Laporan Praktikum Bioinformatika
Hari, Tanggal Waktu PJP Asisten
: Kamis, 09 Nopember 2017 : 13.00-1.00 WIB : Dr Dra Laksmi Ambarsari MS : Rini Kurniasih, SSi M Maftuchin Sholeh, SSi Farhan Azhwin M, SSi Zurilas Salas, SSi
PENELUSURAN BASIS DATA, IDENTIFIKASI DAN ANALISIS SEKUEN HOMOLOGI
Kelompok 8 Salma A Hamdani Riyan Hidayatullah
G84140008 G84140055
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2017
PENDAHULUAN
Bioinformatika merupakan cabang ilmu pengetahuan yang memfasilitasi penggunaan aplikasi perangkat lunak dalam menginterpretasikan data-data biologis. Cabang ilmu ini menggabungkan kemahiran di bidang biologi, matematika, ilmu komputer, serta statistika dalam penerapannya. Bioinformatika memiliki beragam fungsi yang sangat penting, sehingga penguasaan materi-materi bioinformatika merupakan hal yang esensial bagi para mahasiswa tingkat sarjana program studi Biokimia. Beberapa kajian ilmu bioinformatika di antaranya penelusuran basis data, identifikasi dan analisis sekuens homologi, desain primer, analisis struktur hasil elektroforesis dan sekuensing, serta analisis kekerabatan filogenetik antar individu. Selain itu, bioinformatika juga mempelajari analisis fungsi dan visualisasi struktur protein beserta sistem docking antar molekul. Praktikum ini bertujuan mengetahui cara penelusuran basis data dan mengidentifikasi sekuens homologi enzim glukokinase. Enzim merupakan suatu biomolekul berupa protein berbentuk globular yang terdiri atas rantai polipeptida atau lebih dari satu rantai polipeptida. Enzim berfungsi sebagai biokatalisator yang dapat mempercepat reaksi dan meningkatkan laju reaksi kimia dengan menurunkan energi aktivasi (Risnoyatiningsih 2011). Enzim memiliki sifat yang spesifik yaitu satu enzim hanya dapat berinteraksi dengan satu substrat. Bagian enzim yang sangat penting yaitu pada bagian sisi aktifnya, karena pada bagian ini terjadi reaksi antara enzim dan substrat yang dapat mempengaruhi kerja enzim. Sifat-sifat enzim yang lainnya yaitu enzim mudah rusak oleh suhu panas yang tinggi, enzim dapat bekerja berulang-ulang, enzim memerlukan kofaktor agar dapat teraktivasi. Aktivitas enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pengaruh inhibitor, suhu dan pH (Santoso dan Intan 2011). Teori kerja enzim dapat dibedakan sesuai dengan kebutuhan yaitu lock and key theory dan induced fit theory. Glukokinase atau dapat disebut heksokinase adalah enzim hati yang diinduksi oleh insulin yang berfungsi melakukan fosforilasi glukosa. Enzim ini paling aktif selepas makan, saat kadar glukosa di vena porta hepatis tinggi. Glikolisis diaktifkan oleh fruktosa 2,6-bifosfat yang meningkat ketika kadar insulin dalam darah meningkat dan kadar glucagon dalam darah menurun. Fruktosa 2,6 bifosfat dihasilkan dalam jaringan oleh enzim fosfofruktokinase2/fruktose 2,6-bifosfatase yaitu sejenis enzim bifungsional. Glukokinase terdapat dalam proses glukoneogenesis yang berfungsi sebagai pengembali reaksi yaitu mengubah glukosa menjadi glukosa-6-fosfat di hati (Djakani et al. 2013). Aktivitas enzim ini terkait aktivitas transporter di hati yang dapat menimbulkan fluks bersih glukosa ke dalam hati saat konsentrasi glukosa darah meningkat setelah makan-makanan tinggi karbohidrat dan fluks bersih glukosa keluar dari hati saat konsentrasi glukosa darah menurun.
