PENGANTAR DAN PROSEDUR PRAKTIKUM BIOKIMIA
Oleh: Ir. R. M. Prijo Utomo Drs. Widjajanto Prijosoedjono Drs. I Wayan Sumberartha
UNIVERSITAS NEGERI MALANG FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM JURUSAN BIOLOGI 1999
iii
KATA PENGANTAR
Buku Pengantar dan Prosedur Praktikum Biokimia ini disusun berdasarkan hasil pengumpulan dari berbagai bahan bacaan yang terdapat di perpustakaan ataupun koleksi perorangan. Rangkaian percobaan diatur sedemikian rupa sehingga mudah dilaksanakan dan dimengerti oleh para praktikan. Selain itu juga diberikan dasar-dasar teori yang membekali mahasiswa sebelum melakuka praktikum. Pada umumnya percobaan-percobaan yang ada ini banyak bersifat kualitatif, sedangkan untuk yang bersifat kuantitatif baru akan kami susulkan kemudian. Jenis-jenis percobaan dalam buku ini dipilihkan yang sederhana, terutama dari segi peralatan dan bahan kimia yang digunakan. Oleh sebab itu diharapkan dengan ketelitian kerja, keahlian, dan pengalaman, kesederhanaan ini dapat terimbangi dengan baik sehingga percobaan-percobaan ini dapat dipertanggungjawbkan secara ilmiah. Akhirnya kami sebagai penyusun mengucapkan banyak terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu untuk terbitnya buku penuntun ini. Buku ”Pengantar dan Prosedur Praktikum Biokimia” ini dipergunakan untuk kepentingan lingkup sendiri. Mengingat dalam penyusunan ini masih ada yang mengalami kekurangan, maka penyusun mengharap kritik serta saran yang bersifat membangun. Tim Biokimia
i
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR PENGANTAR .......................... ....................................... ........................... ........................... ........................... ...................... ........ i DAFTAR ISI ........................... ......................................... ........................... ........................... ........................... ........................... .................... ...... ii BAGIAN I KARBOHIDRAT........................ KARBOHIDRAT...................................... ........................... ........................... ...................... ........ 1 Klasifikasi Klasifikasi Karbohidrat Karbohidrat ............................ ......................................... ........................... ...................... ........ 1 Monosakarida Monosakarida ........................... ......................................... ........................... ........................... ...................... ........ 1 Disakarida...................... Disakarida................................... ........................... ........................... ........................... .................... ...... 3 Oligosakarid Oligosakaridaa ......................... ........................................ ............................ ........................... ........................ .......... 3 Polisakarida Polisakarida ......................... ....................................... ............................ ........................... .......................... ............. 3 Praktikum Praktikum Karbohidr Karbohidrat at ........................... ......................................... ............................ ...................... ........ 5 BAGIAN II LEMAK/LIPIDA LEMAK/LIPIDA ........................... ......................................... ........................... ........................... .................... ...... 9 Klasifikasi Klasifikasi Lipida Lipida ........................... ......................................... ............................ ........................... ................. .... 9 Sifat-Sifat Sifat-Sifat Umum Lemak ........................... ......................................... ........................... ................... ...... 11 Praktikum Praktikum Lemak dan Minyak Minyak ............................ .......................................... ........................ .......... 13 BAGIAN III ASAM AMINO, AMINO, PEPTIDA, PEPTIDA, DAN PROTEIN.............. PROTEIN........................... ................... ...... 15 Asam Amino ........................... ......................................... ........................... ........................... ........................ .......... 15 Klasifikasi Klasifikasi Asam Amino.......................... Amino........................................ ............................ ...................... ........ 15 Peptida............... Peptida............................. ........................... ........................... ............................ ........................... ................. .... 16 Protein ........................... ........................................ ........................... ........................... ........................... .................... ...... 16 Klasifikasi Klasifikasi Protein................. Protein............................... ............................ ........................... .......................... ............. 17 Sifat-Sifat Sifat-Sifat Umum Protein................ Protein............................. ........................... ........................... ................. .... 18 Sifat-Sifat Sifat-Sifat Protein Protein yang Memberi Memberi Reaksi Reaksi Warna ........................ ........................ 19 Sifat-Sifat Sifat-Sifat Protein yang Memberi Memberi Reaksi Pengendapan............. Pengendapan............. 20 Denaturasi Denaturasi Protein ........................... ......................................... ........................... ........................... ................ 21 Praktikum Praktikum Protein................. Protein............................... ............................ ........................... .......................... ............. 22 Skema Identifik Identifikasi asi Zat Protein Protein yang yang Tidak Diketahu Diketahuii ................. ................. 27 APPENDIX APPENDIX Pereaksi Pereaksi untuk Praktikum Praktikum Biokimia Biokimia ........................... ........................................ ................. .... 28
ii
BAGIAN I KARBOHIDRAT Sebagian besar zat-zat organik alam adalah golongan karbohidrat. Bila ditinjau dari strukturnya, karbohidrat merupakan derivate aldehid atau keton dari alkohol polihidris atau senyawa turunannya sebagai hidrolisanya, contoh pati dan gula yang terdapat pada tumbuhtumbuhan. Fungsi dari karbohidrat adalah sebagai bahan baku atau bahan-bahan sumber energi, baik itu untuk tumbuh-tumbuhan maupun hewan. Pektin, selulosa, dan hemiselulosa merupakan bahan baku pembentuk organ tumbuhtumbuhan. Disamping itu amilum (pati), sukrosa, dan fruktosa juga berasal dari tumbuhtumbuhan, yang mana diperoleh dari hasil fotosintesis; sedangkan hasil fotosintesissendiri berasal dari bahan dasar CO 2 dan H2O dengan pertolongan sinar matahari. Glikogen sendiri yang bahan penyusunnya D-glukosa merupakan bahan dan sumber energi yang y ang terdapat pada hati dan otot hewan. Ada zat penetral racun dalam tubuh suatu organisme yang disintesis dari glukosa, zat ini disebut asam glukuronat. Asam glukuronat ini berkonjugasi dengan racun kemudian dibuang keluar melalui urine; disamping masih ada yang lain yaitu asam amino glisin. Klasifikasi Karbohidrat 1. Monosakarida (gula sederhana): karbohidrat yang tidak dapat dihidrolisis tanpa kehilangan sifat gulanya. 2. Disakarida: sakar yang bila dihidrolisis menghasilkan dua monosakarida yang sama atau berbeda. 3. Oligosakarida: sakar yang bila dihidrolisis menghasilkan 3-10 monosakarida. 4. Polisakarida: sakar yang bila dihidrolisis menghasilkan lebih dari 10 monosakarida. 1. Monosakarida Monosakarida merupakan karbohidrat yang paling sederhana dan mempunyai rasa manis. Golongan yang termasuk monosakarida ini adalah: triosa, tetrosa, pentosa, heksosa, dan heptosa. Gula ini dapat sebagai gula aldehid (aldosa) atau gula keton (ketosa). a. Diosa Satu-satunya diosa yang dikenal adalah etilen glikol atau dikenal pula sebagai glikol aldehid. Diosa ini penting dalam metabolisme pentosa. b. Triosa Dikenal dua macam: sebagai aldotriosa adalah D-gliseraldehida. D-gliseraldehida. sebagai ketotriosa adalah dihidroksi aseton. • •
c. Tetrosa yang terpenting di antaranya yaitu: sebagai aldotetrosa adalah eritrosa. sebagai ketotetrosa adalah eritrulosa. • •
d. Pentosa Yang terpenting dari pentosa adalah ribosa dan deoksiribosa. D-ribosa terdapat pada RNA, koenzim, ATP, NAD +, NADP+, dan lain sebagainya. Sedangkan D-deoksiribosa terdapat pada DNA di dalam inti sel dan mitokondria. Pentosa yang berbentuk sebagai aldopentosa
1
