COCOS GRAM-POSITIVOS
Cepa C “
”
Staphylococcus aureus
FISIOLOGIA MICROBIANA UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR
UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD ASIGNATURA - FISIOLOGÍA MICROBIANA DOCENTE-JUAN CARLOS PRADA HERRERA PROGRAMA – MICROBIOLOGÍA
IDENTIFICACIÓN IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM GR AM POSITIVOS A TRAVÉS DE PRUEBAS BIOQUIMICAS CONVENCIONALES
GRELYS JOHANA TERNERA MEJIA GINO FRANCHESCO OLIVIERI SALAS KATHY GRISALES HERNANDEZ IVONN CAROLINA SIMANCA MEDINA HERNILDA HOYOS ANGULO IDEZARETH HERNANDEZ MESTRE
VALLEDUPAR – CESAR 2015
INTRODUCCIÓN
Los cocos Gram positivos son microorganismos que se aíslan con más más frecuencia en muestras de pacientes y se han involucrado como agentes importantes en enfermedades infecciosas, estos microorganismos se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza y algunos hacen parte de la microbiota normal de la piel y mucosas del hombre y de animales. Es de vital importancia identificarlos puesto que de ello depende que se lleve a cabo un buen diagnóstico y procedimiento cuando se esté frente a este tipo de patógenos.
OBJETIVOS
Estudiar las características macroscópicas, microscópicas y cambios producidos por el microorganismo en los diferentes medios utilizados. Conocer algunas de las pruebas bioquímicas de laboratorio utilizadas para para la identificación de especies de cocos Gram-positivos. Identificar género y especie especie de una cepa cepa bacteriana que es totalmente desconocida antes de aplicar las pruebas.
MARCO TEÓRICO
En microbiología, se denominan bacterias Gram positivas a aquellas bacterias que se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram: de aquí el nombre de "Gram-positivas" o también "Gram positivas". positi vas". Esta característica carac terística Química está íntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular por lo que refleja un tipo natural de organización bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias, y cuando se tratan como taxón se utiliza también el nombre de pos bacteria. Las restantes son las bacterias Gram negativas. La envoltura celular de las bacterias Gram-positivas comprende la membrana citoplasmática y una pared celular compuesta por una gruesa capa de peptidoglicano, que rodea a la anterior. La pared celular se une a la membrana citoplasmática mediante moléculas de ácido lipoteicoico. La capa de peptidoglicano confiere una gran resistencia a estas bacterias y es la responsable de retener el tinte durante la tinción de Gram. A diferencia de las Gram-positivas, las Gram-negativas presentan una segunda membrana lipídica externa a la pared celular. Incluyen especies tanto móviles con vía flagelos como inmóviles con forma de bacilo (Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Lactobacillus, Listeria) o coco (Staphylococcus, Streptococcus); con gruesas paredes celulares o sin ellas (Mycoplasma). Algunas especies son fotosintéticas, pero la mayoría son heterótrofas. Muchas de estas bacterias forman endosporas en condiciones desfavorables. desfavorables.4 Realmente, no todas las bacterias del grupo son Gram-positivas (no se tiñen por la aplicación de ese método), pero se incluyen aquí por su similitud molecular con otras bacterias Gram-positivas. (Koneman, 2006). Los cocos Gram positivos son microorganismos unicelulares, caracterizados por presentar una forma esférica, en la que algunas de sus especies se agrupan en diferentes patrones, de manera que son clasificados por su forma en diplococos, los cuales son cocos asociados en parejas como el Streptococcus Pneumoniae o neumococo; los tetracocos, tétradas o tetrágenos son cuatro micrococos dispuestos a manera de cuadro; la sarcina que adopta formaciones en paquete de ocho o más micrococos. A su vez, los Staphylococcus se presentan en esferas que forman racimos de uvas como el Staphylococcus aureus; y por último los Streptococcus formados por esferas dispuestas en cadena, resultado de su división a lo largo de un eje, lo que lo diferencia del Staphylococcus que se divide en varios ejes formando racimos. Los Staphylococcus son microorganismos que qu e presentan una colonización transitoria en el individuo como sucede con el S. aureus presente en la humedad de los pliegues de la piel, la orofaringe, tracto gastrointestinal, además del urogenital, siendo considerado el causante de ciertas patologías a través de sus toxinas o invasión directa lo que produce destrucción de los tejidos.
