Determinacion Del Punto Isoelectrico De La Caseina
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Categoría: Temas Variados Enviado por: Helena 24 abril 2011 Palabras: 4027 | Páginas: 17
... rmas esferoidales y no establecen interacciones intermoleculares como son los puentes de hidrógeno (característicos de las proteínas fibrosas) siendo solubilizadas en suspensiones coloidales. En la leche hay tres clases de proteínas: caseína, lacto albúminas y lacto globulinas (todas globulares). La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca. Las fosfoproteinas son un grupo de proteínas que están químicamente unidas a una sustancia su stancia que contiene ácido fosfórico. En la caseína la mayoría de los grupos fosfato están unidos por los grupos hidroxilo de los aminoácidos serina y treonina. La caseína en la leche se encuentra en forma de sal cálcica (caseinato cálcico). La caseína representa cerca del 77% al 82% de las proteínas presentes en la leche y el 2,7% en composición de la leche líquida. La caseína está formada por alpha(s1), alpha(s2)-caseína, ß-caseína, y kappa-caseína formando una micela o unidad soluble. Ni la alfa ni la beta caseína son solubles en la leche, solas o combinadas. Si se añade la kappa caseína a las dos anteriores o a cada una de ellas por separado se forma un complejo de caseína que es solubilizado en forma de micela. Esta micela está estabilizada por la kappa caseína mientras que las alfa y beta son fosfoproteínas
que precipitan en presencia de iones calcio. PROTEINAS: Los aminoácidos son la unidad principal de toda proteína. Su fórmula clásica es: R-CH-COOH NH2 Normalmente se encuentran como iones dipolares. Al unirse mediante enlaces peptídicos pierden una molécula de agua. Se conocen en la actualidad 21 a.a. que forman parte de las proteínas. 10 son no esenciales para el hombre (12 para adultos). Todos son L-aaminoácidos en mamíferos. La estructura presenta actividad óptica por ser el carbono a un carbono quiral. El único a.a. que no es quiral es la glicina. En las células puede haber otros aa diferentes pero no forman proteínas (ej. GABA). Los aminoácidos pueden clasificarse como alifáticos, aromáticos, azufrados, hidroxilados, ácidos, básicos, y con grupo amida. Existen polipéptidos no proteicos como el glutatión, el TRH, etc. Las proteínas, característicamente tienen estructuras tridimensionales bien definidas que les permiten tener funciones biológicas muy específicas. Para comprender por qué una proteína tiene una forma y para reconocer que fuerzas la estabilizan, se han establecido niveles de estructura: 1. Estructura primaria: se refiere a la secuencia lineal de los aminoácidos y a los puentes disulfuro entre cisteínas. Es la proteína con sólo sus enlaces covalentes. La secuencia de aa es la que condiciona los siguientes niveles de conformación. 2. Estructura secundaria. Se relaciona con el orden regular y repetitivo en el espacio. Existen dos formas estructurales que son la hélice a (vueltas cada 3-6 residuos con giro hacia la derecha y se mantiene por interacciones entre el C=O y el NH de residuos cercanos, es espontánea y muy estable) y lámina b plegada (con cadenas en zigzag enlazadas transversalmente por puentes de hidrógeno entre grupos C=O y H-N de cadenas adyacentes. 