adalah D-arabinosa, D-silosa, dan D-liksosa. Yang berbentuk sebagai ketopentosa adalah ribulosa. e. Heksosa yang terpenting dari heksosa adalah D-glukosa, D-fruktosa, D-galaktosa, dan Dmanosa. D-glukosa banyak terdapat dalam buah yang rasanya manis, juga merupakan hasil hidrolisis amilum, sukrosa, maltosa, dan laktosa. Glukosa juga terdapat dalam darah sebagai sumber energi dan bila kandungannya kandungannya naik naik terus dapat menimbulkan kencing kencing manis, dan bila terdapat dalam urine disebut glukonuria. Glukosa dengan rotasi yang spesifik +111º disebut α-glukosa dan sebaliknya bila mengalami pergeseran menjadi +19º disebut β-glukosa. D-fruktosa banyak terdapat pada buah-buahan, madu, atau hasil hidrolisis dari sukroa atau inulin. Dalam usus atau hepar fruktosa diubah menjadi glukosa. Demikian pula galaktosa, merupakan hasil hidrolisis laktosa. Di dalam hati diubah menjadi glukosa. Galaktosa merupakan bagian penting dari glikolipid dan glikoprotein. f. Heptosa Yang perlu diketahui adalah sedoheptulosa, zat ini terdapat sebagai zat antara dalam metabolisme karbohidrat. Sifat-Sifat Monosakarida Monosakarida a. Sifat mereduksi dalam alkali Gugus karbonil bebas (gugus aldehid atau gugus keton) dalam larutan alkalis menjadi bentuk enol yang reaktif dan mudah dioksidasi. b. Reduksi dari gula Glukosa direduksi menjadi sorbital. Mannosa direduksi menjadi mannital. Fruktosa direduksi menjadi campuran sorbital dan mannital. Galaktosa direduksi dulsital. c. Pengaruh asam Pentosa dengan asam pekat dan pemanasan menjadi furfural, sedangkan heksosa dengan asam pekat dan pemanasan menjadi hidroksimetilfurfural. d. Pengaruh alkali Dalam larutan alkali aldosa dan tetrosa menjadi bentuk enol yang reaktif. Bentuk enol glukosa, fruktosa, dan mannosa adalah sama. Bila larutan alkalis salah satu gula didiamkan maka akan diperoleh campuran glukosa, fruktosa, dan mannosa. e. Pembentukan osazon Fenilhidrazin dengan monosakarida dan beberapa sakarida lain akan membentuk osazon, yaitu kristal kuning yang tidak larut dalam air dan bentuknya khas untuk setiap macam gula. gula. Dengan demikian uji ini dapat dipergunakan unuk identifikasi. Osazon dari glukosa dan fruktosa adalah sama, sedangkan sukrosa tidak membentuk osazon. f. Persenyawaan dengan iodium aldosa bila dipanaskan dengan asam iodida pekat oksigennya akan dilepas, dan membentuk senyawa iodida. Sebagai contoh glukosa dengan asam iodida pekat akan membentuk iodoheksana. g. Asetilasi Kemampuan gula untuk membentuk ester, misalnya asetilasi dengan asetil-klorida menunjukkan adanya gugus alkohol. Jumlah gugus asil yang dapat diikat dapat digunakanuntuk menghitung banyaknya gugus alkohol. Gula dengan 5 gugus hidroksil (misalnya glukosa) akan menghasilkan penta asetat. • • • •
2
h. Oksidasi Oksidasi aldosa akan menghasilkan asam aldonat. Bila gugus aldehid tidak mengalami perubahan maka disebut asam uronat. 2. Disakarida Disakarida yang terpenting adalah sukrosa, matosa, laktosa, dan trehalosa. Sukrosa Hidrolisis dengan asam akan menghasilkan glukosa dan fruktosa dengan jumlah seimbang yang biasa disebut gula invert. Sifat lain dari sukrosa yaitu tidak mereduksi, tidak dapat membentuk osazon, tetapi dapat difermentasikan/diragikan. difermentasikan/diragikan. Maltosa Diperoleh dari hasil hidrolisis pati yang menghasilkan dua molekul glukosa. Mempunyai sifat mereduksi, membentuk osazon, dan dapat difermentasikan. Laktosa Dapat diperoleh terutama pada susu hewan dan urine mamalia yang sedang hamil atau menyusui. Adanya laktosa yang terdapat pada urine wanita yang sedang menyusui disebut laktosuria. Hidrolisis dengan asam atau laktase akan menghasilkan glukosa dan galaktosa. Sifat-sifatnya dapat mereduksi, dapat membentuk osazon, tetapi tidak dapat difermentasikan. Trehalosa Terdapat pada fungi dan yeast. Trehalosa merupakan ikatan antara glukosa dengan glukosa pada ikatan 1 – 1, sehingga tidak ada lagi gugus yang mereduksi atau tidak dapat membentuk osazon. Hidrolisis trehalosa akan menghasilkan glukosa. 3. Oligosakarida kurang begitu penting. Contohnya raffinose, bila dihidrolisis akan menghasilkan glukosa, fruktosa, dan galaktosa. 4. Polisakarida polisakarida merupakan polimer monosakarida yang mempunyai bobot molekul tinggi. Sifat tidak larut dalam air, berbentuk koloid pada larutan biasa, dan tidak terasa manis. Dalam sistem digestivus ada yang dapat dicerna dan ada pula yang tidak dapat dicerna, perbedaan ini sangat tergantung spesiesnya. Pemberian nama tergantung pada monosakarida penyusunnya; misalnya pentosa, nama polisakaridanya menjadi pentosan dan sebagainya. Amilum Banyak terdapat pada sumber nabati yang kaya akan karbohidrat, sebagai contoh: beras, ubi kayu, jagung, dan sebagainya. Bentuk dan besar amilum tergantung spesiesnya. Amilum terdiri dari dua macam yaitu amilose dan amilopektin. Perbedaan keduanya terletak pada rantainya, yang satu lurus, lainnya bercabang; serta pada amilopektin rantainya lebih pendek. Hidrolisis amilum menggunakan asam menghasilkan glukosa, sedangkan bila menggunakan enzim menghasilkan maltosa. Dengan iod amilose memberikan warna biru, sedangkan amilopektin memberikan warna ungu. Pada saat dipanaskan warna hilang. Setelah dingin warna timbul kembali. Dengan alkali warna hilang sebab alkali mengikat iodium. Amilum tidak mereduksi dan tidak membentuk osazon. Pada saat dihidrolisis dengan enzim atau dengan asam akan terbentuk
3
hasil antara, yaitu amilodekstrin, eritrodekstrin, akhrodekstrin, dan akhirnyamenjadi maltosa yang akhirnya menjadi glukosa setelah terpengaruh enzim maltase. Dekstrin Dekstrin memiliki beberapa sifat, yaitu amilodekstrin dengan iodium , warna menjadi ungu, eritrodekstrin dengan iodium warna menjadi merah, sedang akhrodekstrin dengan iodium menjadi tak berubah warnanya. Dekstran Polisakarida dengan bobot molekul 50.000 yang berhubungan erat dengan amilum dan glikogen, disintesis oleh bakteri tertentu, dan merupakan polimer dari unit D-glukopiranosa. Glikogen Glikogen merupakan polisakarida yang terdapat pada otot dan hati, serta merupakan glukosan yang rantainya bercabang dengan cabang yang lebih pendek, namun jumlah cabangnya lebih banyak. Dengan iodium berwarna merah, tidak membentuk osazon, dan dapat diendapkan dengan menjenuhkan dengan (NH 4)2SO4. Selulosa Selulosa merupakan glukosan dengan polimer rantai panjang yang terdapat pada dinding sel tumbuh-tumbuhan. Sulit larut dalam air maupun lemak dan tidak dapat dicerna, kecuali pada hewan tertentu, kelompok ruminansia, karena ada bakteri yang menghasilkan enzim untuk membongkar selulosa. Dengan iodium tidak terjadi perubahan warna. Inulin Inulin merupakan fruktosan yang tidak dapat dicerna dan terdapat pada umbi akar bunga dahlia, umbi artichokes, dan bunga dandelions. Pentosan Pentosan merupakan polimer pentosa dan bila dihidrolisis akan menghasilkan arabinosa. Sebagai contoh gummi arabicum. Pentosan dalam janggel jagung bila dihidrolisis akan menghasilkan silosa. Khitin Khitin merupakan polisakarida struktural yang mengandung N-asetil D-glukosamin dan terdapat pada hewan invertebrata. Mukopolisakarida Mukopolisakarida merupakan polisakarida struktural. Sebagai contoh asam hialuronat, khondroitin sulfat, heparin, dan mukopolisakarida yang terdapat pada dinding bakteri sebagai reaksi imun. Heparin adalah suatu bahan yang dapat mencegah pembekuan darah. Glukoprotein dan mukoprotein mukoprotein Terdapat pada lendir sebagai alfa 1 dan 2 globulin plasma serta beberapa hormon, misalnya gonadotropin, tireotropin, dan isoaglutinin dalam butir darah (eritrosit). Galaktan Galaktan merupakan polimer galaktosa dan bila dihidrolisis akan menghasilkan galaktosa.
4
PRAKTIKUM KARBOHIDRAT 1. Uji Kelarutan dan Percobaan Molisch Bila zatnya padat larutkan dengan aquades hingga larut semuanya. Bila belum semuanya larut, lanjutkan dengan pemanasan dan aduk sehingga membentuk larutan. Lakukan percobaan Molisch; bila positif ini menunjukkan adanya karbohidrat. Reaksi ini berdasarkan pembentukan furfural atau turunan-turunannya turunan-turunannya dari karbohidrat yang didehidratasi oleh asam sulfat pekat. Hasilnya akan bereaksi dengan α-naftol membentuk senyawa berwarna ungu kemerah-merahan. Percobaan a. Amilum Larutkan amilum dibubuhi dengan beberapa tetes larutan α-naftol dalam alkohol. Tuangkan perlahan-lahan perlahan-lahan asam sulfat pekat melalui dinding dalam tabung reaksi sehingga terjadi batasan cincin. Adanya karbohidrat akan memberikan cincin berwarna merah ungu. b. Selulosa Sobekan kertas filter atau serbuk selulosa dimasukkan ke dalam 2 ml air dan setelah itu diberi beberapa tetes larutan α-naftol dan dengan asam sulfat pekat dibatasi cincin. Adanya karbohidrat memberikan cincin berwarna merah ungu. c. Monosakarida Larutan glukosa sebanyak 1 ml (+ setinggi 1-1,5 cm) ditambah 2 tetes 10% α-naftol yang baru dan dicampur. Alirkan 1 ml H 2SO4 pekat sehingga membentuk lapisan di bawah campuran. Adanya cincin ungu menunjukkan adanya karbohidrat. Tugas: Periksalah dengan prosedur yang sama dengan yang di atas pada fruktosa 1%, sukrosa 1%, maltosa 1%, arabinosa 1%, larutan bahan nabati 1%, dan larutan bahan hewani 1%. 2. Percobaan Iod Setetes larutan yang akan diperiksa diletakkan dalam lekukan tempat tes papan porselin. Teteskan larutan iodium. Bagaimana perubahan warna yang terjadi. Prinsipnya patidengan iodium dapat membentuk ikatan kompleks yang berwarna biru. Komponen pati yang berperan yaitu amilosa. Taung larutan amilum dalam tabung reaksi setinggi 1-2 cm, tambahkan larutan iod. Adakah perubahan warna bila dipanasi? Bagaimana bila didinginkan kembali? Bagaimana pula bila ditambah larutan NaOH? Tugas: Periksalah larutan zat yang mengandung amilum 1%, glikogen 1%, amilodekstrin 1%, eritrodekstrin 1%, akrodekstrin 1%, maltosa 1%, glukosa1%, fruktosa 1%, gum arab 1%, agaragar 1%, dan inulin 1%. 3. Percobaan Benedict Isi reagen Benedict 2 ml dalam tabung reaksi (setinggi 1-2 cm) ditambahkan 8 tetes larutan yang diperiksa. Panaskan dalam api langsung selama 2-3 menit. Adanya perubahan warna hijau, kuning, jingga, atau merah menunjukkan reaksi yang positif. Prinsipnya larutanlarutan tembaga yang alkalis bila direduksi oleh karbohidrat yang mempunyai gugus aldehid atau keton bebas akan membentuk Cupro Oksida (Cu 2O) yang berwarna kuning sampai merah.
