BUKU PANDUAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
LABORATORIUM DASAR PROSES KIMIA DEPARTEMEN TEKNIK KIMIA FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS INDONESIA DEPOK 2015
KATA PENGANTAR
Puji syukur kami panjatkan ke hadirat Allah Swt, karena dengan rahmat dan hidayahNya kami dapat menyelesaikan penyusunan buku petunjuk praktikum Biokimia ini. Praktikum Biokimia merupakan salah satu mata kuliah dasar yang diberikan departemen Teknik KimiaFTUI pada semester genap. Buku petunjuk praktikum Biokimia ini dibuat dengan maksud membantu mahasiswa agar lebih mudah mendalami materipraktikum yang akan dilaksanakan. Kemudian pada kesempatan ini kami ingin menyampaikan ucapan terima kasih yang sebesar - besarnya kepada semua pihak yang telah membantu dalam penyusunan buku ini. Kami menyadari bahwa buku ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu kami dengan senang hati menerima kritik dan saran yang membangun. membangun. Akhimya kami mengharapkan semoga buku ini dapat memberikan manfaat bagi para pembacany pembacanya. a.
Depok, 15 Januari 2015 Editor,
Eko Anjang Budi P
1
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR........................................................... PENGANTAR.............................................................................................................................. ........................................................................ ..... 1 DAFTAR ISI ............................................................................................. ............................................................................................................................................... .................................................. 2 TATA TERTIB PRAKTIKUM PRA KTIKUM ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... 3 ASPEK KESELAMATAN ............................................................................................................................. ............................................................................................................................. 4 SUSUNAN PENULISAN LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA ...................................................................... ...................................................................... 7 MODUL 1
REAKSI-REAKSI PADA HIDROKARBON .................................................................................... .................................................................................... 9
MODUL 2ANALISIS
POLISAKARIDA ALAMI................................................................... ............................................................................................ ......................... 19
MODUL 3EKSTRAKSI MINYAK MODUL 4EKSTRAKSI
DNA DARI KACANG HIJAU ................................................................................... ................................................................................... 31
MODUL 5EKSTRAKSI DAN MODUL 6PERHITUNGAN MODUL 7KLOROFIL
DAN IDENTIFIKASI LIPID DAN ASAM LEMAK ......................................... 25
KUANTIFIKASI PROTEIN DARI SUMBER MAKANAN .................................... 37
MIKROSKOPIS ............................................................................................... ............................................................................................... 48
DAN KAROTENOID ................................................................................................ ................................................................................................ 52
MODUL 8TEKNIK ASEPTIK
DAN PEMBUATAN BIAKAN BIAKA N MURNI............................................................. 57
2
TATA TERTIB PRAKTIKUM
1. Semua praktikan wajib mengenakan jas lab yang berwarna putih selama melaksanakan praktikum. 2. Semua praktikan wajib hadir 10 menit sebelum tes awal dimulai, dan menandatanganidaftar hadir. 3. Semua praktikan wajib menyerahkan berkas Laporan Pendahuluan dan Jurnal Praktikumkepada asisten sebelum praktikum dimulai. Berkas tersebut dapat diminta lagi kepadaasisten setelah mengikuti tes awal. 4. Semua praktikan wajib mengikuti tes awal sebelum percobaan dilakukan sampai asistenyang bertanggungjawab menilai bahwa yang bersangkutan pantas dan mampumelaksanakan modul percobaan yang telah ditentukan. Apabila praktikan tidak mengikutites awal, percobaan dinyatakan GUGUR. Tes awal berlangsung 10-20 menit. 5. Semua praktikan wajib mencatat semua hasil pengamatan dari percobaan yang dilakukandi dalam Jurnal Praktikum. Pada akhir percobaan semua hasil pengamatan harusdiketahui dan ditandatangani oleh asisten. 6. Laporan Praktikum harus diserahkan kepada asisten satu minggu setelah praktikum.Keterlambatan penyerahan akan dikenai sanksi yaitu tidak boleh mengikuti praktikumpada hari penyerahan Laporan Praktikum. 7. Laporan praktikum yang belum memenuhi persyaratan harus diperbaiki, dan diserahkankepada asisten yang bersangkutan paling lambat satu minggu setelah dinyatakan perluperbaikan. 8. Peminjaman alat-alat praktikum harus seijin petugas laboratorium dan dikembalikankepada petugas dalam keadaan yang sama. 9. Sebelum meninggalkan laboratorium, praktikan harus membersihkan meja kerja dan alat-alatpraktikum serta mengatur kembali letak bahan dan alat praktikum. 10. Penggunaan alat-alat dan pemakaian bahan kimia harus hati-hati, tidak boleh sampai adabahan kimia yang tercecer atau tumpah. 11. Kerusakan alat atau bahan yang terbuang yang terjadi karena kesalaha kerja dan ataukelalaian praktikan, wajib diganti oleh praktikan dengan alat/bahan yang sama. 12. Bersikap sopan pada petugas laboratorium dan asisten. 13. Ketidakhadiran praktikan pada waktu yang telah dijadwalkan mendapatkan sanksidinyatakan GUGUR, kecuali ada alasan kuat seperti musibah/kemalangan yang tidakterhindarkan. 14. Ketidakhadiran karena sakit, percobaannya dapat dilakukan di luar jadwal praktikumdengan persetujuan asisten, setelah mendapat ijin dari Dosen Kordinator Praktikum.Dispensasi penjadwalan ulang karena sakit hanya diperbolehkan satu kali selama periodepraktikum. 15. Ketentuan lulus praktikum: − Telah mengikuti tes awal dan menyerahkan Laporan Pendahuluan dan Jurnalsebelum praktikum dimulai. − Telah melaksanakan semua percobaan pada semester yang sama dan dinyatakan lulus oleh asisten. − Menyerahkan laporan praktikum untuk semua percobaan yang telah dilaksanakan dan dinilai oleh asisten. − Lulus ujian akhir praktikum.
3
ASPEK KESELAMATAN
Untuk memperoleh hasil percobaan yang benar maka haruslah diketahui lebih dulu cara-cara pokok dalam penggunaan alat-alat laboratorium. I. Pemanasan Kebanyakan dari proses pemanasan dalam laboratorium dilakukan dengan menggunakan alat pembakar gas, meski demikian untuk beberapa hal dipakai peralatan oven. Pembakaran atau bunsen seperti tergambar di bawah ini pada umumnya memiliki sebuah katup pengatur gas dan pengatur udara. Untuk menyalakan bunsen, dilakukan tahap sebagai berikut : - Katup udara dalam keadaan tertutup dan katup gas terbuka. - Nyalakan dengan korek api, pada tahap ini akan dihasilkan nyala berwarna merah yang tak terlalu panas.
-
Untuk mendapatkan nyala yang baik dan temperatur pembakaran yang lebih tinggi, katup udara dibuka perlahan-lahan hingga didapat nyala biru. Setelah selesai digunakan, matikan bunsen dengan cara menutup katup aliran gas. Jika bunsen digunakan untuk memanaskan zat dalam tabung reaksi/beaker gelas, tata caranya dapat dilihat dalam gambar di bawah ini :
4
Pemanasan dan pendidihan larutan
Pemanasan gelas beker pada standar
dalam sebuah tabung reaksi
dengan bunsen pembakar.
Perhatikan mulut tabung jangan mengarah ke wajah atau kearah orang lain ! II.
Penyaringan Penyaringan bertujuan untuk memisahkan suatu cairan dari bahan padat dengan cara melewatkan cairan pada bahan penyaring, misalnya kertas saring. Tata cara penyaringan adalah sebagai berikut : - Lipat kertas saring seperti gambar di bawah ini :
(a) (b) Cara melipat kertas saring
(c)
(d)
Penyaringan
-
Pasanglah di atas corong, lalu basahi kertas saring tersebut dengan air suling dan hindari adanya rongga udara dibalik kertas saring. Perhatikan posisi tepi kertas saring harus 1/2 sampai 1 sentimeter dari tepi atas corong dan jumlah endapan 2/3 dari ketinggian kertas saring (maksimum). Pasang corong pada penyangga dan taruhlah wadah penampung di bawahnya. 5
-
Tuanglah cairan melalui batang pengaduk dengan hati-hati. Bilaslah beberapa kali dengan air suling hingga benar-benar bersih.
III. Pembacaan skala Pada alat-alat pengukur volume cairan tertera tanda garis-garis melingkar yang menunjukkan batas tinggi cairan pada volume tertentu. Sebagai batas pembacaan adalah bagian permukaan lengkung cairan, kecuali untuk cairan yang berwarna pekat/gelap, dibaca pada bagian atas permukaan lengkung cairan. Untuk lebih jelasnya dapat dilihat pada gambar di bawah ini:
IV.
Pencucian alat Alat-alat yang digunakan dalam laboratorium kimia harus dalam keadaan bersih. Alat yang bersih dapat diketahui bila permukaannya dibasahi maka akan terdapat suatu lapisan cairan yang merata. Adanya lemak atau debu akan menyebabkan lapisan tersebut tidak merata. Pencucian/pembersihan alat dilakukan dengan cara pencucinya dengan ditergen dan bila perlu digosok dengan sikat dan akhimya dibilas dengan air suling. Untuk mencuci alat-alat yang sangat kotor digunakan larutan Kalium dikromat dalam asam sulfat. Cara membuat larutan tersebut dapat ditanyakan pada asisten.
6
SUSUNAN PENULISAN LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA
1. PENULISAN LAPORAN PENDAHULUAN DAN JURNAL
1. PENULISAN LAPORAN PRAKTIKUM A. KULIT LUAR
7
B. ISI
8
MODUL 1 REAKSI-REAKSI PADA HIDROKARBON I.
Tujuan Percobaan
- Menguji kelarutan dan flammability hidrokarbon - Mengetahui sifat-sifat kimia dan reaksi-reaksi pada hidrokarbon II.
Teori
Banyaknya jenis senyawa organik tidak terlepas dari kemampuan atom karbon untuk mengikat satu sama lain dan jumlah unsur-unsur yang mampu membentuk ikatan dengan gugus karbon yang sudah ada. Untuk menyederhanakan masalah ini, maka disepakati bahwa senyawa hidrokarbon adalah senyawa dengan ikatan hidrogen dan karbon saja. Hidrokarbon memiliki jumlah ikatan yang sangat banyak, tetapi dapat dikelompokkan sesuai dengan ciri khas strukturnya. Dimana struktur-struktur ini juga disesuaikan dengan kereaktifan kimia secara umum. Sehingga tiap kelompok dapat dikelompokkan dari struktur maupun kereaktifannya. Pada percobaan ini, praktikan akan mengujicobakan kereaktifan kimia dari hidrokarbon jenuh, tidak jenuh dan aromatik.
Stuktur Hidrokarbon
Hidrokarbon dikatakan jenuh apabila jumlah hidrogen yang terikat pada karbonnya sudah maksimal. Hal ini terjadi bila atom karbon terikat satu sama lain dengan ikatan tunggal atau yang dikenal sebagai ikatan sigma ( ). Etana merupakan contoh hidrokarbon jenuh berdasarkan kriteria ini.
H
H
H
C
C
H
H
H
Gambar 2.1 Struktur hidrokarbon, Etana
Hidrokarbon tak jenuh memiliki jumlah hidrogen yang terikat lebih sedikit daripada jumlah maksimal yang mampu diikatnya. Senyawa jenis dipastikan memiliki ikatan rangkap sehingga jumlah total ikatan kovalen pada tiap atom karbon sebanyak empat. Contoh senyawa jenis ini adalah etilen dan asetilen
9
H
H C
H
C
H
H
C
C
H
Acethylene
Ethylene
Gambar 2.2 Struktur Etilen dan Asetilen
Ikatan karbon rangkap pada etilen terdiri dari sebuah ikatan seperti yang terdapat pada hidrokarbon jenuh dan sebuah ikatan jenis pi ( ). Keduanya bersamasama membentuk ikatan rangkap. Sedangkan acetilen memiliki ikatan rangkap tiga yang terdiri dari satu ikatan dan dua ikatan . Hidrokarbon aromatik memiliki ikatan yang unik antara karbonnya yang susah untuk dideskripsikan. Pada benzene, salah satu jenis hidrokarbon aromatik, semua ikatan karbon-karbonnya (6 ikatan) identik. Dua contoh jenis ikatan benzene, a dan b, memiliki ikatan tunggal dan double yang bervariasi.
(a)
(b)
(c)
Gambar 2.3 Struktur benzena
Akantetapi, keduanya mewakili jenis molekul yang berbeda. Strutur c, yang menggunakan lingkaran dalam heksagon, dapat lebih diterima. Lingkaran ini mewakili enam elektron yang terdistribusi secara merata pada ikatan aromatik di keenam atom karbonnya. Ikatan yang diwakili oleh sisi-sisi hexagonal adalah ikatan . Struktur c dapat digunakan untuk mewakili semua jenis ikatan karbon-karbon dalam benzen secara benar.
