Manual de laboratorio de bioquímica

Manual de laboratorio de Bioquímica, Código 24726, Profesora Martha Cecilia Daza Espinosa

MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

Segundo semestre del 2012

Martha Cecilia Daza Espinosa Profesora Asociada Escuela de Química

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CALENDARIO DE LAS PRÁCTICAS DEL LABORATORIO

PRÁCTICA

FECHA

Introducción al laboratorio de bioquímica

Noviembre 19

Determinación de punto isoeléctrico de aminoácidos

Noviembre 26

Determinación de la concentración de proteínas

Diciembre 3

Extracción y precipitación fraccionada de proteínas

Diciembre 10

Evaluación dela actividad enzimática de peroxidasa. Ensayo enzimático. Ver http://es.wikipedia.org/wiki/Ens http://es.wikipedia.org/wiki/Ensayo_enzim%C3%A1ti ayo_enzim%C3%A1tico co

Diciembre 17

Determinación de concentración de azúcares reductores y totales

Enero 21

Aspectos generales de las enzimas: Efecto de la concentración de enzima, de la temperatura y del ph sobre la hidrólisis de almidón

Enero 28

Extracción e identificación cualitativa de lípidos

Febrero 4

Extracción de DNA y determinación del efecto de parámetros ambientales sobre su estabilidad. part e I

Febrero 11

Extracción de DNA y determinación del efecto de parámetros ambientales sobre su estabilidad. part e II

Febrero 18

Trabajo de Investigación Personal - Asesoría

Febrero 25

Trabajo de Investigación Personal – Elaboración presentación

Marzo 4

Trabajo de Investigación Personal – Presentación oral

Marzo 11

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Lineamientos generales del laboratorio de bioquímica: Pre-informes e informes Antes de cada práctica el estudiante debe realizar una consulta de los temas relacionados en la guía y a partir de ella responder las preguntas correspondientes. En algunas prácticas de laboratorio incluyen un taller que el estudiante debe resolver previamente. Al inicio de cada práctica se realizará un quiz para evaluar la preparación de la práctica de laboratorio. El quiz tendrá un valor del 20% de la nota del laboratorio. Estará relacionado con el tema, las preguntas de consulta y la metodología de la práctica. El pre-informe y el informe tendrán un valor del 80%. Cada estudiante deber elaborar un pre-informe que incluye el título, los objetivos y el procedimiento, el que deberá presentar en un cuaderno exclusivo para el laboratorio en el que consignará todos los preinformes, los resultados, el análisis y discusión de resultados, las conclusiones y la bibliografía. Cada práctica de laboratorio iniciará con una explicación y puesta en común de los objetivos, del procedimiento y de los cuidados particulares que se deberán tener en su desarrollo. Recuerde que cada pre-informe debe contener:

1) Título de la práctica 2) Objetivos 3) Procedimiento: Antes de cada laboratorio, el estudiante deberá elaborar un diagrama de flujo en el que indique la secuencia de pasos en que se realizarán las actividades necesarias para el desarrollo del laboratorio. El diagrama de flujo facilita la comprensión, y provee una visión clara de lo que se va a hacer, muestra las relaciones entre las diferentes actividades propuestas, sirve de guía para el desarrollo del laboratorio y facilita el trabajo en equipo y la comunicación. A continuación se incluye una guía general para la elaboración de un diagrama de flujo: a) Identifique todas las actividades, el principio, y el fin del laboratorio que va a realizar. ¿Qué es lo primero que se realiza?, ¿Qué es lo siguiente que se realiza?, ¿Qué es lo último que se realiza? b) Identifique qué se requiere para desarrollar cada una de las actividades. c) Construya el diagrama de flujo.

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Empiece identificando el inicio del proceso; posteriormente identifique la primera actividad del proceso y escríbala dentro de un rectángulo. Luego determine y registre la siguiente actividad actividad y siga así así sucesivamente con las demás actividades necesarias para el desarrollo del laboratorio hasta las que las registre todas. Utilice la siguiente simbología:

Rectángulo redondeado: El símbolo de inicio y terminación de un proceso es un rectángulo

redondeado. Para indicar el inicio escriba dentro del rectángulo la palabra <>. Para indicar el final escriba la palabra fin dentro del rectángulo. Así queda indicado el punto de partida y de terminación de un flujo.

Rectángulo regular: El símbolo de actividad es un rectángulo, en el que se hace una breve

descripción de ella.

Flecha: La línea de flujo indica el camino del proceso que conecta las actividades. Las flechas

se utilizan para indicar la dirección del flujo.

Círculo: El círculo representa un punto de conexión entre procesos. Se utiliza cuando es

necesario dividir un diagrama de flujo en varias partes, por ejemplo por razones de espacio o simplicidad. Una referencia debe de darse dentro para distinguirlo de otros. La mayoría de las veces se utilizan números en los mismos. Rombo: El rombo se utiliza para representar una condición. Normalmente el flujo de

información entra por arriba y sale por un lado si la condición se cumple o sale por el lado opuesto si la condición no se cumple. Para comprender el uso de los símbolos en el diagrama, tenga en cuenta las siguientes reglas:

Reglas para la elaboración del diagrama de flujo: - Los diagramas de flujo deben escribirse de arriba hacia abajo, o de izquierda a derecha. - Los símbolos se unen con líneas, las cuales tienen en la punta una flecha que indica la dirección en que fluye la información, o los procesos. Se deben de utilizar solamente líneas de flujo horizontal o vertical (nunca diagonales). - Se debe evitar el cruce de líneas. - No deben quedar líneas de flujo sin conectar. - Todo texto escrito dentro de un símbolo debe ser legible, preciso, evitando el uso de muchas palabras.

El informe de cada práctica debe presentarse en la “Plantilla informes Lab Bioquímica.docx” que encontrará en d:\Mis documentos\MyDropbox\Lab-Bioquimica documentos\MyDropbox\Lab-Bioquimica Para la discusión de resultados tengan en cuenta el significado de la palabra discusión. Según el diccionario de la RAE, discusión significa: Análisis o comparación de los resultados de una investigación, a la luz de otros existentes o posibles. Y según el diccionario Oxford (Discussion: a 4


detailedtreatment of a topic in speechorwriting, que traducido significa: Un tratamiento detallado de un tema en una presentación oral o en un escrito. Tenga en cuenta el significado de la palabra discusión para que redacte la discusión de sus resultados. Haga énfasis en los aspectos importantes observados en el desarrollo del laboratorio, la concordancia entre los resultados esperados y los encontrados y en las conclusiones que se deriven de ellos. Cuando haya desacuerdo plantee una explicación argumentada, para ello debe entender la reacción que se estaba analizando y explicar el por qué los resultados no fueron los que “deberían” obtenerse y plantear una solución. En la discusión de resultados también se pueden incluir sugerencias para mejorar la eficiencia de la práctica. Estas sugerencias también deben ser argumentadas. No debe repetir, de forma detallada, los datos u otras informaciones ya incluidas en los resultados. Explique en el apartado de discusión el significado de los resultados, las limitaciones del estudio. Se compararán las observaciones realizadas con sus concepciones anteriores y analice si concuerdan o no; si no concuerdan trate de explicar por qué. Relacione las conclusiones con los objetivos del estudio, evite afirmaciones poco fundamentadas y conclusiones insuficientemente avaladas por los datos. Podrán incluirse recomendaciones cuando sea oportuno. Recuerde que las conclusiones del trabajo deben derivarse directamente de los resultados del mismo.

Figuras. Cada figura debe estar numerada con números arábigos. La numeración debe indicarse en el texto y en la parte posterior de la figura. Escribir los nombres de los ejes en forma clara y tan cerca como sea posible e indicar las unidades utilizando el sistema internacional de unidades. Tablas. Las tablas deben numerarse con números arábigos e ir encabezadas por un título breve e informativo. Referencias bibliográficas. Las citas a la literatura deben indicarse en números arábigos encerrados entre paréntesis y enumerarse consecutivamente según el orden de aparición dentro del texto. Las referencias bibliográficas deben seguir el formato presentado en los siguientes ejemplos y numerado en arábigo sin paréntesis: Ejemplo 1: Artículo publicado en una revista : 1. Corma A.; MartínezTriguero J. The Use of MCM-22 MCM-22 as a Cracking Zeolitic Additive Additive for FCC. J.Catal. 1997. 165 (1): 102-105. Ejemplo 2: Libro: 1. Smith, A. B. Textbook of Chemistry. Washington, D.C. American American Chemical Society. 1972. pp. 75. Ejemplo 3.Capítulo de libro: 1. Ferst A. The Three-Dimensional Three-Dimensional Structure of Proteins. En: Structure and Mechanism Mechanism in Protein Science. New York : W.H. Freeman and Company. 1997. pp. 1-50. Ejemplo 4.Tesis: 1. Meyer, B. N. Brine Shrimp Toxicity; Toxicity; Certain Components Components of Stapelia, Coryphanta, Lupinus and Quinoa . Ph. D. Thesis, Purdue University, West Lafayette, IN, 1983, p. 35. Ejemplo 5.Patente: 1. Davis, R. U.S. Patent 5,708,591, 1998.

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Esta manera de citar la literatura l iteratura se tomó de las instrucciones in strucciones que la revista colombiana de química exige a los autores: http://www.unal.edu.co/rcolquim/instrucciones/instrucciones5.htm

Reconocimiento de las normas de seguridad en el laboratorio de bioquímica.

El laboratorio de bioquímica es un lugar donde se desarrollan prácticas elegidas por el docente para confirmar y reafirmar los conocimientos teóricos impartidos en el salón de clase. Al realizar cada práctica deben seguirse las instrucciones y observar y registrar lo que sucede. Es importante señalar la necesidad de seguir todos los pasos indicados en cada práctica para obtener los resultados correctos de cada experimento. En todas las prácticas deberán anotarse las observaciones, los resultados y las conclusiones. En el caso de que el experimento no resultara como está planeado, el alumno deberá investigar, consultar y agotar todas las posibilidades para lograr un desarrollo correcto. Si no se lograra el objetivo de la práctica, debe preguntar al docente, él le explicará en donde está la falla y la manera de corregirla. De esta forma se logrará desarrollar una actitud crítica hacia la materia, un mejor aprovechamiento de clase práctica y un apoyo mayor a la clase teórica.

Medidas de seguridad en un laboratorio Localiza los dispositivos de seguridad más próximos. Estos dispositivos son elementos tales como extintores, lava ojos, ducha de seguridad, salida de emergencia.

