Determinación cuantitativa de proteínas solubles por el método de biuret Ángela Ruiz, Angélica Quiroz Quiroz & Carlos Maje Estudiantes Del Del V semestre de Ingeniería De Alimentos Docente !udi "il#a $ni#ersidad De %a Amazonia A#d A#d Circun#alar, 'arrio (or#enir )lorencia *Ca+uet 'io+uímica A-ril ./01 -------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Resumen: (ara el estudio de la estructura de una 2roteína, de la acti#idad de una enzima o el contenido 2roteínico de un alimento, es necesario conocer cuantitati#amente la concentraci3n de las 2roteínas 2or tal raz3n en esta 2rctica se utiliz3 el método de 'iuret con el o-jeti#o de conocer la concentraci3n de 2roteína contenida en la clara de 4ue#o, 4ue#o, donde se realizo una cur#a estndar, estndar, al des2ejar la ecuaci3n ecuaci3n la cur#a se o-tu#o 05/,06mg7 ml de al-umina 8 en 2orcentaje se o-tu#o 059 Palabras
claves: cuantifi cuantificaci cación ón de proteína proteínas, s, Biuret, Biuret, curva curva patrón, patrón,
espectrofotometría.
Introducción
Estimar la concentraci3n de 2roteína es necesario no solo solo en los la-o la-ora rato tori rios os de in#e in#est stig igac aci3 i3n, n, sino sino tam-ién en la industria alimenticia, :armacéutica, 8 -iotecnol3gica en general E;isten muc4os métodos 2ara la determinaci3n de 2roteínas (rimiti#amente, la cantida cantidadd de 2roteí 2roteínas nas se e#alua e#alua-a -a midien midiendo do la cantidad total de nitr3geno 2roteico, 8 teniendo en cuenta +ue este elemento re2resenta a2ro;imadamente el 0<9 del 2eso de una 2roteína Este era un método largo 8 la-orioso 8 con 2oca sensi-ilidad %a a2arici3n de métodos calorimétricos 4a 2ermit 2ermitido ido sol#en sol#entar tar estos estos dos incon# incon#eni enient entes es =Arellano & Du4alt, s:> Entre los métodos +ue se -asan en la :ormaci3n de com2 com2le lejo joss colo colori rimé métr tric icos os entre entre las las 2rot 2roteí eína nass 8 reacti reacti#os #os es2ecí es2ecí:ic :icos os se encuen encuentra tran n el método método de 'iuret, el método de %o?r8 8 el método de 'rad:ord
@omado de MA$A% (RÁC@ICA" %A'BRA@BRIB DE 'IBQ$MICA
DE
%os tres métodos tienen como 2rinci2io alguna reacci3n +uímica de los gru2os al+uilo o arilo de los di:erentes aminocidos
Materiales y métodos %os materiales utilizados en esta 2rctica :ueron H tu-os de ensa8o, una gradilla, un -eaer, un agitador el es2ectro:ot3metro, dos 2i2etas Reacti#os soluci3n de al-umina de 4ue#o, reacti#o de 'iuret, aCl
El método de 'iuret es la técnica ms sim2le 2ara la determinaci3n de 2roteínas solu-les, las sustancias +ue contienen dos o ms enlaces 2e2tídicos :orman un com2lejo 2ur2ura*#ioleta con sales de co-re =II> alcalinas =:igura 0> Es 2osi-le +ue el color se :orme 2or la :ormaci3n de un ion coordinado, tetracu2rico, con dos gru2os amida ad8acentes El desarrollo del color es di:erente 2ara cada 2roteína 8 su intensidad se 2uede determinar es2ectrosc32icamente a 16/nm %a cuanti:icaci3n de la 2roteína se lle#a aca-o con una cur#a 2atr3n, el 2rinci2io esta-lecido 2or la le8 de %am-ert 'eer E;isten 2ocas inter:erencias en esta determinaci3n entre ellas, la 2resencia del ion amonio altera el desarrollo del color algunos 2igmentos a-sor-en a la misma longitud de onda, algunos lí2idos 8 car-o4idratos son ca2aces de :ormar com2lejos con el ion coordinado ='olaos, Fiselle, & Gerrera, .//5>
