cantidad de varillas por quintal de acero y su peso por metro lineal de cada varilla
Descripción: Tipos de esporas, Micología
Cuantificacion de MaterialesFull description
Descripción: CUANTIFICACION DE CIMENTACION
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Esporas Os Estilos de NietzscheDescrição completa
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Descripción: metodos cuantitativos de impacto ambiental
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PRACTICA N° 1 Cuantificación de la Concentración de Esporas La cuantificación de la concentración de esporas permite determinar el número de unidades infectivas por unidad de peso o volumen existentes en una formulación y sirve de base para establecer la dosificación de un producto.
PROCEDIMIENTO: Para los patrones patrones B.bassiana (Bb920! y ".anisopliae ".anisopliae ("a92#$! se se toma una botella al a%ar& de un cultivo de 2 d'as de desarrollo. emover las esporas con la ayuda de una esp)tula de madera& despu*s adicionar a+ua con ,-een 0 al 0.1/ asta un volumen conocido (00 o 1000ml!. e esta forma ueda preparada la suspensión madre de la cual se toman 3 submuestras de 1ml y se depositan en tubos con 9 ml de 45& uedando de esta manera preparada la dilución 10 61& se repite el procedimiento llevando 1 ml de esta dilución (10 61! a tubos con 9 ml de 45& es decir& 10 62 y as' sucesivamente asta obtener una dilución 10 63 o la dilución apropiada ue permite el conteo para para estimar el número número de esporas por mililitro mililitro de la suspensión. Para el recuento de esporas se utili%a la c)mara de 7eubauer o emocitómetro. La c)mara esta dividida en 2 ret'culos y cada uno se subdividen en 9 cuadrados de 1mm2 cada uno& o sea ue cada ret'culo tiene una superficie total de 9mm2. 5l cuadrado central aparece de nuevo subdividido en 2 cuadrantes m)s peue8os. 5l volumen (! en mm# de cada uno de los cuadrantes es el si+uiente: olumen ; anco x lar+o x profundidad ; 1mm x 1mm x 0.1mm ; 0.1mm #( olumen del cuadrante en el cual se reali%a el
conteo de esporas!.
5l número de esporas se obtiene en ml& por tanto& se debe reali%ar la conversación de mm# a ml& entonces: 1 ml 6 10 # mm #
1ml x 0.1 mm# <
#
< = 0.1 mm < ; 10 61 x 10 6# ; 10 63
0.1 ml ; 0.1x10 6#
; #
#
10 mm ml (>actor de la c)mara !
#
10
5l recuento se determina sumando el total de esporas presente en los 2 cuadrantes centrales de la c)mara. 4 cada submuestra se le reali%a tres veces este procedimiento para un total de seis lecturas. La concentración de esporas se calcula multiplicando el promedio del número de esporas obtenido por el inverso de la dilución empleada para el conteo (?i la dilución empleada fue 10 6# el inverso es 10#! y por el inverso del factor de la c)mara (103!. ?i 7 es el número promedio de esporas por cuadrante& entonces la concentración ue se desea conocer& denominada @& se estima de la si+uiente manera: @ ; 7 x ilución empleada x >actor de @)mara 4ntes de proceder al recuento de esporas el emocitómetro debe ser lavado y secado. 5l tubo de la dilución de la muestra de la cual se va a acer el conteo de esporas se a+ita en un vórtex durante #0 se+undos e inmediatamente se toma la muestra de 10 ul (0.01ml! con una micropipeta y se deposita con cuidado& de manera ue el l'uido entre por capilaridad sin ue se formen formen burbuAas en la c)mara. ?i esto ocurre& ocurre& se retira el cubre obAetos& se lava& se seca la c)mara y se repite el proceso. 5n cada compartimiento de las c)maras se depositan 10ul de la dilución 10=3 o de auella ue facilite un conteo de 10 a 0 esporas por cuadrante. ?e deAa reposar medio minuto antes de proceder al conteo. Lue+o se lleva la c)mara al microscopio y con el obAetivo 10x se locali%a en el campo visual el cuadrante central& se enfoca en tal forma ue se observen n'tidamente los cuadrantes y lue+o se pasa el obAetivo 30x. Para el c)lculo del número de esporas por +ramo se debe terminar previamente el peso del sustrato arro% 6 a+ua utili%ado para el cultivo del on+o. Para obtener el número de esporas por +ramo del producto& se multiplica el promedio del número de esporas por mililitro obtenido en el recuento& por el volumen empleado en la preparación de la suspensión madre y se divide por el peso de la muestra muestra ocupada (or!ato 1"#