1. No deben efectuarse experimentos no autorizados, a menos que estén supervisados por el docente. 2. Cualquier accidente debe ser notificado de inmediato al docente o al auxiliar del laboratorio. 3. Uso indispensable de bata como medida de protección. 4. Los tubos y varillas de vidrio y objetos calientes deben colocarse sobre tela de asbesto y en un lugar no muy accesible de la mesa de trabajo, para evitar quemaduras así mismo o a un compañero. 5. Los tubos de ensayo calientes, con líquido o no, deben colocarse en una gradilla de alambre o dentro de un vaso de precipitados. 6. Cuando se calientan sustancias contenidas en un tubo de ensayo, no se debe apuntar la boca del tubo al compañero o a sí mismo, ya que q ue pueden presentarse proyecciones del líquido caliente. 7. La dilución de ácidos concentrados debe hacerse de la siguiente manera: • Utilizar recipientes de pared delgada. • Añadir lentamente el ácido al agua resbalándolo por las paredes del recipiente, al mismo tiempo que se agita suavemente. NUNCA AÑADIR AGUA AL ÁCIDO, ya que puede formarse vapor con violencia explosiva. • Si el recipiente en el que se hace la dilución se calentara demasiado, interrumpir de inmediato y continuar la operación en baño de agua o hielo. 8. No se debe probar ninguna sustancia. Si algún reactivo se ingiere por accidente, se notificará de inmediato al docente. 9. No manejar cristalería u otros objetos con las manos desnudas, si no se tiene la certeza de que están fríos. 6


10. No se debe oler directamente una sustancia, sino que sus vapores deben abanicarse con la mano hacia la nariz. 11. No tirar o arrojar sustancias químicas, sobre nadantes del experimento o no, al desagüe. En cada práctica deberá preguntar al profesor sobre los productos que pueden arrojar al desagüe para evitar la contaminación de ríos y lagunas. 12. Cuando en una reacción se desprendan gases tóxicos o se evaporen ácido, la operación deberá hacerse bajo una campana de extracción. 13. Los frascos que contengan los reactivos a emplear en la práctica deben mantenerse tapados mientras no se usen. 14. No trasladar varios objetos de vidrio al mismo tiempo. No se debe usar equipo de vidrio que esté agrietado o roto. Este material se debe depositar en un contenedor para vidrio, no en un recipiente destinado para la basura. 15. No utilice nunca un equipo o aparato sin conocer perfectamente su funcionamiento. En caso de duda, pregunte siempre al profesor. 15. No ingerir alimentos ni fumar f umar dentro del laboratorio. 16. Se deberá mantener una adecuada disciplina durante la estancia en el laboratorio. El orden es fundamental para evitar accidentes. Se debe mantener el área de trabajo ordenada, sin libros, abrigos, bolsas, exceso de recipientes de desecho de productos químicos y elementos innecesarios o inútiles. 17. Estar atento a las instrucciones del docente. 18. Es indispensable lavarse las manos después de realizar un experimento y antes de salir del laboratorio. 19. Lea las etiquetas de seguridad. Las botellas de reactivos contienen pictogramas y frases que informan sobre su peligrosidad, uso correcto y las medidas a tomar en caso de ingestión, inhalación, etc. Algunos aparatos pueden contener información del mismo tipo. Lee siempre detenidamente esta información y ten en cuenta las especificaciones que se señalan en ella. 20. Preste atención a las medidas específicas de seguridad. Las operaciones que se realizan en algunas prácticas requieren información específica de seguridad. Estas instrucciones son dadas por el profesor y/o recogidas en la guía de laboratorio y debes de prestarles una especial atención. En caso de duda, consulta al profesor. Cualquier duda que tengas, consúltala con tu profesor. Recuerda que no está permitido realizar ninguna ninguna experiencia experiencia no autorizada autorizada por tu profesor.

21. Cuando se presente algún derrame de reactivos, se debe llamar a los auxiliares de laboratorio o a los profesores para verificar el riesgo del producto químico y proceder posteriormente a realizar la limpieza del mismo. 22. Al finalizar cada práctica de laboratorio, se debe entregar el material de vidrio asignado a cada grupo de trabajo totalmente limpio. 23. Se debe trabajar sin prisas, pensando en cada momento lo que se está haciendo y con los materiales y reactivos ordenados. No se deben realizar bromas, correr, jugar, empujar, etc. En el laboratorio. 24. Durante la práctica de laboratorio no se deben usar celulares, ipod, portátiles o cualquier otro equipo de comunicación ya que esto interfiere con la concentración, pone en peligro su seguridad en el laboratorio, además de interrumpir el desarrollo normal de la práctica.

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Manual de laboratorio de Bioquímica, Código 24726, Profesora Martha Cecilia Daza Espinosa “Un comportamiento irresponsable puede ser motivo de expulsión inmediata del laboratorio y de .” sanción académica .”

Otras consideraciones: Cuida tus ojos. Los ojos son particularmente susceptibles de daño permanente por productos corrosivos así como por salpicaduras de partículas. Es obligatorio usar gafas de seguridad siempre que se esté en un laboratorio donde los ojos puedan ser dañados. No lleves lentes de contacto en el laboratorio, ya que en caso de accidente, las salpicaduras de productos químicos o sus vapores pueden pasar detrás de las lentes y provocar lesiones en los ojos. Cómo ir vestido al laboratorio. El uso de bata es obligatorio en el laboratorio, ya que son inevitables las salpicaduras de productos químicos. La bata será preferentemente de algodón, ya que, en caso de accidente, otros tejidos pueden adherirse a la piel, aumentando el daño. Se prohíbe el uso de minifalda o pantalones cortos, sandalias, tenis de tela o cualquier otro tipo de calzado que ponga en riesgo la seguridad durante la manipulación de sustancias químicas o sustancias con peligro biológico. • El cabello siempre debe estar recogido durante la práctica de laboratorio.

Usa guantes. Es recomendable usar guantes, sobre todo cuando se utilizan sustancias corrosivas o tóxicas, igualmente cuando se manipulan cultivos de bacterias, hongos, muestras de sangre y orina. En ocasiones, pueden ser recomendables los guantes de un solo uso. Sustancias que deben usarse con precaución Todas las que se utilizan en las operaciones y reacciones en el laboratorio de química son potencialmente peligrosas por los que, para evitar accidentes, deberá trabajarse con cautela y normar el comportamiento en el laboratorio por las exigencias de la seguridad personal y del grupo que se encuentre realizando una práctica. Numerosas sustancias orgánicas e inorgánicas son corrosivas o se absorben fácilmente por la piel, produciendo intoxicaciones o dermatitis, por lo que se ha de evitar su contacto directo; si este ocurriera, deberá lavarse inmediatamente con abundante agua la parte afectada.

¿Qué hacer en caso de accidente? 1. En caso de accidente en el laboratorio, hay que comunicarlo inmediatamente al docente. 2. Salpicaduras por ácidos y álcalis, lavarse inmediatamente y con abundante agua la parte afectada. Si la quemadura fuera en los ojos, después de lavado, acudir al servicio médico. Si la salpicadura fuera extensa, llevar al lesionado al chorro de la regadera inmediatamente y acudir después al servicio médico. 3. Quemaduras por objetos, líquidos o vapores calientes, aplicar pomada para quemaduras o pasta dental en la parte afectada. Es caso necesario, proteger la piel con gasa y acudir al servicio médico.

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Práctica 2. Carácter anfotérico y punto isoeléctrico de aminoácidos 1. Introducción Introducción

Los aminoácidos son las unidades estructurales de las proteínas. Todos los aminoácidos poseen un grupo ácido (-COOH) y un grupo básico (-NH2), por tal razón, todos los aminoácidos libres presentan características ácido-base. En el interior celular los aminoácidos predominan en forma de ion dipolar o zwitterion (del alemán ion híbrido). En la forma dipolar el grupo carboxilo se encuentra disociado (-COO-) y el grupo amino protonado (-NH3+), pero la carga de la molécula es neutra. Un zwitterion puede actuar como un ácido o como una base cediendo o aceptando protones. La protonación o desprotonación de los grupo amino y carboxilo depende del pH. Para la glicina el pKa para el grupo carboxilo y amino es 2,3 y 9,6, respectivamente. Esto significa que a pH inferiores a 2,3 los grupos carboxilo y amino estarán protonados y la carga neta de la molécula será positiva. A pH entre 2,3 y 9,6 el grupo carboxilo estará desprotonado y el grupo amino protonado, siendo la carga neta del aminoácido cero. A pH superiores a 9,6 ambos grupos estarán desprotonados, siendo la carga neta negativa. Dado que los grupos ionizables de los aminoácidos son ácidos relativamente débiles podemos aplicar la ecuación de Henderson-Hasselbalch para calcular la fracción de cada grupo que se encuentra ionizada a un determinado pH. pH =

 A  , donde A-: aceptor de protones y HA: donor de protones pK a + log  HA

El grupo α-carboxilo tiene un pKa entre 1,8 y 2,5, mucho más bajo que el pKa del ácido acético (pKa = 4,8). Esto se debe al efecto inductivo que ejerce el grupo amino que al estar protonado atrae hacia si los electrones del grupo carboxilo favoreciendo la desprotonación del mismo. Para un grupo carboxilo que tenga un pKa de 2,0 la razón de forma desprotonada a forma protonada a pH 7 será de 100.000 a 1, es decir, a pH fisiológico la forma predominante es la de anión carboxilato. Para el grupo amino el valor de pKa varía entre 8,7 y 10,9. Así, para un grupo amino cuyo pKa sea de 10,0 la razón base/ácido será de 1/1000 a pH 7. Estos datos confirman el hecho de que la forma predominante a pH neutro para los aminoácidos es la forma for ma de zwitterion neutro. 2. Objetivos

1.

Comprobar el carácter anfotérico de los aminoácidos.

2.

Determinar los valores de pK de los grupos ionizables de un aminoácido.

3.

Hallar el punto isoeléctrico de un aminoácido. 9

Manual de laboratorio de Bioquímica, Código 24726, Profesora Martha Cecilia Daza Espinosa 3. Procedimiento Procedimiento

Dispondremos de soluciones acuosas 0,1 M de los aminoácidos E y H. La práctica consta de dos partes. La primera es de trabajo teórico en casa, el cuál es indispensable para realizar la parte experimental. La parte teórica es parte del preinforme. I.

Primera parte: Taller

1. Consulte los valores para el pK de los grupos carboxilo y amino correspondientes a uno de los dos aminoácidos, calcule el PI y el pH de una solución 0,1M. Haga los cálculos suponiendo que el aminoácido que Ud. eligió se encuentra como clorhidrato. Hágalos también considerando que el aminoácido se encuentra como la sal de sodio. 2.

Haga los cálculos para la titulación de 5 mL de solución 0,1M de uno de los dos aminoácidos, considerando que adiciona alícuotas de 1 mL de HCl 0,1M hasta pH 1,5.

3.

Haga los cálculos para la titulación de otros 5 mL de solución 0,1M del mismo aminoácido considerando que adiciona NaOH 0,1 M hasta pH 12,5.

4.

Haga una gráfica de la curva de titulación para el aminoácido y dibuje las estructuras del aminoácido a pH 1,5, en el PI, y a pH 12,5.

II.

Segunda parte: Experimental.

1.

Titulación de un aminoácido Tome 5 mL de la solución acuosa de cada aminoácido asignado 0,1M en un tubo de ensayo.

2.

Calibre el pH metro y determine el pH inicial de la solución y regístrelo en una tabla de resultados.

3. Adicione dos gotas de un indicador adecuado y empiece la titulación, adicione 1 mL de HCl 0,1 M y determine el pH. 4.

Continúe adicionando ácido en alícuotas de 1mL y registando el valor del pH hasta obtener un valor de pH de 1,5.

5.

Registre en una tabla los valores de pH y de ácido adicionado.

6.

Lave el electrodo con agua destilada y titule con NaOH hasta un pH de 12,5 otros 5 mL de la solución de aminoácido siguiendo un procedimiento similar a la titulación con HCl.

7.

Determine los valores de pK a y calcule los puntos isoeléctricos a partir de las curvas de titulación.

8.

Elabore las curvas de titulación de pH versus milequivalentes de HCl y de NaOH adicionados.

