JURNAL PRAKTIKUM FITOKIMIA IDENTIFIKASI SENYAWA GOLONGAN POLIFENOL DAN TANIN (Ekstrak Psidium guajava)
Muftia Mu’alimin 201410410311111 Kelompok 2
PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH MALANG 2017
I. TUJUAN Mahasiswa mampu melakukan identifikasi senyawa golongan flavonoid dalam tanaman..
II. TINJAUAN PUSTAKA a. Klasifikasi Jambu Biji Jambu biji berasal dari Amerika tropik, tumbuh pada tanah yang gembur maupun liat, pada tempat terbuka dan mengandung air cukup banyak. Pohon ini banyak ditanam sebagai pohon buah-buahan. Namun, sering tumbuh liar dan dapat ditemukan pada ketinggian 11.200 m dpl. Jambu biji berbunga sepanjang tahun (Hapsoh, 2011).
Secara botanis tanaman jambu biji diklasifikasikan sebagai berikut : Kingdom
: Plantae
Divisi
: Spermatophyta
Class
: Dicotyledoneae
Ordo
: Myrtales
Famili
: Myrtaceae
Genus
: Psidium
Spesies
: Psidium guajava L.
Nama Lokal
: Jambu Biji
b. Morfologi Tumbuhan Jambu Biji Jambu biji perdu atau pohon kecil, tinggi 2-10 m, percabangan banyak. Batangnya berkayu, keras, kulit batang licin, mengelupas, berwarna cokelat kehijauan. Daun tunggal, bertangkai pendek, letak berhadapan, daun muda berambut halus, permukaan atas daun tua licin. Helaian daun berbentuk bulat telur agak jorong,ujung tumpul, pangkal membulat, tepi rata agak melekuk ke atas, pertulangan menyirip, panjang 6-14 cm, lebar 3-6 cm, berwarna hijau. Bunga tunggal, bertangkai, keluar dari ketiak daun, berkumpul 1-3 bunga, berwarna putih. Buahnya buah buni, berbentuk bulat sampai bulat telur, berwarna hijau sampai hijau kekuningan. Daging buah tebal, buah yang masak bertekstur lunak, berwarna putih kekuningan atau merah jambu. Biji buah banyak mengumpul di tengah, kecil-kecil. Keras, berwarna kuning kecoklatan (Hapsoh, 2011).
c. Manfaat Tumbuhan Jambu Biji Tanaman jambu biji atau Psidium guajava L. Termasuk familia Myrtaceae, banyak tumbuh di daerah-daerah di tanah air kita. Penduduk terlalu mementingkan buahnya, sedangkan daun-daunnya hanya sebagian kecil saja yang memperhatikannya, padahal mempunyai nilai obat yang baik, terutama untuk menyembuhkan sakit: diare dan astringensia (Kartasapoetra, 1992). Jambu biji memiliki beberapa kelebihan, antara lain buahnya dapat dimakan sebagai buah segar, dapat diolah menjadi berbagai bentuk makanan dan minuman. Selain itu, buah jambu biji bermanfaat untuk pengobatan (terapi) bermacam-macam penyakit, seperti memperlancar pencernaan, menurunkan kolesterol, antioksidan, menghilangkan rasa lelah dan lesu, demam berdarah, dan sariawan. Selain buahnya, bagian tanaman lainnya, seperti daun, kulit akar maupun akarnya, dan buahnya yang masih muda juga berkhasiat obat untuk menyembuhkan penyakit disentri,
keputihan, sariawan, kurap, diare, pingsan, radang
lambung, gusi bengkak, dan peradangan mulut, serta kulit terbakar sinar matahari (Cahyono B, 2010). Ekstrak etanol daun jambu biji juga telah dilakukan penelitian terhadap uji aktivitas anti oksidannya (Soebagio,et al. 2007) dan uji aktivitasnya sebagai anti bakteri penyebab diare (Adyana, et al. 2004). Daun jambu biji mempunyai manfaat bagi kesehatan yaitu sebagai antiinflamasi, antidiare, analgesik, antibakteri, antidiabetes, antihipertensi, mengurangi demam dan penambah trombosit (Kirtikar dan Bashu., 1998). Daun jambu biji putih telah terbukti secara
klinis menghambat pertumbuhan rotavirus yang menyebabkan enteritis pada anak-anak dan menyembuhkan kejang dan penyakit diare akut (Lozoya et al., 2002; Wei et al., 2000).
d. Kandungan Kimia Daun Jambu Biji Kandungan kimia pada daun jambu biji (Psidium guajava L.) menurut Taiz dan Zeiger (2002) yaitu terpen, fenolik, dan senyawa mengandung nitrogen terutama alkaloid. Kandungan kimia tersebut merupakan bagian dari sistem pertahanan diri yang berperan sebagai pelindung dari serangan infeksi mikroba patogen dan mencegah pemakanan oleh herbivora. Hasil fitokimia dalam ekstrak daun jambu biji putih adalah senyawa flavonoid, tanin, triterpenoid, saponin, steroid, dan alkaloid (Arya, et al.,2012). Flavonoid adalah senyawa yang terdiri dari dari 15 atom karbon yang umumnya tersebar di dunia tumbuhan. Quercetin adalah zat sejenis flavonoid yang ditemukan dalam buah-buahan, sayuran, daun dan biji-bijian. Hal ini juga dapat digunakan sebagai bahan dalam suplemen minuman atau makanan. Saponin adalah jenis glikosida yang banyak ditemukan dalam tumbuhan. Saponin memiliki karakteristik berupa buih. Sehingga ketika direaksikan dengan air dan dikocok maka akan terbentuk buih yang dapat bertahan lama. Minyak atsiri adalah kelompok besar minyak nabati yang berwujud cairan kental pada suhu ruang namun mudah menguap sehingga memberikan aroma yang khas. Minyak atsiri merupakan bahan dasar dari wangi-wangian atau minyak gosok (untuk pengobatan) alami. Tanin merupakan substansi yang tersebar luas dalam tanaman dan digunakan sebagai energi dalam proses metabolisme dalam bentuk oksidasi, Tanin juga sebagai sumber asam pada buah. Alkaloid adalah sebuah golongan senyawa basa bernitrogen yang kebanyakan heterosiklik dan terdapat didunia tumbuhan (tetapi ini tidak mengecualikan senyawa yang berasal dari hewan).