5
Tugas: Periksalah larutan yang mengandung sukrosa 1%, glukosa 1%, maltosa 1%, laktosa 1%, fruktosa 1%, dan galaktosa 1%. 4. Percobaan Barfoed Isi reagen Barfoed 2 ml ke dalam tabung reaksi, tambahkan 1 ml larutan yang diperiksa. Panaskan selama 5 menit, kemudian diamkan sebentar setelah itu ditambahkan 2-3 reagen fosfo-molibdat. Bila terjadi larutan yang berwarna biru menunjukkan reaksi positif. Tugas: Periksalah larutan yang mengandung sukrosa 1%, glukosa 1%, maltosa 1%, laktosa 1%, fruktosa 1%, dan arabinosa 1%. 5. Percobaan Peragian Siapkan 3 ml zat yang akan diperiksa dalam tabung reaksi dan tambahkan 3 ml suspensi ragi roti. Suhu campuran dinaikkan sampai 37 oC dengan pH 6-7. masukkan campuran tersebut ke tabung fermentasi dan tunggu selama 1 jam. Adanya gelembung gas menunjukan reaksi positif. Tugas: Periksalah larutan yang mengandung amilum 1%, sukrosa 1%, glukosa 1%, maltosa 1%, laktosa 1%, fruktosa 1%, galaktosa 1%, dan arabinosa 1%. 6. Percobaan Seliwanoff Isi reagen Seliwanoff 2 ml ke dalam tabung reaksi, tambahkan 5 tetes zat yang akan diperiksa. Panaskan dalam api langsung selama 20 detik. Fruktosa akan bereaksi cepat dengan membentuk warna merah. Zat-zat lain juga akan bereaksi cepat seperti fruktosa bila pemanasan lebih lama. Prinsipnya reaksi berdasarkan atas pembentukan 4-hidroksi metil furfural yang akan membentuk suatu senyawa berwarna ungu dengan adanya resorsinol (1,3dihidroksi benzen). Reaksi ini spesifik untuk ketosa, yang ditandai dengan hasil reaksi berubah warna menjadi merah. Tugas: Periksalah larutan yang mengandung sukrosa 1%, glukosa 1%, fruktosa 1%, galaktosa 1%, arabinosa 1%, larutan bahan nabati 1%, dan larutan bahan hewani 1%. 7. Percobaan Tauber Larutan 4% benzidin dalam asetat glasial sebanyak 0,5 ml ditambah 1 tetes larutan pentosa. Panaskan sampai mendidih sebentar kemudian didinginkan di bawah air ledeng. Kalau perlu ditambah 1 ml aquades akan terjadi warna merah anggur. Prinsipnya pentosa dengan benzidin di dalam asetat glasial akan membentuk senyawa berwarna merah anggur. Tugas: Periksalah larutan yang mengandung glukosa 1%, fruktosa 1%, arabinosa 1%, gum arab 1%, bahan nabati 1%, dan bahan hewani 1%. 8. Percobaan Bial Reagens Bial 5 ml ditambahkan 2-3 ml larutan yang akan diperiksa. Panaskan sampai timbul gelembung gas yang akan sampai ke permukaan. Adanya warna hijau dan adanya endapan menunjukkan reaksi yang positif. Furfural yang terbentuk dari gula atau dari pentosa
6
akan bereaksi dengan orsinol (3,5-dihidroksi toluena) membentuk senyawa berwarna kebirubiruan karena adanya ion ferri. Tugas: Periksalah larutan yang mengandung sukrosa 1%, laktosa 1%, glukosa 1%, arabinosa 1%, furfural 1%, gum arab 1%, bahan nabati 1%, dan bahan hewani 1%. 9. Hidrolisis Selulosa Potongan-potongan kertas saring dibasahi dengan air dan secara perlahan-lahan ditambahkan asam sulfat pekat, diaduk, dan dipanaskan setelah ditambah air secukupnya. Setelah satu jam ambilah beberapa tetes larutan tersebut dan tes dengan Benedict. Bila masih negatif panaskan kembali larutan tersebut setengah jam lagi, kemudian tes kembeli dengan Benedict. 10. Hidrolisis Amilum Suspensi amilum 10 ml ditambah 2,5 ml 1N HCl, kemudian panaskan pada api langsung. Setiap tiga menit tes larutan tersebut dengan tes iodium. Di samping itu larutan tetap dipanaskan. Bila tes iodium telah negatif, maka lakukanlah tes Benedict tiap 3 menit berikutnya. 11. Uji Osazon Tabung reaksi diisi 0,5 ml larutan fenilhidrazin, Na-asetat kering, kemudian tambahkan 2 ml larutan bahan percobaan dan dikocok sampai homogen. Larutan yang telah omogen tersebut terus dipanaskan pada penangas air mendidih selama 30 menit. Apabila sudah dingin maka akan kelihatan endapan berwarna kuning dan periksalah di bawah mikroskop, maka setiap bahan percobaan punya karakteristik sendiri. Prinsipnya aldosa atau ketosa dapat bereaksi dengan hidrazin akan membentuk osazon. Tugas: Periksalah larutan yang mengandung glukosa 1%, fruktosa 1%, galaktosa 1%, laktosa 1%, maltosa 1%, sukrosa 1%, arabinosa 1%, larutan bahan nabati, dan larutan bahan hewani 1%. 12. Uji Asam Musat Dalam gelas piala kecil dimasukkan 5 ml larutan bahan percobaan (harus jernih) dan 1 ml asam nitrat pekat. Panaskan campuran itu di atas pemanas sampai tersisa setengahnya dan biarkan mendingin secara perlahan-lahan. Perhatikan ada tidaknya hablur yang keras seperti pasir. Ujilah kelarutan hablur itu di dalam air dan periksalah bentuknya di bawah mikroskop. Prinsipnya oksidasi galaktosa dengan asam nitrat akan menghasilkan asam dikarboksilat yang disebut asam musat. Kristal asam musat tidak larut dalam air. Tugas: Periksalah larutan yang mengandung galaktosa 1%, glukosa 1%, fruktosa 1%, l;aktosa 1%, bahan nabati 1%, dan bahan hewani 1%.
7
SKEMA IDENTIFIKASI KARBOHIDRAT YANG TIDAK DIKETAHUI Larutan yang diuji Tes Molisch Tes Iodium
Negatif
Positif
Bukan karbohidrat
Karbohidrat
Biru
Tidak berwarna
Coklat
Merah
Pati/Amilum
Monosakarida Disakarida
Glikogen
Amilodekstrin Eritrodekstrin
Tes Barfoed
Positif dalam 5-7”
Negatif
Benedict (-) Peragian (+) Seliwanoff (+) Glukosazon setelah dihidrolisis
Positif dalam 7-12”
Disakarida
Monosakarida Tes Tauber
Positif
Negatif
Pentosa
Heksosa
Peragian
CO2 (+)
CO2 (-)
Maltosa
Laktosa
Tollens (+) Tauber (+) Pentosazon
Negatif
Positif
Glukosa atau galaktosa
Fruktosa Glukosazon Peragian (-)
Glukosa Glukosazon Benedict (+)
Galaktosa Galaktosazon Asam musat (Mucic acid) tes (+), Benedict (+)
8
BAGIAN II LEMAK/LIPIDA Lemak adalah ester asam lemak dan gliserin. Biasanya zat tersebut tidak larut dalam air tetapi larut dalam pelarut lemak. Adapun pelarut lemak tersebut adalah eter, kloroform, benzena, karbon tetraklorida (CCl 4), xylena, alkohol panas, dan aseton panas. Lipida dalah zat yang menyerupai lemak, sangat penting karena merupakan simpanan tenaga yang amat besar dan sebagai pelarut vitamin A, D, E, dan K. Bagi hewan dan manusia lipida selain sebagian sumber energi juga diperlukan sebagai insulating pada jaringan lain, juga untuk fungsi dari sel membran, dan lain sebagainya. Klasifikasi Lipid Menurut Bloor A. Lemak Sederhana Lemak ini merupakan zat yang terdiri dari ester asam lemak dengan alkohol. Ada 3 jenis lemak sederhana, yaitu: 1. Lemak yang teksturnya padat dalam suhu kamar. 2. Minyak yang teksturnya cair dalam suhu kamar. 3. Lilin atau malam yang merupakan ester asam lemak dengan alkohol yang BM-nya tinggi (rantai C-nya panjang). B. Lemak Kompleks (Compound Lipids). Lemak ini merupakan ester asam lemak yang mengandung gugus lain yang terikat pada alkoholnya. 1. Fosfolipida: ester asam lemak dan gliserol yang mengandung asam fosfat, basa nitrogen atau zat lainnya. 2. Serebrosida (glikolipida): zat yang terdiri dari asam lemak dengan karbohidrat dan mengandung asam fosfat. 3. Lemak kompleks lainnya: kelompok ini termasuk sulfolipida, aminolipida, dan lipoprotein. c. Derivat Lipida Derivat lipida adalah zat yang berasal dari hasil hidrolisis zat-zat tersebut di atas yang antara lain: 1. Asam lemak jenuh dan tak jenuh. 2. Alkohol dan gliserol. 3. Sterol. 4. Lemak aldehid. 5. Badan-badan keton (ketone bodies). ● Asam Lemak Asam lemak ini merupakan hasil hidrolisis dari lemak. Di alam asam lemak yang terbanyak adalah yang mengandung atom C genap dan ikatannya membentuk rantai lurus. Pembagian asam lemak 1. Asam lemak jenuh (satuated fatty acids) Contoh: asam butirat, asam laurat, asam palmitat, dan sebagainya. 2. Asam lemak tak jenuh dengan ikatan rangkap tunggal (monounsaturated fatty acids) Contoh: asam palmitoleat dan asam oleat. 3. Asam lemak tak jenuh dengan ikatan rangkap ganda/lebih dari satu (polyunsaturated fatty acids)
9
Contoh: asam linoleat, asam linolenat, dan asam arachidonat. 4. Asam lemak yang mengandung gugus hidroksil. Contoh: asam risinoleat. 5. Asam lemak siklik Contoh: asam kaulmograf. ● Alkohol Alkohol merupakan hasil hidrolisis lipida selain asam lemak, misalnya gliserol dan asetil alkohol. Asetil alkohol merupakan hasil hidrolisis lilin/malam. Adanya gliserol dapat dites dengan uji akrolein. ● Steroid Biasanya terdapat bersama lemak dan dapat dipisahkan dengan cara penyabunan, sebab steroid tidak dapat bereaksi dengan penyabunan. Steroid mempunyai inti derivat siklo pentano perhidro fenantren. Beberapa sterol yang terpenting diantaranya adalah kolesterol. Zat ini banyak terdapat pada sel tubuh terutama jaringan syaraf dan tidak terdapat pada tumbuhtumbuhan. ● Ergosterol Banyak terdapat pada ragi dan tumbuhan ergot. Zat ini merupakan prekursor vitamin D. ● Koprosterol Terdapat di faeses sebagai hasil reduksi dari kolesterol. ● Sterol lainnya Yang termasuk sterol lainnya ini adalah asam empedu, hormon korteks adrenal, hormon kelamin, vitamin D, dan sebagainya. ● Badan-Badan Keton (Ketone Bodies) Zat ini merupakan hasil dari metabolisme asam lemak dalam tubuh. Beberapa keton bodies yang terdapat pada tubuh antara lain aseton, asam aseto asetat, dan beta hidroksi asam butirat. ● Trigliserida Trigliserida merupakan ester dari asam lemak dan gliserol. Zat ini banyak diperoleh do alam. Asam lemak yang sering kdapatan, diantaranya aitu asam palmitat, asam stearat, dan asam oleat. ● Lilin dan Malam Lilin merupakan ester dari asam lemak dengan alkohol yang mempunyai BM tinggi selain gliserol. Zat ini banyak diproduksi oleh lebah dan beberapa tanaman misalnya daun talas muda. ● Fosfolipid Nama lain golongan senyawa ini adalah fosfogliserida atau gliserol fosfatidat. Senyawa ini terdiri dari gliserol-3-fosfat dan sebagai kerangka dasarnya asam lemak dan alkohol. Sebagai alkoholnya antara lain yaitu kolin, serin, etanolamin, inositol, dan gliserol. Senyawa induk fosfolipida disebut asam fosfatidat. Khusus untuk sphingomyelin terdapat pada jaringan saraf otak dan plasmalogen sebanyak 10% dari fosfolipida yang terdapat pada otak dan otot.