De la misma manera los Streptococcus presentan especies patógenas para el organismo humano, mientras que otros forman parte de la microbiota normal de la piel y las mucosas en individuos inmunocompetentes, siendo estos últimos oportunistas en situaciones que presenten factores predisponentes como sucede con el estrés o enfermedades consuntivas. A su vez se encuentran los Enterococcus que son considerados, patógenos oportunistas, presentes en la microbiota normal del tracto gastrointestinal y son causantes de infecciones en heridas quirúrgicas, infecciones urinarias, además de abscesos intrabdominales. Por sus parte y de acuerdo a los requerimientos atmosféricos se pueden clasificar en: aerobios y anaerobios facultativos, representados por la familia de Micrococacceae que comprende a los Staphylococcus, Micrococcus, Stomacoccus y Planococcus, además de los géneros Streptococcus y Enterococcus; existiendo adema los anaerobios estrictos, representados por los Peptococcus y Peptoestreptococcus. (Evangelina Olivas).
http://www.microbeworld.org/component/jlibrary/?view=article&task=download&id=7611
MATERIALES
Cepa bacteriana. Microscopio. Agar Manitol al 7% Agar nutritivo. Agar sangre. Agar DNasa. Agar Mueller Hinton. Tubo con EDTA 0.5 Caldo nitrato. Fosfatasa Alcalina. Oxidasa. Novobiocina discos. Escala de Macfarlan Glucosa 5ml 0.5 al 1% Maltosa 5ml 0.5 al 1% Sacarosa 5ml 0.5 al 1% Manitol 5ml 0.5 al 1% Manosa 5ml 0.5 al 1% Tubos estériles centrifuga Alcohol Algodón Asas para siembra Mechero Fósforos Gradilla Reactivos para la tinción de Gram Láminas Cinta para rotular
PROCEDIMIENTO
Se toma una cepa bacteriana como parte del análisis cuya finalidad es lograr identificar que microorganismo está presente a través del uso de una serie de pruebas bioquímicas convencionales. La presente técnica es para la detección de Staphylococcus y más que todo la especie aureus, la cual consiste en los siguientes pasos: Aislamiento selectivo, selectivo, se utiliza un medio selectivo selectivo sólido, el cual cual inhibe el desarrollo de géneros diferentes al Staphylococcus, pero además permite reconocer el desarrollo característico del microorganismo buscado. Recuperación de la cepa, este paso permite restaurar las células dañadas dañadas de Staphylococcus aureus. Identificación bioquímica, bioquímica, en este punto se identifica el el género y especie de Staphylococcus aureus. Estas pruebas bioquímicas (de acuerdo a la Norma Oficial) son: presencia de la enzima coagulasa, catalasa y presencia de la enzima termonucleasa.
La caracterización bioquímica de Staphylococcus aureus se obtiene a través de pruebas convencionales siguiendo estos pasos:
Se ingresó al laboratorio de microbiología microbiología manteniendo las normas de bioseguridad. Se procedió a escuchar una breve introducción de lo que será la práctica a realizar (pruebas bioquímicas de identificación). Escuchar con atención las pautas, pautas, recomendaciones recomendaciones y normas para realizar la práctica (indicaciones) por parte del profesor. Observar con detenimiento detenimiento y anotar todos los pasos realizados por el el docente al realizar una demostración rápida de lo que será la práctica a realizar (pruebas bioquímicas de identificación). Preparar el rótulo respectivo para las placas asignada (1 por grupo) (Fecha, agar, técnica, muestra, Tº, nombre, grupo). Se realizó la identificación identificación de la morfología morfología colonial de la cepa tal y como como se percibe y se pudo observar que las colonias eran mediadas blanquecinas, con una forma redonda u ovalada. Luego se realizó la tinción de Gram con los respectivos reactivos reactivos y respetando el tiempo para cada uno. Se observó en el microscopio microscopio y se hizo una posible identificación puesto que se encontraron cocos en racimos de color morado. Se tomaron fotografías y se anotaron los resultados.
Se procedió a inocular y a sembrar el microorganismo microorganismo en las diferentes pruebas bioquímicas y agares e incubar a 37°C y así determinar el nombre del microorganismo teniendo en cuenta los resultados al revelar.
Siembra en Agar Nutritivo
Se tomó de la placa con el medio de cultivo cultivo una muestra del microorganismo con el asa redonda, previamente flameada.
