Scriptaid Peptid vòng O

Depsipeptid (FK-228)

HN O

CH3 O

H N

NH

S S

CH3 CH3

H3C

O HN

O

CH3 O

Acipidin CHAP Benzamid O

MS-275

O

N H

H N

NH2

N

CI-994

O

Các acid béo O

Acid valproic

Phenyl butyrat

OH

Các dẫn chất ceton Trifluoromethyl ceton

Alphacetoamid

7

ONa O

Bảng 1.2. Khả năng ức chế của một số HDACIs trên HDAC nhóm I, II, IV [50] Nhóm I

HDAC10

HDAC11

nd

nd

nd

NVP-LAQ824

nd

nd

nd

Panbinostat

nd

nd

nd

Belinostat

nd

nd

nd

nd

Chất ức chế không chọn lọc

Depsipeptid

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

Apicidin Valproic acid

nd

Trapoxin

nd

nd

SB-429201

nd

Bispyridinum diene

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

SHI-1:2 R306465

nd

SB-379278A

nd

nd

PCI-34051 Cpd2

nd

nd

APHA derivaties

nd

nd

nd

Tubacin

nd

nd

nd

NCT-10a/14a Ghi chú:

nd

nd

MGCD0103

Mercaptoacetamide

HDAC6

Vorinostat (SAHA)

nd

HDAC9

nd

MS-275

HDAC7

nd

nd

HDAC5

HDAC4

HDAC8

HDAC3

HDAC2

HDAC1

nd

PCI-24781

Chất ức chế nhóm I

Nhóm IV

TSA

HDACIs

Chất ức chế nhóm II

Nhóm II B

Nhóm II A

nd nd nd Ức chế mạnh Ức chế yếu

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd nd

nd nd nd Không ức chế nd: không có dữ liệu công bố

Trong số các HDACIs, nhiều chất đang đƣợc nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng pha I, II hoặc III trên các đối tƣợng bệnh nhân ung thƣ máu, ung thƣ thể rắn hoặc ung thƣ các cơ quan khác trong cơ thể nhƣ: Phenyl butyrate, SAHA, LAQ824, Acid valproic, PXD101, ITF-2357, Depsipeptid, MS275, CI-994, Pyroxamid,… [36]. Những dữ liệu bƣớc đầu của các thử nghiệm lâm sàng cho thấy, HDACIs có hiệu quả tốt trong điều trị ung thƣ và độc tính thấp đối với các tế bào lành tính. Các

8

ƣu điểm trong lâm sàng này khiến HDACIs trở thành mục tiêu phân tử đầy hứa hẹn cho tƣơng lai điều trị ung thƣ và là hƣớng nghiên cứu khả quan cho các nhà khoa học. 1.2.2. Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC Có nhiều bằng chứng cho rằng HDACIs có tác dụng chống ung thƣ do tác động lên nhiều giai đoạn quan trọng của chu trình tế bào, làm mất sự điều hòa trong tế bào ác tính. Trong đó, các cơ chế chính quyết định hoạt tính chống ung thƣ của HDACIs là thúc đẩy sự biệt hóa, ức chế chu trình tế bào và gián tiếp gây ra sự chết tế bào theo chƣơng trình. Ngoài ra, HDACIs còn ức chế sự phát triển của khối u bằng cách ngăn cản cung cấp oxy và chất dinh dƣỡng, từ đó ức chế quá trình tạo mạch của khối u, làm giảm khả năng hình thành và sống sót của khối u; đồng thời làm tăng sự nhận dạng và hoạt hóa của tế bào miễn dịch, ngăn cản rõ rệt sự phát triển khối u ban đầu và sự di căn [5, 26]. 1.2.3. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC Các chất ức chế HDAC đƣợc chia thành nhiều nhóm khác nhau, nhƣng cấu trúc đều có các phần chính sau [2, 16, 38]:

CAP (C)

Cầu nối (B)

Nhóm gắn Zn2+ (A, ZBG)

Trong đó: -

Nhóm khoá hoạt động (capping group) hay vùng nhận diện bề mặt (C):

thƣờng là vòng thơm hoặc peptid vòng, nằm trên bề mặt của enzym. -

Cầu nối sơ nƣớc (B): thƣờng là các hydrocarbon thân dầu, nằm trong lòng

mạch enzym, quyết định sự phù hợp về cấu trúc của các chất với chiều dài kênh enzym. -

Nhóm gắn với Zn2+ trên vị trí tác dụng của các enzym HDAC (A) nhƣ acid

hydroxamic, các thiol, benzamid, mercaptoceton... quyết định tính đặc hiệu và hiệu lực tác dụng của các HDACIs. Cấu trúc tinh thể kết tinh của các HDAC cho thấy phần B, C và một phần của A nằm trong túi enzym, làm đầy khoảng trống trong lòng kênh enzym. Phần 9

còn lại của A tƣơng tác với phần vành trên bề mặt miệng túi enzym. Việc nghiên cứu thiết kế công thức cho các HDACIs mới đều dựa trên cấu trúc cổ điển này. 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC HƢỚNG ỨC CHẾ HDAC HIỆN NAY 1.3.1. Các nghiên cứu tổng hợp các acid hydroxamic trên thế giới Năm 1986, TSA đã đƣợc Morioka và cộng sự chứng minh tác dụng rất tốt trong việc làm giảm sự biệt hóa tế bào trong bệnh bạch cầu Friend và ức chế chu trình tế bào bình thƣờng ở cả pha G1 và G2 [53]. Bên cạnh đó, TSA có tác dụng ức chế mạnh, đặc hiệu với HDAC (Ki = 3,4nM) [46, 48] và đóng vai trò nhƣ chất ngăn cản sự di căn trong ung thƣ đại tràng. Tuy nhiên, hiện nay TSA chủ yếu dùng làm chất đối chiếu trong nghiên cứu tìm ra các chất ức chế HDAC mới [46] do việc sản xuất TSA rất tốn kém mà lại không hiệu quả (trải qua 20 bƣớc và hiệu suất 2%). Năm 2006, sau khi trải qua các pha trong tiến trình thử nghiệm lâm sàng, SAHA (Vorinostat, Zolinza) đã đƣợc FDA phê duyệt sử dụng trong điều trị u lympho da tế bào T, đƣợc chứng minh nhạy cảm với các dòng tế bào Hut78, HH, M [53]. Ngoài TSA, SAHA, nhiều dẫn chất acid hydroxamic ức chế HDAC khác đang đƣợc nghiên cứu và chia thành nhiều phân nhóm nhỏ: acid hydroxamic mạch thẳng, dẫn chất cinnamic, dẫn chất phenyl... (hình 1.4).

H h 1.4. HDACIs có cấu trúc hydroxamic 10

Cho tới nay, dẫn chất acid hydroxamic đã trở thành nhóm chất ức chế HDAC đƣợc nghiên cứu rộng rãi nhất, với nồng độ ức chế nằm trong khoảng micromol đến nanomol. Giống nhƣ các HDACIs khác, cấu trúc của các dẫn chất acid hydroxamic cũng gồm 3 phần chính: Nhóm khóa hoạt động (C), cầu nối sơ nƣớc (B) và nhóm gắn Zn2+(Zinc Binding Group, ZBG) là acid hydroxamic. Nhiều nghiên cứu đã thay đổi nhóm gắn Zn2+ này bằng nhiều nhóm chức khác với mong muốn tìm ra nhiều chất ức chế HDAC có hiệu lực. Tuy nhiên,khi thay nhóm chức hydroxamic bằng một số nhóm chức nhƣ sulfonamid, thiocarbonat, dithiocarbonat và trithiocarbonat, hoạt tính ức chế HDAC của các chất tổng hợp đƣợc đều giảm so với SAHA, thậm chí có chất còn không có hoạt tính [17, 24, 34]. Nhƣ vậy có thể thấy, các acid hydroxamic là nhóm có cấu trúc đơn giản, hoạt tính ức chế HDAC mạnh do rất dễ tạo phức với ion Zn2+. Tuy nhiên, cũng vì nhóm chức acid hydroxamic dễ tạo phức với ion Zn2+ của HDAC nên các dẫn chất này ức chế không chọn lọc cả HDAC nhóm I, II. Thêm vào đó, chúng bị chuyển hóa nhanh nên nửa đời in vivo ngắn [21, 38]. Chính vì vậy, rất nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới đang nỗ lực tìm kiếm các dẫn chất mới dựa trên phiên mẫu của TSA, SAHA và các dẫn chất acid hydroxamic đã tìm đƣợc trƣớc đó nhằm tìm ra sự liên quan về cấu trúc tác dụng của các dẫn chất này, phục vụ cho việc nghiên cứu thiết kế và tổng hợp các ứng viên lâm sàng mới cho điều trị ung thƣ. Một số nghiên cứu trên thế giới đã tiến hành thay đổi cấu trúc cầu nối và nhóm nhận diện bề mặt của SAHA và thu đƣợc các kết quả dƣới đây. 1.3.1.1. Thay đổi cầu nối Nhằm hiểu rõ hơn về vai trò của cầu nối trong cấu trúc hoạt động của các dẫn xuất acid hydroxamic tƣơng tự SAHA, nhóm nghiên cứu do Anton V. Bieliauskas (Mỹ) đứng đầu đã thiết kế và tổng hợp các hydroxamic khác nhau bằng cách gắn thêm các nhóm thế vào nguyên tử C liền kề với nhóm chức acid hydroxamic của SAHA (hình 1.5). Kết quả khi thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro cho thấy các dẫn chất thu đƣợc có hoạt tính giảm 800 – 1000 lần (IC50 = 3,2 - 226 µM) so với SAHA (IC50 = 0,09 µM) trong cùng thử nghiệm. Điều này cho thấy vùng không gian tham gia tạo phức với nhóm chức acid hydroxamic trong

11

trung tâm hoạt động của các HDAC có kích thƣớc rất hạn chế và các nhóm thế ở vị trí gần với nhóm chức này sẽ làm giảm hoạt tính của các HDACIs [14].

Hình 1.5. Các dẫn chất thế 2’ của SAHA Phân tích cấu tạo trung tâm hoạt động dạng túi của HDAC, nhóm nghiên cứu thuộc trung tâm nghiên cứu Sigma-Tau (Pomezia, Ý) đặc biệt chú ý phần miệng túi với các vòng acid amin có thể tham gia nhiều tƣơng tác quan trọng với nhóm nhận diện bề mặt hoặc các nhóm lân cận. Dựa trên cơ sở này, nhóm nghiên cứu đã thiết kế và tổng hợp dãy dẫn chất -alkoxy của SAHA (hình 1.6) [23]. Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế HDAC2 cho thấy tất cả các dẫn chất -alkoxy (dạng racemic) của SAHA đều cho giá trị IC50 ở mức rất thấp (0,05-0,5 µM), nhiều chất tác dụng tƣơng đƣơng SAHA. Kết quả này cho thấy các nhóm thế -alkoxy đã có hiệu quả tăng cƣờng tác dụng sinh học cho các dẫn chất này, có thể do chúng đã tạo thêm các tƣơng tác với các aminoacid thuộc vùng mép túi tại trung tâm hoạt động của enzym, đồng thời các dẫn chất -alkoxy có cầu nối với chuỗi alkyl có 6C cho hoạt tính tốt hơn so với cầu nối có chuỗi alkyl 5C. Đáng chú ý là cấu hình của nhóm chức alkoxy không ảnh hƣởng đến hoạt tính sinh học.

Hình 1.6. Các dẫn chất -alkoxy của SAHA [23] Một hƣớng thay đổi cầu nối của SAHA đƣợc thực hiện bởi các Maurizio Taddei và cộng sự (Italia) bằng cách gắn các lactam-carboxyamid vào C7 trong chuỗi alkyl của SAHA (hình 1.7) đã thu đƣợc kết quả rất đáng lƣu ý. Việc gắn lactam vào cầu nối này đã tăng cƣờng đáng kể tác dụng kháng tế bào ung thƣ in vitro. Nhiều dẫn chất đƣợc tạo ra có khả năng ức chế HDAC nhóm I, II B và IV với

12

IC50 ở mức nanomol, thấp hơn SAHA hàng trăm lần, điển hình là 2 dẫn chất 3a, 3b (bảng 1.3) [39].

Hình 1.7. Các dẫn chất 7-aminosuberoylamid hydroxamic acid Kết quả trên cho thấy sự có mặt của vòng amid trên C7 của cầu nối alkyl gần với nhóm khóa hoạt động có ảnh hƣởng đặc biệt lên ái lực với enzym. Có thể sự xuất hiện của vòng amid đã làm tăng thêm tƣơng tác với các acid amin ở lối vào trung tâm hoạt động của HDAC đem lại hoạt tính ức chế HDAC mạnh cho các dẫn chất này. Điều này đƣợc minh chứng khi tiếp tục nghiên cứu tác dụng kháng tế bào ung thƣ in vitro trên dòng tế bào H460, các dẫn chất 7-aminosuberoylamid hydroxamic acid cho hoạt tính rất mạnh, đặc biệt các chất 3a, 3b có IC50 = 0,5 µM, mạnh hơn SAHA 6 lần (bảng 1.3). Bảng 1.3. Hoạt tính ức chế HDAC và kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro của các dẫn chất 7-aminosuberoylamid hydroxamic acid [39]. Chất

HDAC (IC50, nM)

IC50, µM

HDAC1 HDAC2 HDAC3 HDAC8 HDAC6 HDAC10 HDAC11

H460

SAHA

258

921

350

243

29

456

362

3,4

3a

2

8

2

32,9

2

10,6

55,5

0,5

3b

7

27

11

52

3

30,3

15,5

0,5

Từ kết quả trên có thể nhận thấy 3a (ST8078AA1) là một chất dẫn đƣờng hấp dẫn, với các biến đổi đơn giản nhƣng tạo đƣợc đƣợc một chất kháng ung thƣ mới hƣớng ức chế HDAC đầy triển vọng. Dựa trên cấu trúc của SAHA, Andrianov Victor và cộng sự đã thiết kế hàng loạt các dẫn chất hydroxamic có cấu trúc amid hƣớng ức chế HDAC nhằm khảo sát 13

liên quan về mặt cấu trúc tác dụng của các dẫn xuất này. Nhóm nghiên cứu đã thay đổi cấu trúc nhóm nhận diện bề mặt của các HDACIs này bằng một loạt các aryl rất đa dạng, đồng thời thay đổi chiều dài của cầu nối sơ nƣớc theo số nhóm –CH2 và thu đƣợc kết quả về sự liên quan cấu trúc tác dụng của các dẫn chất này nhƣ sau: Liên kết amid quan trọng nhƣng không phải là then chốt

Acid hydroxamic cần thiết để gắn kết Zn2+ và hoạt tính

Độ dài mạch tối ƣu là 5 – 6 carbon

Các hợp chất thơm tốt hơn, đặc biệt là các liên kết không no

Hình 1.8. SAR của các dẫn chất acid hydroxamic hƣớng ức chế HDAC [11] Nhóm nghiên cứu thuộc công ty TopoTarget (Anh) đã thiết kế và tổng hợp gần 40 dẫn chất amid ngƣợc của SAHA (hình 1.9) [10]. Nhiều chất trong số này có hoạt tính ức chế HDAC tƣơng đƣơng, thậm chí mạnh hơn SAHA.

Hình 1.9. Các dẫn chất amid ngƣợc của SAHA Trong các dẫn chất ngƣợc của SAHA, hai chất đã đƣợc thử nghiệm mô hình ung thƣ in vivo trên chuột và cho kết quả rất khả quan, định hƣớng cho các nghiên cứu tiếp theo. Liên quan cấu trúc - tác dụng rút ra đƣợc từ các dãy chất này cho thấy những đặc điểm tƣơng tự SAHA, đó là: i) nhóm acid hydroxamic là cần thiết cho hoạt tính ức chế HDAC mạnh; ii) cầu nối 5-6 C là tối ƣu; iii) liên kết amid có vai trò trong tƣơng tác với trung tâm hoạt động song có thể thay đổi; iv) phần Ar là nhân thơm cho hoạt tính mạnh hơn, nếu có cầu nối giữa nhân thơm với nhóm amid thì cầu nối không no tốt hơn [10]. 14

Ngoài việc tiến hành gắn thêm các nhóm thế, nhiều nhà khoa học cũng tiến hành gắn thêm các nguyên tử nguyên tố khác C nhƣ O, S,…vào chuỗi alkyl trong cầu nối của SAHA (hình 1.10) và tiến hành khảo sát hoạt tính của các dãy dẫn chất này. Hầu hết hoạt tính ức chế HDAC của các dẫn chất này đều giảm so với SAHA trong cùng thử nghiệm, cụ thể nhƣ các nghiên cứu của nhóm Soon-Ai Kim và Dong Hoon Kim (Hàn Quốc). Nhóm nghiên cứu của Soon-Ai Kim đã nghiên cứu thiết kế và tổng hợp các dẫn chất oxo-SAHA (5) với nguyên tử O đƣợc thêm vào phần cầu nối alkyl của SAHA (hình 1.10). Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym cho thấy tất cả các chất tổng hợp đều có tác dụng ức chế HDAC với IC50 = 0,64 – 37,69 µM, thấp hơn so với SAHA trong cùng thử nghiệm [29]. Nhóm nghiên cứu của Dong Hoon Kim đã thay thế nhóm amid trong cầu nối của SAHA bằng nguyên tử S, thu đƣợc N-hydroxy-7-(2-naphthylthio) heptanomide (HNHA) (hình 1.10) có hoạt tính ức chế HDAC in vitro mạnh với IC50 = 0,1 µM, nhƣng vẫn chỉ bằng một nửa hoạt tính so với SAHA (IC50 = 0,05µM) [27]. Ngoài ra, khi thay thế S trong HNHA bằng O hoặc N với chiều dài của chuỗi alkyl là 5C hoặc 7C hoạt tính ức chế HDAC của các chất đều giảm [27]. Charles Marson và các cộng sự (Anh) đã tiến hành tổng hợp các dẫn chất aryloxyalkanoic acid hydroxamic (7) (hình 1.10) với mong muốn có thể làm tăng khả năng liên kết với miệng túi của kênh enzym nhờ liên kết hydro của O nằm giữa vòng thơm và chuỗi alkyl với các acid amin ở phần vành miệng túi, qua đó làm tăng hiệu lực của các HDACIs hƣớng ức chế HDAC. Kết quả thu đƣợc nhiều dẫn chất có hoạt tính in vitro mạnh, thậm chí mạnh hơn cả Trichostatin A và SAHA trong cùng thử nghiệm với IC50 = 0,9 - 70 nM, hoạt tính mạnh nhất là 7a (IC50 = 0,9nM) [38].

