JURNAL PRAKTIKUM FITOKIMIA FRAKSINASI DENGAN KROMATOGRAFI KOLOM
si di um g uaj uaj ava) (Ekstrak P sid
Disusun Oleh : Muftia Mu’alimin
(201410410311111) Kelompok 2 Tim Dosen : Drs.Herra Studiawan, M.Si.,Apt. Siti Rofida, M.Farm., Apt.
PROGRAM STUDI FARMASI UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH MALANG TAHUN AKADEMIK 2016/2017
I.
TUJUAN
Mahasiswa mampu melakukan fraksinasi suatu ekstrak menggunakan kromatografi kolom
II.
TINJAUAN PUSTAKA
A. Klasifikasi Jambu Biji
Jambu biji berasal dari Amerika tropik, tumbuh pada tanah yang gembur maupun liat, pada tempat terbuka dan mengandung air cukup banyak. Pohon ini banyak ditanam sebagai pohon buah-buahan. Namun, sering tumbuh liar dan dapat ditemukan pada ketinggian 11.200 m dpl. Jambu biji berbunga sepanjang tahun (Hapsoh, 2011).
Secara botanis tanaman jambu biji diklasifikasikan sebagai berikut : Kingdom
: Plantae
Divisi
: Spermatophyta
Class
: Dicotyledoneae
Ordo
: Myrtales
Famili
: Myrtaceae
Genus
: Psidium
Spesies
: Psidium guajava L.
Nama Lokal
: Jambu Biji
B. Morfologi Tumbuhan Jambu Biji
Jambu biji perdu atau pohon kecil, tinggi 2-10 m, percabangan banyak. Batangnya berkayu, keras, kulit batang licin, mengelupas, berwarna cokelat kehijauan. Daun tunggal, bertangkai pendek, letak berhadapan, daun muda berambut halus, permukaan atas daun tua licin. Helaian daun berbentuk bulat telur agak jorong,ujung tumpul, pangkal membulat, tepi rata agak melekuk ke atas, pertulangan menyirip, panjang 6-14 cm, lebar 3-6 cm, berwarna hijau. Bunga tunggal, bertangkai, keluar dari ketiak daun, berkumpul 1-3 bunga, berwarna putih. Buahnya buah buni, berbentuk bulat sampai bulat telur, berwarna hijau sampai hijau kekuningan. Daging buah tebal, buah yang masak bertekstur lunak, berwarna putih kekuningan atau merah jambu. Biji buah banyak mengumpul di tengah, kecil-kecil. Keras, berwarna kuning kecoklatan (Hapsoh, 2011).
C. Manfaat Tumbuhan Jambu Biji
Tanaman jambu biji atau Psidium guajava L. Termasuk familia Myrtaceae, banyak tumbuh di daerah-daerah di tanah air kita. Penduduk terlalu mementingkan buahnya, sedangkan daun-daunnya hanya sebagian kecil saja yang memperhatikannya, padahal mempunyai nilai obat yang baik, terutama untuk menyembuhkan sakit: diare dan astringensia (Kartasapoetra, 1992). Jambu biji memiliki beberapa kelebihan, antara lain buahnya dapat dimakan sebagai buah segar, dapat diolah menjadi berbagai bentuk makanan dan minuman. Selain itu, buah jambu biji bermanfaat untuk pengobatan (terapi) bermacam-macam penyakit, seperti memperlancar pencernaan, menurunkan kolesterol, antioksidan, menghilangkan rasa lelah dan lesu, demam berdarah, dan sariawan. Selain buahnya, bagian tanaman lainnya, seperti daun, kulit akar maupun akarnya, dan buahnya yang masih muda juga berkhasiat obat untuk menyembuhkan penyakit disentri,
keputihan, sariawan, kurap, diare, pingsan, radang
lambung, gusi bengkak, dan peradangan mulut, serta kulit terbakar sinar matahari (Cahyono B, 2010). Ekstrak etanol daun jambu biji juga telah dilakukan penelitian terhadap uji aktivitas anti oksidannya (Soebagio,et al. 2007) dan uji aktivitasnya sebagai anti bakteri penyebab diare (Adyana, et al. 2004). Daun jambu biji mempunyai manfaat bagi kesehatan yaitu sebagai antiinflamasi, antidiare, analgesik, antibakteri, antidiabetes, antihipertensi, mengurangi demam dan penambah trombosit (Kirtikar dan Bashu., 1998). Daun jambu biji putih telah terbukti secara
klinis menghambat pertumbuhan rotavirus yang menyebabkan enteritis pada anak-anak dan menyembuhkan kejang dan penyakit diare akut (Lozoya et al., 2002; Wei et al., 2000).