Luego en la placa con tapa tapa previamente previamente rotulado en donde se encuentra el Agar Nutritivo.
Luego sembramos con el asa utilizando el metodo metodo de siembra siembra por Agotamiento.
Cerramos herméticamente después de sembrar sembrar y se colocó en la incubadora a 37° durante 24 horas.
Presencia de catalasa
Se toma un portaobjetos nuevo
Con un asa se tomó una colonia y se depositó en un portaobjetos
Luego se añadió una gota de peróxido de hidrógeno hidrógeno al al 30% 30%
Y se observó la formación de burbujas (resultado positivo)
Presencia de Coagulasa
Se mezcló con un asa cargada con el microorganismo obtenido de un un cultivo en medio sólido,
Se agregó en 0,5 ml de plasma plasma de humano, contenido en un tubo pequeño de aproximadamente 7 mm de diámetro.
Se Incubo a 37°C y se examinó periódicamente durante 4 horas.
Siembra en agar BHI
Se tomó de la placa con el medio de cultivo cultivo una muestra del microorganismo con el asa de platino en forma de , previamente flameada.
Luego en la placa placa con tapa previamente rotulada en donde se encuentra el el Agar BHI.
Luego sembramos con el asa utilizando el metodo metodo de siembra siembra por Agotamiento.
Cerramos herméticamente después de sembrar sembrar y se colocó en la incubadora a 37° durante 24 horas.
Presencia de DNasa
Se tomó de la placa con el medio de cultivo una muestra muestra del microorganismo con el asa de platino en forma de aro, previamente flameada.
Luego en la placa con con tapa previamente rotulada en donde se encuentra el Agar DNasa.
Luego sembramos con el asa utilizando el metodo metodo de siembra siembra por Agotamiento.
Cerramos herméticamente después de sembrar sembrar y se colocó en la incubadora a 37° durante 24 horas.
Presencia de sensibilidad por Novobiocina en agar Müller Hinton
Se tomó de la placa con el medio de cultivo una muestra del microorganismo con el asa de platino en forma de aro, previamente flameada.
Luego en la placa con con tapa previamente rotulada en donde se encuentra el Agar Müller Hinton.
Luego sembramos con el asa utilizando utilizando el metodo de siembra siembra por Agotamiento.
Se agregan 3 sencidisco de novobiocina novobiocina con con una pinsa pinsa esteril esteril
Cerramos herméticamente después de sembrar sembrar y se colocó en la incubadora a 37° durante 24 horas.
Presencia de Hemolisis
Se tomó de la placa placa con el medio medio de cultivo una muestra del microorganismo con el asa de platino en forma de aro, previamente flameada.
Luego en la placa con con tapa previamente rotulada en donde se encuentra el Agar Sangre.
Luego sembramos con el asa utilizando utilizando el metodo de siembra siembra por Agotamiento.
Cerramos herméticamente después de sembrar sembrar y se colocó en la incubadora a 37° durante 24 horas.
Crecimiento en Manitol Salado
Se tomó de la placa con el medio de cultivo una muestra muestra del microorganismo con el asa de platino en forma de aro, previamente flameada.
Luego en la placa con con tapa previamente rotulada en donde se encuentra el Agar Manitol Salado.
Luego sembramos con el asa utilizando utilizando el metodo de siembra siembra por Agotamiento.
Cerramos herméticamente después de sembrar sembrar y se colocó en la incubadora a 37° durante 24 horas.
Fermentación de Manitol, Sacarosa, Maltosa y Glucosa
Se tomaron de la placa con el medio de cultivo cultivo dos muestra del microorganismo con el asa de platino en forma de punta, previamente flameada.
Se tomaron tomaron los tubos de ensayo con tapa previamente previamente rotulado en donde se encuentran las azucares con rojo de metilo y campana de durhan: (Manitol, Sacarosa, Maltosa y Glucosa).
Luego se flamearon flamearon los tubos tubos al abrir y se sembró con el asa utilizando el metodo de siembra por resuspensión.
Se Cerró después de sembrar sembrar y se colocó colocó en una gradilla y en la incubadora a 37° durante 24 horas.