Kereaktifan Hidrokarbon
Ikatan pada hidrokarbon jenuh (alkana) sangat stabil sehingga sangat tidak reaktif. Pada temperatur tinggi, hidrokarbon jenuh bereaksi dengan oksigen (pembakaran). Pada reaksi tersebut, ikatan karbon-karbon diputus dan produknya adalah karbondioksida dan air. Jika pembakarannya tidak efisien, maka yang terbentuk adalah karbon monoksida atau bahkan karbon tunggal (soot). Tetapi secara umum hidrokarbon jenuh terbakar dengan lebih efisien daripada jenis hidrokarbon lainnya. Ikatan karbon-hidrogen dari alkana dapat digantikan oleh halogen. Persamaan reaksi yang umum dengan bromin adalah sebagai berikut :
10
heat
R
H
+ Br 2
R
(2.1)
+ HBr
Br
Perhatikan bahwa HBr adalah produk dari reaksi tersebut. Untuk bereaksi dengan halogen diperlukan heat ataupun energi yang ringan. Ikatan pada hidrokarbon tak jenuh (alkena dan alkuna) bersifat reaktif dan mempermudah terjadinya reaksi tambahan. Pada reaksi ini, sebuah molekul seperti bromin membentuk dua ikatan tunggal karbon-bromin yang setara dengan energi ikatan . Etilen bereaksi dengan bromin membentuk 1,2-dibromoetana.
H
H C
+
C
Br 2
Br
H
H
(colorless)
(red-brown)
H
H
C
C
H
H
Br
(2.2)
(colorless)
Reaksi tersebut dapat terjadi pada suhu ruang. Sebagai hasilnya, karakteristik warna merah kecoklatan pada bromin menghilang. Perlu diperhatikan juga bahwa tidak terbentuk HBr seperti pada reaksi substitusi hidrokarbon jenuh pada reaksi ini. Acetilen yang memiliki dua ikatan juga mengalami reaksi lanjutan :
H
C
C
(colorless)
+
H
Br
2Br
(red-brown)
H
H
C
C
Br
Br
Br
(2.3)
(colorless)
Ikatan juga merupakan pusat serangan oleh oxidizing agents. Sebagai contoh, larutan potasium permanganat yang netral bereaksi dengan alkena dan akuna sehingga menghasilkan dialkohol. Secara visual, reaksi ini diikuti dengan hilangnya warna ungu dari potasium permanganat dan terbentuknya warna coklat sebagai wujud dari manganese dioxide. Percobaan untuk menguji reaksi tak jenuh disebut test Baeyer.
3 R HC
CHR
+ 2 KMnO4 + 4 H2O (purple)
3
R
OH
OH
C
C
H
H
R
+ 2MnO2 (s) + 2 KOH (brown)
(2.4)
11
Jaringan dari senyawa aromatik dipertahankan selama reaksi. Bahkan grup yang sudah jenuh yang terikat pada cincin benzene bisa diserang oleh axidizing agents dengan energy yang sangat besar. Produk yang selalu dihasilkan ketika alkyl group tunggal terikat pada cincin benzene adalah asam benzoid.
CH2CH2CH3
CO2H
oxidazing + 2 CO2 + 3 H2O
agent
(2.5)
Benzoic Acid
Atom hidrogen dari benzene bisa disubstitusikan oleh bromin. Akantetapi, diperlukan katalis Fe. Perhatikan bahwa reaksi berikut ini adalah reaksi substitusi dan HBr terbentuk. Br
+ Br2
III.
Fe
+ HBr
(2.6)
Prosedur III.1 Alat Tabung reaksi 10x 75 mm Tabung reaksi 16 x 150 mm Acetylene generator Pipet tetes Kaca arloji Rak tabung reaksi III.2 Bahan Heptana 1-oktana toluene xylena 1-butanol karbon tetraklorida 1% bromin dalam karbon tetraklorida paku payung 1% larutan potasium permanganat sample hidrokarbon yang tidak diketahui kalsium karbida kertas lakmus biru
12
III.3 Prosedur Percobaan Perhatikan bahwa limbah organik harus dibuang ke tempat yang tersedia.
Catatan : 1. 2.
Lakukan semua percobaan di bawah ini. Percobaan A sampai D menggunakan tiga hidrokarbon yakni, heptana, 1-oktana dan toluena. Gunakan tabung reaksi yang bersih dan kering untuk semua reaksi. Struktur ketiga hidrokarbon tersebut adalah : CH3
CH3(CH2)5CH3 Heptane
CH2=CH(CH2)5CH3 1-Octane
Toluene
Gambar 4.1 Struktur hidrokarbon dalam percobaan
3.
Kebanyakan alkana mengandung pengotor alkena. Untuk membersihkannya, alkana dicampur dengan H 2SO4 dengan perbandingan alkana : H2SO4 = 3:1. Terbentuk lapisan, dimana lapisan bawah yang lebih gelap (H2SO4) dipisahkan. Lapisan alkana yang tersisa diperlakukan ulang dengan H 2SO4 hingga tidak terbentuk lagi lapisan yang lebih gelap. Setelah itu, alkana dicuci dengan air. (Hatihati dengan larutan H 2SO4, dikerjakan hanya oleh orang yang sudah berpengalaman)
A. 1.
Kelarutan Hidrokarbon. Kocoklah secara perlahan 0.5 ml heptana dengan 5ml pelarut air dalam tabung reaksi 16x150 mm untuk menguji kelarutannya. Catatlah hasil pengamatan Anda. Ulangi langkah 1dengan sampel 1-Oktana dan toluena, masing-masing dengan takaran yang sama. Ganti pelarut dengan 1-butanol dan ligroin (campuran alkana), ulangi langkah 1 dan 2 di atas dengan takaran yang sama.
2. 3.
B. Flammability Hidrokarbon Hati-hati : hidrokarbon sangat mudah terbakar, dan uapnya sangat ekplosif di udara. Berhati-hatilah dengan apinya. Jangan menambah kuantitas dari hidrokarbon selain daripada yang sudah ditentukan.
1. 2. 3. 4.
Teteskan 3 tetes dari salah satu jenis sampel hidrokarbon pada kaca gelas, dengan menggunakan korek, nyalakanlah hidrokarbon tersebut. Amati type dan warna nyalanya, karbon yang terdapat dalam nyala tersebut dan jumlah residu yang tertinggal. Ulangi langkah di atas untuk kedua sampel hidrokarbon lainnya. Catat hasil pengamatan Anda.
13
C. 1.
2. 3. 4. 5. 6. 7. D. 1. 2. 3.
4. 5. E. 1.
2.
F. 1.
2. 3. 4.
5.
Perilaku Bromin dalam Karbon Tetraklorida. Masukkan 1ml bromin dalam karbon tetraklorida dalam tabung reaksi kecil. Tambahkan 10-20 tetes dari sampel hidrokarbon, perhatikan perubahan warnanya. Bila tidak terjadi perubahan warna setelah tetes ke-20, tambahkan iron tack, dan biarkan selama 5 menit. Bila masih tidak terdapat perubahan warna, panaskan larutan tersebut dalam water bath panas selama 15-20 menit. Untuk mengetes terdapatnya kandungan hidrogen bromid, letakkan kertas lakmus biru lembab di mulut tabung reaksi. Ulangi percobaan dengan kedua sampel hidrokarbon lainnya. Catatlah hasil pengamatan Anda. Reaksi dengan Potassium Permanganat Tempatkan 1ml sampel hidrokarbon dalam tabung reaksi kecil. Tambahkan 3 tetes dari larutan 1% potasium permanganat. Kocok tabung reaksi tersebut, perhatikan semua perubahan yang terjadi. Berapa waktu yang dibutuhkan sebelum perubahan terjadi? Ulangi dengan sampel hidrokarbon lainnya. Catat hasil pengamatan Anda. Pengelompokkan Zat Dapatkan sampel hidrokarbon yang tidak diketahui dari asisten praktikum Anda. Lakukan tes untuk menggelompokkann sampel-sampel tersebut menjadi hidrokarbon saturated, unsaturated dan aromatik. Preparasi dan Sifat-Sifat Kimia dari Acetylene . Perhatikan alat percobaan acetylene yang terdiri dari sebuah botol kering 250 ml dengan dua buah karet stopper, sebuah saluran dropping, tubing kaca dan karet yang sesuai. (Lihat Gambar). Beberapa potongan kalsium karbid (CaC 2) dimasukkan dalam botol kering tersebut. Penambahan air yang berhati-hati dan sedikit demi sedikit akan menghasilkan gas acetylene. Untuk mengeringkan tabung reaksi 16x150mm yang mengandung 10 tetes dari larutan 1% bromin dalam karbon tetraklorida, tambahkan sekitas 3ml karbon tetraklorida. Alirkan acetylene ke larutan tersebut. Perhatikan perubahan yang terjadi. Untuk tabung reaksi 16x150 mm yang mengandung 3 tetes dari larutan 1% potasium permanganat, tambahkan sekitar 3ml air. Alirkan acetylene ke larutan tersebut hingga warna permanganatnya menghilang. Jika reaksinya lamban, kocok dan teruskan dengan aliran acetylene. Ulangi hingga terjadi penghilangan warna. Perhatikan Perubahan yang terjadi. 14
6.
Catatlah hasil pengamatan Anda.
IV.
Potensi Bahaya
No. 1 2 3 4 5
Alat Tabung Reaksi Acetylene Generator Pipet Tetes Kaca Arloji Rak Tabung Reaksi
No. 1
Bahan Heptana
2
1-oktana
3
Toluena
4
Xylena
5
1-butanol
6
Karbon Tetraklorida
7
Bromin
Potensi Bahaya Pecah/meledak Bocor/meledak Pecah Pecah/meledak Patah Potensi Bahaya Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar. Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau memasuki saluran pernapasan. Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak jangka panjang. Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing. Mudah terbakar. Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar. Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau memasuki saluran pernapasan. Mudah terbakar jika terkena panas atau api. Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar. Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau memasuki saluran pernapasan. Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak jangka panjang. Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing. Mudah terbakar. Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar. Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau memasuki saluran pernapasan. Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak jangka panjang. Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing. Mudah terbakar. Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar. Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau memasuki saluran pernapasan. Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak jangka panjang. Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing. Mudah terbakar. Iritasi bila terkena mata dan kulit Bahaya bila tertelan dan terhirup Oksidator yang kuat. Mudah terbakar. Korosif. 15
Dapat menyebabkan iritasi pada mata dan kulit. Dapat menyebabkan iritasi sistem pencernaan bila tertelan. Dapat menyebabkan iritasi sistem pernapasan bila terhirup. Dapat menyebabkan gangguan saraf, jantung, hati, dan ginjal. Paku payung Tertusuk. Potasium permanganat Oksidator yang kuat. Mudah terbakar. Korosif. Dapat menyebabkan iritasi pada mata dan kulit. Dapat menyebabkan iritasi sistem pencernaan bila tertelan. Dapat menyebabkan iritasi sistem pernapasan bila terhirup. Kalsium Karbida Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar. Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau memasuki saluran pernapasan. Dapat menyebabkan kebakaran jika terpapar oksigen atau panas.
8 9
11
V.
Pertanyaan Berikan produk hasil dari reaksi berikut ini : a.
CH3CH2CH3
+
O2
heat
b. CH3 heat KMnO4
CH3
c. CH2CH3
heat KMnO 4
d. H3C
CH3 C
Br 2
C
CCl4
H3C
CH3
e. CH3C
CCH2CH3
Br 2 CCl4
16
f. CH3CH2CH2CH=CH2
KMnO4
g. CH3
Br 2 Fe
CH3
h. CaC2
VI.
+
H2O
Format Laporan dan Pengumpulan A. Kelarutan Hidrokarbon No. Data yang diambil 1 0,5 ml heptana + 5 ml air 2 0,5 ml 1-oktana + 5 ml air 3 0,5 ml toluena + 5 ml air 4 0,5 ml heptana + 5 ml ligroin 5 0,5 ml 1-oktana + 5 ml ligroin 6 0,5 ml toluena + 5 ml ligroin 7 0,5 ml heptana + 5 ml 1-butanol 8 0,5 ml 1-oktana + 5 ml 1-butanol 9 0,5 ml toluena + 5 ml 1-butanol B. No. 1 2 3
Hasil Pengamatan
Flammability Hidrokarbon Data yang diambil Hasil Pengamatan 3 tetes heptana + api 3 tetes 1-oktana + api 3 tetes toluena + api
C. Perilaku Bromin dalam Karbon Tetraklorida No. Data yang diambil
1 2 3
D.
Hasil Pengamatan
1 ml 1% bromin dalam karbon tetraklorida + 10-20 tetes heptana 1 ml 1% bromin dalam karbon tetraklorida + 10-20 tetes 1-oktana 1 ml 1% bromin dalam karbon tetraklorida + 10-20 tetes toluena Reaksi dengan Potassium Permanganat 17
No. 1 2 3 E.
1 2
3 tetes hidrokarbon + api 0,5 ml hidrokarbon + 5 ml 1-butano l 1 ml 1% bromin dalam karbon tetraklorida + 10-20 tetes hidrokarbon 1 ml hidrokarbon + 3 tetes larutan 1% potassium permanganat
F.
No. 1 2
Waktu Reaksi
Pengelompokkan Zat
Data yang diambil
4
Hasil Pengamatan
1 ml heptana + 3 tetes larutan 1% potassium permanganat 1 ml 1-oktana+ 3 tetes larutan 1% potassium permanganat 1 ml toluena + 3 tetes larutan 1% potassium permanganat
No.
3
VII.
Data yang diambil
Hasil Pengamatan
Waktu Reaksi -
Preparasi dan Sifat-sifat Kimia dari Acetylene.
Data yang diambil
Hasil Pengamatan
(10 tetes larutan 1% bromin dalam tetraklorida + 3 ml karbon tetraklorida) + gas acetylene (3 tetes larutan 1% potassium permanganat + 3 ml air) + gas acetylene
Daftar Pustaka Tim Penyusun, 2006. Buku Panduan Praktikum Kimia Organik . Departemen Teknik Gas dan Petrokimia Universitas Indonesia. Depok. Fessenden, Ralph J., and Fassenden, Joans S., 1982, Organic Chemistry, 2nd ed., Williard Grant Press/PWS Publisher, Masachusetts, USA.