D. Kandungan Kimia Daun Jambu Biji
Kandungan kimia pada daun jambu biji (Psidium guajava L.) menurut Taiz dan Zeiger (2002) yaitu terpen, fenolik, dan senyawa mengandung nitrogen terutama alkaloid. Kandungan kimia tersebut merupakan bagian dari sistem pertahanan diri yang berperan sebagai pelindung dari serangan infeksi mikroba patogen dan mencegah pemakanan oleh herbivora. Hasil fitokimia dalam ekstrak daun jambu biji putih adalah senyawa flavonoid, tanin, triterpenoid, saponin, steroid, dan alkaloid (Arya, et al.,2012). Flavonoid adalah senyawa yang terdiri dari dari 15 atom karbon yang umumnya tersebar di dunia tumbuhan. Quercetin adalah zat sejenis flavonoid yang ditemukan dalam buah-buahan, sayuran, daun dan biji-bijian. Hal ini juga dapat digunakan sebagai bahan dalam suplemen minuman atau makanan. Saponin adalah jenis glikosida yang banyak ditemukan dalam tumbuhan. Saponin memiliki karakteristik berupa buih. Sehingga ketika direaksikan dengan air dan dikocok maka akan terbentuk buih yang dapat bertahan lama. Minyak atsiri adalah kelompok besar minyak nabati yang berwujud cairan kental pada suhu ruang namun mudah menguap sehingga memberikan aroma yang khas. Minyak atsiri merupakan bahan dasar dari wangi-wangian atau minyak gosok (untuk pengobatan) alami. Tanin merupakan substansi yang tersebar luas dalam tanaman dan digunakan sebagai energi dalam proses metabolisme dalam bentuk oksidasi, Tanin juga sebagai sumber asam pada buah. Alkaloid adalah sebuah golongan senyawa basa bernitrogen yang kebanyakan heterosiklik dan terdapat didunia tumbuhan (tetapi ini tidak mengecualikan senyawa yang berasal dari hewan). E. Identifikasi Senyawa
1. Lakukan optimasi eluen dengan cara uji KLT terhadap ekstrak dengan mengganti-ganti eluen sampai diperoleh pemisahan yang baik. Eluen tersebut akan digunakan untuk fraksinasi 2. Saipakan ± 50 gram silica gel 3. Siapkan eluen dari butir (1) sebanyak 300 ml 4. Silika gel dimasukkan ke dalam labu erlemeyer, kemudian ditambahkan sedikit eluen, kocok selama 15 menit 5. Campuran butir (4) tersebut dituang kedalam kolom sampai setinggi 10 cm dari atas
6. Tuangkan eluen ke dalam kolom sampai jenuh, tutup dengan aluminium foil, biarkan semalam 7. Timbang ekstrak sebanyak 1% dari jumlah silica gel yang digunakan, kemudian ekstrak di tambahkan sedikit pelarut (etanol/methanol) ad larut dicampur dengan silica gel sama banyak, diaduk-aduk menggunakan gelas pengaduk sampai homogen dan kering 8. Eluen dibiarkan sampai permukaannya 0,5 cm diatas permukaan silica gel. 9. Ekstrak yang sudah dikeringkan dengan silica gel, dimasukkan ke dalam kolom (diatas permukaan silica