10
● Lesitin Zat lesitin mengandung gliserol, asam lemak, asam fosfat, dan kholin. Adapu fungsinya untuk struktur sel metabolit. ● Chepalin Zat ini susunannya hampir sama dengan lesitin, anya perbedaannya kholin diganti dengan etanolamin. ● Serebrosida (glikolipid) Serebrosida mengandung galaktosa, asam lemak yang beratom C banyak dan spingosin (pada hidrolisis didapatkan asam lemak, asam fosfat, kholin, dan kompleks amino alkohol). Zat ini banyak terdapat pada jaringan selain otak. ● Sulfatid Sulfatid adalah derivat sulfat dari galatosil residu dari serebrosida. ● Gangliosid Gangliosida adalah glikolipida yang banyak terdapat pada otak. Zat ini mengandung asam N-asetil neuraminat, asam lemak, spingosin, dan tiga molekul heksosa (glukosa dan galaktosa). Sifat-Sifat Umum Lemak a. Hidrolisis Hidrolisis dari trigliserida biasanya dengan enzim lipase akan menghasilkan gliserol dan asam lemak. b. Pembentukan membran misel dan emulsi Pada umumnya lipid tidak larut dalam air, sebab mengandung ikatan hidrokarbon yang non polar, namun ada beberapa lipida seperti fosfolipida spingolipida mengandung lebih banyak bagian yang polar bila dibandingkan dengan yang non polar, sedangkan bagian yang polar memiliki sifat larut dalam air. Dengan demikian interfase minyak air bagian polar pada fase air, sedangkan non polar pada fase minyak. Dengan adanya polar lipid dapat membentuk membran biologis dengan dengan lapisan ganda yang disebut disebut double layer.
c.
d.
e.
Misel dapat terjadi bila polar lipida mencapai konsentrasi tertentu yang terdapat aqueous medium, maka akan terbentuk misel. Pada pembentukan garam empedu menjadi misel, akan memudahkan pencernaan lemak. Dengan demikian akan memudahkan penyerapan lemak di intestinum (usus halus). Hidrogenasi Hidrogenasi adalah proses pembentukan lemak tak jenuh menjadi jenuh. Hal ini terjadi khususnya pada lemak tumbuh-tumbuhan untuk dijasikan margarin. Untuk prosesnya diperlukan katalisator Pt dan Ni. Ransid/tengik Ransid adalah perubahan bau dan rasa lemak yang mengandung asam lemak tak jenuh yang mengaami oksidasi dari udara bebas. Katalisator yang mempercepat ransid adalah Pb dan Cu. Oleh karena itu perlu adanya zat antioksidan untuk mencegah ketengikan. Penyabunan Penyabunan adalah terjadi reaksi antara lemak dan alkali. Ada beberapa lipida tak dapat disabunkan, akan tetapi larut dalam eter. Berhubung sabun tidak larut dalam eter, maka beberapa zat tersebut dapat dipisahkan. Beberapa zat yang tidak dapat disabun
11
f.
g.
adalah keton, alkohol dengan BM tinggi dan steroid. Bilangan Penyabunan Bilangan penyabunan adalah jumlah mg KOH yang diperlukan untuk menyabunkan 1 gram minyak atau lemak. Gunanya untuk mengetahui banyaknya asam lemak yang terdapat pada lemak tersebut. Bilangan Iodine Bila iodine adalah jumlah gram iod yang dapat diikat oleh 100 gram lemak atau minyak. Gunanya untuk mengetahui derajat ketidak jenuhan dari lemak.
12
PRAKTIKUM LEMAK DAN MINYAK 1. Kelarutan prinsip kerjanya, kelarutan lemak/minyak dapat dilihat dengan pengamatan langsung kelarutan lemak, yang tergantung dari bahan pelarut yang digunakan. Perhatikan kelarutan dari 2 tetes minyak, 2 mg minyak, 2 mg lemak, 2 tetes minyak ikan, 2 mg kolesterol, pada: tabung 1: 2 ml air tabung 2: 2 ml HCl 2N tabung 3: 2 ml Na 2CO3 1% tabung 4: 2 ml alkohol dingin tabung 5: 2 ml alkohol panas tabung 6: 2 ml petroleum eter tabung 7: 2 ml aseton dingin tabung 8: 2 ml aseton panas tabung 9: 2 ml eter tabung 10: 2 ml premium Pertanyaan 1. Bagaimanakah hasil-hasil kelarutannya? 2. Zat apa saja pelarut lemak? 3. Apa yang disebut emulgator? 4. Zat-zat apa saja yang disebut emulgator? 5. Apakah emulsi minyak dalam air stabil? 2. Emulsi Prinsip kerjanya yaitu lemak atau minyak tidak dapat larut dalam air tetapi dapat membentuk emulsi yang stabil bila ada bahan lain yang berfungsi sebagai emulgator. Larutan sabun sebanyak 3 ml ditambahkan 10 tetesminyak kelapa kemudian dikocok kuat-kuat. Bagaimanakah hasil-hasil percobaan tersebut? Tugas: Lakukan juga dengan cara sama tetapi memakai larutan air dan minyak kelapa. Selain itu lakukan juga pada larutan minyak kelapa tengik dengan air ditambah Na 2CO3 secukupnya. Perhatikan di mana letak perbedaannya. 3. Percobaan Acrolein Prinsip kerjanya yaitu gliserol dalam bentuk bebas atau yang terdapat dalam lemak/minyak bila mengalami dehidrasi akan membentuk aldehid akrilat atau akrolein yang berciri khas. Dalam cawan porselin masukkan kristal KHSO 4 anhidrous dan 2 tetes gliserol. Panaskan dalam kasa asbes, maka bau khas akrolin akan tercium. Tugas: Lakukan tes yang sama untuk asam palmitat padat dan minyak kelapa. Bagaimana hasilnya dan bagaimana reaksi tersebut dapat terjadi? 4. Gliserol dengan Benedict Prinsip kerjanya yaitu gugus aldehid atau keton bebas akan membentuk kupro oksida yang berwarna kuning hingga merah. Reagen Benedict 5 ml ditambah 5 tetes gliserol panaskan 3 menit.
13
Tugas: Lakukan juga dengan gliserol sebanyak 25 tetes yang ditambah 1 tetes H 2O2 dan 1 tetes FeCl 3 kemudian diambil 5 tetes dari campuran tersebut untuk dites dengan Benedict (lakukan hatihati). 5. Sifat Tidak Jenuh terhadap Air Brom dan KMnO 4 Prinsip kerjanya yaitu asam lemak tak jenuh memiliki ikatan rangkap yang dapat diadisi oleh golongan halogen atau dioksidasi. Minyak amandel 1 ml ditambah eter sedikit kemudian dikocok, kemudian ditambakan air Brom 1 ml. Arna air Brom akan hilang. Tugas: Lakukan juga tapi kini air Brom diganti dengan larutan KMnO 4 + H2SO4 encer. Bagaimana hasilnya? Apakah perbedaan lipida, minyak, dan lemak? Sebutkan asam lemak tidak jenuh. 6. Percobaan Salkowski untuk Kolesterol Prinsip kerjanya yaitu berkaitan kelarutan dan fluoresensi yang khas. Kolesterol padat 10 mg dilarutkan dalam 2 ml kloroform. Tambahkan asam sulfat pekat (hati-hati), kemudian digoyangkan (hati-hati). Setelah didiamkan beberapa lama (2-3 menit) maka akan terlihat lapisan atas kloroform berwarna merah coklat sampai ungu. Lapisan bawah asam sulfat yang berfluoresensi hijau. Pertanyaan: mengapa terjadi demikian? 7. Reaksi Asam Basa Prinsip kerjanya yaitu lemak/minyak bila dibiarkan lama akan mengalami perubahan. Basahilah kertas indikator lakmus dengan aquades. Masukkan kertas yang sudah dibasahi ke dalam bahan eksperimen. Amati perubahan apa yang terjadi pada kertas indikator sambil digoyang-goyang. Tugas: Lakukan eksperimen pada bahan seperti minyak kelapa, minyak tengik, minyak kacang tanah, gliserol, asam oleat, asam palmitat, dan air suling. 8. Kristal Lemak Prinsip kerjanya lemak dapat membentuk kristal demikian pula asam lemak. Masukkan 5 ml ether ke dalam piala kecil. Setelah itu bubuhkan 20 tetes lemak cair atau sedikit bubuk asam palmitat dan kocoklah sampai semua bahan terlarut. Biarkan ether menguap spontan sampai kristalnya terpisah dan amati bentuk kristalnya di bawah mikroskop. Tugas: Amati percobaan serupa pada bahan minyak kelapa, lemak sapi, lemak domba, mentega, margarin ”blueband”, dan asam palmitat.