e. Senyawa Golongan Tanin Dalam metabolisme sekunder yang terjadi pada tumbuhan akan menghasilkan beberapa senyawa yang tidak digunakan sebagai cadangan energi melainkan untuk menunjang kelangsungan hidupnya seperti untuk pertahanan dari predator. Beberapa senyawa seperti alkaloid, triterpen dan golongan phenol merupakan senyawa-senyawayang dihasilkan dari metabolisme sekunder. Golongan fenol dicirikan oleh adanyacincin aromatik dengan satu atau dua gugus hidroksil. Kelompok fenol terdiri dari ribuan senyawa, meliputi flavonoid, fenilpropanoid, asam fenolat, antosianin, pigmen kuinon, melanin, lignin, dan tanin, yang tersebar luas di berbagai jenis tumbuhan.
Tanin merupakan zat organik yang sangat kompleks dan terdiri dari senyawa fenolik. Istilah tanin pertama sekali diaplikasikan pada tahun 1796 oleh Seguil. Tanin terdiri dari sekelompok zat – zat kompleks terdapat secara meluas dalam dunia tumbuh – tumbuhan, antara lain terdapat pada bagian kulit kayu, batang, daun dan buah – buahan. Ada beberapa jenis tumbuh – tumbuhan atau tanaman yang dapat menghasilkan tanin, antara lain : tanaman pinang, tanaman akasia, gabus, bakau, pinus dan gambir. Tanin juga yang dihasilkan dari tumbuh – tumbuhan mempunyai ukuran partikel dengan range besar. Tanin ini disebut juga asam tanat, galotanin atau asam galotanat. Tanin merupakan salah satu jenis senyawa yang termasuk ke dalam golongan polifenol. Senyawa tanin ini banyak di jumpai pada tumbuhan. Tanin dahulu digunakan untuk menyamakkan kulit hewan karena sifatnya yang dapat mengikat protein. Selain itu juga tanin dapat mengikat alkaloid dan glatin.Tanin adalah kelas utama dari metabolit sekunder yang tersebar luas pada tanaman. Tanin merupakan polifenol yang larut dalam air dengan berat molekul biasanya berkisar 1000-3000 (Waterman dan Mole tahun 1994, Kraus dll., 2003). Menurut definisi, tanin mampu menjadi pengompleks dan kemudian mempercepat pengendapan protein serta dapat mengikat makromolekul lainnya (Zucker, 1983). Tanin merupakan campuran senyawa polifenol yang jika semakin banyak jumlah gugus fenolik maka semakin besar ukuran molekul tanin.Pada mikroskop, tanin biasanya tampak sebagai massa butiran bahan berwarna kuning, merah, atau cokelat. Daun jambu biji (Psidium guajava L) adalah salah satu obat tradisional yang masih sering digunakan sampai sekarang. Daun jambu biji sebagai obat tradisional digunakan untuk pengobatan diare, radang lambung, sariawan, keputihan, kencing manis. Secara alamiah daun jambu biji yang diketahui berkhasiat dan aman dikonsumsi (Dalimartha, 2001). Salah satu zat yang terkandung dalam tananaman jambu biji (Psidium guajava L) adalah tanin yang dapat digunakan sebagai obat anti diare. Tanin merupakan senyawa fenolik larut air dengan BM 500-3000, memberikan reaksi umum senyawa fenol dan memiliki sifat-sifat khusus seperti presipitasi alkaloid, gelatin, dan protein-protein lain. Tanin banyak tedapat di dalam tumbuhan berpembuluh, khususnya dalam jaringan kayu, selain itu banyak terdapat pada bagian daunnya. Senyawa aktif pada daun yang berfungsi sebagai anti diare adalah tannin. Ekstrak daun jambu biji dapat digunakan untuk membasmi bakteri/mikroba penyebab diare (Salmonella typhii, E. coli, Shigella dysentriae). Komposisi kimia di dalam daun jambu biji adalah tannin 9 - 12%, minyak atsiri, minyak lemak dan asam malat, asam ursolat, asam psidiolat, asam kratogolat, asam oleanolat, asam guajavarin dan vitamin.