gel),
lalu ditambah
eluen kira-kira
setinggi
3 cm. Eluen
dialirkan/diteteskan sambil dituangi eluen baru sampai kolom terisi penuh dengan eluen, sementara penetesan tetep dilakukan. Kecepatan penetesan diatur. 10. Penampungan eluen setiap vial sebanyak 5 ml 11. Dilakukan uji KLT untuk kelipatan 10 vial (vial no.1,10,20,30,40,dst). Pada uji KLT, fase gerak yang digunakan adalah sama dengan fase gerak pada kromatografi kolom. 12. Bila uji KLT memberikan noda yang sama, maka fraksi diataranya dapat di gabung 13. Bila uji KLT mmeberikan noda yang berdea, maka uji KLT dilakukan pada vial diantaranya (bila vial no 10 dan 20 berbeda, maka vial no.15 dilakukan uji KLT). 14. Penetesan dihentikan bila vial terakhir sudah tidak memberikan noda pada analisis dengan KLT 15. Hasil penggabungan berdasarkan kemiripan profil kromatogram, dianalisis dengan teknik Kromatografi Lapis Tipis dan dihitung Rf masing-masing spot noda 16. Dokumentasikan pada UV 254, UV 365 dan visual 17. Plat KLT (no.15) di derivatisasi dengan pereaksi dragendrof, uap amonia, anisaldehidasam sulfat, FeCl3, dan KOH 10%
F. Pemisahan KLT
Thin Layer Chromatography (TLC) Kromatografi lapis tipis adalah salah satu contoh kromatografi planar. Fase diamnya (Stationary Phase) berbentuk lapisan tipis yang melekat pada gelas/kaca, plastik, aluminium. Sedangkan fase geraknya (Mobile Phase) berupa cairan atau campuran cairan, biasanya pelarut organi dan kadangkadang juga air. Fase diam yang berupa lapisan tipis ini dapat dibuat dengan membentangkan /meratakan fase diam (adsorben=penjerap=sorben) diatas plat/lempeng kaca plastik ataupun aluminium.Digunakan untuk pemisahan zat secara cepat dengan menggunakan zat penyerap berupa serbuk halus yang dilapiskan serba rat pada lempeng kaca. Lempeng yang dilapis dapat dianggap sebagai kolom kromatografi terbuka
dan pemisahan didasarkan pada penyerapan pembagian atau gabungannya tergantung dari zat penyerap pembagian atau gabungannya tergantung dari jenis zat penyerap dan cara pembuatan lapisan zat penyerap dan jenis zat pelarut. KLT dengan penyerap penukar ion dapat digunakan untuk pemisahan senyawa polar.
Fase diam Sifat fase diam yang satu dengan fase diam yang lain berbeda karena strukturnya, ukurannya, kemurniannya, zat tambahan sebagai pengikat dll. Fasa diam yang digunakan TLC tidak sama dengan yang digunakan untuk kromatografi kolom, terutama karena ukuran dan zat yang ditambahkan. Fase diam dijual dengan spesifikasi tertentu, iaitu ukuran (diameter) dalam mesh atau j^m dan untuk kegunaannya (mis: untuk TLC atau kromatografi kolom). Beberapa fase diam yang banyak dijual dipasaran.
