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Practica No 4 y 6
Efecto hipercrómico del
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MÉTODO RÁPIDO, ECONÓMICO Y CONFIABLE DE, MINI PREPARACIÓN DE ADN PARA AMPLIFICACIONES POR RAPD EN BANCOS DE GERMOPLASMA Asia Y. Zambrano Zambrano*, *, Jhonny R. Demey**, Demey**, Gustavo Martínez*, Francia Fuenmayor*, Zulay Gutiérrez*, Gustavo Saldaña* y María Torrealba*
*Investigadores. *Investigadores. INIA. Centro Nacional de Investigaciones Agropecuaria Unidad de Biotecnología. Av. Universidad, vía El Limó Apdo. 4521. Maracay -2101, estado Aragua. Venezuel **Consultor. TI-GC. Apdo. 4521. Maracay 2101. Venezuel
RECIBIDO: enero 14, 200
RESUMEN
Existen numerosos métodos de extracción de ADN desarrollados para diferentes especies de plantas, sin embargo, la mayoría requieren una alta inversión de tiempo, material vegetal y reactivos, o producen bajo rendimiento de ADN. Cuando se trabaja con un gran número de plantas, como es el caso de los bancos de germoplasma, se requiere un método rápido y eficiente de extracción que produzcan ADN de alta calidad. La metodología de extracción de ADN descrita es rápida, sencilla y permite la obtención de ADN genómico de buena calidad, libre de compuestos secundarios, proteínas y polifenoles que coprecipitan con el ADN, los cuales inhiben la reacción de amplificación de ADN. Produce entre 15-25 μg de AD por 100 mg de tejido fresco. La calidad de ADN fue validada a través de su consistente amplificación usando la técnica de RAPD en Saccharum spp., Musa sp., yManihot esculenta. El tiempo requerido para la extracción de ADN fue reducido a un 40% y su costo y nivel de toxicidad a un 50% comparado con los métodos utilizados normalmente.
Palabras Clave: Extracción de ADN; RAPD; Saccharum spp.; Musa sp.; Manihot esculenta.
INTRODUCCIÓNSign up to vote on this title
laboriosas, con alto Las técnicas de biología molecular son normalmente requerimiento de tiempo y dinero, siendo esto particularmente cierto cuando se trata de la extracción de ADN. El análisis de ADN genómico de plantas es realizado Useful
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Cuando se trabaja con un gran número de plantas como es el caso de los bancos d germoplasma se requiere un método rápido y eficiente de extracción que produzca ADN de alta calidad.
En este trabajo se describe un protocolo modificado de extracción de ADN descrito por el CIAT (1999) para Pyricularia grisea , relativamente sencillo, económico, que produce alta cantidad de ADN de buena calidad en Saccharum spp., Musa sp., y Manihot esculentapara ser usado en la amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD), y que puede ser realizado completamente en 50 muestras por una person en un día.
MATERIALES Y MÉTODOS Material vegetal
Se utilizó tejido foliar joven de Saccharum spp., Musa sp., y Manihot esculenta, al cual se le realizó el procedimiento modificado de extracción de ADN descrito por el CIAT (1999) para Pyricularia grisea en arroz.
Protocolo de extracción de ADN 1. Pulverizar con nitrógeno líquido tejido foliar joven recién cortado. 2. En un tubo eppendorf de 1,5 ml colocar material vegetal pulverizado hasta la
marca de 500 μl y resuspender con 750 μl de buffer CTAB (2X), (2% de CTAB, 100 You're Reading a Preview mM de tris base pH 8,0, 10 mM de EDTA y 0,7 M de NAC1 agregar agua hasta 500 ml y autoclavar). Adicionar 30 μl de 2-β mercaptoetanol. Agitar suavemente e Unlock full access with a free trial. incubar por 30 minutos a 65 ºC.
Download potasio With (3 M,Free pH Trial 4,8), mezclar suavemente e 3. Agregar 300 μl de acetato de incubar en hielo por 15 min. Centrifugar 10 min a 14 000 rpm y transferir el sobrenadante a otro tubo.
4. Adicionar 500 μl de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1), mezclar suavemente por inversión del tubo y centrifugar 10 min a 14 000 rpm.
5. Cuidadosamente pipetear la fase superior en tubo con 500 μl de Isopropanol frí para precipitar el ADN. Incubar en hielo durante 60 min. Sign up to vote on this title
el Useful sobrenadante. 6. Centrifugar en 5 min a 14 000 rpm y descartar Not useful
7. Lavar el pellet de ADN dos veces con 500 μl de Etanol al 70% frío. Descartar el
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Validación de la calidad de ADN a través su amplificación por RAPD
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Una vez extraído y cuantificado el ADN se procedió a su validación a través de la amplificación con iniciadores aleatorios, utilizando 15 μl de mezcla de reacción constituida por 1,5 μl de Buffer B 10X, 3 mM de MgC12, 0,2 mM de cada uno de lo dNTPs, 1μM de primer, 0,5 U de Taq y 15 ng de ADN.
La amplificación fue realizada en un Termociclador MJ Research PTC 200, empleando un ciclo de desnaturalización inicial a 94 ºC por 5 min, seguido de 45 ciclos de amplificación a 94 ºC por 1 min, 36 ºC por 30 seg, y 72 ºC por 2 min, y un ciclo final de extensión a 72 ºC por 7 min. La separación de los productos de PCR se realizó en geles de agarosa 1,2% corridos Por 2 h a 80 W y visualizados co Bromuro de Etídio bajo luz UV.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La metodología de extracción de ADN descrita es rápida, sencilla y permite la obtención de ADN genómico de buena calidad, libre de compuestos secundarios qu atrapan el ADN en una matriz gelatinosa (Guillemaut y Marechal, 1992) y de proteínas y polifenoles que coprecipitan con el ADN (Demeke y Adams, 1992; Do y Adams, 1991) los cuales inhiben la reacción de amplificación de ADN (Pandey et a 1996).