18
MODUL 2 ANALISIS POLISAKARIDA ALAMI I.
Tujuan Percobaan
II.
Mengkarakterisasi gula: monosakarida dan polisakarida Menganalisis polisakarida alami Teori Monosakarida Secara umum, ciri-ciri dari monosakarida adalah sebagai berikut:
- Sebuah molekul yang terdiri dari C, H, dan O dengan rasio 1:2:1 [CH 2O)n]. - Sebagian besar monosakarida pada protoplasma adalah berupa 3-karbon gula (triosa), 5-karbon gula (pentosa), atau 6-karbon gula (heksosa) - Gula yang merupakan monosakarida juga dikarakterisasi oleh apapun yang mengandung aldehid (aldosa) atau grup keton (ketosa) Sebagian besar monosakarida dikenal sebagai heksosa, karena terdiri atas 6rantai atau cincin karbon. Atom-atom hidrogen dan oksigen terikat pada rantai atau cincin ini secara terpisah atau sebagai gugus hidroksil (OH). Ada tiga jenis heksosa yang penting dalam ilmu gizi, yaitu glukosid, fruktosa, dan galaktosa. Ketiga macam monosakarida ini mengandung jenis dan jumlah atom yang sama, yaitu 6 atom karbon, 12 atom hidrogen, dan 6 atom oksigen. Perbedaannya hanya terletak pada cara penyusunan atom-atom hidrogen dan oksigen di sekitar atomatom karbon. Perbedaan dalam susunan atom inilah yang menyebabkan perbedaan dalam tingkat kemanisan, daya larut, dan sifat lain ketiga monosakarida tersebut. Monosakarida yang terdapat di alam pada umumnya terdapat dalam bentuk isomer dekstro (D). Struktur kimianya dapat berupa struktur terbuka atau struktur cincin. Jenis heksosa lain yang kurang penting dalam ilmu gizi adalah manosa. Monosakarida yang mempunyai lima atom karbon disebut pentosa, seperti ribosa dan arabinosa. Polisakarida Secara umum, ciri-ciri dari polisakarida adalah sebagai berikut:
- Banyak jenis berbeda dari polisakarida yang diketahui. Dan pati, glikogen, serta selulosa adalah jenis polisakarida yang penting dalam sistem kehidupan. - Ketiga jenis polisakarida tersebut terbuat dari subunit glukosa yang tergabung akibat adanya perpindahan air (kondensasi) untuk membentuk ikatan glikosida. - Ketiga jenis polisakarida tersebut berbedadalam hal struktur dan juga sifatsifat kimianya. Adapun sifat-sifat dari ketiga jenis polisakarida yang penting dalam sistem kehidupan tersebut, dilampirkan pada Tabel 2.1, sebagai berikut:
19
Tabel 2.1 Perbedaan jenis polisakarida
Jenis Dihasilkan oleh Fungsi
Jenis glikosida
Glikogen Pati Sel hewan Sel tumbuhan Polisakarida penyimpan yang mungkin terdeposit pada granula yang cukup besar di dalam sel.
Selulosa Sel tumbuhan Polisakarida struktural yang meliputi sel dinding tumbuhan betaikatan Ikatan alpha-glikosida (glikogen lebih Ikatan bercabang dibandingkan dengan pati) glikosida (tidak mudah terpecah di alam, selulosa bersifat sangat kuat dan merupakan zat yang tahan lama.
Polisakarida merupakan polimer molekul-molekul monosakarida yang berupa rantai lurus dan bercabang. Polisakarida dapat dihidrolisis oleh enzim-enzim tertentu dan diantaranya dihasilkan oligosakarida. Pada bahan makanan ada dua macam polisakarida yaitu polisakarida yang berfungsi sebagai penguat tekstur (struktural) seperti selulosa, hemiselulosa, pektin dan lignin atau yang disebut serat, dan polisakarida sumber energi seperti pati, dekstrin, glikogen dan fruktan (Winarno, 1997). Hidrolisis Pemecahan ikatan glikosida melibatkan penambahan air dinamakan proses hidrolisis. Peristiwa ini dapat dilakukan dengan memanaskan polisakarida dalam air dan/atau asam kuat. Enzim mengkatalisis reaksi hidrolitik yang sama dalam larutan normal tanpa kondisi ekstrim. Kontrol dalam Percobaan Sebuah kontrol positif atau negatif dalam prosedur percobaan dibuat dalam rangka untuk memastikan bahwa hasil percobaan diperoleh bukan karena:
-
Kesalahan sistematik Kesalahan eksperimental
Dalam kontrol positif, sebuah efektor positif meliputi variasi uji, termasuk di dalamnya. Sedangkan pada kontrol negatif, variasi uji tidak termasuk didalamnya dan diharapkan hasil bersifat negatif. III.
Prosedur III.1 Alat Tabung reaksi Rak Tabung Reaksi Tusukan gigi (1 pack ) Pipet pasteur Boiling water bath
20
III.2 Bahan Saliva 1M glukosa 0,5% pati Larutan Benedict 6M HCl 5M NaOH Na2CO3 III.3 Prosedur Percobaan Bagian I 1. Ambil saliva pada beaker yang telah disediakan. 2. Tandai 4 (empat) tabung reaksi, dengan label A, B, C, dan D, 3. Isi keempat tabung reaksi tersebut dengan komposisi masing-masing tabung adalah sebagai berikut: - Tabung A: 15 ml H 2O + 30 tetes saliva - Tabung B: 30 tetes saliva + 15 ml pati - Tabung C: 15 ml H 2O + 30 tetes pati - Tabung D: 15 ml pati + amilase 4. Inkubasi keempat tabung tersebut pada suhu 37 oC dalam jangka waktu 1 jam. 5. Tambahkan 20 tetes larutan Benedict (setelah 1 jam). 6. Panaskan selama 5 menit pada boiling pada boiling water bath. bath . 7. Observasi dan catat perubahan warna yang terjadi. Bagian II 1. Tandai 4(empat) tabung reaksi, dengan label E, F, G, dan H. 2. Isi keempat tabung dengan komposisi masing-masing tabung adalah sebagai berikut: - Tabung E: 15 ml H 2O - Tabung F: 15 ml larutan pati - Tabung G: 1 tusukan gigi yang telah dipecah menjadi bagian-bagian yang cukup kecil + 15 ml H 2O - Tabung H: 15 ml larutan glukosa 3. Panaskan keempat tabung tersebut dalam boiling water bath selama bath selama 15 menit dan kemudian biarkan dingin 4. Tambahkan 20 tetes larutan Benedict pada semua tabung 5. Catat warnanya 6. Panaskan dalam boiling water bath selama bath selama 5 menit 7. Catat warnanya Bagian III 1. Tandai 4 (empat) tabung reaksi, dengan label I, J, K, dan L. 2. Isi keempat tabung reaksi dengan komposisi sebagai berikut: - Tabung I: 15 ml H2O + 10 ml 5N HCl - Tabung J: 15 ml larutan pati + 10 ml 5N HCl(*) - Tabung K: 1 tusukan gigi yang telah dipecah menjadi bagian-bagian kecil + 10 ml 5N HCl - Tabung L: 15 ml larutan glukosa + 10 ml 5N HCl 3. Panaskan dalam boiling water bath selama 15 menit dan kemudian dinginkan 21
4. Tambahkan Na2CO3 secara bertahap, sampai pembentukan gelembung berhenti 5. Tambahkan 20 tetes larutan Benedict 6. Panaskan dalam boiling water bath selama bath selama 5 menit 7. Catat warnanya (* ) PERHATIAN! Praktikan seharusnya selalu menambahkan asam ke dalam air, bukan air ke dalam asam. (**) PERHATIAN! Letakkan mulut tabung cukup jauh dari praktikan (***) PERHATIAN! Jangan tambahkan NaOH terlalu banyak, karena reaksi terjadi sangat cepat. IV.
Potensi Bahaya
No. 1 2 3 4 5
Alat Tabung Reaksi Rak Tabung Reaksi Tusukan Gigi Pipet Pasteur Boiling Water Bath
Potensi Bahaya Pecah/meledak Patah Tertusuk Pecah Meledak/Terpapar tubuh
No. Bahan 1 Saliva 2 Larutan benedict
3
4
5
V.
Potensi Bahaya Dapat menularkan penyakit. Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar. Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau memasuki saluran pernapasan. Asam Klorida (HCl) Sangat korosif dan toksik. Dapat menyebabkan iritasi bila terkontak dengan mata atau terhirup. Natrium Hidroksida Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar. (NaOH) Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau memasuki saluran pernapasan. Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak jangka panjang. Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing. Mudah terbakar. Natrium Karbonat Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar. (Na2CO3) Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau memasuki saluran pernapasan. Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak jangka panjang. Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing. Pertanyaan
1. Untuk masing-masing bagian dalam percobaan, tentukan dan terangkan, manakah yang merupakan tabung kontrol negatif, tabung kontrol positif, dan tabung uji! 2. Apakah kandungan dari larutan Benedict? Reaksi apakah yang terjadi di dalamnya? 22
3. Mengapa tabung reaksi perlu untuk dipanaskan setelah penambahan larutan Benedict? Jelaskan! 4. Mengapa glukosa disebut juga reducing juga reducing sugar / gula pengurang? 5. Untuk bagian I, apa yang dapat anda simpulkan terkait saliva? Apa yang anda harapkan untuk menjadi hasil, jika anda menggunakan tusukan gigi dan juga larutan pati dalam percobaan? 6. Tuliskan reaksi yang merupakan hasil dari pembentukan gelembung ketika Na2CO3 ditambahkan dalam percobaan. Mengapa reaksi ini dibutuhkan? Jelaskan! 7. Gambarkan struktur dari: a. Glukosa b. Ikatan glikosida pada pati dan Selulosa c. Reaksi hidrolisis VI.
Format Laporan dan Pengumpulan Bagian I
Hasil Pengamatan
No.
Data yang diambil
1 2 3 4
Tabung A: 15 ml H 2O + 30 tetes saliva Tabung B: 30 tetes saliva + 15 ml pati Tabung C: 15 ml H 2O + 30 tetes pati Tabung D: 15 ml pati + amilase
Perubahan Warna
Bagian II
No.
Data yang diambil
1 2
Tabung E: 15 ml H 2O Tabung F: 15 ml larutan pati Tabung G: 1 tusukan gigi yang telah dipecah menjadi bagian-bagian yang cukup kecil + 15 ml H 2O Tabung H: 15 ml larutan glukosa
3 4
Perubahan warna Perubahan setelah warna ditambahkan setelah larutan dipanaskan benedict
Bagian III
No.
Data yang diambil
1 2
Tabung I: 15 ml H2O + 10 ml 5N HCl Tabung J: 15 ml larutan pati + 10 ml 5N HCl Tabung K: 1 tusukan gigi yang telah dipecah menjadi bagian-bagian kecil + 10 ml 5N HCl Tabung L: 15 ml larutan glukosa + 10 ml 5N HCl
3 4 VII.
Perubahan Warna
Daftar Pustaka 23
Ozoren, Nesrin. Ugur, Sibel. Aslan, Tolga. Seker, Tungcay. Atay, Cigdem.,2008. Cell Biology Lab Manual . Departement of Molecular Biology and Genetics: Bogazici University, Istanbul. Winarno, F.G., 1997. Kimia Pangan dan Gizi. Cet. ke-8. P. T. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.
24
MODUL 3 EKSTRAKSI MINYAK DAN IDENTIFIKASI LIPID DAN ASAM LEMAK I.
Tujuan Percobaan
-
Melakukan ekstraksi lipid dan melakukan analisa kelarutan dan kejenuhan lemak Menentukan jumlah asam lemak bebas yang terkandung dalam minyak goreng
II.
Pendahuluan Trigliserida, salah satu jenis lipida, adalah ester dari gliserol alkohol dan asam karboksilat rantai panjang. O
H2C
O
C
R
O
HC
O
C
R'
O
H2C
O
C
R''
Trigliserida mengandung asam dengan 8 sampai 12 karbon atom dan terdiri dari campuran beberapa jenis asam yang berbeda. Jika sebagian besar asam tersebut tidak jenuh, maka gliserida tersebut berupa cairan dan diklasifikasikan sebagai minyak. Gliserida yang mengandung asam jenuh yang lebih banyak memiliki titik leleh yang lebih tinggi dan diklasifikasikan sebagai lemak. Hidrolisis lemak atau minyak dengan basa untuk menghasilkan gliserol dan garam dari asamnya dikenal sebagai proses saponifikasi. Sabun adalah garam-garam dari asam karboksilat berantai panjang. Garam sodium dan potasium larut dalam air, sedangkan garam dari magnesium, kalsium, dan besi tidak terlarut dalam air.
O
H2C
O
C
R CH2OH
O
HC
O
C
R'
O
H2C
O
C
+
3 NaOH
CHOH
CH2OH
RCO2 Na +
R'CO2 Na R''CO2 Na
R''
Deterjen adalah garam dari aryl sulfonates atau alkyl sulfates.