Silika gel Silika gel merupakan fase diam yang sering digunakan pada TLC. Dalam perdagangan dijual dengan variasi ukuran (diameter) 10-40μm. Makin kecil diameter akan makin lambat kecepatan alir fase geraknya dengan demikian mempengaruhi kualitas pemisahan. Luas permukaan silica gel bervariasi dari 300-1000 m2/g. Bersifat higroskopis, pada kelembaban relatif 45-75% dapat mengikat air 7-20%. Macam-macam silka gel yang dijual dipasaran, Silika gel dengan pengikat. Pada umumnya digunakan pengikat gypsum, (CaSO4 5-15%). Jenis ini diberi nama Silika gel G. Ada juga menggunakan pengikat pati (starch) dan dikenal Silika gel S, penggunaan pati sebagai pengikat mengganggu penggunaan asam sulfat sebagai pereaksi penentuan bercak.Silika gel dengan pengikat dan indicator flouresensi. Jenis silica gel ini sama seperti silika gel diatas dengan tambahan zat berfluoresensi bila diperiksa dibawah lampu UV A, panjang atau pendek. Sebagai indicator digunakan timah kadmium sulfida atau mangan-timah silikat. Jenis ini disebut Silika gel GF atau Silika gel GF254 (berflouresensi pada 254 , nm). Silika gel tanpa pengikat, dikenal dengan nama Silika gel H atau Silika gel N. Silika gel tanpa pengikat tetapi dengan indicator flouresensi. Silika gel untuk keperluan pemisahan preparatif.
Fase gerak Yang digunakan sebagai fase gerak biasanya adalah pelarut organik. Dapat digunakan satu macam pelarut organic saja ataupun campuran. Bilamana fase gerak merupakan campuran pelarut organik dengan air maka mekanisme pemisahan adalah partisi. Pemilihan
pelarut organic ini sangat penting karena akan menentukan keberhasilan pemisahan. Pendekatanpolaritas adalah yang paling sesuai untuk pemilihan pelarut. Senyawa polar akan lebih mudah terelusi oleh fase gerak yang bersifat polar dari pada fase gerak yang non polar. Sebaliknya, senyawa non polar lebih mudah terelusi oleh fase gerak non polar dari pada fase gerak yang polar.
Pembuatan plat (lempeng) silica gel 30 Gram fase diam berbentuk serbuk (dengan diameter tertentu dijual dengan merk dagang tertentu misalnya Silica gel GF 254) dibuat bubur dengan air atau pelarut lain sejumlah tertentu (lihat tabel 2) diratakan diatas 4-5 lempeng kaca ukuran 20X20 cm, dalam waktu tidak lebih dari 4 menit. Perataan ini dapat menggunakan alat perata Stahl-Desaga untuk plat kaca ukuran 20X20 cm, 20X10 cm dengan ketebalan dapat diatur 0,25-2,0 mm. Bila ukuran plat lebih kecil dapat dibuat dengan mencelupkan ke dalam bubur adsorbent. Setelah lapisan bubur ini mengering diruangan kemudian dipanaskan di dalam oven pada 100-120°C selama 60 menit, dengan tujuan semua air akan menguap. Proses pengeringan atau penghilangan air disebut proses mengaktifkan plat kromatografi (fase diam), selanjutnya didalam rak penyimpan plat-plat ini dimasukkan kedalam dexicator. Sehingga pada waktu penyimpanan plat-plat tadi tidak menyerap lembab (air) dari udara. Dengan demikian mekanisme pemisahan komponen (senyawa-senyawa) yang ditahan fase diam adalah mekanisme absorption.