Gambar 1 Enzim glukokinase atau heksokinase membantu reaksi perubahan glukosa menjadi glukosa-6-fosfat METODE Waktu dan Tempat Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan pada hari Kamis, 9 November 2017 di Ruang Kuliah B3D, gedung Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan pada percobaan yang dilakukan antara lain www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Adapun bahan yang digunakan adalah basis data Human liver glucokinase (ATP:D-hexose 6-phosphotransferase) mRNA pada laman NCBI dalam format FASTA. Prosedur Pencarian sekuen nukleotida glukokinase Sekuen nukleotida glukokinase dalam bentuk FASTA didapat dengan cara mencarinya pada GeneBank , melalui website http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Kemudian diketik protein yang ingin dicari pada kolom search, pilih nucleotide lalu enter. Hasil penelusuran akan menampilkan berbagai protein dari beragam spesies lalu dipilih salah satu. Kemudian dipilih menu FASTA untuk menampilkan sekuen nukleotida. Setelah itu pilih Send , pada pilihan Choose Destination dipilih File kemudian dipilih dalam format FASTA lalu Create File. File sekuen nukleotida dari protein yang dicari akan terdownload. Analisis BLAST Identitas dan homologi suatu gen dengan yang lainnya dapat dicari dengan menggunakan program BLAST yang dapat diakses menggunakan internet pada https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ kemudian dipilih blastn. Setelah itu dilakukan input sekuen nukleotida dengan cara select file, kemudian klik menu BLAST pada halaman paling bawah. Hasil analisis BLAST akan muncul pada layar.
Translate sekuen nukleotida menjadi sekuen protein Sekuen nukleotida diterjemahkan menjadi sekuen protein melalui website http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq dengan cara men-copy paste sekuen nukleotida yang telat didapatkan. Kemudian klik submit . Multiple sekuen alligment Sekuen nukleotida yang telah dipilih di alligment dengan sekuen nukleotida lain hasil homologi melalui web https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo dengan cara melakukan copy paste sekuen nukleotida tersebut, kemudian klik submit . Klik show color untuk menampilkan warna, kemudian sekuen yang sama pada setiap organisme dicari.
HASIL DAN PEMBAHASAN
BLAST atau Basic Local Alignment Search Tool merupakan program yang digunakan untuk mencari kemiripan antar sekuen. Selain itu, BLAST juga digunakan sebagai alat identifikasi gen dan karakter genetik. BLAST dapat melakukan pencarian sekuen melalui perbandingan dengan database DNA dalam waktu singkat.BLAST terdiri atas beberapa jenis yang dapat membandingkan antara nukleotida atau protein yang kita miliki dengan nukleotida atau protein pada database (Madden 2004). Terdapat banyak jenis BLAST yaitu, megaBLAST, BLASTn, BLASTp, BLASTx, tBLASTn, PSI-BLAST, RPSBLAST dan DELTA-BLAST. Masingmasing memiliki fungsi yang berbeda. Jenis megaBLAST digunakan untuk mengoptimalkan urutan-urutan sekuen yang mirip pada suatu spesies yang terkait erat. Setelah dicari kecocokannya maka akan dilanjutkan dengan perpanjangan menjadi full alignment. BLASTn digunakan untuk membandingkan suatu sekuen nukleotida sampel dengan database dari sekuen nukleotida. BLASTp digunakan untuk membandingkan suatu sekuen asam amino sampel dengan database sekuen protein. BLASTx digunakan untuk membandingkan produk hasil translasi konsep 6-frame sebuah sekuen (translated nucleotide) yang kita miliki dengan database dari sekuen protein. tBLASTn digunakan untuk membandingkan sekuen protein dengan database sekuen nukleotida yang ditranslasikan secara cepat (Zhang et al. 2000). Gambar 2 menunjukkan grafik homologi dari berbagai sekuen nukleotida dari enzim glukokinase pada berbagai spesies dengan sekuen nukleotida dari M69051.1 Human liver glucokinase (ATP:D-hexose 6-phosphotransferase) mRNA, complete cds. Grafik dibawah menunjukkan bahwa sekuen-sekuen nukleotida dari basis data memiliki kesamaan nukleotida yang tinggi. Hal ini dilambangkan oleh warna merah yang artinya antar sekuen memiliki kesamaan lebih dari 200 nukleotida. Semakin kanan warna yang terbentuk maka semakin tinggi kesamaannya dengan urutan hitam, biru, hijau, ungu dan merah. Warna hitam melambangkan kesamaan nukleotida dibawah 40, biru sebanyak 40-50, hijau sebanyak 50-80, ungu sebanyak 80-200 dan merah sebanyak lebih dari 200 (Azizah 2009).
