PREPARATE ENZIMATICE UTILIZATE îN INDUSTRIA BERII În industria berii intervin două tehnologii distincte şi anume tehnologia malţului şi tehnologia berii.
4.1. TEHNOLOGIA MALŢULUI Tehnologia malţului implică următoarele operaţii (fig. 1) din care, din punct de vedere biotehnologic, interesează operaţia de germinare a orzului, respectiv orzoaicei, materii prime de start. Germinarea orzului/orzoaicei are drept scop următoarele: -
sinteza de enzime în cantitate mai mare;
-
micşorarea complexităţii substanţelor de rezervă şi a celor ce intră în structura bobului de
orz/orzoaică, proces denumit şi “solubilizarea orzului”. La germinarea orzului/orzoaicei au loc următoarele procese: -
creşterea ţesutului embrionar cu dezvoltarea plumulei şi a radicelelor;
-
activarea enzimelor preexistente în orz şi sintetizarea “de novo” a enzimelor, în principal a
hidrolazelor, orzul/orzoaica matur(ă) conţinând în cantităţi mici toate enzimele hidrolitice cu excepţia -amilazei. La germinare se formează deci amilază şi cantităţi noi din celelalte hidrolaze în următoarea succesiune: -glucanaze, -amilază, enzime proteolitice (peptidaze şi proteinaze), fosfataze, -amilază; -
respiraţia, care va fi dependentă de aerarea orzului în procesul de germinare. La germinare sunt degradate principalele substanţe din orz şi anume:
Degradarea amidonului. Conţinutul de amidon scade de la ~ 63% la ~ 58% prin formare
de zaharuri simple sub acţiunea amilazelor. Din zaharurile simple formate ~ 50% sunt consumate prin respiraţie. Activitatea amilazică a malţului finit se măsoară prin “puterea diastazică”.
Orz brut Condiţionare Precuraţire Curăţire Sortare pe calitate Depozitare pentru postmaturare şi învingerea repausului germinativ Apă
Aer
Aer
Înmuierea orzului la 1520ºC/36-48 ore, spălare şi dezinfectare Germinare 17-25ºC/4-6 zile
Aer cald
Orz germinat (malţ verde) Uscare la 50-60ºC la 60-80ºC Răcire şi degerminare Malţ finit Depozitare pentru maturare
Fig. 1. Schema de operaţii unitare a procesului de fabricare a malţului
Degradarea hemicelulozelor Pereţii celulari ai bobului de orz sunt formaţi din
hemiceluloze, respectiv din -glucani (80-90%) şi pentozani (20%). -Glucanii sunt polimeri liniari cu masă moleculară mare (conţin ~ 200000 resturi de D-glucopiranoză) formaţi din D-glucoză legate între ele -1,4 (70%) şi 1,3 (30%). La nivelul pereţilor celulari -glucanii sunt legaţi de proteine prin legături covalente, formând complexe care realizează o matrice relativ rigidă. Pentozanii sunt polimeri ramificaţi cu masă moleculară mare formaţi din molecule de
D-xiloză legate -1,4. Lanţurile laterale sunt formate din arabinoză. Prima enzimă implicată în degradarea -glucanilor este -glucan solubilaza care
realizează scindarea -glucanului de proteină (enzima joacă rolul unei carboxipeptidaze),
-
glucanii eliberaţi din complex devenind solubili. -Glucan solubilaza este prezentă în orz dar este şi sintetizată în cursul germinării. Enzima este termostabilă, fiind stabilă la brasaj, timp de o oră şi la 65C. -Glucanii sunt degradaţi în continuare de -glucanaze diferite. Două endo--
glucanaze şi anume -1,3 glucanaza şi 1,3-1,4 glucanaza sunt în principal sintetizate la germinare şi vor interveni în degradarea pereţilor celulari ai orzului. Aceste -glucanaze fragmentează lanţul -glucanic conducând la -oligozaharide. Exo -glucanazele desprind o moleculă de celobioză de la capătul nereducător al lanţului -glucanic iar celobioza la rândul ei este transformată în două molecule de glucoză de către celobiază (-glucozidază). Circa 50-90% din activitatea -glucanazelor este pierdută la uscarea malţului, iar la brasaj hidroliza -glucanilor are loc la 45-55C deoarece la temperaturi ceva mai ridicate aceste -glucanaze sunt inactivate rămânând doar -glucan solubilaza care va elibera glucani din complexul cu proteinele, ceea ce va conduce la creşterea vâscozităţii mustului şi deci mărirea timpului de filtrare a plămezii. Un exces de -glucani în bere poate cauza dificultăţi de filtrare sau tulburări în produsul finit. Enzimele care degradează pentozanii sunt: endoxilanaza (hidrolizează legăturile - 1,4 din interiorul lanţului pentozanic); exoxilanaza (hidrolizează legăturile -1,4 de la capătul lanţului pentozanic); arabinoxilanaza care acţionează asupra lanţurilor laterale de pentozani formate din arabinoză cu eliberare de arabinoză; xilobiaza care degradează xilobioza la două molecule de xiloză. În prima etapă de degradare a -glucanilor şi a pentozanilor se formează dextrine liniare -glucanice şi respectiv “dextrine” ramificate -pentozanice. În etapa a doua dextrinele menţionate sunt degradate la celobioză şi respectiv xilobioză (dizaharide) şi glucoză, respectiv arabinoza, xiloză (monozaharide). Hidroliza hemicelulozelor (-glucani) şi pentozani are loc în proporţie de 70% în timpul malţificării orzului (fig. 2). Gradul de degradare a hemicelulozelor se apreciază prin diferenţa de randament între măcinişul fin şi măcinişul grosier (dur) care trebuie să fie maximum 2,2% şi prin măsurarea vâscozităţii mustului de laborator (maximum 1,85 mPa·s) respectiv a conţinutului de -glucani (~ 200 mg/l).
