COLORAÇÃO DE GRAM
Fixação e coloração de microrganism os A morfologia individual e as reações tintoriais constituem, em geral, os critérios preliminares para identificação das bactérias e sua posterior classificação. O exame microscópico direto de um microrganismo é comumente suplementado com exame microscópico após coloração que, além de facilitar sua observação, permite a visualização de determinadas estruturas. Porém, antes de ser corado, o microrganismo deve ser fixado à lâmina, através de secagem por simples exposição ao ar ou secagem na chama. Existem inúmeros métodos para coloração. A introdução de colorações, no estudo dos microrganismos, veio a contribuir substancialmente com a Microbiologia, por quatro razões principais: 1. Permitem uma visualização melhor das células, já que nas preparações sem corantes são reveladas apenas o contorno e a conformação dos arranjos; 2. Permitem a caracterização de alguns componentes intracelulares; 3. Podem levar à diferenciação entre os grupos de microrgani microrganismos smos e 4. Podem, eventualmente, identificar identi ficar alguns grupos. Quanto aos tipos de coloração temos: 1. Coloração simples – cuja proposta é apenas tornar a forma forma e estrutura básica das células mais visíveis. 2. Coloração diferencial – nessa coloração o corante reage diferentemente com diferentes tipos de bactérias. A coloração de Gram e a álcool - ácido resistente são exemplos de colorações diferenciais. 3. Coloração especial – são aquelas utilizadas para corar e identificar partes específicas dos microrganismos como esporos (Conklin-Wirtz), flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas (Hiss). No processo de coloração podem ser usadas substâncias que intensificam a cor por aumentarem a afinidade do corante com seu espécime biológico. Essas substâncias são chamadas mordentes, e é o caso do iodo na coloração de Gram. Uma outra função do mordente é tornar uma estrutura mais espessa e mais fácil de visualizar após a coloração.
Preparação de esfregaços e coloração pelo método de Gram Método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1884) que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço
bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, iodo, etanol-acetona e fucsina básica. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Grampositivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. A coloração de Gram é uma coloração diferencial porque não cora todos os tipos de células igualmente. Essa maneira de reagir diferentemente, frente ao Gram, é em razão das diferenças na estrutura da parede celular das bactérias. Aquelas bactérias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta (CV) mais o iodo (complexo iodo pararosanilina) coram-se em violeta (Gram positivo), enquanto que as que não retém o complexo coram-se em vermelho (Gram negativo). Bactérias Gram(+) possuem uma camada de peptideoglicano mais espessa que as Gram(-).
Gram positiva
Parede celular constituída de uma camada grossa de peptídeoglicano
Membrana plasmática
Gram negativa
Complexo de membrana externa, com inclusões de lipopoliproteínas e lipossacarídeos Parede celular constituída de uma camada fina de peptideoglicano Membrana plasmática
Figura – Estruturas típicas das paredes de bactérias Gram positivas e Gram negativas Quando aplicado em células Gram (+) e Gram (-) o cristal violeta (CV) e o iodo penetram facilmente, e dentro das células eles se combinam para formar o complexo CVIodo, que é maior que a molécula de CV que penetrou. Por causa do seu tamanho o complexo não pode ser lavado das células Gram (+) pelo álcool e então estas células permaneceram coradas pelo CV e aparecem violeta. Nas células Gram (-) o álcool rompe a camada lipopolissacarídica e o complexo é lavado através da camada fina de peptideoglicano, que não consegue reter o complexo. Estas células são então contracoradas pelo segundo corante, a Safranina ou Fucsina e aparecem vermelhas. Esta coloração é o ponto de partida na identificação bacteriana, mas não deve nunca ser utilizada como um diagnóstico definitivo. É importante ressaltar que a coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil, quando corretamente realizada e interpretada.
Coloração de Gram – técnica O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido, com um corante primário, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gramnegativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona (1:1 v:v). O solvente dissolve a porção lipídica dasmembranas externas das bactérias Gram(-) e o complexo cristal violeta-iodo é removido, decorando as células. Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Gram (+) e provoca a contração dos poros do peptideoglicano, tornando-as impermeáveis ao complexo; o corante primário é retido e as células permanecem coradas. A etapa da descoloração é crítica, pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias, podendo produzir resultados falsos. A retenção ou não do corante primário é, portanto, dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura, densidade, porosidade e integridade. Em seguida, a amostra é tratada com um corante secundário, a fucsina básica. Ao microscópio, as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gramnegativas em vermelho ou rosa escuro. Células de bactérias Gram-positivas, células velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos, tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. Portanto, o uso de material fresco é importante. Por outro lado, resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento
com etanol-acetona for omitido. O corante cristal violeta pode ser substituído, com os mesmos resultados, pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituído pelo corante vermelho safranina. A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina, que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. O solvente etanolacetona pode ser substituído por álcool 95%.
PREP ARO DO ESFREGAÇO Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio líquido 1. Flambar a alça corretamente 2. Esfriá-la nas paredes do tubo 3. Introduzi-la no meio líquido de maneira que este forme um filme sobre a alça. 4. Colocar o material coletado sobre uma lâmina limpa e seca. 5. Espalhar o material sobre a lâmina, procurando obter um esfregaço fino. 6. Secar à temperatura ambiente. 7. Fixar o esfregaço na chama do bico de Bunsen, passando a lâmina algumas vêzes pela chama. OBS. Esperar que o esfregaço esteja completamente seco para fixálo. 8. Realizar a coloração. Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio sólido 1. Colocar com a própria alça, já flambada, uma gota de solução salina no centro da lâmina de vidro. 2. Flambar novamente a alça 3. Esfriá-la no meio sólido numa região sem colônia. 4. Coletar uma pequena quantidade do crescimento bacteriano. 5. Homogeneizar este material com a gota de água, cuidando para obter uma suspensão pouco densa e sem grumos. 6. Secar a lâmina por exposição ao ar. 7. Fixar o esfregaço.
COLORAÇÃO 1. Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. ATENÇÃO PARA NÃO COLOCAR A LÂMINA INVERTIDA!!!!!!!! 2. Lavar rapidamente em água corrente; 3. Cobrir todo o esfregaço com lugol por 1 minuto; 4. Lavar rapidamente em água corrente; 5. Lavar uma ou duas vezes, rapidamente, com a solução diferenciadora: álcool ou acetona; 6. Lavar rapidamente em água corrente;
7. Cobrir todo o esfregaço com fucsina básica por 30 segundos; 8. Lavar novamente em água corrente; 9. Secar a lâmina, tomando o cuidado de não remover o esfregaço; 10. Observar ao microscópio com objetiva de imersão (100x).
Observações importantes para obtenção de bons resultados na coloração de Gram. A solução de cristal-violeta deve ser semanalmente renovada, devendo ser filtrada para a remoção de precipitados. NÃO AGITAR O FRASCO!!!!!!!!!!!!!!!!! A etapa de descoloração é um passo crítico na coloração. Ela deve ser efetuada rapidamente. Porém, não tão rapidamente que a descoloração não possa ser completada. Os esfregaços não devem ser muito espessos, pois são mais difíceis de descorar e de permitir observações. Esfregaços obtidos com culturas velhas mostram irregularidades na coloração, com bactérias G (+) apresentando-se como G(-) e bactérias G(-) corando-se fracamente. Evitar estas culturas!
Questionário Descreva como são e do que se compõem as paredes das bactérias Gram positivas e Gram negativas? Cite alguns fatores que podem influenciar na coloração de Gram, podendo inclusive levar a erros?