25
Ar
-
+
SO3 Na
Sodium aryl sulfonate
R
-
+
OSO3 Na
Sodium alkyl sulfate
Karena garam kalsium dari aryl sulfonate dan alyl sulfate terlarut dalam air, deterjen bisa digunakan dalam air keras, sedangkan sabun akan membentuk presipitant tidak terlarut. Setiap tahunnya, orang Amerika menggunakan jutaan kilogram deterjen untuk mencuci pakaian dan perlatan lainnya. Hampir setiap gram dari deterjen tersebut mengalir ke danau maupun sungai. Kebanyakan produk laundry mengandung phospate yang apabila sudah berada dalam perairan, akan menyuburkan pertumbuhan algae. Phosphate bertindak sebagai pupuk bagi alga dalam bentuk seperti ketika phosphate menyuburkan tanaman atau rumput di kebun. Alga mengonsumsi oksigen yang terlarut dalam air dalam jumlah banyak. Konsentrasi dari oksigen terlarut yang berkurang menyulitkan ikan-ikan atau hewan air lain, sehingga menganggu keseimbangan ekosistem. Pada percobaan ini, deterjen komersial diujicobakan untuk mengetahui keberadaan kandungan phosphate di dalamnya. Dasar dari percobaan ini adalah reaksi kimia antara anion phosphate anion molybdate dalam larutan asam. 12Mo7O246- + 7 PO43- + 72 H+ 7 PMo12O403- + 36 H2O
(3.1)
Larutan ammonium molybdate, (NH 4)6Mo7O24, ditambahkan pada sampel terdahulu yang bersifat asam. Jika sampel tersebut mengandung anion phospate, presipitat ammonium phosphomolybdate (NH 4)3PMo12O40 yang terpisah dengan baik dan berwarna kuning terang akan terbentuk. Pada percobaan ini, praktikan diminta untuk membawa sendiri sedikit sampel dari deterjen cair ataupun bubuk. Pastikan sudah mengecek labelnya untuk menentukan bahwa apakah produk tersebut mengandung phospate. Ujicoba dilakukan tukaran dengan praktikan yang lain untuk mengetahui kandungan phospate. III.
Prosedur III.1 Alat Tabung reaksi 16x150 mm Tabung reaksi 10x75 mm Peraltan refluks Pipet tetes Glass stirring rod Gelas Beaker III.2 Bahan Minyak biji kapas Heksana Karbon tetraklorida Larutan 5% bromin dalam karbon tetraklorida 26
etanol 95% Larutan NaOH Larutan HCl konsentrasi tinggi Kalsium klorida 0.1M Magnesium klorida 0.1M Besi (III) klorida 0.1M Larutan ammonium molybdate 0.2 M Asam nitrat 6M Kertas lakmus atau kertas penguji pH Minyak mineral.
III.3 Prosedur Percobaan Ekstraksi Minyak Menentukan Kelarutan Minyak 1. Masukkan masing-masing 0.5ml (sekitar 10 tetes) minyak biji kapas ke empat buah tabung reaksi 16x150 mm. 2. Tambahkan 1ml air ke tabung pertama, 1ml etanol ke tabung kedua, 1ml heksana ke tabung ketiga dan 1ml karbon tetraklorida ke tabung keempat. 3. Kocoklah tabung-tabung reaksi tersebut, catatlah kelarutan dari masingmasing larutan dalam tabung reaksi. 4. Tambahkan maing-masing 5 ml pelarut tambahan 5. Kocoklah dengan kencang masing-masing tabung, amatilah apakah minyaknya terlarut sekarang. 6. Catatlah hasil pengamatan Anda. Identifikasi Lipid Menentukan Ketakjenuhan Trigliserida 1. Gunakanlah 2ml dari larutan antara karbon tetraklorida dan minyak biji kapas yang dipraktekkan dalam percobaan A untuk percobaan ini. 2. Tambahkan tetes demi tetes larutan bromin 5% dalam karbon tetraklorida. 3. Hitunglah jumlah tetesan yang diperlukan untuk menghasilkan efek warna bromin terhadap larutan tersebut. 4. Larutkan 0.1 g crisco ke dalam 1ml karbon tetraklorida. 5. Ulangi langkah 2 dan 3. 6. Catatlah hasil pengamatan Anda. Identifikasi Asam Lemak Menentukan Jumlah Asam Lemak 1. Buat larutan KOH dalam etanol 0.1 N dalam labu 100 mL. Titrasi dengan larutan HCl 0,1 N. 2. Buat campuran benzena dan etanol dengan perbandingan 1:1 dalam erlenmeyer, kemudian masukan erlenmeyer ini ke dalam air panas sambil digoyang-goyang, sampai campuran menjadi homogen. 3. Titrasi larutan (benzena + etanol) dengan KOH 0,1 N hingga larutan berubah warna dari bening jadi ungu. 4. Sementara itu, timbanglah 1 g minyak goreng dalam erlenmeyer. 5. Campurkan larutan hasil titrasi dengan minyak goreng, kemudian teruskan titrasi sampai terbentuk warna merah. 27
6.
Catat volume titran yang ditambahkan.
Maka dapat dihitung nilai asam (acid value) dari minyak goreng dengan:
NILAI ASAM
BM KOH (56.11) * T * N
W
(3.2)
dengan:
T = volume titran KOH yang ditambahkan pada titrasi CPO N = normalitas KOH W = berat sampel CPO yang dititrasi
IV.
Potensi Bahaya
No. 1 2 3 4 5
Alat Tabung Reaksi Peralatan refluks Pipet Tetes Glass stirring rod Gelas Beaker
No. Bahan 1 Minyak biji kapas 2 Heksana
3
Karbon tertraklorida
4
NaOH
5
HCl
6
Kalsium klorida
Potensi Bahaya Pecah/meledak Pecah/meledak Pecah Pecah Pecah Potensi Bahaya Dapat tertelan. Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar. Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau memasuki saluran pernapasan. Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak jangka panjang. Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing. Mudah terbakar. Iritasi bila terkena mata dan kulit Bahaya bila tertelan dan terhirup Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar. Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau memasuki saluran pernapasan. Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak jangka panjang. Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing. Mudah terbakar. Sangat korosif dan toksik. Dapat menyebabkan iritasi bila terkontak dengan mata atau terhirup. Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pernapasan bila terhirup. Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pencernaan ringan bila tertelan. 28
7
8
9
10
11
V.
VI.
Dapat menyebabkan iritasi kulit ringan. Dapat menyebabkan abrasi mekanis atau luka bakar pada mata dari panas iritasi hidrolisis dan klorida. Magnesium klorida Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pernapasan bila terhirup. Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pencernaan ringan bila tertelan. Dapat menyebabkan iritasi kulit ringan. Dapat menyebabkan iritasi pada mata. Besi (III) klorida Dapat menimbulkan kebakaran jika terkena bahan-bahan yang mudah terbakar. Dapat mengakibatkan luka bakar. Dapat menyebabkan efek merugikan jangka panjang dalam lingkungan air. Sangat beracun untuk organisme air. Larutan amonium Oksidator kuat. molybdate Dapat menyebabkan mata dan kulit terbakar. Dapat menimbulkan kebakaran jika terkena bahan-bahan yang mudah terbakar. Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pernapasan bila terhirup. Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pencernaan ringan bila tertelan. Asam nitrat Bersifat korosif. Dapat menyebabkan mata dan kulit terbakar. Dapat menimbulkan kebakaran jika terkena bahan-bahan yang mudah terbakar. Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pernapasan bila terhirup. Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pencernaan ringan bila tertelan. Minyak mineral Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pernapasan bila terhirup. Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pencernaan ringan bila tertelan. Pertanyaan 1. Dari semua pelarut yang dicobakan, manakah pelarut paling bagus untuk menghilangkan noda minyak atau lemak dari pakaian ? 2. Berapa gramkah bromin yang diperlukan untuk bereaksi secara sempurna dengan 1mol trigliserida yang mengandung hanya asam oleic? Format Laporan dan Pengumpulan
Ekstraksi Minyak No. Data yang diambil 1 0,5 ml minyak biji kapas + air 2 0,5 ml minyak biji kapas + etanol 3 0,5 ml minyak biji kapas + heksana
Kelarutan
29
4
0,5 ml minyak biji kapas + karbon tetraklorida
Identifikasi Lipid
No.
1
2
Data yang diambil
Hasil Pengamatan
Jumlah Tetesan 5% bromin dalam karbon tetraklorida
2 ml larutan karbon tetraklorida + karbon tetraklorida (hasil dari percobaan A) + 5% bromin dalam karbon tetraklorida 0,1 g crisco dalam 1 ml karbon tetraklorida + 5% bromin dalam karbon tetraklorida
Identifikasi Asam Lemak
No.
Data yang diambil
1 2 3
Larutan KOH dalam etanol 0,1 N Campuran benzena dan etanol Campuran larutan 1 dan 2 + 1 g minyak goreng
Volume titran
VII. Daftar Pustaka Modul Praktikum Kimia Organik Departemen Gas dan Petrokimia Universitas Indonesia 2006. Fessenden, Ralph J., and Fassenden, J oans S., 1982, Organic Chemistry, 2nd ed., Williard Grant Press/PWS Publisher, Masachusetts, USA.
30
MODUL 4 EKSTRAKSI DNA DARI KACANG HIJAU I.
II.
Tujuan Percobaan
Mengisolasi DNA (Deoxyribo Nucleic Acid) dari kacang hijau (bovine spleen) Teori DNA (Deoxyribo Nuceic Acid) DNA adalah akronim dari Deoxyribo Nucleic Acid yang bila diterjemahkan kedalam bahasa Indonesia berarti Asam Deoksiribo Nukleat. DNA merupakan senyawa kimia yang terdapat di dalam inti sel yang sangat berperan pada proses sintesis protein untuk pembentukan enzim, dan protein lain.
Pada tahun 1953, Francis H.C Crick dan James D. Watson, berdasarkan analisis foto difraksi sinar X, menggambarkan struktur DNA sebagai tangga tali terpilin dan disebut “ Double Helix” (heliks ganda). Ibu tangganya terdiri atas rentetan rantai gugus gula deoksiribosa dan gugus fosfat, sedangkan anak tangganya terdiri atas basa nitrogen, yaitu Purin terdiri atas Adenin(A) dan Guanin (G); serta Pirimidin terdiri atas Sitosin (S) dan Timin (T). Basa-basa nitrogen yang menyusun anak tangga tersebut dihubungkan oleh ikatan hidrogen yang sifat ikatannya lemah. Setiap anak tangga terdiri atas pasangan basa nitrogen yang khas, yaitu Adenin (A) dengan Timin (T), Sitosin (S) dengan Guanin (G). Atas penemuan mereka mengenai struktur model DNA tersebut, pada 1962, Crick dan Watson menerima hadiah Nobel. Crick dan Watson menyimpulkan bahwa tatanan nukleotida merupakan perangkat kode instruksi pembangunan seluruh organisme. Fungsi DNA
DNA berfungsi menyampaikan informasi genetika dari induk ke generasi berikutnya dan mengatur perkembangan metabolisme tubuh. Dengan demikian, dapat dikatakan bahwa DNA adalah gen itu sendiri. DNA dapat juga mengawasi aktivitasaktivitas sel dengan memerintahkan pembentukan semua macam protein (enzim) di dalam sel. DNA berada di dalam inti sel dan pada umumnya pembentukan protein terjadi pada ribosom, yaitu pada sitoplasma. Sehingga, informasi yang ada pada DNA harus diterjemahkan dahulu oleh suatu senyawa tertentu dan dibawa oleh senyawa tersebut dariinti ke sitoplasma. DNA akan membentuk senyawa lain dalam menyampaikan informasi genetik yang akan memerintahkan sintesis protein. Senyawasenyawa yang dibentuk oleh DNA, yaitu RNA duta, RNA transfer, dan RNA ribosom. Ektraksi DNA Ekstraksi DNA adalah sebuah prosedur rutin yang dilakukan untuk mendapatkan dan mengumpulkan DNA untuk molekuler subsekuen atau analisis forensik.
31
DNA diekstraksi dari sel-sel yang ada pada manusia untuk berbagai alasan. Dengan sampel murni berupa DNA, anda dapa menguji bayi yang baru lahir untuk penyakit genetik, menganalisis pembuktian forensik, atau mempelajari gen yang terlibat dala kanker.Secara garis besar, tahapan untuk ekstraksi DNA adalah sebagai berikut: 1. Buka sel dengan cara dipecah/ cacah untuk menampakkan DNA 2. Hilangkan lemak membran dengan penambahan deterjen 3. Presipitasi DNA dengan alkohol. Adapun jenis alkohol yang digunakan adalah etanol atau isopropanol (70-95%). Karena DNA tidak terlarut pada alkohol jenis tersebut, DNA akan teragregasi secara bersama-sama, denga pemberian pellet saat proses sentrifugasi. Tahapan ini juga berguna untuk menghilangkan garam yang larut dalam alkohol (alcohol-soluble salt ).
III.
Prosedur III.1 Alat Blender Saringan Tabung reaksi Rak tabung reaksi Batang lidi/ kayu Gelas beaker Wadah UV Spektroskopi III.2 Bahan Kacang hijau Garam/ NaCl Air dingin Deterjen cair Enzim (Dapat berupa pelunak daging (meat tenderizer ), jus nanas, atau larutan pembersih lensa kontak) Alkohol 70-95% (Etanol atau Isopropanol) DNA Standar III.3 Prosedur Percobaan Secara garis besar, tahapan untuk ekstraksi DNA adalah seba gai berikut: 1. Buka sel dengan cara dipecah/ cacah untuk menampakkan DNA 2. Hilangkan lemak membran dengan penambahan deterjen 3. Presipitasi DNA dengan alkohol. Adapun jenis alkohol yang digunakan adalah etanol atau isopropanol (70-95%). Karena DNA tidak terlarut pada alkohol jenis tersebut, DNA akan teragregasi secara bersama-sama, denga pemberian pellet saat proses sentrifugasi. Tahapan ini juga berguna untuk menghilangkan garam yang larut dalam alkohol (alcohol-soluble salt ). Adapun proses detail untuk percoban ini adalah sebagai berikut: 1. Siapkan alat dan bahan yang telah ditentukan sebelumnya 2. Masukkan ½ cup kacang hijau (100 ml) dalam blender 32
3. Masukkan sejumput garam (kurang dari 1/8 sendok teh, kurang dari 1 ml) dalam blender 4. Masukkan air dingin sebanyak 2 (dua) kali lebih banyak dari jumlah kacang hijau yang sebelumnya sudah dimasukkan dalam blender (kira-kira 1 cup, 200 ml) 5. Blender kesemuanya dengan kecepatan tinggi selama 15 detik
Gambar 4.1 Ilustrasi proses blending (Sumber:http://learn.genetics.utah.edu, 2008 )
6. Blender memisahkan sel dari kacang hijau dari beberapa komponen di dalamnya, sehingga setelah selesai di-blender , praktikan akan mendapatkan sel kacang hijau dalam bentuk menyerupai soup. 7. Tuangkan soup sel kacang hijau hasil blender tersebut melalui saringan ke dalam wadah yang lain, seperti gambar berikut ini.