Degradarea proteinelor. Sub influenţa peptid hidrolazelor (endo- şi exopeptidaze şi
proteinaze) are loc o hidroliză a substanţelor cu azot fapt ce este apreciat prin gradul de solubilizare proteică (cifra Kolbach) şi conţinutul malţului în azot aminoacidic. Nivelul de solubilizare este în funcţie de tipul de bere ce se produce din malţul respectiv: -
malţul tip Pils va conţine ~ 600 mg/100 g s.u. azot solubil total şi 126 mg/100 g s.u. azot -aminic;
-
malţul pentru berea blondă va conţine 700 mg/100 g s.u. azot solubil total şi 147 mg/100 g s.u. azot -aminic;
-
malţul pentru berea brună va conţine 900 mg/100 g s.u. azot solubil total şi 190 g/100 g s.u. azot -aminic.
Fig. 2. Hidroliza pentozanilor şi -glucanilor Din diferite cauze, malţul finit poate prezenta următoarele deficienţe: -
conţinut ridicat de boabe negerminate, care se constată prin măsurarea plumulei
(acrospirei) care, în mod normal, la orzul bine germinat este:
2/3 până la 3/4 din lungimea bobului la malţul blond;
3/4 până la 1/1 din lungimea bobului la malţul brun.
Dacă plumula este zero, orzul se consideră negerminat şi atunci se determină procentul de boabe negerminate. Un malţ cu 8% boabe negerminate este de fapt un amestec de malţ şi orz şi ca atare la plămădire se intervine cu enzime din afară pentru a suplimenta nivelul de enzime al boabelor negerminate la nivelul celor germinate. În acest scop se recomandă să se folosească Cereflo 200 L (endo--glucanază dar care are şi activitate nestandardizată de
-
amilază) + Cereflo 2XL (conţine -amilază, -glucanază şi protează), Ceremix 2XL + Ultraflo L (conţine -glucanaza) sau Ceremix 6XMG (conţine proteaza neutră, -amilază, -glucanază, pentozanază şi celulază). Se poate folosi şi Alphalase AP-3 care conţine -amilază, protează şi glucanază. -
Malţ deficitar în -amilază, deficienţă care se poate constata analitic prin una din
următoarele metode:
determinarea duratei de zaharificare (normal 15 min);
determinarea filtrabilităţii palierului 80C de la brasaj (analiza Hartong-Piratski);
determinarea gradului de fermentare a mustului de laborator (minimum 80%);
determinarea conţinutului de -amilază după metoda EBC.
Prelucrarea malţului cu deficienţă în -amilază va avea următoarele consecinţe: obţinerea de plămezi nezaharificate; filtrabilitate redusă a mustului şi berii; flocularea prematură a drojdiei la fermentare; obţinerea de bere cu grad de fermentare redus; apariţia de urme de nezaharificate în must şi bere. Deficienţele menţionate se pot corecta folosind enzime exogene în diferite etape tehnologice: plămădire, în mustul cu hamei înainte de fierbere; în linul de fermentare. Deficitul de -amilază în malţ poate fi corectat după cum urmează:
adaos de Fungamyl 800L în proporţie de 1-2kg/t măciniş la plămădire;
adaos de Termamyl 120 L în proporţie de 2g/hl must;
adaos de Fungamyl 800 L în proporţie de 0,5-3 g/hl must în linul de fermentare (doza
de 0,5 g/hl se utilizează atunci când temperatura de fermentare este de 4-7C, doza de 3g/hl se foloseşte când se doreşte un grad de fermentare mai ridicat); -
adaos de Nervanase BT-2 în proporţie de 1,5l/tonă malţ pentru Nervanase BT-2 (180)
Malţ incomplet citolizat. Această deficienţă a malţului se poate constata prin următoarele
determinări: diferenţa între măcinişul fin şi grosier (dur), care în mod normal trebuie să fie 1,8%; vâscozitatea mustului de laborator care în mod normal trebuie să fie 1,5-1,65 mPa·sec. Folosirea malţului incomplet citolizat ar conduce la randament în extract mai scăzut, o filtrabilitate mai scăzută a mustului şi berii. Se recomandă în acest caz folosirea următoarelor preparate enzimatice exogene: Cereflo 200L în proporţie de 0,5-1 kg/tonă malţ sau Ultraflo L în proporţie de 0,2 kg/tonă malţ. Deoarece Ultraflo L are numai activitate -glucanazică, în principal, şi celulazică, pentozanazică, arabinazică, în secundar, şi nu are activitate -amilazică, cele două enzime se utilizează împreună la plămădire, în următoarele proporţii: Cereflo 200L 0,4-0,8 kg/tonă malţ iar Ultraflo L 0,1-0,2 kg/tonă malţ.