Tanin merupakan komponen zat organik derivat polimer glikosida yang terdapat dalam bermacam-macam tumbuhan, terutama tumbuhan berkeping dua (dikotil). Monomer tannin adalah digallic acid dan D-glukosa. Ekstrak tanin terdiri dari campuran senyawa polifenol yang sangat kompleks dan biasanya tergabung dengan karbohidrat rendah. Oleh karena adanya gugus fenol, maka tannin akan dapat berkondensasi dengan formaldehida. Tanin terkondensasi sangat reaktif terhadap formaldehida dan mampu membentuk produk kondensasi, berguna untuk bahan perekat termosetting yang tahan air dan panas. Tanin diharapkan mampu mensubsitusi gugus fenol dari resin fenol formaldehid guna mengurangi pemakaian fenol sebagai sumberdaya alam tak terbarukan. Tanin merupakan metabolit sekunder tanaman yang bersifat astrigen dengan rasa khas yang sepat. Secara umum tannin terbagi atas tannin (proanthocyanidins) hidrolisis dan tannin kondensasi. Tannin hidrolisis diprekursor oleh asam dehydroshikimic sedangkan tannin kondensasi disintesis dari prekursor flavonoid. Tingginya kandungan tannin dari kalus yang dihasilkan secara in vitro dapat dipahami karena produksi metabolit sekunder pada kalus in vitro dipengaruhi oleh berbagai faktor di antaranya komposisi media yang digunakan dan zat pengatur tumbuh yang diaplikasikan. Psidium guajava L. diketahui mengandung beberapa bahan aktif antara lain tanin, flavonoid, guayaverin, leukosianidin, minyak atsiri, asam malat, damar, dan asam oksalat, tetapi hanya komponen khusus seperti flavonoid, tanin, minyak atsiri, dan alkaloid yang memiliki efek farmakologi sebagai antidiare terutama pada penyakit diare yang disebabkan oleh bakteri.Senyawa tanin yang terkandung dalam daun Psidium guajava L. dapat diperkirakan memiliki jumlah sebanyak 9–12%. Tanin dapat menimbulkan rasa sepat pada buah dan daun Psidium guajava L. tetapi berfungsi memperlancar sistem pencernaan, dan sirkulasi darah. Tanin mempunyai sifat sebagai pengelat berefek spasmolitik yang mengkerutkan usus sehingga gerak peristaltik usus berkurang. Tanin atau lebih dikenal dengan asam tanat, biasanya mengandung 10% H2O. Struktur kimia tanin adalah kompleks dan tidak sama. Asam tanat tersusun 5 - 10 residu ester galat, sehingga galotanin sebagai salah satu senyawa turunan tanin dikenal dengan nama asam tanat. Beberapa struktur kimia senyawa tanin adalah sebagai berikut.
Gambar 1.1: Struktur kimia tanin Tanin terkondensasi (condensed tannins) biasanya tidak dapat dihidrolisis, tetapi dapat terkondensasimenghasilkan asam klorida. Tanin jenis ini kebanyakan terdiri dari polimerflavonoid yang merupakan senyawa fenol. Nama lain dari tanin ini adalah Proanthocyanidin. Proanthocyanidin merupakanpolimer dari flavonoid yang dihubungkan dengan melalui ikatan C-8 dengan C-4. Salahsatu contohnya adalah Sorghum procyanidin, senyawa ini merupakan trimeryang tersusun dari epiccatechin dan catechin.Senyawa ini jika dikondensasi maka akan menghasilkan flavonoid jenis flavan dengan bantuan nukleofil berupa floroglusinol. Tanin
terhidrolisis
biasanya
berikatan
dengan
karbohidrat
dengan
membentuk jembatan oksigen, maka dari itu tanin ini dapat dihidrolisis denganmenggunakan asam sulfat atau asam klorida. Salah satu contoh jenis tanin iniadalah gallotanin yang merupakan senyawa gabungan dari karbohidrat denganasam galat. Selainmembentuk gallotanin, dua asam galat akan membentuk taninterhidrolisis yang biasa disebut Ellagitanins.Ellagitanin sederhana disebut jugaester asam hexahydroxydiphenic (HHDP). Senyawa ini dapat terpecah menjadiasam galic jika dilarutkan dalam air.
Gambar 2.1: Tanin Terkondensasi, Proanthocyanidin merupakan polimer dari flavonoid yang dihubungkan dengan melalui ikatan C-8 dengan C-4.
Gambar 3.1: Tanin Terhidrolisis, Gallotanin prototipe merupakanglukosapentagalloyl(β-1, 2, 3, 4, 6-Pentagalloyl-OD-Glukopyranose). PGGmemiliki5hubunganesteridentikyang melibatkangugus hidroksialifatikgulainti. PGG memiliki banyak isomer seperti Gallotanin.
Rantai ester poligallol ditemukan di dalam gallotanin terbentuk dari meta-atau paradepside obligasi, melibatkan hidroksil fenolik dari pada gugus hidroksialifatik. Depside obligasi lebih mudah dihidrolisis dari pada ikatan ester alifatik. Metanolisis dalam asam lemah dengan menggunakan metanol dapat menghancurkan depside tetapi tidak estero bligasi. Dengan demikian poliol inti dengan kelompok galloyl yang teresterisasi dapat dihasilkan dari campuran kompleks dari esterpoly galloyl oleh metanolisis dengan buffer asetat. Asam kuatmineral, panas, dan metanol dapat digunakan untuk metanolisis baik depside dan ester obligasi menghasilkan poliol inti dan metil galat. Hidrolisis dengan asam kuat dapat mengubah galotanin menjadi asam galat dan poliol inti.
Gambar 3.3: Aceritannin, gallotannin yang ditemukan pada daun maple dan hamamellitannin adalah gallotannin dari kulit kayu pohon ek.