Gambar 4.2Ilustrasi proses penyaringan (Sumber:http://learn.genetics.utah.edu, 2008 )
8. Tambahkan sekitar 2 (dua) sendok makan deterjen cair (kira-kira) 30 ml ke dalam soup sel kacang hijau hasil saringan. 9. Aduk sehingga membentuk sebuah campuran 10. Biarkan campuran tersebut selama 5-10 menit 11. Tuang campuran ke dalam tabung reaksi, masing-masing sekitar 1/3 volume maksimal tabung reaksi 12. Tambahkan sedikit enzim (enzim yang digunakan dapat berasal dari pelunak daging (meat tenderizer ), jus nanas, atau larutan pembersih lensa kontak) pada masing-masing tabung reaksi 13. Aduk perlahan (Hati-hati! Jika anda mengaduk terlalu kencang/ keras, secara otomatis anda akan merusak DNA dalam campuran tersebut) 14. Miringkan tabung reaksi tersebut dan secara perlahan-lahan tuangkan alkohol ke dalam tabung reaksi, seperti gambar berikut ini.
33
Gambar 4.3Ilustrasi proses penambahan alkohol (Sumber:http://learn.genetics.utah.edu, 2008 )
15. Tuangkan alkohol (70-95%) kesamping, sehingga membentuk lapisan di atas campuran kacang hijau 16. Tuang hingga didapati jumlah lapisan alkohol yang sama dalam tabung dengan campuran kacang hijau 17. Kemudian amati bahwa DNA akan naik ke lapisan alkohol dari lapisan campuran kacang hijau 18. Gunakan lidi/ batang kayu tipis untuk mendapatkan DNA yang naik ke lapisan alkohol, seperti gambar di bawah ini
Gambar 4.4 Ilustrasi proses pengambilan ekstrak DNA (Sumber:http://learn.genetics.utah.edu, 2008 )
19. Jika anda ingin menyimpan dan meneliti DNA tersebut, anda dapat memindahkannya ke dalam wadah berukuran kecil yang berisi alkohol. 20. Analisis DNA menggunakan kurva standar dari DNA standar. IV.
Potensi Bahaya
No. 1 2 3 4
Alat Blender Tabung reaksi Rak tabung reaksi Batang lidi/kayu
Potensi Bahaya Meledak/terbakar Meledak/pecah Patah Tertusuk 34
5 6
Gelas Beaker UV Spektroskopi
No. 1 2
Bahan Kacang hijau Garam/NaCl
3
4
Pecah Meledak/terbakar
Potensi Bahaya Dapat tertelan/tersedak. Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pernapasan bila terhirup. Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pencernaan ringan bila tertelan. Dapat menyebabkan iritasi kulit ringan. Dapat menyebabkan iritasi bila terkena mata. Deterjen cair Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar. Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau memasuki saluran pernapasan. Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak jangka panjang. Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing. Alkohol Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar. Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau memasuki saluran pernapasan. Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak jangka panjang. Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing. Mudah terbakar.
V.
Pertanyaan 1. Mengapa kacang hijau digunakan dalam percobaan ini? Apakah kacang hijau merupakan sumber DNA terbaik? Jelaskan alasan anda! 2. Apakah fungsi dan tujuan penambahan garam dan deterjen pada percobaan ini? 3. Mengapa air dingin lebih baik dibandingkan dengan air hangat dalam mengekstraksi DNA? Jelaskan! 4. Bagaimanakah sel dinding dari sel tumbuhan dapat dicacah/ pecah? 5. Jenis enzim apakah yang ditemukan di dalam pelunak daging/ jus nanas/ larutan pembersih lensa kontak? 6. Apakah yang dapat anda lakukan untuk meningkatkan hasil DNA dalam percobaan ini? 7. Mengapa DNA menggumpal secara bersama-sama? Jelaskan! 8. Bagaimana anda dapat mengkonfirmasi bahwa gumpalan putih berserabut yang menempel pada lidi/ batang kayu tersebut adalah DNA? 9. Apakah mungkin bahwa gumpalan putih berserabut tersebut adalah campuran DNA dan RNA? 10. Berapa lama daya tahan DNA? Akankah kuantitas DNA menurun dan menghilang? Jelaskan! 11. Dapatkah anda mengekstrak DNA manusia menggunakan prosedur percobaan ini? 12. Dapatkah anda menggunakan mikroskop untuk melihat DNA yang anda ekstrak dalam percobaan ini?
VI.
Format Laporan dan Pengumpulan 35
No. 1 2
Data yang diambil DNA Standar DNA kacang hijau
VII.
Daftar Pustaka
Absorbansi
Genetic Science Learning Center Team, 2008. How to Extract DNA from Anything Living (http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/howto/DNA_Extraction.pdf). Genetic Science Learning Center, Utah. K. Murray, Robert, dkk. 2003. Biokimia Harper . Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta. Ozoren, Nesrin. Ugur, Sibel. Aslan, Tolga. Seker, Tungcay. Atay, Cigdem.,2008. Cell Biology Lab Manual . Departement of Molecular Biology and Genetics: Bogazici University, Istanbul.
36
MODUL 5 EKSTRAKSI DAN KUANTIFIKASI PROTEIN DARI SUMBER MAKANAN I.
Tujuan: Menentukan konsentrasi protein dari suatu sample yang tidak diketahui
II.
Teori Protein adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang
merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen dan kadang sulfur serta fosfor. Protein merupakan salah satu bio-makromolekul yang penting perananya dalam makhluk hidup. Setiap sel dalam tubuh kita mengandung protein, termasuk kulit, tulang, otot, kuku, rambut, air liur, darah, hormon, dan enzim. Fungsi dari protein itu sendiri secara garis besar dapat dibagi ke dalam dua kelompok besar, yaitu sebagai bahan struktural dan sebagai mesin yang bekerja pada tingkat molekular. Beberapa protein struktural, fibrous protein, berfungsi sebagai pelindung, sebagai contoh a dan b-keratin yang terdapat pada kulit, rambut, dan kuku. Sedangkan protein struktural lain ada juga yang berfungsi sebagai perekat, seperti kolagen. Protein dapat memerankan fungsi sebagai bahan struktural karena seperti halnya polimer lain, protein memiliki rantai yang panjang dan juga dapat mengalami cross-linking dan lainlain. Selain itu protein juga dapat berperan sebagai biokatalis untuk reaksi-reaksi kimia dalam sistem makhluk hidup. Makromolekul ini mengendalikan jalur dan waktu metabolisme yang kompleks untuk menjaga kelangsungan hidup suatu organisma. Suatu sistem metabolisme akan terganggu apabila biokatalis yang berperan di dalamnya mengalami kerusakan.
1. Tahap utama sintesis protein
Tahap 1 : Aktivasi asam amino Tahap ini terjadi di sitosol, bukan pada ribosom. Masing- masing dari 20 asam amino diikat secara kovalen dengan suatu RNA pemindah spesifik dengan memanfaatkan energi ATP. Reaksi ini dikatalisis oleh enzim pengaktif yang memerlukan Mg2+ sebagai kofaktor yang masing- masing spesifik bagi satu asam amino dan bagi tRNA-nya.
37
Tahap 2 : Inisiasi Rantai Polipeptida RNA pembawa pesan yang membawa sandi bagi polipeptida yang akan dibentuk diikat oleh subunit ribosom yang berukuran lebih kecil, diikuti oleh inisiasi asam amino yang diikat oleh tRNA-nya membentuk suatu kompleks inisiasi. tRNA asam amino penginisiasi ini berpasangan dengan triplet nukleutida spesfik atau kodon pada mRNA yang menyandi permulaan rantai polipeptida. Dalam proses ini memerlukan guanosin trifosfat (GTP), dilangsungkan oleh tiga protein sitosol spesifik yang dinamakan faktor inisiasi. Tahap 3 : Pemanjangan Rantai polipeptida diperpanjang oleh pengikatan kovalen unit asam amino berturut-turut, masing-masing diangkut menuju ribosom dan diletakkan ke tempatnya secara benar oleh tRNA masing-masing, yang berpasangan dengan kodonnya pada molekul RNA pembawa pesan. Pemanjangan digiatkan oleh protein sitosol yang dinamakan faktor pemanjangan. Energi yang diperlukan untuk mengikat setiap aminoasil t-RNA yang datang dan untuk pergerakan ribosom disepanjang RNA pembawa pesan satu kodon diperoleh dari hidrolisis dua molekul GTP bagi setiap residu yang ditambahkan ke polipeptida yang sedang tumbuh. Terdapat 3 faktor penunjang yaitu Tu, Ts, dan G. Tahap 4 : Terminasi dan pembebasan Terminasi polipeptida didisyaratkan oleh satu diantara tiga triplet terminasi (UAA, UAG, dan UGA) dimana triplet tersebut tidak menyandi asam amino manapun. Sekali ribosom
mencapai kodon terminasi, ada tiga faktor pengakhir
(terminasi) atau faktor pembebas, yaitu protein R 1, R 2, dan S, yang kemudian turut menyebabkan (1) penguraian hidrolitik polipeptida dari ujung tRNA terakhir dan melepaskannya dalam bebtuk bebas, (2) pelepasan tRNA terakhir yang sekarang kosong dari tempat P, dan (3) dissosiasi ribosom 70S menjadi subunit 30S dan 50S nya siap untuk memulai rantai polipeptida yang baru. Tahap 5 : pelipatan dan pengolahan Untuk memperoleh bentuk aktifnya secara biologis, polipeptida harus mengalami pelipatan menjadi konfirmasi tiga dimensi yang benar. Sebelum dan sesudah pelipatan, polipeptida baru dapat mengalami pengolahan oleh kerja enzimatik untuk melepaskan asam amino penginisiasi, dan mengikat gugus fosfat, metil, karboksil atau gugus lain pada residu asam amino tertentu, atau untuk mengikat gugus
38
oligosakarida atau gugus prostetik. Perubahan yang terjadi tersebut dinamakan modifikasi pasca translasi, dimana pengolahannya bergantung pada proteinnya.
2. Struktur protein
Suatu asam amino-α terdiri atas: 1. Atom C α. Disebut α karena bersebelahan dengan gugus karboksil (asam). 2. Atom H yang terikat pada atom C α. 3. Gugus karboksil yang terikat pada atom C α. 4. Gugus amino yang terikat pada atom C α. 5. Gugus R yang juga terikat pada atom C α.