15

Hình 1.10. Các dẫn chất có gắn thêm O, S vào cầu nối của SAHA 1.3.1.2. Thay đổi nhóm nhận diện bề mặt Phần nhận diện bề mặt tại trung tâm hoạt động của HDAC chấp nhận một hệ vòng khá đa dạng, từ indol, benzofuran, quinolin, benzodioxol… Nhóm Nitơ trong cấu trúc của phần nhân thơm R có thể tạo liên kết Hydro với các nhóm aminoacid trong cấu trúc túi, tăng tƣơng tác với mép túi tại trung tâm hoạt động của HDAC, do đó tăng hoạt tính của các chất ức chế HDAC [23]. Vì vậy, các nghiên cứu khảo sát dẫn chất ức chế HDAC bằng cách thay đổi nhóm khoá hoạt tính (thay thế vị trí phenyl bằng các nhân thơm nhƣ benzothiazol, phenylthiazol, isoxazol...) trong SAHA có tính khả quan cao. Một số nghiên cứu trên thế giới về thay đổi nhóm khóa hoạt động của dãy chất này đã thu đƣợc những kết quả bƣớc đầu.  Các acid phenyl-hydroxamic tương tự SAHA Một loạt các dẫn chất thay đổi nhóm khóa hoạt động của SAHA bằng cách thay đổi vị trí của các nhóm thế khác nhau trên khung phenyl của SAHA đã đƣợc Chanaz Salmi – Smail và các cộng sự (Pháp) nghiên cứu thiết kế tổng hợp (hình 1.11). Đánh giá hoạt tính kháng ung thƣ in vitro trên các dòng tế bào ung thƣ ở ngƣời của các dẫn chất này, có nhiều chất có hoạt tính tƣơng đƣơng với SAHA, thậm chí mạnh hơn SAHA tới 10 lần nhƣ 8a [47].

Hình 1.11. Các dẫn chất phenyl-hydroxamic tƣơng tự SAHA Từ kết quả nghiên cứu, nhóm nghiên cứu nhận thấy bản chất nhóm thế hút (NO2, -CN, -F) hay đẩy điện tử (-NH2, -NMe2, -OH) trên khung phenyl không ảnh 16

hƣởng tới hoạt tính của các chất, tuy nhiên nhóm thế ở vị trí ortho làm giảm hoạt tính của các chất này. Điều này chứng tỏ sự cản trở về cấu trúc không gian và bản chất sơ nƣớc của các nhóm thế là yếu tố chủ yếu ảnh hƣởng tới hoạt tính kháng HDAC của các dẫn chất 8. Với căn cứ này, để tăng kích thƣớc vùng sơ nƣớc, nhóm nghiên cứu đã thay đổi nhóm phenyl của SAHA bằng các hệ vòng thơm khác nhau và thu đƣợc dẫn chất 9a (hình 1.12) có hoạt tính kháng HDAC in vitro mạnh hơn so với SAHA (EC50 = 1,2 µM) [47].

Hình 1.12. Các aryl-hydroxamic tƣơng tự SAHA Hai chất 8a và 9a đã đƣợc đánh giá độc tính trên các tế bào ung thƣ của bệnh nhân ung thƣ bạch cầu và các tế bào máu ngoại vi của ngƣời tình nguyện khỏe mạnh để so sánh với SAHA trong cùng thử nghiệm. Kết quả cho thấy 9a thể hiện khả năng điều trị tốt hơn so với 8a và SAHA. Vì thế, cùng với SAHA, các chất này đƣợc tiếp tục đánh giá hoạt tính kháng HDAC in vivo trên dòng tế bào ung thƣ bạch cầu ở chuột khi cho dùng thuốc bằng đƣờng uống. Đây là một trong những ứng viên khả quan để tiếp tục nghiên cứu sâu hơn trong điều trị ung thƣ, đặc biệt là ung thƣ bạch cầu [47].  Các acid biphenyl-hydroxamic tương tự SAHA Nhóm nghiên cứu của Alan P. Kozikowski đã tiến hành thiết kế và tổng hợp một dãy các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic tƣơng tự SAHA (hình 1.13).

Hình 1.13. Các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic Kết quả các dẫn chất biphenyl ức chế HDAC mạnh hơn SAHA trên 6 loại HDAC (HDAC1, 2, 3, 8, 6, 10) [30]. Khi gắn thêm nhóm -NH2 vào vị trí ortho trên vòng phenyl thứ 2 hoạt tính giảm, xong khi nhóm -NH2 này đƣợc acyl hóa bằng

17

những nhóm aminoacyl cồng kềnh, tác dụng ức chế HDAC lại đƣợc tăng cƣờng. Điều này chứng tỏ phần nhận diện bề mặt của trung tâm hoạt động của HDAC có thể chấp nhận nhiều nhóm có kích thƣớc lớn. Kết quả này cũng gợi ý các tƣơng tác đƣợc tạo lập thêm từ những nhóm aminoacyl này với các acid amin tại vành của túi hoạt động đã làm tăng ái lực đối với HDAC của các dẫn chất.  Các acid phenylthiazol-hydroxamic tương tự SAHA Các nhà khoa học thuộc Viện nghiên cứu quân đội Walter Reed (Mỹ) đã thiết kế và tổng hợp hàng trăm dẫn chất acid hydroxamic mang hợp phần phenylthiazol thay thế vào vị trí của phenyl của SAHA (hình 1.14), trong đó có nhiều chất có khả năng ức chế HDAC tƣơng đƣơng hoặc mạnh hơn SAHA [19]. Kết quả đánh giá tác dụng trên HDAC cho thấy dẫn chất WR301801 (11a) với nhóm khóa hoạt động là 3-aminophenyl-5-thiazolyl có tác dụng ức chế mạnh nhất với IC50 = 10,4 nM, mạnh hơn cả SAHA trên cùng thử nghiệm. Đồng phân vị trí của WR301801 là WR301826 (11b) (nhóm thế amino ở vị trí ortho) cũng có tác dụng mạnh tƣơng đƣơng SAHA [19].

Hình 1.14.Các acid phenylthiazol hydroxamic tƣơng tự SAHA Sử dụng hai chất WR301801 và WR301826 làm những chất dẫn đƣờng mới, nhóm nghiên cứu của Alan P. Kozikowski thuộc Đại học Illinois (Chicago, Mỹ) tiếp tục thiết kế dãy acid phenylthiazol-hydroxamic dẫn chất hóa dựa trên nhóm amino của vòng phenyl (hình 1.15) [30]. Kết quả cho thấy, khi nhóm amin thế trên vòng phenyl đƣợc acyl hóa bằng những nhóm cồng kềnh, tác dụng ức chế nhiều týp HDAC tăng. Tác dụng mạnh nhất thu đƣợc với dẫn chất 11d (hình 1.15). IC50 của dẫn chất này với HDAC2, HDAC3 thấp dƣới mức 0,2 nM. Kết quả thử độc tính trên 5 dòng tế bào ung thƣ tụy công bố với 11a, 11b, 11c cho thấy các dẫn chất này đều có IC50 nhỏ hơn 3 M [30]. 18

Hình 1.15. Một số acid phenylthiazol hydroxamic  Các acid isoxazol-hydroxamic tương tự SAHA Trong quá trình nghiên cứu các dẫn chất acid phenylthiazol-hydroxamic, nhóm nghiên cứu của Alan P. Kozikowski thuộc Đại học Illinois (Chicago, Mỹ) đã tổng hợp dẫn chất acid phenylisoxazol-hydroxamic WR3018049 (hình 1.16). Dẫn chất isoxazol này có tác dụng ức chế các HDAC1, 3 và 6 rất mạnh với IC50 thấp đến 0,002 nM [31].

Hình 1.16. Dẫn chất acid phenylisoxazol-hydroxamic WR3018049  Các dẫn chất 1,3,4-thiadiazol hydroxamic acid Nhóm nghiên cứu của Peng Guan (Trung Quốc) đã tiến hành tổng hợp các dẫn chất acid hydroxamic với nhóm khóa hoạt động là 1,3,4-thiadiazol (hình 1.17). Kết quả đánh giá tác dụng trên HDAC cho thấy nhiều chất có khả năng ức chế mạnh tƣơng đƣơng với SAHA, thậm chí mạnh hơn SAHA nhƣ 12a với IC50 = 0,089 µM [22].

Hình 1.17. Dẫn chất 1,3,4-thiadiazol hydroxamic Giữ nguyên nhóm khóa hoạt động 5-phenyl-1,3,4-thiazol, nhóm nghiên cứu của Harish Rajak (Ấn Độ) đã thiết kế tổng hợp dãy dẫn chất acid hydroxamic với cầu nối 2-amino pyrimidin, thu đƣợc 8 dẫn chất có nhóm thế khác nhau ở vị trí 2,3,4 trên nhóm phenyl của nhóm khóa hoạt động (hình 1.18). Tất cả các dẫn chất tổng hợp đều có hoạt tính mạnh hơn hoặc tƣơng đƣơng với SAHA, cụ thể nhƣ 13a, 19

13b đều có hoạt tính ức chế HDAC với IC50 = 0,007 µM; 13, 13c với IC50 = 0,008 µM [44].

Hình 1.18. Các dẫn chất 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol hydroxamic Kết quả docking của các dẫn chất 1,3,4-thiazol cho thấy 2 nguyên tử N trên nhóm khóa hoạt động này tạo liên kết hydro với các acid amin ở phần vành của miệng túi enzym. Điều này chứng tỏ nhóm khóa hoạt động có khung 1,3,4-thiazol có khả năng tƣơng tác rất mạnh với trung tâm hoạt động của HDAC, làm tăng hoạt tính của các chất.  Các dẫn chất 1,3,4-oxadiazol hydroxamic acid Trong quá trình tổng hợp các dẫn chất 1,3,4-thiazol, nhóm nghiên cứu của Harish Rajak cũng tiến hành tổng hợp các dẫn chất 5-phenyl-1,3,4-oxadiazol tƣơng tự (hình 1.19). Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế HDAC cho thấy các dẫn chất này cho thấy dãy dẫn chất này có khả năng ức chế mạnh từ 0,006 – 0,017 µM, trong đó mạnh nhất là chất 14 và 14a với IC50 = 0,006 µM [44].

Hình 1.19. Các dẫn chất 5-phenyl-1,3,4-oxadiazol hydroxamic Tƣơng tự nhƣ nhóm khóa hoạt động 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol, nhóm nghiên cứu nhận thấy nhóm khóa hoạt động 5-phenyl-1,3,4-oxadiazol tƣơng tác mạnh với các acid amin ở lối vào trung tâm hoạt động của kênh enzym theo tƣơng tác Van der Waals, làm tăng hoạt tính ức chế HDAC.

20

Gần đây nhất, Zhang Song cùng các cộng sự (Trung Quốc) đã đăng ký bằng sáng chế (CN 103159646) cho một dẫn chất mới của SAHA là N1-(2,5dimethoxyphenyl)-N(8)-hydroxyoctandiamid (N25) (hình 1.20) [54].

Hình 1.20. Cấu trúc N1-(2,5-dimethoxyphenyl)-N(8)-hydroxyoctandiamid Khi kiểm tra hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro, N25 cho thấy hoạt tính mạnh hơn SAHA trên các dòng tế bào ung thƣ phổi H460, A549, H1299 và ung thƣ thần kinh đệm U251 (bảng 1.4). Thêm vào đó, khi thử nghiệm trên chuột, N25 thấm qua đƣợc hàng rào máu não với độc tính thấp (LD50 = 240,84 mg/kg). Điều này mở ra hi vọng mới cho điều trị ung thƣ, đặc biệt là ung thƣ thần kinh đệm.

Chất N25

Bảng1.4. Tác dụng kháng các tế bào ung thƣ in vitro của N25 [54] IC50±SD (µM) U251

U87

T98G

H460

6,28±0,89 11,33±0,51 15,44±1,01 2,44±0,31

SAHA 6,32±1,27

6,41±0,08

10,04±2,00 5,16±0,97

A549

H1299

3,46±0,84 2,93±0,64 7,20±1,29 6,87±1,13

1.3.2. Các nghiên cứu tro g ƣớc Từ những năm 90 của thế kỷ trƣớc, rất nhiều nhà khoa học trên thế giới đã tập trung nghiên cứu và hàng trăm bài báo đã đƣợc công bố trong quá trình tìm kiếm các chất ức chế HDAC. Cho đến nay, bên cạnh 2 chất là vorinostat (Zolinza®) và Depsipeptid (Romidepsin®) đã đƣợc FDA phê duyệt sử dụng trong điều trị u lympho da tế bào T, còn có khoảng hơn 10 chất đang đƣợc nghiên cứu ở pha lâm sàng I, II. Ở Việt Nam, vẫn chƣa có nhà khoa học nào quan tâm đến thiết kế, tổng hợp các chất ức chế HDAC ngoài các công bố mà nhóm nghiên cứu tại Bộ môn Hóa dƣợc – Trƣờng Đại học Dƣợc đang tiến hành. Nhiều kết quả đã đƣợc công bố trong các tạp chí trong nƣớc và quốc tế, cũng nhƣ trong các khóa luận thạc sĩ, Dƣợc sĩ đại học.

21

Khi khảo sát hoạt tính ức chế HDAC của các chất có cấu trúc tƣơng tự SAHA với nhóm khóa hoạt động khác là benzothiazol, tác giả Đào Thị Kim Oanh đã chỉ ra rằng khi thay đổi nhóm nhận diện bề mặt là vòng benzothiazol thì độ dài cầu nối có 6 carbon là tối ƣu cho hoạt tính. Điều này cũng hoàn toàn phù hợp với một số nghiên cứu trƣớc đây về độ dài cầu nối của các hydroxamat tƣơng tự SAHA. Quan trọng hơn, kết quả ức chế HDAC2 còn cho thấy sự có mặt của vòng benzothiazol cho tác dụng tốt hơn. Cả 8 chất 16a-h ức chế HDAC2 với IC50 = 0,013 – 0,262 µg/ml, cao hơn cả SAHA (IC50 = 0,530 µg/ml) [6].

Hình 1.21. Cấu trúc các hydroxamic tƣơng tự SAHAvới nhóm khóa hoạt động benzothiazol [6] Nghiên cứu thiết kế dãy các hydroxamic tƣơng tự SAHA với nhóm thế là 5phenyl-1,3,4-thiadiazol (17) của nhóm nghiên cứu tại Bộ môn cũng thu đƣợc một số chất có triển vọng trong phát triển thuốc mới (hình 1.22) [1, 2, 6, 7].

Hình 1.22. Cấu trúc các hydroxamic tƣơng tự SAHAvới nhóm khóa hoạt động 5phenyl-1,3,4-thiadiazol Khi thử hoạt tính kháng tế bào in vitro của các dẫn chất 5-phenyl-1,3,4thiadiazol (17), chất 17b thể hiện độc tính mạnh trên cả 5 dòng tế bào, đặc biệt là chất có hoạt tính mạnh nhất trên 3 dòng tế bào SW620 (IC50 = 0,34 µM), AsPC-1 (IC50 = 0,63 µM), NCI-H460 (IC50 = 0,11 µM) so với các dẫn chất còn lại và có hiệu lực mạnh gấp 11, 6, 25 lần so với SAHA trên các dòng tế bào trên trong cùng

22

thử nghiệm. Ngoài ra, 17a có hoạt tính mạnh trên dòng tế PC-3 với IC50 = 0,88 µM, mạnh gấp 5 lần so với SAHA; 17c có hoạt tính mạnh trên dòng tế bào MCF-7 với IC50 = 0,73µM, mạnh gấp 9 lần so với SAHA. Điều này cho thấy các chất có cấu trúc 1,3,4 – thiadiazol ở giữa vòng phenyl và nhóm amid cho kết quả độc tính tốt hơn SAHA. Kết quả này tạo điều kiện cho nhóm nghiên cứu tiếp tục phát triển hƣớng nghiên cứu trong thiết kế công thức mới bằng việc giữ nguyên cấu trúc acid hydroxamic với dị vòng 5 cạnh 1,3,4-thiadiazol ở giữa vòng thơm và nhóm amid, và thay vòng phenyl bằng dị vòng chứa O hoặc S, các chất thu đƣợc cho những kết quả khả quan về độc tính trên tế bào và tác dụng ức chế HDAC, đặc biệt là chất 18c có khả năng kháng tế bào ung thƣ mạnh gấp 15 lần SAHA (bảng 1.5) [1]. Bảng 1.5. Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro và tác dụng ức chế enzym HDAC của các chất 18a-d IC50 (µM)1

18a

Tác dụng ức chế HDAC +

18b

+

0,28

18c

+

0,25

18d

+

0,65

+

3,7

Chất

R

SAHA

0,29

Chú thích: Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào. 1

Gần đây nhất, khi khảo sát các hydroxamic tƣơng tự SAHA với nhóm khóa hoạt động là 3-oxim-isatin, cầu nối 6C (hình 1.23), nhóm nghiên cứu ở Bộ môn đã thu đƣợc một loạt các dẫn chất có hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro mạnh hơn SAHA trên cả 5 dòng tế bào SW620, MCF-7, PC-3, AsPC-1, NCI-H460. Chất 19a có hoạt tính mạnh trên dòng tế bào AsPC-1 với IC50 = 0,08 µM, gấp 46 lần so với SAHA trong cùng tử nghiệm [4]. Nhƣ vậy, nhóm khóa hoạt động 3-oxim-isatin đã làm tăng hoạt tính của các chất ức chế HDAC tƣơng tự SAHA nhờ tăng tƣơng tác với các acid amin ở lối vào trung tâm hoạt động của kênh enzym.