Se mai recomandă şi adaosul de Fynizym în proporţie de 1g/hl must; la fermentarea primară se pot folosi şi combinaţiile Ceremix 2XL+Cereflo 200 L; Ceremix 2XL + Ultraflo L sau Ceremix 6XMG, al cărui dozaj se face în funcţie de diferenţa între randamentul în măciniş fin şi grosier (dur) aşa cum se arată în tabelul 1. Tabelul 1. Corelaţia dintre diferenţa de măciniş în % şi adaosul de Ceremix 6XMG Diferenţa de randament de măciniş % Ceremix 6XMG g/tonă malţ
3,0 50
3,5 100
4,0 150
4,5 200
5,0 250
Se poate utiliza şi -Glucanase 200 L în proporţie de 250-500 ml/tonă malţ. -
Malţ insuficient solubilizat proteolitic. În general un malţ bine solubilizat este
caracterizat prin următoarele:
azot solubil total pentru o bere blondă 550-750 mg/100 g s.u.;
azot aminic liber, minimum 150 mg/100 g s.u. Determinările se fac pe mustul de laborator. Dacă valorile menţionate nu sunt realizate,
malţul este insuficient solubilizat şi va avea următoarele consecinţe: încetinirea procesului de fermentaţie şi respectiv oprirea procesului de fermentare la diferite grade de fermentare (aceste deficienţe sunt datorate în principal conţinutului mai scăzut de aminoacizi liberi). La un conţinut de aminoacizi liberi prea mare (malţ suprasolubilizat) se va influenţa negativ culoarea mustului la fierbere şi implicit a berii şi de asemenea se vor înrăutăţi proprietăţile senzoriale şi stabilitatea berii (coloidală şi biologică). Pentru a remedia această deficienţă a malţului (de slabă solubilizare) se recomandă folosirea la brasaj a preparatului Neutrază 0,5L în proporţie de 0,3-0,7 kg/tonă malţ. Se mai poate folosi Proteinase 200 L în proporţie de 0,25 kg/tonă malţ.
4.2. TEHNOLOGIA BERII Tehnologia berii implică operaţiile menţionate în figura 3, din care, din punct de vedere biotehnologic, interesează operaţiile de brasaj (plămădire şi zaharificare), fermentaţie /primară şi secundară) şi maturizare a berii.
Cereale nemalţificate
Malţ Pretratare malţ Curăţire Desprăfuire
Păstrare cereale Curăţire Desprăfuire
Măcinare
Pregătire termică a nemalţificatelor (cazan de plămădire) 50100 C 40-60 min
Brasaj (Plămădire şi zaharificare) 4070C 100 – 150 min
Filtrare plămadă zaharificată
Hamei
Borhot
Must Fierbere must cu hamei Separarea trubului la cald Trub la cald Răcire în schimbător cu plăci de la 95C la 8C Limpezire la rece Trub la rece
CO2
Drojdie
Fermentare 10-20C 0-15 zile
Inoculator drojdie
Tanc de maturare la 0C/7-21 zile Filtrare bere Pasteurizare în tunel sau Flash 64-70C/40/0,5 min Tragere bere la sticle, butoaie, cutii
Fig. 3. Schema tehnologică de obţinere a berii
Plămădirea şi zaharificarea plămezii (brasaj) este operaţia care se execută în scopul obţinerii mustului. Substanţele care trec din malţ în must formează extractul mustului, extract ce este format prin solubilizarea substanţelor solubile preexistente în malţ, respectiv cele care devin solubile în operaţia de brasaj sub influenţa enzimelor din malţ şi a celor adăugate. Principalele enzime care acţionează la brasaj şi sunt proprii plămezii sunt arătate în tabelul 2. Tabelul.2. Principalele enzime de plămadă şi caracteristicile lor Enzima
pH optim
Temperatura optimă
Temperatura de inactivare, C
-amilaza
5,6-5,8
70-75
80
-amilază
5,4-5,6
60-65
70
Legătura hidrolizată
Produse de hidroliză
Enzime care hidrolizează amidonul
Dextrinaza limită (pulullanaza)
5,1
55-60
65
Maltaza Invertaza
6,0 5,5
35-40 50
40 55
-1,4 din orice loc în dextrine liniare din interiorul amilozei şi amiloză amilopectinei. dextrine ramificate Acţiunea se opreşte la din amilopectină 2-3 resturi glucoză maltoză (puţină) şi înaintea legăturii -1,4 glucoza din amiloză şi amilopectină -1,4 de la capătul dextrine nereducător al catenei ramificate atât la amiloză cât şi la maltoză amilopectină. Acţiunea se opreşte la 2-3 resturi glucoză în faţa legăturii -1,6 Dextrine liniare cu masă 1,6 moleculară mică din cele ramificate cu masă moleculară mai mică (5-8 resturi de glucoză) Maltoza 2 Glucoză Zaharoza Glucoza+fructoza
Enzime care hidrolizează substanţele cu azot Endopeptid hidrolaze (proteinaze) Carboxi peptidaze Amino peptidaze Dipeptidaza
3,9 şi 5,5
45-50
7
5,2-5,6
50
70
7,0-7,2
40-45
55
8,8
40-45
55
4,5-4,8
40-45
55
4,6 şi 5,5 6,6-7,0
60
70
63
73
Legături peptidice din interiorul polimerului proteic Legături peptidice din interiorul polimerului proteic Legături peptidice de la capătul Cterminal Dipeptide
Peptide scurte
Peptide scurte
Aminoacizi
Aminoacizi
Glucanaze Endo 1,4 glucanaza Endo -1,3 glucanaze -Glucan solubilaza
Legături 1,4
-glucani cu masă moleculară mică Legături 1,3 -Glucani cu masă moleculară mică Legătura dintre - -Glucani + proteină glucan şi proteine
Enzima
Endoxilanaze Exoxilanaze Arabino xilanaza
pH optim
Temperatura optimă
Temperatura de inactivare, C
5,0 5,0 4,6-4,7
42 45 40-50
5,0
50-53 50-65
60 70-75
50
65
Legătura hidrolizată
Produse de hidroliză
Xilandextrine Xiloza Arabinoza
60
Alte enzime Fosfataze Peroxidaze Lipaze
Fosfaţi organici Oxidarea polifenolilor Lipide
Acid fosforic Polifenolioxidaţi Acizi graşi + glicerină
Substraturile atacate în timpul brasajului sunt substanţele cu azot, hemicelulozele, compuşii cu fosfor, polifenolii, lipidele şi amidonul.