Gambar 4.1: Elagitanin sederhana merupakan ester dari asam hexahidroxidifenik (HHDP).
f. Poli fenol Tumbuhan yang hidup disekitar kita memiliki kandngan kimia yang unk. Kimia bahan alam yang merupakan hasil dari metabolisme sekunder. Bahan kimia yang dimaksud biasanya di gunakan manusia untuk memenuhi kebutuhannya dalam bidang farmasi. Salah satu kelompok senyawa yang banyak memberikan manfaat bagi manusia adalah polifenol. Senyawa yng termasuk kedalam polifenol ini adalah semua senyawa yang memiliki struktur dasar berupa fenol. Polifenol adalah kelompok zat kimia yang ditemukan pada tumbuhan. Zat ini memiliki tanda khas yakni memiliki banyak gugus fenol dalam molekulnya. Fenol sendiri merupkan struktur yangterbentuk dari benzena tersubtitusi dengan gugus –OH. Gugus–OH yang terkandung merupakan aktivator yang kuat dalam reaksi subtitusi aromatik elektrofilik (Fessenden,1982).
Fenol Polifenol
dapat
diklasifikasikan
menjadi
beberpa
jenis
berdasarkan
unit
basanya(Wikipedia.com)antara lain Asam Galia, Asam Sinamat, dan Flavon. Selain itu senyawa-senyawa polifenol jikaberdasarkan komponen penyusun fenolnya dapaat dibagi menjadiFenol, pyrocatechol, pirogallol,resorsinol, floroglucinol, dan hidroquinon. Jenisjenisdiatas akan dibahas dalam makalah ini. Selainitu juga makalah ini juga akan membahassalah satu contoh senyawa polifenol yang ada didalam teh yang sering kita konsumsi.Senyawa yang dimaksud antara lain epicatechin dan epigallocatechin.Senyawa ini akandibahs tentang reaksi oksidasi dan biosintesis dari turunan epigallocatechin yangberupa senyawa
Epigallocatechin
gallate
(EGCG).Kerena
polifenol
banyak
dimanfaatkan
olehmanusia dan sebagian telah diproduksidengan cara disintesis secara industri sebagai obat. Itulahsebabnya kita akan membahastentang beberapa contoh dan fungsi-fungsi senyawa polifen.
g. IDENTIFIKASI SENYAWA Preparasi Sampel Ekstrak Psidium guajava sebanyak 0.3 gram ditambah 10 mL aquadest panas, diaduk dan kemudian dibiarkan sampai tercapai temperature ruangan. Kemudian tambahkan 3-4 tetes NaCl 10%, diaduk kemudian disaring. Filtrate kemudian dibagi menjadi 3 bagian dan disebut larutan IVA, IVB, IVC Reaksi Uji Uji Gelatin Larutan IVA digunakan sebagai blanko, larutan IVB ditambah sedikit larutan gelatin dan 5 mL NaCl 10%. Jika terjadi endapan putih menunjukan adanya Tanin. Uji Ferri Klorida Larutan IVA digunakan sebagai blanko, larutan IVC ditambah beberapa tetes larutan FeCl3, kemudian di amati perubahan warnanya. Jika terjadi warna hijau kehitaman menunjukkan adanya Tanin. Jika terjadi warna hijau biru hingga kehitaman menunjukkan adanya Polifenol Kromatografi Lapis Tipis Larutan IVA ditotolkan pada fase diam. Fase diam
: Kiesel Gel 254
Fase gerak
: Kloroform :Etilasetat : Asamformiat (0.5:9.0:05)
Penampak noda
: pereaksi FeCl3
Adanya polifenol ditunjukkan dengan timbulnya noda berwarna hitam pada sampel
h. Pemisahan KLT Thin Layer Chromatography (TLC) Kromatografi lapis tipis adalah salah satu contoh kromatografi planar. Fase diamnya (Stationary Phase) berbentuk lapisan tipis yang melekat pada gelas/kaca, plastik, aluminium. Sedangkan fase geraknya (Mobile Phase) berupa cairan atau campuran cairan, biasanya pelarut organi dan kadangkadang juga air. Fase diam yang berupa lapisan tipis ini dapat dibuat dengan membentangkan /meratakan fase diam (adsorbent=penjerap=sorbent) diatas plat/lempeng kaca plastik ataupun aluminium.Digunakan untuk pemisahan zat secara cepat dengan menggunakan zat penyerap berupa serbuk halus yang dilapiskan serba rat pada lempeng kaca. Lempeng yang dilapis dapat dianggap sebagai kolom kromatografi terbuka dan pemisahan didasarkan pada penyerapan pembagian atau gabungannya tergantung dari zat penyerap pembagian atau gabungannya tergantung dari jenis zat penyerap dan cara pembuatan lapisan zat penyerap dan jenis zat pelarut. KLT dengan penyerap penukar ion dapat digunakan untuk pemisahan senyawa polar. Fase diam Sifat fase diam yang satu dengan fase diam yang lain berbeda karena strukturnya, ukurannya, kemurniannya, zat tambahan sebagai pengikat dll. Fasa diam yang digunakan TLC tidak sama dengan yang digunakan untuk kromatografi kolom, terutama karena ukuran dan zat yang ditambahkan. Fase diam dijual dengan spesifikasi tertentu, iaitu ukuran (diameter) dalam mesh atau j^m dan untuk kegunaannya (mis: untuk TLC atau kromatografi kolom). Beberapa fase diam yang banyak dijual dipasaran. Silika gel Silika gel merupakan fase diam yang sering digunakan pada TLC. Dalam perdagangan dijual dengan variasi ukuran (diameter) 10-40μm. Makin kecil diameter akan makin lambat kecepatan alir fase geraknya dengan demikian mempengaruhi kualitas pemisahan. Luas permukaan silica gel bervariasi dari 300-1000 m2/g. Bersifat higroskopis, pada kelembaban relatif 45-75% dapat mengikat air 7-20%. Macam-macam silka gel yang dijual dipasaran, Silika gel dengan pengikat. Pada umumnya digunakan pengikat gypsum, (CaSO4 5-15%). Jenis ini diberi nama Silika gel G. Ada juga menggunakan pengikat pati (starch) dan dikenal Silika gel S, penggunaan pati sebagai pengikat mengganggu penggunaan asam sulfat sebagai pereaksi penentuan bercak.Silika gel dengan pengikat dan indicator flouresensi. Jenis silica gel ini sama seperti silika gel diatas dengan tambahan zat
berfluoresensi bila diperiksa dibawah lampu UV A, panjang atau pendek. Sebagai indicator digunakan timah kadmium sulfida atau mangan-timah silikat. Jenis ini disebut Silika gel GF atau Silika gel GF254 (berflouresensi pada 254 , גnm). Silika gel tanpa pengikat, dikenal dengan nama Silika gel H atau Silika gel N. Silika gel tanpa pengikat tetapi dengan indicator flouresensi. Silika gel untuk keperluan pemisahan preparatif.