23

Hình 1.23. Cấu trúc của các dẫn chất 3-oxim-isatin [4] Tiếp tục hƣớng nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính của dãy dẫn chất tƣơng tự SAHA với cầu nối 6 carbon nhƣng nhóm khóa hoạt động là 3-methoxim-isatin nhằm khai thác sự khác biệt ở phần miệng của kênh enzym khi thay đổi nhóm nhận diện bề mặt giữa các HDAC. Căn cứ vào các kết quả nghiên cứu đó, có thể thiết kế công thức làm tăng hoạt tính và tăng khả năng ức chế chọn lọc, nhằm đƣa ra các ứng viên thử tiền lâm sàng và lâm sàng cho điều trị ung thƣ. Cho tới hiện nay, chƣa có công bố nào sử dụng 3-methoxim-isatin làm nhóm khóa hoạt động thay thế cho phenyl trong SAHA, vì vậy nghiên cứu mà chúng tôi tiến hành trong luận văn là phù hợp với xu hƣớng nghiên cứu trên thế giới. 1.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP TỔNG HỢP ACID HYDROXAMIC 1.4.1. Tổng hợp acid hydroxamic từ ester Đây là phƣơng pháp đƣợc nhiều nhóm nghiên cứu ứng dụng để tổng hợp các acid hydroxamic. Hanessian và cộng sự [23], Andrianov và cộng sự [11], Marson và cộng sự [38] đều tổng hợp các acid hydroxamic từ dẫn chất methyl ester bằng cách cho phản ứng với dung dịch hydroxylamin trong hỗn hợp NaOH, MeOH ở điều kiện 0oC đến nhiệt độ phòng với hiệu suất khá cao (sơ đồ 1.1).

Sơ đồ 1.1. Tổng hợp các dẫn chất -alkoxy của SAHA [23] Tùy thuộc vào bản chất của chất tham gia phản ứng, điều kiện phản ứng và dung môi có thể thay đổi cho phù hợp. Trong nghiên cứu tổng hợp các acid hydroxamic có cầu nối chứa vòng triazol, Chen và cộng sự [15] tiến hành tổng hợp acid hydroxamic từ dẫn chất methyl ester với dung dịch hydroxylamin trong hỗn hợp KCN:THF (1:1) ở nhiệt độ phòng, hiệu suất phản ứng cũng rất cao (>80%). 24

1.4.2. Tổng hợp acid hydroxamic từ acid carboxylic Trong một số trƣờng hợp, phản ứng trực tiếp giữa dẫn chất methyl ester và hydroxylamin không thể xảy ra. Khi đó, nhiều nhóm nghiên cứu lựa chọn phƣơng pháp sử dụng tác nhân hoạt hóa acid carboxylic đồng thời sử dụng hydroxylamin có nhóm bảo vệ -OH để tăng khả năng phản ứng vào nhóm -NH2. Để tổng hợp các dẫn chất acid 5-pyridin-2-yl-thiophen-2-hydroxamic, Price và cộng sự đã sử dụng tác nhân hoạt hóa HATU để tạo ester hoạt hóa ngay trong phản ứng, đồng thời sử dụng hydroxylamin tetrahydropyran. Sau đó, nhóm bảo vệ OH đƣợc tách bởi acid p-TSA hoặc HCl 4M trong dioxan. Phản ứng trải qua 2 bƣớc do vậy hiệu suất tổng chỉ đạt đƣợc khoảng 40 – 50%.

Sơ đồ 1.2. Tổng hợp acid biaryl hydroxamic [43] Song song, nhiều tác nhân hoạt hóa khác cũng đƣợc các nhóm nghiên cứu sử dụng trong tổng hợp acid hydroxamic. Isobutyl cloroformat đƣợc Kozikowski và cộng sự [31] dùng trong phản ứng tổng hợp các acid phenylthiazol hydroxamic. Phản ứng tiến hành ở 0oC, tạo anhydrid hỗn tạp ngay trong phản ứng. Đây là tác nhân acyl hóa mạnh nên hydroxylamin phản ứng trực tiếp, không cần sử dụng loại có nhóm bảo vệ -OH. Tuy nhiên, hiệu suất phản ứng không cao, khoảng 26-30% (sơ đồ 1.3).

Sơ đồ 1.3. Tổng hợp các acid phenylthiazol hydroxamic [31]

25

Chƣơ g 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình tổng hợp đƣợc nhập từ Mecrk, Sigma – Aldrich và Trung Quốc. Bao gồm: TT

Nguyên liệu

Xuất xứ

TT

Nguyên liệu

Xuất xứ

1

Isatin

Aldrich

10

Pyridin

Merck

2

5-Fluoroisatin

Aldrich

11

Ethanol

Trung quốc

3

5-Cloroisatin

Aldrich

12

K2CO3

Trung quốc

4

5-Bromoisatin

Aldrich

13

KI

Trung quốc

5

5-Nitroisatin

Aldrich

14

Dimethylformamid

Merck

6

5-Methylisatin

Aldrich

15

Acid hydrocloric

Trung quốc

7

7-Cloroisatin

Aldrich

16

Natri hydroxid

Trung quốc

8

Methoxylamin HCl

Merck

17

Methanol

Trung quốc

9

Ethyl 7-Bromoheptanoat

Merck

18

Tetrahydrofuran

Merck

2.2. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ -

Các dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml, bình chiết, sinh

hàn hồi lƣu, ống nghiệm, ống đong, pipet, cốc có mỏ các loại. -

Bình sắc ký Camag, đèn tử ngoại Camag bƣớc sóng 254 nm và 365 nm, bản

mỏng silicagel F254 (Merck). -

Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimazu. Tủ lạnh, tủ sấy Memmert.

-

Máy cất quay Buchi R-210, máy siêu âm, máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC,

máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Gallenkamp Melting Point Apparatus. -

Máy đo phổ hồng ngoại: GX-Perkin Elmer-USA, khoa Hóa học - Trƣờng

Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. -

Máy đo phổ khối: Agilent 6310 Ion Trap LC/MS (Agilent Technologies),

Viện Hóa hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. -

Máy đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Bruker AC-500 MHz, Viện Hóa học -

Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 26

-

Máy đọc kết quả Western blot: molecular Imaging® ChemiDocTM XRS+ (với

phần mềm ImageTM) kết nối máy quét HP 4850. 2.3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Nội dung nghiên cứu  Tổng hợp 7 dẫn chất mang khung 3-methoxim-isatin:

N-hydroxy-7-(3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanamid

(IVa)

7-(5-fluoro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin)-N-hydroxyheptanamid

(IVb)

7-(5-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin)-N-hydroxyheptanamid

(IVc)

7-(5-bromo-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin)-N-hydroxyheptanamid

(IVd)

N-hydroxy-7-(3-(methoxyimino)-5-nitro-2-oxoindolin)heptanamid

(IVe)

N-hydroxy-7-(3-(methoxyimino)- 5-methyl-2-oxoindolin)heptanamid

(IVf)

7-(7-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin)-N-hydroxyheptanamid

(IVg)

 Khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp đƣợc dựa trên phân tích dữ liệu phổ khối (MS), phổ hồng ngoại (IR) và phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13CNMR).  Thử tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp đƣợc.  Thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro của một số dẫn chất có tác dụng ức chế HDAC mạnh.  Đánh giá mối liên quan cấu trúc – tác dụng và mức độ giống thuốc của các chất tổng hợp đƣợc. 2.3.2. Phƣơ g pháp ghiê cứu 2.3.2.1. Tổng hợp hóa học Tổng hợp 7 dẫn chất IVa-g bằng phƣơng pháp hóa học. Sơ đồ phản ứng tổng hợp đƣợc trình bày trong mục 3.1. 2.3.2.2. Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết

27

Sắc ký lớp mỏng: Dùng để theo dõi quá trình phản ứng, xác định thời điểm kết thúc phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm sau khi tinh chế. Sắc ký lớp mỏng đƣợc tiến hành trên bản mỏng silicagel Merck 60 (240 – 400 mesh) tráng sẵn, hoạt hóa ở 110oC trong 30 phút. Hệ dung môi DCM:MeOH (9:1). Mẫu thử đƣợc hòa tan trong dung môi thích hợp. Để bản mỏng trong bình sắc ký đã bão hòa dung môi ở nhiệt độ phòng, cho dung môi chạy khoảng 8 cm. Quan sát kết quả dƣới đèn tử ngoại ở bƣớc sóng 254 nm. Nhiệt độ nóng chảy: Đo bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Gallenkamp Melting Point Apparatus để kiểm tra độ tinh khiết của các dẫn chất. 2.3.2.3. Phương pháp phân tích cấu trúc Để phân tích, khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp, luận văn đã sử dụng các phƣơng pháp phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lƣợng (MS) và phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR).  Phổ hồng ngoại: Phổ hồng ngoại đƣợc tiến hành ghi trên máy GX-Perkin Elmer-USA với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000 - 600 cm-1. Ghi phổ ở độ phân giải 4 cm-1. Các mẫu rắn đƣợc phân tán tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ 1:200 rồi ép dƣới dạng film mỏng dƣới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm.  Phổ khối lượng: Phổ khối lƣợng đƣợc tiến hành ghi trên máy Agilent 6310 Ion Trap LC/MS (Agilent Technologies), Viện hóa hợp chất thiên nhiên – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.  Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Phổ NMR đƣợc đo trên máy cộng hƣởng từ hạt nhân Bruker AC-500 MHz, dung môi DMSO-d6. Phổ 1H-NMR đo ở tần số 500 MHz, phổ 13C-NMR đo ở tần số 125 MHz. Độ dịch chuyển hóa học (, ppm) đƣợc tính theo chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS), nhiệt độ ghi phổ khoảng 300oK. 2.3.2.4. Phương pháp thử hoạt tính sinh học  Thử tác dụng ức chế histon deacetylase Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp đƣợc đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong tế bào ung thƣ đại tràng 28

SW620. Phân tích dựa trên Western blot có thể khẳng định đƣợc tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng. a. Nguyên liệu và nuôi cấy tế bào: Các tế bào ung thƣ đại tràng SW620 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng RPMI (bổ sung L-glutamin, 10% huyết thanh bào thai bò (fetal bovine serum)), gọi là môi trƣờng nuôi cấy hoàn chỉnh (complete medium). Tất cả tế bào đƣợc ủ ở 37°C với 5% (w/v) CO2 và 95% (w/v) không khí. Trƣớc khi sử dụng, các mẫu thử nghiệm dạng bột đƣợc hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO) để tạo dung dịch gốc nồng độ 10 mg/ml. Các dung dịch gốc sau đó đƣợc pha loãng bằng môi trƣờng nuôi cấy hoàn chỉnh để tạo các dung dịch làm việc ở nồng độ 1 M. b. Phân lập histon và Western Blot Tế bào SW620 (khoảng 1 x 106) đƣợc ủ với mẫu thử trong 24 giờ, song song làm mẫu trắng (mẫu tế bào không ủ với mẫu thử). Sau đó, các tế bào đƣợc xử lý và rửa bằng dung dịch nƣớc muối sinh lý có đệm phosphat. Tế bào đƣợc dung giải trong dung dịch dung giải đệm [20 mM Tris-HCl (pH 7,5); 150 mM NaCl; 1 mM Na2EDTA; 1 mM EGTA; 1% triton; 2,5 mM Na pyrophosphat; 1 mM glycerophosphat; 1 mM Na3VO4; 1 g/ml leupeptin], ủ trong đá 15 phút. Hỗn dịch đƣợc ly tâm và phần dịch đƣợc thu hồi để tiến hành điện di trên gel. Histon đƣợc điện di qua gel SDS-PAGE 10% và chuyển vào màng PVDF. Các màng đƣợc ủ qua đêm cùng kháng thể 1 là kháng acetyl histon H3, kháng acetyl histon H4 (Milipore), tiếp theo ủ với kháng thể 2 là kháng thể IgG thỏ liên hợp peroxidase của ngựa trong 2 giờ. Các dải có phản ứng dƣơng tính đƣợc phát hiện nhờ sự phát quang đã đƣợc tăng cƣờng. Các thí nghiệm đƣợc làm lặp lại ít nhất 3 lần một cách độc lập.  Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro Thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ ngƣời in vitro đƣợc thực hiện tại Khoa Dƣợc, Trƣờng Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phƣơng pháp MTT [12, 15] và giá trị IC50 đƣợc tính trên phần mềm GraphPad Prism. D ng tế bào thử nghiệm: -

SW620: tế bào ung thƣ đại tràng

-

MCF-7: tế bào ung thƣ vú 29

-

AsPC-1: tế bào ung thƣ tụy

-

PC-3: tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến

-

NCI-H460: tế bào ung thƣ phổi

Các dòng tế bào ung thƣ đƣợc lấy từ Ngân hàng tế bào ung thƣ của Viện nghiên cứu sinh học và công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium với dòng tế bào MCF-7) hoặc RPMI (với dòng 4 tế bào còn lại) bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò). Độc tính tế bào của các chất đƣợc thử bằng phƣơng pháp MTT theo các bƣớc sau: Bước 1: Chuẩn bị Các tế bào ở pha logarit đƣợc trypsin hóa và phân tán vào hỗn dịch đơn tế bào trong môi trƣờng DMEM hoặc RPMI bổ sung 10% FBS và điều chỉnh đến nồng độ khoảng 1,5.104 đến 3,5.104 tế bào, sau đó chia đều vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng 200l. Các đĩa sau đó đƣợc ủ ở 37oCtrong điều kiện 5% CO2. Sau 24 giờ ủ, các mẫu thử đƣợc chuẩn bị trong 20l môi trƣờng DMEM/RPMI bổ sung 10% FBS từ dung dịch gốc 10 mg/ml trong dimethyl sulfoxid (DMSO) rồi thêm 2 l mẫu thử vàocác giếng ở nhiều nồng độ khác nhau, các đĩa này sau đó đƣợc ủ thêm 48 giờ. Tất cả các mẫu đƣợc chuẩn bị sao cho nồng độ cuối cùng của DMSO là 0,1%. Bước 2: Tiến hành thử Sau khi ủ 48 giờ, thêm vào mỗi giếng 20 l thuốc nhuộm MTT (3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) nồng độ 5 mg/ml trong PBS. Các đĩa đƣợc ủ thêm 3 giờ ở 37oCtrong điều kiện 5% CO2. Tiếp theo, mỗi giếng đƣợc cho 100 l dung dịch MTT trong DMSO, để 5 phút cho thuốc nhuộm MTT đƣợc hòa tan. Độ hấp thụ đƣợc đọc ở bƣớc sóng 510nm. Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó, độ hấp thụ giảm đi 50% so với nhóm chứng (trắng âm tính là giếng chỉ thêm môi trƣờng nuôi cấy): kết quả cuối

30

cùng là giá trị trung bình của 4 lần đo độc lập với giá trị độ hấp thụ khác nhau không quá 5%. 2.3.2.5. Docking Để kiểm tra sơ bộ tính tƣơng tác của các chất tổng hợp đƣợc với HDAC, chất IVa đã đƣợc tiến hành docking. Quá trình docking đƣợc thực hiện tại phòng nghiên cứu cấu trúc Đại học quốc gia Seul, Hàn Quốc, sử dụng mạng lƣới cấu trúc của HDAC8, HDAC2 tƣơng tác với SAHA. Chúng tôi lựa chọn HDAC2 và HDAC8 là hai enzym thuộc HDAC nhóm I – phân nhóm HDAC mà các dẫn chất acid hydroxamic có tác dụng ức chế mạnh nhất (bảng 1.2) để tiến hành docking nhằm dự đoán khả năng ức chế của IVa đối với các enzym này căn cứ vào sự phù hợp về hình dạng, kích thƣớc và năng lƣợng tƣơng tác giữa IVa và các enzym. Docking đƣợc thực hiện bằng chƣơng trình AutoDock Vina, sau đó dự đoán năng lƣợng của tƣơng tác liên kết từ sự gắn kết trên khi SAHA rời khỏi hệ tƣơng tác. Kết quả sẽ đƣợc minh họa bằng hình ảnh mô hình và số liệu dự đoán năng lƣợng liên kết (mục 3.5). 2.3.2.6. Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất tổng hợp được Tính giá trị logP của các chất tổng hợp đƣợc bằng phần mềm EPTsuite cung cấp bởi US Environmental Protection Agency’s Office of Pollution Prevention and Toxics and Syracuse Research Corporation (SRC). Quy trình bao gồm vẽ cấu trúc 2D, tạo Smile notation bằng phần mềm ChemSketch 4.0 của ACD labs, sau đó đƣa Smile notation vào phần mềm EPTsuite để tính các giá trị logP. Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất dựa trên quy tắc Lipinsky [32]: -

Khối lƣợng phân tử của chất không lớn hơn 500 g/mol

-

Số trung tâm nhận liên kết Hydro (N,O) không lớn hơn 10

-

Số trung tâm cho liên kết Hydro (NH,OH) không lớn hơn 5

-

Giá trị logP của chất không lớn hơn 5

-

Số liên kết linh động không lớn hơn 15

31

Chƣơ g 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 3.1. TỔNG HỢP HÓA HỌC Từ đặc điểm chung của các dẫn chất acid hydroxamic hƣớng ức chế HDAC và kết quả của các nghiên cứu gần đây, chúng tôi thiết kế dãy dẫn chất với cấu trúc tƣơng tự SAHA với các đặc điểm về cấu trúc nhƣ sau: -

Giữ nguyên phần cầu nối carbon và nhóm chức acid hydroxamic

-

Thay khung phenyl của SAHA bằng khung 3-methoxim-isatin 7 chất trong luận văn đƣợc tổng hợp theo sơ đồ:

Sơ đồ 3.1. Sơ đồ phản ứng tổng hợp các dẫn chất mang khung 3-methoxim-isatin Quy trình tổng hợp gồm 3 giai đoạn: -

Giai đoạn 1: Thực hiện phản ứng cộng hợp ái nhân vào nhóm carbonyl, tạo

3-(methoxyimino)-2-oxoindolin và các dẫn chất. -

Giai đoạn 2: Thực hiện phản ứng alkyl hóa, tổng hợp ethyl 7-(3-

(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat từ 3-methoxim-isatin và các dẫn chất mang nhóm thế tại vị trí số 5 và số 7 với ethyl 7-bromoheptanoat trong dung môi DMF. -

Giai đoạn 3: Thực hiện phản ứng thế ái nhân acyl tạo acid hydroxamic, tổng

hợp N-hydroxy-7-(3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanamid và các dẫn chất từ các chất trung gian ở giai đoạn 2 với hydroxylamin hydroclorid. 3.1.1. Tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin và dẫn chất (IIa-g) Quy trình tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolinvà dẫn chấtđược thực hiện theo sơ đồ sau:

32

Sơ đồ 3.2. Sơ đồ phản ứng tổng hợp các chất IIa - g 3.1.1.1. Tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IIa) * Tiến hành phản ứng: Cân 0,147 g isatin (1 mmol) cho vào bình cầu, hòa tan trong hỗn hợp dung môi 5 ml ethanol và 2,5 ml methanol. Tiếp tục cho 0,501 g methoxylamin hydroclorid (6 mmol) trong 5ml pyridin khan. Đun hồi lƣu phản ứng trong 3h. Kiểm tra phản ứng bằng SKLM với pha động DCM:CH3OH (9:1). * Xử lý hỗn hợp phản ứng: Hỗn hợp phản ứng đƣợc để nguội đến nhiệt độ phòng, sau đó thêm từ từ 30 ml acid HCl 5M lạnh thấy xuất hiện kết tủa. Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nƣớc cất cho tới khi dịch lọc trung tính, sấy chân không ở 40C trong 24h. Sản phẩm trung gian IIa thu đƣợc đƣợc dùng làm nguyên liệu để tổng hợp IIIa. * Kết quả:

- Rf = 0,63. Chất rắn thu đƣợc có màu vàng. - Khối lƣợng: 0,138 mg - Hiệu suất: 93,9%.