Ada 4 tingkat struktur protein yaitu struktur primer, struktur sekunder, struktur tersier dan struktur kuartener. a. Struktur primer Struktur primer adalah urutan asam-asam amino yang membentuk rantai polipeptida. Struktur primer protein bisa ditentukan dengan beberapa metode: (1) hidrolisis protein dengan asam kuat (misalnya, 6N HCl) dan kemudian komposisi asam amino ditentukan dengan instrumen amino acid analyzer , (2) analisis sekuens dari ujung-N dengan menggunakan degradasi Edman, (3) kombinasi dari digesti dengan tripsin dan spektrometri massa, dan (4) penentuan massa molekular dengan spektrometri massa. b. Struktur sekunder Struktur sekunder protein bersifat reguler, pola lipatan berulang dari rangka protein. Pada struktur sekunder, protein sudah mengalami interaksi intermolekul, melalui rantai samping asam amino. Analisa defraksi sinar-X merupakan cara yang baik untuk mempelajari struktur sekunder protein serabut. Kekuatan yang menstabilkan struktur protein
Beberapa interaksi nonkovalen yang secara individual lemah, namun secara numerik cukup kuat menstabilkan
39
konformasi protein. Kekuatan ini mencakup iktan hidrogen, interaksi hidrofobik, interaksi elektrostatik dan kekuatan van der Walls. 1. Ikatan hidrogen Residu dengan gugus polar R umumnya terdapat pada permukaan protein globuler, dimana residu tersebut membentuk ikatan hidrogen terutama dengan molekul air. Di bagian lain, residu aminoasil pada tulang punggung membentuk ikatan hidrogen antara satu dgn yang lain. 2. Interaksi hidrofobik Interaksi ini meliputi gugus nonpolar R pada residu aminoasil yang dalam protein globular thipikal berada dalam bagian interior protein. Pembentukan interaksi ini digerakkan secara entropis. Keseluruhan bentuk yang sferis kasar mengurangi daerah permukaan. Konsentrasi residu nonpolar dalam bagian interor protein menirinkan jumlah residu permukaan dan memaksimalkan peluang bagi lapisan tipis molekul air permukaaan untuk membentuk ikatan hidrogen antara satu dengan yang lainnya yaitu suatu proses yang berkaitan dengan peningkatan entropi. Berkebalikan, lingkungan nonpolar membran biologik lebih memberikan peluang bagi residu permukaaan yang hidrofobik yang gugus nonpolar R nya berpartisipasi dalam interaksi hidrofobik dengan rantai samping akil ester asil lemak pada lapisan ganda membran. 3. Interaksi elektrostatik Interaksi elektrostatik atau ikatan garam dibentuk antar gugus yang muatannya berlawanan seperti gugus terminal amino dan karboksil pada peptida dan gugus R bermuatan pada residu polar aminoasil. Gugus polar spesifik yang melakukan fungsi biologis yang esensial dapat terletak dalam celah yang menembus bagian interior protein. Karena residu polar dapat pula berpartisipasi dalam interaksi ionik, maka keberadaan garam seperti KCL dapat menurunkan secara bermakna interaksi ionik antar residu permukaan. 4. Interaksi van der Walls Kekuatan van der Wall bersifat sangat lemah serta bekerja hanya pada jarak yang amat pendek mencakup komponen yang menarik dan yang menolak. Kekuatan yang menarik (attractive force) meliputi interaksi antar sifat bipoler yang terbentuk oleh fluktuasi monomer distribusi elektron pada atom didekatnya. Kekuatan yang menolak (repulsive pulse) turut berperan ketika dua buah atom datang begitu dekat sehingga orbit elektronnya saling tumpang tindih. Jarak 40
dimana kekuatan yang menarik bekerja maksimal dan kekuatan yang menolak minimal disebut jarak kontak van der Walls. Ikatan yang membentuk struktur ini, didominasi oleh ikatan hidrogen antar rantai samping yang membentuk pola tertentu bergantung pada orientasi ikatan hidrogennya. Dua pola terbanyak adalah alpha helix dan beta sheet . b-sheet itu sendiri ada yang paralel dan juga ada yang anti-paralel, bergantung pada orientasi kedua rantai polipeptida yang membentuk struktur sekunder tersebut. Struktur sekunder bisa ditentukan dengan menggunakan spektroskopi circular dichroism (CD) dan Fourier Transform Infra Red (FTIR). Spektrum CD dari puntiran-alfa menunjukkan dua absorbans negatif pada 208 dan 220 nm dan lempeng-beta menunjukkan satu puncak negatif sekitar 210-216 nm. Estimasi dari komposisi struktur sekunder dari protein bisa dikalkulasi dari spektrum CD. Pada spektrum FTIR, pita amida-I dari puntiran-alfa berbeda dibandingkan dengan pita amida-I dari lempeng-beta. Jadi, komposisi struktur sekunder dari protein juga bisa diestimasi dari spektrum inframerah.
c. Struktur tersier Struktur tersier terbentuk karena terjadinya perlipatan (folding) rantai α-helix, konformasi β, maupun gulungan rambang suatu polipeptida, membentuk globular, yang struktur tiga dimensiny lebih rumit daripada protein tersebut. Interaksi intra molekuler seperti ikatan hidrogen, ikatan ion, van der Waals, hidropobik turut menentukan orientasi struktur 3 dimensi dari protein. Beberapa protein telah dapat ditentukan struktur tersiernya, misalnya hemoglobin, mioglobin, lisozim, ribonulease dan kimo tripsinogen. Sebagai contoh, struktur tersier enzim sering padat, berbentuk globuler.
41
Struktur tersier dari protein enzim triosa fosfat isomerase (TPI)
d. Struktur kuartener Beberapa protein tersusun atas lebih dari satu rantai polipeptida. Struktur kuartener menggambarkan subunit-subunit yang berbeda dipak bersama-sama membentuk struktur protein. Beberapa molekul protein dapat berinteraksi secara fisik tanpa ikatan kovalen membentuk oligomer yang stabil (misalnya dimer, trimer, atau kuartomer) dan membentuk struktur kuartener. Kemantapan struktur kuartener suatu protein oligomer disebabkan oleh interaksi dan ikatan nonkovalen yang lemah antara masing-masing sub bagiannya. Kemampuan untuk berhimpun diri daripada beberapa sub bagian ini merupakan ciri struktur kuartener suatu protein oligomer. Sebagian besar protein oligomer mengalami disidiasi pada pH tinggi atau rendah, juga bila ditempatkan dalam larutan urea atau garam berkonsentrasi tinggi. Dalam proses denaturasi ini, protein oligomer mengalami dua proses bertingkat, yaitu : 1. Disosiasirantai polipeptida yang satu dengan yang lainnya 2. Merenggangnya satuan rantai polipeptida Struktur kuartener yang terkenal adalah enzimRubisco dan insulin. Sebagai contoh adalah molekul hemoglobin manusia yang tersusun atas 4 subunit, yang akan berdisosiasi pada proses pengenceran. Masing-masing sub bagian terdiri atas dua rantai polipeptida, α dan β.
42
Struktur hemoglobin yang merupakan struktur kuartener protein
3. Percobaan berdasarkan reaksi warna :
a. Percobaan kadar-N Kapur natron, yaitu campuran NaOH dan Ca(OH) 2 dalam tabung reaksi dengan larutan protein dipanaskan. Keluarlah Amoniak dan Amina.Lakmus merah yang dibasahi menjadi biru. b. Reaksi Xantoprotein Larutan asam nitrat pekat ditambahkan dengan hati-hati ke dalam larutan protein. Setelah dicampur terjadi pengendapan putih yang dapat berubah menjadikuning apabila dipanaskan.. reaksi yang terjadi ialah nitrasi pada inti Benzen yang terdapata pada molekul protein. Jadi, reaksi ini positif untuk protein, fenilalanin dan triptofan. Kulit kita bila kena asam nitrat berwarna kuning, itu juga karena terjadi reaksi xantoprotein ini. c. Reaksi Millon Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat, apabila pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein, akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang berwarna. Protein yang mengandung tirosin akan memberikan reaksi positif.
43
d. Reaksi Biuret Beberapa reaksi uji terhadap protein, tes biuret merupakan salah satu cara untuk mengidentifikasi adanya protein, dalam larutan basa biuret memberikan warna violet dengan CuSO 4 karena akan terbentuk kompleks Cu 2+ dengan gugus CO dan gugus NH dari rantai peptida dalam suasana basa. Pengendapan dengan logam diketahui bahwa protein mempunyai daya untuk menawarkan racun. Salting out, apabila terdapat garam-garam anorganik alam presentase tinggi dalam larutan protein, maka kelarutan
protein
akan
berkurang,
sehingga
mengakibatkan
pengendapan.
Pengendapan dengan alkohol, penambahan pelarut organik seperti aseton atau alkohol akan menurunkan kelarutan protein pada kedudukan dan distribusi dari gugus hidrofil polar dan hidrofob polar di dalam molekul hingga menghasilkan protein yang dipol (Tim Dosen Kimia, 2011). Pengembangan dari metode biuret adalah metode lowry. Metode lowry merupakan teknik uji biokimia untuk mengetahui kadar total protein di dalam suatu larutan. Total konsentrasi protein diperlihatkan melalui proporsi perubahan warna larutan sampel dibandingkan dengan konsentrasi protein, yang dapat dihitung dengan menggunakan teknik colorimetric. Nama Lowry sendiri diambil dari nama seorangbiochemist bernama Oliver H. Lowry yang mengembangkan reagen pada tahun 1940. Dalam metode ini terlibat 2 reaksi. Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk sebagaimana metode biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I). Ion Cu+ kemudian akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteu, kompleks
phosphomolibdat-phosphotungstat
(phosphomolybdotungstate),
menghasilkan heteropolymolybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna biru intensif yang dapat dideteksi secara kolorimetri. Kekuatan warna biru terutama bergantung pada kandungan residu tryptophan dan tyrosine-nya. Keuntungan metode Lowry adalah lebih sensitif (100 kali) daripada metode Biuret sehingga memerlukan sampel protein yang lebih sedikit. Batas deteksinya berkisar pada konsentrasi 0.01 mg/mL. Namun metode Lowry lebih banyak interferensinya akibat kesensitifannya. Beberapa zat yang bisa mengganggu penetapan kadar protein dengan metode Lowry ini, diantaranya buffer, asam nuklet, gula atau karbohidrat, deterjen, gliserol, Tricine, EDTA, Tris, senyawa-senyawa kalium, sulfhidril, disulfida, fenolat, asam urat, guanin, xanthine, magnesium, dan kalsium. Interferensi agen-agen ini dapat 44
diminimalkan dengan menghilangkan interferens tersebut. Sangat dianjurkan untuk menggunakan blanko untuk mengkoreksi absorbansi. Interferensi yang disebabkan oleh deterjen, sukrosa dan EDTA dapat dieliminasi dengan penambahan SDS atau melakukan preparasi sampel dengan pengendapan protein (Lowry et al., 1951). Metode Lowry-Folin hanya dapat mengukur molekul peptida pendek dan tidak dapat mengukur molekul peptida panjang (Alexander dan Griffiths, 1992). Prinsip kerja metode Lowry adalah reduksi Cu2+ (reagen Lowry B) menjadi Cu+ oleh tirosin, triptofan, dan sistein yang terdapat dalam protein. Ion Cu+ bersama dengan fosfotungstat dan fosfomolibdat (reagen Lowry E) membentuk warna biru, sehingga dapat menyerap cahaya (Lowry et al., 1951).
III.
Prosedur III.1 Alat Spektrofotometer Gelas beaker Tabung reaksi Pipet Mikropipet III.2 Bahan Tahu Tempe Susu Na2CO3 N NaOH NaK Tartrate H2O CuSO4.5 H2O Folin-Phenol 2 N III.3 Prosedur Percobaan
1. Siapkan bahan-bahan berikut: A. 2% Na2CO3 dalam 0.1 N NaOH B. 1% NaK Tartrate dalam H 2O C. 0.5% CuSO4.5 H 2O dalam H2O D. 48 mL of A, 1 mL of B, 1 mL C E. Phenol Reagent : 1 bagian Folin-Phenol [2 N] : 1 bagian air BSA Standard - 1 mg/ mL 2. Siapkan sampel (tempe, tahu, susu) dengan 4 konsentrasi berbeda 3. Tambahkan 2 mL larutan D pada setiap tabung 4. Inkubasikan selama 10 menit pada suhu ruang. 5. Tambahkan 0.2 mL larutan phenol reagent pada setiap tabung. 45
6. Vortex (melakukan pencampuran dengan bantuan vibrator) segera setiap tabung tersebut dengan segera. 7. Inkubasikan selama 30 menit pada suhu ruang. 8. Tentukan absorbansi setiap sample menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm. 9. Plot absorbansi vs mg protein sampel untuk mendapatkan kurva kalibrasi standar. 10. Ambil sample dengan konsentrasi yang yang tidak diketahui dari asisten praktikum. 11. Ukur absorbansi sampel tersebut. 12. Tentukan konsentrasinya IV. No. 1 2 3 4
Potensi Bahaya Alat Spektrofotometer Gelas Beaker Tabung reaksi Pipet dan mikropipet
Potensi Bahaya Meledak/terbakar Pecah Meledak/pecah Meledak/pecah
No. Bahan 1 Natrium (Na2CO3)
2
3
5
6
V.
Potensi Bahaya karbonat Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar. Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau memasuki saluran pernapasan. Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak jangka panjang. Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing. Natrium Hidroksida Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar. (NaOH) Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau memasuki saluran pernapasan. Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak jangka panjang. Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing. Mudah terbakar. NaK Tartrate Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar. Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau memasuki saluran pernapasan. Dapat menyebabkan iritasi pada mata dan kulit. CuSO4.5 H2O Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar. Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau memasuki saluran pernapasan. Dapat menyebabkan iritasi pada mata dan kulit. Folin-Phenol Dapat menyebabkan gangguan fatal pada kulit jika terpapar. Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau memasuki saluran pernapasan. Dapat menyebabkan iritasi fatal pada mata dan kulit.
Pertanyaan 1. Jelaskan Prinsip kerja dari metode Lowry dalam menentukan konsentrasi protein 46
2. Jelaskan mengenai keketerbatasan metode Lowry ini VI.
Format Laporan dan Pengumpulan No. Data yang diambil 1 Tempe 2 Tahu 3 Susu Sampel dengan konsentrasi yang 4 diketahui
Absorbansi
tidak
VII. Daftar Pustaka Modul Praktikum Kimia Organik Departemen Gas dan Petrokimia Universitas Indonesia 2006. Budi, Setya. 2008. Struktur dan Fungsi Protein. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret: Surakarta.
47
MODUL 6 PERHITUNGAN MIKROSKOPIS I.
Tujuan Percobaan Untuk menghitung spesimen dengan menggunakan mikroskop
II.