3. Estructura terciaria. Se refiere a cómo la cadena polipeptídica se pliega para formar una estructura compacta tridimensional relacionada con la función biológica. Depende de los grupos R de los aminoácidos y de su relación con el medio y con grupos prostéticos. Para adquirir estructura globular, muchas veces es necesario que la dirección de la cadena polipeptídica cambie de manera brusca, esto se logra mediante un asa b o pliegue apretado. Se da por un puente de hidrógeno entre el carbonilo de un residuo y la amida de un aminoácido tres posiciones adelante, prolina y glicina normalmente. 4. Estructura cuaternaria. Se refiere a proteínas que tienen dos o más cadenas polipeptídicas unidas por fuerzas no covalentes. Se denominan oligómeros. V.g. la hemoglobina y la RNA polimerasa. Aplicaciones de la caseína
La caseína generalmente se emplea en la industria para la fabricación de pinturas especiales y la preparación de tejidos, clarificación de vinos, elaboración de preparados farmacéuticos, la fabricación de plásticos (botonería, peines y mangos de u tensillos), pinturas la cual a sido usada desde la antigüedad por los egipcios, pegamento en relojería, carpintería 8recomendadas para maderas terciadas), papel, vidrio, porcelana. La caseína industrial se vende en grano, fino o grueso. La harina de caseína esta es finalmente molida. Caseína αs1 La caseína αs1 es la mayoritaria en la leche de vaca. La variante más común tiene 199
aminoácidos en su secuencia, con 8 ó 9 grupos fosfato. Desde el punto de vista estructural, está formada por tres regiones hidrofóbicas, con dos de ellas situadas en los extremos (aminoácidos 1-41, 90-113 y 132-199), y una zona muy polar (entre los aminoácidos 42 y 80), en la que se encuentran todos los grupos fosfato menos uno, lo que le da una carga neta negativa muy importante al pH de la leche (alrededor de 6,6). La caseína αs1 de vaca
contiene 17 restos de prolina, distribuidos a lo largo de toda la cadena, lo que hace que tenga muy pocas zonas con estructura secundaria organizada. La asociación con otras moléculas de caseína se produce a través de interacciones hidrofóbicas en las que está implicada fundamentalmente la zona situada entre los aminoácidos 136 y 196. Caseína αs2
Esta caseína está formada, en la vaca, por 207 aminoácidos Se conocen varias variantes genéticas, y también varias variantes en el grado de fosforilación. La máxima fosforilación afecta a 12 serinas y una treonina. Esta caseína tiene un puente disulfuro entre las cisteínas que ocupan las posiciones 36 y 40 de la secuencia, y es más hidrofílica que la caseína αs1,
con tres regiones de carga neta negativa, una de ellas en el extremo N-terminal. En la zona del extremo C-terminal se sitúan aminoácidos hidrofóbicos y con carga neta positiva. Caseína β La caseína β es la caseína más hidrofóbica, y presenta además estructura particular, con una
clara división en dos zonas. La que corresponde al extremo C-terminal es particularmente hidrofóbica, mientras que los aminoácidos más hidrofílicos, y todos los grupos fosfato unidos a serinas, se concentran en el extremo N-terminal. La variante genética más común en la vaca está formada por 209 aminoácidos, con cinco grupos fosfato. Caseína κ La caseína κ tiene una estructura claramente distinta de la de las otras caseínas. En primer
lugar, es algo más pequeña, estando formada, en la vaca, por 169 aminoácidos. Además está muy poco fosforilada, teniendo solamente un grupo de fosfato. Esto hace que interaccione con el ión calcio mucho menos que las otras caseínas. Sin embargo, comparte con la caseína β la propiedad de tener zonas predominantemente hidrofílicas e hidrofóbicas
bien marcadas y separadas.