14
BAGIAN III ASAM AMINO, PEPTIDA, DAN PROTEIN A. Asam Amino Asam amino merupakan satuan penyusun protein. Berdasarkan rumus bangunnya asam amino dapat dipandang sebagai turunan asam karboksilat, yang satu atom hidrogennya diganti oleh gugus amino (-NH 2). Protein sendiri dapat dipecah kembali menjadi asam amino, yaitu dengan memakai asam, basa, ataupun hidrolisis dengan enzim. Hidrolisis yang sempurna dari protein akan menghasilkan 20 macam asam amino. Asam amino tergolong amfoter yaitu dapat bereaksi asam atau basa. Menampakkan diri sebagai zwietter ion yang sedikit banyaknya tergantung pada titik iso elektriknya. Klasifikasi Asam Amino Asam amino dapat dibagi dalam: 1. Berdasarkan gugus dan rumus bangunnya. a. Asam amino yang mempunyai gugus alifatik. Contoh: alanin, glisin, isoleusin, leusin, valin. b. Asam amino yang mempunyai gugus hidroksil. Contoh: serin dan treonin. c. Asam amino yang mempunyai gugus sulfur. Contoh: sistein dan metionin. d. Asam amino yang bersifat asam. Contoh: asam aspartat, asam glutamat, asparagin, dan glutamin. e. Asam amino yang bersifat basa. Contoh: arginin, hidroksilin, lisin, dan histidin. f. Asam amino dengan cincin aromatis. Contoh: fenilalanin, triptofan, dan tirosin. g. asam amino yang mempunyai gugus imino Contoh: prolin dan hidroksiprolin. hidroksiprolin. 2. Berdasarkan fungsinya Asam amino dapat dibagi dua yaitu: y aitu: a. Asam amino esensial Contoh: fenilalanin, isoleusin, leusin, metionin, lisin, treonin, tritofan, treonin, triptofan, dan valin. b. Asam amino non esensial Contoh: alanin, asam aspartat, asam glutamat, asparagin, arginin, glutamin, hidroksiprolin, prolin, histidin, serin, sistein, dan tirosin. Masing-masing gugus asam amino dapat bereaksi, misalnya dengan pembentukan garam, esterifikasi, dan oksidasi. Reaksi umum untuk menunjukkan adanya asam amino adalah reaksi ninhidrin. Ninhidrin adalah suatu oksidator yang menyebabkan dekarboksilasi oksidatif dari α-amino yang menghasilkan CO 2, NH3, dan aldehid dengan kehilangan 1 atom karbon. Senyawa ini kemudian bereaksi dengan NH 3 bebas membentuk senyawa kompleks berwarna biru dengan absorbsi warna maksimum pada λ=570 nm. Di samping itu juga dapat dipergunakan untuk mengukur banyaknya kandungan asam amino. Asam amino aromatis, seperti s eperti triptofan, tirosin, histidin, dan fenilalanin dapat menyerap sinar ultraviolet. Asam amino juga dapat diidentifikasi dengan reaksi warna khusus, sebab reaksi warna ini menunjuk sifat struktur rantai samping, bukan gugus karboksilat atau aminonya.
15
Reaksi penunjuk ini antara lain: 1. Fenilalanin dengan tes Xantoprotein. 2. Histidin dengan tes Pauly. 3. Arginin dengan tes Sakaguchi. 4. Sistein dengan tes Nitroprusida dan Sullivan. 5. Triptofan dengan tes Hopkins-Cole, Ehrlich, Xanthoprotein (protein kuning). 6. Tirosin dengan tes Pauly, Millons, Folin-Ciocalteau, dan Xanthoprotein. B. Peptida Protein merupakan ikatan antara asam amino yang membentuk rantai panjang. Ikatan asam amino yang membentuk rantai panjang ini disebut ikatan peptida. Ikatan ini terjadi antara dua asam amino pada gugus berlainan yaitu gugus karboksil dari asam amino yang satu dengan gugus amino dari asam amino yang lainnya. Bila ikatan asam amino ini membentuk rantai yang panjang dan jumlah asam amino yang banyak, maka disebut polipeptida. polipeptida. Adanya ikatan peptida dapat dibuktikan dengan berbagai reaksi. Reaksi yang biasa dipakai adalah reaksi biuret. Reaksi ini adalah reaksi untuk protein dan dapat mengetahui banyaknya ikatan peptida. Sebenarnya yang disebut rangkaian peptida ialah rangkaian asam amino yang jumlahnya kurang dari 100 asam amino. Sebaliknya bila lebih dari itu disebut protein. Struktur primer adalah susunan urutan asam amino dalam rangkai peptida ini. Telah dapat diketahui cara untuk mengetahui banyaknya, macam, serta urutan asam amino pembentuknya. Caranya adalah sebagai berikut: 1. Untuk mengetahui mengetahui banyaknya banyaknya dan macamnya asam amino pembentuk pembentuk baik baik peptida peptida maupun protein dilakukan dengan cara berikut: a. Hidrolisis protein dengan asam. b. Pemisahan dan identifikasi sisa-sisa asam aminonya. c. Khromatografi kertas. d. Hidrolisis protein dengan enzim. e. Khromatografi lapis tipis. f. Khromatografi penukar ion. 2. Untuk mengetahui mengetahui urutan asam amino penyusun baik baik peptida peptida amupun protein dilakukan dilakukan dengan cara berikut: a. Hidrazinolisis. b. pemberian reagen Sanger (1-fluoro-2,4-dinitrobenzena). (1-fluoro-2,4-dinitrobenzena). c. Reaksi dengan fenilisotiosianat degan fosgen. d. Pencernaan dengan amino peptidase atau karboksipeptidase. e. Pencernaan dengan residu endopeptidase spesifik. C. Protein Protein terdiri dari atas satu atau beberapa rantai polipeptida yang mempunyai BM tinggi. Banyaknya asam amino pada suatu protein antara 50.000-100.000. bila BM asam amino 100, BM protein berkisar antara 5.000-5.000.000. struktur dari protein sangat berpengaruh terhadap aktifitas fisiologis. Ada 4 macam struktur dari protein yaitu: struktur primer, sekunder, tersier, dan kuarterner. Pada organisme protein berperan dalam penyusunan dinding sel, plasma sel, hormon, enzim, dan lain sebagainya. Pada pembauran sinar X dapat diketahui adanya bermacam-macam struktur protein, yaitu: 1. Struktur protein primer, yang dibentuk karena ikatan peptida. 2. Struktur protein sekunder, yaitu dengan terbentuknya alfa-heliks yang memutar sepanjang sumbunya.
16
3. Struktur protein tersier, yang mana protein berbentuk melingkar karena adanya ikatan S-S maupun ikatan Van der Waals. Struktur ini menentukan apakah protein itu fibrosa ataupun globuler. 4. Struktur protein kuarterner, terjadi karena beberapa rantai polipeptida yang bergabung menjadi satu. Klasifikasi Protein Protein dapat dibagi dalam 2 kelompok besar, yaitu: A. Protein Sederhana (simple protein) Biasanya hanya mengandung asam α-amino saja. a. albumin b. globulin c. glutelin d. prolamin e. albuminoid f. histon g. protamin B. Protein Majemuk (conjugated protein) Protein yang mengandung zat lain (prosthetic groups) yang berikatan dengan protein dengan ikatan lain selain cara ikatan ion. a. nukleoprotein b. glikoprotein c. fosfoprotein d. kromoprotein e. lipoprotein f. metaloprotein ● Albumin Larut dalam air, asam, basa, an larutan garam encer. Dapat digumpalkan oleh panas dan dapat diendapkan oleh garam jenuh (amonium sulfat). Contoh: serum albumin, laktalbumin (pada susu), dan ovalbumin. ● Globulin Tidak larut dalam air, namun dapat larut dalam larutan garam encer, dalam asam atau basa keras. Dapat digumpalkan oleh panas dan dapat diendapkan dengan setenga menjenuhi dengan amonium sulfat. Contoh: serum globulin dan ovalbumin. ● Glutelin Larut dalam asam encer ata alkali encer dan tidak larut dalam pelarut netral. Dapat digumpalkan oleh panas. ● Prolamin Larut dalam alkohol 70-80%. Tidak larut dalam alkohol absolut, air, dan pelarut netral. Contoh: zein (pada jagung) dan gliadin (pada gandum). ● Albuminoid (skleroprotein) Tidak larut dalam semua pelarut netral, asam encer, maupun alkali encer. Contoh: keratin dan kolagen. Kolagen terdapat pada jaringan penunjang/jaringan penunjang/jaringan ikat.
17
● Histon Larut dalam air dan asam encer. Tidak dapat larut dalam amoniak. Tidak dapat digumpalkan oleh panas. Asam amino yang terdapat lebih banyak bersifat basa. Contoh: nukleohiston dalam inti. ● Protamin Larut dalam air dan amoniak encer. Tidak menggumpal oleh panas, namun dapat mengendapkan protein lainnya. Lebih banyak mengandung asam amino yang bersifat basa dan terutama diperoleh dari sel telur. Contoh: salmin dari telur ikan salmon dan sturine dari ikan sturgeon. ● Nukleoprotein Zat ini merupakan gabungan antara protein dengan asam nukleat. Bisa terdiri dari satu atau lebih protein. Contoh: nuklein dan nukleohiston. ● Glikoprotein Zat ini merupakan gabungan antara protein dengan karbohidrat. Contoh: musin yang terdapat pada ludah, lendir, dan usus, terutama usus besar, serta alfa 1 dan 2 dari protein plasma. ● Fosfoprotein Zat ini merupakan gabungan protein dengan gugus yang mengandung fosfor selain fosfolipida dan asam nukleat. Contoh: kasein, yang merupakan protein utama dalam air susu. Kasein tidak larut dalam air, namun larut dalam asam dan basa. Sifatnya asam dan bergabung dengan basa membentuk garam. Kasein banyak mengandung asam amino esensial yang lengkap, sehingga sering disebut protein sempurna. ● Khromoprotein Zat ini merupakan gabungan antara protein dengan gugus berwarna. Contoh: hemoglobin, hemosianin, sitokrom, dan flavoprotein. ● Lipoprotein Zat ini merupakan gabungan antara protein dengan lemak netral (trigliserida) atau dengan lipida lainnya seperti fosfolipida dan kolsterol. ● Metaloprotein Zat ini merupakan protein yang mengikat logam. Contoh: ceruloplasmin yang mengandung Cu dan Siderofilin yang mengandung besi. Sifat-Sifat Umum Protein 1. Protein murni tidak berbau, tidak mempunyai rasa, namun beberapa derivatnya memberi rasa pahit. 2. Bersifat ampholit. 3. Dalam bentuk larutan, viskositasnya tergantung dari macamnya protein. Bila ditinjau dari strukturnya protein fibrosa lebih besar viskositasnya dibandingkan protein globular. Contoh protein fibrosa: kolagen, miosin, keratin, fibrin, dan sebagainya. Contoh protein globular: albumin, globulin, protein enzim, dan protein hormon. 4. Memberikan reaksi warna. 5. Memberikan reaksi pengendapan. pengendapan. 6. Bereaksi dengan asam nitrat.