Teori
Bagian-bagian dari mikroskop cahaya Tipe Mikroskop Cahaya Mikroskop cahaya menggunakan cahaya tampak untuk melihat spesimen. Cahaya tersebut akan melewati dua lensa yang akan memperbesar gambar . Sementara itu, lensa yang ketiga berada ditempat untuk melakukan pengamatan yang dekat dengan mata pengamatan untuk mendapatkan gambar sesungguhnya. Batas dari mikroskop ini berhubungan dengan resolusi, iluminasi, dan keterangan. Resolusi dapat ditingkatkan menggunakan lensa imersi, pencahayaan dan keterangan dapat ditingkatkan dengan memodifikasi area gelap, fase terang, dan interferensi terang. Hal-hal yang mempengaruhi kualitas mikroskop adalah sebagai berikut Perbesaran, derajat kebesaran dari gambar dibandingkan dengan ukuran aslinya. Perbesaran dilakukan oleh dua lensa yaitu lensa okular (8 atau 10x) dan lensa objektif (4, 10, 100x). Total dari perbesaran adalah hasil perkalian perbesaran kedua lensa. Resolusi, adalah perhitungan untuk kejelasan gambar Kemampuan untuk lihat mendetail, gambar yang diberikan dari mikroskop dapat melihat objek secara detail. Keterangan, adalah kemampuan untuk melihat kedetailan dari spesimen terhadap latar belakang. Perbesaran maksimum didapatkan dari mikroskop cahaya adalah sebesar 400 kali. Dengan kata lain, ukuran yang dapat dilihat minimal adalah sebesar 0,2 µm. Batas ini adalah hasil dari difraksi oleh objek saat observasi yang disebabkan oleh interferensi cahaya oleh gambar. Perhitungan Mikroskopis Ukuran linear dari spesimen yang diobservasi di mikroskop diekspresikan dalam µm bukan dari total perbesaran. Ukuran aktual dari objek yang dilihat dibawah 48
mikroskop dapat di estimasi berdasarkan fakta bahwa penglihatan mikroskop dan kombinasi lensa memiliki diameter konstan. Alat untuk pengukurannya disebut dengan hemocytometer seperti yang terdapat pada gambar dibawah ini,
Hemocytometer dibawah mikroskop cahaya Alat ini digunakan untuk menghitung jumlah spesimen (sel/bakteri). Metode ini banyak digunakan dalam suatu riset. Aplikasi hemocytometer biasa ditemukan untuk menghitung jumlah sel darah. Dalam percoban akan dilakukan untuk menghitung jumlah spesimen yang digunakan. Contoh perhitungan, Diameter yang digunakan pada x10 lensa objektif = 2 mm Diameter dari media yang digunakan, x40 lensa objektif = 2x10/40 mm = 0,5 mm III.
Prosedur
III.1 Alat Mikroskop cahaya Hemocytometer Slide mikroskop Coverslip Pipet III.2 Bahan Rambut Dedaunan Safranin stain Methylene blue Etanol Isopropanol (to clean objective lenses) III.3 Prosedur Percobaan 49
Perhitungan diameter rambut 1. Menghitung diamter media dengan hemocytometer. Gunakan lensa objektif perbesaran 10x dan 40x. Gunakan hemocytometer berdiameter 0,05 mm. Bandingkan nilai yang didapatkan keduanya. Apakah ada perbedaan? 2. Bersihkan slide gelas kaca mikroskop dengan etanol 3. Ambil sehelai rambut (potong kecil) dan diletakkan pada slide) 4. Berikan air sehingga menutupi rambut 5. Observasi sampel dengan menggunakan lensa objektif 40x. Untuk mengestimasi ketebalan dari sampel, luruskan rambut yang menjadi spesimen. Hitung diameter dari rambut. Observasi sel daun Daun muda digunakan untuk mempelajari struktur sel karena sel ini hanya teridir dari beberapa layer. 1. Ambil sedikit bagian dari daun muda, teteskan air hingga menutupi spesimen 2. Lakukan pengamatan dengan perbesaran 40x 3. Tambahan tetesan dari safranin stain untuk membuat dinding sel lebih terlihat. Tambahkan stain (1 tetes) untuk menutupi jaringan dari sampel yang tertutupi Observasi sel epitel 1. Gesekan pipi dengan menggukanan tusuk gigi 2. Teteskan methylene blue pada slide hingga menutupi sel epitel 3. Lakukan pengamatan dengan perbesaran 40x 4. Gambarkan tipe sel yang didapatkan IV. No. 1 2 3 4
Potensi Bahaya Alat Mikroskop cahaya Hemocytometer Slide mikroskop Pipet
No. 1
Bahan Safranin stain
2
3
Potensi Bahaya Meledak/terbakar Pecah/patah Meledak/terbakar Meledak/pecah
Potensi Bahaya Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar. Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau memasuki saluran pernapasan. Dapat menyebabkan iritasi pada mata, hati, dan ginjal. Mudah terbakar dalam bentuk cair dan uap. Methylene blue Dapat menyebabkan gangguan pada kulit dan mata jika terpapar. Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau memasuki saluran pernapasan. Mudah terbakar. Etanol Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar. Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau memasuki saluran pernapasan. Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak jangka panjang. Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing. Mudah terbakar. 50
5
V.
Isopropanol
Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar. Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau memasuki saluran pernapasan. Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak jangka panjang. Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing. Mudah terbakar.
Pertanyaan 1. Apa perbedaan dari mikroskop dengan area terang dan gelap? Apa tipe mikroskop yang baik digunakan untuk melihat sampel? 2. Apa bagian sel yang dipengaruhi oleh safranin dan methylene blue? 3. Berapa diameter dari daun dan sel epitel?
VI. Format Laporan dan Pengumpulan Perhitungan Diameter Rambut No. Data yang diambil 1 Rambut pada perbesaran lensa objektif 10 x 2 Rambut pada perbesaran lensa objektif 40 x
Diameter
Observasi Sel Daun Gambar atau hasil pengamatan Observasi Sel Epitel Gambar sel epitel yang didapatkan VII.
Daftar Pustaka Ozoren, Nesrin. Ugur, Sibel. Aslan, Tolga. Seker, Tungcay. Atay, Cigdem. Cell Biology Lab Manual . 2008. Departement of Molecular Biology and Genetics: Bogazici University.
51
MODUL 7 KLOROFIL DAN KAROTENOID I.
II.
Tujuan Percobaan
Mengekstraksi klorofil dan karotenoid dari dedaunan Menentukan kandungan klorofil dan karotenoid Teori
Sumber energi yang paling utama dari semua sumber kehidupan di alam ini adalah matahari. Energi yang terdapat dalam sinar matahari yang memasuki biosfer dimanfaatkan oleh sebuah proses yang dinamakan fotosintesis, yang biasanya terjadi pada tumbuh-tumbuhan, alga, dan beberapa jenis bakteri. Fotosintesis dapat juga dikatakan sebagai proses physico-chemical , dimana organisme yang melakukan fotosintesis menggunakan energi cahaya untuk mensintesis senyawa-senyawa organik. Proses fotosintesis tergantung pada sebuah set molekul protein kompleks yang berlokasi di dalam dan sekitar sebuah membran yang sangat terorganisir. Melalui serangkaian reaksi transfer energi, mesin fotosintetik tersebut mengubah energi cahaya menjadi sebuah bentuk stabil yang dapat bertahan selama ratusan juta tahun. Pada tumbuh-tumbuhan, alga, dan beberapa jenis bakteri, proses fotosintesis menghasilkan suatu pelepasan oksigen molekular dan penghilangan karbon dioksida dari atmosfer, yang akan digunakan untuk mensitesa karbohidrat (fotosintesis oksigenik). Sedangkan ada beberapa jenis bakteri yang menggunakan energi cahaya untuk membuat senyawa organik tetapi tidak menghasilkan oksigen (fotosintesis anoksigenik). Fotosintesis menyediakan energi dan mengurangi karbondioksida yang diperlukan untuk kelangsungan semua kehidupan di muka bumi ini, juga oksigen molekular yang sangat diperlukan untuk kehidupan organisme yang mengkonsumsi oksigen, termasuk manusia. Juga bahan-bahan bakar yang dibakar untuk menyediakan energi bagi aktivitas kehidupan manusia dihasilkan oleh organisme-organisme fotosintetik pada zaman dahulu. Meskipun fotosintesis terjadi di dalam sel atau organela yang sesungguhnya hanya berukuran beberapa mikron, tetapi proses ini dapat berdampak pada lapisan atmosfer bumi dan iklim. Pada tumbuhan-tumbuhan proses fotosintesis terjadi didalam kloroplast, dimana organela-organela ditemukan di dalam sel. Kloroplast menyediakan energi dan karbon tereduksi yang diperlukan untuk pertumbuhan tumbuhan dan perkembangannya, sementara itu tumbuhan menyediakan CO 2, air, nitrogen, senyawa organik, dan mineralmineral yang penting yang diperlukan kloroplast untuk biogenesis. Kebanyakan kloroplast berada dalam sel daun yang spesial, dimana biasanya mengandung 50 atau lebih kloroplast tiap sel. Fotosintesis digerakkan terutama oleh cahaya tampak (panjang gelombang dari 400 sampai 700 nm) yang terabsorb oleh molekul pigmen (terutama klorofil a dan b, dan karotenoid).
52
Gambar 2.1 Struktur kimia Klorofil a
Struktur kimia dari molekul klorofil a dapat dilihat pada Gambar 4.1 Pada klorofil b, CH3 pada cincin II digantikan oleh grup CHO. Tumbuhan akan kelihatan hijau dikarenakan klorofil yang dimilikinya. Cahaya yang dikumpulkan oleh 200 – 300 molekul pigmen akan yang diikat oleh protein kompleks berada di dalam membran fotosintetik. Masing-masing klorofil ini memiliki kelebihan pada daya absorpsi terhadap panjang gelombang tertentu seperti ditunjukkan pada Gambar 4.2.
Gambar 2.2. Daya absorpsi klorofil a dan b terhadap energi cahaya
Reaksi fotosintesis secara umum dibagi menjadi dua tahap, yaitu reaksi terang dan reaksi gelap. Pada reaksi terang terjadi reaksi transfer elektron dan proton, sedangkan pada reaksi gelap terjadi reaksi biosintesa karbohidrat dari CO 2. Reaksi terang menghasilkan sintesis ATP dan NADPH untuk membentuk senyawa organik pada reaksi gelap.
53
Pada reaksi terang molekul air (H2O) terurai menjadi molekul oksigen (O 2) dan proton (H+). Dalam reaksi tersebut dihasilkan energi dalam bentuk ATP dan NADP +. Kemudian, H+ yang dihasilkan dalam reaksi penguraian air tersebut ditangkap oleh NADP+ sehingga terbentuk NADPH. Persamaan reaksinya adalah sebagai berikut: 12 H2O + ATP + 24 NADP + 6 O2 + ATP + 24 NADPH
(2.1)
Reaksi terang tersebut terjadi di dalam grana. Sedangkan reaksi gelap yang dikemukakan oleh Blackman terjadi pada stroma. Dalam reaksi gelap, ATP dan NADPH yang terbentuk pada reaksi terang digunakan untuk pembentukan glukosa dari karbon dioksida. Persamaan reaksinya adalah sebagai berikut : 6 CO2 + 18ATP + 12NADPH (CH2O)6 + 6 H2O
(2.2)
Jika kedua reaksi tersebut digabungkan, akan didapat persamaan reaksi umum fotosintesis sebagai berikut : 6 CO2 + 12 H2O + energi cahaya C6H12O6 + 6 H2O + 6 O2
(2.3)
Jadi reaksi gelap hanya berlangsung jika tersedia energi kimia dan proton (H +) yang dihasilkan oleh reaksi terang. Tanpa didahului reaksi terang, reaksi gelap tak akan berlangsung. III.
Prosedur III.1 Alat Sentrifuge Tabung sentrifuge Labu Erlenmeyer Vortexer Kuvet kaca Spektrofotometer Botol aquades Oven pengering III.2 Bahan Daun-daunan dari tumbuhan hijau Aquades Larutan aseton 80% III.3 Prosedur Percobaan
Persiapan Dedaunan
1. 2. 3. 4.
Ambil dedaunan dari pepohonan yang ada disekitar tempat tinggal Anda. Keringkan dedaunan pada aliran udara panas 50 oC (1-2 jam) Tumbuk dengan mortar dedaunan kering tersebut hingga halus Timbang berat sejumlah (sekitar 10 gram) bubuk dedaunan kering. 54
Pencucian Dedaunan
1. Larutkan dalam air suling secukupnya 2. Bagi sampel menjadi beberapa bagian sama rata untuk ditempatkan dalam tabung sentrifuge. 3. Sentrifuge larutan tersebut dengan putaran 3300 g (6200 rpm) selama 10 menit 4. Pisahkan padatan bubuk dedaunan kering dari pelarutnya Ekstraksi Dedaunan
1. Masukkan padatan bubuk dedaunan kering ke dalam tabung erlenmeyer lalu larutkan dengan sejumlah volume larutan aseton 80% (rasio larutan aseton 80% dengan sampel biasanya 1:1 atau 1:2) 2. Aduk secara merata dengan vorteks selama 30 detik (dilakukan tidak terus menerus, tetapi setiap 5 detik) 3. Diamkan hingga 5 menit 4. Bagi sampel menjadi beberapa bagian sama rata untuk ditempatkan dalam tabung sentrifuge. 5. Sentrifuge larutan yang terjadi (3300 g/10 menit) 6. Ambil supernatan dari hasil sentrifuge larutan di atas. Supernatan merupakan larutan bagian atas di dalam tabung sentrifuge setelah sampel melalui proses sentrifuge. Pengukuran Chlorophyl a
1. Masukkan kuvet kaca yang berisi sampel ke dalam spektrofotometer. 2. Masukkan juga kuvet kaca yang berisi larutan aseton 80% sebagai pembanding dalam waktu yang hampir bersamaan dengan masuknya kuvet yang berisi sampel ke dalam spektrofotometer. 3. Ukur absorbansi supernatan tersebut pada panjang gelombang 663 nm 4. Hitung konsentrasi chlorophyll a dalam supernatant dengan rumusan berikut: CChl a = (A663nm) / 0.8204 (4.1)
5. Hitung jumlah khloropil a dalam padatan dengan rumusan berikut: Chl a = CChl a x (Vaseton80%)
(4.2)
6. Hitung kandungan chlorophyl a dalam deaunan kering dengan rumusan berikut: Chl a content = Chl a / M bubuk dedaunan kering (4.3) Pengukuran Carotenoid
1. Ukur absorbansi supernatan tersebut pada panjang gelombang 460 nm 2. Hitung konsentrasi Carotenoid dalam supernatant dengan rumusan berikut: CCar = (A460nm) / 2.0 3. Hitung jumlah Carotenoid dalam padatan dengan rumusan berikut: Car = CCar x (Vaseton80%)
(4.4)
(4.5)
4. Hitung kandungan Carotenoid dalam deaunan kering dengan rumusan berikut: Car Content = Car / M bubuk dedaunan kering
(4.6) 55
IV.
