Práctica 4 Espectrofotometría: cuantificación de proteínas totales por el método de Biuret Objetivo 1: que el estudiante aprenda los conceptos teóricos relacionados a la espectrofotometría y cómo éstos son aplicados en el laboratorio de Bioquímica para la cuantificación de sustancias. Objetivo 2: realizar una determinación correctamente el resultado obtenido
espectrofotométrica
y
reportar
Fundamentos de espectrofotometría La luz puede ser clasificada de acuerdo a su longitud de onda. La luz con una longitud de onda corta, entre 200 nm y 400 nm se conoce como ultravioleta, mientras que aquella que posee una longitud de onda más larga, entre 700 nm y 900 nm se conoce como luz infrarroja cercana. La luz con longitudes de onda de entre los 400 nm a los 700 nm contempla el rango de luz de diferentes colores visible al ojo humano. ¿Qué ocurre cuando una radiación electromagnética atraviesa la materia? Si la radiación tiene energía adecuada con la estructura de la materia, ésta última podrá absorberla. La medición de la cantidad de luz absorbida puede ser usada para detectar, identificar moléculas y medir su concentración en solución. Esta medición se basa en la Ley de Beer y Lambert o simplemente Ley de Beer. Esta ley establece que la concentración de una sustancia es directamente proporcional a la cantidad de energía radiante absorbida por la sustancia, o inversamente proporcional al logaritmo de la energía radiante transmitida por la sustancia. Considérese un rayo de energía radiante con una intensidad inicial Io que se hace pasar a través de una celda de vidrio cuadrada contiendo una solución homogénea de una sustancia que absorbe luz de cierta longitud de onda, como se ilustra en la Figura 1.
Io
Is
Figura 1. Transmisión de energía radiante a través de una celda de vidrio, donde Io representa la intensidad de la luz incidente e Is representa la intensidad de luz transmitida. La intensidad de la energía radiante transmitida Is es menor a la intensidad inicial Io. debido precisamente a que la solución fue capaz de absorber cierta cantidad de energía radiante. La transmitancia para un compuesto en solución es definida como la proporción de luz incidente que es transmitida:
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Transmitancia=T= Is / Io. Esta proporción generalmente es expresada como un porcentaje de la siguiente forma: Porcentaje T= %T= Is / Io. X 100%
El concepto de transmitancia es importante porque solo la luz transmitida, no la absorbida, puede ser medida directamente en el laboratorio. Conforme la concentración del compuesto en solución aumenta, más luz será absorbida por el mismo y por lo tanto menos luz será transmitida. El porcentaje T varía de forma inversa y logarítmica con respecto a la concentración (Figura 2B). A esta relación se le llama absorbancia o A. Es decir: A= -log Is / Io.= -log T= log 1/T Para convertir T en %T, tanto el denominador como el numerador deben ser multiplicados por 100%: A= log 1/T X 100%= log 100% / %T Esta expresión es equivalente a: A= log 100% - log %T A= 2- log %T
(ecuación 1)
Mediante esta transformación matemática se obtiene entonces una relación entre la absorbancia y el porcentaje de transmitancia. En el laboratorio, una vez determinado el porcentaje de transmitancia, éste se transforma a absorbancia, la cual, según la ley de Beer es directamente proporcional a la concentración de una sustancia, como se observa en la Figura 2A. La mayoría de los instrumentos utilizados hoy en día para estas determinaciones, llamados espectrofotómetros, realizan esta conversión automáticamente, de forma tal que el valor reportado es la absorbancia, no la transmitancia. La función matemática que relaciona a la absorbancia con la concentración de una solución está dada por la ley de Beer en la forma: A=abc Donde A es absorbancia, a es el coeficiente de absortividad molar (una propiedad física propia de cada sustancia), b es la distancia en cm recorrida por la luz dentro de la solución (diámetro de la cubeta utilizada) y c es la concentración de la
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Absorbancia (A)
sustancia. Los valores de absorbancia no tienen unidades ya que las unidades del coeficiente de absortividad molar son recíprocas a las de b y c.