9. Analice e interprete sus resultados. Incluya tabla de datos y curva de titulación experimental para el aminoácido titulado e inclúyala en el informe. Calcule los valores de pK y del PI a partir de las curvas de titulación para el aminoácido. Calcule la fracción ionizada de los diferentes grupos a pH 7. Utilice la ecuación de Henderson-Hasselbalch. Incluya una respuesta a las siguientes preguntas de consulta

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1. ¿Pueden comportarse los aminoácidos como un buffer intracelular? Argumente su respuesta. Tenga en cuenta el rango de valores del pKa de los grupos carboxilo y amino de los 20 aminoácidos. 2. ¿Cómo separaría los aminoácidos R, H, D y E de una mezcla a pH 7? 3. Calcule el PI del péptido N-E-A-L. 4. Materiales Materiales y reactivos reactivos

Soluciones 0,1 M de los aminoácidos aminoácidos E y H. NaOH 0,1 N (titulado) HCl 0,1 N (titulado) Vasos de precipitados de 50 mL Tubos de ensayo Pipetas de 1 mL Agitador magnético pH metro 5. Bibliografía Bibliografía

Segel, I. H. 1.976. Biochemical Calculations.How to Solve Mathematical Problems in General Biochemistry.Second Edition. John Wiley & Sons, Inc., New York. Boyer, R. 2000.Modern Experimental Biochemistry. Addison Wesley Longman, San Francisco. Third Edition.Nelson, D. L., Cox, M. M..2000. Lehninger Principles of Biochemistry, Worth Publishers, Third Edition, New York.

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Práctica 3. ESPECTROFOTOMETRÍA. Métodos de cuantificación de proteínas. Curva de calibración Elaborada por: Martha Cecilia Daza Espinosa 1. INTRODUCCIÓN Cuantificación química: Métodos espectroscópicos y no‐espectroscópicos. La ley de Lambert ‐ Beer; sus limitaciones. Cuantificación de proteínas por técnicas espectrofotométricas. Absorción UV de proteínas y ácidos nucléicos. Fundamentos de los métodos de Lowry, Biuret y Bradford .

La espectrofotometría es un método de análisis óptico muyútil en bioquímica. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto con una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia. La espectroscopia UV‐visible (longitud de onda comprende entre 190 y 800 nm, mire la figura) se utiliza para identificar algunos grupos funcionales y para determinar la concentración de soluciones con solutos que absorban en este rango de longitud de onda.

Absorbancia de proteínas a 280 nm Aunque ninguno de los 20 aminoácidos hallados en las proteínas absorbe luz en la región visible del espectro electromagnético, tres de ellos (tirosina, triptófano y fenilalanina) absorben significativamente en la región del UV cercano (alrededor de 280 nm). Dado que las proteínas poseen restos de aminoácidos aromáticos, las medidas de absorción a 280 nm constituyen un método rápido para la determinación del contenido de proteína de una solución. Transmitancia y absorbancia Cuando la luz atraviesa o se refleja en la muestra, la cantidad de luz absorbida es la diferencia entre la radiación incidente (Io) y la transmitida (I). La cantidad de luz absorbida se expresa como transmitancia o absorbancia. La transmitancia normalmente se da en términos de una fracción de 1 o como porcentaje, y se define como se indica a continuación: T=I/I0,o,%T= (I/I0) X100 La absorbancia se define:A=‐logT Para la mayoría de las aplicaciones se utilizan valores deabsorbancia, ya que la relación entre ésta y tanto laconcentración como el paso óptico es, normalmente, lineal.

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Objetivos 1. Conocer la técnica de espectrofotometría UV-Vis para cuantificación de proteínas. 2. Aprender a preparar una curva de calibración para determinación de concentración de proteínas. 3. Comparar la sensibilidad de la cuantificación de proteínas usando el método de Bradford con la medición de absorbancia a 280 nm. Preguntas de Consulta: 1) ¿Cuáles son las partes de un espectrofotómetro? Imprima una copia de un espectrofotómetro e indique las partes. Es indispensable para poder hacer la práctica. 2) Indique cuál es la diferencia entre transmitancia y absorbancia y como se relacionan matemáticamente. 3) En qué consiste la ley de Beer‐Lambert. 4) ¿Qué es y qué importancia tiene una curva de calibración? 5) ¿Qué cuidados debe tener en la práctica para garantizar la precisión en la cuantificación de una sustancia? 6) ¿Qué es y qué importancia tiene el uso de un blanco en un experimento? 7) Diga cómo se realiza la valoración de proteínas por el método Lowry, Biuret y Bradford. 2. MATERIALES Y REACTIVOS

     

Espectrofotómetro Tubos de Ensayo Pipetas Vaso de precipitado Reactivo Biuret Solución patrón de proteína (albúmina sérica bovina o caseína) de 1,0 y 5,0 mg/ mL en NaCl 1%

3. PROCEDIMIENTO Curva de calibración y determinación y determinación de la concentración de una muestra problema. muestra problema.

a) Calcule el volumen de la solución patrón de albúmina sérica bovina (BSA) de concentración 5g/L para preparar 3 mL de concentración concen tración 0,5 g/L, 1,0 g/L, 1,5 g/L, 2 g/L, 4 g/L y 5 g/L. g /L. Y complete los datos de la tabla1 Tubos [BSA] g/L

1

2

3

4

5

6

7

8

0,0 0 ,5 ,5 1 ,0 ,0 1 ,5 ,5 2 ,0 ,0 3 ,0 ,0 4 ,0 ,0 5 ,0 ,0

Problema ¿?

Solución patrón de BSA (mL)

0

Agua destilada (mL)

0

b) A cada uno de los tubos (1‐8) adiciónele 3 mL del reactivo de Biuret y déjelos reaccionar por 20 minutos. Lea la absorbancia de la soluciones a 548 nm. En el tubo problema coloque 3 mL de la solución problema y aplíquele el mismo procedimiento para la curva de calibración. Tenga cuidado de que cuando mida la absorbancia todos los tubos hayan tenido el mismo tiempo de reacción con el reactivo de Biuret. MÉTODO DE ABSORCIÓN EN EL ULTRAVIOLETA

c) Determine los valores de absorbancia a 280 nm para las diferentes soluciones (tubos B, 1-7, y para la muestra problema y haga una gráfica (concentración de BSA vs absorbancia) y determine la concentración de la muestra problema por interpolación. Haga una curva de calibración utilizando como solución patrón, una solución acuosa de proteínas (albúmina de huevo o caseína) de concentración 1 mg/ mL. 13

Manual de laboratorio de Bioquímica, Código 24726, Profesora Martha Cecilia Daza Espinosa Para la curva de calibración, en 9 tubos de ensayo rotulados mida los siguientes reactivos: TUBO B 1 2 3 4 5 6 Sol. Sol. patr patrón ón de prot proteí eína na ( mL) mL)

-

Extracto problema ( mL)

-

NaCl 1% ( mL)

5,0

0,2 0,2

4,8

7*

8*

0,4 0,4

0,6 0,6

0,8 0,8

1,0 1,0

1,2 1,2

1,5 1,5

-

-

-

-

-

-

-

1,0

4,0

3,8

4,5 4,5

4,0

4,6 4,6 4,4 4,4, 4,2 4,2

Mezcle bien y mida la absorbancia a 280nm.

d) Con los datos de absorbancia construya una curva de calibración (concentración de BSA vs absorbancia) y determine la concentración de la muestra problema por interpolación. Si la absorbancia de la muestra problema es superior al valor de absorbancia del tubo 8 haga diluciones hasta obtener un valor de absorbancia menor. e) Haga un análisis comparativo de los resultados. 4. BIBLIOGRAFÍA Douglas A. Skoog, James Holler y Timothy A. Nieman. Principios de análisis instrumental. Quinta edición. Mc Graw Hill. Madrid, España. http://es.wikipedia.org/wiki/Curva_d http://es.wikipedia.org/wiki/Curva_de_calibrado e_calibrado http://www.quimicaviva.qb.fcen.u http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/cal ba.ar/contratapa/calibracion/calibrac ibracion/calibracion.htm ion.htm http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/control.h .ar/contratapa/control.htm tm

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Práctica 4. Extracción y precipitación fraccionada de proteínas. Fraccionamiento de las proteínas de la leche por pI y precipitación salina 1. INTRODUCCIÓN La caseína (del latín caseus, "queso") es una fosfoproteína (un tipo de heteroproteína) presente en la leche y en algunos de sus derivados (productos fermentados como el yogur o el queso). En la leche, se encuentra en la fase soluble asociada al calcio (fosfato de calcio) en un complejo que se ha denominado caseinógeno. La tabla 1 recoge el contenido de esta proteína en la leche de distintas especies de mamíferos. Tabla 1. Contenido proteico y caseínico de la leche de algunas especies animales.[1],[2],[3],[4],[5] Componente

Especie Huma Humana na Bovi Bovina na Ovina Caprina proteínas (% del total lácteo) 1,3‐1,5 3,2‐3,5 5,4‐6,0 3,1‐4,0 caseínas (% del total protei proteico) co) 44,9 44,9 82,5 84,8 81,3 Características de las caseínas Las caseínas son un conjunto heterogéneo de proteínas por lo que es difícil fijar una definición. Sin embargo, todas las proteínas englobadas en lo que se denomina caseína tienen una característica común: precipitan cuando se acidifica la leche a pH 4,6. Por ello, a la caseína también se le suele denominar proteína insoluble de la leche. Por otra parte, y aunque las proteínas que se denominan caseínas son específicas de cada especie, se clasifican en los siguientes grandes grupos de acuerdo con su movilidad electroforética electroforética:: αs1‐caseína, αs2‐caseína, β‐caseína y κ‐ caseína (véase la Figura 1). Esta última es de especial interés en la industria quesera, ya que su hidrólisis enzimática por el cuajo (la enzima quimosina quimosina)) genera una nueva proteína, denominada para‐κ‐caseína. Cuando esta última reacciona con el calcio genera paracaseinato de calcio. Durante el proceso de maduración del queso, y a partir de la para‐κ‐caseína, se forman unos macropéptidos denominados γ‐caseínas, responsables de las características reológicas y organolépticas de los quesos.