2 @on relación a las muestras producidas en sustrato arro% por los @omit*s epartamentales de @afeteros y entidades particulares& las cuatro submuestras se obtienen a partir de cuatro botellas seleccionadas por feca o lote de producción y se prepara la suspensión madre se+ún la metodolo+'a citada para el patrón de comparación. @uando se trata de una formulación en polvo se toma una muestra representativa del lote ue se va a examinar& se procede de la si+uiente manera: 1.= ,omar 19 +ramos de cada recipiente (lote! y se prepara una me%cla de la cual se extraen cuatro submuestras de 1 +ramo. 2.= @ada submuestra es depositada es tubos de ensayo calibrados ue contienen 10ml de t-een 0 al 0.1/ en 45 (suspensión madreC; 100!& a+itar en un vórtex o manualmente durante un minuto. #.= "e%clar& un mililitro de la suspensión madre con 9ml de 45 (dilución 10=1! y un mililitro de la dilución 10=1 con 9ml de 45 asta obtener la dilución 10=2. ?e continua de i+ual manera asta obtener una dilución apropiada ue permita f)cilmente el recuento de esporas. 3.= 5l número de esporas por +ramo producto& se obtiene multiplicando el promedio del número de esporas por mililitro& obtenido en el recuento& por el volumen empleado en la preparación de la suspensión madre (10ml! y se divide por el peso de muestra utili%ada (1+!. 7ormalmente las formulaciones en materiales inertes contienen mucos artefactos ue impiden acer los recuentos en diluciones muy baAas. Por tanto& es necesario acer los estimados en diluciones mayores ue permitan observar bien las esporas. @uanto se evalúan formulaciones l'uidas& se toman 10 ml de cada recipiente y se reali%a una me%cla (suspensión madre 100!& de la ue toma cuatro submuestras se preparan las diluciones de la forma antes descrita para estimar el número de esporas por mililitro de formulación.
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PRACTICA N° $ %er!inación de Esporas 5sta prueba establece la viabilidad del on+o y en combinación con el estimativo del número de esporas se puede calcular la cantidad de esporas viables de una formulación por unidad de peso o volumen. 5ste estimativo se ace con cada una de las cuatro submuestras preparadas para determinar la concentración de esporas.
PROCEDIMIENTO: 1# Preparar de 10 a 1 ml de 4+ar=a+ua al 1./ sin acidificar en caAas de petri. "arcar puntos en la superficie externa inferior de la caAa& correspondientes a los puntos en los cuales se depositar)n las al'cuotas ue contienen las esporas.
$# e la dilución 10=# de cada submuestra preparada en la prueba anterior y previamente a+itada& tomar ul para depositar en las caAas petri& a ra%ón de al'cuotas por caAa por submuestra. Dncubar las caAas de petri inoculadas a 2(E=! 2F@ durante 23 oras.
&# ,ranscurrido el tiempo de incubación a+re+ar una +ota de a%ul de lactofenol a cada al'cuota con el propósito de detener la +erminación y a la ve% te8ir las esporas del on+o& lue+o cortar las al'cuotas deposit)ndolas sobre una l)mina portaobAetos y cubrir con una laminilla.
'# La observación se ace con el obAeto 30< contando un m'nimo de 100 esporas (re+istrar +erminadas y no +erminadas! por al'cuota. @on los datos obtenidos en las cuatro submuestras calcular el porcentaAe de +erminación (or!ato $"# Gna formulación comercial debe tener una +erminación superior al / en un tiempo de incubación de 23 oras. Lo anterior& debido a ue al asperAar el on+o en el campo debe tener un r)pido efecto sobre la población del insecto ue esta atacando y un corto per'odo de exposición a condiciones ambientales adversas.