Potensi Bahaya
No. 1 2 3 4 5 6
Alat Sentrifuge Labu Erlenmeyer Vortexer Kuvet kaca Spektrofotometer Oven pengering
No. 1
Bahan Potensi Bahaya Aseton Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar. Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau memasuki saluran pernapasan. Dapat menyebabkan iritasi pada mata. Dapat menyebabkan gangguan pada sistem saraf. Sangat mudah terbakar dalam bentuk cair dan uap.
V.
1. 2. 3. 4.
Potensi Bahaya Meledak/terbakar Pecah/patah Meledak/terbakar Pecah Meledak/terbakar Meledak/terbakar
Pertanyaan
Pada panjang gelombang berapa klorofil diukur? Dimana letak klorofil di dalam sel? Apakah kaitan antara klorofil a dengan proses fotosintesis? Gambarkan struktur kimia dari klorofil b! Apakah yang dimaksud dengan karotenoid? Apa fungsi karoten dalam kaitannya dengan kesehatan mata?
VI. No. 1 2 3
Format Laporan dan Pengumpulan Data yang diambil Larutan aseton 80% (λ = 663 nm) Supernatan daun (λ = 663 nm) Supernatan daun (λ = 460 nm)
VII.
Daftar Pustaka
Absorbansi
Tim Penyusun, 2006. Buku Panduan Praktikum Kimia Organik . Departemen Teknik Gas dan Petrokimia Universitas Indonesia. Depok.
56
MODUL 8 TEKNIK ASEPTIK DAN PEMBUATAN BIAKAN MURNI I.
Tujuan - Mempraktikkan teknik aseptik dan pembuatan biakan murni
II.
Teori
Pemanfaatan mikroba dalam bioteknologi umumnya bergantung pada biakan murni yang terdiri dari spesies tunggal, dan pemeliharaan kemurniannya. Sebagian besar aplikasi bioteknologi modern melibatkan penggunaan biakan murni. Metoda yang paling praktis dan bermanfaat untuk mendapatkan biakan murni adalah metoda “streak plate”, dimana campuran biakan di sebar atau dioleskan pada permukaan medium sedemikan rupa sehingga sel-sel tunggal menjadi terpisah satu sama lainnya. Masing-masing sel tunggal akan tumbuh menjadi suatu koloni yang merupakan biakan murni, oleh karena sel-sel yang tumbuh dalam koloni tersebut adalah keturunan dari sel tunggal. Teknik aseptik diperlukan dalam bekerja dengan suatu biakan mikroba murni dan untuk menjaga/memelihara kesterilan suatu media atau larutan. Dengan teknik aseptic, ahli-ahli bioteknologi dapat mencegah kontaminasi biakan atau larutan oleh mikroba yang tidak diinginkan. Banyak cawan petri dan plate kultur jaringan yang digunakan untuk menumbuh-biakan mikroorganisme terbuat dari bahan yang telah disterilkan oleh produsennya, pengisian peralatan-peralatan ini dengan media steril membutuhkan teknik aseptic. Teknik aseptic yang benar juga melindungi peneliti di bidang bioteknologi dari kontaminasi biakan-biakan yang berpotensi pathogen. Termasuk dalam teknik aseptic adalah menghindari kontak antara biakan murni, media steril, dan permukaan steril peralatan bejana dengan mikroorganisme kontaminan. Untuk mencapai tujuan ini : 1. 2. 3.
Tempat kerja harus dibersihkan dengan larutan antiseptic untuk mengurangi jumlah kontaminan potensial Peralatan disterilkan sebagai contoh batang ose disterilkan melalui pemanasan dengan pembakar Bunsen sebelum dan setelah transfer biakan Pekerjaan dilakukan secara cepat dan efisien untuk mengurangi waktu kontak dimana kontaminasi pada biakan atau pekerja laboratorium dapat terjadi
Langkah-langkah yang biasa dilakukan dalam transfer biakan dari satu bejana/tabung ke bejana lain adalah sebagai berikut: 1. 2. 3. 4. 5.
Menempelkan jarum ose ke api Membuka dan menempelkan mulut tabung biakan ke api Menggunakan jarum ose, sejumlah biakan diambil dan dipindahkan ke media segar Menempelkan mulut tabung biakan kea pi dan tabung ditutup kembali Menempelkan kembali jarum ose ke api
Teknik yang sama digunakan untuk inokulasi ke dalam cawan petri dan plate mikroskop, kecuali bahwa tutup cawan dan plate tidak dibakar. Pemahaman dan pengetahuan yang menyeluruh mengenai teknik aseptic dan prosedur pemindahan biakan merupakan persyaratan awal untuk bekerja dengan kultur mikrobiologi. Kita akan menghemat banyak waktu dan tenaga serta menghindari kesalahan hasil jika aturan-aturan umum dicermati ketika bekerja dengan biakan. 1.
Sterilkan selalu jarum inokulasi ose dengan pembakaran sebelum menggunakannya dan memasukkannya ke bahan biakan. 57
2.
Bekerja selalu dekat dengan api, bila perlu bibir tabung (bahan gelas) ditempelkan pada api sebelum memasukkan jarum ose. Langkah ini akan merusakkan sel-sel kontaminan yang mungkin tersimpan pada bibir tabung saat transfer biakan sebelumnya atau oleh hal lain. 3. Menjaga semua bahan biakan agar tertutup dengan baik. Jangan meletakkan penutup tabung atau cawan petri di atas meja, karena hal ini akan memungkinkan kontaminasi pada biakan. Ketika mentransfer koloni dari cawan petri, gunakan tutup cawan sebagai pelindung dengan sedikit mengangkatnya sehingga jarum ose dapat dimasukkan, tetapi permukaan media masih terlindung dari kontaminan-kontaminan yang mungkin jatuh ke atasnya. 4. Jangan membiarkan penutup tabung atau cawan petri menyentuh apapun kecuali wadah biakannya masing-masing. Hal ini akan mencegah kontaminasi terhadap penutup dan biakan. 5. Gunakan cara yang tepat pada saat membuka dan memasang penutup. III.
Prosedur III.1 Alat Batang inokulasi (jarum ose) Cawan petri Tabung reaksi tertutup 18x150 mm Laminar flow Lampu spirtus Inkubator pengocok (shaker) Inkubator (oven) 37 oC Rak tabung reaksi III.2 Bahan 2x5 mL media LB cair (Luria-Bertani: 10 g/L bacto-tryptone; 5 g/L yeastextract; 10 g/L NaCl) 5x10 mL LB-agar (tambahkan 15 g/L bacto-agar ke dalam LB cair) Sampel: 5 mL biakan murni E. Coli dalam LB cair Alkohol Kertas tissue III.3 Prosedur Percobaan
Catatan Pemimpin Praktikum Sehari sebelum percobaan, 5 mL LB cair diinokulasi dengan kultur E. Coli. Inkubasi disertai pengocokan E. coli pada 37 oC, 150 rpm. Seluruh pekerjaan di bawah ini dilakukan di dalam kamar steril (laminar flow). Ingat!! Bersihkan dan sterilkan ruang laminar sebelum dan setelah bekerja di dalamnya.
A. Transfer Biakan Hari ke satu 1. Pegang batang inokulasi (ose) antara ibu jari dan jari telunjuk, tempelkan bagian kawat ose pada api lampu spirtus, bakar seluruh kawat hingga merah dan berpijar. 58
2.
3.
4. 5.
6.
7. 8. 9.
Biarkan kawat dingin selama 5-10 detik sebelum diteruskan ke langkah berikutnya. Jangan kibaskan ose di udara. Gunakan tangan anda yang bebas, ambil tabung yang mengandung biakan E. coli dan perlahan-lahan kocok biakan untuk meratakan biakan. Buka tutup tabung dan tempatkan pada jari kelingking yang bebas dari tangan yang memegang jarum ose steril, kemudian bibir tabung dibakar pada pembakar spirtus. Pegang tabung biakan dengan posisi miring, masukan ose steril dan pindahkan sedikit biakan dari tabung ke kawat ose. Usahakan jarum ose tidak menyentuh dinding tabung atau sisi bibir tabung selama proses pemindahan. Bakar bibir tabung, dan dengan hati-hati ditutup kembali. Kemudian kembalikan tabung biakan E. coli ke rak tabung reaksi. Ambil tabung reaksi baru yang mengandung 5 mL LB cair steril. Buka dan pindahkan tutup tabung dengan cara yang sama seperti tahap sebelumya dan mulut tabung dibakar. Masukkan jarum ose yang menganduk inokulum hidup ke dalam tabung yang mengandung LB cair steril dan goncangkan kawat ose sehingga mikroorganisme berpindah ke dalam medium. Keluarkan jarum ose dari dalam tabung. Selanjutnya mulut tabung dibakar, ditutup kembali, dan diletakkan pada rak tabung reaksi. Kawat ose dibakar kembali untuk disimpan. Berikan label pada tabung baru yang telah diinokulasi, dan tempatkan pada inkubator pengocok, pada 37 oC dengan pengocokan 150 rpm selama 1 malam.
Hari ke dua 1. Setelah inkubasi satu malam, keluarkan tabung dari inkubator. 2. Amati tabung dan gambarkan kondisinya. B. Streak Plate Hari ke satu 1. Berikan label pada media LB dengan informasi nama, tanggal, nama media, dan nama sumber biakan yang akan digunakan. 2. Gunakan LB di atas untuk: a. Menumbuhkan biakan E. coli dengan kedua metoda streak (kuadran dan kontinyu) masing-masing pada satu plate LB agar. b. Satu dari masing-masing plate agar akan digunakan sebagai kontrol.
Berikan label pada masing-masing cawan petri. Metode Quadrant Streak
a. b.
Gambar kuadran pada bagian bawah luar cawan petri agar. Bakar batang inokulasi (kawat ose) dan biarkan dingin sebelum bersentuhan dengan biakan. Ose yang panas akan membunuh mikroorganisme dan menghasilkan aerosol ketika bersentuhan dengan agar dingin. Ikuti prosedur pada percobaan bagian A (Transfer Biakan, tahap 1 s/d 4) untuk memindahkan biakan dari media cair ke kawat ose. c. Ambil plate agar, dan angkat sedikit tutup cawannya. Biarkan kawat ose menyentuh permukaan agar, kemudian kawat digeser perlahan (dioleskan) diseluruh permukaan agar dalam satu kuadran melalui gerakan streaing continue (tidak terputus). Hindari penusukan kawat ose kedalam agar. Gunakan pantulan cahaya untuk melihat dimana anda melakukan streaking dan inokulasi pada agar. Area ini akan terlihat sebagai goresan59
d.
e. f.
goresan redup. Hal ini akan membantu dalam menempatkan inokulasi lebih baik. Bakar jarum ose kemudian biarkan dingin, dan lakukan streak silang dari area sebelumnya (kuadran 1) ke kuadran kedua. Selalu sterilkan ose setelah inokulasi setiap kuadran pada cawan, hal ini akan membuhun selsel yang menempel pada jarum ose dan mencegah kontaminasi pada inokulasi berikutnya. Ulangi prosedur yang sama untuk setiap kuadran berikutnya, hingga semua quadrant pada cawan terinokulasi Bakar jarum ose setelah selesai
Metode Streak Continue
a.
Ambil sedikit biakan inokulum pada kawat ose dengan cara yang sama seperti percobaan bagian A (Transfer Biakan, tahap 1-4). b. Sebarkan (oleskan melalui gerakan tunggal yang kontinyu (tidak terputus), terus menerus dan dengan arah bolak-balik diseluruh permukaan agar pada setengah area cawan. c. Tanpa pembakaran dan tanpa mengeluarkan kawat ose, putar cawan 90 o dan lanjutkan prosedur streaking dengan cara yang sama seperti di atas pada setengah area cawan berikutnya. 3. Siapkan inokulasi kontrol(Metode quadran streak) dimana plate agar digores dengan hanya menggunakan kawat ose steril tanpa biakan. Cawan ini akan menjadi indikator yang baik untuk teknik aseptik, karena apapun seharusnya tidak tumbuh pada cawan ini. 4. Balikkan cawan untuk menghindari kondensasi air dari kultur bakteri yang telah disebarkan di permukaan agar, letakkan cawan pada inkubator 37 oC untuk diinkubasi selama 24-28 jam.
Gambar quadrant streak dan continuous streak
Hari ke dua 1. Setelah inkubasi selama 24-28 jam, cawan dikeluarkan inkubator. 2. Amati cawan, amati dimana anda menemukan koloni yang terisolasi dengan baik (koloni tunggal).
IV.
Potensi Bahaya
No. 1 2 3 4 5 6 7 8
Alat Batang inokulasi Cawan petri Tabung reaksi Laminar flow Lampu spirtus Inkubator pengocok Inkubator (oven) Rak tabung reaksi
No. Bahan
Potensi Bahaya Tertusuk Pecah/patah Pecah/patah Meledak/terbakar Meledak/terbakar/tumpah Meledak/terbakar/konselet Meledak/terbakar/konselet Patah
Potensi Bahaya 60