RESULTADOS CEPA BACTERIANA
CEPA OBSERVADA AL MICROSCOPIO
REACCIÓN CATALASA
AGAR SANGRE DESPUÉS DE 24 HORAS HOR AS
AGAR SANGRE DESPUÉS DE 72 HORAS HOR AS
PRUEBAS FERMENTACION DE AZUCARES A 24 HORAS
A 48 HORAS MANOSA
PRUEBA NITRATO
GLUCOSA
MALTOSA
PRUEBA UREA
SACAROSA
PRUEBA COAGULASA
AGAR DNasa
AGAR BAIRD PARKER
AGAR MUELLER HINTON CON SENCIDISCOS DE NOVOBIOCINA
ANALISIS DE RESULTADOS PRUEBA
RESULTADO
TINCION DE GRAM Útil para la identificación de la morfología microscópica de la especie bacteriana.
GRAM-POSITIVO: Cocos agrupados en racimos
POSIBLE MICROORGANISMO S. epidermidis, S. aureus S. saprophyticus, S. pyogenes, S. agalactiae, S. pneumoniae, entre
otros.
POSITIVO: El microorganismo posee la enzima catalasa y la utiliza para desdoblar el peróxido de hidrogeno en agua y oxigeno.
Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus Staphylococcus saprophyticus
HEMOLISIS Detecta la presencia de hemolisina, enzima que permite la clasificación de cocos en alfa, beta y gamma hemolíticos. MANITOL- SALADO Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciación de estafilococos.
BETA HEMOLITICO: hemolisis total o un halo grueso alrededor de la colonia.
Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalectiae, Staphylococcus aureus.
POSITIVO: acidificación del medio, el microorganismo es capaz de crecer en altas concentraciones de sal.
S. aureus y algunas cepas de S. saprophyticus
COAGULASA Enzima que estimula la conversión de fibrinógeno en fibrina, comprueba la capacidad de un microrganismo de coagular el plasma por acción de esta enzima. SENSIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA Antibiotico que en agar Mueller -Hilton inhibe el crecimiento de algunos Staphylococcus.
POSITIVO: El microorganismo es capaz de coagular plasma a través de la enzima coagulasa.
S. aureus
SENSIBLE: El microorganismo no muestra resistencia ante el antibiótico.
S. aureus y S. saprophyticus
POSITIVO para todos los azucares con formación de gas en la campana de Durham
S. aureus
CATALASA Identificar si el microorganismo posee la enzima catalasa. Útil para la diferenciación de microorganismos del genero Staphylococcus y Streptococcus
FERMENTACION DE AZUCARES (Glucosa, Maltosa, Sacarosa, Manitol) Útil para observar la capacidad
del microorganismo de fermentar estos azucares con producción de gas en la campana de Durham BAIRD PARKER Medio de alta especificidad diagnóstica, selectivo y diferencial para el aislamiento y recuento de estafilococos en alimentos y otros materiales de importancia sanitaria. DNasa Determina la capacidad del microorganismo para desdoblar el ADN en sus nucleótidos a partir de la enzima DNasa.
Colonias negras brillantes debido a la reducción del telurito a telurio.
El resultado fue variable puesto que el microorganismo creció, pero al momento de revelarlo dio negativo y esto se debe a que el medio estaba vencido.
S. aureus y S. epidermidis
S. aureus
De acuerdo a lo anteriormente descrito podemos deducir que la cepa C que nos fue entregada corresponde a S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s ya que responde de manera positiva a las pruebas catalasa, coagulasa y DNasa, además fermenta los azucares en su totalidad, características propias de esta especie. Cabe resaltar que las demás pruebas fueron realizadas con el fin de tener un mayor conocimiento en la diferenciación de este género y aportar un reporte completo en la presentación de los resultados.
CONCLUSIÓN
En algunas infecciones graves es importarte determinar el patógeno o agente infectante y para eso es necesario tener conocimiento de que pruebas son útiles para la identificación de dicho agente. En el caso de Staphylococcus aureus puede encontrarse infecciones en casi todos los sitios anatómicos siendo más frecuentes en lesiones de la piel y partes blandas, esto obliga a realizar un diagnostico previo para luego tratar la infección.
BIBLIOGRAFIAS http://www.revistasbolivianas.org.bo/scielo.php?pid=S230437682014001000004&script=sci_arttext 10/06/15 11:39am Elmer W. Koneman, Stephen Allen. Diagnostico Microbiológico. Capitulo 40 pág. 39. Editorial Médica panamericana. Año 2006. Argentina, España, México, Venezuela. Evangelina Olivas, Manual de prácticas de Microbiología I, II y parasitología. Práctica 6. Pág. 25. Editorial Médica panamericana. Año 2004. México.