Penyiapan dan penotolan sampel Sampel atau cuplikan dilarutkan dalam pelarut yang sesuai (hampir pelarut organik dapat digunakan dan biasanya dipilih yang mudah menguap), air digunakan hanya bila tidak dapat dicari pelarut organik yang sesuai. Untuk keperluan analisis kuantitatif sample harus ditimbang demikian juga pelarut yang digunakan. Kemudian larutan sample disimpan dalam wadah yang tertutup rapat untuk menghindari penguapan. Pada umumnya ditotolkan 1- 20 μl larutan yang mengandung 50-100 μg sample tiap bercak untuk kromatografi absorbsi dan 5 2Qμg sample untuk kromatografi partisi. Penotolan dapat dilakukan dengan gelas kapiler
yang dibuat sendiri atau dengan pipet mikro. Untuk keperluan kuantitatif digunakan quantitative microsyringe. Kepada plat TLC konvensional (20X20 cm, 5X20 cm, tebal 0,2 mm) sample ditotolkan sebagai bercak
Tinjauan Eluen Fase gerak merupakan medium angkut yang terdiri atas satu atau beberapa pelarut. Fase gerak bergerak dalam fase diam karena adanya gaya kapiler. Pelarut yang digunakan sebagai fase gerak hanyalah pelarut bertingkat mutu analitik dan bila diperlukan system pelarut mltikomponen ini harus berupa suatu campuran yang sesederhana mungkin yang terdiri atas maksimum 3 komponen. Angka banding campuran dinyatakan dalam bagian volume total 10 (Nyiredy, 2002). Pelarut pengembang dikelompokkan ke beberapa golongan Snyder’s berdasarkan kekuatan pelrutnya. Menurut Stahl (1985) eluen atau fase gerak yang digunakan dalam KLT dikelompokkan ke dalam 2 kelompok, yaitu untuk pemisahan senyawa hidrofil dan lipofil. Eluen untuk pemisahan senyawa hidrofil meliputi air, methanol, asam asetat, etanol, isopropanol, aseton, n-propanol, tert-butanol, fenol, n-butanol, sedangkan untuk pemisahan senyawa lipofil meliputi etil asetat, eter, kloroform, benzene, toluene, sikloheksana, dan petroleum eter.
1. Kloroform a. Sifat fisis
(Ketta & Cunningham, 1992)
Rumus molekul
: CHCl3
Berat molekul
: 119,39 g/gmol
Wujud
: cairan bening
Titik didih
: 61,20C
Titik leleh
: -63,50C
Densitas
: 1,489 g/cm3, 32oC
Suhu kritis
: 264oC
Specific gravity
:1,489
Viskositas
: 0,57 cP (20oC)
Kapasitas panas
: 0,234 kal/goC, pada 20oC
Tekanan kritis
: 53,8 atm
Volume kritis
: 0,239 m3/kmol
Tegangan permukaan
: 0,0267 N/m, 25°C
Kapasitas panas
: 113,666 kJ/kmol.K, 25°C
Panas penguapan
: 29,5 kJ/mol, 61,2°C
Energi Gibbs
: -18,663 kkal/mol
Entalpi pembentukan
: -32,12 kkal/mol
Kelarutan dalam 100 ml bagian air
: 0,8 g (250C)
b. Sifat kimia
Kloroform jika bereaksi dengan udara atau cahaya seara perlahan-lahan akan teroksidasi menjadi senyawa beracun phosgene (karbonil klorida). Reaksi : CHCl3 + ½ O2
udara atau cahaya
COCl2 + HCl
Kloroform dapat direduksi dengan bantuan zeng dan asam klorida untuk membentuk metilen klorida. Jika proses reduksi dilakukan dengan bantuan debu sebg dan air akan dapat diperoleh metana. Reaksi :
Zn
CHCl3 + 2H
COCl2 + HCl HCl Zn
CHCl3 + 6H
CH4 + 3 HCl H2O
Kloroform dapat bereaksi dengan asam nitrat pekat untuk membentuk nitro kloroform atau kloropikrin. Reaksi : CHCl3 + HNO3
CCl2 NO2 + H2O
Kloropikrin biasanya digunakan sebagai insektisida.