3.1.1.2. Tổng hợp 5- fluoro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IIb) Chất IIb đƣợc tổng hợp từ 0,165 g 5-fluoroisatin (1 mmol) với quy trình tổng hợp và cách xử lý phản ứng tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIa. Kết quả thu đƣợc đƣợc thể hiện trong bảng 3.1 3.1.1.3. Tổng hợp 5-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IIc) Chất IIc đƣợc tổng hợp từ 0,181 g 5-cloroisatin (1 mmol) với quy trình tổng hợp và cách xử lý phản ứng tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIa. Kết quả thu đƣợc đƣợc thể hiện trong bảng 3.1 3.1.1.4. Tổng hợp 5-bromo-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IId) Chất IId đƣợc tổng hợp từ 0,226 g 5-bromoisatin (1 mmol) với quy trình tổng hợp và cách xử lý phản ứng tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIa.

33

Kết quả thu đƣợc đƣợc thể hiện trong bảng 3.1 3.1.1.5. Tổng hợp 3-(methoxyimino)-5-nitro-2-oxoindolin (IIe) Chất IIe đƣợc tổng hợp từ 0,192 g 5-nitroisatin (1 mmol) với quy trình tổng hợp và cách xử lý phản ứng tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIa. Kết quả thu đƣợc đƣợc thể hiện trong bảng 3.1 3.1.1.6. Tổng hợp 3-(methoxyimino)-5-methyl-2-oxoindolin (IIf) Chất IIf đƣợc tổng hợp từ 0,163 g 5-methylisatin (1 mmol) với quy trình tổng hợp và cách xử lý phản ứng tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIa. Kết quả thu đƣợc đƣợc thể hiện trong bảng 3.1 3.1.1.7. Tổng hợp 7-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (IIg) Chất IIg đƣợc tổng hợp từ 0,181 g 7-cloroisatin (1 mmol) với quy trình tổng hợp và cách xử lý phản ứng tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất IIa. Kết quả thu đƣợc đƣợc thể hiện trong bảng 3.1 Bảng 3.1. Kết quả tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin và dẫn chất

TT Chất

R

KLPT

Màu

Dạng tồn tại

Rf

Khối lƣợng Hiệu (g) suất (%)

1

IIa

-H

176

Vàng

Chất rắn

0,63

0,138

94

2

IIb

5-F

194

Vàng

Chất rắn

0,58

0,149

90

3

IIc

5-Cl

210,5

Vàng

Chất rắn

0,60

0,165

91

4

IId

5-Br

255

Vàng da cam Chất rắn

0,53

0,210

93

5

IIe

5-NO2

221

Vàng

Chất rắn

0,52

0,169

88

6

IIf

5-CH3

190

Vàng

Chất rắn

0,50

0,150

92

7

IIg

7-Cl

210,5

Vàng

Chất rắn

0,57

0,170

94

3.1.2. Tổng hợp ethyl-7-(3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat và dẫn chất (IIIa – g) Quy trình tổng hợp ethyl-7-(3-(methoxyimino)-5-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat và dẫn chất được thực hiện theo sơ đồ sau: 34

Sơ đồ 3.3. Sơ đồ phản ứng tổng hợp các chất IIIa - g 3.1.2.1. Tổng hợp ethyl-7-(3-(methoxyimino)–2-oxoindolin-1-yl)heptanoat (IIIa) * Tiến hành phản ứng: Cho 0,176 g (1 mmol) chất IIa vào bình cầu dung tích 50 ml. Thêm 3 ml DMF vào bình cầu, siêu âm cho hỗn hợp tan hoàn toàn (7 phút), sau đó làm lạnh xuống 5C. Thêm 0,166 g K2CO3 khan (1,2 mmol). Khuấy đều hỗn hợp ở -5C trong 1h (sử dụng máy khuấy từ). Sau đó khuấy thêm 45 phút ở nhiệt độ phòng cho hỗn hợp đồng nhất. Thêm 0,5 ml CH3OH và 0,008 g KI (0,05 mmol) vào hỗn hợp, tiếp tục khuấy trong vòng 15 phút. Nhỏ từ từ 0,237 g ethyl 7-bromoheptanoat (1 mmol) (đã đƣợc hòa tan trong 1 ml DMF) vào hỗn hợp phản ứng. Nâng nhiệt độ phản ứng lên 60C, khuấy đều hỗn hợp phản ứng trong 24h. Kiểm tra phản ứng bằng SKLM với pha động DCM:CH3OH (9:1). * Xử lý hỗn hợp phản ứng: Sau khi phản ứng kết thúc, làm lạnh bình phản ứng. Acid hóa hỗn hợp phản ứng bằng acid HCl 10%. Chiết sản phẩm bằng DCM (50 ml × 2 lần). Thu lớp dịch chiết, cất quay thu hồi DCM dƣới áp suất giảm thu đƣợc dẫn chất IIIa. Kết quả:

- Rf = 0,69. Ester thu đƣợc có dạng dầu, màu nâu vàng. - Khối lƣợng: 0,137 mg. - Hiệu suất 77,7%

3.1.2.2.

Tổng

hợp

ethyl-7-(5-fluoro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-

yl)heptanoat (IIIb) Chất IIIb đƣợc tổng hợp từ 0,194 g (1 mmol) 5-fluoro-3-(methoxyimino)-2oxoindolin (IIb) với quy trình tổng hợp và xử lý phản ứng tƣơng tự khi tổng hợp chất IIIa. Kết quả của quá trình tổng hợp đƣợc thể hiện trong bảng 3.2.

35

3.1.2.3. Tổng hợp ethyl-7-(5-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat (IIIc) Chất IIIc đƣợc tổng hợp từ 0,211 g (1 mmol) 5-cloro-3-(methoxyimino)-2oxoindolin (IIc) với quy trình tổng hợp và xử lý phản ứng tƣơng tự khi tổng hợp chất IIIa. Kết quả của quá trình tổng hợp đƣợc thể hiện trong bảng 3.2. 3.1.2.4.

Tổng

hợp

ethyl-7-(5-bromo-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-

yl)heptanoat (IIId) Chất IIId đƣợc tổng hợp từ 0,255 g (1 mmol) 5-bromo-3-(methoxyimino)-2oxoindolin (IId) với quy trình tổng hợp và xử lý phản ứng tƣơng tự khi tổng hợp chất IIIa. Kết quả của quá trình tổng hợp đƣợc thể hiện trong bảng 3.2. 3.1.2.5. Tổng hợp ethyl-7-(3-(methoxyimino)-5-nitro-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat (IIIe) Chất IIIe đƣợc tổng hợp từ 0,221 g (1 mmol) 3-(methoxyimino)-5-nitro-2oxoindolin (IIe) với quy trình tổng hợp và xử lý phản ứng tƣơng tự khi tổng hợp chất IIIa. Kết quả của quá trình tổng hợp đƣợc thể hiện trong bảng 3.2. 3.1.2.6.

Tổng

hợp

ethyl-7-(3-(methoxyimino)-5-methyl-2-oxoindolin-1-

yl)heptanoat (IIIf) Chất IIIf đƣợc tổng hợp từ 0,190 g (1 mmol) 3-(methoxyimino)-5-methyl-2oxoindolin (IIf) với quy trình tổng hợp và xử lý phản ứng tƣơng tự khi tổng hợp chất IIIa. Kết quả của quá trình tổng hợp đƣợc thể hiện trong bảng 3.2. 3.1.2.7. Tổng hợp ethyl-7-(7-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat (IIIg) Chất IIIg đƣợc tổng hợp từ 0,211 g (1 mmol) 7-cloro-3-(methoxyimino)-2oxoindolin (IIg) với quy trình tổng hợp và xử lý phản ứng tƣơng tự khi tổng hợp chất IIIa. Kết quả của quá trình tổng hợp đƣợc thể hiện trong bảng 3.2. 36

Bảng 3.2. Kết quả tổng hợp ethyl 7-(3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1yl)heptanoatvà dẫn chất

TT Chất

R

KLPT

Màu

Dạng tồn tại

Rf

Khối lƣợng Hiệu suất (g) (%)

332

Nâu vàng Dạng dầu

0,69

0,137

78

350

Nâu vàng Dạng dầu

0,60

0,165

85

366,7

Nâu vàng Dạng dầu

0,62

0,186

88

411

Nâu vàng Dạng dầu

0,63

0,204

80

5-NO2

377

Vàng nhạt Dạng dầu

0,65

0,141

64

IIIf

5-CH3

346

Nâu vàng Dạng dầu

0,55

0,160

84

IIIg

7-Cl

366,7

Nâu vàng Dạng dầu

0,61

0,158

75

1

IIIa

-H

2

IIIb 5-F

3

IIIc

4

IIId 5-Br

5

IIIe

6 7

5-Cl

3.1.3. Tổng hợp N-hydroxy-7-(3-methoxyimino-2-oxoindolin-1-yl)heptanamid và dẫn chất (IVa-g) Quy

trình

tổng

hợp

N-hydroxy-7-(3-methoxyimino-2-oxoindolin-1-yl)

heptanamid và dẫn chất được thực hiện theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 3.4. Sơ đồ phản ứng tổng hợp các chất IVa-g 3.1.3.1. Tổng hợp N-hydroxy-7-(3-methoxyimino-5-2-oxoindolin-1-yl)heptanamid (IVa) * Tiến hành phản ứng: Cân 0,4 g (10 mmol) NaOH, hòa tan trong 2 ml nƣớc cất, để lạnh ở -5C. Cho 0,332 g (1 mmol) ester IIIa vào bình cầu dung tích 50 ml. Thêm vào hỗn hợp dung môi CH3OH/THF (3 ml/3ml). Làm lạnh bình phản ứng xuống -5C, 37

thêm 0,695 g (≈10 mmol) hydroxylammonium clorid. Thêm từ từ dung dịch NaOH đã đƣợc làm lạnh vào hỗn hợp phản ứng. Duy trì nhiệt độ phản ứng ở -5C (sử dụng đá muối), khuấy đều hỗn hợp cho đến khi ester phản ứng hết. Kiểm tra phản ứng bằng SKLM với pha động DCM:CH3OH (9:1). * Xử lý hỗn hợp phản ứng: Sau khi phản ứng kết thúc, trung hòa phản ứng bằng dung dịch HCl 15% tới pH 7 để tạo kết tủa. Lọc lấy tủa, rửa sạch bằng nƣớc cất. Sấy khô tủa ở 60C. Tinh chế bằng cách kết tinh lại trong ethanol. Kết quả:

- Rf = 0,71. Chất rắn thu đƣợc có màu vàng - Khối lƣợng: 0,249 mg - Hiệu suất: 75%

3.1.3.2.

Tổng

hợp

N-hydroxy-7-(5-fluoro-(3-methoxyimino)-2-oxoindolin-1-

yl)heptanamid (IVb) Chất IVb đƣợc tổng hợp từ 0,350 g (1 mmol) ethyl 7-(5-fluoro-3(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat (IIIb) với quy trình và cách xử lý phản ứng tƣơng tự khi tổng hợp IVa. Kết quả của quá trình tổng hợp đƣợc thể hiện trong bảng 3.3. 3.1.3.3.

Tổng

hợp

N-hydroxy-7-(5-cloro-(3-methoxyimino)-2-oxoindolin-1-

yl)heptanamid (IVc) Chất IVc đƣợc tổng hợp từ 0,367 g (1 mmol) ethyl-7-(5-cloro-3(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat (IIIc) với quy trình và cách xử lý phản ứng tƣơng tự khi tổng hợp IVa. Kết quả của quá trình tổng hợp đƣợc thể hiện trong bảng 3.3. 3.1.3.4.

Tổng

hợp

N-hydroxy-7-(5-bromo-(3-methoxyimino)-2-oxoindolin-1-

yl)heptanamid (IVd) Chất IVd đƣợc tổng hợp từ 0,411 g (1 mmol) ethyl-7-(5-bromo-3(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat (IIId) với quy trình và cách xử lý phản ứng tƣơng tự khi tổng hợp IVa. Kết quả của quá trình tổng hợp đƣợc thể hiện trong bảng 3.3.

38

3.1.3.5.

Tổng

hợp

N-hydroxy-7-(3-(methoxyimino)-5-nitro-2-oxoindolin-1-

yl)heptanamid (IVe) Chất IVe đƣợc tổng hợp từ 0,377 g (1 mmol) ethyl-7-(3-(methoxyimino)-5nitro-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat (IIIe) với quy trình và cách xử lý phản ứng tƣơng tự khi tổng hợp IVa. Kết quả của quá trình tổng hợp đƣợc thể hiện trong bảng 3.3. 3.1.3.6.

Tổng

hợp

N-hydroxy-7-(3-(methoxyimino)-5-methyl-2-oxoindolin-1-

yl)heptanamid (IVf) Chất IVf đƣợc tổng hợp từ 0,346 g (1 mmol) ethyl 7-(3-(methoxyimino)-5methyl-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat (IIIf) với quy trình và cách xử lý phản ứng tƣơng tự khi tổng hợp IVa. Kết quả của quá trình tổng hợp đƣợc thể hiện trong bảng 3.3. 3.1.3.7.

Tổng

hợp

N-hydroxy-7-(7-cloro-(3-methoxyimino)-2-oxoindolin-1-

yl)heptanamid (IVg) Chất IVg đƣợc tổng hợp từ 0,367 g (1 mmol) ethyl 7-(7-cloro-3(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat (IIIg) với quy trình và cách xử lý phản ứng tƣơng tự khi tổng hợp IVa. Kết quả của quá trình tổng hợp đƣợc thể hiện trong bảng 3.3.

39

Bảng 3.3. Kết quả tổng hợp N-hydroxy-7-(3-methoxyimino-2-oxoindolin-1yl)heptanamid và dẫn chất

TT Chất

R

KLPT

Màu

Dạng tồn tại

Khối lƣợng (g)

Hiệu suất (%)

1 IVa

-H

319

Vàng

Chất rắn

0,249

75

2 IVb

5-F

337

Vàng nhạt

Chất rắn

0,252

72

3 IVc

5-Cl

353

Vàng nhạt

Chất rắn

0,286

78

4 IVd

5-Br

397

Vàng đậm

Chất rắn

0,300

73

5 IVe

5-NO2

364

Vàng đậm

Chất rắn

0,264

70

6

5-CH3

333

Vàng nhạt

Chất rắn

0,266

77

7-Cl

353

Vàng nhạt

Chất rắn

0,275

75

IVf

7 IVg

3.2. KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT Sau khi tổng hợp, các dẫn chất IVa-g đƣợc kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy (Tnc) của chúng.  Sắc ký lớp mỏng (SKLM): -

SKLM đƣợc tiến hành trên bản nhôm tráng sẵn silicagel Merck 60 (240 –

400 mesh). Các chất IVa-g đƣợc hòa tan trong dung môi DMF, tiến hành chạy SKLM với hệ dung môi DCM:CH3OH (9:1) -

Sau khi chạy sắc ký, quan sát bản mỏng dƣới đèn tử ngoại có bƣớc sóng

254nm thấy các chất đem thử đều cho một vết gọn.  Đo nhiệt độ nóng chảy (Tnc): Bên cạnh việc kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM, chúng tôi tiến hành đo nhiệt độ nóng chảy của các chất tổng hợp đƣợc. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy cho thấy: các chất đều có điểm chảy rõ ràng, khoảng chênh lệch hẹp. Giá trị Rf và Tnc của các chất IVa-g đƣợc thể hiện trong bảng 3.4.