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PRACTICA N° & Pruea de Pure)a La prueba de pure%a tiene como finalidad establecer la proporción del a+ente bioló+ico en la formulación e identificar los microor+anismos contaminadores& contribuyendo a meAorar el proceso de producción y formulación de los entomopató+enos. Para reali%ar esta prueba se reali%a el si+uiente procedimiento.
PROCEDIMIENTO: 1.
Preparar ?4 m)s cloranfenicol (0.01$/! de la si+uiente manera: 0.2 +ramos de cloranfenicol en 100ml de a+ua destilada est*ril& de esta solución tomar 1ml ue se a+re+a a 10ml de ?4 previo al vaciado en las caAas de petri esterili%adas& es decir cuando alcance una temperatura de 30F@. erter el medio en cantidades de 10 a 1 ml por caAa.
2.
Lue+o tomar los tubos de la dilución 10=3 de cada una de las submuestras del patrón y se a+itan en un vórtex durante un minuto& inocular 0.1ml en la superficie de dos caAas por submuestra& dispersando el inóculo con la ayuda de un rastrillo o pipeta esterili%ada. 5n el caso de los productos comerciales tomar una dilución 10=# o 10=3& dependiendo de la concentración del producto.
#.
Las caAas inoculadas someter a incubación a una temperatura de 2(E=! 2F@ con el fin de promover el desarrollo de unidades formadoras de colonia (G>@!.
3.
iariamente y durante H d'as se contabili%a el número de G>@ de cada microor+anismo en cada una de las submuestras. 4l final de las lecturas& se identifican los microor+anismos presentes. 4notar el número estimado& el porcentaAe del entomopató+eno en estudio& otros on+os& bacterias y levaduras encontrados (or!ato &".
5l porcentaAe de pure%a (P! se calcula de la si+uiente manera: G>@ del on+o evaluado /P ;
< 100 G>@ totales
?e considera ue las fórmulas comerciales deben tener un porcentaAe de pure%a superior al 90/.
PRACTICA N° * PR+E,A DE PATO%ENICIDAD 5sta es la prueba m)s importante en el an)lisis de calidad de una formulación& ya ue determina si el pató+eno realmente ataca la pla+a para la cual esta recomendado. ?in embar+o& no ase+ura ue baAo condiciones de campo su eficacia va a ser i+ual a la re+istrada en laboratorio. euiere el desarrollo de una metodolo+'a para criar y manipular los insectos en el laboratorio y ase+urar ue permane%can vivos en el tratamiento testi+o durante la prueba. Las pruebas se dise8an para proporcionar condiciones ideales en el momento de la exposición al pató+eno& para ue ocurra la +erminación e invasión del ospedante& y en la conidio+*nesis & para favorecer la esporulación del on+o sobre el insecto muerto y poder confirmar ue la mortalidad se debió al tratamiento con el ol+o.