12
100
10
% T
8 6 4 2 0
0
0
5
10
15
Concentración
(A)
0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0
1
10000 1E+08 1E+12 1E+16 Concentración
(B)
Figura 2. Representación gráfica de la relación que existe entre la absorbancia (A) y el porcentaje de transmitancia (B) con respecto a la concentración de una sustancia. La determinación se realiza utilizando muestras de concentración conocida que se denominan patrones o estándares. La mayoría de las sustancias a cuantificar en bioquímica no poseen color. Por lo tanto es necesario acoplar algún tipo de reacción química que involucre la aparición o desaparición de un cromógeno con la sustancia a cuantificar. Generalmente se escogen cromógenos cuyo coeficiente de absortividad molar sea alto ya que mayor será la absorbancia a medir y por tanto la técnica tendrá mayor sensibilidad. El siguiente paso es corroborar bajo qué condiciones se cumple la ley de Beer, es decir cuál es la longitud de onda apropiada para realizar las mediciones y qué concentraciones son las adecuadas. Para ello se determina la absorbancia de la sustancia en cuestión a diferentes concentraciones. Las soluciones de concentración conocida que se preparan para este propósito se conocen como patrones o estándares. La relación absorbancia versus concentración debe generar un gráfico que demuestre una línea recta cuyo intercepto en el eje de las abscisas y las ordenadas es cero (Figura 2A). Una vez que se ha realizado este paso se puede entonces determinar la concentración de una solución midiendo su absorbancia y extrapolando dicho valor en el gráfico. Debido a que existe una relación lineal entre ambas variables, es posible relacionar la concentración desconocida a un solo estándar (generalmente el que tiene la absorbancia más similar a la muestra) mediante una simple relación de tres: Ae = Ce Am Cm
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Donde Ae es la absorbancia del estándar, Am es la absorbancia de la muestra, Ce es la concentración del estándar y Cm es la concentración de la muestra. Esta relación se convierte en: Cm= Am X Ce Ae Esta última ecuación es válida solo si el cromógeno a detectar cumple con la ley de Beer y tanto estándares como muestra son medidos bajo las mismas condiciones. Otra forma más exacta es determinar la ecuación de la línea recta generada y de ésta extrapolar el valor de concentración de la muestra incógnita. El rango de concentración dentro del cual un cromógeno cumple con la ley de Beer debe determinarse experimentalmente. La ley de Beer es una relación matemática ideal que contiene ciertas limitaciones. Desviaciones de la misma, es decir circunstancias en las cuales la relación entre la absorbancia y la concentración de una muestra no es lineal pueden ocurrir cuando: 1. La concentración de la solución a medir es muy elevada 2. La luz incidente no es monocromática 3. La cantidad de luz absorbida por el solvente es significativa con respecto a la sustancia en solución que se desea medir 4. Hay luz transmitida que no es generada a partir de la sustancia a cuantificar 5. Los lados de la celda donde se deposita la muestra no son paralelos 6. Mezcla de varias especies químicas que absorben luz de la misma longitud de onda: las especies “competirán” entre sí por la luz, cada una con diferente absortividad. Cada uno de los puntos mencionados anteriormente puede evitarse haciendo un uso correcto del espectrofotómetro como se enseñará en la práctica de laboratorio de hoy, además de una buena aplicación de la teoría de la ley de Beer en la práctica. En el caso del punto uno, la mejor forma de evitar esta situación es diluyendo la muestra a cuantificar. En el caso del punto dos, es necesario tener una buena fuente de energía radiante. La mayoría de los instrumentos de buena calidad la poseen hoy en día. Para el punto tres, es necesario corroborar que la cantidad de luz absorbida por el solvente no es significativa. Para ello, se debe utilizar cada vez que se hace una determinación espectrofotométrica el blanco reactivo. El blanco reactivo es una muestra más que contiene todos los componentes utilizados para la determinación (por ejemplo agua, reactivo, etc) excepto el compuesto a medir (ver sección de procedimiento). La cantidad de luz transmitida por este blanco no debe ser detectada por el aparato. Para ello, el espectrofotómetro se ajusta manualmente de forma tal que esta cantidad de luz no sea medida. Este procedimiento se conoce comúnmente como “calibración del cero”, es decir, la cantidad de absorbancia del blanco es reconocida o cuantificada como cero por el aparato. En el caso del punto cuatro, es necesario asegurarse de que no
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existan otras fuentes de luz cercanas cuando se hace la medición. Para evitar la situación expuesta en el punto cinco, se deben utilizar celdas certificadas, las cuales son hoy en día fáciles de conseguir a un precio razonable. Por último, para evitar el aspecto mencionado en el punto seis, es necesario asegurarse de que el compuesto a medir se encuentre en solución de forma pura o en presencia de otros compuestos que no absorben a la misma longitud de onda. Es también imprescindible recordar que si se hacen mediciones en el rango de luz ultravioleta es necesario utilizar celdas de cuarzo, ya que el vidrio absorbe luz a esas longitudes de onda. En la práctica del día de hoy se determinará la concentración de proteínas en una muestra de suero. Dado que la mayoría de las proteínas no absorben luz dentro del rango de longitud de onda visible, es necesario acoplar una reacción química que genera color y así poder cuantificarlas.