Figura 1. Patrón de electroforésis que se obtiene con las proteínas lácteas procedentes de las especies humana (calle 2) y bovina (calle 3). La calle 1 muestra las proteínas de referencia para los pesos moleculares y la flecha indica el sentido de migración de las proteínas, [1 ,2, 3, http://es.wikipedia.org/wiki/Ca http://es.wikipedia.org/wiki/Caseina#cite_note seina#cite_note‐7]. Química y física de las caseínas A diferenciade muchas otras proteínas, incluso del queso, las caseínas no precipitan por acción del calor. Por el contrario, precipita por la acción de una enzima proteasa presente en el estómago de los mamíferos llamada

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Manual de laboratorio de Bioquímica, Código 24726, Profesora Martha Cecilia Daza Espinosa reninay forma un precipitado denominado paracaseína. reninay paracaseína. Si la precipitación se realiza por la acción de ácidos, se le llama caseína ácida. ácida. En la elaboración de los quesos tienen lugar ambos tipos de precipitaciones. Las características de las caseínas de la leche de vaca se resumen en la tabla 2. La secuencia aminoacídica (ver Figura 2) de la caseína contiene un número inusual de residuos del aminoácido prolina prolina:: entre 10 en la αs2‐caseína y 35 en la β‐caseína. Como resultado, las caseínas son relativamente hidrofóbicas (poco soluble en agua) y carecen de estructura secundaria o terciaria bien definidas. En la leche se encuentra como suspensión de partículas que asemeja a las micelas de surfactantes (pequeñas esferas hidrofílicas en el exterior e hidrófobicas en el interior). Estas micelas de caseína se estabilizan por iones de calcio e interacciones hidrofóbicas. Otro dato interesante, utilizado para separar las caseínas del resto de las proteínas lácteas mediante su precipitación, es que su punto isoeléctrico (pI) promedio es de 4,6. A este pH, las caseínas se encuentra en su punto de menor solubilidad debido a la reducción de las repulsiones intermoleculares, por lo que precipitan (vulgarmente se dice que coagulan). Ahora bien, el pI es diferente para cada una de las fracciones caseínicas, ya que varía entre el 4,44‐4.97 para la αs1‐caseína y el 5,3‐5,8 en la variante genética B de la κ‐caseína. Tabla 2. Algunas de las características fisicoquímicas de las caseínas bovinas [6,9] Característica

Caseína αs1 12‐15

αs2 3 ‐4

β 9‐11

κ 2‐4

Concentración en leche (g/L) Variantes genéticas ByC A A1 y A2 AyB Masa molecular 23.545‐23.6 23.615 15 25.2 25.226 26 23.9 23.983 83‐24.0 24.023 23 19.0 19.006 06‐19.037 Punto isoeléctrico (pI) 4,44‐4,76 ... 5,07‐5,45 5,77 Restos de aminoácidos (Nº) 199 207 209 169 El sulfato de amonio es una de las sales más utilizadas para la precipitación salina de proteínas. Se usa para precipitar fraccionadamente las globulinas que no son solubles en agua y para diferenciarlas de las albúminas albúminas.. Es muy soluble (760 g de sulfato de amonio/1000 ml. de agua a una temperatura de 20°C, temperatura promedio del laboratorio) y el ión sulfato divalente permite alcanzar altas fuerzas iónicas. El sulfato de amonio es excelente para realizar una precipitación fraccionada fraccionada,, porque, entre otras cosas, hace que el agua compita entre la disolución de esta sal o de la proteína (formada por muchos grupos carboxilo y amonio), amonio ), causando que precipite la proteína. Preguntas de consulta

1) Consulte la reacción catalizada por la enzima quimosina (chymosin). ¿Cuál es el pH óptimo para esta enzima? ¿En que aminoácidos de la caseina rompe el enlace peptídico? 2) Consulte las aplicaciones alimenticias e industriales de la caseína. 3) Consulte el pI para las proteínas lactoferrina, albúmina sérica bovina y α‐lactoalbúmina yβ‐ lactoalbúmina de la leche. Explique el porqué estas proteínas no precipitan a pH 4.7 y la caseína sí. 4) ¿Qué tipo de proteínas son las proteínas de la leche, solubles a pH de 4,7? 5) ¿Qué otros métodos, diferentes a la precipitación salina, se pueden utilizar para precipitar proteínas? 6) ¿Qué otras proteínas, además de las figura 1, forman parte de la proteínas de la leche bovina?

NOTA:

Buena parte de las respuestas a estas preguntas las pueden encontrar en el trabajo de grado del químico Cesar Augusto Bernal [10].

2. OBJETIVOS 16


1. Analizar el efecto del pH sobre la solubilidad de proteínas hidrosolubles en solución acuosa. 2. Separar proteínas de una solución acuosa de proteínas hidrosolubles utilizando precipitación salina. 3. Cuantificar la concentración de proteínas en diferentes fracciones de leche entera bovina. 3. MATERIALES Y REACTIVOS             

Espectrofotómetro Centrífuga pHmeter Tubos de Ensayo Tubos de centrífuga Pipetas Vasos de precipitados Reactivo Biuret Papel filtro Embudo de vidrio sinterizado Erlenmeyer con desprendimiento lateral 100mL de leche entera no procesada, es decir de cantina no de bolsa ni de caja, refrigerada por grupo. 100 mL de solución de sulfato de amonio saturada

4. PROCEDIMIENTO 3.1.

Determinación de las proteínas totales en la leche:

a) En un tubo de ensayo tome 1,5 mL de agua destilada y adicione 1,5 mL de reactivo de Biuret. Mezcle bien y calibre el espectrofotómetro. b) En otro tubo de ensayo adicione1,5mL de leche y 1,5 mL del reactivo de Biuret, mezcle bien y mida la absorbancia. Tenga en cuenta la curva de calibración que obtuvo en la práctica anterior. Si la absorbancia es mayor a los valores de la curva, haga diluciones hasta que obtenga un valor de absorbancia en el rango de la curva de calibración. Para hacer las diluciones use la fórmula V1C1=V2C2. Anote los datos de las diluciones para que los tenga en cuenta para calcular la concentración de proteínas totales en la leche. 3.2.

Fraccionamiento de las proteínas de la leche:

a) Precipitación de caseína por punto isoeléctrico.

 Tome 20 mL de leche en un vaso de precipitados y mida el pH.  Agregue lentamente pequeñas alícuotas de HCl, agite con agitación magnética, hasta obtener un pH de 4,7. Registre las observaciones del efecto del pH sobre las propiedades de la leche(suspensión de proteínas en agua).  Filtre el precipitado usando un embudo de vidrio sinterizado. Pese el embudo antes de la filtración y el embudo con las caseínas (después de la filtración). Tenga en cuenta estos pesos para determinar la concentración de caseínas totales en la leche (%).  Mida el volumen del sobrenadante y téngalo en cuenta para determinar el % de las proteínas de la leche que son solubles a pH de 4,7. b) Determinación de la concentración de proteínas solubles (presentes en el sobrenadante).  Tome 1,5 mL del sobrenadante y 1,5 mL del reactivo de Biuret, mezcle bien y mida la absorbancia. Tenga en cuenta la curva de calibración que obtuvo en la práctica anterior. Si la absorbancia es mayor a los valores de la curva, haga diluciones hasta que obtenga un valor de absorbancia en el rango de la curva de calibración. Para hacer las diluciones use la fórmula V1C1=V2C2. Anote los 17


datos de las diluciones para que los tenga en cuenta para calcular la concentración de proteínas solubles totales en la leche. c) Precipitación salina de las proteínas solubles (presentes en el sobrenadante) Haga precipitación con sulfato de amonio al 20%, 40%, 60% y 80%. A cada grupo se le asignará dos concentraciones salinas. Para realizar la precipitación salina tome 10 mL de la solución de proteínas solubles (leche sin caseínas, o lo que es lo mismo el sobrenadante de la precipitación de las caseínas). Para calcular el volumen de la solución saturada de sulfato de amonio que debe adicionar a los 10 mL, suponga que la concentración de la solución saturada de sulfato de amonio es del 100% y utilice la fórmula: Ci * Vi = Vf * Cf . En este caso tendríamos 100% x Vi = (10mL + Vi) x Cf . Donde Cf es la concentración final de sulfato de amonio deseada, y Vi es el volumen de la solución saturada de sulfato de amonio. Nota: “Es como si diluyéramos la solución salina con la leche”. Ejemplo para obtener una concentración de sulfato de amonio del 10% (100%)(Vi) = (10mL + Vi)(10%) Vi = 1,1 mL Ahora, haga el cálculo del volumen necesario para obtener la concentración de sulfato de amonio que le correspondió a su grupo y que deberá adicionar a los 10 mL de la solución de proteínas de la leche solubles a pH 4,7. Tome el volumen de sulfato de amonio calculado y adiciónelo a los 10 mL de las proteínas solubles de la leche, agite lentamente y centrifugue al máximo de rpm (revoluciones por minuto) durante 15 minutos. Para esto vierta la solución en tubos de centrífuga, balancéelos (es decir, use un número par de tubos y adicione a todos el mismo volumen) y luego introdúzcalos en la centrífuga, seleccione el tiempo y el número de rpm y centrifugue. Cuando se detenga la centrífuga, retire los tubos y tome 1,5 mL del sobrenadante y adicione 1,5 mL de Biuret, agite y mida la absorbancia. Tenga en cuenta la curva de calibración que obtuvo en la práctica anterior. Si la absorbancia es mayor a los valores de la curva, haga diluciones hasta que obtenga un valor de absorbancia en el rango de la curva de calibración. Para hacer las diluciones use la fórmula V1C1=V2C2. Anote los datos de las diluciones para que los tenga en cuenta para calcular la concentración de proteínas solubles, a la concentración de sulfato de amonio que Ud. utilizó. 3.3. Análisis de resultados Presente los datos de concentración de proteínas totales, proteínas solubles a pH 4,7, proteínas en el sobrenadante de las precipitaciones utilizando 20%, 40%, 60% y 80% de sulfato de amonio obtenidas a partir de leche entera de bovino. Incluya los cálculos que Ud. realizó para obtener las diferentes concentraciones de proteína (tenga en cuenta las diluciones). Incluya la gráfica de la curva de calibración que utilizó. Diga qué proteínas están presentes en el sobrenadante de la precipitación a pH 4,7 y porqué. Diga qué proteínas estarían presentes en cada uno de los sobrenadantes de la precipitación salina con sulfato de amonio (20%, 40%, 60% y 80%). Explique el porqué de estos resultados. Haga un análisis y discusión de los resultados.

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Manual de laboratorio de Bioquímica, Código 24726, Profesora Martha Cecilia Daza Espinosa 5. BIBLIOGRAFÍA

1. Jenness J. 1980. Composition and characteristics of goat milk: Review 1968-1979. Journal of Dairy Science63(10): 1605-1630. 2. Lonnerdal B. y Forsum E. 1985. Casein content of human milk. American Journal of Clinical Nutrition41(1): 113-120. 3. Ribadeau-Dumas B yGrappin R. 1989. Milk protein analysis. Le Lait 69 69(5): 357-416. 4. Park Y.W., Juárez M., Ramos M. y Haenlein G.F.W. 2007. Physico-chemical characteristics of goat and sheep milk. Small RuminantResearch68(1-2): 88–113. 5. Willamson M.B. 1944. The amino acid composition of human milk proteins. Journal of Biological Chemistry156(1): 47 - 52. ab 6. Farrell H.M, Jimenez-Flores R, Bleck G.T, Brown EM, Butler JE, Creamer LK, Hicks CL, Hollar CM, Ng-Kwai-Hang KF y Swaisgood HE. 2004. Nomenclature of the Proteins of Cows’ Milk— Sixth Revision. Journal of Dairy Science '87'(6): 1641-1674. 7. Kunz C y Lonnerdal B. 1989. Human milk proteins: separation of whey proteins and their analysis by polyacrylamide gel electrophoresis, fast protein pro tein liquid chromatography (FPLC) gel filtration, and anion-exchange chromatography. American Journal of Clinical Nutrition 49(3): 464-470. 8. Van Hekken D.L y Thompson MP. 1992. Application of PhastSystem® to the resolution of bovine milk proteins on urea-polyacrylamide gel electrophoresis. Journal of Dairy Science '75'(5): 12041210. 9. Swaisgoo H.E. 1993. Review and update of casein chemistry. Journal of DairyScience76(10): 3054-3061 10. Bernal C.A. 2009. Purificación de inmunoglobulinas de suero de leche por técnicas cromatográficas. Trabajo de grado, Escuela de Química, Universidad Industrial de Santander.