PROCEDIMIENTO: ?eleccionar adultos de broca del caf* de menos de d'as de edad& provenientes de una cr'a libre de pató+enos. esinfectar previamente con una solución de ipoclorito de sodio al 0./ durante 10 minutos y lavar en 45 usando mallas de tul esterili%adas ue sirven de colador. e estas brocas seleccionar las ue mayor actividad presenten. @omparar las formulaciones ue se deben evaluar con el patrón (Bb 920!. La concentración de inóculo empleado debe ser de 1x10H eIml suspendidas en 45& tanto para el patrón como para cada uno de los productos comerciales formulados y no formulados. Para la evaluación de cada producto tomar 30 brocas al a%ar& distribuidas en 3 repeticiones& cada una con 10 individuos. Para cada evaluación utili%ar un testi+o compuesto de adultos de broca ue no entran en contacto con el on+o. ?umer+ir las brocas en una suspensión de esporas del on+o 1x10H eIml durante 2 minutos& la cual se mantiene en a+itación manual. Lue+o& colocar una broca por vial de vidrio (frasco antibiótico!& con un disco de toalla de papel previamente umedecido con 45 y tapar con una mota de al+odón esterili%ada bien aAustada a la boca del vial. 4l cabo de 23 oras adicionar& como sustrato a cada vial& un +rano de caf* per+amino seco de a+ua (3/ de umedad!& es decir& sin nin+ún proceso de secado mec)nico. iariamente y durante 10 d'as se evalúa la mortalidad causada por el on+o en estudio& observando al estereoscopio los s'ntomas y si+nos de enfermedad en las brocas. Las brocas vivas o muertas deben permanecer en los viales para no interrumpir el desarrollo normal del on+o en el insecto. @on una Aerin+a desecable diariamente adicionar 45 asta umedecer el disco de papel evitando la presencia de a+ua libre. La umedad puede ser considerada como el factor m)s importante en el desarrollo de una micosis en la etapas de +erminación de las esporas y conidio+*nesis. @on el re+istro diario de pato+enecidad (or!ato '" establecer el ciclo del desarrollo del on+o sobre la broca& el porcentaAe de mortalidad (or!ato *" y el promedio del tiempo de mortalidad (or!ato -!& ue constituyen otros criterios importantes en la calidad bioló+ica del on+o en estudio. 5l tiempo de evaluación var'a para cada on+o entomopató+eno estudiado& dependiendo del ciclo bioló+ico del on+o en el insecto y de la supervivencia del insecto no tratado baAo las condiciones del ensayo. Los productos comerciales deben causar mortalidades superiores al 0/ en esta prueba.
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PRACTICA N° PR+E,A. I.ICO/+0MICA. A#
p
"ediante este& se determina la acide% o la alcalinidad de una formulación.
PROCEDIMIENTO: Preparar una me%cla en proporción 1:10 (muestra: a+ua destilada!& omo+eni%ar y deAar reposar durante una ora. @on un potenciómetro previamente calibrado con soluciones Buffer& se determina el pJ (or!ato 2!. 5l valor del pJ influye en la +erminación del on+o& retard)ndola en valores extremos. ?e consideran intervalos óptimos de pJ los valores entre . y H.0.
,#
Porcenta3e de u!edad
Los valores de umedad encontrados en las producciones artesanales ue utili%an como sustrato de arro%& tanto del on+o B. bassiana como ". anisopliae son muy variables y oscilan entre el #0 y 0/ y en +eneral no afectan la +erminación y pato+enicidad de los on+os. Jumedades mayores del 0/ proporcionan condiciones favorables para el desarrollo de microor+anismos tales como bacterias y levaduras ue entran en a competir con el a+ente bioló+ico y reducen su viabilidad. 5n el caso de productos liofili%ados o formulados en inertes como talco& bentonita& lece y tierra de diatómaceas& se presentan porcentaAes de umedad entre #.0 y 1/& ue retardan li+eramente el proceso de +erminación.