Fase gerak Yang digunakan sebagai fase gerak biasanya adalah pelarut organik. Dapat digunakan satu macam pelarut organic saja ataupun campuran. Bilamana fase gerak merupakan campuran pelarut organik dengan air maka mekanisme pemisahan adalah partisi. Pemilihan pelarut organic ini sangat penting karena akan menentukan keberhasilan pemisahan. Pendekatanpolaritas adalah yang paling sesuai untuk pemilihan pelarut. Senyawa polar akan lebih mudah terelusi oleh fase gerak yang bersifat polar dari pada fase gerak yang non polar. Sebaliknya, senyawa non polar lebih mudah terelusi oleh fase gerak non polar dari pada fase gerak yang polar.
Pembuatan plat (lempeng) silica gel 30 Gram fase diam berbentuk serbuk (dengan diameter tertentu dijual dengan merk dagang tertentu misalnya Silica gel GF 254) dibuat bubur dengan air atau pelarut lain sejumlah tertentu (lihat tabel 2) diratakan diatas 4-5 lempeng kaca ukuran 20X20 cm, dalam waktu tidak lebih dari 4 menit. Perataan ini dapat menggunakan alat perata Stahl-Desaga untuk plat kaca ukuran 20X20 cm, 20X10 cm dengan ketebalan dapat diatur 0,25-2,0 mm. Bila ukuran plat lebih kecil dapat dibuat dengan mencelupkan ke dalam bubur adsorbent. Setelah lapisan bubur ini mengering diruangan kemudian dipanaskan di dalam oven pada 100-120°C selama 60 menit, dengan tujuan semua air akan menguap. Proses pengeringan atau penghilangan air disebut proses mengaktifkan plat kromatografi (fase diam), selanjutnya didalam rak penyimpan plat-plat ini dimasukkan kedalam dexicator. Sehingga pada waktu penyimpanan plat-plat tadi tidak menyerap lembab (air) dari udara. Dengan demikian mekanisme pemisahan komponen (senyawa-senyawa) yang ditahan fase diam adalah mekanisme absorption.
Penyiapan dan penotolan sampel Sampel atau cuplikan dilarutkan dalam pelarut yang sesuai (hampir pelarut organik dapat digunakan dan biasanya dipilih yang mudah menguap), air digunakan hanya bila tidak dapat dicari pelarut organik yang sesuai. Untuk keperluan analisis kuantitatif sample harus ditimbang demikian juga pelarut yang digunakan. Kemudian larutan sample disimpan dalam wadah yang tertutup rapat untuk menghindari penguapan. Pada umumnya ditotolkan 1-20 μl larutan yang mengandung 50-100 μg sample tiap bercak untuk kromatografi absorbsi dan 52Qμg sample untuk kromatografi partisi. Penotolan dapat dilakukan dengan gelas kapiler yang dibuat sendiri atau dengan pipet mikro. Untuk keperluan kuantitatif digunakan quantitative microsyringe. Kepada plat TLC konvensional (20X20 cm, 5X20 cm, tebal 0,2 mm) sample ditotolkan sebagai bercak
Tinjauan Eluen Fase gerak merupakan medium angkut yang terdiri atas satu atau beberapa pelarut. Fase gerak bergerak dalam fase diam karena adanya gaya kapiler. Pelarut yang digunakan sebagai fase gerak hanyalah pelarut bertingkat mutu analitik dan bila diperlukan system pelarut mltikomponen ini harus berupa suatu campuran yang sesederhana mungkin yang terdiri atas maksimum 3 komponen. Angka banding campuran dinyatakan dalam bagian volume total 10 (Nyiredy, 2002). Pelarut pengembang dikelompokkan ke beberapa golongan Snyder’s berdasarkan kekuatan pelrutnya. Menurut Stahl (1985) eluen atau fase gerak yang digunakan dalam KLT dikelompokkan ke dalam 2 kelompok, yaitu untuk pemisahan senyawa hidrofil dan lipofil. Eluen untuk pemisahan senyawa hidrofil meliputi air, methanol, asam asetat, etanol, isopropanol, aseton, n-propanol, tert-butanol, fenol, n-butanol, sedangkan untuk pemisahan senyawa lipofil meliputi etil asetat, eter, kloroform, benzene, toluene, sikloheksana, dan petroleum eter. 1. Kloroform a. Sifat fisis
Rumus molekul
: CHCl3
Berat molekul
: 119,39 g/gmol
Wujud
: cairan bening
Titik didih
: 61,20C