Degradarea substanţelor cu azot Substanţele cu azot din orz sunt solubilizate în
proporţie de ~ 70% la malţificare de către peptid hidrolazele existente în orz şi cele sintetizate la malţificare. În malţul uscat vor rămâne active în principal proteinazele (endopeptid hidrolazele) şi carboxipeptidaza. În timpul malţificării se vor forma din proteinele insolubile de depozit, proteine solubile, peptide şi aminoacizi. La brasaj vor exista în plămadă proteine insolubile, globuline şi albumine solubile, peptide şi aminoacizi. Primul palier de temperatură la brasaj este cel denumit proteolitic şi este cuprins între 40 şi 50C iar durata variază între 15 şi 60 minute. În timpul acestui palier se vor hidroliza în continuare proteinele cu formare de peptide şi aminoacizi. Sub acţiunea enzimelor proteolitice menţionate în tabelul 6,2, acţiunea acestor enzime fiind dependentă de temperatură, pH şi durată. La temperaturi de 40-45C se formează produşi cu masă moleculară mai mare (acţionează mai bine endoproteinazele şi carboxipeptidazele). Dacă pauza de proteoliză la 4550C este mai mare se micşorează cantitatea de substanţe cu masă moleculară mai mare şi deci se va influenţa negativ capacitatea de spumare a berii şi stabilitatea spumei acesteia. Produşii rezultaţi în urma activităţii endo- şi exopeptid hidrolazelor sunt următorii:
Compuşi macromoleculari cu masa moleculară 60000 care constituie azotul coagulabil
şi care reprezintă ~ 20% din substanţele cu azot ale mustului nefiert. Aceşti compuşi sunt coagulabili la plămădire şi mai ales la fierberea mustului. Sunt precursori activi de trub din bere;
Compuşi cu masă moleculară medie (10000-60000) care reprezintă ~ 20% din substanţele
cu azot din must. Au acţiune favorabilă în formarea spumei berii, fiind relativ termostabili;
Compuşi cu masă moleculară mică, reprezentând ~ 60% din substanţele cu azot din must,
din care circa 22% sunt -aminoacizi liberi, sursă de azot pentru drojdii. Conţinutul în -aminoacizi din must trebuie să fie 200 mg N/l pentru a se asigura multiplicarea drojdiei şi o aromă corectă a berii.
Controlul degradării substanţelor cu azot la brasaj se face prin determinarea azotului solubil, azotului coagulabil, azotului -aminic. Un indice important este cifra intensităţii plămădirii după Kolbach cu valori între 80-120 (normal 105) care se calculează cu relaţia: Grad de solubilizare în primul must Intensitatea plămădirii = _________________________________·100 Grad de solubilizare în mustul congres fiert Substanţele cu azot formate la brasaj şi care ajung în must sunt implicate în: -
nutriţia drojdiei pentru fermentare deci şi formarea unor substanţe de aromă;
-
însuşirile senzoriale ale berii finite (plinătate şi rotunjire, gust, culoare);
-
capacitatea de spumare a berii şi însuşirile spumei (densitate, persistenţă, volum);
-
formarea trubului în berea finită, deci stabilitatea coloidală a berii.
Degradarea hemicelulozelor În timpul palierului de proteoliză are loc şi o degradare a
-glucanilor din pereţii celulari ai endospermului sub influenţa -1,3-1,4 glucanazei şi endo 1,4 glucanazei care acţionează bine la 40-45C şi sunt inactivate la 55-60C. La temperaturi mai mari se eliberează -glucani din complexele cu proteinele sub influenţa -glucan-solubilazei şi respectiv este eficientă endo 1,3- glucanaza care acţionează bine la 60-62C. Rezultă că în must pot exista -oligozaharide, glucoza, arabinoza, xiloză, precum şi -glucani şi pentozani în măsura în care aceştia nu au fost solubilizaţi. Rezultă cu nivelul de -glucani şi -xilani din must va fi cu atât mai mare cu cât malţul iniţial a fost mai slab solubilizat. Pe de altă parte nivelul substanţelor menţionate în must va fi mai mare dacă nu se respectă la brasaj parametrii optimi de acţiune ai -glucanazelor şi xilanazelor.
Degradarea compuşilor cu fosfor Degradarea fosfaţilor are loc sub influenţa fosfatazelor
din malţ care hidrolizează compuşii cu fosfor organici eliberând acid fosforic. Acidul fosforic eliberat reacţionează cu sărurile din apă şi formează în plămadă şi must sisteme tampon. Are loc şi o scădere a pH-ului plămezii. Condiţiile optime pentru fosfataze sunt: temperatura 50-53C (sunt inactivate la temperaturi mai mari de 60C şi pH = 5). Temperatura de plămădire de 5862C restrânge activitatea fosfatazelor. Degradarea compuşilor cu fosfor este influenţată de gradul de solubilizare a malţului, de activitatea fosfatazică a malţului şi condiţiile de brasaj.
Degradarea polifenolilor Polifenolii reprezintă 0,3-0,4% din substanţa uscată a orzului,
fiind localizaţi în coajă şi strat aleuronic (mai puţin) precum şi în endosperm. La brasaj, polifenolii care trec în plămadă şi respectiv în must vor forma cu proteinele complecşi insolubili (mai ales la fierberea mustului cu hamei), ceea ce va face ca berea finită să fie mai stabilă coloidal. În prezenţa aerului însă, polifenolii pot fi oxidaţi enzimatic la brasaj, cu formare de
compuşi incolori care apoi se vor polimeriza în compuşi coloraţi. Brasajul, la temperaturi mai mici (~ 50C) şi cu pauze mari va conduce la o cantitate mai mare de polifenoli în must, iar un brasaj la temperatură mai mare şi durata mai mică va conduce la un must cu un conţinut mai redus de polifenoli. La plămădire este necesar să se ia următoarele măsuri: -
să se evite contactul cu aerul pentru a nu se ajunge la formarea de substanţe colorante;
-
să se corecteze pH-ul (pH-ul deplasat spre acid conduce la micşorarea oxidării
polifenolilor); -
să se inactiveze enzimele care catalizează oxidarea enzimatică a polifenolilor prin adaos
de formaldehidă (250 mg/kg malţ folosit la plămădire).