Una particularidad de esta caseína es la presencia de una zona con carga neta positiva entre los aminoácidos 20 y 115. Esta zona con carga neta positiva permite la interacción de la caseína con polisacáridos como los carragenanos, que tienen carga negativa. También tiene en la cadena dos grupos de cisteína. La caseina κ es la única caseína que tiene parte de las moléculas glicosiladas. El grupo
glucídico está formado o bien por un trisacárido o bien por un tetrasacárido unido a un resto de treonina, o bien en la treonina que ocupa la posición 131, en la 133, o bien en otra más próxima aún al extremo carboxilo-terminal de la cadena. Dada la presencia de ácido Nacetil neuramínico, este grupo glucídico aporta carga neta a la caseína &kappa. La caseína κ se rompe fácilmente por proteolisis en el enlace situado entre la fenilalanina
105 y la metionina 106, en una región rica en restos de prolina y probablemente fácilmente accesible. Cuando esta proteolisis se produce, el fragmento N-terminal 1-105 (para κ caseína), que es fundamentalmente hidrofóbico, queda unido a las otras caseínas en la micela, mientras que el fragmento C-terminal 106-169 (caseino macropéptido), muy hidrofílico, y en el que está situado el resto glucídico en las moléculas glicosiladas, queda libre en solución. Caseína γ Recibe el nombre de caseina γ un conjunto de fragmentos de la caseína β formados por la
acción de la plasmina, una proteinasa presente en la leche. En condiciones normales, esta “caseína” representa alrededor del 3% del total de caseínas. Los fragmentos de caseína β
más pequeños formados en este proceso proteolítico quedan eln el lactosuero, y reciben el nombre de “fracción proteosa - peptona”. Existe otra caseína que aparece en pequeña proporción que se asume es un producto de la rotura de algunas cadenas de la caseína b. Las proporciones en las que aparece cada especie son: a: 50%, b: 30% k: 15% g: 5% La caseína aparece en la leche en forma de sal cálcica. La estructura del caseinato de calcio es bastante compleja. En realidad las caseínas a y b no son solubles en la leche en presencia del calcio (el grupo fosfato es muy insoluble en presencia de calcio). Sin embargo si se añade caseína k, el conjunto se solubiliza al formar una estructura para la que se postula la siguiente forma. Qué hay en la leche? Como J.C.T van den Berg explica: " la leche es el primer alimento que el recien nacido ya sea humano o el mamífero recibe. Describiendola por su propósito, es un alimento que
contiene todos los nutrientes que el recién nacido requiere. Inclusive más allá del período de la lactancia, sigue siendo el alimento más completo para los seres humanos y los mamíferos. Algunos minerales y vitaminas esenciales tales como el hierro y la vitamina D, sin embargo, no estan presentes en suficientes cantidades, o en proporciones óptimas, para satisfacer los requisitos para una nutrición completa. Durante el primer período de su vida, el animal joven por lo tanto compensa la escasez de ciertos alimentos en la leche explotando las reservas que recibe de su madre en el nacimiento, que son normalmente suficientes hasta que su dieta incluye otros alimentos. Para hacer los nutrientes fácilmente consumidos y digeridos, están disponibles en estado líquido, en parte como solución, en parte como suspensión. Hay una amplia variación en el balance de componentes entre la leche de varios mamíferos, aunque los componentes mismos son básicamente iguales " (van den Berg 1988, p.5) Animales lactantes. Las varias especies producen cantidades perceptiblemente diversas de leche. Incluso dentro de la misma especie hay variaciones amplias en la producción, en gran parte dependiendo de: • Propósito doméstico • Raza y calidad genética • Condiciones ambientales • Condiciones psicológicas • Nivel de administración
En general, los animales productores dominantes en una región reflejan las condiciones geográficas y climáticas. Las cabras, por ejemplo, pueden ser manejadas con éxito en regiones montañosas con áreas pobres de pasto, que serían absolutamente inadecuadas para otros animales. Composición de la leche (g/100g) en diferentes especies. La caseína está formada por alpha(s1), alpha(s2)-caseína, ß-caseína, y kappa-caseína formando una micela o unidad soluble. Ni la alfa ni la beta caseína son solubles en la leche, solas o combinadas. Si se añade la kappa caseína a las dos anteriores o a cada una de ellas por separado se forma un complejo de caseína que es solubilizado en forma de micela. Esta micela está estabilizada por la kappa caseína mientras que las alfa y beta son fosfoproteínas que precipitan en presencia de iones calcio. La kappa caseína, sin embargo, tiene pocos grupos fosfato y un alto contenido de carbohidratos unidos a ella. También tiene todos sus residuos de serina y treonina con sus correspondientes grupos hidroxilo, así como los carbohidratos dispuestos en una sola cara
