Protocolos de Pruebas de Identificacion Bacteriana 2[1]

Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico microbiológico . Laboratorio de Diagnóstico Clínico. 2º curso.

Protocolos de de pr pruebas de de id identificación ba bacteriana - 1 UT 16 - 2 Bloque temático III

Protocolos de pruebas de identificación bacteriana Quizás las más utilizadas cuantitativamente sean las pruebas bioquímicas que nos permiten determinar características metabólicas de los microorganismos objeto de identificación, aunque las reacciones de aglutinación o precipitación utilizadas son más rápidas y más específicas. Las pruebas podríamos clasificarlas fundamentalmente fundamentalmente en aquellas que nos permiten la identificación de Gram positivos y pruebas para identificación identificación de Gram negativos, aunque aunque hay una una serie de pruebas pruebas comunes a ambos grupos que vamos a enumerar,

Pruebas de identificación iniciales: - Morfología bacteriana - Tinción de Gram - Agrupamiento celular - Movilidad - Atmósfera de crecimiento

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Catalasa Citocromo - oxidasa Oxidación -fermentación

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Fermentación de azúcares

Gram positivos

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Lisostafina Coagulasa DNAsa Fosfatasa CAMP Hidrólisis de esculina Hidrólisis Hidrólisis del hipurato hipurat o Sensibilidad Sensibilidad a novobiocina novobi ocina Sensibilidad Sensibilidad a optoquina opto quina Sensibilidad Sensibilidad a bacitracina Sensibilidad Sensibilidad a SXT SX T Crecimiento en ClNa Crecimiento en bilis Producción de hemólisis Pruebas inmunológicas

Gustavo A. Díaz Martín. I. E. S. Jaime Ferrán Ferrán Clúa.

Gram negativos

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ß galactosidasa galactosidasa (ONPG) (ONP G) Lisina y ornitina decarboxilasa decarboxilasa Utilización Utilización de citrato Producción de SH 2 Ureasa Triptófano desaminasa (TDA) Producción de indol Reducción de nitratos nitratos a nitritos nit ritos

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Arginina dehidrolasa Rojo de metilo Voges Proskauer Kligler Hidrólisis de la gelatina Pruebas inmunológicas

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Profesor Técnico de Formación Profesional. San Fernando Fernando de Henares. (28830 Madrid)

Curso 2003-2004 Código 28038616

Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico . Laboratorio de Diagnóstico Clínico. 2º curso.

Protocolos de pruebas de identificación bacteriana - 2 UT 16 - 2 Bloque temático III

Catalasa Fundamento: Se basa en la capacidad del enzima catalasa de descomponer el peróxido de hidrógeno añadido, formándose agua y O2, el cual se libera en forma de burbujas. Excluyendo los estreptococos, la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad catalasa. Métodos: Método del portaobjetos. Otros métodos: Método en tubo de ensayo, método del tubo capilar, método del cubreobjetos. Reactivos: Peróxido de hidrógeno (agua oxigenada H2O2) al 30% (Superoxal).( 1) (Conservar en frasco topacio, lejos de la luz y refrigerado). Tween 80 al diluido al 10% en Buffer fosfato M/15 pH:7. (La adición de un detergente como el Tween 80 al H2O2, aumenta la duración de las burbujas formadas) •

•

Procedimiento: 1) En un porta limpio y seco depositar una colonia bacteriana procedente de un cultivo joven 2) Añadir una gota de H2O2 al 30% sobre la colonia, sin mezclar. No invertir el orden 3) Observar la inmediata formación de burbujas. Lectura:

Inmediata.

Interpretación: Prueba positiva: formación inmediata de burbujas bien visibles. Prueba negativa: no hay formación de burbujas. Utilización: Se usa para diferenciar 1) Cocos gram positivos: Familia Micrococcaceae (Staphilococcus y Micrococcus ) (+) de Géneros Streptococcus y Enterococcus (-). 2) Bacilos gram positivos esporulados: Género Bacillus (+) de Género Clostridium (-) 3) Bacilos gram positivos no esporulados: Listeria (+) y Corynebacterium (+)(1) de Erysipelothrix (-) Control de calidad: Prueba positiva: Staphilococcus aureus Prueba negativa: Enterococcus faecalis. Precauciones: Si tomamos la colonia de un agar sangre, hemos de tener en cuenta que si tocamos el agar podemos arrastrar eritrocitos que, al poseer catalasa pueden dar positiva la prueba, dando lugar a falsos positivos. Las colonias viejas pueden perder su actividad para la catalasa. La quemadura con agua oxigenada al 30% debe lavarse con alcohol etílico de 70º, no con agua.