18
7. Bereaksi dengan formaldehid. 8. Dapat mengalami denaturasi. Protein memberikan reaksi warna Pemeriksaan protein umumnya berdasarkan reaksi warna. Reaksi warna ini adalah berdasarkan atas adanya ikatan peptida ataupun adanya sifat-sifat tertentu dari asam amino yang dikandungnya. 1. Reaksi Biuret Reaksi warna ini umum untuk peptida dan protein, termasuk di antaranya hasil hidrolisis protein seperti: metaprotein, proteosa, pepton, polipeptida, kecuali asam amino. Reaksi positif terjadi dengan adanya perubahan warna menjadi ungu atau merah muda akibat terjadinya persenyawaan antara Cu dengan N dari ikatan peptida dan O dari air, warnayang terjadi tergantung panjangnya ikatan peptida. Bila ikatan peptidanya panjang warnanya ungu, sebaliknya bila pendek warnanya merah muda. Asam amino memberikan reaksi biuret negatif, ebab tidak ada iaktan peptida. Dengan demikian reaksi negatif dapat dijadikan indikator selesainya hidrolisis protein. 2. Reaksi Xantoprotein Reaksi warna ini untuk asam amino yang mengandung cincin fenil atau inti benzen. Contoh: tirosin, fenilalanin, dan triptofan. Reaksi positif ditandai dengan timbulnya warna kuning setelah ditambah asam nitrat dan dipanaskan. Bila asam amino ini ditambah alkali akan memberi warna oranye. 3. Reaksi Millon Reaksi ini positif bila terjadi pengikatan hg dari pereaksi Millon dengan gugus hidroksifenil dari protein/peptida/asam amino. Reaksi ini dapat dipergunakan untuk menunjukkan adanya tirosin, namun tidak spesifik sebab fenol juga memberikan reaksi positif. 4. Reaksi Hopkins-Cole Reaksi ini positif apabila terjadi cincin ungu pada bidang batas. Hal ini terjadi karena adanya kondensasi 2 inti induk dari triptofan dengan aldehid (aldehid yang dipakai adalah asam glioksilat). Pada eksperimen Adam Kiewcs terdapat campuran asam glioksilat dengan asam sulfat pekat. 5. Reaksi Reduksi Sulfur Reaksi positif ditandai dengan timbulnya warna hitam dri PbS. Hal ini terjadi akrena setelah protein diberi Pb dan dipanaskan, unsur S yang terdapat pada protein lepas dan berikatan menjadi PbS. Reaksi ini positif khususnya bila ada protein tersebut terdapat asam amino yang mengandung sulfur, seperti sistein, sistin, dan metionin. 6. Reaksi Sakaguchi Reaksi positif ditandai dengan timbulnya warna merah setelah protein yang telah dialkaliskan dengan NaOH dan diberi α-naftol bereaksi dengan kalium hipoklorit. Reaksi ini dipergunakan untuk identifikasi adanya arginin dalam protein. 7. Reaksi Pauly Reaksi positif ditandai dengan timbulnya warna merah atau jingga setelah terjadi persenyawaan dengan asam sulfanilat yang mengalami reaksi diaso dan dialkaliskan dengan NaOH atau NH 4OH. Reaksi ini penting untuk identifikasi adanya istidin dalam protein.
19
Protein Memberikan Reaksi Pengendapan 1. Pengendapan dengan (NH 2)SO4 dan alkohol pekat. Pengendapan ini disebabkan oleh adanya gugusan –NH 2, -NH, -OH, dan –CO dalam protein yang dapat mengikat air. Amonium sulfat dan alkohol pekat akan menarik air sehingga protein kehilangan air. Pada saat inilah protein mempunyai kelarutan yang paling kecil dan mudah diendapkan. Molekul protein sendiri tidak mengalami perubahan kimia dan mudah dilarutkan kembali setelah diberi air. 2. Pengendapan dengan ion positif logam berat Ion positif logam berat ini dapat diperoleh dari CuSO 4, AgNO3, Hg(NO3)2, HgCl2, Pb(CH3-COO)2 dan FeCl3. Reaksi ini akan menimbulkan penetralan muatan. Pengendapan terjadi bila protein berada pada kondisi alkalis terhadap titik isoelektrisnya. Protein bermuatan negatif dengan adanya ion positif dari logam berat membentuk senyawa netral yang memiliki sifat mengendap. Hasil pengendapan ini dapat larut kembali setelah diberi penambahan alkali encer. 3. Pengendapan dengan ion negatif dari reagens alkaloid Reaksi ini terjadi pada pH yang lebih rendah terhadap titik isoelektrisnya, sehingga protein bermuatan positif. Selanjutnya penetralan dengan ion negatif seperti asam pikrat, as am ferrosianat, asam laktat, asam sulfosalisilat, dan lain-lainnya akan menimbulkan pengendapan. Proses ini sering dilakukan untuk mengendapkan alkaloid tumbuh-tumbuhan yang disebut reagens alkaloid. Hasil pengendapan dapat larut kembali setelah diberi penambahan asam encer. 4. Pengendapan dengan alkohol dan pelarut organik Reaksi pengendapan akan terjadi paling baik pada titik isoelektrisnya, sedangkan dasarnya adalah seperti reaksi pengendapan dengan amonium sulfat dan alkohol. 5. Pengendapan dengan mineral pekat Reaksi pengendapan akan timbul bila jumlah asam sedikit. Bila pemberian asam berlebihan akan menghidrolisis protein. 6. Koagulasi oleh panas Panas dapat mengkoagulasi protein. Suhu yang paling efektif berkisar antara 38 o-75oC dan paling baik pada titik isoelektrisnya. Koagulan ini tidak larut lagi bila pelarutnya menyebabkan hidrolisis. Sifat koagulasi (penggumpalan) dapat dipergunakan sebagai salah satu cara memisahkan protein. Reaksi dengan Asam Nitrit Asam nitrit akan membebaskan gugusan asam amino bebas dari protein atau gugus amino menjadi gas nitrogen (N 2). Reaksi dengan Formaldehid Protein bereaksi dengan formaldehid membentuk endapan yang tidak larut dan mengeras. Pengaruh formaldehid terhadap asam amino menyebabkan asam amino bereaksi atau kehilangan sifat basanya akibat formaldehid terikat gugus amino dan membentuk asam amino dimetilal. Reaksi yang demikian ini disebut reaksi Sorensen dan metodenya dapat digunakan untuk penetapan asam amino secara kuantitatif.
20
Denaturasi Protein Denaturasi merupakan perubahan sifat fisik dan fisiologis protein. Hal ini disebabkan adanya perubahan konfigurasi protein yang menjadi memanjang, karena rusaknya ikatan hidrogen dan ikatan non polar. Denaturasi ini dapat disebabkan oleh bahan-bahan kimia, pemanasan, sinar X, dan sinar ultraviolet. Perubahan akibat denaturasi dapat berakibat perubahan titik isoelektris, kelarutan, dan tegangan permukaannya. Disamping itu denaturasi juga dapat berakibat hilangnya aktifitas enzimatis, hormon, antibodi, dan antigenik.
21
PRAKTIKUM PROTEIN A. Reaksi perubahan warna 1. Uji Biuret Ke dalam larutan protein 2 ml ditambahkan 1 ml NaOH 10%. Setelah itu tambahkan 2-3 tetes larutan CuSO 4. terjadinya warna ungu atau merah menandakan reaksi positif. Warna biru berarti negatif. Tugas: Reaksikan pula pada larutan protein, pepton, tripeptida, dan asam amino. Amati perubahan yang terjadi. Masukkan + setengah sendok urea ke dalam cawan krus porselen dan panaskan dengan nyala api langsung. Amati adanya gas yang keluar: baunya, uji dengan kertas lakmus merah basah. Gas apa itu? Bila gas sudah habis, dinginkan dan perhatikan adanya residu di dasar krus. Tuangi dengan akuades dan larutkan. Pindahkan ke dalam tabung reaksi dan uji dengan uji biuret. Pada tabung reaksi lain masukkan sedikit sedikit urea, beri akuades dan uji dengan uji biuret. Catatlah perbedaan yang ada dan bagaimana reaksi pemanasan urea? 2. Uji Molisch Lakukan uji Molisch seperti prosedur karbohidrat k arbohidrat di depan untuk larutan protein. Tugas: Lakukan uji ini pada larutan albumin dan pepton (dari kasein). Amati perubahan yang terjadi. Tariklah kesimpulan Anda. 3. Uji Xanthoprotein Ke dalam 2 ml larutan yang diperiksa tambahkan 1 ml HNO 3 pekat. Panaskan selama 1 menit, kemudian dinginkan di air keran mengalir. Masukkan ke dalam tabung dengan perlahan-lahan dan hati-hati NaOH 40% sampai terjadi perubahan warna. Warna oranye atau kuning tua pada bidang pembatas menyatakan reaksi positif. Tugas: Lakukan uji ini pada larutan protein dan pepton. Amati perubahan yang terjadi. 4. Uji Millon Reagens Millon dapat dibuat dengan susunan kimiawi berikut: HgO 100 mg dicampur dengan HNO 3 pekat 140 ml dan diencerkan dengan aquades yang volumenya dua kali lipat. Kerjakan dengan hati-hati. Masukkan 2 ml zat yang diperiksa ke dalam tabung reaksi, tambahkan beberapa tetes reagens Millon. Aduk sampai terlihat adanya endapan putih. Panaskan hati-hati dan tambahkan NaNO2 setelah dingin. Adanya warna merah menandakan reaksi positif. Tugas: Lakukan uji ini pada larutan fenol dan protein. Amati perubahan apa yang terjadi. Apa kesimpulan Anda?