40

Bảng 3.4. Giá trị Rf và Tnc của các chất IVa-g

Pha động

Rf

Tnc (C)

-H

DCM/CH3OH = 9/1

0,71

191 - 193

IVb

5-F

DCM/CH3OH = 9/1

0,70

200 - 202

3

IVc

5-Cl

DCM/CH3OH = 9/1

0,70

198 - 199

4

IVd

5-Br

DCM/CH3OH = 9/1

0,76

205 - 207

5

IVe

5-NO2

DCM/CH3OH = 9/1

0,67

203 - 205

6

IVf

5-CH3

DCM/CH3OH = 9/1

0,75

193 - 195

7

IVg

7-Cl

DCM/CH3OH = 9/1

0,72

189 - 191

TT

Chất

1

IVa

2

R

Nhận xét: Thông qua sắc ký đồ khi chạy SKLM và nhiệt độ nóng chảy của các chất, có thể sơ bộ khẳng định các chất này là tinh khiết, đủ điều kiện để đo phổ và thử tác dụng sinh học. 3.3. KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC Để phân tích, khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp đƣợc, 7 chất IVa-g đƣợc tiến hành ghi và phân tích dữ liệu phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lƣợng (MS) và phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR). 3.3.1. Phổ hồng ngoại (IR) Tại phòng thí nghiệm khoa Hóa Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, các chất IVa-g đƣợc ghi phổ hồng ngoại (IR) trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật làm viên nén KBr, ghi trong vùng 4000- 600 cm-1. Kết quả phân tích phổ đƣợc thể hiện trong bảng 3.5.

41

Số sóng ứng với các dao động (cm-1)

Bảng 3.5. Kết quả phân tích phổ IR của các chất IVa-g

Chất

IVa

IVb

IVc

IVd

IVe

IVf

IVg

R

H

5-F

5-Cl

5-Br

5-NO2

5-CH3

7-Cl

OH

3399

3331

3431

-

-

-

-

NH

3249

3234

3259

3222

3210

3217

3232

C-H, aren

3038 2933

3045

-

-

3047

3059

2931

2935

2935

2934

2926

2937

2861

2859

2856

2856

2856

2858

1607

1602

1609

1604

1611

1616

1605

1539

1529

1469

1466

1522

1594

1545

1464

1477

1442

1436

1474

1482

1465

1704

1702

1621

1622

1714

1722

1729

1706

1728

C=N, oxim

1647

1655

1645

1647

1638

Nhóm thế

-

1343

C-H, mạch nhánh (-CH2)

C=C, aren

C=O

2862 2824

1522

Chú thích:  là dao động hóa trị

Nhận xét: Rất khó để khẳng định cấu trúc của các dẫn chất qua phổ đồ hồng ngoại, tuy nhiên trên phổ đồ của các dẫn chất IVa-g đã thấy xuất hiện một số peak rất đặc trƣng của dao động hóa trị trong một số nhóm chức: -OH (acid), C=O, oxim, C-H (-CH2), aryl. 3.3.2. Phổ khối lƣợng (MS) Sử dụng phƣơng pháp đo phổ khối lƣợng với kỹ thuật ion hóa tại áp suất khí quyển API (Atmospheric Pressure Ionization – API), hình thành ion theo kiểu ion hóa tia điện (electrospray ionization – ESI). 42

Bảng 3.6. Kết quả phân tích phổ khối lƣợng của các chất IVa-g

TT

Chất

Nhóm thế

KLPT (M)

m/z (ESI-MS)

1

IVa

-H

319

318 [M – H]-

2

IVb

5-F

337

335 [M – 2H]-

3

IVc

5-Cl

353

352 [M – H]-

4

IVd

5-Br

399

398 [M – H]-

5

IVe

5-NO2

364

363 [M – H]-

6

IVf

5-CH3

333

332 [M – H]-

7

IVg

7-Cl

353

352 [M – H]-

Nhận xét: Kết quả phân tích phổ khối ở bảng 3.6 cho thấy các chất khảo sát đều có giá trị pic ion phân tử đúng bằng số khối của phân tử dự kiến với cƣờng độ mạnh. 3.3.3. Phổ cộ g hƣởng từ hạt nhân Phổ NMR đƣợc đo trên máy cộng hƣởng từ hạt nhân Bruker AC-500 MHz tại phòng phân tích phổ - Viện hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam với dung môi DMSO-d6 . Phổ 1H-NMR đo ở tần số 500 MHz, phổ 13C-NMR đo ở tần số 125 MHz. Độ dịch chuyển hóa học (, ppm) đƣợc tính theo chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS), nhiệt độ ghi phổ khoảng 300oK. Dƣới đây là kết quả phân tích phổ đồ. 3.3.3.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR Kết quả phân tích phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR đƣợc thể hiện trong bảng 3.7. Nhận xét: Kết quả phân tích phổ đồ 1H-NMR của các chất IVa-g cho thấy số lƣợng proton của nhân thơm, mạch nhánh và các nhóm thế là phù hợp với công thức cấu tạo dự kiến của các chất.

43

Bảng 3.7. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các chất IVa-g

TT Chất

 (ppm) (500 MHz, DMSO-d6)

R

10,33 (1H, s, NH); 8,66 (1H, s, OH); 7,87 (1H, d, JH4’-H5’ = 7,5 Hz, H-4’); 7,46 (1H, t, JH5’-H6’ ≈ JH5’-H4’ = 7,5 Hz, H-5’); 7,12 (1H, d, JH7’-H6’ = 8,0 Hz, H-7’); 7,07 (1H, t, JH6’-H7’ ≈ 1

IVa

-H

JH6’-H5’ = 7,5 Hz, H-6’); 4,20 (3H, s, - OCH3); 3,66 (2H, t, J= 7,0 Hz, 2H-7); 1,92 (2H, t, J= 7,0 Hz, 2H-2); 1,56 (2H, m, 2H-6); 1,45 – 1,47 (2H, m, 2H-3); 1,26 (4H, m, 2H-4 & 2H5). 10,33 (1H, s, NH); 8,66 (1H, s, OH); 7,65 (1H, dd, JH4’-H6’ = 8,0Hz, JH4’-H7’ = 2,5 Hz, H-4’); 7,33 (1H, td,JH6’-F= JH6’-H7’= 9,25 Hz, JH6’-H4’ = 2,5 Hz, H-6’); 7,14 (1H, dd, JH7’-H6’ = 8,5

2

IVb

5-F

Hz, JH7’-H4’ = 4,0 Hz, H-7’); 4,21 (3H, s, - OCH3); 3,66 (2H, t, J= 7,0 Hz, 2H-7); 1,91 (2H, t, J= 7,0 Hz, 2H-2); 1,53 - 1,56 (2H, m, 2H-3); 1,45 – 1,46 (2H, m, 2H-6); 1,25 - 1,26 (4H, m, 2H-4 & 2H-5). 10,45 (1H, s, NH); 7,81 (1H, s, H-4’); 7,50 (1H, d, JH6’-H7’ = 8,0 Hz, H-6’); 7,16 (1H, d, JH7’-H6’ = 8,0 Hz, H-7’); 4,22 (3H,

3

IVc

5-Cl

s, - OCH3); 3,65 (2H, t, J= 6,5 Hz, 2H-7); 1,93 (2H, t, J= 7,0 Hz, 2H-2); 1,53 - 1,55 (2H, m, 2H-3); 1,44 – 1,46 (2H, m, 2H-6); 1,25 - 1,27 (4H, m, 2H-4 & 2H-5). 7,94 (1H, s, H-4’); 7,62 (1H, d, JH6’-H7’ = 7,5 Hz, H-6’); 7,11

4

IVd

5-Br

(1H, d, JH7’-H6’ = 8,0 Hz, H-7’); 4,22 (3H, s, - OCH3); 3,65 (2H, t, J= 6,5 Hz, 2H-7); 1,91 (2H, t, J= 7,0 Hz, 2H-2); 1,53

44

(2H, m, 2H-3); 1,44 (2H, m, 2H-6); 1,25 (4H, m, 2H-4 & 2H5). 10,33 (1H, s, NH); 8,66 (1H, s, OH); 8,49 (1H, d, JH4’-H6’ = 1,5 Hz, H-4’); 8,35 (1H, dd, JH6’-H7’ = 9,0 Hz, JH6’-H4’ = 2,5 5

IVe

5-NO2

Hz, H-6’); 7,35 (1H, d, JH7’-H6’ = 9,0 Hz, H-7’); 4,29 (3H, s, OCH3); 3,73 (2H, t, J= 7,0 Hz, 2H-7); 1,92 (2H, t, J= 7,0 Hz, 2H-2); 1,54 - 1,58 (2H, m, 2H-3); 1,43 – 1,49 (2H, m, 2H-6); 1,26 - 1,27 (4H, m, 2H-4 & 2H-5). 10,34 (1H, s, NH); 7,70 (1H, s, H-4’); 7,26 (1H, d, JH6’-H7’ = 8,0 Hz, H-6’); 7,00 (1H, d, JH7’-H6’ = 8,0 Hz, H-7’); 4,19 (3H,

6

IVf

5-CH3

s, - OCH3); 3,64 (2H, t, J= 7,0 Hz, 2H-7); 2,27 (3H, s, CH3); 1,91 (2H, t, J= 7,5 Hz, 2H-2); 1,53 - 1,55 (2H, m, 2H-3); 1,43 – 1,46 (2H, m, 2H-6); 1,24 - 1,25 (4H, m, 2H-4 & 2H5). 10,36 (1H, s, NH); 8,66 (1H, s, OH); 7,90 (1H, d, JH6’-H5’= 7,5 Hz, H-6’); 7,47 (1H, d, JH4’-H5’= 8,0 Hz, H-4’); 7,09 (1H,

7

IVg

7-Cl

t, JH5’-H6’ ≈ JH5’-H4’ = 8,0 Hz, H-5’); 4,22 (3H, s, - OCH3); 3,95 (2H, t, J= 7,0 Hz, 2H-7); 1,93 (2H, t, J= 7,5 Hz, 2H-2); 1,56 – 1,60 (2H, m, 2H-3); 1,44 – 1,50 (2H, m, 2H-6); 1,26 – 1,28 (4H, m, 2H-4 & 2H-5).

Ghi chú: s: singlet (vạch đơn); d: doublet (hai vạch); t: triplet (ba vạch); m: multiplet (đa vạch).

3.3.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR Nhận xét: Qua kết quả phân tích phổ 13C-NMR ở bảng 3.8 và phổ đồ phần phụ lục, có thể nhận thấy số lƣợng C của các dẫn chất IVa-g xuất hiện đầy đủ, tƣơng ứng với các giá trị của độ dịch chuyển hóa học . Nhƣ vậy, dữ liệu các phổ thực nghiệm IR, MS,1H-NMR, 13C-NMR cho phép khẳng định cấu trúc các chất tổng hợp IVa-g đúng nhƣ dự kiến và là sản phẩm tinh khiết. Từ đó, các acid hydroxamic này sẽ đƣợc tiến hành thử hoạt tính sinh học.

45

Bảng 3.8. Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các chất IVa-g

Chất

IVa

IVb

IVc

IVd

R

-H

5-F

5-Cl

5-Br 5-NO2 5-CH3

169,06

169,10

169,04 168,69 169,05 169,02 169,01

C2’ 162,15

162,03

161,77 161,66 162,43 162,11 162,57

C3’ 143,68

158,83

142,44 142,80 148,87 143,38 141,92

C=O

C1

 (ppm) (125 MHz, DMSO-d6)

143,28 C

C4’

(aryl)

C9’

132,96 127,34 122,61 114,87 109,40

C(nhóm C10’ thế)

C (mạch nhánh)

156,93*

IVe

IVf

IVg 7-Cl

142,41 142,32 142,34 141,44 139,21

142,96

132,30 135,13 141,79 133,13 134,76

140,02 119,04-119,23 115,33-115,41 114,29-114,50 110,46-114,52

126,54 129,22 129,06 131,65 126,36 126,38 116,41 121,84 127,81 124,10 115,97 114,00 114,74 114,90 117,84 111,00 111,47 109,72 109,15 114,49

64,40

64,67

64,71 64,72 65,20

64,34 64,79

-CH3

-

-

-

-

-

20,40

-

C7

-

-

-

-

-

-

40,87

C2

32,14

32,15

32,09 28,15 32,11

32,12 32,10

C4

28,14

28,16

28,11 26,68 28,13

28,13 29,06

C6

26,77

26,71

26,67 26,18 26,77

26,76 28,13

C5

25,87

25,86

25,80 25,84 25,80

25,85 25,70

C3

24,95

24,95

24,91 25,03 24,91

24,93 24,95

Ghi chú: δ là độ dịch chuyển hóa học, * độ dịch chuyển hóa học của C5’-F.

3.4. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 3.4.1. Thử tác dụng ức chế histon deacetylase 46

Sau khi đã khẳng định cấu trúc, chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng ức chế histon deacetylase trên histon H3, H4 trong tế bào ung thƣ đại tràng SW620 ở nồng độ 10 µg/ml của các dẫn chất IVa-g theo phƣơng pháp phân tích Western blot. Kết quả thu đƣợc: IVa-c, IVg ức chế mạnh HDAC ở nồng độ này; còn lại IVd-f ức chế không đáng kể (hình 3.1). Thử nghiệm đƣợc thực hiện tại khoa Dƣợc, Trƣờng Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc.

Hình 3.1. Kết quả phân tích Western blot của các chất IVa – g Chú thích: VH: mẫu trắng, GAPDH: enzym chuyển hóa glucosid

3.4.2. Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào u g thƣ in vitro Thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ ngƣời in vitro trên 5 dòng tế bào thử nghiệm: SW620: tế bào ung thƣ đại tràng, MCF-7: tế bào ung thƣ vú, AsPC-1: tế bào ung thƣ tụy, PC-3: tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến, NCI-H460: tế bào ung thƣ phổi theo phƣơng pháp MTT. Thử nghiệm đƣợc thực hiện tại Khoa Dƣợc, Trƣờng Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc. Giá trị IC50 đƣợc tính trên phần mềm GraphPad Prism. Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro của các chất IVa – g đƣợc trình bày trong bảng 4.2 (mục 4.3.2). 3.5. KẾT QUẢ DOCKING Để kiểm tra sơ bộ tính tƣơng tác của các chất tổng hợp đƣợc với HDAC (docking), chúng tôi đã tiến hành docking chất IVa với HDAC 8 và HDAC2. Quá trình docking đƣợc thực hiện tại phòng nghiên cứu cấu trúc Đại học quốc gia Seoul, Hàn Quốc. 47

Kết quả docking của chất IVa và SAHA với HDAC8 (hình 3.2) cho thấy IVa gắn với HDAC8 tại trung tâm hoạt động của enzym tƣơng tự SAHA, nhóm acid hydroxamic liên kết với Zn2+. Tuy nhiên, năng lƣợng liên kết IVa – HDAC8 nhỏ hơn năng lƣợng liên kết SAHA – HDAC8, do đó ái lực của IVa với HDAC8 mạnh hơn so với SAHA.

Hình 3.2. Kết quả docking của chất IVa và SAHA với HDAC8 Chú thích: SAHA (màu vàng), chất IVa (màu tím) và HDAC8 (màu xanh lá cây). Ion Zn2+ là hình cầu màu xám đậm.

Tƣơng tự, khi tiến hành docking chất IVa và SAHA với HDAC2 thu đƣợc kết quả nhƣ sau:

Hình 3.3. Kết quả docking của chất IVa và SAHA với HDAC2 Chú thích: SAHA (màu vàng), chất IVa(màu xám bạc) và HDAC8 (màu xanh lá cây) . Ion Zn2+ là hình cầu màu xám đậm.

Chúng tôi nhận thấy: IVa gắn với HDAC2 tại trung tâm hoạt động của enzym tƣơng tự SAHA, nhóm acid hydroxamic liên kết với Zn2+. Chuỗi alkyl (6C) gắn 48

mạnh vào vùng thân dầu của kênh enzym. Năng lƣợng liên kết IVa – HDAC2 nhỏ hơn năng lƣợng liên kết SAHA – HDAC2, do đó ái lực của IVa với HDAC2 mạnh hơn so với SAHA. 3.6. ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ GIỐNG THUỐC CỦA CÁC CHẤT TỔNG HỢP Tính giá trị logP của các chất tổng hợp đƣợc bằng phần mềm EPTsuite cung cấp bởi US Environmental Protection Agency’s Office of Pollution Prevention and Toxics and Syracuse Research Corporation (SRC). Tất cả các chất IVa-g đều thỏa mãn 5 yêu cầu của quy tắc Lipinsky về độ giống thuốc. Bảng 3.9. Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất IVa-g theo quy tắc Lipinsky

TT

Chất

R

M

LogP

Số NH, OH

Số N, O

Kết luận

1

IVa

-H

319.36

2,67

2

7

Đạt

2

IVb

5-F

337.35

2,87

2

7

Đạt

3

IVc

5-Cl

353.80

3,31

2

7

Đạt

4

IVd

5-Br

398.25

3,56

2

7

Đạt

5

IVe

5-NO2

364.35

2,89

2

7

Đạt

6

IVf

5-CH3

333.38

3,22

2

7

Đạt

7

IVg

7-Cl

353.80

3,31

2

7

Đạt

49

Chƣơ g 4. BÀN LUẬN 4.1. VỀ HÓA HỌC 4.1.1. Tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin và các dẫn chất (IIa-g) -

Phản ứng xảy ra theo cơ chế cộng hợp ái nhân AN vào nhóm carbonyl, sau đó

có sự loại nƣớc. -

Điều kiện của phản ứng tùy thuộc vào hoạt tính của nhóm carbonyl, phụ

thuộc vào cả tính base của tác nhân ái nhân. -

Hiệu suất phản ứng cao 88 – 94% (bảng 3.1), dễ thực hiện.