Degradarea lipidelor Degradarea lipidelor aduse de malţ (trigliceride mono- şi
digliceride, fosfatide) are loc şi la brasaj, sub influenţa lipazelor din malţ, care au temperatură optimă la 35-40C şi sunt inactivate la 65C/30 min. La plămădire la 62-64C în must se găseşte o cantitate mai mică de lipide decât la plămădire la 68C. La fierberea mustului şi la răcirea acestuia, odată cu trubul format se elimină o parte din lipidele mustului. Cu cât în must se găseşte o cantitate mai mare de lipide nehidrolizate cu atât se influenţează mai mult negativ gustul berii şi însuşirile de spumare ale berii.
Degradarea amidonului Degradarea amidonului decurge în trei faze: absorbţia apei şi
umflarea granulei; gelatinizarea amidonului; degradarea enzimatică a componentelor granulei de amidon (lichefiere şi zaharificare). În prima fază granula de amidon absoarbe apa şi îşi măreşte volumul, cu atât mai mult cu cât temperatura apei de plămădire este mai mare (volumul maxim se obţine la 50C). În faza a doua granula de amidon se fisurează iar când granula ajunge la temperatura de gelatinizare, se distruge şi amidonul se transformă într-o soluţie vâscoasă, care la răcire se gelifică. Soluţia vâscoasă de amidon este formată din molecule de amilopectină dispersate în faza continuă formată din amiloză. Temperatura de gelificare a amidonului este în funcţie de provenienţa acestuia (tabelul 3).
Tabelul 3. Temperatura de gelatinizare a amidonului din diferite surse Sursa de amidon Cartofi Grâu Porumb Orz(malţ) Orez
Temperatura de gelatinizare, C 55-60 62-74 70 60 68-78
În faza a treia sub acţiunea enzimelor sintetizate în principal la malţificare au loc două procese şi anume: -
lichefierea amidonului, care se manifestă prin micşorarea vâscozităţii amidonului
gelatinizat sub acţiunea dextrinizantă a -amilazei (optim la 70C); -
zaharificarea, care constă în scindarea legăturilor -1,4 din amiloză şi amilopectină de
către -amilaza cu formare de dextrine liniare şi ramificate şi cu masă moleculară mai mică, precum şi cantităţi mici de maltoză şi glucoză; concomitent acţionează şi -amilaza (optim 63C) cu formare de amilopectină. (Atât acţiunea -amilazei cât şi a -amilazei asupra amilopectinei se opreşte la 2-3 resturi de glucoză în faţa legăturilor -1,6 din amilopectină. Dextrinaza limită (optim 55-60C) are o acţiune slabă deoarece este inactivată la temperaturi scăzute (65C). În fig. 4. se arată schema de degradare a amidonului la brasaj. Pentru a obţine musturi cu fermentescibilitate mai mare (conţinut mai mare de lactoză) se fac pauze mai mari la temperatura de 62-63C, adică la temperatura optimă de acţiune a
-
amilazei şi se corectează pH-ul plămezii la 5,4-5,6. Dacă se fac pauze mari la 72-75C, adică la temperatura optimă de acţiune a
-amilazelor, musturile sunt mai bogate în dextrine, deci au
fermentescibilitate mai redusă. Acţiunea de zaharificare a enzimelor din plămadă va putea fi deci influenţată prin temperatură, durată, pH, concentraţia plămezii. O zaharificare bună a amidonului trebuie să conducă la musturi cu grad final aparent de fermentaţie de cel puţin 80% (must numai din malţ).
Figura 4 Schema de degradare a amidonului la malţificare şi brasaj
2.1. Preparate enzimatice exogene utilizate la fermentarea primară Preparatele enzimatice folosite la fermentaţia primară se utilizează pentru unul din următoarele scopuri:
hidroliza urmelor de amidon din must;
creşterea gradului de fermentare;
îmbunătăţirea filtrabilităţii berii. În primul caz, se ştie că mustul diluat, rezultat din amestecarea primului must cu apele de
spălare a borhotului (denumit şi mustul de cazan plin) se fierbe împreună cu hameiul, după care se separă trubul la cald, se răceşte până la temperatura de însămânţare şi se limpezeşte la rece. Acest must mai poate conţine urme de amidon nehidrolizat (valori de iod mai mari de 0,2 determinate fotometric după metoda EBC), care ar afecta stabillitatea coloidală şi microbiologică a berii finite. Pentru a înlătura acest inconvenient se recomandă un adaos de Fungamyl 800 L, în proporţie de 0,3-0,5 ml/hl must, în linul de fermentare, preparat enzimatic care este o -amilază fungică ce hidrolizează legăturile 1,4 din amiloză şi amilopectină. Prin adaos de Fungamyl 800 L, creşte şi gradul de fermentare cu 2.5%. În cel de-al doilea caz, pentru creşterea gradului de fermentare, este necesar să se modifice spectrul în hidraţi de carbon al mustului, ceea ce se poate realiza prin următoarele metode: modificarea diagramei de brasaj, prin mărirea pauzei la 63C, pentru creşterea cantităţii de zaharuri fermentescibile; adaos de extract de malţ cu putere diastazică ridicată în timpul fermentaţiei, însă există pericolul infectării mustului iniţial; prin utilizarea unor preparate enzimatice pentru zaharificare, fie la brasaj, fie la fermentare. Ca preparate enzimatice se pot folosi:
Fungamyl 800L în proporţie de 0,3-1 ml/hl must pentru un grad de fermentare de 80-85%;
Fungamyl 800 L în proporţie de 1-5 ml/hl must pentru un grad de fermentare de 85-90%. Preparatul enzimatic se adaugă în linul de fermentare.