* 1) .-

Algunos autores utilizan H2O 2 a concentraciones menores, como 10%, 3% o 0,5%.

* 2) .-

Excepciones: Corynebacterium pyogenes y Corynebacterium haemoliticum, que son (-).

Gustavo A. Díaz Martín. I. E. S. Jaime Ferrán Clúa.

Profesor Técnico de Formación Profesional. San Fernando de Henares. (28830 Madrid)

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Oxidasa Descripción: Es una prueba que detecta la presencia del enzima c itocromooxidasa. Fundamento: La enzima citocromooxidasa, en presencia de oxígeno atmosférico, oxida el reactivo fenilendiamina oxidasa para formar un compuesto coloreado: indofenol. Métodos: Método directo en placa (adición de reactivo a las colonias). Método del disco impregnado de reactivo. - Método directo en placa. - Método indirecto en disco o tira reactiva. Método de la torunda impregnada de reactivo. Reactivos: Los reactivos pueden usarse en solución para utilizar en el método directo en placa o impregnando algún soporte, como discos, tiras, o torundas. Los reactivos más utilizados son: Reactivo de Kovacs: Diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiemina al 1%. Este reactivo es más sensible, más rápido y menos tóxico que los demás. Reactivo de Gordon y McLeod: Diclorhidrato de dimetil-p-fenilendiamina. Reactivo de Nadi: Una mezcla por partes iguales de  -naftol al 1% en etanol de 95º y aminodimetilanilina al 1%. Reactivo de Carpenter: Oxalato de p-amino-dimetil-anilina al 1%. •

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Procedimiento: Método del disco: 1) Colocar una colonia bacterian sobre la superficie del disco. 2) Observar un eventual cambio de color. Método directo en placa: 1) Añadir 2 o 3 gotas de reactivo a algunas colonias sospechosas. No inundar toda la placa ni invertirla. 2) Observar un eventual cambio de color. Lectura: Con reactivo de Kovacs: Antes de 10 segundos. Con reactivo de Gordon: La positividad con el reactivo de Gordon y McLeod puede aparecer entre 10 y 30 minutos. Con rectivo de Nadi: Antes de 1 minuto. Resultado: Prueba positiva: Con reactivo de Kovacs: color negro purpúreo en 10 segundos. Con reactivo de Gordon: cambio de color a rosado - marrón y negro final. Con reactivo de Nadi: color azul intenso. Prueba negativa: Sin cambio de color o permanece el color de la colonia. • • •

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Utilización: Se usa para diferenciar: 1) Bacilos Gram negativos:(1) Familia Pseudomonadaceae (+)(1) de Familia Enterobacteriaceae (-) 2) Cocos Gram negativos: Género Neisseria (+) de otros cocos gram negativos (-) Se usan también para ayudar a la identificación de: Aeromonas (+), Moraxella (+), Acinetobacter (-). •

Precauciones: La utilización de asas de hierro puede dar pruebas falsamente positivas. Los compuestos p-fenilendiamina son relativamente inestables y pierden su actividad si son expuestos a la luz. No debe realizarse una prueba de oxidasa de las colonias cultivadas en un medio que contenga glucosa, pues su fermentación puede inhibir la actividad de la enzima oxidasa y dar lugar a falsos negativos. Las especies de Pseudomonas producen una sustancia inhibidora que impide la producción de oxidasa en las especies de Neisseria; por esta razón pueden producirse resultados falsamente negativos si un cultivo mixto contiene especies de ambos géneros. Rotular el reactivo como Reactivo oxidasa de Kovacs para evitar la confusión con el Reactivo de indol de Kovacs. Después de la adición del reactivo sobre las colonias sospechosas, una coloración negra en el medio que rodea a las colonias, pero no en éstas, debe ser considerada como una prueba de oxidasa negativa. Con el método directo en placa es posible recuperar colonias oxidasa positivas mientras son viables. La viabilidad de las colonias dura mientras éstas permanecen de color rosado con el reativo de Gordon y McLeod.

Control de calidad: Prueba positiva: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Prueba negativa: Escherichia coli ATCC 25922.