4.1.2. Phản ứng tổng hợp dãy ester trung gian (IIIa-g) Isatin và các dẫn chất 5 (7) isatin phản ứng với ethyl-7 bromoheptanoat theo cơ chế thế ái nhân alkyl (SN2) với sự có mặt của K2CO3 và xúc tác KI. Cơ chế phản ứng đƣợc trình bày theo sơ đồ sau:

Trong đó:

Sơ đồ 4.1. Cơ chế phản ứng thế ái nhân alkyl tạo IIIa-g - Phản ứng xảy ra khá dễ dàng, hiệu suất tƣơng đối cao, từ 70 – 80% (bảng 3.2). Kiểm tra bằng SKLM cho thấy sản phẩm ester thu đƣợc tƣơng đối tinh khiết, có thể sử dụng cho giai đoạn tổng hợp tiếp theo. - K2CO3 đƣợc sử dụng để hoạt hóa isatin tạo tác nhân ái nhân - KI xúc tác nhằm làm tăng tốc độ phản ứng do tạo RI có khả năng tham gia phản ứng thế ái nhân nhanh hơn RBr. - Phản ứng thế ái nhân alkyl xảy ra trong hệ dung môi phân cực DMF:MeOH. Hệ dung môi này làm tăng độ tan của các chất tham gia phản ứng, giúp phản ứng xảy ra nhanh đồng thời tránh nguy cơ thủy phân nhóm chức amid và ester. 50

- Cần kiểm soát thời gian phản ứng và theo dõi kết quả phản ứng bằng SKLM để tránh tạo sản phẩm phụ. - Các dung môi và dụng cụ thực hiện phản ứng này phải đảm bảo yêu cầu khan nƣớc để tránh thủy phân chức ester tạo ra. 4.1.3. Phản ứng tổng hợp dãy chất acid hydroxamic (IVa-g) - Phản ứng đƣợc sử dụng để tổng hợp acid hydroxamic trong luận văn là phản ứng thế ái nhân acyl với tác nhân thế ái nhân là nhóm amin, nên còn gọi là phản ứng N-acyl hóa (sơ đồ 4.2).

Sơ đồ 4.2. Phản ứng thế ái nhân acyl Trong phản ứng trên, tác nhân ái nhân là amin. Phản ứng tổng hợp các acid hydroxamic từ ester và hydroxylamin ở môi trƣờng trung tính không xảy ra, nó chỉ đƣợc thực hiện ở pH > 10. Phƣơng pháp tổng hợp chủ yếu là dùng xúc tác base và ester trong alcol [12]. Qua tham khảo một số tài liệu nhƣ trên và để phù hợp với khả năng hòa tan trong dung môi của các chất cũng nhƣ hóa chất sẵn có tại phòng thí nghiệm, phản ứng tổng hợp acid hydroxamic IVa-g từ ester và hydroxylamin đƣợc tiến hành với xúc tác NaOH, dung môi MeOH/THF ở -5oC trong thời gian từ 30 phút đến 1giờ. Phản ứng diễn ra nhanh với hiệu suất thu đƣợc từ 70 – 78% (bảng 3.3). Sơ đồ 4.3 giải thích cơ chế của phản ứng.

Sơ đồ 4.3. Cơ chế phản ứng tổng hợp acid hydroxamic IVa-g từ ester - Lƣợng NH2OH.HCl cho vào bình phản ứng phải dƣ để cân bằng dịch chuyển theo chiều thuận. 51

- Duy trì ở nhiệt độ thấp (-5ᴼ C) làm cho phản ứng xảy ra nhanh và hoàn toàn, đồng thời tránh đƣợc sự thủy phân ester thành các acid carboxylic khi có mặt NaOH. - NaOH đƣợc làm lạnh và cho từ từ vào bình phản ứng để tránh quá nhiệt khi pha loãng dung môi MeOH bằng nƣớc. Lƣợng NaOH sử dụng cần dƣ để đảm bảo điều kiện phản ứng và chuyển NH2OH. HCl thành dạng NH2OH. - Khi acid hóa bằng acid HCl để xử lý hỗn hợp phản ứng, cần lƣu ý tránh tạo pH vƣợt quá pH tủa. Khi pH vƣợt quá pH tủa, các acid hydroxamic tạo thành sẽ chuyển sang dạng dầu, đồng thời rất khó tủa lại. 4.2. VỀ KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC 7 chất trong luận án sau khi tổng hợp xong đều đƣợc nhận dạng cấu trúc bằng các phƣơng pháp phổ hồng ngoại (IR), phổi khối lƣợng (MS) và phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H và

13

C. Dữ liệu các loại phổ đƣợc trình bày trong mục 3.2 và phổ đồ

trong phần phụ lục. Sau đây là một số bàn luận về việc nhận dạng cấu trúc thông qua các dữ liệu phổ. 4.2.1. Phổ hồng ngoại Phổ hồng ngoại bản chất là phổ dao động của các nhóm chức trong phân tử, cho thông tin về đỉnh hấp thụ của các kiểu dao động trong các nhóm chức. Phổ đồ của các chất đều bao gồm hai vùng: vùng nhóm chức có bƣớc sóng từ 4000 - 1500 cm-1 và vùng vân tay có bƣớc sóng từ 1500 – 625 cm-1. Các chất IVa-g trong luận văn đều là những chất có cấu trúc phức tạp, vì vậy phổ hồng ngoại của chúng chứa rất nhiều dải hấp thụ khác nhau, đặc biệt là các dải hấp thụ trong vùng vân tay, rất khó biện giải cho từng nhóm chức. Vì thế, trong luận văn chúng tôi tập trung chủ yếu vào vùng nhóm chức – vùng cho các thông tin về nhóm chức trong phân tử với dải hấp thụ khá đặc trƣng để xác định các nhóm chức đặc trƣng của các chất đã tổng hợp. - Tất cả 7 chất IVa-g đều là acid hydroxamic nên đều có vân hấp thụ của dao động hóa trị O-H acid mạnh từ 3400-2500 cm-1[3]. Các chất IVa-c có các vân hấp thụ tù của dao động hóa trị O-H từ 3431 – 3331 cm-1. Các chất IVd-g không ghi nhận đỉnh hấp thụ mà tạo thành dải hấp thụ hình quả đồi ở dƣới 3200 cm-1. 52

- Các chất tổng hợp IVa-d, IVf đều xuất hiện vân hấp thụ của C=N trong hợp chất oxim. Riêng IVe, IVg không ghi nhận đỉnh nhƣng tạo thành vân hấp thụ tù trong vùng 1690 – 1630 cm-1 của hợp chất này. - Các chất IVa-g trong cấu trúc đều có liên kết –NH-CO-, nên phổ hồng ngoại của tất cả các chất này đều xuất hiện vân hấp thụ của dao động hóa trị N-H trong amid bậc 2 từ 3320 – 3150 cm-1 [3]. - Ngoài liên kết -NH-CO- trong nhóm chức acid hydroxamic, các chất IVa-g còn có liên kết C=O của khung 3-methoxim-isatin nên trong phổ đồ các chất IVa, IVb xuất hiện 2 vân hấp thụ của dao động hóa trị C=O. Tuy nhiên liên kết -NH-COtrong nhóm chức hydroxamic có thể xảy ra hiện tƣợng hỗ biến (hình 4.1), nên các chất IVc-g chỉ xuất hiện 1 vân hấp thụ C=O trong khung isatin nằm trong dải 1725 – 1680 cm-1.

Hình 4.1. Hiện tƣợng hỗ biến của nhóm chức hydroxamic - Phổ đồ của cả 7 chất đều cho thấy dao động hóa trị của liên C=C trong aryl với dải hấp thụ từ 1600 – 1450 cm-1. Ngoài ra, các chất IVa, IVb, IVf, IVg còn xuất hiện dao động hóa trị của liên kết C-H (sp2) trong vùng 3100 – 3000 cm-1 của aryl. Phổ đồ của các chất IVc-e không thấy xuất hiện vân hấp thụ của liên kết này do bị vân hấp thụ của –OH (acid hydroxamic) che lấp. - Phần cầu nối alkyl của các chất tổng hợp đƣợc cũng cho thấy sự có mặt trên phổ đồ với dao động hóa trị của -CH2 (sp3) nằm trong dải từ 2970 – 2850 cm-1 [3]. - Đối với các nhóm thế trên aryl, chúng tôi nhận thấy sự xuất hiện của vân hấp thu của nhóm -NO2 tại 1522 cm-1, nằm trong dải 1370 – 1300 cm-1 là vùng hấp thu mạnh của dao động hóa trị NO2 trong hợp chất thơm. Các nhóm thế halogen -F, -Cl, -Br có dao động hóa trị nằm trong vùng vân tay, rất khó xác định bằng phổ đồ hồng ngoại [3]. Nhƣ vậy, phổ IR đã cho thấy một số nhóm chức và liên kết trong cấu tạo các chất đã tổng hợp . Tuy nhiên, sự hấp thu hồng ngoại của các nhóm chức có thể thay

53

đổi trong một miền rộng do sự tƣơng tác phức tạp của các dao động bên trong phân tử, vì thế giải đoán phổ hồng ngoại cần sự ngoại suy từ phổ của các hợp chất đơn giản hơn. Điều này lý giải tại sao không thể có sự xử lý chính xác các dao động của một phân tử phức tạp, giống nhƣ các chất mà chúng tôi đã tổng hợp. Vì thế, để khẳng định chắc chắn cấu trúc của các chất cần nghiên cứu các số liệu của phổ khối lƣợng và phổ cộng hƣởng từ hạt nhân. Sau đây là hình ảnh minh họa phổ hồng ngoại của chất IVa. BO MON HOA VAT LIEU-KHOA HOA-TRUONG DHKHTN Ten may: GX-PerkinElmer-USA Resolution: 4cm-1 Date: 11/9/2012

Nguoi do: Phan Thi Tuyet Mai

Ten mau: 6A

100.0 95 90 85 80 75 70

811 1314

65

503

1193 1094

60

1539

1204

55 3038

%T

939

593 495 558

783

1126

1444

692 1049

616

1115

2824

50

864

1349

45

2862

745

1081

2933

40

1377

35

3399

30

1004

1464

1029

3249

25

1621

20

1647

15

1704 1607

10 5 0.0 4000.0

3600

3200

2800

2400

2000

1800

1600

1400

1200

1000

800

600

400.0

cm-1

Hình 4.2. Phổ hồng ngoại của chất IVa 4.2.2. Phổ khối lƣợng Phổ khối lƣợng đóng vai trò quan trọng trong khẳng định cấu trúc các chất tổng hợp và thƣờng là phổ đƣợc lựa chọn đầu tiên để kiểm chứng xem sản phẩm phản ứng có khả năng sẽ là chất dự kiến hay không. Trên phổ đồ của 7 chất đều xuất hiện pic ion có số khối bằng [M-H]- (chế độ ESI (-)). Pic ion phân tử của các hợp chất không phải là vạch riêng lẻ mà là một cụm pic do các nguyên tố chứa trong hợp chất đều tồn tại các đồng vị nhƣ 54

13

C là

đồng vị của 12C, 2H là đồng vị của 1H, 33S,

15

N là đồng vị của 14N, 37Cl là đồng vị

của 35C, 18O là đồng vị của 16O... Bởi vậy, bên cạnh vạch chính ứng với pic ion phân tử M+• còn có các vạch [M-1]-, [M]-, [M+1]-... Phân tích phổ đồ của chất IVa làm ví dụ. Chất IVa có CTPT dự kiến là C16H21N3O4 tƣơng ứng với số khối 319. Phổ đồ của IVa (hình 4.3) cho thấy cụm pic ion phân tử gồm các ion đồng vị có số khối là M-1, M, M+1 (hình 4.3) và pic [M1]- cƣờng độ lớn nhất (100%) có số khối 318. Nhƣ vậy, sơ bộ cho thấy chất IVa có số khối đúng nhƣ số khối dự kiến.

Hình 4.3. Phổ khối lƣợng của chất IVa 4.2.3. Phổ cộ g hƣởng từ hạt nhân Cùng với dữ liệu phổ hồng ngoại và phổ khối, 7 chất tổng hợp còn đƣợc đo phổ 1H-NMR và 13C-NMR để khẳng định chính xác cấu trúc của sản phẩm. Dữ liệu phổ cộng hƣởng từ hạt nhân của các chất đƣợc trình bày trong mục 3.2 và phổ đồ trong phần phụ lục. Sau đây là một số bàn luận dựa trên dữ liệu phổ cộng hƣởng từ để chứng minh cấu trúc các chất tổng hợp.

55

4.2.3.1. Phổ 1H – NMR

a. Khung 3-methoxim-isatin có các proton được xác định rõ ràng trên phổ đồ  Proton H-4’ có độ dịch chuyển hóa học trong khoảng 7,49 – 7,94 ppm, vân phổ có dạng singlet (s) hoặc doublet (d). Chất IVa, IVg không có nhóm thế tại vị trí số 5’, do đó H-4’ tƣơng tác với H5’ (ortho) với hằng số tƣơng tác Jortho= 7,5 – 8,0 Hz, vân phổ dạng doublet (d) (hình 4.4). Các chất IVb-f đều là có các nhóm thế tại vị trí 5’, tính chất hút đẩy điện tử của nhóm thế có ảnh hƣởng đến độ chuyển dịch hóa học cũng nhƣ dạng vân phổ của H-4’. Các nhóm thế hút điện tử mạnh -NO2 hoặc các nguyên tử có độ âm diện lớn F, -Cl, -Br làm giảm sự chắn tại chỗ nên tăng độ dịch chuyển hóa học. Độ âm điện của các nhóm này càng lớn, thì độ dịch chuyển hóa học càng lớn, proton có xu hƣớng chuyển dịch sang phía từ trƣờng yếu. Tuy nhiên, khi các nhóm thế này ở bên cạnh proton, chúng có thể tạo dòng điện và tạo một từ trƣờng xung quanh H-4’, tạo ra sự chắn bất đẳng hƣớng. Vì thế, thay vì dịch chuyển về phía trƣờng yếu khi độ âm điện của nguyên tử bên cạnh tăng lên, các chất tổng hợp đã lần lƣợt dịch chuyển theo hƣớng ngƣợc lại theo chiều từ IVd, IVc, IVb, IVe về phía từ trƣờng mạnh. Ngoài ra, các nguyên tử - Cl, -Br tạo ra sự cản trở không gian giữa H-4’ và H-6’, nên vân phổ có dạng singlet (s), trong khi các nhóm thế -NO2, -F có dạng doublet (d). Chất IVf có nhóm thế -CH3 do tính chất đẩy điện tử yếu nên độ dịch chuyển hóa học gần nhƣ không thay đổi 7,73 – 7,74 ppm, vân phổ dạng singlet (s).  Proton H-5’ của các chất IVa, IVg có độ dịch chuyển là 7,46 và 7,09 ppm, vân phổ có dạng triplet do tƣơng tác với H-4’ và H-6’. Hằng số tƣơng tác H-4’ và H-6’ (Jortho) lớn, nằm trong khoảng 7,5 – 8,0 Hz nên vân phổ có dạng triplet (hình 4.4). 56

 Proton H-6’có độ dịch chuyển hóa học từ 7,07 – 8,35 ppm (thay đổi tùy thuộc vào ảnh hƣởng của nhóm thế 5’-R hoặc 7’-R) và tƣơng tác với proton là H-7’ (với dẫn chất có nhóm thế 5’-R) hoặc H-5’ (với đẫn chất có nhóm thế 7’-R) thì vân phổ có dạng doublet (d) (IVc, IVd, IVf, IVg), một số chất quan sát thấy cả tƣơng tác với H-4’ nên vân phổ có dạng doublet of doublets (dd) (IVe), vân phổ dạng triplet of doublets (td) do có thêm tƣơng tác với –F (IVb). Riêng chất IVa không có nhóm thế trên khung 3-methoxim-isatin nên proton H-6’ có thể tƣơng tác với H-5’ và H-4’ (Jortho≈ Jpara). Hằng số tƣơng tác ortho lớn, nằm trong khoảng 7,5 – 9,25 Hz (IVa-g), còn tƣơng tác meta có J thấp, khoảng 2,5 Hz (IVb, IVe).  Proton H-7’ của các chất IVa-f có độ dịch chuyển hóa học từ 7,00 – 7,35 ppm và tƣơng tác với proton là H-6’ thì vân phổ có dạng doublet (d), chất IVb quan sát thấy cả tƣơng tác với H-5’ nên vân phổ có dạng doublet of doublets (dd). Sau đây là phổ 1H – NMR của IVa.

Hình 4.4. Phổ 1H – NMR dãn rộng của IVa Trên lý thuyết, các H trên vòng thơm đều tƣơng tác với nhau tạo ra một hệ thống multiplet phức tạp. Thực tế, phổ đồ trong những trƣờng hợp trên cho thấy hằng số tƣơng tác giữa các proton là rất nhỏ và có thể bỏ qua (Jmeta, Jpara). 57

b. Các proton mạch nhánh  Một nhóm các proton quan trọng khác trong cấu trúc của các dãy chất trên là các proton mạch nhánh. Cả 7 chất đều có đủ số proton mạch nhánh với độ dịch chuyển hóa học của các nhóm -CH2- trong khoảng 1,24 – 3,95 ppm. Do hiệu ứng hút điện tử mạnh của nhóm chức amid và vòng 3-oxim-isatin làm hạt nhân bị giảm sự chắn tại chỗ, độ dịch chuyển của H-7 là lớn nhất, sau đó đến H-2 (hình 4.5).

Hình 4.5. Phổ 1H – NMR dãn rộng của IVg  Chúng tôi đã tiến hành so sánh phổ 1H-NMR phổ của từng cặp chất tƣơng ứng với nhau trong dãy chất IVa-g tổng hợp đƣợc với dãy chất 19a-g trong luận văn của Thạc sỹ Nguyễn Thị Mơ [4]. Cụ thể, khi so sánh phổ 1H-NMR của 19e (hình 4.6) và IVe (hình 4.7) thu đƣợc kết quả trong bảng 4.1.

58

Hình 4.6. Phổ cộng hƣởng từ 1H – NMR của 19e

Hình 4.7. Phổ cộng hƣởng từ 1H – NMR của IVe

59

Bảng 4.1. Bảng so sánh phổ cộng hƣởng từ 1H – NMR của 2 chất 19e và IVe

Vị trí các proton

Độ dịch chuyển hóa học  (ppm) 19e IVe

Nhận xét - Độ dịch chuyển hóa học của

H-4’

8,67

8,49

H-6’

8,34

8,35

H-7’

7,35

7,35

H-7

3,75

3,73

NH, -OH) của 2 chất là tƣơng

H-2

1,92

1,92

đƣơng nhau.