PROCEDIMIENTO: La determinación de umedad se puede reali%ar mediante la utili%ación de un desecador infrarroAo LA=1$& al cual se le adapta un censor ue re+istra la p*rdida de umedad del producto cada minutos y compara la lectura actual con la anterior asta el momento en ue se estabili%a la umedad& re+istrando el porcentaAe de p*rdida o estableciendo previamente los tiempos de secado de acuerdo al producto inerte& eA: sustrato arro% H0 minutos& y talcos o bentonitas 30 minutos (or!ato 2!. Ktra forma de determinar la umedad se consi+ue secando una c)psula de porcelana a 10F @ durante dos oras. ,omar lue+o con una pin%a met)lica y enfriar durante #0 minutos en un desecador de vidrio con cloruro de calcio& el cual favorece la presencia de umedad constante. ,ranscurrido este tiempo& se pesa la c)psula vac'a (P@! en una balan%a anal'tica y se toma una muestra de 1+ de formulación ue se deposita en la c)psula. Lue+o re+istrar su peso (Peso @)psula E "uestra Júmeda ; P@"J!. Posteriormente& la c)psula m)s la muestra úmeda se lleva a la estufa a 10F c& durante 23 oras. 4l finali%ar el secado& sacar de la estufa y trasladar a un desecador durante #0 minutos. Por último& pesar la c)psula m)s la muestra seca ( Peso @)psula E "uestra ?eca& P@"?! (or!ato 4!. 5l porcentaAe de umedad se determina como en el si+uiente eAemplo: P@ ; 10.919 + P@"J ; 20.H$ + P@"? ; 20.H220 + Peso úmedo (PJ! ; (P@"J! 6 (P@"?! ; 00.3$ + Peso muestra (P"! ; (P@"J! 6(P@! ; 9.H$9 PorcentaAe de umedad ; / J ; PJ x 100IP" /J ; 0.03$ x 100 I 9.H$9 ; 0.3H/
H
C#
u!ectailidad
etermina el tiempo ue tarda un polvo moAable en umedecerse completamente.
PROCEDIMIENTO: Pesar + de la formulación ue se va a evaluar y depositar en un punto fiAo en la superficie de un vaso de precipitación de 20ml y Hcm de di)metro interno& ue contiene 200ml de a+ua destilada. @on un cronómetro medir el tiempo transcurrido entre el momento de a+re+ar la muestra y el instante en ue esta desaparece de la superficie (or!ato 2!. 5sta prueba se reali%a solo a productos industriales formulados en polvos& talcos& bentonitas& tierra de diatom)ceas y lece& entre otros.
PRACTICA N° 2 PR+E,A. I.ICO/+0MICA. .uspensiilidad etermina la concentración de esporas del producto en suspensión despu*s de un tiempo de preparada la me%cla& con el fin de ase+urar la omo+eneidad de la concentración del producto durante la aspersión.
PROCEDIMIENTO: 1# Para el patrón de referencia (Bb 920! se utili%a el on+o producido en arro% con 2 d'as de desarrollo (aislamiento reactivado en broca e incubado a 2 E= 2F @!. @on este on+o preparar una suspensión adicionando a una botella (100+ de arro% con on+o! 10ml de aceite de uso a+r'cola y un poco de a+ua destilada est*ril& removiendo las esporas con la ayuda de una esp)tula.
$# erter la suspensión en un erlenmeyer y completar asta un litro& adicionando a+ua destilada. 4s' se obtiene la suspensión madre.
&# ,omar de la suspensión madre 0ml y llevar a un volumen total de un litro (suspensión de esporas (?5!!& conservando la relación +ramo de producto formulado por volumen de a+ua recomendado (100+ de arro% con on+o I 20L de a+ua!& en aspersiones en el campo.
'# 4+itar el volumen total de suspensión de esporas& se filtra a trav*s de una malla $0 mes o colador de red peue8a ue permita solamente el paso de las esporas del on+o y elimine los residuos de arro%. 4+itar la muestra& se toma 1ml y llevar a un tubo con 9 ml de 45 (10=1!& reali%ando las diluciones respectivas. @ontar las esporas en el emocitómetro y se calcula la concentración inicial (@D! de esporas por mililitro en el volumen total de la suspensión.
*# 5l volumen restante de la suspensión distribuir en cuatro probetas de 20ml& a+itando previamente. eAar en reposo en un sitio ue no este sometido a vibraciones a movimientos ue alteren el proceso de sedimentación normal de las esporas.
-# 4l cabo de 0 minutos introducir lentamente a cada una de las probetas& una pipeta de 10ml& cuya punta penetre 1cm desde la +raduación superior de la probeta. e este sitio se toman 10ml de la suspensión de esporas y depositar en tubos de vidrio.