22
5. Uji Ninhydrine Ke dalam 3 ml larutan protein tambahkan 10 tetes larutan ninhydrine. Panaskan 1-2 menit. Diamkan sampai dingin, akan terbentuk warna biru. Terbentuknya warna biru karena terjadi reaksi ninhydrine yang menghasilkan aldehid yang rendah dan melepaskan CO 2 dan amoniak. Tugas: Lakukan uji ini terhadap larutan protein dan amati perubahan apa yang terjadi. 6. Uji Hopkins-Cole Buatlah terlebih dahulu asam oksalat pekat dan reagens Hopkins-Cole. Asam oksalat pekat terdiri dari asam oksalat 25 g dan akuades 250 ml. Reagens Hopkins-Cole terdiri dari Magnesium powder 10 g, asam oksalat pekat 250 ml, asam asetat glasial 25 ml dan ditambah akuades sehingga volume mencapai 1000 ml. Pelaksanaan uji Hopkins-Cole Bahan yang diuji sebanyak 1 ml ditambah dengan 1 ml reagens Hopkins-Cole. Setelah itu tambahkan asam sulfat pekat dengan hati-hati. Amati, akan terbentuk cincin ungu pada perbatasan dan bila dikocok akan menjadi ungu seluruhnya. Prinsip kerjanya adalah triptofan akan berkondensasi dengan aldehid dan dengan adanya asam sulfat pekat akan membentuk reksi yang berwarna. Aldehid diperoleh dari asam oksalat dengan adanya magnesium akan membentuk asam glioksilat. Tugas: Lakukan uji ini terhadap protein, pepton (dari kasein) dan gelatin. Amati perubahan apa yang terjadi. 7. Uji Sulfur Larutan protein sebanyak 1 ml ditambah 1 ml NaOH 40%, panaskan hati-hati selama 1 menit untuk mengubah sulfur organik menjadi Na-S. Setelah itu tambahkan 1 tetes larutan Pb-asetat, akan terjadi warna coklat atau hitam karena terbetnuk PbS. Tugas: Lakukan uji pada protein, asam amino yang ada terutama yang mengandung unsur S. Amati perubahan yang terjadi. 8. Uji Sakaguchi Larutan protein 3ml yang dialkaliskan kuat dengan ditetesi larutan NaOH 10%, kemudian ditambah dengan 3 tetes larutan α-naftol (1% dalam alkohol). Campurkan dengan rata, kemudian tambahkan dengan volume yang sama larutan kalium hipoklorit atau sampai menunjukkan adanya perubahan warna. Perubahan warna menjadi merah menandakan reaksi positif. Tugas: Lakukan uji ini pada larutan protein, amati perubahan yang terjadi. Lakukan juga uji terhadap asam amino glisin, arginin, kreatin (suatu guanidin) juga terhadap urea. Amati perubahan yang terjadi dan buat kesimpulannya.
23
9. Uji Pauly Berdasar Reaksi Diazo Larutan asam sulfanilat 0,5% dalam HCl 2% sebanyak 2ml dicampurkan hati-hati dengan larutan natrium nitrit 0,5% yang sama banyaknya. Terjadilah reaksi diazo dan tunggulah sampai 1 menit (reaksi diazo akan lebih cepat terbentuk bila reaksi dilakukan dalam suhu yang rendah, karena itu sebaiknya tabung reaksi dimasukkan ke dalam air es). Kemudian tambahkan ke dalamnya 1 ml larutan protein yang diuji. Campuran ini kemudian dialkaliskan dengan menambahkan larutan NaOH atau NH 4OH. Hasilnya positif bila terbentuk warna merah atau jingga. Tugas: Lakukan uji ini pada protein, juga lakukan terhadap asam amino glisin, tirosin, dan triptofan. Amati perubahan yang terjadi dan buat kesimpulan dari pengamatan Anda. B. Reaksi Pengendapan 1. Uji Pengendapan dengan Reagens Alkohol Pekat Sediakan reagens berikut: asam pikrat jenuh, asam trichlorasetat, asam fosfo tungstat, asam fosfomolibdat, asam sulfosalisilat, dan alkohol 96%. Siapkan 6 tabung reaksi untuk ke 6 reagens di atas, dan isilah masing-masing tabung dengan 3ml larutan protein encer. Tetesi masing-masing tabung dengan masing-masing reagens dan hitunglah pada berapa tetes reagens dapat menyebabkan terjadinya endapan. Tugas: Amati perubahan apa yang terjadi hitung berapa tetes reagens menyebabkan terjadinya endapan. Teruskan penetesan dan pada tetes berapa terjadi kelarutan kembali dari masing-masing reagens. Buat kesimpulan zat apa saja yang dapat mengendapkan protein dan bagaimana bila zat tersebut diberikan berlebihan. 2. Pengendapan Protein oleh Garam-Garam Atau Ion Ion Logam Logam Berat Berat Sediakan reagens perak nitrat 2%, tembaga sulfat 2%, ferrichlorida 2%, dan merkurichlorida 2%. Siapkan tabung reaksi untuk keempat reagens tersebut, isilah tabung reaksi dengan 3 ml larutan protein encer. Tetesi masing-masing tabung dengan masingmasing reagens dan hitunglah pada berapa tetes reagens menunjukkan adanya endapan. Tugas: Amati perubahan yang terjadi. Hitung pada berapa tetes reagens menunjukkan adanya endapan. Teruskan penetesan reagens hingga berlebih dan amati apakah endapan tersebut akan larut kembali. Buat kesimpulan k esimpulan pengamatan Anda. 3. Pengendapan Protein oleh Garam Amonium Sulfat Sediakan 5 ml larutan protein dan jenuhkan dengan amonium sulfat dengan jalan mengocoknya dengan amonium sulfat (NH 4)2SO4 padat dan berlebihan. Akan terjadi endapan. Tugas: Amati perubahan apa yang terjadi. Bagaimana bila endapan yang terjadi diencerkan lagi? Apa yang terjadi?
24
4. Pengendapan protein oleh asam a. Heller test Bila ke dalam larutan protein ditambahkan asam akan terjadi pengendapan, bila asam yang ditambahkan berlebihan endapan akan larut kembali. Akan tetapi HNO3 merupakan asam yang paling kurang dapat melarutkan kembali. Hal ini disebabkan karena dengan HNO3 akan terjadi reaksi denaturasi yang kemudian diikuti koagulasi dan lama kelamaan akan terjadi nitrasi yang menyebabkan warna kuning. Prosedurnya Ke dalam 2 ml larutan protein, dengan hati-hati sekali masukkan 2 ml HNO 3 pekat. Akan terlihat pada perbatasan warna putih yang bila dibiarkan lama kelamaan berubah menjadi kuning. Tugas: Amati perubahan apa yang terjadi pada larutan protein. Dapatkah Heller Test ini dipergunakan untuk menentukan adanya protein pada urine? b. Pengendapan oleh asam asetat Ke dalam 5 ml larutan protein tambahkan 2 tetes larutan asam asetat 1 N. Kemudian tabung dipanaskan dalam penangas air mendidih selama 5 menit. Tugas: Amati perubahan yang terjadi, apakah endapan yang terjadi larut dalam air. Selidiki reaksi endapan ini dengan reagens Millon dengan cara memasaknya dengan beberapa tetes reagens Millon. Terjadinya endapan merah atau warna larutan menjadi merah itu menunjukkan adanya gugusan hidroksifenil (yang terdapat pada asam amino tirosin) dalam protein. 5. Pengendapan albumin dan globulin oleh asam sulfosalisil sulfosalisil Serum encer (atau larutan protein) sebanyak 2 ml ditambah dengan 1-2 tetes asam sulfosalisil akan terjadi endapan warna putih. Tugas: Amati perubahan apa yang terjadi. Apakah kalau ditambah air yang berlebihan endapan dapat larut kembali? 6. Pengendapan kasein oleh asam asam asetat dengan indikator bromkresol hijau hijau Larutan kasein yang alkalis sebanyak 5 ml ditambah 1 tetes indikator bromkresol hijau, warna akan menjadi biru. Kemudian tambahkan setetes demi setetes asam asetat 2% sampai warna larutan menjadi agak hijau (pH=4,7). Akan terjadi endapan kasein. Tugas: Amati perubahan apa yang yang terjadi. Apakah kalau ditambah air yang berlebih endapan dapat larut kembali? C. Reaksi Penggumpalan 1. Penggumpalan metaprotein Suspensi metaprotein sebanyak 5 ml dimasak. Setelah didinginkan dibagi menjadi 2 tabung. Satu tabung diberi setetes HNO 3 encer; tabung yang satu lagi dibuat alkalis dengan memberi 1 atau 2 tetes Na 2CO3 2%.
25
Tugas: Amati perubahan apa yang terjadi. Bagaimana pengaruh pemanasan terhadap kelarutan metaprotein? Mengapa? 2. Penggumpalan pada proteosa Sebagian dari larutan proteosa dimasak. Tugas: Amati perubahan apa yang terjadi. Apakah terjadi koagulasi? D. Pengaruh Formaldehid terhadap Asam Amino. Ambillah 2 buah tabung reaksi. Tabung pertama diisi dengan 1 ml larutan asam amino, dan tabung kedua dengan 1 ml larutan formaldehid (formalin). Tiap tabung ditambah setetes indikator fenolftalein. Selanjutnya masing-masing tabung dinetralkan dengan menambah dengan hati-hati larutan NaOH 10%, hingga warna menjadi merah muda. Kedua larutan tersebut kemudian dicampur. Tugas: Amati perubahan apa yang terjadi. Apakah warna merah muda hilang? Mengapa demikian? E. Timbulnya gas N Larutan asam amino sebanyak 1 ml ditambah beberapa tetes larutan Natrium hipobromit segar. Akan keluar gas nitrogen (N 2). Tugas: Amati perubahan apa yang terjadi. Lakukan juga reaksi ini terhadap urea dan garam amonium dan buat kesimpulannya. F. Penjendalan (Gelatineren) pada Gelatin 1. Uji Pembengkakan dan kelarutan Kocoklah sedikit dengan 10 ml air dan biarkan selama 10 menit. Tugas: Amati perubahan yang terjadi. Adakah terjadi pembengkakan? Selanjutnya panaskan dengan diaduk. Adakah kelarutan? Larutan gelatin yang terjadi dipergunakan untuk percobaan selanjutnya. 2. Uji penjendalan (gelatineren) (gelatineren) Sebagian larutan gelatin pindahkan ke dalam tabung reaksi sebanyak + 2 ml, kemudian masukkan tabung reaksi ke dalam es batu. Tugas: Amati perubahan yang terjadi. 3. Uji Pengendapan 3.1. Tunjukkan bahwa gelatin dapat diendapkan dengan setengah menjenuhi dengan garam (NH4)2SO4. 3.2. Tunjukkan bahwa gelatin tidak memberi endapan dengan pemberian campuran kalium ferrosianida dan asam asetat.