Titik leleh
: -63,50C
Densitas
: 1,489 g/cm3, 32oC
Suhu kritis
: 264oC
Specific gravity
:1,489
Viskositas
: 0,57 cP (20oC)
Kapasitas panas
: 0,234 kal/goC, pada 20oC
Tekanan kritis
: 53,8 atm
Volume kritis
: 0,239 m3/kmol
Tegangan permukaan
: 0,0267 N/m, 25°C
Kapasitas panas
: 113,666 kJ/kmol.K, 25°C
Panas penguapan
: 29,5 kJ/mol, 61,2°C
Energi Gibbs
: -18,663 kkal/mol
Entalpi pembentukan
: -32,12 kkal/mol
Kelarutan dalam 100 ml bagain air
: 0,8 g (250C)
(Ketta & Cunningham, 1992)
b. Sifat kimia Kloroform jika bereaksi dengan udara atau cahaya seara perlahan-lahan akan teroksidasi menjadi senyawa beracun phosgene (karbonil klorida). Reaksi : CHCl3 + ½ O2
udara atau cahaya
COCl2 + HCl
Kloroform dapat direduksi dengan bantuan zeng dan asam klorida untuk membentuk metilen klorida. Jika proses reduksi dilakukan dengan bantuan debu sebg dan air akan dapat diperoleh metana. Reaksi :
Zn
CHCl3 + 2H
COCl2 + HCl HCl
CHCl3 + 6H
Zn
CH4 + 3 HCl
H2O
Kloroform dapat bereaksi dengan asam nitrat pekat untuk membentuk nitro kloroform atau kloropikrin. Reaksi : CHCl3 + HNO3
CCl2NO2 + H2O
Kloropikrin biasanya digunakan sebagai insektisida.
Kloroform dapat mengalami proses klorinasi dengan klorin jika terkena sinar matahari dan mengahsilkan karbon tetraklorida. Reaksi : CHCl3 + Cl2
CCl4 + HCl
(Kirk and Othmer, 1982)
2. Aseton a. Sifat-sifat fisika
Rumus molekul
: CH3COCH3
Berat molekul
: 58,080 kg/kmol
Densitas
: 785,601 kg/m3, 25°C
Viskositas
: 0,32 cP, 20°C
Titik didih
: 56,29°C
Titik leleh
: -94,6°C
Temperatur kritis
: 235,05°C
Tekanan kritis
: 4.701 kPa
Volume kritis
: 0,209 m3/kmol
Tegangan permukaan
: 0,0230 N/m, 25°C
Kapasitas panas
: 126,281 kJ/kmol.K, 25°C
Panas penguapan
: 29,1 kJ/mol
Entalpi penguapan
: 30,836 kJ/mol
Energi Gibbs
: -36,47 kkal/mol
Entalpi pembentukan
: -59,33 (cair) kkal/mol
Kelarutan (dalam air)
: larut dalam berbagai rasio
b. Sifat-sifat kimia Dengan air akan membentuk suatu 1,1-diol yang disebut gem-diol atau hidrat. Reaksi ini bolak-balik dan biasanya kesetimbangan terletak pada sisi karbonil. Reaksi :
Dengan hidrogen sianida dalam kondisi sedikit basa (aseton hidrat) akan membentuk sianohidrin aseton. Reaksi :
Dengan amonia dan amina primer akan membentuk imina, suatu senyawa yang mengandung gugusan C = N. Reaksi ini dapat berjalan dengan baik pada keadaan asam, dimana pH optimum 3-4. Reaksi :
Dengan amina sekunder (R2NH akan menghasilkan ion iminium yang bereaksi lebih lanjut menjadi enamina (vinilamina). Reaksi :
3. Asam formiat I.
II.
Sifat fisika
Rumus molekul
: HCOOH
Berat molekul
: 46,03 g/mol
Densitas
: 785,601 kg/m3, 25°C
Viskositas
: 1,57 cP, 25°C
Titik didih
: 100,8°C (760 mmHg)
Titik leleh
: 8,4°C
Spesifik gravity
: 1,22647, 20°C
Tegangan permukaan
: 37,67 dyne/cm, 22°C
Kapasitas panas
: 82,8 joulel/mol.K, 0°C
Panas pembentukan
: 3031 kal/mol
Panas penguapan
: 104 kal/mol
Panas pembakaran cairan
: –60,9 kkal/mol, pada 25°C
Panas pembentukan cairan
: –101,52 kkal/mol, pada 25°C
Sifat kimia Asam formiat dapat bercampur sempurna dengan air dan sedikit larut dalam benzene, karbon tetra klorida, toluene dan tidak larut dalam hidrokarbon alifatik seperti heptana dan oktana. Asam formiat dapat melarutkan nilon, poliamida tetapi tidak melarutkan Poli Vinil Chlorida (PVC). Campuran Asam formiat dan air membentuk campuran azeotrop (yaitu campuran larutan yang mempunyai titik didih mendekati titik beku) dengan kandungan maksimum Asam formiat 77,5 % pada tekanan atmosfer. Asam formiat akan terdekomposisi menjadi Karbon dioksida dan air pada temperatur 100 oC atau dalam temperatur kamar bila ditambahkan katalis Palladium. Asam formiat terhidrasi oleh Asam sulfat pekat dan menghasilkan Karbon monoksida dan air.