Gambar 2 Grafik homologi sekuen nukleotida glucokinase (ATP:D-hexose 6-phosphotransferase) mRNA, complete cds Analisis BLAST bertujuan mengidentifikasi identitas dan homologi suatu gen dengan gen lainnya. BLAST dapat mengidentifikasi homologi berdasarkan sekuens nukleotida, residu asam amino, maupun parameter lainnya yang terkait. Similarity score merupakan skor yang diberikan secara keseluruhan mengenai kesamaan sekuens yang kita miliki dengan sekuens hasil analisis yang diprediksi. Query cover memuat informasi persentase kueri yang saling overlap terhadap sekuens hasil analisis. Nilai persentase query coverage yang semakin tinggi menunjukkan antar kedua sekuens tersebut memiliki daerah coverage yang semakin identik. Expect- value menunjukkan hasil analisis yang semakin signifikan atau diharapkan apabila mendekati nilai nol. Identity merupakan persentase kesamaan kueri pada coverage yang sama. Semakin tinggi nilainya, maka antar sekuens memiliki informasi yang identik pada query coverage yang sama (NCBI 2017). Tabel 1 menunjukkan hasil analisis BLASTn dari M69051.1 Human liver glucokinase (ATP:D-hexose 6-phosphotransferase) mRNA. Tabel 1 menunjukkan bahwa sekuen yang memiliki homologi terdekat adalah Chlorocebus sabaeus glucokinase (hexokinase 4) dengan nilai query cover sebesar 94%. Artinya, sebanyak 94% sekuen dalam database selaras dengan query. Nilai identity juga menunjukkan hasil yang tinggi yaitu sebesar 96% yang artinya terdapat kecocokan sebanyak 96% antara query dengan database yang
tersejajarkan (Miller 1990). Sedangkan sekuen dengan homologi terjauh adalah Pantholops hodgsonii glucokinase (hexokinase 4) (GCK), transcript variant X2 dengan nilai query cover sebesar 59%. Nilai ini menunjukkan bahwa sebanyak 59% sekuen dalam database selaras dengan query. Keduanya memiliki nilai evalue 0 artinya hasil yang ditampilkan dapat dipercaya (Suyono 2010).
Tabel 1 Perbandingan sekuen nukleotida Human liver glucokinase dengan sekuen nukleotida lain dalam basis data Description Human liver glucokinase (ATP:Dhexose 6 phosphotransferase) mRNA PREDICTED: Chlorocebus sabaeus glucokinase (hexokinase 4) (GCK), transcript variant X1, Mrna PREDICTED: Chlorocebus sabaeus glucokinase (hexokinase 4) (GCK), transcript variant X3, Mrna PREDICTED: Orcinus orca glucokinase (hexokinase 4) (GCK), transcript variant X1, mRNA PREDICTED: Panthera pardus glucokinase (GCK), mRNA PREDICTED: Equus caballus glucokinase (hexokinase 4) (GCK), transcript variant X2, mRNA PREDICTED: Pantholops hodgsonii glucokinase (hexokinase 4) (GCK), transcript variant X2, mRNA
Max Score
Total Score
Query Cover
EValue
Ident
Accession
4710
4710
100%
0
100%
M69051.1
3624
3950
94%
0
96%
XM 007981463.1
1934
3674
88%
0
95%
XM 007981466.1
1925
1925
54%
0
92%
XM 004282965.2
1914
1914
57%
0
90%
XM 019450861.1
1906
1906
59%
0
89%
XM 003364757.3
1888
1888
53%
0
92%
XM 005957702.1
Gambar 3 Hasil perbandingan sequence alignment homolog organisme Human liver glucokinase (ATP:D-hexose 6-phosphotransferase) mRNA dan Chlorocebus sabaeus glucokinase (hexokinase 4) (GCK), transcript variant X1 Gambar 3 menunjukkan hasil dari perbandingan 2 sekuen, yaitu antara query dengan sekuen dari Chlorocebus sabaeus glucokinase (hexokinase 4) (GCK), transcript variant X1. Hasil dari perbandingannya yaitu terdapat kesamaan sekuen antara sekuen nomor 327 sampai 386 pada query dengan sekuen nomor 1956 