26
SKEMA IDENTIFIKASI ZAT PROTEIN YANG TIDAK DIKETAHUI Larutan yang diuji
Padat atau Larutan
Larutan pada: air dingin, panas, larutan garam encer (ammonium sulfat), alkali encer, dan asam encer. Ingat: protein sukar larut dan bila lartu umumnya larutan agak kental.
Uji Biuret
Positif
Negatif
Polipeptida/Protein derivatnya
Polipeptida/Protein derivatnya
Langkah Selanjutnya 1. Buatlah reaksi dari larutan menjadi pH 5,4. hal ini ditunjukkan dengan tepat hilangnya warna merah dari khlorfenol merah setelah ditambah dengan asam asetat 2%. Suatu presipitasi yang kemudian menjadi koagulasi k oagulasi pada waktu dididihkan menunjukkan adanya protein. 2. Bila tidak terjadi presipitasi pada nomr 1 di atas, tetapi terjadi koagulasi bila larutan itu dididihkan pada pH tersebut, maka mungkin ada albumin dan globulin. Albumin dan globulin dapat dibedakan dengan penambahan (NH 4)2SO4. 3. Buatlah larutan yang asli atau semula menjadi pH 4,7. Hal ini ditandai dengan timbulnya warna hijau dari bromcresol hijau. Timbulnya presipitasi menunjukkan adanya kasein. 4. Bila semua percobaan di atas negatif, dan dengan asam ferosianat juga negatif maka kemungkinan itu adalah gelatin. Lakukan percobaan untuk gelatin. Reaksi-reaksi warna untuk sistein dan triptofan biasanya juga negatif bila itu gelatin. 5. Bila semuanya di atas negatif, coba dikerjakan pengendapan dari larutan yang asli dengan menjenuhi dengan amonium sulfat. Bila ada endapan itu menunjukkan adanya proteosa. Setelah itu lakukan reaksi biuret dan reaksi warna. Reaksi ini positi bila ada polipeptida. 6. Bila semua reaksi di atas tetap negati, maka perlu diuji reaksi formaldehid untuk asam aminonya. Namun perlu dibuktikan dahulu bahwa dalam larutan tersebut tidak ada garam amoniumnya. Setelah itu baru dilakukan semua reaksi warna beserta pengendapannya. pengendapannya. Satu hal yang perlu diperhatikan yaitu setiap hasil uji entah itu positif atau negatif jangan dibuang, bagi yang positif harus dikerjakan reaksi-reaksi selanjutnya, yaitu reaksi warna dan pengendapan lengkap.
27
Appendix PEREAKSI UNTUK PRAKTIKUM BIOKIMIA Benedict Pereaksi Benedict ini dipergunakan untuk menentukan adanya gula-gula reduksi. Ion kupri (Cu++) dalam pereaksi ini akan direduksi oleh gula-gula pereduksi sehinga menjadi ion kupro (Cu+) yang berwarna merah dan mengendap. Reaksinya terjadi dalam suasana basa dan untuk mempercepat jalan reaksi perlu dilakukan pemanasan. Natrium karbonat dalam pereaksi ini berfungsi untuk membuat suasana menjadi basa; natrium sitrat berfungsi mencegah mengendapnya ion kupri dalam suasana basa. Susunan pereaksi Benedict: larutkan 173 gram Na-sitrat dan 100 gram Na 2CO3 dalam 800 ml akuades. Bila semua sudah larut, tuangkan ke dalamnya larutan 17,3 gram CuSO 4 dalam 100 ml akuades, sedikit demi sedikit sambil terus t erus diaduk. Tambahkan akuades sehingga volumenya menjadi 1 liter. Barfoed Pereaksi Barfoed bersifat asam lemah dan hanya direduksi oleh monosakarida. Namun bila pemanasan berlangsung terlalu lama dapat terjadi hidrolisis disakarida menjadi monosakarida, sehingga memberikan hasil positip yang palsu. Endapan kupro oksida yang terbentuk setelah pemanasan tidak sebanyak pada reaksi dengan pereaksi Benedict. Untuk memperjelas adanya endapan kupro oksida dapat ditambahkan ke dalam reaksi tersebut fosfomolibdat sehingga timbul warna biru yang khas. Susunan pereaksi batfoed: larutkan 48 gram kupri asetat dalam 900 ml akuades mendidih sehingga semuanya larut. Segera tambahkan 50 ml asam laktat 8,5% dan segera kocok kemudian tambah akuades sehingga volume menjadi 1 liter dan saring bila masih ada yang tidak dapat larut. Fosfomolibdat untuk Tes Barfoed Modifikasi Tauber-Kleiner Larutkan 150 gram asam molibdat dan 75 gram Na 2CO3 dalam 500 ml akuades dan panaskan hinga mendidih. Setelah agak dingin saringlah untuk menghilangkan zat-zat yang tidak dapat larut dan tambahkan ke dalam filtrat 300 ml asam fosfat 85%, dinginkan dan tambahkan akuades sehingga volumenya menjadi 1 liter. Molisch: Larutan α-naftol Pereaksi ini dipergunakan untuk membuktikan adanya karbohidrat secara umum. Asam sulfat pekat yang ditambahkan kepada senyawa yang diuji akan menyebabkan ikatan glikosidik akan terhidrolisis sehingga terbentuk monosakarida yang kemudian akan mengalami dehidrasi menjadi furfural dengan derivatnya. Senyawa ini selanjutnya bergabung dengan αnaftol yang mengalami sulfonasi oleh asam sulfat pekat sehingga terbentuk kompleks yang berwarna ungu. Uji Molisch selain menggunakan larutan α-naftol dengan komposisi: 1 gram αnaftol dalam 20 ml alkohol 95%, juga menggunakan asam sulfat pekat. Larutan α-naftol dalam alkohol ini tidak dapat disimpan terlalu lama. Karena itu buatlah secukupnya saja. Seliwanoff Ketosa lebih mudah mengalami dehidrasi daripada aldosa untuk menghasilkan derivat furfural, yang selanjutnya mengadakan kondensasi dengan resorcinol membentuk kompleks yang berwarna merah. Pereaksi Seliwanoff terdiri atas larutan resorcinol (m-dihidroksi benzena) dalam asam chlorida dengan susunan: 0,5 gram resorcinol dalam 100 ml HCl 3 N. Larutan ini tidak dapat disimpan lama. Karena itu buatlah hanya cukup untuk satu hari saja.
28
Bial Bila pentosa dipanaskan dengan HCl pekat, maka terbentuklah furfural yang dapat berkondensasi dengan ocinol dan dengan adanya ion ferri (Fe++) menghasilkan warna biruhijau. Reaksi ini tidak sangat spesifik untuk pentosa, karena pemanasan yang berlebihan dapat juga menyebabkan heksosa menghasilkan hidroksimetil furfural yang dengan orcinol dan ion ferri menghasilkan kompleks yang berwarna biru-hijau. Komposisi pereaksi orcinol dari Bial: larutkan 1,5 gram dalam 500 ml HCl pekat tambahkan padanya 20 tetes larutan FeCl 100 gram/lt. Osazone Senyawa-senyawa yang mengandung gugusan –CO-CHOH- akan membentuk kristal osazon pada perlakuan dengan phenylhydrazine. Kristal osazone mempunyai bentuk yang khas dan titik cair tertentu dan sifat ini dapat dipergunakan untuk mengidentifikasi gula-gula mereduksi. Hal lain yang dapat dipergunakan untuk membantu identifikasi adalah waktu yang diperlukan untuk pembentukan kristal dan apakah kristal osazon yang terbentuk itu mengendap pada larutan yang panas atau hanya pada larutan yang didinginkan. Phenylhydrazine akan bersenyawa dengan gugusan karbonil dari gula menghasilkan phenylhydrazone yang selanjutnya bereaksi lebih lanjut dengan phenylhydrazine yang lain sehingga terbentuk osazon. Pemeriksaan bentuk kristal osazon haruslah dengan menggunakan mikroskop. Tollens Reaksi Tollens ini dipergunakan untuk membedakan pentosa dari heksosa. Pereaksi Tollens mempunyai susunan: 20 gram floroglusinol dilarutkan dalam alkohol 95%, bila sudah larut encerkan labih lanjut dengan alkohol 95% sehingga volumenya menjadi 1 liter. Larutan ini tidak dapat disimpan lama, karena itu setiap kali harus dibuat baru. Cara kerja: 2 ml larutan floroglusinol dipanaskan dengan 5 tetes larutan bahan yang akan diperiksa dalam penangas air. Adanya pentosa ditandai dengan terbentuknya warna merah anggur. Somogyi-Nelson Reaksi Somogyi-Nelson dipergunakan untuk menentukan gula-gula mereduksi. Bila ada gula mereduksi dipanaskan dengan tembaga tartrat dalam suasana alkalis akan terbentuk kupro oksida, yang bila bereaksi dengan arsenomolibdat akan menghasilkan warna birumolibden yang khas. Penggunan natrium sulfat dalam reaksi ini adalah untuk mencegah terjadinya reoksidasi kupro oksida. Intensitas warna biru molibden dapat dipergunakan untuk mengetahui kadar gula reduksi yang diperiksa (dengan menggunakan spektrofotometer). Pereaksi untuk keperluan ini: Somogyi-Nelson A : 12,5 gram NaCO; 12,5 gram Na; K-tartrat (garam Rochelle); 10 gram NaHCO3; dan 100 gram Na 2SO4 anhidrat dilarutkan dalam 350 ml akuades. Larutan ini kemudian diencerkan sehingga menjadi 500 ml. Somogyi-Nelson B : 7,5 gram CuSO4.5H2O dilarutkan 50 ml akuades, dan diberi 1 tetes H2SO4 pekat. Larutan kerja: 25 bagian A dicampur dengan 1 bagian B.
29
Amonium Molibdat Larutkan 25 gram amonium molibdat dalam 450 ml akuades dan 25 ml H 2SO4 pekat hingga semuanya terlarut. Tuangkan ke dalam larutan ini larutan 3 gram Natrium-arsenat (Na2.HasO4.7H2O) dalam 25 m akuades. Aduk hingga merata, masukkan ke dalam botol berwarna coklat dan inkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC.
30