* 3) .- Dentro de la división de bacterias gram negativas hay otras familias y géneros diferentes a los citados, pero ellas suponen cuantitativamente el grupo más numeroso. * 4) .- La excepción más importante es Stenotrophomonas


.

maltophilia (-)


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Oxidación - Fermentación: Descripción La prueba de oxidación-fermentación, determina el tipo de metabolismo, oxidativo o fermentativo que utilizan las bacterias al actuar sobre un hidrato de carbono. Fundamento:: En la vía oxidativa, el aceptor final de electrones debe ser el oxígeno y por consiguiente el proceso es aerobio y produce poca acidez; mientras que en la vía fermentativa, el aceptor final de electrones es un compuesto orgánico y el proceso es anaerobio, originando mucha acidez. La acidez se detecta por la presencia de un indicador de pH (rojo de fenol), que hace virar el medio de rojo a amarillo. Los microorganismos oxidativos producen ácido en la zona de contacto con el aire, pero no lo hacen en profundidad Los microorganismos fermentativos producen mucho ácido en todo el tubo Medios de cultivo utilizados: El medio utilizado es el de Hugh-Leifson, que contiene peptona en baja concentración (0,2%) y glucosa (1%). La acidez producida por el metabolismo oxidativo es baja; a su vez las bacterias producen sustancias básicas tras la degradación aeróbica de las peptonas. A las concentraciones de Otros Reactivos: Vaselina o aceite de parafina estéril. Procedimiento: Para cada bacteria en estudio se utilizan dos tubos de O/F. Con medio de Hugh - Leifson Se siembran en picadura y se cubre uno de ellos con vaselina o aceite de parafina estéril. Incubar a 35º-37º C. Lectura: A las 24-48 h. (a veces es necesaria una incubación de hasta 14 días) Resultado: Si la vía es oxidativa, solamente el tubo abierto vira ligeramente en la parte superior a amarillo ( y más tarde se extenderá por todo el tubo) y nunca con producción de gases. Si la vía es fermentativa hay un viraje intenso a amarillo que comienza en la parte inferior de los dos tubos con o sin producción de gases. Utilización: Precauciones: Control de calidad: Fermentador de glucosa: Escherichia coli Oxidador de glucosa: Pseudomonas aeruginosa No reacciona: Micrococcus spp.



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Kligler: Fundamento: Determina la capacidad de un organismo de utilizar un hidrato de carbono específico incorporado a un medio de crecimiento básico con producción o n o de gas u de SH2. El agar hierro de Kligler y el agar triple azucar (TSI) son medios diferenciales mixtos en tubo, en los que se puede determinar las fermentaciones de los hidratos de carbono, la producción de gas y la producción de SH 2 . El medio de Kligler contiene dos hidratos de carbono: lactosa y glucosa. El medio TSI lleva, además de estos dos azucares, sacarosa. Los fundamentos bioquímicos son los mismos en el Kligler que en el TSI. En este test se observan: La desintegración de los aminoácidos azufrados (cistina, cisteina, metatión, etc.) se detecta por el desprendimiento de SH2 que se traduce por un ennegrecimiento del medio debido a la formación de un sulfuro metálico, al reaccionar el SH2 con una sal de hierro. La fermentación de la lactosa se observa por el viraje de la parte superior del tubo inclinado. La fermentación de la glucosa se observa solamente por el viraje de la parte inferior debido a que la pequeña cantidad de glucosa se consume rápidamente en la superficie que se realcaliniza por el ataque a la pepton a (en caso de lactosa -) Esta fermentación puede estar acompañada con producción de gases o no ( H 2 y CO2 ) que se observa por la formación de burbujas o ruptura del medio. Material: Agar hierro de Kligler. Técnica: Tomar una colonia de un cultivo puro y con hilo de siembra, inocular hasta el fondo y a continuación en estria en la zona inclinada. La lectura se efectúa tras 16 a 24 horas de incubación a 37º. Resultados: a) Fermentación sólo de glucosa: - en la zona inclinada reacción alcalina: rojo. - en la zona profunda reacción ácida: amarillo. La fermentación alcalina/ácida se observa en aquellos organismos capaces de fermentar sólamente la glucosa, la zona inclinada es alcalina (roja) lo que indica degradación aeróbica de la glucosa ya que la concentración de glucosa en el medio (0,1%) es baja y el organismo la ha consumido y empieza a utilizar las peptonas como nutrientes para su crecimiento, esta utilización de la peptona produce liberación de NH 3 dand o pH alcalino con el rojo de fenol incorporado al medio. En la capa profunda del medio se observa color amarillo debido a la fermentación anaeróbica de la glucosa, con formación del productos terminales ácidos estables y por lo tanto pH ácido (amarillo). b) Fermentación de la glucosa y de la lactosa: - en la zona inclinada reacción ácida:amarillo - en la zona profunda reacción ácida:amarillo. La lactosa se encuentra en una concentración del 1% (10 veces más que la glucosa ) por lo que en el período de incubación 18-24 horas, ésta lactosa no se habrá consumido y la reacción permanecerá ácida. c) No fermentación de la glucosa ni de la lactosa: - en la zona inclinada reacción alcalina: rojo. - en la zona profunda : si el organismo es aeróbico no hay crecimiento y no hay cambio de color. Si el organismo es facultativo hay reacción alcalina : color rojo. Existen bacterias que no fermentan ni lactosa ni glucosa, consiguiendo los nutrientes de la peptona q ue contie ne el medio. Si la zona inclinada es alcalina y la zona profunda alcalina, se trata de un organismo que degrada la pepto na tanto aeróbica como anaeróbicamente. Si la zona inclinada es alcalina y la zona profunda sin cambio, es un organismo que sólo utiliza la peptona aeróbicamente. Cuando las peptonas son d egrad adas se p roduc e un pH alcalino por la liberación de NH que da al medio un color rojo intenso. d) Producción de gas: - formación de una o varias burbujas. - desdoblamiento del medio. - desplazamiento del medio. - ligera muesca en el lateral del tubo. d) Producción de SH2 : - color negro por toda la capa profunda que oculta la acidez. - anillo negro en la parte superior de la zona profunda. - precipitado negro en la zona profunda pero que no oculta totalmente la acidez.