Fundamento de la prueba Las proteínas y péptidos reaccionan con iones de cobre en solución alcalina, formando un quelato color violeta de configuración desconocida. La intensidad de color es directamente proporcional a la concentración de proteínas presente en la muestra.
Reactivos A. Reactivo de Biuret: Disolver 1.9 g de CuSO4.5H2O y 3,35 g de Na2EDTA en 350 ml de agua destilada. Agregar lentamente y con agitacion constante 100 ml de solución fresca de NaOH 5 mol/l. Aforar a 500 ml con agua destilada. B. Solución patrón de proteínas: preparación comercial, generalmente de 6g/dl. C. Muestras: suero o plasma de diferentes especies animales.
Procedimiento Precaución: el día de hoy usted trabajará con muestras biológicas. Una regla de oro preventiva es trabajar cualquier muestra biológica como potencialmente infecciosa. El uso de guantes es recomendado. Si ocurre algún derrame, avise inmediatamente al instructor más cercano.
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A. Se obtienen muestras de plasma o suero por centrifugación de la sangre total de diferentes especies animales, utilizando citrato de sodio al 3.8% como anticoagulante o sin anticoagulante.
B. Rotular 3 tubos de ensayo como “muestra”, “patrón” y “blanco reactivo”. Añadir a cada tubo: Reactivo Biuret Agua destilada Estándar 6g/dl Muestra
Tubo blanco 2 ml 20 μl -
Tubo estándar 2 ml 20 μl -
Tubo muestra 2 ml 20 μl
C. Mezclar e incubar los tubos por 10 minutos a temperatura ambiente. D. Leer la absorbancia a una longitud de onda de 550 nm en el espectrofotómetro o en el fotómetro a 540nm.
Notas A. El color del complejo proteico es estable al menos por 1 hora. B. La ley de Beer y Lambert se cumple hasta los 10g/dl
Cálculos [Proteínas totales] = Absorbancia de la muestra X [patrón] Absorbancia del patrón
Resultados A. Calcule la concentración de proteínas totales de su muestra, describiendo detalladamente los pasos matemáticos realizados.
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B. Cuáles son los valores de referencia para la especie animal a la que pertenece la muestra que usted cuantificó? Se encuentra el valor obtenido para su muestra dentro de los valores de referencia?
C. Qué patologías pueden presentar niveles elevados o niveles bajos de proteínas totales. Averigüe.
D. ¿Por qué es importante agitar los tubos de ensayo después de preparar las disoluciones, particularmente en esta determinación? 49
E. ¿Qué aparato se utiliza en esta práctica? Describa sus componentes internos.
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Bibliografía -Amato M, S y Granados P, F. Manual de Laboratorio. Cátedra de Bioquímica. Universidad Nacional, 1994 -Angulo Ugalde, Y. Bioquímica Manual de Laboratorio. Universidad de Costa Rica. 1999 -Kaplan, L et al. Clinical Chemistry: theory, analysis and correlation. 2nd edition. CW. Mosby Company, 1989 -Switzer, R. y L. Garrity. Experimental Biochemistry: Theory and exercises in fundamental methods. 3rd edition, Freeman and Company, New York 1999
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