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Práctica 5. Determinación de la actividad enzimática de la

peroxidasa extraida de hojas de palma africana y su inhibición por el efecto de la temperatura. 1. OBJETIVO El primer paso en el estudio de una enzima en indeterminado material biológico suele ser comprobar que efectivamente dicha enzima esta presente en el material. Para ello hay que poner de manifiesto que realmente existe su actividad catalítica, y que dicha actividad es debida a una proteína. El objetivo de esta práctica es extraer en solución la enzima de una planta y cuantificar su actividad a diferentes diluciones. 2. FUNDAMENTO. La peroxidasa es una enzima que cataliza la oxidación de un amplio número de sustratos orgánicos e inorgánicos, utilizando el poder oxidante del peróxido de hidrógeno (el cual es el sustrato). Es utilizada ampliamente en bioquímica clínica. Así, los ensayos para la determinación y cuantificación de metabolitos como glucosa, ácido úrico, colesterol otriglicéridos en fluidos biológicos usan peroxidasa como enzima acoplada. También seutiliza en inmunoensayos para la detección de virus tan conocidos como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) causante del SIDA o el herpesvirus. La peroxidasa también se utiliza como biocatalizador para la generación de productos de interés biotecnológico e industrial como resinas fenólicas, adhesivos, antioxidantes, antiestáticos y protectores de radiación magnética, colorantes alimentarios y componentes bioactivos de detergentes. En este experimento, para analizar la actividad de la enzima se utilizara la solución extraída de la planta y reaccionara con soluciones de H2O2. La enzima descompone el peroxidoy libera O2 libre que reacciona con un compuesto (Guayacol) que al oxidarse forma una solución coloreada (Tetraguayacol) y de esta forma puede ser detectado a una longitud de onda en el rango visible. Consulte que funciones desempena esta enzima en plantas y una aplicación industrial de la enzima e inclúyalo en su preinforme. 3. MATERIALES Y REACTIVOS. Solución extractora: Buffer fosfato 60 mM, NaCl 0.1 M pH 7.0 Solución de peroxidasa: Picar 2 gramos de hoja de palma africana y homogenizar con 20 ml de la solucion extractora en licuadora durante 2‐3 minutos, incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego centrifugar a 5000 rpm durante 15 minutos. Usar el sobrenadante como solucion de peroxidada Buffer fosfato 10 mM pH 6.0 para preparación de soluciones de sustratos. Solución de sustratos: Disolver 10 ul de peroxido de hidrogeno (30%) y 40 ul de guayacol en 20 ml de buffer fosfato pH 6.0 4. PROCEDIMIENTO Preparar en 5 tubos de ensayo 100 ul de la solución de peroxidasacada una de las siguientes diluciones: ½, 1/5, 1/10, 1/25, 1/50.

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Manual de laboratorio de Bioquímica, Código 24726, Profesora Martha Cecilia Daza Espinosa Llevar con una pipeta 3 ml de la solución de sustrato a la celda del espectrofotómetro, colocar la longitud de onda a 470 nm y calibrar la absorbancia a cero con esta solución. Para realizar las lecturas de absorbancia adicione primero 100 ul de la solucion de peroxidasa (5 experimentos, 1 para cada dilucion) a la celda, inmediatamente adicione 3 ml de solución de sustrato y registre el valor de la absorbancia cada 15 segundos por un periodo entre 3‐5 minutos. Dibuje una grafica para los 5 experimentos de absorbancia VS tiempo. Determine la actividad de la peroxidasa sabiendo que el coeficiente de extinción molar a 470 nm del tetraguayacol es 5200 M‐1 cm‐1. Utilice la siguiente ecuación: Act= ( m(3.1)(60)(1x103))/ 5200 donde m = pendiente de la grafica para cada experimento de dilución de peroxidasa 3.1 = volumen total en ml de la solución en la celda del espectrofotómetro 60 = factor de la pendiente de segundos a minutos 1x10‐3 = factor de mmol a umol para el valor de M del coeficiente de extinción. Determinar la concentración de proteína utilizando el método de Biuret (con estandares de BSA). Utilizar los valores de concentración de proteína para mirar el comportamiento y elucidar un valor aproximado para la actividad especifica de la enzima. EFECTO DE LA TEMPERATURA EN LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA. 1. Seleccionar una de las diluciones de la enzima del experimento anterior. 2. Adicionar 1 ml de esta dilución a un tubo de eppendorf, taparlo y calentarlo en un baño a 95°C. 3. Sacar 0.1 ml de esta solución a los 0, 5, 10, 15, 30 minutos de incubación y enfriarlos inmediatamente en un vaso con hielo. 4. Realizar el experimento que se hizo anteriormente con esta dilución para determinar la actividad de la misma forma que lo anterior para cada valor de tiempo. De los datos obtenidos compare los valores de actividad para la enzima sin calentar y al calentar la dilución a cada tiempo. Literatura Sakharov Y. I., Bautista A. G., Sakharova V. I., Rojas A. &Pletjuschkina Y. O.(1999) Peroxidasa de plantas tropicales Revista colombiana de química. 28, 1 :45‐60. Rev.Colomb.Quim. v.38 n.3 Bogotá sep./dic. 2009 21


Práctica 6. ANÁLISIS CUALITATIVO DE CARBOHIDRATOS Introducción Los carbohidratos son los compuestos orgánicos más abundantes de la biosfera y a su vez los más diversos. Son constituyentes estructurales de los vegetales y también de los tejidos animales y la principal fuente de energía y de esqueletos carbonados de los seres vivos. Según el número de moléculas, los carbohidratos pueden dividirse en cuatro grandes grupos: 1. Monosacáridos: Pentosas

-

Xilosa (madera), D‐ribosa y D‐desoxiribosa(ácidos desoxiribosa(ácidos nucléicos), y arabinosa (gomas, mucílagos y pectinas que normalmente ingerimos dentro de mermeladas y dulces) Hexosas (son 24 pero, solamente 4 tienen importancia biológica). D‐glucosa presente en los frutos maduros y en todas las células. D‐manosa siempre aparece combinada, nunca libre. D‐galactosa asociada con lípidos complejos, puede ser convertida en glucosa en el hígado. D‐fructosa se encuentra en la miel y en los jugos los jugos de frutas. Tiene un sabor muy dulce. 2. Disacáridos se subdividen en maltosa, lactosa y sacarosa. Maltosa presente en la malta o cebada germinada y es muy soluble en agua. Lactosa: Es el azúcar de la leche y es poco soluble en agua. Sacarosa: Es el azúcar de mesa, se obtiene de la caña de azúcar y de la remolacha, y es muy soluble en agua. 3. ‐ Oligosacáridos: trisacáridos: la rafinosa se encuentra en las legumbres.

-

Tetrasacáridos: estaquiosa, el más estudiado, se encuentra en las semillas de soja.

4. ‐ Polisacáridos:

-

Almidón: está constituido por dos polímeros de D‐glucosa, uno lineal la amilosa y el otro ramificado, la amilopectina. La amilosa es un polímero lineal formado por 250‐300 unidades de ‐D‐glucopiranosa, unidas exclusivamente por enlaces  (14). La amilosa se disuelve fácilmente en agua adquiriendo una estructura secundaria característica, de forma helicoidal, en la que cada vuelta de la hélice tiene 6 unidades de glucosa. La amilopectina es un polímero ramificado compuesto por unas 1000 unidades de ‐D‐ glucopiranosa. Además de las uniones  (14) contiene uniones  (16). Las uniones  (16) están regularmente espaciadas (cada 25‐30 residuos de glucosa), y son los puntos por donde se ramifica la estructura. Cada rama contiene únicamente uniones  (14).

-

Glucógeno: es un polímero de moléculas de D‐Glucosa unidas por enlaces  (14) y  (1 6), presente en hígado y en los músculos. Es un polisacárido de reserva de las células animales y ayuda controlar los cambios de presión osmótica que la glucosa libre podría ocasionar en la célula.

-

Celulosa: Es el principal componente de la pared celular de los vegetales. Se puede considerar como la molécula orgánica más abundante en la Naturaleza. Es un polímero lineal de varios miles de glucosas unidas por enlaces  (14).

-

Inulina: Aparece en los tubérculos de dalia, ajos y cebollas. Liquenina: presente en los musgos y líquenes.

-

Mucopolisacáridos: Cumplen función de sostén, nutrición y comunicación intercelular.

22


Objetivos 1.

Explorar la diversidad de la química de los carbohidratos

2.

Identificar cualitativamente azúcares reductores, pentosas, cetosas, monosacáridos y polisacáridos. y el azúcar presente en un hidrolizado de polisacárido (problema).

3.

Diferenciar cualitativamente almidón de celulosa.

Procedimiento 1.

Consulte y escriba y escriba las reacciones químicas entre los carbohidratos que utilizará en la práctica la práctica y los y los indicadores que empleará para empleará para su detección cualitativa.

2.

Identificación cualitativa de monosacáridos y disacáridos y disacáridos

Tome 4 tubos de ensayo y etiquételos con los números del 1 al 4. Adicione a cada uno de lo tubos 2 mL de los diferentes reactivos: Barfoed, Benedict, Seliwanoff y Seliwanoff y Bial. Adicione 0,5 mL de glucosa a cada tubo, mezcle bien y colóquelos en un baño de agua hirviente por 5 a 10 minutos y registre la formación de color y el tiempo requerido para su aparición. Lave bien los tubos, séquelos y repita el procedimiento anterior, pero ahora con fructosa y vuelva a lavar los tubos, a secarlos y repita el procedimiento con lactosa, sacarosa, pentosa, almidón y celulosa. Haga una tabla con los 28 datos correspondientes a los 6 carbohidratos y a las 4 pruebas, analice sus resultados y discútalos teniendo en cuenta la química de los diferentes carbohidratos y plantee la reacción indicadora del tipo de carbohidrato. 3.

Diferenciación cualitativa de celulosa y almidón y almidón

Observe el aspecto físico de la celulosa y del almidón y de sus soluciones al 1% y registre sus observaciones.



Determine la solubilidad en agua caliente.



Determine los productos de hidrólisis con amilasa salival. Para esto tenga en cuenta la información de la siguiente tabla: Tubo

1

2

3

4

Celulosa (mL)

1

1

1

1

Almidón (mL) α

-amilasa (mL)

0,5

Benedict *(mL)

0,5

Lugol, I2/KI, (mL)

0,5

-

-

0,5 0,5

-

5

6

7

8

1

1

1

1

0,5

0,5

-

-

0,5 0,5

0,5 0,5

-

0,5

*Coloque los tubos en un baño de agua hirviente por 5 a 10 minutos y registre la formación de color y el tiempo requerido para su aparición. 23

Manual de laboratorio de Bioquímica, Código 24726, Profesora Martha Cecilia Daza Espinosa Con base en los resultados, diga cuál de los dos polvos blancos es celulosa y cuál es almidón. Explique. Determine cuáles de los carbohidratos estudiados son monosacáridos, disacáridos, agentes reductores, cetosas y pentosas. Analice e interprete sus resultados. Elabore un informe de la práctica e incluya una respuesta a: 1. ¿En qué forma se encuentran lo carbohidratos en las células animales? 2. Mencione el nombre y la función de 3 carbohidratos presentes en las células animales. 3. Incluya las reacciones para cada una de las pruebas utilizadas en el laboratorio.

Materiales y reactivos Reactivos: Barfoed (monosacáridos) Benedict (azúcares reductores) Seliwanoff (cetosas) Seliwanoff (cetosas) Bial (pentosas) Lugol (Yoduro al 1%: KI al 2%) Soluciones al 1% de glucosa, fructosa, lactosa, sacarosa, una pentosa, almidón y celulosa (carboximetilcelulosa). Alfa amilasa salival Material Tubos de ensayo (por lo menos 4) Gradilla Pipetas Baño termostatado

Bibliografía 1.

Morrison, R.T., Boy, R.N. 1998. Química Orgánica. Addisson Wesley, México.

2.

Volhart, K. P. 1.987. Organic Chemistry. W.H. Freeman and Company, N.Y.