%a 2rue-a consisti3 en 2rimero, en 2re2arar la muestra con soluci3n de al-umina de 4ue#o, luego se rotularon J tu-os de ensa8o 8 se 2rocedi3 de la siguiente manera $n tu-o se rotulo como -lanco, 8 el resto se rotularon con nKmeros de 0 al H al tu-o rotulado como -lanco se le agrego ./ ml de agua 8 6/ ml del reacti#3 de -iuret, al tu-o 0 se la agrego, /. ml de 2atr3n de al-umina, 0,H ml de agua 8 6/ del reacti#3 de -iuret, al tu-o . se le agrego /6 ml de 2atr3n de al-umina, 0< ml de agua 8 6/ del reacti#3 de -iuret, al tu-o 5 se le agrego /< ml de 2atr3n de al-umina, 0,6 ml de agua 8 6/ del reacti#3 de -iuret, al tu-o 6 se le agrego /H ml de 2atr3n de al-umina, 0,. ml de agua 8 6/ del reacti#3 de -iuret, al tu-o 1 se le agrego 0/ ml de 2atr3n de al-umina, /,1 ml de muestra, 0,1 ml de agua 8 6/ del reacti#3 de -iuret, al tu-o < se le agrego /1 ml de muestra, 01 ml de agua 8 6/ del reacti#3 de -iuret, al tu-o L se le agrego 0/ ml de muestra, 0/ ml de agua 8 6/ ml del reacti#3 de -iuret 8 al tu-o H se le agrego /5 ml de muestra, 0,L ml de agua 8 6/ del reacti#3 de -iuret Des2ués de tener todos los tu-os con la soluci3n se colocaron en re2oso 2or 5/ minutos en una 2arte oscura Al término del tiem2o se realiz3 la cuanti:icaci3n de la soluci3n 2or medio de un es2ectro:ot3metro a 16/ nm de los tu-os, entre cada medici3n se la#a-an las celdas al tener todas las mediciones se dis2uso a realizar la cur#a de cali-raci3n
El es2ectro:ot3metro +ue se #a a manejar en la 2rctica es del ti2o con#encional de 4az sim2le $n es+uema del mismo se 2resenta a continuaci3n
Resultados y Cálculos
tubos de ensayo después de agregarle patrón de albumina, muestra, agua y reactivo de Biuret Figura 3:
Figura 2: Esquema de un espectrofotómetro convencional de haz simple El o-jeti#os a realizar en esta 2rctica es determinar el 2orcentaje de al-umina o-tenida en la clara de 4ue#o 2or el método de -iuret
.
Cálculos para determinar tubo (:
la concentración del
TABLA 2: Resultados Obtenidos Del Espectrofotómetro !"lculos De La !oncentración De Albumina TU!"
A-sor-ancia
Mg7Ml Al-umina N
#
/051
/0
$
/0<5
/55/
%
/.//
/1//
&
/.5H
/<
'
/.L5
/H55
@u-o de la muestra a determinar la concentraci3n de al-umina (
/.6J
Convertir los m) a )ramos
05/,06
%os tu-os < 8 L se omitieron de-ido a +ue los resultados arrojados 2or el es2ectro:ot3metro estn 2or :uera de los rangos de los tu-os 0 al 1
Re)la de tres simple para saber cuántos )ramos *ay en #++ ml,
0 ml O
0// ml
*ora si determinamos del porcenta.e peso/ volumen de la concentración de albumina en el tubo (
6 mencione cual es la raz3n de +ue el método de -iuret la a-sor-ancia de una 2roteína se lea a una longitud de 16/nm
Discusión de los resultados
Cuando se determin3 la a-sor-ancia 2or medio del es2ectro:ot3metro de los di:erentes tu-os del 0 al 1 =#éase ta-la .> se o-ser#a +ue la a-sor-ancia #a aumentado de tu-o en tu-o, 8 esto es de-ido a +ue la intensidad del color de la reacci3n es 2ro2orcional a la cantidad de 2roteína en la muestra Esto se o-ser#3 claramente en la coloraci3n de las soluciones =#éase :igura 5>, el tu-o P0 :ue el ms claro de todos 8 es el tu-o +ue contiene tan s3lo /.ml de la soluci3n 2atr3n de 2roteína En el tu-o P., 5, 6, 8 1 el color #a aumentando en tu-o en tu-o, de acuerdo al aumento de la concentraci3n de 2roteína Adems, la soluci3n 2ro-lema =tu-o H> tiene tam-ién un color claro 8 2resent3 un #alor de a-sor-ancia de /,.6J +ue se encuentra entre los #alores del tu-o P6 8 1