AMG-300 L (amiloglucozidaza), în proporţie de 5 ml/hl must, în care caz se obţine un
grad de fermentare foarte mare ( 100%), berile respective având un conţinut redus de hidraţi de carbon. Explicaţia faptului că prin folosirea AMG se obţine un grad de fermentare aşa de mare, constă în aceea că AMG scindează atât legăturile -1,4 cât şi pe cele -1,6 glucozidice de la capătul nereducător al substratului care poate fi amidonul, dextrinele sau oligozaharidele din must, cu eliberare de glucoză.
Promozym 200L, în proporţie de 32 ml/hl must pentru a obţine un grad de fermentare de
până la 90%, enzima producând deramificarea dextrinelor şi amilopectinei, prin scindarea legăturilor -1,6.
Ambazyme 200 L (amiloglucozidaza), care se foloseşte în proporţie de 3-9 g/hl must;
Amylozyme 200 L, care se foloseşte în proporţie de 1-2 g/hl must. Preparatele ezimatice utilizate, după ce au acţionat, trebuie să fie inactivate, ceea ce
impune pasteurizarea berii finite. Acest lucru se impune cu atât mai mult cu cât atât AMG cât şi Fungamyl au şi o activitate proteolitică nestandardizată care ar putea conduce la deprecierea berii. Pentru inactivarea enzimelor respective trebuie realizate următoarele valori de pasteurizare: AMG 1200 UP (echivalent a 5 min. de încălzire la 76C); Promozym 80 UP; Fungamyl 10UP (echivalent a 60 min. la 60C). În general, preparatele enzimatice amilolitice de origine fungică sunt caracterizate prin temperaturi de inactivare mai scăzute decât cele de origine bacteriană şi de aceea sunt preferate sub aspectul inactivării lor într-un regim blând de pasteurizare a berii. Având în vedere totuşi rezistenţa termică destul de ridicată a AMG şi în mare măsură şi a Promozym-ului, se recomandă ca aceste enzime să fie folosite la plămădire şi mai puţin la fermentarea primară. În cazul în care berea nu se pasteurizează este necesar ca şi Fungamyl-ul să fie utilizat tot la plămădire. În cel de-al treilea caz, pentru îmbunătăţirea filtrabilităţii berii se utilizează Finizym 200 L în proporţie de 0,4 ml/hl bere. Se mai poate mări filtrabilitatea mustului şi respectiv a berii prin folosire la plămădire a următoarelor preparate enzimatice: Cereflo 200L; Ultraflo L; Viscozym 120L. De asemenea se recomandă folosirea preparatului enzimatic -Glucanase 200L în proporţie de 250-500 ml/tonă malţ (când se utilizează malţ + orez). Preparatul poate fi adăugat şi la fermentarea primară/secundară în proporţie de 0,5-1 ml/tonă must sau bere.
2.2. Preparate enzimatice exogene utilizate la fermentarea secundară şi maturarea berii Berea de fermentaţie primară este o bere din care s-a recuperat biomasa de drojdie (2-2,5 l cremă de drojdie/hl must însămânţat) şi care conţine 0,4-0,5 kg CO2/hl dizolvat. Această bere este trecută la fermentaţia secundară şi maturare unde vine cu 1,2-1,4% extract fermentescibil din care 80% maltoză şi 20% maltotrioză. La fermentaţia secundară au loc următoarele procese:
se continuă fermentarea zaharurilor până la atingerea gradului de fermentare a berii de
vânzare;
saturarea berii cu CO2;
limpezirea naturală a berii (formarea trubului la rece). La maturarea berii au loc următoarele procese:
depunerea drojdiilor rămase după îndepărtarea biomasei şi a precipitatelor din bere;
antrenarea unor compuşi volatili cu CO2 care se degajă;
sinteza unor noi cantităţi de produşi secundari de fermentaţie (creşte cu 20% cantitatea de
alcooli superiori şi cu 30-200% cea de esteri);
transformarea unor compuşi cu prag de sensibilitate mai ridicat (diacetil, aldehide), berea
considerându-se matură când conţinutul de diacetil scade sub 0,1 mg/l. Consecinţa maturării berii îl reprezintă înnobilarea gustului şi aromei berii. La fermentaţia secundară şi maturarea berii trebuie să avem în vedere următoarele aspecte: -
îndepărtarea componentelor care ar produce în berea finită trubul coloidal (amidon,
dextrine, -glucani, proteine, polifenoli); -
îndepărtarea sau împiedicarea formării produşilor secundari cu prag de sensibilitate ridicat
(dicetone vicinale cum ar fi diacetilul şi acetoina); -
îndepărtarea oxigenului. Pentru îndepărtarea amidonului nehidrolizat şi a dextrinelor şi -glucanilor se utilizează,
în ordine, următoarele enzime:
Fungamyl 800L, care se dozează în berea cu temperatura de 4C, în proporţie de 1ml/hl
pentru un timp de acţionare de 5 zile;
Fungamyl 800 L, care se dozează în berea cu temperatura de 4C, în proporţie de 3 ml/hl,
pentru un timp de acţiune de 3 zile. Fungamyl-ul se adaugă atunci când în berea rezultată de la fermentaţia primară au rămas urme de amidon şi când concentraţia de CO2 din bere , înainte de filtrare, este prea mică. Enzima este introdusă într-un tanc gol peste care se transvazează berea cu deficienţele menţionate.
Finizym 200 L care se adaugă în proporţie de 1ml/hl bere, în condiţiile în care berea nu
s-a limpezit bine ca o consecinţa a unui conţinut mare de -glucani. Enzima se introduce într-un tanc gol peste care se transvazează berea cu deficienţe. La folosirea Finizym-ului în scopul îmbunătăţirii filtrabilităţii berii timpul de maturare se prelungeşte cu 2-5 zile.