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Manual de laboratorio de Bioquímica, Código 24726, Profesora Martha Cecilia Daza Espinosa 3.

Dotti, L.B.,Kleiner, I.S. 1962. Laboratory Instructions in Biochemistry.The C.V. Mosby Company.

Sacarosa: Glucosa + fructosa Lactosa: Galactosa + glucosa Benedict: Precipitado rojo ladrillo positivo para azúcares reductores. Glu, Fru, Xyl, EL reactivo tiene una coloración azul claro. Barfoed precipitado rojo ladrillo positivo para monosacáridos, si se calienta demasiado da falso positivo con disacáridos. El reactivo tiene una coloración azul claro Bial positivo para pentosas color azul verdoso. La solución tiene una coloración amarilla. Seliwanoff positivo Seliwanoff positivo para cetosas color rojo. La solución es transparente

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Práctica 7. ASPECTOS GENERALES DE LAS ENZIMAS: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE ENZIMA, DE LA TEMPERATURA Y DEL pH SOBRE LA HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN

4. INTRODUCCIÓN. La mayoría de las enzimas son catalizadores biológicos de naturaleza proteínica. El ARN también presenta actividad catalítica, estas moléculas son denominadas ribozimas. Las enzimas están presentes en todas las células vivas, en todos los tejidos y en todas las estructuras subcelulares. Las enzimas son macromoléculas cuya estructura secundaria, terciaria y cuaternaria depende de las interacciones no covalentes (puentes de hidrógeno, fuerzas de London, par iónico e interacciones hidrofóbicas). Puesto que la actividad de las enzimas depende de su estructura es importante mantener su conformación nativa (estructura activa) mediante un estricto control del pH, la fuerza iónica, los agentes quelantes y la temperatura. Cada enzima tiene un conjunto de valores “óptimos” para estos parámetros. Además cada enzima se caracteriza por tener unos parámetros enzimáticos característicos. Parámetros enzimáticos

1. Km (constante de Michaelis-Menten, es única para cada enzima) = concentración de sustrato (S) a la que la V oes 1/2 Vmáx. Bajo ciertas circunstancias que dependen del tipo de enzima, la K m es una medida de la afinidad del enzima por S. Cuanto menor es Km, mayor es la afinidad de la enzima por S. 2. K cat (constante para cada enzima) = número de recambio = número de moléculas de sustrato convertidas en producto por molécula de enzima y unidad de tiempo, en condiciones de saturación de sustrato. 3. Vmax = velocidad máxima teórica = la velocidad cuando todos los centros activos están ocupados con sustrato (nunca alcanzada en la realidad). 4. Unidad de enzima = cantidad de enzima que transforma 1 µmol de sustrato por min = una forma común de expresar la velocidad. 5. Actividad específica = unidades por mg de proteína total de la preparación enzimática.

Factores que afectan la cinética enzimática

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Man al de labor torio de Bioquímica, Código 24726, Profesora

artha Cecil a Daza Espinosa

a velocid d de las r eacciones catalizad s por enz imas dep nde de v rios facto es, tales omo: H, tempe atura, concentració de sustr to y de pr ducto, pr sencia d cofactore s, presen ia de i hibidores , modulación alostér ica, modifi cación co alente y p roteólisis. fecto del p H sobre la ctividad e zimática

as enzimas posee grupos químicos ionizables (carboxil s -COO ; amino NH2; tiol -SH; i idazol, tc.) en la s cadena laterales de sus minoácid s. Segú el pH d l medio, estos rupos pu den tene carga el ctrica po itiva, neg tiva o neutra. Como la conf rmación e las roteínas epende, n parte, e sus car gas eléctr icas, habr un pH e n el cual l a conform ación erá la má adecuada para la ctividad c talítica, este es el ll amado pH óptimo. a mayorí de los nzimas s n muy s nsibles a écimas p r encima o por deb jo del pH óptimo p l pepsina gástrica ti ne un pH óptimo d 2, la ure 10 (Figura 1). Como ligeros ca bios del H puede l s seres v ivos han esarrolla o sistemas más o i tracelular : Los amo rtiguadore s fisiológic os.

los cambios de pH. Desviaciones de ocas eden afe tar drásti amente s actividad . Así, sa lo tien e a pH 7 la argina a lo tiene a pH provocar la desnat uralizació de la pro eína, enos complejos par a manten r estable el pH

fecto de la temperatu a sobre la ctividad e zimática

n general , los aum ntos de t emperatur a acelera las reac iones qu micas: por cada 10 C de i cremento , la veloci dad de re cción se uplica. L s reaccio es catali adas por nzimas siguen sta ley g neral. Si embargo, al ser pr oteínas, a partir de cierta te peratura, se empie an a esnaturali zar por el calor. La temperat ra a la c al la acti idad catalítica es máxima se llama temperatur a óptima Figura 1). Por enci a de est temperat ura, el aumento de velocidad de la r eacción d bido a la emperatu ra es cont arrestado por la pér dida de a tividad ca alítica de ida a l desnatu alización t érmica, y la activida enzimáti ca decrec rápidam nte hasta anularse.

Figura 1. Efecto del pH y de la temperatura sobre la activid d enzimá ica oncentrac ón de sustr ato

a velocid d de una reacción nzimática depende de la con entración de sustra o. Ver fig ra 2. bserve el efecto de diferente concentr ciones de sustratos .

27



l estudio de las en imas es n campo de la biot cnología que avan a cada dí a, con el in de ncontrar ejores y nuevas s luciones ara proc sos y productos en la indust ia y en la bio r emediació n ambiental (eliminación de re siduos tóxicos del a iente). as enzimas se uti lizan am liamente en la industria: alimenticia umana animal, textil, f armacéuti a, papelera, del cu ro, en la f bricación de deterg entes más eficientes . a α-amila sa es una enzima resente en todos lo s organis os que ueden uti lizar el al idón omo fuen e de gluc sa. La α- milasa c taliza la h idrólisis d los enlac es glucosí dicos α (1 4) ntre las s bunidade s de gluco sa del almidón.

P R O D U

Tiem

igura 2. E fecto de l concentr ción de s ustrato so re la ciné tica enzimática. a velocid d de hidr lisis del almidón po la α-amil sa puede determin rse por la disminuci n de l concent ación de sustrato ( lmidón) o por el au mento en la concentración de producto ( -D- -D- altosa) ediante la reacci n de lucopirano il- (1,4)- -glucopira osa, nom re común de la ehling pa a azúcares reducto es.

28


5. Objetivos 1. Conocer el efecto de los cambios de pH y de la temperatura sobre la actividad enzimática. 2. Someter una muestra cruda de α-amilasa de origen humano a cambios en el pH y la temperatura para determinar el efecto en sus parámetros cinéticos. Tabla 1. Test del lugol para el almidón y sus hidrolizados.

Almidón y sus hidrolizados

Coloración de la Reacción.

Almidón

Azul

Amilodextrinas

Violeta

Eritrodextrinas

Rojo

Acrodextrinas

Amarillo ( No reacción )

Maltodextrinas

Amarillo ( No reacción)

Maltosa

Amarillo ( No reacción )

6. Procedimiento 2. Comparación de la hidrólisis enzimática y no enzimática del almidón.

TUBO Ácido clorhídrico

1

2

2,0mL

-amilasa sali alival (en (enzima)

4

5

6

2,0mL 2,0mL 0mL

α

Agua Almidón (sustrato)*

3

2,0mL 2,0mL

2,0mL

2,0mL 2,0mL 2,0mL 2,0mL 2,0mL 2,0mL

Temperatura de incubación (ºC)

38

38

38

100

100

100

Tiempo de incubación (minutos)**

5

5

5

5

5

5

NOTA: AGITE BIEN LOS TUBOS ANTES DE INCUBARLOS. Incube los tubos a la temperatura indicada durante 5 minutos con el almidón antes de adicionar la enzima o el HCl.

29


**Al finalizar el tiempo de incubación enfríe los tubos a temperatura ambiente y realice el test de lugol y de Fehling. Test de lugol.

Tome 1 mL de muestra de cada uno de los tubos del experimento y añada 1 gota de lugol. Anote la coloración de cada tubo y explique sus observaciones. Un cambio en la coloración del lugol a azul oscuro, o violeta oscuro o marrón oscuro es indicador de presencia de almidón. Test de Fehling

Tome 3 mL de muestra de cada uno de los tubos del experimento y añada 1 mL de solución de Fehling (Fehling A y Fehling B). Lleve a ebullición durante 3 minutos. Observe la formación de óxido de cobre rojo. Anote la coloración de cada tubo, y explique sus observaciones. La presencia del precipitado de óxido de cobre es indicador de la presencia de azúcares reductores.

2. Determinación de la cinética enzimática de la amilasa salival. La determinación del efecto de la concentración de enzima, del pH y de la temperatura sobre la actividad enzimática de la amilasa salival se evaluará mediante la hidrólisis de almidón utilizando el test de lugol (I 2/KI). 2.1. Relación entre la tasa de reacción y la concentración de la enzima. Prepare diluciones al 40, 60 y 80% de la muestra de saliva con agua destilada. En cuatro tubos de ensayos prepare las siguientes reacciones: TUBO

1

-amilasa salival (enzima) al 40%

2

3

4

2mL

α


2mL

α


2mL

α

-amilasa salival (enzima) sin diluir

2mL

α

Almidón (sustrato) Incube a 38ºC Reactivo indicador (I2/KI)**

5

4mL

2mL

2mL

2mL

2mL

*

*

*

*

*

1 gota

1 gota

1 gota

1 gota

1 gota

*NOTA: Cada minuto, tome 1 mL de cada tubo y agréguele 1 gota de Lugol, anote sus observaciones. Observe el cambio gradual de la reacción del azul, al azul rojizo y finalmente al 30


rojo. En la tabla 1 se encuentran los nombres de los productos de la reacción de la alfa-amilasa (E) con el almidón (S) y su coloración respectiva. Relacione las diferentes velocidades de formación de las eritrodextrinas con la concentración de α-amilasa presente en cada tubo de reacción, y explique cuál es el efecto de la concentración de la enzima sobre la cinética enzimática. Si sus resultados no son conclusivos, discuta con base en lo que esperaría de acuerdo con el comportamiento de las enzimas. 2.2 Efecto de la temperatura sobre la tasa de reacción enzimática.

Para evaluar el efecto de la temperatura sobre la actividad de la enzima prepare en tres tubos diferentes, las siguientes reacciones: TUBO

1

2

3

α

-amilasa salival (enzima)

1,5mL

1,5mL

1,5mL

Temperatura* (5 minutos)

100ºC

38ºC

0ºC

Almidón (sustrato)

1,5mL

1,5mL

1,5mL

3 minutos

3 minutos

3 minutos

1gota

1gota

1gota

Tiempo de incubación Reactivo indicador (I2/KI)

* Enfríe la solución enzimática del tubo 1(colóquelo dentro de hielo) y adicione el sustrato a los tres tubos, de manera simultánea o con pequeñas diferencias de tiempo. Espere 3 minutos y adicione el reactivo indicador. Observe las diferencias de color en los tres tubos. Relacione los diferentes productos formados con las temperaturas evaluadas. Discuta los resultados. 2.3 Efecto del pH en la hidrólisis del almidón.