Rta El color #ioleta característico se 2resenta a esa longitud la cual se da 2or la coordinaci3n de un tomo de co-re con cuatro tomos de nitr3geno El com2lejo se -asa en la des2rotonaci3n de los gru2os amida 2ara :ormar el enlace con el co-re =II> o 2or el esta-lecimiento de un enlace coordinado entre el metal 8 los 2ares de electrones li-res de los tomos de o;ígeno 8 de nitr3geno del 2é2tido
.1 E;2li+ue si una cur#a 2atr3n 2uede ser em2leada 2ara cuanti:icar sustancias di:erentes a las 2roteínas 8 cules serían las di:erencias con estas < cul es la :inalidad de utilizar un tu-o como -lanco Mencione si siem2re se utiliza agua como -lanco
Des2ejando de la ecuaci3n de la recta se o-tu#o una concentraci3n de 05/,06mg7ml de al-umina contenida en el tu-o H, 8 en 2orcentaje 2eso7#olumen se o-tu#o 059 "egKn F3mez, ./05 la clara de 4ue#o tiene 0/,J 9 de 2roteina El resultado o-tenido es casi silimar al esta-lecido 2or Fomez
Rta @omar la medida de la cual 2arte la cur#a 2atr3n, no siem2re se utiliza agua como -lanco, sino una mezcla concentrada de la sustancia con la cual se est tra-ajando
Conclusión iblio)ra0ía
A2licando el método 'iuret se 2uede determinar la concentraci3n de 2roteína en unas muestras 2ro-lema, +ue resulta de des2ejar una ecuaci3n de los #alores de a-sor-ancia en una cur#a 2atr3n originada a 2artir de concentraci3n de 2roteína conocida
Arellano, G F, & Du4alt, R V =s:> cuanti:icacion de 2roteinas Recu2erado el 0J de /6 de ./01, de 4tt277???sm--comm;7re#ista7Re#istaS0 JJHS.7-itacora2d:
Cuestionario:
'olaos, , F %, & Gerrera, C G =.//5> !u"mica de #limentos: $anual de laboratorio Recu2erado el 0J de /6 de ./01, de 4tt2s77-oosgooglecomco7-oos idTHV2UH:o8DiIC&2gT(A5<&l2gT(A5<&d +Tcur#adecali-raci 9C59'5n2araladeterminaci 9C59'5ncuantitati#adelas2rote 9C59ADnas&sourceT-l&otsT+0sBlQ:j0: &sigTl+V-H%gBi"Wr/VnCW.@X5uQ+B? &4lTes&saTO&eiT1$c?V!rgMoW)sAYQ *6CAC?&#ed
0 Descri-a +ue es el es2ectro:ot3metro 8 2ara +ué sir#e Rta: $n
es2ectro:ot3metro es un instrumento 2ara medir la transmitancia o a-sor-ancia de una muestra, en :unci3n de la longitud de onda de la radiaci3n electromagnética"ir#e 2ara calcular las concentraciones de las distintas sustancias en :unci3n de la a-sorci3n del color . de:ina con sus 2ro2ias 2ala-ras +ue es una cur#a 2atr3n
CA%%E, G D, "ÁCGEX, " C, & %AI@Z, U C =s:> $#%&#' ()*+-+#. /E '#B0)#0)-0 /E B-0!&1$-+# Recu2erado el 0J de /6 de ./01, de 4tt277tu;uiseduco7+uimica7sites7de:ault7:il es72aginas7arc4i#os7V//Man0/'io+caSM) BQ*'Q/0S/H/L./052d:
Rta: "on
las medidas conocidas en orden ascendente +ue sir#en de guía 2ara ajustar una soluci3n 2ro-lema 5 cules son las #entajas 8 des#entajas, de em2lear los reacti#os de -iuret 2ara cuanti:icar 2roteínas e;2li+ue
F3mez, D =./05> &E30.: 4E%E)#'-/#/E. Recu2erado el .J de /6 de ./01, de 4tt2s77de8merg:iles?ord2resscom7./0570 /74ue#osSgeneralidades2d:
Rta: Dentro
de las #entajas del reacti#o de 'iuret es +ue es -astante es2ecí:ico 2ara 2roteínas, muestra 2ocas inter:erencias 8 es -arato ! la des#entaja es +ue es 2oco sensi-le
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