Tinjauan Indeks Polaritas Pelarut Pentana 1,1,2-trikorotrifluoroetana Siklopentana Heptane Heksana Iso oktana Petroleum eter Sikloheksana N-butilklorida Toluene Metal t-butil eter O-xylene Klorobenzena O-diklorobenzena Etil eter Diklorometana Etilen diklorida N-butil alcohol Isopropyl alcohol N-butil asetat Isobutil alcohol Metal isoamil keton N-propoil alcohol Tetrahidrofuran Kloroform Metal isobutyl keton Etil asetat Metal n-propil keton Metal etil keton 1,4-dioxana Aseton Methanol Piridin 2-metoksietanol Aseetonitrit Propilen karbonat N-n dimetilformamida Dimetil asetamida N-metilpirolidin dimetilsulfoksida
Indeks Polaritas 0 0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,2 1,0 2,4 2,5 2,5 2,7 2,7 2,8 3,1 3,5 3,9 3,9 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,1 4,2 4,4 4,5 4,7 4,8 5,1 5,1 5,3 5,5 5,8 6,1 6,4 6,5 6,7 7,2
III.
BAGAN ALIR
A. PREPARASI SAMPEL 0,3 gram ekstrak ditambah 10 ml aquadest panas, diaduk dan dibiarkan sampai temperatur kamar, lalu tambahkan 3-4 tetes 10% NaCl, diaduk dan disaring.
Filtrat dibagi menjadi tiga bagian masing-masing ± 3 ml dan disebut sebagai larutan IV A, IV B dan IV C.
B. UJI GELATIN Larutan IV A digunakan sebagai blanko, larutan IV B ditambah dengan sedikit larutan gelatin dan 5 ml larutan NaCl 10%.
Jika terjadi endapan putih menunjukkan adanya tanin.
C. UJI FERRI KLORIDA Sebagian larutan IV C diberi beberapa tetes larutan FeCl3 kemudian diamati terjadinya perubahan warna.
Jika terjadi warna kehitaman menunjukkan adanya tanin.
Jika pada penambahan gelatin dan NaCl tidak timbul endapan putih, tetapi setelah ditambahkan dengan larutan FeCl3 terjadi perubahan warna menajdi hijau biru hingga hitam, menunjukkan adanya senyawa polifenol. FeCl3 positif, uji gelatin positif tanin (+) FeCl3 positif, uji gelatin negative polifenol (+) FeCl3 negatif polifenol (-), tanin (-)
D. KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS Sebagian larutan IV C digunakan untuk pemeriksaan KLT. Fase diam: Kiesel Gel 254 Fase gerak: Kloroform-Etil asetat-Asam formiat (0,5 : 9 : 0,5) Penampak noda: Pereaksi FeCl3
Jika timbul warna hitam menunjukkan adanya polifenol dalam sampel.
IV.
SKEMA KERJA a. Preparasi Sampel + 0,3 gram ekstrak + 10ml aquadest panas → diaduk dan dibiarkan sampai temperatur kamar,lalu + 3-4 tetes 10% NaCl → diaduk dan disaring.
Filtrat dibagi tiga bagian masingmasing ± 3ml, disebut sebagai larutan IVA, IVB, dan IVC
b. Uji Gelatin Larutan IVA sebagai blanko
Larutan IVB + sedikit larutan gelatin + 5ml larutan NaCl 10%
Jika terjadi endapan putih menunjukkan adanya tanin
c. Uji Ferri Klorida Larutan IVC diberi beberapa tetes larutan FeCl3 → diamati perubahan warna
Jika terjadi warna hijau kehitaman → adanya tanin Jika penambahan Gelatin dan NaCl tidak timbul endapan putih, tetapi setelah + dengan larutan FeCl3 terjadi perubahan warna hijau biru hingga hitam → adanya senyawa polifenol FeCl3 positif, uji gelatin positif → tanin (+) FeCl3 positif, uji gelatin negatif → polifenol (+) FeCl3 negatif → polifenol (-), tanin (-)
d. Kromatografi Lapis Tipis
Larutan IVC ad larutan menjadi basa
Totolkan pada plat KLT
Filtrat uapkan kering dengan metanol.
Masukan plat KLT ke dalam chamber yang telah jenuh. Kemudian lakukan pemeriksaan KLT
di ad
Jika timbul warna hitam → adanya polifenol dalam sampel
V.
HASIL
Gambar V.1: IVA sebagai Blanko (Preparasi Sampel); IVB (Uji Gelatin) ; IVC (Uji Ferri Klorida)
Gambar V.2: KLT dengan Sinar uv 254nm sebelum di eluasi
Gambar V.3: KLT dengan sinar uv 365nm dan sinar uv 254nm sesudah di eluasi
Perhitungan Rf pada noda: Noda 1 = 1,1 : 8 =0,14 Noda 2 = 2,5 : 8 = 0,31 Noda 3 = 4 : 8 = 0,50 Noda 4 = 5,3 : 8 = 0,66
VI.