Para evaluar el efecto de la temperatura sobre la actividad de la enzima prepare en tres tubos diferentes, las siguientes reacciones: TUBO Buffer pH 5

1

2

1mL

Buffer pH 7

1mL

Buffer pH 9 -amilasa salival

α

3

1mL 1,5mL

1,5mL 31

1,5mL


Almidón (sustrato)

1,5mL

1,5mL

1,5mL

Temperatura de incubación

38ºC

38ºC

38ºC

Mantenga la enzima con el buffer dos minutos y luego adicione el sustrato y agite bien los tubos. Tome 1 mL de la mezcla enzima – sustrato, cada 1 o 2 minutos, y adicione una gota de lugol y registre sus observaciones. Haga una grafica de pH versus tiempo de aparición de los distintos productos de la acción de la enzima. Discuta sus resultados.

7. Materiales y reactivos Solución de almidón al 0,5% en una solución de 0,3 % de NaCl Lugol (I2/KI), reactivo indicador para almidón Solución de Fehling. Solución de saliva: Para su preparación, enjuague bien la boca. Tome 20 mL de agua destilada y

manténgalos en la boca por 2 min. Homogeneizando con la lengua. Después de esto deposite la mezcla en un vaso de precipitados prec ipitados y fíltrela a través de papel de filtro. Solución de Ácido clorhídrico al 10 % Buffer fosfato citrato 0,1 M, pHs 5, 7, y 9,0 Baños termostatizados Tubos de ensayo Gradillas Varillas de vidrio Termómetro Pipetas

8. Bibliografía Stroev E.A. V.G. Makarova. 1989. Laboratory Manual in Biochemistry. Mir Publishers. Moscow.

32


Práctica8.EXTRACCIÓN E IDENTIFICACIÓN CUALITATIVA DE LÍPIDOS 1. Introducción. Los estéridos son lípidos simples, se dividen en esteroles y esteroides, y están ampliamente distribuidos en plantas y animales: Los esteroles son estéridos que tienen una o varias funciones hidroxilo, por ejemplo, el colesterol, que se encuentra en la bilis, el cerebro, las suprarrenales, el tejido intersticial del testículo, etcétera. La molécula tiene una dimensión de 20 Å de longitud y 7 a 7,5 Å de anchura por 5 Å de espesor. El colesterol puede estar en estado libre o esterificado (por ejemplo como un éster de los ácidos palmítico, esteárico, u oleico). El tejido nervioso es especialmente rico en colesterol, donde el colesterol alcanza concentraciones de 20‐30 g por kg de tejido; las concentraciones más altas de colesterol (40‐55 g/kg) han sido reportadas en la materia blanca y en la médula espinal. Los esteroides son estéridos que contienen una o varias funciones carbonilo o carboxilo. Por ejemplo, las hormonas sexuales (estradiol, segregado por la teca de los folículos; la progesterona, segregada por el cuerpo amarillo o lúteo; la testosterona, elaborada por las células intersticiales del testículo), las hormonas de la corteza suprarrenal y la vitamina D son esteroides. Los esteroles vegetales o fitoesteroles, incluidos el ergosterol, el estigmaestol, los B sitoesteroles y los fucoesteroles están presentes en aceites vegetales, frutos y algas. El colesterol puede extraerse de muestras biológicas con cloroformo, etanol caliente, éter dietílico, acetona, y otros solventes orgánicos. Es común la práctica de usar una mezcla de solventes orgánicos en su extracción. Cuando está inmerso en agua el colesterol se hincha y forma una emulsión. Al contrario de otros lípidos el colesterol no esta sujeto a la precipitación por agentes alcalinos. Se trata de un lípido muy poco soluble en agua, pero extremadamente soluble en sangre (la concentración de colesterol en el plasma de individuos sanos es normalmente de 150‐200 mg/dL, lo cual constituye el doble de la concentración de glucosa sanguínea normal). Esto es explicable debido a la presencia de unas proteínas llamadas lipoproteínas plasmáticas (principalmente LDL y VLDL) que poseen la capacidad de fijar y por tanto solubilizar grandes cantidades de colesterol. Las lecitinas que son ésteres del fosfo‐gliceraldehído y de ácidos grasos y colina (lípidos complejos). Las funciones alcohólicas son esterificadas por un ácido graso R‐COOH, mientras que el ácido fosfórico es esterificado por la colina. Las lecitinas se encuentran en la mayor parte de las células vivas, siendo un componente importante de las membranas celulares.

2. Objetivos 1. Extraer y caracterizar la lecitina y el colesterol de yema de huevo. 2. Determinar cualitativamente la presencia de colina, fosfatos y glicerol en un hidrolizado de lecitina.

3. Procedimiento



Extracción de lípidos totales

33



a) Identificación e colester l eactivo de LibermanBurchard ome 2 mL del sobrenad nanteen un tubo de en ayo y añad 10 gotas d anhídrido cético y 2 g tas de ácid sulfúrico concentrado, la aparición d una colora ión verde es indicadora de la prese cia de colesterol. eacción de alkowski ida 1 mL d l sobrenadanante en un tubo de en ayo, incline el tubo y deslice por su pared interna un volum n i ual de ácid sulfúrico c ncentrado, cuidando q e los líquid s no se mezclen. Obser e la formación de un anillo coloreado en la interfase.

b) Des ués de pes do el preci pitado de l citina, dis élvalo nue amente con 6 mL de na mezcla de etan l-éter 2:1 realice las siguientes pruebas: I entificació

de fostatos

ome 1 mL de la disoluci n de lecitina y adicione 1 mL de áci o molíbdic , agite, deje 3 minutos en reposo. dicione 1 mL de solución de ácido ascórbico observe la formación de un color azul.

34

Manual de laboratorio de Bioquímica, Código 24726, Profesora Martha Cecilia Daza Espinosa Detección de colina Tome 1 mL de la disolución de lecitina y caliente suavemente en un mechero o en un baño de agua hirviente. La trimetilamina liberada se caracteriza por un olor a pescado Identificación de glicerol Tome 2 mL de la disolución de lecitina + 2 mL de agua de bromo. Calentar en vitrina para expulsar el exceso de bromo. Tomar 0,4 mL de esta solución + 0,1 mL de solución de naftol al 5% en etanol, agitar. Adicionar 40 gotas de ácido sulfúrico. Calentar 2 minutos en baño maría, enfriar. Observar la aparición de coloración verde.

Cálculos y expresión de resultados Incluya en el informe: Porcentaje de lípidos totales Porcentaje de lecitina referida a la yema de huevo y a los lípidos totales Porcentaje de colesterol referido a la yema de huevo y a los lípidos totales Interprete con reacciones los resultados obtenidos en las pruebas realizadas para la identificación de los diferentes productos obtenidos.

4. Materiales y reactivos.

Extracción de lípidos y análisis de lecitina Yema de huevo cocida Mortero Baño maría Vasos de precipitados Erlenmeyer Varilla de vidrio Pipetas Probeta Balanza Tubos de ensayo Embudo y papel de filtro Mezcla etanol‐éter 2:1 Mezcla cloroformo‐etanol 2:1 Agua de bromo 2‐naftol al 5% en etanol Ácido sulfúrico concentrado Ácido molíbdico Ácido ascórbico 1 mg/mL recién preparado 35


Análisis de colesterol Anhídrido acético Ácido sulfúrico concentrado Preguntas de consulta 1. ¿Qué es saponificación? 2. ¿Es saponificable el colesterol? Argumente su respuesta. 3. ¿Cuáles deben ser los valores promedio de colesterol total, triglicéridos y lipoproteínas (VLDL, LDL, HDL) en los humanos? ¿Son los mismos para todas las edades? 4. ¿Cuáles son las funciones del colesterol en los humanos? 5. ¿De cuáles compuestos es el colesterol un precursor? 6. ¿En qué órgano y a partir de que compuesto se sintetiza el colesterol en los humanos?

5. Bibliografía Bohinski, R.C. Bioquímica. 1991. Editorial Addison‐wesley. Ed. Iberoamericana..

Nelson, D. L., Cox, M. M..2000. Lehninger Principles of o f Biochemistry, Worth Publishers, Third Edition, N.Y. Stroev E.A. V.G. Makarova. 1989. Laboratory Manual in Biochemistry. Mir Publihsers.Moscow. Stryer, L. Bioquímica. 1.995. Editorial Reverté, Barcelona.

36


Prácticas 9 y 10: Extracción de ADN y estudio de algunas de sus propiedades 1. INTRODUCCIÓN En las células eucariotas, el ADN está presente en el núcleo, así como en mitocondrias y cloroplastos. En procariotas, el ADN se encuentra en el citoplasma celular. La molécula de ADN es el soporte material de los caracteres hereditarios de una especie y es trasmitida íntegramente a la progenie. Cada cromosoma eucariota contiene una sola molécula de ADN. Su masa molecular es enorme. El modelo de Watson y Crick explica las propiedades biológicas del ADN. La extracción de los ácidos nucléicos ADN y ARN de las células o de virus se hace teniendo en cuenta sus propiedades químicas. El ADN es insoluble en alcohol y en soluciones diluidas de NaCl, pero soluble en soluciones concentradas de NaCl y puede disociarse de las nucleoproteínas con un detergente o con fenol. Mientras que el ARN es soluble en soluciones diluidas de NaCl, insoluble en alcohol y también puede disociarse de las nucleoproteínas con un detergente o con fenol. La obtención de ADN o ARN puros puede hacerse por métodos cromatográficos: intercambio iónico, tamiz molecular, afinidad; electroforesis y ultra centrifugación en gradiente de densidad; o por hibridación. La obtención de ADN nativo es difícil debido al tamaño de la molécula y a la presencia de enzimas hidrolíticas. El ADN y el ARN absorben en el ultravioleta. Las bases nitrogenadas de los oligonucleótidos tienen un máximo de absorción a 260 nm. Usando una celda de 1 cm de paso de luz, el coeficiente de extinción del ADN a esta longitud de onda es de 20. Con base en este coeficiente de extinción, la absorbancia a 260 nm en una cubeta de cuarzo (1 cm) de una solución de 50 g/mL de ADN de doble hélices es igual a 1. Las proteínas tienen máxima absorción a 280 nm, debido principalmente a los residuos de aminoácidos aromáticos. La pureza del ADN extraído puede determinarse por el cociente entre la absorbancia a 260 nm y la absorbancia a 280 nm. Si el valor está entre 1,8 –2,0 el ADN está libre de contaminantes celulares. Valores inferiores indican contaminación con proteínas, fracciones de membrana o fenol, cuando ha sido utilizado para la extracción de las proteínas. El ADN se desnaturaliza fácilmente y debe trabajarse con cuidado para obtener un producto estructuralmente semejante al encontrado en la célula. Debe evitarse la tensión mecánica y condiciones físicas y químicas extremas y deben d eben inhibirse las nucleasas. Para extraer el ADN de una célula célula hay que romper sus membranas membranas plasmática y nuclear. nuclear. Esta ruptura puede hacerse por choque osmótico o un método mecánico. Las proteínas se disocian del ADN por acción de un detergente aniónico o sales concentradas. Se pueden usar agentes quelantes para remover los metales, especialmente Ca++ y Mg ++ que son cofactores de las ADN nucleasas. Las etapas anteriores a la separación de las proteínas debe hacerse lo más rápido posible y en frío. El pH se ajusta a valores medianamente alcalinos para disminuir la interacción electrostática entre las proteínas y el ADN. La proteína liberada puede extraerse con fenol o precipitarse por desnaturalización con cloroformo y alcohol isoamílico. Después de varias extracciones de la proteína, se adiciona etanol o propanol para separar la fase acuosa. El ADN precipita en fibras que pueden enrollarse en una varilla de vidrio y retirarse de la solución y transferirse a otro tubo. El ADN obtenido nunca tiene la longitud de las moléculas nativas en la célula; la manipulación provoca rupturas aleatorias. Si el ADN se ha manipulado 37


con cuidado, la longitud de los fragmentos serán aproximadamente la centésima parte de la longitud total del cromosoma. Factores que determinan la estructura del ADN

La estructura helicoidal del ADN se mantiene gracias a interacciones no covalentes. Por un lado, el apilamiento entre las bases adyacentes de una misma hebra favorece interacciones hidrofóbicas entre éstas, y por otro, cada base está unida a su pareja mediante puentes de hidrógeno, figuras 1y 2. La energía libre de las interacciones no covalentes que mantienen la estructura helicoidal del ADN no es muy superior a la energía de los movimientos térmicos a temperatura ambiente, por lo que es posible desestabilizar la estructura tridimensional del ADN mediante un simple aumento de la temperatura.