La Figura 1 muestra de izquierda a derecha ADN de Saccharum spp., en la primera fila, deMusa sp., en la segunda fila y de Manihot esculentum en la tercera fila, donde se puedeYou're estimar visualmente Reading a Preview 100 ng/μl por comparación con ADN de λ no digerido. La metodología de extracción Unlock full access with aentre free trial.15-25 μg por 100 mg de descrita produce alto rendimiento de ADN tejido fresco, estable, con una relación A260/A280 entre 1,83 y 1,96 lo qu sugiere que el ADN aislado Download esta libreWith de proteínas. Free Trial
La calidad del ADN fue validada a través de su amplificación, siendo consistentemente amplificable a través de la técnica de RAPD utilizando 20 oligonucleótidos de OPERON lo cual se muestra en las Figura 2, se observan los patrones generados por los productos de amplificación con 14 oligonucleótidos para Saccharum spp., (Figura 2a), con 16 oligonucleótidos para Musa sp., (Figura 2b) y con 20 oligonucleótidos para Manihot esculenta (Figura 2c), generándose en las tres especies productos de amplificación que oscilan entre 200 y 1 750 pb. Sign up to vote on this title
No se requirió una segunda precipitación de proteínas y polifenoles con Cloroformo useful Useful Not así como la purificación final con Fenol lo que reduce el uso de estos reactivos de alto riesgo.
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FIGURA 1. Análisis electroforético de la calidad de ADN extraído en (a) Saccharum spp. (b)Musa sp. sp., (c) Manihot esculenta, comparado con 100 mg de ADN de λ no digerido (Primera columna de la izquierda).
You're Reading a Preview Unlock full access with a free trial.
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FIGURA 2. Patrones de ADN polimórfico de Saccharum spp. (a), Musa sp. (b) y Manihot esculenta (c). Oligonucleóticos: OPA01, OPA02, OPA04, OPA07, OPA10, OPA11, OPA17, OPA18, OPA19, OPA01 (primera fila de izquierda a derecha) y OPB06, OPB07, OPC13, OPC15, OPE02, OPF13, OPF14, OPM04, OPM14, y OPM20 (segunda fila de izquierda aderecha).
Sign up to vote on this title CUADRO. Comparación entre metodologías de extracción. Useful Doyle y Doyle Dellaporta et al. Protocolo (1987) (1983) Tejido vegetal
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Método propuesto ~1g
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plant material and reagents, or produce low yields of DNA. When working with a great number of plants as with germoplasm collections, a fast and efficient method of extraction to produce DNA of high quality is required. The methodology describes for DNA extraction is fast, simple and renders genomic DNA of good quality, free of secondary compounds, proteins and polyphenols that coprecipitate with the DNA inhibiting the reaction of DNA amplification. Methodology produced between 15-25 μg per 100 mg of fresh tissue. Quality of DNA was validated through its consistent amplification using RAPD technique in Saccharum spp., Musa sp., and Manihot esculenta. Time required for DNA extraction was reduced to 40% and its cost and level of toxicity to 50%, compared with other commonly used methods. Key Words: DNA extracción; RAPD; Saccharum spp.; Musa sp.; Manihot esculenta. BIBLIOGRAFÍA ALJANABI, S. M. and I. MARTÍNEZ. 1997. Universal and rapid saltextraction of high quality genomic DNA for PCR- based techniques. Nucleic Acids Res. 25:4692-4693. CHEN, D. H. and P. C. RONALD. 1999. A rapid DNA minipreparation meted suitable for AFLP and other PCR applications. Plant Mol Biol Rep. 17:53-57. You're Reading a Preview
CIAT. 1999. Taller integración de fitopatología, mejoramiento y biología Unlock full with a free trial. molecular para el desarrollo deaccess resistencia al añublo del arroz. Centro Internacional de Agricultura Tropical. Cal¡. Colombia, 14-18 de octubr Download With Free Trial
DELLAPORTA, S. J., J. WOOD and J. B. HICKS. 1983. A plant DNA minipreparation: versión II. Plant Mol Biol. Rep. 1:19-21.
DEMEKE, T. and R. P. ADAMS. 1992. The effect of plant polysaccharides an buffer additives of PCR. Bio Techniques. 12:332-334. DO, N. and R. P. ADAMS. 1991. A simple technique for removing plant polissacharide contaminants from DNA. Bio Techniques. 10:162-166. Sign up to vote on this title
DOYLE, J. J. and J. L. DOYLE. 1987. A rapid DNA isolation procedure from useful Useful Bull. Not small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem 19:11-15.
GUILLEMAUT, P. L. and D. MARECHAL. 1992. Isolation of plant DNA: a fast
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HONEYCUTT, H. J., B. W. SOBRAL, P. KIEM and J. E. IRVINE. 1992. A rapid DNA extraction-method for sugarcane and relatives. Plant Mol Biol Rep. 10(1):66-72. PANDEY, R. N., R. P. ADAMS and L. E. FLOURNOY. 1996. Inhibition of random amplified polymorphic DNAs (RAPDs) by plant polysaccharides. Plant Mol Biol Report. 14:17-22. ^
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