Mesa #4
Laboratorio de Tópicos de Bacteriología Cínica
Conservación de cepas: Glicerol Objetivo •
Dism Dismin inui uirr al míni mínimo mo la acti activi vida dad d del del micr microo oorg rgan anis ismo mo a larg largo o plaz plazo o medi median ante te la criopreservación.
Introducción dcdñlcmdñlmcñedlmc
Método ideal de conservación • • •
Cultivos puros, sin contaminación. Sobrevida del 70!0" del inóculo. Gen#ticamente estables.
Fundamento Congelamiento $ descongelamiento r%pido. Glicerol. &gente crioprotector no iónico 'neutraliza el e(ecto de las sales). *a congelación disminu$e la actividad metabólica dr%sticamente de una c#lula por la disminución de agua disponible +asta el caso de pr%cticamente anularlo con nitrógeno líuido '-/C). Compuesto uímico no tó1ico, atraviesa con (acilidad la membrana celular $ se acumula intr intrac acel elula ularm rment ente. e. 2educ educe e al míni mínimo mo los los e(ec e(ecto tos s per3 per3ud udic icia iale les s del del aume aument nto o de la concentración de solutos $ la (ormación de cristales de +ielo lisis celular. 4emperatura: 4emperatura: 5n auell auellos os conge congelad lador ores es ue sólo alcanz alcanzan an temper temperatu aturas ras entre entre 60 60 C $ 680 680 C, no son aconse3ables, entre otras cosas porue debido a la gran concentración de solutos ue e1isten en la suspensión celular, su punto de congelación ba3a. 5l daño ue se produce en las c#lulas es debido a ue a estas temperaturas +a$ (recuentes congelaciones $ descongelaciones. Si se añade un crioprotector no iónico, como por e3emplo el glicerol, se reduce la cantidad de +ielo ue se produce $ se evita el aumento de la concentración iónica. • • •
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*a congelación debe ser lenta a la par con una descongelación r%pida. Condiciones: + asta 0C $ luego un r%pido descenso en la temperatura. 9n C por minuto +asta 4emperatura de conservación m%s ba3a recomendada es 70C 'esto 4emperatura recristalización recristalización intracelular).
Microorganismos •
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evita
la
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Procedimiento *os microorganismos pueden ser preservados de ; a 0 C por - años por congelación en cultivo en caldo o en suspensiones celulares en viales.
, cuando son almacenadas a 70C o en nitrógeno líuido de -;/ a -/C. Con cultivos en caldo se toman de la mitad o pasada la (ase logarítmica del crecimiento $ mezclado con un volumen igual de -0 a 0" 'v?v) de glicerol o de ; a -0" 'v?v) de D=S>. <ernativamente, se puede preparar una suspensión de glicerol al -0" v?v de crecimiento del microorganismo desde las ca3as petri. 5n este caso la suspensión es pipeteada a viales criog#nicos o ampolletas, se congela $ se almacenan. Solución de glicerol 'alco+ol) -0; ". 4emperatura: 70 C
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2econstitución 'des+ielo). Descongelación r%pida: baño =aría 'A7 C) Crioviales: Criotolerancia, tapa a rosca $ o@ring. =%1ima capacidad de almacenamiento $ (acilidad de mane3o. Colocar 0,;-,0 m* de la suspensión de celular, no llenar. 2ecuperación postcongelado. 9na vez recuperadas, nunca utilizar los microorganismos inmediatamente en pruebas siológicas, realizar de - pasa3es previos 'estr#s celular). 4rans(erir a medios adecuados 'caldos o medios agarizados). 4iempo de incubación: puede disminuir la velocidad de crecimiento.
Factores que infuyen en la viabilidad y estabilidad de las cepas 4emperatura de almacenamiento: itrógeno líuido: -/ C '(orma gaseosa -80 C). Se utiliza para la conservación de bacterias, virus $ líneas celulares. 51isten varios problemas pr%cticos: el nitrógeno se evapora continuamente por lo ue se debe rellenar regularmenteE se deben utilizar recipientes ue resistan bien estas temperaturas $ ue est#n bien cerrados para evitar la entrada del nitrógeno. •
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9ltra(reezer: +asta / C. Congelador: 0 a 80 C. <a densidad celular: 9sar entre -07-08 c#lulas?m*: lisis de parte del inóculo. 5dad de las c#lulas: Felocidad de crecimiento promedio '-! +oras, - semana, 0 días). *o ideal es la preservación en la (ase log tardía o al inicio de su (ase estacionaria 'ma$or resistencia a la congelación $ descongelación). Si se trata de cepas ue cuentan con un estado de esporulación, se debe realizar en ese momento. ucleación cristalina: Felocidad de congelación: --0 C?minuto minimiza el e(ecto de la concentración de los solutos durante la nucleación. *a congelación paulatina evita la lisis celular.
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Ventajas • • • •
Fiabilidad 7-0 años. Glicerol 0" garantiza viabilidad por A años. o se +an reportado cambios a nivel gen#tico. &pto para gran variedad de microorganismos. Sencillo, pretratamiento mínimo.
esventajas • • • •
2euiere euipo especial, aumenta el costo. Suministro constante de energía. 5specio (ísico re(rigerado. o apto para el envío de cepas
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!ibliogra"#a 1. +.
A.
Burguet LN, Sierra PN, costa !M. !"aluación de una or$ulación para la conser"ación de cepas de Pseudo$onas aeruginosa. %e"ista C!N&C Ciencias Biológicas, 'ol. 4(, No. 1, pp. (1)(*, +14. rencibia -, %osario L, /0$e %. M2todos /enerales de Conser"ación de Microorganis$os.researc3 /ate +56 Morales /7, -u8ue !, %odrígue 9, -e la Torre :, Martíne C%, P2re T%, Mu;o %:. Bacterias preser"adas, una uente i$portante de recursos bi otecnológicos. BioTecnología +16 'ol 14 no +