Fig. 1. Efecto de la temperatura sobre la estructura del ADN Cuando se calienta un ADN de doble hebra (forma nativa) se rompen las fuerzas de unión entre las dos hebras y acaban por separarse. Por tanto, el ADN desnaturalizado es de una sola hebra. La transición entre el estado nativo y el desnaturalizado se conoce como desnaturalización. En determinadas condiciones, una disolución de ADN monocatenario (desnaturalizado), puede volver a formar el ADN nativo (de doble hebra). Este proceso recibe el nombre de renaturalización del ADN. Cuando el ADN renaturalizado se forma a partir de moléculas de ADN de distinto origen, o entre una molécula de ADN y otra de ARN, la renaturalización se conoce como hibridación. El ADN también puede desnaturalizarse por cambios en el pH y en la fuerza iónica que afecten las interacciones que mantienen la estructura de la doble hélice. Fundamento de la extracción del ADN

Las principales etapas en el aislamiento del ADN son : ruptura de las células por choque osmótico, digestión enzimática o por un método mecánico suave, seguido del aislamiento del núcleo, mitocondrias, virus u otras estructuras subcelulares que contenga ADN. Posteriormente las proteínas se disocian del ADN por la acción de un detergente aniónico o sales concentradas. Con frecuencia se agregan agentes quelantes para remover los metales. El pH se ajusta a valores medianamente alcalinos para disminuir la interacción electrostática con el ADN. A DN. La proteína liberada puede extraerse con fenol o precipitarse por desnaturalización con cloroformo y alcohol isoamílico. Después de varias extracciones de la proteína se agrega etanol o propanol para separar la fase acuosa. La sal hidrofílica del ADN precipita en fibras que pueden enrollarse en un varilla de vidrio y sacarse de la solución. En este punto, la mayoría del ARN queda en solución. Si se repite el 38



rocedimie to se remueve más A N, polisa áridos y o ras impurezas: El tra amiento c n ribonucleasa o la sediment ción en un gradiente e densida en CsCl s n formas efectivas de remover la trazas de ARN. odas las e apas de la urificació deben conducirse de anera que se minimi e la hidrólisis por ADNasas (remover r pidamente las proteí as, mantener la solución fría trabajar ápidament ), por hidrólisis uímica (evite un pH i ferior a 2, y una te peratura s perior a 9 ºC) y por uptura hid odinámica (evite ipetear el ADN a través de orificios apilares y la agitación). Tam ién, se debe preve ir la esnaturali ación (ruptura de los puentes de hidróg no interc tenarios) or repulsión electro tática cuando se expone el DN a sales de conce tración menor a 0,0 M o a calentamient a temper turas superiores a 70ºC, o por cambio e la forma i nica de las bases (pH inferior a 3 o superior a 10).

ig. 2. Efe to de la te peratura sobre la est uctura del ADN 2.

MATERIALES

REACTI OS

xtracción del ADN ortero; erlenmeyer con tapa; tu os de vidrio para cen rífuga; ter ostato; ce trífuga; células de le adura de germe de trigo; arena lava a; NaCl 1 en EDT 0,1M pH 8,0; SDS a 25%; perclorato de s dio o e potasio 6M (sobres turado); m zcla clorof ormo: alco ol isoamílico (24:1 v/ ); etanol. olución s ock de A N aCl 0,15%; espectrof tómetro UV. fecto del H uffer bora o 0,05M, diferentes p

en el ran o 8,5 a 12,5

fecto del calentami nto y del nfriamien to rápido uffer bora o 0,05M p 8,5; NaCl 0,15%

39

Manual de laboratorio de Bioquímica, Código 24726, Profesora Martha Cecilia Daza Espinosa Preparación de algunos reactivos

(NaCl 1% EDTA 0,1M pH 8) Pese 3,72g de EDTA, 0,4 g de NaOH, ajuste el pH a 8,0. Agregue 1 g de NaCl. Complete con agua a 100mL. (NaCl 0,15%) Pese 150 mg de NaCl y complete con agua a 100mL. (SDS 25%). Pese 1g de SDS, SDS, disuélvalo y complete con agua a 4mL. (Perclorato de potasio 6 M, sobresaturado). Pese 16,62g, disuelva y complete con agua a 20mL. (Buffer bórax 0,05M) Mida 6,25 mL de bórax saturado (4M) y diluya con agua hasta 500mL (pH = 9,0). A partir de esta solución, prepare 50 mL de los distintos buffer en el rango de pH de 9,5 a 12,5 agregando base para ajustar el pH. El resto de solución ajústelo a pH 8,5.

3. PROCEDIMIENTO Extracción de ADN

Pese 5g de levadura o de germen de trigo y 10g de arena lavada y coloque la levadura y la arena en un mortero previamente enfriado y muela vigorosamente durante 5 minutos. Vierta el homogenizado en un erlenmeyer con tapa y agregue 30 mL de solución salina con EDTA, agite, agregue 2mL de dodecil sulfato de sodio (SDS) y llévelo rápidamente a un baño maría a 60ºC durante 10 minutos. Enfríe a temperatura ambiente (coloque el erlenmeyer en un recipiente con agua de la llave), agregue 5 mL de perclorato de sodio sobresaturado (6M), mezcle, agregue 40 mL de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1 v/v) y agite magnética o mecánicamente por 15 minutos con el erlenmeyer tapado. Transfiera esta mezcla a dos tubos de centrífuga. Equilíbrelos por peso y centrifugue la emulsión a baja velocidad (1000 a 5000 rpm) por 10 minutos. Retire con cuidado la capa acuosa superior con una pipeta Pasteur, procurando no tomar el precipitado presente en la interfase. Colóquela en un erlenmeyer de 250 mL y agregue lentamente 70 mL de etanol a la solución. Mezcle suavemente con una varilla de vidrio, recolecte el material fibroso precipitado enrollándolo sobre la varilla de vidrio y presionándolo contra la pared para retirar el líquido. Si no obtuvo fibras, centrifugue a 2500 rmp por 5 minutos y descarte el líquido. Disuelva el ADN en 2-4 mL de agua con 0,2 mL de buffer salino EDTA. Mida el volumen final. Lea la absorbancia a 260 nm. Si queda por fuera del rango de lectura, prepare con una alícuota de 0,2 mL diluciones seriadas: x10, x100, x1000 y lea la absorbancia. Soluciónstock

Prepare una solución de 70 mL de una solución de ADN en NaCl 0,15% de una forma tal que la absorbancia a 260 nm sea 1,0 0,3. Mida también la absorbancia a 280 nm. Si fuese necesario, la solución stock puede congelarse para realizar posteriormente los ensayos de rendimiento y propiedades del ADN. Efecto del pH

Rotule 6 tubos y agregue a cada uno lo siguiente: 40

Tubo

Manual de laboratorio de Bioquímica, Código 24726, Profesora Martha Cecilia Daza Espinosa B 1 2 3 4 5

Solución stock mL

---

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

Buffer borato 0,05M (0,5mL)

3,0

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

pH del buffer

8,5

8,5

9,5

10,5

11,5

12,5

Mida la absorbancia a 260 nm, empleando el tubo B como blanco para ajustar el 100% T. Efecto del calentamiento y del enfriamiento rápido

Prepare 11 tubos y agregue en cada uno solución stock de ADN y buffer borato 0,05 M pH 8,5 en las cantidades que se indican en la tabla siguiente y caliente los tubos a las temperaturas señaladas. Tubo

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

Solución stock de ADN

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

Buffer borato 0,05M pH 8,5

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

Calentar 15 minutos a ºC

20

37

60

70

80

82

84

86

88

90

92

Pase inmediatamente los tubos a un baño de agua – hielo, dando vuelta a los tubos para que se enfríen rápidamente. Deje que los tubos alcancen la temperatura ambiente y mida la Abs a 260 nm. Como blanco para ajustar el 100% T prepare un tubo que contenga 1,5 mL de buffer borato 0,05M pH 8,5 y 1,5 mL de NaCl 0,15%. Cálculo y expresión de resultados.

1.

Calcule la concentración de ADN g/mL de ADN = Abs 260nm x factor de dilución x 50 g/mL/unidad de Abs 260nm. 2. Calcule la cantidad de ADN obtenido g de ADN recuperado = ADN (g/mL) x volumn total (mL) 3. Calcule la pureza del ADN = Abs 260 / Abs 280 4. Grafique la Abs versus pH o versus temperatura (ºC). Haga las gráficas en la misma hoja de papel para facilitar la comparación. 5. Interprete los resultados. 4. PREGUNTAS a) Diga ¿Cuál ADN tiene mayor Tm: ADN con GC = 63% o ADN con GC = 41%? b) ¿Qué función desempeñan el SDS, cloroformo, alcohol isoamílico, percolrato de sodio, EDTA en la extracción del ADN? c) ¿Cómo se puede purificar el ADN de un extracto de levadura? 5. BIBLIOGRAFÍA Wilson, K., Walker, J.M. 1997. Principles and Techniques of Practical Biochemistry.Cambridge UniversityPress, London. Plummer, D.T. 1.981. Bioquímica Práctica. Editorial McGraw-Hill Latinoamericana, .S.A., Bogotá.

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Práctica 11: Trabajo de Investigación Personal Instrucciones para elaborar el documento del trabajo de investigación personal Noviembre 9 de 2012 Título (máximo 15 palabras, 100 caracteres inlcuidos espacios) Autor o autora, filiación (ver como se incluyen los autores y su filiación en un artículo de la ACS) Tipo de trabajo: Trabajo de investigación personal para la asignatura Lab. Bioquímica, código 24726. Fecha (día-mes-año) Palabras clave (máximo 5) Resumen (máximo 150 palabras) Contenido (máximo 4000 palabras) Tablas y figuras (máximo 6) con leyendas explicatorias para cada tabla y figura. las figuras deben estar citadas y explicadas en el texto. Conclusiones (máximo 150 palabras) Bibliografía (mínimo 5 artículos posteriores al 2000). El documento debe estar basado exclusivamente en artículos científicos que se encuentren en el ISI Web of Knowledge. No se aceptan citas de libros ni de artículos que no esten en esta base de datos ni documentos de la www. Pueden usar como modelo para el documento escrito de su trabajo de investigación el artículo del Journal of Biological Chemistry que pueden descargar de la carpeta d:\Mis documentos\My Dropbox\Bioquimica\TIP-Topic and instructions. O usar como modelo un artículo del Chemical Reviews. Para títulos usar fuente TimesNew Roman 14 Para el resto del documento usar fuente TimesNew Roman 12. Figuras en formato TIFF *.tif Máximo 15 páginas, puede ser a doble columna.

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Manual de laboratorio de bioquímica

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