Kloroform dapat mengalami proses klorinasi dengan klorin jika terkena sinar matahari dan mengahsilkan karbon tetraklorida. Reaksi : CHCl3 + Cl2
CCl4 + HCl
(Kirk and Othmer, 1982)
2. Aseton a. Sifat-sifat fisika
Rumus molekul
: CH3COCH3
Berat molekul
: 58,080 kg/kmol
Densitas
: 785,601 kg/m3, 25°C
Viskositas
: 0,32 cP, 20°C
Titik didih
: 56,29°C
Titik leleh
: -94,6°C
Temperatur kritis
: 235,05°C
Tekanan kritis
: 4.701 kPa
Volume kritis
: 0,209 m3/kmol
Tegangan permukaan
: 0,0230 N/m, 25°C
Kapasitas panas
: 126,281 kJ/kmol.K, 25°C
Panas penguapan
: 29,1 kJ/mol
Entalpi penguapan
: 30,836 kJ/mol
Energi Gibbs
: -36,47 kkal/mol
Entalpi pembentukan
: -59,33 (cair) kkal/mol
Kelarutan (dalam air)
: larut dalam berbagai rasio
b. Sifat-sifat kimia
Dengan air akan membentuk suatu 1,1-diol yang disebut gem-diol atau hidrat. Reaksi ini bolak-balik dan biasanya kesetimbangan terletak pada sisi karbonil. Reaksi :
Dengan hidrogen sianida dalam kondisi sedikit basa (aseton hidrat) akan membentuk sianohidrin aseton. Reaksi :
Dengan amonia dan amina primer akan membentuk imina, suatu senyawa yang mengandung gugusan C = N. Reaksi ini dapat berjalan dengan baik pada keadaan asam, dimana pH optimum 3-4. Reaksi :
Dengan amina sekunder (R2NH akan menghasilkan ion iminium yang bereaksi lebih lanjut menjadi enamina (vinilamina). Reaksi :
3. Asam formiat a. Sifat fisika
Rumus molekul
: HCOOH
Berat molekul
: 46,03 g/mol
Densitas
: 785,601 kg/m3, 25°C
Viskositas
: 1,57 cP, 25°C
Titik didih
: 100,8°C (760 mmHg)
Titik leleh
: 8,4°C
Spesifik gravity
: 1,22647, 20°C
Tegangan permukaan
: 37,67 dyne/cm, 22°C
Kapasitas panas
: 82,8 joulel/mol.K , 0°C
Panas pembentukan
: 3031 kal/mol
Panas penguapan
: 104 kal/mol
Panas pembakaran cairan
: – 60,9 kkal/mol, pada 25°C
Panas pembentukan cairan
: – 101,52 kkal/mol, pada 25°C
b. Sifat kimia
Asam formiat dapat bercampur sempurna dengan air dan sedikit larut dalam benzene, karbon tetra klorida, toluene dan tidak larut dalam hidrokarbon alifatik seperti heptana dan oktana.
Asam formiat dapat melarutkan nilon, poliamida tetapi tidak melarutkan Poli Vinil Chlorida (PVC).
Campuran Asam formiat dan air membentuk campuran azeotrop (yaitu campuran larutan yang mempunyai titik didih mendekati titik beku) dengan kandungan maksimum Asam formiat 77,5 % pada tekanan atmosfer.
Asam formiat akan terdekomposisi menjadi Karbon dioksida dan air pada temperatur 100 oC atau dalam temperatur kamar bila ditambahkan katalis Palladium.
Asam formiat terhidrasi oleh Asam sulfat pekat dan menghasilkan Karbon monoksida dan air.