sampai 2015 pada sekuen Chlorocebus sabaeus glucokinase (hexokinase 4) (GCK), transcript variant X1. Sekuen yang sama antara keduanya pun ditemukan pada urutan sekuen lainnya. Analisis yang digunakan selain BLAST yaitu Clustal. Clustal merupakan aplikasi yang digunakan untuk menganalisis keadaan representative dari suatu prediksi gen (Anurogo dan Parikesit 2016). Menurut Sholeh (2015), Clustal terbagi menjadi Clustal W dan Clustal O. Clustal W digunakan dalam pensejajaran berganda (multiple alignment) yang dapat mengetahui motif dari suatu sekuens. Motif itu sendiri adalah suatu cirri khas yang dimiliki oleh setiap sekuens, jiika sekuens tersebut saling homolog maka motifnya semakin mirip. Analisis Clustal juga dapat digunakan untuk menunjukkan kekerabatan dari setiap sekuens yang digunakan. Gambar 4 menunjukan hasil motif dari 5 organisme yang sudah dianalisis menggunakan Clustal. Penajajaran yang didapatkan terjadi kemiripan asam amino pada masing-masing organisme. Selain kemiripan yang didapat, akan tetapi terdapat perbedaan dari masing-masing organism yang disebut motif. Organisme tertentu pasti memiliki motif yang memang hanya organisme tertentu yang memilikinya. Didapat motif enzim glukokinase pada bakteri, contoh nya E. coli, Y. pestis, N. meningitis dan lain sebagainya. Terdapat persamaan beberapa asam amino yang disandikan pada motif tersebut, dengan kata lain enzim glukokinase pada beberapa organisme memiliki motif yang khas.
Gambar 4 Motif Clustal dari 6 organisme yang memiliki enzim glukokinase SIMPULAN
Hasil dari analisis BLASTn pada sekuen nukleotida Human liver glucokinase (ATP:D-hexose 6-phosphotransferase) mRNA menunjukkan bahwa sekuen tersebut memiliki kesamaan sekuen dengan beberapa sekuen pada database. Motif yang didapatkan dari hasil analisis CLUSTAL menunjukkan bahwa enzim glukokinase memiliki motif yang khas pada beberapa organisme.
DAFTAR PUSTAKA
Anurogo D, Parikesit A. 2016. Pendekatan bioinformatika terhadap transkriptomik filagrin. Journal of Agromedicine and Medical Sciences. 2(3): 8-16. Azizah A. 2009. Perbandingan pola pita amplifikasi DNA daun, bunga dan buah kelapa sawit normal dan abnormal [Skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Djakani H, Masinem TV, Mewo YM. 2013. Gambaran kadar gula darah puasa pada laki-laki usia 40-59 tahun. Jurnal eBM . 1(1): 71-75. Madden TL. 2004. BLAST : at the core of powerful and diverse set sequence analysis tools. Nucleic Acid Research. 32 (2): 20-25. doi.org/10.1093/nar/gkh435. Miller G, Beckwith R, Fellbaum C, Gross D, Miller K. 1990. WordNet: An online lexical database. International journal of lexicography. [NCBI] National Center for Biotechnology Information. 2016. Handbook: BLAST . [terhubung berkala http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=handbook&part=ch1 6#A614] (15 Nopember 2017). Risnoyatiningsih S. 2011. Hidrolisis pati ubi jalar kuning menjadi glukosa secara enzimatis. Jurnal Teknik Kimia. 5(2) : 417-424. Santoso A, Intan KT. 2011. Studi persepsi masyarakat terhadap peran enzim dalam pembuatan susu terfermentasi. Jurnal Pendidikan Kimia. 3(1): 2026. Suyono Y. 2010. Penentuan spesies bakteri Pseudomonas dan analisis phylogenetic tree secara bioinformatika. Biopropal Industri. 1(2): 24-30. Zhang Z, Schwart S, Wagner L, Miller W. 2000. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. J Comput Biol. 7 (1-2): 203-214.