de su superficie por lo que esta parte exterior es fácilmente soluble en agua gracias a los grupos polares que posee. La otra parte de su superficie se une fácilmente a las alfa y beta caseína insolubles, lo que da lugar a la formación de la micela. La propiedad característica de la caseína es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la caseína cargada negativamente y solubilizada como sal cálcica. Si se añade ácido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza ( los grupos fosfato se protonan) y la proteína neutra precipita. La conformación de la caseína es similar a las proteínas desnaturalizadas globulares. El alto numero de residuos de prolina en la caseína causa un especial plegamiento en la cadena de proteína e inhibe la formación de una fuerte y ordenada estructura secundaria. La caseína no contiene puentes di sulfuro. De igual manera la falta de estructura secundaria es importante para la estabilidad de la caseína frente a la desnaturalización por calor. Proteína. Las proteínas son el alimento más importante de la leche y una parte esencial de nuestra dieta. Están presentes como solución en la leche, y las proteínas que consumimos se rompen en compuestos más simples en el sistema digestivo y el hígado. Entonces estos compuestos se transportan a las células del cuerpo, donde se utilizan como material de construcción para construir la propia proteína del cuerpo. Ciertas proteínas activas, las enzimas, controla a la gran mayoría de las reacciones químicas que ocurren en un organismo. Las proteínas son moléculas gigantes acumuladas de unidades más pequeñas llamadas los aminoácidos, y una molécula de proteína consiste en una o más cadenas entrelazadas de aminoácidos. Vitaminas Las vitaminas son sustancias orgánicas que ocurren en concentraciones muy pequeñas en plantas y animales. Las vitaminas dan a la leche su gusto y son esenciales para los procesos normales de la vida. Su composición química es generalmente muy compleja, y las varias vitaminas son señaladas por mayúsculas, seguidas a veces por subíndices numéricos, e.g. A, B1,B2. La leche, contiene muchas vitaminas y entre las mejores y mas conocidas están A, B1, B2, C y D. las Vitaminas A y D son solubles en grasa, o solventes grasosos, mientras que las otras son solubles en agua. Enzimas. Las enzimas (catalizadores) son un grupo de proteínas producidas por los organismos vivos. Tienen la capacidad de disparar reacciones químicas y de afectar el curso y velocidad de tales reacciones, y pueden hacerlo sin ser consumidas.La acción de las enzimas es específica: cada tipo de enzima cataliza solamente
un tipo de reacción. Dos factores que influencian fuertemente la acción enzimática, son temperatura y el pH. Varias de las enzimas en leche se utiliza para pruebas de calidad y control. La LIPASA parte la grasa en el glicerol y los ácidos grasos libres. Cuando se ha dañado la leche, la lipasa causa diferencias en gusto. Por ejemplo, los ácidos libres en exceso en la leche y los productos lácteos dan lugar a un gusto rancio. Muchos microorganismos producen la lipasa. El PEROXIDASE Se activa si la leche se calienta a 80 °C por algunos segundos. Esto se puede utilizar para probar la presencia o ausencia del peroxidase en leche y de tal modo para controlar si o no, la temperatura de pasterización sobre 80 °C se ha alcanzado. CATALASE parte el peróxido de hidrógeno en el agua y oxígeno libre. La leche de ubres enfermas tiene un alto contenido del catalase, mientras que la leche fresca de una ubre sana contiene solamente una cantidad insignificante. PHOSPHATASA puede partir ciertos ésteres del ácido-fosfórico en ácido fosfórico y alcohol. La phosphatasa es destruida por la pasterización ordinaria (72 °C por 15 segundos). La prueba del phosphatasa se puede utilizar para determinarse si la temperatura de la pasterización ha sido lograda. PUNTO ISOELECTRICO Todas las macromoléculas de la naturaleza adquieren una carga cuando se dispersan en agua. Una característica de las proteínas y otros biopolímeros es que la carga total que adquieren depende del pH del medio. Así, todas las proteínas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que se encuentren y de los aminoácidos que la componen, así como de las cargas de cualquier ligando que se encuentre unido a la proteína de forma covalente (irreversible). Debido a la composición en aminoácidos de la proteína, los radicales libres pueden existir en tres formas dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y aniónicos. Cualquier proteína tendría una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo suficientemente ácido debido a que los grupos COOH de los aminoácidos aspártico y glutámico estarían en su forma neutra pero los grupos amino de Arginina y lysina estarían protonados (-NH3 +).