H-3

1,58-1,59

1,54-1,58

H-6

1,46-1,47

1,43-1,49

H-4, H-5

1,27-1,29

1,26-1,27 - Pic –OH (3’-oxim) trên phổ

-OH

14,13

-

-OCH3

-

4,29

Acid

-NH

10,34

10,33

hydroxamic

-OH

8,67

8,66

Khung isatin

H-6’, H-7’, các proton trong mạch nhánh và proton trong

Mạch nhánh -CH2-

Oxim

nhóm chức acid hydroxamic (-

- Độ dịch chuyển hóa học của proton H-4’ ở 2 chất khác nhau. đồ chất 19e không thấy xuất hiện trên phổ đồ chất IVe. - Pic -OCH3 (3’-oxim) của IVe không xuất hiện trên phổ của 19e.

So sánh phổ đồ của các cặp chất còn lại trong 2 dãy chúng tôi vẫn thu đƣợc kết quả tƣơng tự. Điều này chứng tỏ nhóm 3’-oxo ở các ester trung gian của 19a-g đã phản ứng với hydroxylamin, đồng thời sự thay đổi độ dịch chuyển hóa học của H-4’ nhƣ trên đã chỉ ra sự hiện diện của nhóm oxim ở vị trí 3’ của các dẫn chất 19a-g. 60

Điều này cũng có nghĩa, phản ứng tạo oxim của I đã xảy ra (sơ đồ 3.1, mục 3.1) . Ngoài ra, tại vị trí 3’-oxim của IVa-g không thấy xuất hiện pic dạng singlet tại 13,20 – 14,32 ppm của –OH nhƣ trong phổ đồ các chất 19a-g, thay vào đó phổ đồ của các chất IVa-g xuất hiện pic dạng singlet tại 4,19 – 4,29 ppm của –OCH3. Cấu trúc của các chất IVa-g có nhóm chức hydroxamic và liên kết amid nên còn quan sát thấy sự có mặt của 2 singlet có độ dịch chuyển hóa học 10,30 – 12,77 ppm và 8,62 – 8,78 ppm tƣơng ứng với proton –NH và -OH (acid hydroxamic).  Các dẫn chất có nhóm thế chứa proton trên khung 3-oxim-isatin nhƣ -CH3, OCH3 cho tín hiệu của các proton trong nhóm thế. Cụ thể nhƣ các chất IVa-g đều có nhóm methoxy -OCH3 cho vân phổ dạng singlet của 3H ở trƣờng thấp từ 4,19 – 4,29 ppm. Riêng chất IVf có nhóm thế -CH3 sẽ quan sát thấy vân phổ singlet của 3H ở  = 2,27 ppm. 4.2.3.2. Phổ 13C – NMR Phổ 13C-NMR cho thông tin trực tiếp về khung carbon của phân tử giúp cho việc xác định cấu trúc dễ dàng hơn. Sự tƣơng tác spin giữa carbon – carbon là rất hiếm (do hạt nhân

13

C chiếm tỷ lệ thấp), còn tƣơng tác spin C-H đƣợc khử ghép

spin hoàn toàn nên tín hiệu 13C-NMR là các mũi đơn, dễ phân tích.

-

Carbon trong nhóm carbonyl (C=O của acid hydroxamic) có độ dịch chuyển

hóa học từ 168,69 – 169,10 ppm. -

8 carbon của khung 3-methoxim-isatin có độ dịch chuyển hóa học nằm trong

khoảng 109,15 – 162,57 ppm. Trong đó, C2’, C3’ và C8’ do gắn với dị tố O, N nên cộng hƣởng ở trƣờng thấp hơn ( cao hơn) so với các carbon C4’, C5’, C6’, C7’ và C9’. Tuy nhiên, tùy thuộc vào bản chất của nhóm thế 5-R mà độ dịch chuyển hóa học của 8 carbon của khung 3-oxim-isatin có thể thay đổi tăng hoặc giảm so với các chất không gắn nhóm thế.

61

-

Phần cầu nối alkyl cho tín hiệu cộng hƣởng của carbon trong khoảng 24,91 –

40,87 ppm. Trong đó, C7 và C2 gắn với nhóm hút điện tử mạnh nên dịch chuyển về phía trƣờng yếu, chúng có độ dịch chuyển hóa học  lớn hơn so với các C còn lại trong cầu nối. - Phổ đồ các chất cũng đều cho tín hiệu cộng hƣởng của các proton có trên nhóm thế -OCH3 ( = 64,34 – 65,20 ppm). Chất IVf có nhóm -CH3 với  = 20,40 ppm. Riêng chất IVb có gắn nhóm thế 5’-F nên còn xuất hiện tƣơng tác C5’-F. Ngoài ra, do ảnh hƣởng của Flo, tín hiệu của C trong vòng thơm (C4’, C6’, C7’, C9’) bị tách đôi tín hiệu thành 4 cặp từ 110,46 – 119,23 ppm. Sau đây là minh họa phổ 13C-NMR của chất IVf.

62

Hình 4.8. a, Phổ 13C – NMR của chất IVf. b, Phổ 13C – NMR dãn rộng của chất IVf 63

4.3. VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC 4.3.1. Về tác dụng ức chế HDAC Kết quả phân tích Western blot của các chất IVa-g cho thấy IVa-c và IVg ức chế mạnh HDAC ở nồng độ 1 µM. Hình ảnh kết quả điện di trên gel (hình 3.1): vết đậm của IVa-c, IVg biểu thị sự có mặt của acetyl-histon H3 và acetyl-histon H4, chứng tỏ các chất này đã ức chế đƣợc HDAC nên các acetyl-histon H3 và acetylhiston H4 không bị deacyl hóa. Trong khi đó, các chất IVd, IVe có kết quả điện di trên gel là các vết mờ, chứng tỏ 2 chất này có khả năng ức chế HDAC nhƣng hiệu lực ức chế không đáng kể. Với chất IVf, không thấy vết của acetyl-histon H3 và acetyl-histon H4 trên hình ảnh điện di, cho thấy 2 histon này đã bị deacetyl hóa. Nhƣ vậy ở nồng độ 1 µM, chất IVf không thể hiện tác dụng ức chế HDAC. Khi so sánh kết quả phân tích Western blot của các chất IVa-g với các chất 19a-g đã đƣợc tổng hợp trong luận văn Thạc sỹ của Nguyễn Thị Mơ [4], chúng tôi nhận thấy:

Hình 4.9. Kết quả phân tích Western blot của 2 dãy chất 19a-g và IVa-g

64

-

Cả 2 chất 19e và IVe (nhóm thế -NO2 ở vị trí 5’) đều không có tác dụng ức

chế HDAC ở nồng độ 1 µM. Nhƣ vậy có thể kết luận rằng sự hiện diện của nhóm thế 5-NO2 trên khung 3-methoxim-isatin gây cản trở cho việc ức chế HDAC. -

Các chất 19d, 19f có tác dụng ức chế HDAC ở nồng độ 1 µM, trong khi các

chất IVd, IVf hầu nhƣ không có tác dụng ở nồng độ này. Điều này cho thấy sự hiện diện của nhóm thế cồng kềnh nhƣ -Br, -CH3 ở vị trí số 5 trên khung 3-oxim-isatin cùng với việc methyl hóa của nhóm 3’-oxim (IVd, IVf) không thuận lợi cho việc ức chế enzym. 4.3.2. Về tác dụng kháng tế bào u g thƣ in vitro Với các acid hydroxamic đã thiết kế, tác dụng ức chế HDAC là một yếu tố quan trọng quyết định tác dụng kháng tế bào ung thƣ. Tuy nhiên, để gây ra độc tính với tế bào, các chất phải có khả năng thấm qua màng sinh học vào trong tế bào, tiếp cận với enzym. Vì thế, các chất IVa-g tiếp tục đƣợc tiến hành thử độc tính tế bào in vitro nhằm tìm ra những chất thực sự có tác dụng sinh học tốt. Thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ ngƣời in vitro trên 5 dòng tế bào thử nghiệm: SW620: tế bào ung thƣ đại tràng, MCF-7: tế bào ung thƣ vú, AsPC-1: tế bào ung thƣ tụy, PC-3: tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến, NCI-H460: tế bào ung thƣ phổi theo phƣơng pháp MTT. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 4.2. Kết quả thử độc tính tế bào cho thấy cả 7 chất thử nghiệm đều có tác dụng ức chế trên cả 5 dòng tế bào, đặc biệt là 2 dòng tế bào SW620 (0,26 – 2,32 µM) và MCF-7 (0,34 – 7,79 µM). Các chất IVa-c và đặc biệt là IVg thể hiện tác dụng ức chế HDAC mạnh với biểu hiện histon-H3, histon-H4 không bị deacetyl hóa trong phân tích Western blot là những chất gây độc mạnh trên cả 5 dòng tế bào thử nghiệm. Các chất IVd và IVf là những chất hầu nhƣ không gây ra tác dụng ức chế HDAC là những chất có độc tính tế bào thấp nhất trong dãy IVa-g. Nhƣng đáng chú ý, với chất IVe chúng tôi nhận thấy có sự khác biệt về hoạt tính sinh học so với các dẫn chất còn lại trong dãy. Mặc dù IVe không gây tác dụng ức chế enzym HDAC ở nồng độ 1 µM ở thử nghiệm Western blot, nhƣng khi thử nghiệm tác dụng kháng tế bào ung thƣ in vitro, IVe cho thấy khả năng ức chế mạnh trên 4 dòng tế bào (SW620, MCF-7, PC-3, 65

AsPC-1) với nồng độ 0,84 – 1,69 µM. Chất này chỉ có độc tính thấp với dòng tế bào NCI-H460 với nồng độ 14,7 µM. Điều này chứng tỏ IVe có thể không ức chế HDAC nhƣng ức chế yếu tố khác trong chu trình phát triển của tế bào. Bảng 4.2. Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro của các chất IVa - g

TT Chất

R

Độc tính tế bào (IC50)1 , M

KLPT SW620

MCF-7

PC3

AsPC-1

NCI-H460

1

IVa

-H

319,36

0,73

1,71

1,67

1,22

0,75

2

IVb

5-F

337,35

1,11

2,42

1,15

0,97

0,97

3

IVc

5-Cl

353,80

0,49

1,56

2,33

0,49

0,76

4

IVd

5-Br

398,25

2,32

7,79

8,91

1,68

2,90

5

IVe

5-NO2

364,35

1,35

0,94

1,69

0,84

14,27

6

IVf

5-CH3

333,38

1,07

16,67

0,35

5,48

1,19

7

IVg

7-Cl

353,80

0,26

0,34

0,29

0,63

0,35

264,32

3,70

6,42

4,31

3,66

2,77

SAHA2

8

Chú thích:

1

Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào;

2

Acid suberoylanilid

hydroxamic

Khi so sánh độc tính trên tế bào của 7dẫn chất IVa-g với SAHA, chúng tôi nhận thấy đối với từng dòng tế bào, hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro của các dẫn chất có nhóm thế trên khung 3-methoxim-isatin là khác nhau so với SAHA.

-

66

IC50 (µM) 18

16

14

IVa

12

IVb IVc

10

IVd IVe

8

IVf IVg 6

SAHA

4

2

0 SW620

MCF-7

PC-3

AsPC-1

NCI-H460

Dòng tế bào

Hình 4.10. Biểu đồ so sánh tác dụng kháng tế bào ung thƣ in vitro của các dẫn chất IVa-g -

Trên dòng tế bào SW620: Tất cả các dẫn chất IVa-g đều có hoạt tính mạnh

hơn SAHA, trong đó IVg (nhóm thế 7-Cl) và IVc (nhóm thế 5-Cl) là hai dẫn chất có hoạt tính mạnh nhất với IC50 lần lƣợt là 0,26 µM và 0,49 µM, mạnh hơn SAHA 14 lần và 8 lần trong cùng thử nghiệm. IVd (nhóm thế 5-Br) là chất có hoạt tính kháng tế bào ung thƣ thấp nhất trong dãy với IC50 = 2,32 µM. -

Trên dòng tế bào MCF-7: IVg (nhóm thế 7-Cl) là chất có hoạt tính mạnh

nhất trong dãy IVa-g (IC50 = 0,34 µM) và mạnh hơn SAHA (IC50 = 6,42 µM) 19 lần. Các dẫn chất IVa-c, IVe đều có hoạt tính mạnh hơn SAHA, còn lại IVf (nhóm thế 5-CH3, IC50 = 16,67 µM) và IVd (nhóm thế 5-Br, IC50 = 7,79 µM) là hai chất có hoạt tính thấp nhất, đều yếu hơn SAHA. 67

-

Trên dòng tế bào PC-3: IVg (nhóm thế 7-Cl) là chất có hoạt tính mạnh nhất

(IC50 = 0,29 µM), gấp 15 lần so với SAHA (IC50 = 4,31 µM). Tất cả các chất còn lại đều có hoạt tính mạnh hơn SAHA, trừ IVd (nhóm thế 5-Br, IC50 = 8,91 µM). -

Trên dòng tế bào AsPC-1: IVc (nhóm thế 5-Cl) và IIg (nhóm thế 7-Cl) là hai

dẫn chất có hoạt tính mạnh nhất với IC50 lần lƣợt là 0,49 µM và 0,63 µM, cao gấp 7 và 6 lần SAHA (IC50 = 3,66 µM). IVf (nhóm thế 5-CH3, IC50 = 5,48 µM) là chất có hoạt tính thấp nhất và là dẫn chất duy nhất trong dãy IVa-g có hoạt tính thấp hơn SAHA trên dòng tế bào này. -

Trên dòng tế bào NCI-H460: IVg (nhóm thế 7-Cl) là chất có hoạt tính mạnh

nhất (IC50 = 0,35 µM), gấp 8 lần so với SAHA (IC50 = 2,77 µM). IVe (nhóm thế 5NO2, IC50 = 14,27 µM) là chất có hoạt tính thấp nhất trong dãy. Nhƣ vậy, trong dãy IVa-g, tất cả các chất IVa-c, IVg đều có hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro mạnh hơn SAHA trên cả 5 dòng tế bào thử nghiệm, chỉ có IVd và IVf là có hiệu lực thấp hơn SAHA trên dòng tế bào MCF-7. Điều đó cho thấy nhóm thế cồng kềnh ở vị trí số 5 trên vòng isatin có ảnh hƣởng bất lợi đối với độc tính của các dẫn chất 3’-methoxim-isatin (IVd, IVf). Từ các kết quả trên, có thể thấy nhóm thế 5-Cl, đặc biệt 7-Cl trên vòng isatin của dẫn chất 3-methoxim-isatin làm tăng thêm hoạt tính của các dẫn chất này. Chất IVb có hoạt tính kém hơn IVc do có nhóm thế hút điện tử rất mạnh (-F) làm giảm mật độ điện tử trên khung 3-methoxim-isatin nên giảm tƣơng tác Van der Waals của chúng với các acid amin thơm dẫn đến giảm hoạt tính. Tiến hành so sánh tác dụng kháng tế bào ung thƣ của 2 dãy IVa-g và 19a-g đƣợc tổng hợp trong luận văn Thạc sỹ của Nguyễn Thị Mơ [4], chúng tôi thu đƣợc kết quả trong bảng 4.2.

68

Bảng 4.3. So sánh tác dụng kháng tế bào ung thƣ của 2 dãy IVa-g và 19a-g

TT

Độc tính tế bào (IC501, M)

Chất SW620

MCF-7

PC3

AsPC-1

NCI-H460

1

IVa/19a 0,73

0,64

1,71

0,79 1,67

0,98

1,22

1,10

0,75

0,89

2

IVb/19b 1,11

0,11

2,42

1,55 1,15

2,73

0,97

1,72

0,97

1,50

3

IVc/19c 0,49

0,65

1,56

0,68 2,33

0,85

0,49

1,86

0,76

0,85

4

IVd/19d 2,32

0,29

7,79

1,77 8,91

2,21

1,68

0,08

2,90

0,97

5

IVe/19e 1,35

3,39

0,94

1,34 1,69 19,69 0,84

4,68

14,27

7,71

6

IVf/19f 1,07

0,99

1,19 0,35

0,62

5,48

2,44

1,19

2,09

7

IVg/19g 0,26

1,05

16,6 7 0,34

1,74 0,29

1,57

0,63

1,82

0,35

1,35

8

SAHA2 Chú thích:

3,70 1

6,42

4,31

3,66

Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào;

2,77 2

Acid suberoylanilid

hydroxamic

So với tất cả các chất trong 2 dãy trên, chúng tôi nhận thấy chất IVg là chất có hoạt tính kháng tế bào ung thƣ mạnh nhất trên cả 5 dòng tế bào. Tuy nhiên, nếu xét trên tổng thể, hoạt tính kháng tế bào ung thƣ của các chất dãy IVa-g có xu hƣớng yếu hơn so với các chất dãy 19a-g. Điều này có thể dự đoán đƣợc từ:  Kết quả docking các chất đại diện: -

Các chất dãy 19a-g có nhóm –OH (3’-oxim) có khả năng tạo liên kết hydro nội phân tử với nhóm carbonyl ở vị trí 2’, trong khi các chất dãy IVa-g không hề có liên kết này. Đó là điều kiện thuận lợi hơn cho các chất 19a-g dễ dàng qua đƣợc màng sinh học hơn so với các chất IVa-g. 69

-

Nhóm methyl (3’-oxim) cồng kềnh làm cho các dẫn chất IVa-g bị cản trở về mặt không gian nên khó thấm qua màng sinh học hơn so với các dẫn chất 19a-g.