Amylozyme 200 L în proporţie de 0,1-0,5 g/hl bere. Îndepărtarea proteinelor Pentru îndepărtarea substanţelor proteice, pe plan mondial s-
au utilizat următoarele enzime:
Papaina care se adaugă în tancul de fermentare secundară, în timpul maturării berii, când
pH-ul este mic şi deci există condiţii de activare a enzimei de către substanţele reducătoare din bere. Papaina se poate doza în bere şi după o prefiltrare prealabilă a berii, în filtre cu Kieselgur, în acest fel crescând eficienţa papainei. Când se utilizează sub formă de preparat purificat papaina se poate doza, în berea filtrată, înainte de îmbuteliere. În afara acţiunii hidrolizante, papaina are şi capacitatea de a precipita proteinele din bere încărcate negativ, deoarece papaina are sarcină electrică negativă. Prin adaos de papaină în berea tânără (bere după fermentaţia primară) se formează trub, din această cauză adaosul de papaină trebuie făcut cu 10-14 zile înainte de flitrare, în caz contrar trubul se formează în berea finită. Doza de preparat comercial utilizată variază între 2-10 g/hl bere. În timpul pregătirii soluţiei de papaină trebuie evitat contactul cu aerul sau în apa de solubilizare trebuie să se adauge 0,1% metabisulfit. În acest fel se evită inactivarea papainei. Firma Enzymes et Derivates recomandă folosirea preparatului Papaină – Chilko –P în proporţia menţionată în fişa tehnică.
Preparatele enzimatice de origine microbiană sunt reprezentate de endopeptid hidrolaze
din fungi şi bacterii care trebuie să hidrolizeze numai compuşii macromoleculari din bere ce sunt precursorii trubului coloidal. Nu trebuie să fie afectaţi compuşii cu azot responsabili de o bună spumare a berii, pentru plinătatea şi catifelarea gustului ei. Îndepărtarea compuşilor fenolici pentru îndepărtarea compuşilor fenolici s-au propus următoarele procedee: -
oxidarea lor cu o polifenoloxidază în cursul brasajului, oxidare care antrenează
polimerizarea şi deci precipitarea lor, precipitatele fiind îndepărtate la filtrarea plămezii. Acest procedeu nu este încă practicat industrial; -
prin utilizarea PVPP care este un procedeu fiabil, dar costisitor. Îndepărtarea polifenolilor,
care sunt antioxidanţi, poate avea un efect negativ asupra stabilităţii senzoriale a berii. Îndepărtarea oxigenului Oxigenul dizolvat în bere poate modifica caracteristicile senzoriale ale acesteia prin reacţii de oxidare. În berea nepasteurizată, oxigenul favorizează dezvoltarea bacteriilor aerobe, inclusiv a drojdiilor care n-au fost eliminate în totalitate, şi deci favorizează apariţia trubului biologic. Pentru îndepărtarea oxigenului se utilizează preparatul enzimatic glucozoxidază - catalază care acţionează după următorul mecanism: glucozoxidaza elimină oxigenul pe care îl consumă pentru oxidarea glucozei pe care o transformă în acid gluconic; catalaza transformă apa oxigenată generată în cursul acţiunii glucozoxidazei în apă şi oxigen. Preparatele enzimatice de glucozoxidază-catalază extrase din Asp. niger şi P. notatum au pH optim la 4,8 şi 6,0 la 20C. Având în vedere că eliminarea oxigenului este posibilă atât timp cât există glucoza în bere este necesar ca preparatul de glucozoxidază să conţină şi urme de carbohidraze care să
regenereze glucoza din carbohidraţii existenţi în bere sau să se adauge glucoza la nivel de 0,1g/l bere. Berea tratată cu glucozoxidază-catalază capătă un gust uşor de oxidat, datorită faptului că enzima catalaza nu poate transforma H2O2 în prezenţa alcoolului şi în acest caz acţionează ca o peroxidază care oxidează compuşi din bere. Acest inconvenient poate fi surclasat prin folosirea superoxiddismutazei care reacţionează cu ionii superoxidici şi deci conduce la ameliorarea proprietăţilor senzoriale ale berii. Firma Enzymes et Derivates recomandă utilizarea preparatului enzimatic Glucox RF (conţine glucozoxidază + catalază) în proporţie de 0,4-1,5 g/hl bere.
Accelerarea maturizării berii Reducerea diacetilului şi acetoinei este etapa limitantă a maturării berii, defectele de gust
datorită diacetilului şi acetoinei fiind o problemă majoră a berarilor. Diacetilul şi acetoina conferă berii un gust de unt inacceptabil pentru consumatori. Pragul de percepţie pentru diacetil este de 0,02-0,08 mg/l în funcţie de bere şi sensibilitatea consumatorului. Concentraţia de diacetil în bere la sfârşitul maturării trebuie să fie 0,1 mg/l, la concentraţii superioare există riscul ca berea să prezinte un gust de unt. Precursorul diacetilului este -acetolactatul produs de drojdie în timpul fermentaţiei. -Acetolactatul eliberat în must este transformat neenzimatic în diacetil. Această reacţie chimică este etapa limitantă şi este accelerată la temperaturi mai ridicate. În final, diacetilul este asimilat de drojdie şi redus enzimatic în acetoină care are un prag de percepţie la 50 mg/l. Cantitatea de diacetil formată va depinde de compoziţia mustului, starea fiziologică a drojdiei şi procedeul de fermentaţie. Pentru reducerea rapidă a diacetilului în cursul maturării berii s-au propus următoarele procedee: -
maturarea la cald a berii (14-16C/2-3 zile), în care caz -acetolactatul este transformat în
diacetil, care, la rândul său este redus de drojdii în acetoină. Datorită temperaturii ridicate se favorizează autoliza drojdiei şi deci apariţia gustului “de drojdie”, de “autoliză” la bere. În plus, din drojdia autolizată se eliberează enzime proteolitice care afectează spumarea berii prin degradarea proteinelor cu capacitate de spumare. -
folosirea de -acetolactat decarboxilază sub denumirea de Maturex L care se adaugă în
mustul de bere răcit, în linul de angajare în proporţie de 1-2 ml/hl must. Prin folosirea Maturexului concentraţia de diacetil se menţine la nivele scăzute şi timpul de fabricare al berii se scurtează cu 5-6 zile. Firma recomandă ca Maturex-ul să se utilizeze concomitent cu Finizym-ul şi Fungamylul, pentru a realiza şi o mai bună saturare cu CO2 a berii şi pentru o mai bună limpezire.