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Coagulasa Descripción: Es una prueba que detecta las enzimas coagulasas, capaces de producir la coagulación del plasma . Fundamento: Se basa en la capacidad de este enzima de producir un coágulo visible al mezclar una suspensión de microorganismos con plasma oxalatado de conejo. Métodos: En tubo Reactivos: Plasma estéril, humano o de conejo, fresco o liofilizado.( 1) Procedimiento: 1) Poner 0,5 ml de plasma en un tubo estéril. 2) Añadir 0,5 ml de cultivo en caldo en fase exponencial o una colonia grande y aislada. 3) Homogeneizar suavemente. 4) Incubar en baño a 37ºC durante 4 horas. 5) Observar cada 30 minutos hasta las 4 horas. 6) En caso de negatividad incubar hasta las 24 horas. Lectura: Prueba en tubo: 30 minutos/ 4 horas/ 1 día. Resultado: Prueba positiva: Formación de un coágulo de plasma visible. Prueba negativa: Ausencia de un coágulo perfectamente formado. Utilización: Se utiliza para diferenciar Staphylococcus aureus (+) de otras especies de Staphilococcus (-). Precauciones: - Los microorganismos que utilizan el citrato pueden provocar la coagulación de un plasma citratado sin necesidad del enzima coagulasa. Para evitar estos falsos positivos, se recomienda añadir 5 uu de heparina por ml de plasma. - El plasma fresco debe ser repartido en alícuotas de 0,5 ml, congelándose posteriormente para una futura utilización. Control de calidad: Prueba positiva: Staphylococcus aureus Prueba negativa: Staphylococcus epidermidis Control de calidad del plasma: la adición de una gota de Cl 2Ca al 5% a 0,5 ml de plasma debe formar un coágulo

1.-

Es preferible el plasma de conejo al humano por dar coágulos más firmes y por producirse éstos más rápidamente.