Tinjauan Indeks Polaritas Pelarut
Indeks Polaritas
Pentana
0
1,1,2-trikorotrifluoroetana
0
Siklopentana
0,1
Heptane
0,1
Heksana
0,1
Iso oktana
0,1
Petroleum eter
0,1
Sikloheksana
0,2
N- butilklorida
1,0
Toluene
2,4
Metal t -butil eter
2,5
O-xylene
2,5
Klorobenzena
2,7
O-diklorobenzena
2,7
Etil eter
2,8
Diklorometana
3,1
Etilen diklorida
3,5
N -butil alcohol
3,9
Isopropyl alcohol
3,9
N -butil asetat
4,0
Isobutil alcohol
4,0
Metal isoamil keton
4,0
N -propoil alcohol
4,0
Tetrahidrofuran
4,0
Kloroform
4,1
Metal isobutyl keton
4,2
Etil asetat
4,4
Metal n-propil keton
4,5
Metal etil keton
4,7
1,4-dioxana
4,8
Aseton
5,1
Methanol
5,1
Piridin
5,3
2-metoksietanol
5,5
Aseetonitrit
5,8
Propilen karbonat
6,1
N-n dimetilformamida
6,4
Dimetil asetamida
6,5
N -metilpirolidin
6,7
dimetilsulfoksida
7,2
G. Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom merupakan suatu metode pemisahan preparatif. Metode ini memungkinkan untuk melakukan pemisahan suatu sampel yang berupa campuran dengan berat beberapa gram. Pada prinsipnya kromatografi kolom adalah suatu teknik pemisahan yang didasarkan pada peristiwa adsorpsi. Sampel yang biasanya berupa larutan
pekat
diletakkan pada ujung atas kolom. Komponen tunggal yang ada pada sampel dijerap oleh fase diam yang telah dibentuk atau biasa digunakan silica gel yang terdapat pada kolom, namun apabila dialirkan pelarut secara kontinyu maka akan terjadi migrasi senyawa dan senyawa tersebut terbawa oleh pelarut sesuai dengan polaritasnya. Kecepatan eluasi sebaiknya dibuat konstan. Jika kecepatan eluasi terlalu kecil maka senyawa-senyawa akan terdifusi ke dalam eluen dan akan menyebabkan pita makin melebar yang akibatnya pemisahan tidak dapat berlangsung dengan baik. Dan apabila kecepatan eluasi terlalu besar maka pemisahan kurang baik dan tidak berdasarkan tingkat polaritasnya sehingga akan diperoleh fraksi yang sama dan menyebabkan fase diam cepat menjadi kering dan dikhawatirkan terjadi cracking. Permukaan
adsorben harus benar-benar horizontal, hal ini dilakukan untuk menghindari terjadinya cacat yang dapat terjadi selama proses eluasi berjalan.
H. Jenis-Jenis lempeng KLT
Fasa diam dapat digunakan silika gel, alumina dan serbuk selulosa. Partikel silika gel mengandung gugus hidroksil pada permukaannya yang akan membentuk ikatan hidrogen dengan molekul polar air. Pada kromatografi lapis tipis, sebuah garis digambarkan dibagian atas dan bawah lempengan dan setetes pelarut dari campuran pewarna di tempatkan pada garis yang telah ditentukan. Diberikan penandaan pada garis dilempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika dilakukan dengan tinta, pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya kromatogram di bentuk (Roy J. 1991). Alumina (Al2O3) dan silika gel (SiO2). Alumina lebih polar daripada silika gel, dan senyawa ini sering dinyatakan lebih aktif daripada silika gel. Alumina lebih cocok untuk analisis senyawa-senyawa yang nonpolar atau kurang polar (seperti hidrokarbon, eter, aldehida, keton, dan alkil
halida)
karena
senyawa-senyawa
polar
sangat
kuat
teradsorbsi pada adsorbent ini. Analisis KLT senyawa-senyawa polar pada alumina umumnya menghasilkan harga Rf yang rendah dan pemisahan yang minimal. Sebaliknya silika gel dipilih sebagai adsorbent untuk senyawa-senyawa polar (asam karbokislat, alkohol, amina) karena senyawa-senyawa non polar teradsorbsi lemah pada silika gel. Analisis KLT senyawa-senyawa nonpolar pada silika gel umumnya memberikan harga Rf yang tinggi dan pemisahan yang maksimal (Firdaus. 2011).
G. Konstanta dielektrik
n-heksana
= 2.0
kloroform
= 4.8
etil asetat
= 6.0
methanol
= 30.0
semakin tinggi nilai konstanta dielektrik suatu pelarut, maka semakin polar senyawa pelarut tersebut.
III.
BAGAN ALIR
1. Lakukan optimasi eluen dengan cara uji KLT terhadap ekstrak dengan mengganti-ganti eluen sampai diperoleh pemisahan yang baik. Eluen tersebut akan digunakan untuk fraksinasi.