 Chỉ số logP của các chất trong dãy 19a-g [4] và IVa-g cho thấy các chất IVa-g đều có logP thấp hơn so với chất 19a-g tƣơng ứng trong dãy (bảng 4.4). Bảng 4.4. So sánh giá trị logP của các chất 19a-g và IVa-g TT

Chất

LogP

R 19

IV

1

a

5-H

2,69

2,67

2

b

5-F

2,90

2,87

3

c

5-Cl

3,34

3,31

4

d

5-Br

3,58

3,56

5

e

5-NO2

2,91

2,89

6

f

5-CH3

3,24

3,22

7

g

7-Cl

3,34

3,31

Điều này chứng tỏ, các dẫn chất 19a-g có tính thân dầu hơn so với các dẫn chất IVa-g, vì thế các dẫn chất 19a-g có khả năng tƣơng tác chặt chẽ hơn với kênh enzym HDAC thân dầu.  Nhóm –OH (3’-oxim) ngoài khả năng tạo liên kết hydro nội phân tử, còn có khả năng tạo liên kết hydro với các acid amin ở miệng kênh enzym, do đó khả năng gắn chặt với enzym của dãy chất 19a-g tốt hơn so với dãy chất IVa-g. So sánh cả 2 dãy chất trên với SAHA, chúng tôi thấy phần nhận diện bề mặt của các chất này có thêm 2 nguyên tử N, sự có mặt của chúng có lẽ đã làm tăng khả năng tƣơng tácvới các acid amin ở miệng túi của HDAC, đồng thời mạch carbon thân dầu với độ dài phù hợp (6C) đã giúp đƣa nhóm chức acid hydroxamic tiếp xúc dễ dàng với Zn2+, tạo nên khả năng ức chế HDAC một cách hiệu quả cho chúng. Các chất IVa-g trong luận văn đã tiếp tục duy trì phần cầu nối 6C, nhóm acid hydroxamic gắn Zn2+, nhƣng thay đổi nhóm nhận diện bề mặt. So với SAHA, nhóm nhận diện bề mặt phenyl đã đƣợc thay thế bằng nhóm 3-methoxim-isatin. Mục tiêu 70

của nghiên cứu là thiết kế, tổng hợp đƣợc dãy dẫn chất mới, đồng thời xác định kết quả của việc thay đổi nhóm nhận diện bề mặt, xa hơn là xem xét ảnh hƣởng của nhóm thế tại các vị trí khác nhau trên vòng isatin. Kết quả cho thấy hoạt tính sinh học rất tốt của các acid hydroxamic IVa-g. Ngoài ra, các chất đều thỏa mãn đƣợc yêu cầu của quy tắc Lipinsky về độ giống thuốc. Nhƣ vậy, cùng với các kết quả nghiên cứu trƣớc đây [6, 10, 11] có thể thấy cầu nối 6C và nhóm gắn Zn2+ tƣơng tự SAHA là yếu tố quan trọng quyết định độc tính tế bào của các acid hydroxamic hƣớng ức chế histon deacetylase. Bên cạnh đó, viêc lựa chọn nhóm nhận diện bề mặt là 3-methoxim-isatin trong nghiên cứu cho hoạt tính tốt, mạnh hơn gấp nhiều lần so với SAHA, đặc biệt là các chất IVa-c, IVg. Điều này mở ra triển vọng cho việc nghiên cứu cận lâm sàng và lâm sàng của các dẫn chất sau này.

71

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 1. KẾT LUẬN 1.1. Về tổng hợp hóa học và khẳ g định cấu trúc  Đã tổng hợp đƣợc 7 dẫn chất của acid hydroxamic chƣa thấy công bố trong bất cứ tài liệu nào trên thế giới cũng nhƣ trong nƣớc.

N-hydroxy-7-(3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanamid

(IVa)

7-(5-fluoro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin)-N-hydroxyheptanamid

(IVb)

7-(5-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin)-N-hydroxyheptanamid

(IVc)

7-(5-bromo-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin)-N-hydroxyheptanamid

(IVd)

N-hydroxy-7-(3-(methoxyimino)-5-nitro-2-oxoindolin)heptanamid

(IVe)

N-hydroxy-7-(3-(methoxyimino)- 5-methyl-2-oxoindolin)heptanamid

(IVf)

7-(7-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin)-N-hydroxyheptanamid

(IVg)

 Đã kiểm tra độ tinh khiết và khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp đƣợc 1.2. Về hoạt tính sinh học  Kết quả thử hoạt tính sinh học của các chất IVa-g cho thấy IVa-c và IVg ức chế mạnh HDAC; chất IVd, IVe có khả năng ức chế HDAC nhƣng hiệu lực ức chế không đáng kể; IVf không có tác dụng ức chế HDAC ở nồng độ 1 µM.  Tác dụng kháng tế bào ung thƣ in vitro: 7 chất đều có tác dụng kháng 5 dòng tế bào ung thƣ, trong đó có 4 chất IVa-c, IVg tác dụng mạnh hơn SAHA trên cả 5 dòng tế bào. Đặc biệt, trên dòng tế bào SW620 chất IVg (nhóm thế ở vị trí số 7 trên khung isatin) với IC50 = 0,26 µM có tác dụng mạnh gấp 14 lần SAHA (IC50 = 3,7 µM), trên dòng tế bào MCF-7 với IC50 = 0,34 µM mạnh gấp 19 lần SAHA (IC50 = 6,42 µM), trên dòng PC-3 với IC50 = 0,29 µM mạnh gấp 15 lần SAHA (IC50 = 4,31 µM). 2. ĐỀ XUẤT

72

-

Tiếp tục nghiên cứu và phát triển các dẫn xuất của acid hydroxamic mang

khung 3-methoxim-isatin mang nhóm thế ở vị trí số 7 trên khung isatin. -

Thành công bƣớc đầu cho thấy chất 7-(7-cloro-3-(methoxyimino)-2-

oxoindolin)-N-hydroxyheptanamid (IVg) cần nghiên cứu tiền lâm sàng với hy vọng có thể trở thành ứng cử viên lâm sàng điều trị ung thƣ.

73

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Đỗ Thị Mai Dung (2013), Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 1,3.4 – thiadiazol, Khóa luận tốt nghiệp dƣợc sĩ, Đại Học Dƣợc Hà Nội. 2. Vũ Phƣơng Đông (2012), Tổng hợp N1-hydroxy-N8-(5-phenyl-1,3,4thiadiazol-2-yl)octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase, Khóa luận tốt nghiệp dƣợc sĩ, Đại Học Dƣợc Hà Nội. 3. Phạm Khánh Phong Lan (2007), Các phương pháp quang phổ xác định cấu trúc hợp chất hữu cơ, tập 1, Giáo trình sau đại học, Đại học Y Dƣợc TP.Hồ Chí Minh, trang 21-45. 4. Nguyễn Thị Mơ (2013), Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 3oxim-isatin hướng tác dụng kháng ung thư, Luận văn thạc sĩ, Đại học Dƣợc Hà Nội. 5. Nguyễn Hải Nam (2012), Một số mục tiêu phân tử và ứng dụng trong nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung thư hiện nay, NXB Y học, trang 103-186. 6. Đào Thị Kim Oanh (2013), Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất acid hydroxamic hướng ức chế enzym histon deacetylase”, Luận án tiến sĩ dƣợc học, Đại học Dƣợc Hà Nội. 7. Vũ Thị Thanh Tâm (2013), Tổng hợp N1-hydroxy-N8-(5-phenyl-1,3,4thiadiazol-2-yl)octandiamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase, Khóa luận tốt nghiệp dƣợc sĩ, Đại Học Dƣợc Hà Nội. Tiếng Anh 8. Ajamian F., et al. (2004), "Selective regulation of class I and class II histone deacetylases expression by inhibitors of histone deacetylases in cultured mouse neural cells", Neuroscience Letters, 365(1), p. 64-68. 9. Annemieke

J.M.,

et

al.

(2003),

"Histone

deacetylases

(HDACs):

characterization of the classical HDAC family", Biochem. J. , 370, p. 737– 749.

10. Andrianov V., et al. (2008), “Novel amide derivatives as inhibitors of histone deacetylase: Design, synthesis and SAR”, European Journal of Medicinal Chemistry, 226, 1-19. 11. Andrianov V., et. al. (2009), “Novel amide derivatives as inhibitors of histone deacetylase: Design, synthensis and SAR”, European Journal of Medicinal Chemistry, 44, 1067-1085. 12. Bernard Miller (1980), Organic chemistry: The basic of life, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc, USA, 321-324, 355-364. 13. Betrand P. (2010), “Inside HDAC with HDAC inhibitors”, Eur. J. Med. Chem, 45, 2095 – 2116. 14. Bieliauskas A.V., et. al (2007), “Structural requirement of HDAC inhibitors: SAHA analogs functionalized adjacent to the hydroxamic acid”, Bioorg. Med. Chem. Lett., 17, 2116-2219. 15. Chen CS., et al. (2007), “Histone deacetylase inhibitors sensitieze prostate cancer cells to agents that produce DNA double-strand breaks by targeting Ku70 acetylation”, Cancer Res., 67, 5318 – 5327. 16. Chen P.C., et al. (2008), “Synthesis and structure-activity relationship of histone deacetylase (HDAC) inhibitors with triazole-linked cap group”, Bioorg. Med. Chem. Lett., 16, 4839-4853. 17. Dehmel F., et. al. (2008), “Trithiocarbonates as a novel class of HDAC inhibitors: SAR studies, isoenzym selectivity, and pharmacological profiles”, J. Med. Chem, 51, 3985 – 4001. 18. Dokmanovic M., Marks P.A. (2005), “Propects: Histone deacetylase inhibitors”, Journal of Cellular Biochemistry, 96, 293 – 304. 19. Dow G.S., et. al. (2008), “Antimalarial activity of phenylthiazol - bearing hydroxamate – based histone deacetylase inhibitors”, Antimicrobial agents and chemotherapy, 52, p. 3467 – 3477. 20. Edward S. and Douglas W.C. (2000), “Histone deacetylase, transcriptional control, and cancer”, Journal of Cenlular Physyology, 184(1), p. 1-16.

21. Fazi F., et. al. (2005), “Retioic acid targets DNA – methyltransferase and histone deacetylases during APL blats differentiation in vitro and in vivo”, Oncogene, 24, 1820 – 1830. 22. Guan P., et. al. (2012), “Design, synthesis and preliminary bioactivity studies of 1,3,4-thiadiazole hydroxamic acid delivatives as novel histone deacetylase inhibitors”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 20, 3865-3872. 23. Hanessian S., et.al. (2007), “ω – Alkoxy analouges of SAHA as inhibitors of HDAC: A study of chain – length and stereochemical dependence”, Bioorg. Med. Chem. Lett., 17, 6261 – 6265. 24. Jones P., et. al. (2006), “A series of novel, potent, and selective histone deacetylases inhibitors”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 16(23), p. 5948-5952. 25. John R.S. and Collegues A. (2004), "Structural Snapshots of Human HDAC8 Provide Insights into the Class I Histone Deacetylases", The Journal of Structure, 12(7), p. 1325-1334. 26. Johnstone R.W (2002), “Histone deacetylase inhibitors: New drugs for the treatment of cancer”, Drug Discovery Nature Review, 1, 287-297. 27. Kim D.H., et. al. (2007), “Anti-tumor activity of N-hydroxy-7-(2naphthylthio) heptanomide, a novel hisston deacetylase

inhibitor”,

Biochemical and Biophysical Research Communication, 356, 233-238. 28. Kim H.J, Bae S.C. (2011), “Histone deacetylase inhibitors: molecular machanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs”, Am J Transl Res, 3(2), 166-179. 29. Kim S.A., Jin Y.L., Kim H.S., (2009), “Structure – activity relationship studies of novel oxygen-incorporated SAHA analogs”, Arch Pharm Res, Vol 32, No 1, 15-21. 30. Kozikowski A.P., et. al. (2008), “Chemistry, biology and QSAR studies of substituted biaryl hydroxamates and mercaptoacetamides as HDAC inhibitors – Nanomola – Potency inhibitors of pancreatic cancer cell growth”,ChemMedChem, 3, p. 487- 501.

31. Kozikowski A.P., et. al. (2008), “Use of the nitril oxide cycloaddition (NOC) recation for molecular probe generation: A new class of enzyme selective of histone deacetylase inhibitors showing picomolar activity at HDAC6”, J. Med. Chem, 51, 4370 – 4373. 32. Lipinski C.A., et al. (1997), “Experimental and computational approaches to estimal solubility and permeability in drug discovery and development settings”, Advanced Drug Delivery Reviews, 46(3-26), p. 3-26. 33. Liu T. et al. (2006), “Histon deacetylase inhibitors: Mulatifunctional anticancer agents”, Cancer Treatment Review, 32, 157-165. 34. Manku S., et al. (2009), “Synthensis and evaluation of lysin delived sulfamids as histone deacetylase inhibitors”, Bioorg. Med. Chem. Lett., 19, 1866 – 1870. 35. Monneret Claude (2005), “Histone deacetylase inhibitors”, Eur. J. Med. Chem., 40, 1 – 13. 36. Marks P.A., et. al. (2001), “Histone deacetylases and cancer: Causes and therapy”, Macmillan Magazines LTD., 1, 194-200. 37. Marks P.A, Breshow. R (2007), “Dimethyl sulfoxide to Vorinostat development of thí histone deacetylase inhibitor as an anticancer drug”, Nat. Biotechnol, 25, 84-90. 38. Marson

C.M.,

et

al.

(2007),

“Structure-activity

relationships

of

aryloxyalkanoic and hydroxamides as potent inhibitors of histone deacetylase”, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 17, 136-141. 39. Maurizio Taddei, et al. (2013), “Lactam based 7-amino suberoylamide hydroxamic acids as potent HDAC inhibitors”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 24, p61–64. 40. Nam N.H., et al. (2011), “Benzothiazole-containing hydroxamic acids as histone deacetylase inhibitors and antitumor agents”, Medicinal Chemistry Letters, 21(24), 7509-7512.

Bioorganic

and

41. Nam

N.H.,

et

al.

(2013),

“New

benzothiazole/thiazole-containing

hydroxamic acids as histone deacetylase inhibitors and antitumor agents”, J. Med. Chem, 9(8), 1051-1057. 42. Philip J., et al. (2006), “A series of novel, potent, and selective histone deacetylase inhibitors”, Bioor. Med. Chemi. Lett, 16, 5948-5952. 43. Price S., et al. (2007), “Indentification and optimization of series of substituted 5-pyrimidin-2-thiophene-2-hydroxamic acids as potent histone deacetylase inhibitors”, Bioorg. Med. Chem. Lett., 17, 363-369. 44. Rajak H., et al. (2011), “2,5,-Disubstituted-1,3,4-oxadiazole/thiadiazole as surface recognition moiety: Design and synthesis of novel hydroxamic acid based histone deacetylase inhibitors”, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 21, 5735-5738 45. Roth S.Y., Denu J.M., Alllis C.D. (2001), “Histone acetytransferases”, Annu. Rev. Biochem, 120, 81 – 120. 46. Ruijter A.J.M., et al. (2003), “Histone deacetylases: characterization of the classical HDAC family”, Biochem J., 370, 737 – 749. 47. Salmi-Smai. C., et. al. (2010), “Modified cap group Suberoyalanilide hydroxamic acid histon deacetylase inhibitor derivatives reveal improved selective antileukemic activity”, J. Med. Chem, 53, 3038-3047. 48. Seto E. and Glozak M.A. (2007), "Histone deacetylases and cancer", Oncogene, 26, p. 5420-5432. 49. Verdin E. (2006), Histone deacetylases transcriptional regulation and other cellular functions, Cancer drug discovery and development, SpringerLink, Humana Press: Totowa, N.J. 50. Witt O., Deubzer H.E., Midle T., Oehme I. (2009), “HDAC family: What are the cancer relevant targets?”, Cancer Letters, 277, 8 – 21. 51. Word Health Organization (2012), “Fact sheets by Cancer”. http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx

52. Yang X.J. and Seto E. (2007), “HATs and HDACs: from structure, function and regulation to novel strategies for therapy and prevention”, Oncogene, 26, p.5310–5318. 53. Zang C., et al. (2005), “Selective indution of apoptosis by histone deacetylase inhibitor SAHA in cutaneus T – cell: Relevance to mechanim of therapeutic action”, J. Invest. Dermatol, 125, 1045 – 1052. 54. Zhang S., et al. (2014), “A Novel Suberoylanilide Hydroxamic Acid Histone Deacetylase Inhibitor Derivative, N25, Exhibiting Improved Antitumor Activity in both Human U251 and H460 Cells”, Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 15 (10), p. 4331-4338.

PHỤ LỤC PHỔ Phụ lục 1-1 đến 1-4: Phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR của chất IVa Phụ lục 2-1 đến 2-4: Phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR của chất IVb Phụ lục 3-1 đến 3-4: Phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR của chất IVc Phụ lục 4-1 đến 4-4: Phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR của chất IVd Phụ lục 5-1 đến 5-4: Phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR của chất IVe Phụ lục 6-1 đến 6-4: Phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR của chất IVf Phụ lục 7-1 đến 7-4: Phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR của chất IVg

Phụ lục 1-1: Phổ IR của chất IVa

Phụ lục 1-2: Phổ MS của chất IVa

Phụ lục 1-3: Phổ 1H-NMR của chất IVa

Phụ lục 1-4: Phổ 13C-NMR của chất IVa

Phụ lục 2-1: Phổ IR của chất IVb

Phụ lục 2-2: Phổ MS của chất IVb

Phụ lục 2-3: Phổ 1H-NMR của chất IVb

Phụ lục 2-4: Phổ 13C-NMR của chất IVb

Phụ lục 3-1: Phổ IR của chất IVc

Phụ lục 3-2: Phổ MS của chất IVc

Phụ lục 3-3: Phổ 1H-NMR của chất IVc

Phụ lục 3-4: Phổ 13C-NMR của chất IVc

Phụ lục 4-1: Phổ IR của chất IVd

Phụ lục 4-2: Phổ MS của chất IVd

Phụ lục 4-3: Phổ 1H-NMR của chất IVd

Phụ lục 4-4: Phổ 13C-NMR của chất IVd

Phụ lục 5-1: Phổ IR của chất IVe

Phụ lục 5-2: Phổ MS của chất IVe

Phụ lục 5-3: Phổ 1H-NMR của chất IVe

Phụ lục 5-4: Phổ 13C-NMR của chất IVe

Phụ lục 6-1: Phổ IR của chất IVf

Phụ lục 6-2: Phổ MS của chất IVf

Phụ lục 6-3: Phổ 1H-NMR của chất IVf

Phụ lục 6-4: Phổ 13C-NMR của chất IVf

Phụ lục 7-1: Phổ IR của chất IVg

Phụ lục 7-2: Phổ MS của chất IVg

Phụ lục 7-3: Phổ 1H-NMR của chất IVg

Phụ lục 7-4: Phổ 13C-NMR của chất IVc