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Pruebas para bacilos Gram negativos (API 10S) Beta galactosidasa (ONPG) Esta prueba determina la presencia del enzima beta galactosidasa, responsable de la ruptura del disacárido lactosa en dos monosacáridos: glucosa y galactosa Para que se produzca esta hidrólisis es necesario que la lactosa difunda hacia el interior de la bacteria, donde se producirá la hidrólisis y posterior fermentación de los azúcares. Esta difusión es facilitada por otro enzima, la galactósido-permeasa. La existencia de betagalactosidasa podría ponerse de manifiesto mediante la visualización de la disminución de pH, gracias a la presencia de un indicador de pH adecuado. Pero hay bacterias que, poseyendo la betagalactosidasa, no poseen permeasa, por lo que es difícil ver la hidrólisis de la lactosa y posterior utilización de los monosacáridos. El orto-nitrofenil-beta-D-galactopiranósido (ONPG) es una molécula que también es hidrolizada por la beta galactosidasa, dando lugar a un producto final, el ortonitrofenol, que confiere al medio una tonalidad amarillenta. Color inicial: Incoloro Prueba positiva: Amarillo débil Prueba negativa: Incolora Géneros con prueba positiva: Escherichia, Klebsiella, Enterobacter Fermentación de glucosa y arabinosa (GLU, ARA) La utilización de glucosa, ya sea por metabolismo fermentativo u oxidativo da lugar a productos finales ácidos que provocan el viraje a amarillo del indicador presente en la solución. Si el metabolismo es fermentativo, toda la cúpula de reacción vira a amarillo; si el metabolismo es oxidativo solo virará la zona aeróbica. Color inicial: Azul Prueba positiva: Amarillo limón Prueba negativa: Azul o azul verdoso Géneros con GLU positiva: Todas las enterobacterias Géneros con ARA positiva: Todas las enterobacterias menos Morganella, Proteus Providencia Lisina y ornitina decarboxilasa (LDC, ODC) Estas pruebas determina la presencia de estas dos enzimas, capaces de decarboxilar los aminoácidos lisina y ornitina dando lugar a dos sustancias, cadaverina y putrescina de carácter alcalino, que en presencia de un indicador da lugar a la aparición de un color púrpura Color inicial: Amarillo Prueba positiva: Rojo cereza, rojo anaranjado Prueba negativa: Amarillo Especies con LDC positiva: Variable Especies con ODC positiva: Variable Utilización de citrato (CIT) Esta prueba sirve para determinar si un microorganismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono para su metabolismo. El medio utilizado para la fermentación del citrato contiene sales de amonio inorgánicas, Si un microorganismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono para su metabolismo, utiliza también las sales de amonio como su única fuente de nitrógeno. Las sales de amonio se desdoblan en amoniaco (NH3) provocando la alcalinidad del medio y el viraje hacia un color azul intenso. Color inicial: azul claro Prueba positiva: Azul intenso Prueba negativa: Verde claro, azul claro Géneros con prueba positiva: Klebsiella, algunos Proteus



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Producción de SH2 (SH2 ) Esta prueba determina si se ha liberado ácido sulfhídrico por acción enzimática a partir de los aminoácidos que contienen azufre (cistina, cisteina y metionina), produciendo junto con determinados indicadores presentes en el medio, un precipitado visible de color negro Color inicial: Incoloro Prueba positiva: Negra Prueba negativa: Incoloro, grisáceo Géneros con prueba positiva: Proteus, Salmonella, Citrobacter Ureasa (URE) Determina la capacidad de un microorganismo de desdoblar la urea gracias a la enzima ureasa, formando dos moléculas de amoníaco que alcalinizan el medio y producen un viraje de color a rojo grosella. Color inicial: Amarillo Prueba positiva: Fucsia Prueba negativa: Amarillo Géneros con prueba positiva: Klebsiella, Proteus Triptófano desaminasa (TDA) Determina la capacidad de un microorganismo de desaminar la fenilalanina en ácido fenilpirúvico, con la consiguiente acidez resultante. La lectura de esta prueba se hace tras la adición de un reactivo: el cloruro férrico que provoca un cambio de color marrón fuerte en caso de positividad Color inicial: Incoloro Prueba positiva: Marrón oscuro Prueba negativa: Marrón claro o amarillo Géneros con prueba positiva: Proteus, Morganella Indol (IND) Esta prueba determina la capacidad de un microorganismo de formar indol a partir de una molécula de triptófano. Esta reacción es catalizada por un conjunto de enzimas que reciben el nombre de triptofanasa. El producto formado, el indol, es revelado mediante la adición de un reactivo, el reactivo de Kovacs. Color inicial: Incoloro Prueba positiva: Anillo rosa en superficie Prueba negativa: Incoloro Especies con prueba positiva: E. coli, K. oxytoca, P. vulgaris Reducción de nitratos a nitritos (NO2) Determina la capacidad de un microorganismo de reducir el nitrato en nitritos o en nitrógeno libre. Esta reacción se pone de manifiesto mediante la adición de dos reactivos que provocan la aprición de un color rojo sangre en caso de positividad. Esta prueba se hace después de la lectura de la cúpula de fermentación de la glucosa, añadiendo los reactivos 1 y 2 en dicho pocillo. La lectura se hace en los dos minutos siguientes a la adición de l reactivos Color inicial: Amarillo o azulado Prueba positiva: Rojo sangre lacada Prueba negativa: Amarillo o azulado Especies con prueba positiva: Escherichia, Klebsiella, Proteus



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