2. Siapkan ± 50 gram silica gel
3. Siapkan eluen dari butir (1) sebanyak 300 ml dan Silika gel dimasukkan ke dalam labu erlemeyer, kemudian ditambahkan sedikit eluen, kocok selama 15 menit.
4.
Campuran butir (3) tersebut dituang kedalam kolom sampai setinggi 10 cm dari atas. Tuangkan eluen ke dalam kolom sampai jenuh, tutup dengan aluminium foil, biarkan semalam
5. Timbang ekstrak sebanyak 1% dari jumlah silica gel yang digunakan, kemudian ekstrak di tambahkan sedikit pelarut (etanol/methanol) ad larut dicampur dengan silica gel sama banyak, diaduk-aduk menggunakan gelas pengaduk sampai homogen dan kering
6. Eluen dialirkan sampai permukaannya 0,5 cm diatas permukaan silica gel.
7. Ekstrak yang sudah dikeringkan dengan silica gel, dimasukkan ke dalam kolom (diatas permukaan silica gel), lalu ditambah eluen kira-kira setinggi 3 cm. Eluen dialirkan/diteteskan sambil dituangi eluen baru sampai kolom terisi penuh dengan eluen, sementara penetesan tetep dilakukan. Kece atan enetesan diatur.
8. Penampungan eluen setiap vial sebanyak 5 ml. Dilakukan uji KLT untuk kelipatan 10 vial (vial no.1,10,20,30,40,dst). Pada uji KLT, fase gerak yang digunakan adalah sama dengan fase gerak pada kromatografi kolom.
9. Bila uji KLT memberikan noda yang sama, maka fraksi diataranya dapat digabung. Bila uji KLT memberikan noda yang berbeda, maka uji KLT dilakukan pada vial diantaranya (bila vial no 10 dan 20 berbeda, maka vial no.15 dilakukan uji KLT).
11.
Penetesan dihentikan bila vial terakhir sudah tidak memberikan noda pada analisis
dengan KLT
12.
Hasil penggabungan berdasarkan kemiripan profil kromatogram, dianalisis dengan
teknik Kromatografi Lapis Tipis dan dihitung Rf masing-masing spot noda
13.
Dokumentasikan pada UV 254, UV 365 dan visual
14. Plat KLT (no.15) di derivatisasi dengan pereaksi dragendrof, uap amonia, anisaldehid-asam sulfat, FeCl3, dan KOH 10%
IV.
SKEMA KERJA
A. Menyiapkan eluen Di erlenmeyer sebanyak 300 ml dengan perbandingan n-heksan:etil asetat (4:1)
+
n-heksan
etil asetat
B. Menyiapkan silika gel Ditimbang silika gel 90 gram
Serbuk silika gel
kolom
C. Menyiapkan kolom
Dicampur dan diaduk Serbuk silika gel
eluen
Campuran dituangkan kedalam kolom dengan diberi erlenmeyer bagian bawah untuk menampung eluen yang mengalir
Silika gel diisikan ad ¾ bagian tabung (pastikan tidak ada udara dan ratakan bagian atas dengan spatula logam)
Isikan eluen diatas permukaan silika gel kurang lebih 0.5 cm Tunggu 10 menit untuk memampatkan silika gel
Sisa silika gel ditimbang
Ekstrak ditimbang 0.79 gram (ditimbng sebanyak 1% dari jumlah silika yang digunakan)
Ekstrak dilarutkan dengan sedikit pelarut ad larut Teteskan ekstrak sedikit demi sedikit ke dalam kolom
Buka kran tabung, biarkan eluen mengalir sambil diisi kembali. Tunggu ekstrak sampai dibawah tabung
Setelah ekstrak berada dibawah, siapkan untuk penampungan senyawa dengan vial Tampung dari vial 1-80 masingmasing vial 5 ml
D. Uji KLT
Vial no. 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, dan 80
ditotolkan pada plat KLT dan dilakukan eluasi Liat noda pada sinar UV 254 dan 365 nm. Lanjutkan penggabungan fraksinasi