PEMBAHASAN Uji polifenol dan uji tanin bertujuan untuk mengetahui keberadaan senyawa polifenol
dan tanin di dalam ekstrak daun tumbuhan Psidium guajava. Polifenol merupakan senyawa yang dengan tanda khas yaitu memiliki banyak gugus fenol dalam molekulnya. Sedangkan tanin merupakan senyawa yang mengandung gugus hidroksi (turunan benzena) yang dapat larut dalam air karena adanya ikatan hidrogen antara gugus hidroksil yang dimiliki tanin dengan molekul air. Tanin yang bersifat polar akan larut dalam air yang juga bersifat polar. Oleh karena itu pada penentuan tanin, ekstrak daun Psidium guajava dilarutkan dalam air panas agar tanin yang terlarut semakin banyak. Penambahan air panas pada ekstrak juga berguna untuk memecah ikatan-ikatan pada tanin sehingga dihasilkan bentuk monomer-monomer tanin bebas. Kemudian dilakukan pendinginan untuk mengendapkan senyawa-senyawa pengotor yang tidak larut pada suhu rendah, misalnya saponin. Selanjutnya dilakukan penyaringan yang bertujuan untuk memisahkan tanin dari simplisia dan senyawa lain yang terkandung di dalamnya. Larutan filtrat dibagi menjadi 3 bagian yaitu larutan IV A, IV B dan IV C Larutan IV A digunakan sebagai blanko. Larutan IV B ditambahkan dengan larutan gelatin dan 5 ml larutan NaCl 10%. Penambahan ini untuk menguji keberadaan tanin katekat. Tanin katekat merupakan kelompok tanin yang tidak dapat terhidrolisis dan merupakan polimer kondensasi katekin. Terjadi endapan putih setelah penambahan pereaksi sehingga menunjukkan adanya kandungan tanin dalam ekstrak daun Psidium guajava. Pada praktikum kelompok kami, untuk uji gelatin menunjuk adanya endapan putih pada larutan IVB. Sehingga disimpulkan bahwa larutan IVB pada kelompok kami positif menunjukkan adanya tanin Pada kelompok kami, untuk larutan IVC cukup ditambahkan 1 tetes pereaksi FeCl3, karena saat penambahan 1 tetes pereaksi FeCl3 sudah memberikan warna hijau kehitaman pada larutan IVC dibandingkan dengan larutan IVA (blanko). Artinya, bahwa larutan IVC kelompok kami positif adanya tanin pada larutan tersebut. Penambahan FeCl3 berfungsi sebagai sumber atom pusat, dimana tanin merupakan ligan yang membutuhkan atom pusat untuk membentuk kompleks yang stabil, sehingga terbentuklah kompleks antara atom pusat Fe3+ dengan ligan tanin.
Reaksi yang terjadi sebagai berikut:
Sebagian larutan IVA (blanko) digunakan untuk uji metode KLT dengan fase diam berupa Kiesel Gel 254, fase gerak Kloroform-Etil Asetat-Asam formiat dengan perbandingan 0,5:9:0,5 dan penampak noda FeCl3. Larutan IVA ditotolkan pada plat KLT, dimasukkan ke dalam chamber untuk dieluasi. Setelah disemprot dengan penampak noda FeCl3, terbentuk noda berwarna hitam yang menunjukkan hasil positif akan keberadaan polifenol dalam ekstrak daun Psidium guajava. Kepolaran fasa diam dan fasa gerak hampir sama, tetapi masih lebih polar fasa gerak sehingga senyawa tanin yang dipisahkan terangkat mengikuti aliran eluen, karena senyawa tanin bersifat polar. Dari ke empat noda yang ada maka noda yang terakhir adalah noda yang diduga senyawa tanin, yang memiliki harga Rf sebesar 0,66 dan warna noda saat disinari dengan lampu UV 365nm dan lampu UV 254nm setelah dieluasi berwarna hitam. Hal ini diperkuat oleh Harborne (1987) bahwa tanin dapat dideteksi dengan sinar UV pendek berupa noda yang berwarna hitam, selain itu didukung dengan Rf dari ekstrak daun Psidium guajava (memiliki kadar tanin yang tinggi) yang dielusi dengan eluen yang sama dengan harga Rf sebesar 0,62. Pemisahan dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) amenghasilkan harga Rf dari noda pertama sampai ketiga sebesar 0,14 ; 0,31 ; 0,50 yang diduga senyawa antosianidin (Olivina, 2005). Noda keempat dengan harga Rf 0,66 diduga senyawa tanin terkondensasi. Senyawa tanin diduga mempunyai nilai Rf 0,66. Hal ini didukung dari pengukuran standar tanin dari ekstrak daun Psidium guajava yang memiliki kadar tanin yang besar dengan harga Rf sebesar 0,62.
VII.
KESIMPULAN
1. Uji gelatin, terbentuk endapan putih pada larutan IVB yang menunjukkan adanya kandungan tanin dalam ekstrak daun Psidium guajava.
2. Uji Ferri Klorida, terjadi perubahan warna pada larutan IVC menjadi hjau kehitaman yang menunjukkan adanya kandungan tanin dalam ekstrak daun Psidium guajava
3. Uji dengan metode KLT menghasilkan penampakan noda berwarna hitam yang menunjukkan adanya kandungan polifenol dalam ekstrak daun Psidium guajava
4. Nilai Rf kelompok kami pada penampakan noda di duga mengandung senyawa tanin pada ekstrak daun Psidium guajava sebesar 0,66. Dimana hampir mendekati nilai Rf sebenarnya yaitu 0,62