De igual forma si la proteína se encuentra en un medio con un pH muy alto estaría cargada negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo estarían desprotonados (COO-) y los grupos amino estarían en su forma neutra (NH2). De lo anterior se deduce que las proteínas tienen un pH característico al cual su carga neta es cero. A este pH se le denomina punto isoeléctrico (pI). En el punto isoeléctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su agregación Materiales Beaker de 100ml Balón volumétrico de 50 ml Microburetas Tubos de ensayo Reactivos NaOH Acido acético 1N Acido acético 0.1N Acido acético 0.01N Caseína pa Procedimiento 1. Pesamos 0.25gr de caseína, y le adicionamos 20ml de agua destilada. 2. Agregamos 5ml de solución de hidróxido de sodio (NaOH). Agitamos hasta disolver por completo la caseína. 3. Adicionamos 5ml de solución de acido acético (CH3COOH) 1N, enrazamos el balón volumétrico hasta 50ml. 4. Luego preparamos 4 micro buretas rotuladas así: agua destilada, acido acético 0.01N, acido acético 0.1N y acido acético 1N.
5. Preparamos 9 tubos de 20*200mm y adicionar a c/u 1ml de caseína. Preparación de soluciones tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 H2o 8.38 7.75 8.75 8.5 8 7 5 1 7.4 Acid0 .01N .62 1.25 - - - - - - Acido 0.1N - - .25 .5 1 2 4 8 Acido 1N - - - - - - - - 1.6 PH 9.7 9.9 5.8 4.85 9.5 4.7 4.2 3.75 3.4 turbidez 0 0 0 5 0 3 5 5 0 6. Usamos una escala de 0 a 5 cruces anotamos el grado de turbidez de c/u de los tubos. El mayor grado de turbidez se deberá presentar donde el pH es más cercano al punto isoeléctrico de la proteína. 7. Medimos el pH de cada tubo Nota: el procedimiento para el tubo 4 debio realizarse nuevamente ya que la primera vez no dio buen resultado, debido a el posible mal manejo y a suciedad en el tubo lo mismo se tubo que hacer con el tubo numero 5 por las mismas causas Resultados: Tubo #1: En este observamos que no presento turbidez ni precipitado lo que indica que no encontró punto isoelectico, no siendo las cargas neutras y su ph fue 9.7. Esto se puede verificar observando esta muestra que es la primera de derecha a hizquierda en la figura 2 de los anexos Tubo #2: en este observamos que de igual forma no presento turbidez ni presipitado pero lo que indica que su ph esta mas lejano al punto isoeléctrico, su ph fue 9.9 ver siguiente tubo en la figua 2 en anexos Tubo #3: no presento turbidez ni precipitado lo que indica de que también esta lejano su ph del punto isoeléctrico, su ph fue de 5.8 Tubo #4: este tubo si presento un gradote turbidez 5 sin precipitado, sin cruces y su pH fue de 4.85 lo que quiere decir que esta mas cercano alpunto isoelectrico (ver tubo en figura 2) Tubo #5: no presento turbidez ni precipitado, la primera vez dio un phde 9.5, luego se repitio presentando turbidez indicando asi su cercania al punto isoelectrico (en la figura 2 solo se aprecia la primera muestra)