2# 4 partir de estas suspensiones preparar diluciones (10=1&10=2 o la dilución ue permita el conteo de esporas!& preferiblemente la dilución en la cual se efectuó el conteo para determinar la concentración inicial. Jacer el recuento de esporas en el emocitómetro tres veces consecutivas& para un total de seis lecturas estableciendo la concentración final (@>!. @on esta información proveniente de las cuatro probetas& calcular el promedio de esporas presentes en cada una de las suspensiones del patrón (or!ato
5"#
La suspensibilidad de formulaciones en otros portadores se determina en forma similar& teniendo en cuenta la dosis y el volumen por )rea& recomendado por el fabricante& para establecer la concentración del producto. 5l volumen final de la suspensión ue se va a evaluar debe mantener la misma relación +ramo de producto formulado por volumen de a+ua recomendado. La suspensibilidad de las preparaciones y formulaciones de B.bassiana y ".anisopliae se calcula considerando el número de esporas por mililitro presentes al cabo de 0 minutos& teniendo como base la concentración de esporas de suspensión inicial. e esta forma& se obtiene el porcentaAe de esporas suspendidas en cada una de las preparaciones y formulaciones del on+o. La fórmula ue se debe aplicar para el / de suspensibilidad es: / ?uspensibilidad (/?! ; @> x 100 I @ D 5Aemplo:
9 $. x 10H eIml (concentración inicial (@D!! 6 100/ 3.3 x 10H eIml (concentración final (@>!! = < <; $H.H 5n donde <;$H.H/ es el porcentaAe de esporas suspendidas al cabo de 0 minutos& lo ue corresponde al tiempo ue se demora una aspersora de 10 litros de presión previa retenida& para evacuar su contenido con una bouilla de 190 ccImin de descar+a.
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INORME DE PRACTICA. PRE.ENTACI6N DE RE.+7TADO. Los datos de cada prueba sirven para presentar la información al usuario y mantener un arcivo de las evaluaciones reali%adas en el laboratorio. 5n este re+istro se debe anotar& en la sección de observaciones& información pertinente ue contribuya a tener un meAor conocimiento del entomopató+eno obAeto de la investi+ación y producción
(or!ato 11"# Las pruebas de calidad se deben reali%ar en todas las etapas& tanto de producción como de distribución y almacenamiento de las formulaciones de los on+os& para contar con información ue permita corre+ir los factores ue deterioran la calidad. e esta forma& las pruebas ayudan a mantener los est)ndares de calidad de los productos.
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REACTI8ACION DE7 ON%O Para la reactivación del on+o sobre adultos de la broca del caf* se procede como si+ue:
1# ?eleccionar brocas activas de una colonia& especialmente auellas ue se observan volando. $# esinfectar las brocas con ipoclorito de sodio al 0./ el cual se prepara tomando 9.2 ml de cualuier
&# '#
*#
producto comercial (.2/!& llev)ndolo a 100ml con a+ua destilada est*ril (45!. ?umer+ir las brocas durante 10 minutos en esta solución& lue+o se lavan tres veces con 45 sobre mallas de tul esterili%adas& ue sirven de colador. Lue+o con la ayuda de un pincel colocar sobre una toalla de papel esterili%ada. Posteriormente se reali%a la infección de las brocas por inmersión durante dos minutos en 10ml de la suspensión madre del on+o y colocar en una caAa +alletera o en un frasco de boca anca ue conten+a una toalla de papel esterili%ada& la cual debe permanecer úmeda. 5l recipiente se debe mantener tapado. espu*s de 10 d'as& es decir& cuando el on+o se a desarrollado completamente sobre el cuerpo de las brocas& tomar individualmente estas con un pincel desinfestado& someter a una nueva desinfestación con ipo clorito de sodio comercial al .2/ por un minuto y sin lavar& se pasan inmediatamente sobre la toalla de papel esterili%ada para retirar el exceso de ipoclorito. >inalmente las brocas infectadas con el on+o se colocan individualmente en tubos de ensayo con ml de medio de cultivo inclinado& ?abouraud extrosa 4+ar (?4! o tres brocas en una botella de arro%& cuando el on+o obten+a su m)ximo crecimiento y esporulación en el medio se inicia la producción masiva a partir de este.