Proporţiile din fiecare enzimă sunt următoarele: Maturex L 0,25 ml/hl; Finizym 200 L 0,25 ml/hl; Fungamyl 800 L 0,25 ml/hl; Degradarea dicetonelor vicinale (diacetil şi acetoină) cu ajutorul unui preparat enzimatic de diacetilreductază elaborată de Acetobacter aerogenes sau obţinută dintr-un extract de drojdie. Activitatea diacetilreductazei este inhibată de alcool, la o concentraţie de 3,3% alcool, enzima fiind inactivată în proporţie de 42%. Această acţiune inhibitoare a alcoolului limitează utilizarea enzimei sub aspect economic.
3. FOLOSIREA NEMALŢIFICATELOR LA FABRICAREA BERII Ca cereale nemalţificate pot fi utilizate porumbul, orezul, orzul. La folosirea porumbului şi orezului la fabricarea berii se obţin următoarele avantaje: costurile de fabricaţie sunt mai mici; berea finită are o culoare mai deschisă; berea finită are o stabilitate mai mare; proprietăţile de spumare ale berii sunt mai bune. Deoarece temperaturile de gelatinizare a amidonului de porumb şi orez sunt mai mari decât a amidonului din malţ, plămădirea acestor materii prime se face într-un cazan separat pentru nemalţificate, deci se impune o fază tehnologică separată. Pot fi utilizate două variante tehnologice în cazul utilizării acestor două nemalţificate şi anume: -
utilizarea de malţ, care aduce atât -amilază cât şi -amilază;
-
utilizarea unor enzime exogene de lichefiere şi anume o -amilază industrială. În primul rând se utilizează 10% malţ faţă de cantitatea de porumb sau orez folosită ca
nemalţificate, concentraţia plămezii de porumb sau orez trebuind să fie 20% (raport apă/cereale = 5:1). Diagrama de plămădire cu porumb ar fi următoarea: [ 45C(20’), 75C(30’), 100 C(30’)] 45C (20’), 53C (20’), 63C (90’), 72C (zah), 76C (10’). Diagrama de plămădire cu orez ar fi următoarea: [ 45C (20’), 85C (30’), 100C (30’)] 45C (20’), 53C (20’), 63C (90’), 72C (zah), 76C (10’). În cel de-al doilea caz se utilizează un preparat enzimatic pentru lichefiere. Firma Novo recomandă preparatul enzimatic Termamyl 60 L sau 20 L în proporrţie de 0,5 kg/tonă nemalţificate (porumb sau orez) precum şi folosirea a 50-70 ppm Ca2+ prin adaos de Ca (OH)2 în
apa de plămădire , deoarece ionii de Ca2+ au efect de stabilizare termică a Termamyl-ului. Prin folosirea Termamyl-ului este posibil să se ridice concentraţia plămezii până la 30% (raport apă/nemalţificate = 3,3:1). La folosirea orzului ca cereală nemalţificată, malţul poate fi înlocuit în proporţie de 50% cu orz, cu condiţia folosirii unor preparate enzimatice adecvate. Folosirea orzului ca cereală nemalţificată prezintă următoarele avantaje: -
amidonul din orz şi malţ au aceeaşi temperatură de gelatinizare şi deci nu este nevoie de
un cazan pentru nemalţificate; -
orzul conţine şi -amilază ca şi malţul şi deci poate fi ridicat procentul de nemalţificat
peste 50%; -
degradarea proteinelor dun orz conduce la obţinerea de aminoacizi la fel ca şi din malţ. Având în vedere că prin fermentarea mustului se obţine un grad de fermentare mai scăzut
decât atunci când la brasaj s-a folosit numai malţ, se utilizează la plămădire următoarele combinaţii de enzime: - Cereflo 200 L
1 kg/t orz;
- Neutraza 0,5
0,5 kg/t orz sau
- Ceremix 2XL
2 kg/t orz sau
- Ceremix 6XMG 1 kg/t orz. Dacă procentul de orz depăşeşte 40% este bine să se folosească şi Fungamyl 800 L în proporţie de 0,3-0,5 g/h care se adaugă în linul de fermentare în vederea creşterii gradului de fermentare. Diagrama de plămădire la prelucrarea plămezii din măcinătura de malţ şi orz este următoarea: 45C (20’), 52C (30’), 63C (90’), 72C (zah), 76C( 10’). Se mai pot folosi şi următoarele preparate enzimatice: Nervanase BT-2 (vezi fişa produsului) împreună cu -Glucanase (vezi fişa produsului) şi Proteinase 200 L (vezi fişa produsului). Alphalase AP-3 se poate folosi şi singură (vezi fişa produsului http://www.epages.dk/epub/37/altpdf/epub_37.pdf, guide/alphalase_ap3.pdf).
http://mags.datagraf.dk/epub/files/brewing%20e-