Tubo #6: presento turbidez , lo que indica su cercania al punto isoeléctrico y presento un ph de 4.7 Tubo #7: turbidez con precipitado, su pH fue de 4.2 lo que indica que las cargas son neutras y se encontro el punto isoelectrico (ver figura 2 este tubo) Tubo #8: turbidez sin precipitado, sin cruces y su pH fue de 3.75 Tubo #9: turbidez sin precipitado, sin cruces y su pH fue de 3.4 CONSULTAS En 1909, el químico danés Sorensen definió el potencial hidrógeno ( pH ) como el logarítmo negativo de la concentración molar ( mas exactamente de la actividad molar ) de los iones hidrógeno. Esto es: pH = - log [H + ] Desde entonces, el término pH ha sido universalmente utilizado por la facilidad de su uso, evitando asi el manejo de cifras largas y complejas. Por ejemplo, una concentración de [H+] = 1x10-8 M ( 0.00000001) es simplemente un pH de 8 ya que : pH= - log[10-8] = 8 La relación entre pH y concentración de iones H se puede ver en la siguiente tabla, en la que se incluyen valores típicos de algunas sustancias conocidas: Tubo N°1 Su concentración de H+: 109.7= 5011872336 log=9.7 Tubo N°2 Su concentración de H+: 109.9= 794328347 log=9.9 Tubo N°3 Su concentración de H+: 105.8=630957.344 log= 5.8 Tubo N°4 Su concentración de H+: 104.85=70794.578 log= 4.85 Tubo N°5
Su concentración de H+: 109.5=3162277660 log= 9.5 Tubo N°6 Su concentración de H+: 104.7= 50118.723 log= 4.7 Tubo N°7 Su concentración de H+: 104.2= 15848.932 log= 4.2 Tubo N°8 Su concentración de H+: 103.75= 5623.413 log= 3.75 Tubo N°9 Su concentración de H+: 103.4= 2511.886 log= 3.4 CONCLUCIONES • pudimos comprobar que lo tubo 6 fue el único que alcanzo su punto isoelectronico por
que existe una concentración de iones de hidrogeno o un pH en el cual, la proteína no tiene ninguna carga eléctrica y como no hay carga entonces esta no interactúa con el medio y se vuelve insoluble. • También pudimos darnos cuenta que el punto isoeléctrico (pI) de la caseína es 4.6. A este
pH, la caseína se encuentra en su punto de menor solubilidad, debido a la reducción de repulsiones intermoleculares, por lo que precipita. y esta a diferencia de muchas otras proteínas, la caseína no precipita al calor. ANEXOS Figura 1 Figura 2 BIBLIOGRAFÍA • www.geosalud.com/Nutricion/trigliceridos.htm
• laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/triacilgliceridos.html • www.eufic.org/article/es/page/RARCHIVE/expid/review-fats/ • sefh.interguias.com/basedatos.privada/oral/Carpeta%20A-
Z/E/enzimas%20pancreaticas/pancreatina.html • www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/biotec_FQbiomol/Practica3FQB.pdf • espanol.answers.yahoo.com/question/index?qid=20061124150749AA7B26o • arturobola.tripod.com/ph.htm
. CONCLUCIONES • pudimos comprobar que lo tubo 6 fue el único que alcanzo su punto isoelectronico por
que existe una concentración de iones de hidrogeno o un pH en el cual, la proteína no tiene ninguna carga eléctrica y como no hay carga entonces esta no interactúa con el medio y se vuelve insoluble. • También pudimos darnos cuenta que el punto isoeléctrico (pI) de la caseína es 4.6. A este pH, la caseína se encuentra en su punto de menor solubilidad, debido a la reducción de repulsiones intermoleculares, por lo que precipita. y esta a diferencia de muchas otras proteínas, la caseína no precipita al calor. BIBLIOGRAFÍA • • • •
www.geosalud.com/Nutricion/trigliceridos.htm laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/triacilgliceridos.html www.eufic.org/article/es/page/RARCHIVE/expid/review -fats/ sefh.interguias.com/basedatos.privada/oral/Carpeta %20A-
Z/E/enzimas%20pancreaticas/pancreatina.html • www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/biotec_FQbiomol/Practica3FQB.pdf • espanol.answers.yahoo.com/question/index?qid=20061124150749AA7B26o • arturobola.tripod.com/ph.htm
para los temas de bioquimica
. http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/practicasgenerales.htm
