Obtención, Aislamiento e Identificación de Cepas Bacterianas Presuntas Productoras de PHA

UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE BIOLOGÍA

Obtención, Aislamiento e Identificación de Cepas Bacterianas Presuntas Productoras de Poli- β-hidroxialcanoatos (PHAs)

TESIS TRABAJO DE EXPERIENCIA EXP ERIENCIA RECEPCIONAL RECEPCIONAL

QUE PRESENTA:

ELIZABETH ORTIZ GARCÍA

DIRECTOR: Biol. S. Augusto Hernández Rivera

Xalapa, Ver.

2009

Dedicatoria

Me gustaría dedicar esta Tesis a toda mi familia, ya que el esfuerzo y dedicación que he puesto en esta Tesis va con mucho cariño hacia ellos. Principalmente a mis padres, los más importantes y los verdaderos responsables de que hoy esté aquí, este es buen momento para dejar en claro mi más profundo agradecimiento a mi madre por los sacrificios y esfuerzos que realizó a lo largo de…… siempre, porque me ayudo a seguir adelante frente a cada una de las adversidades presentadas… presentadas… a mi hermana y hermanos, así como los demás d emás integrantes integrantes de mi familia. Muchas gracias a todos

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Dedicatoria

Me gustaría dedicar esta Tesis a toda mi familia, ya que el esfuerzo y dedicación que he puesto en esta Tesis va con mucho cariño hacia ellos. Principalmente a mis padres, los más importantes y los verdaderos responsables de que hoy esté aquí, este es buen momento para dejar en claro mi más profundo agradecimiento a mi madre por los sacrificios y esfuerzos que realizó a lo largo de…… siempre, porque me ayudo a seguir adelante frente a cada una de las adversidades presentadas… presentadas… a mi hermana y hermanos, así como los demás d emás integrantes integrantes de mi familia. Muchas gracias a todos

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Agradecimiento s Quiero expresar mi más sincero agradecimient agradecimientoo a todas las personas que de distintas maneras han contribuido contribuido a que culmine esta tesis de licenciatura. licenciatura. Agradezco especialmente a mi director de Tesis el Biólogo S. Augusto Hernández Rivera por el apoyo brindado y por la confianza depositada. depositada. Agradezco de forma especial también, a mi comité revisor; a la Dra. Beatriz Palmeros Sánchez por la ayuda y apoyo brindado a los largo del desarrollo y conclusión de mi trabajo, así como a la Dra. Ma. Carmen Ramírez por cada una de las sugerencias valiosas, valiosas, que fueron de gran ayuda. Al laboratorio de Toxicología Ambiental especialmente a la Dra. Ma. del Socorro por permitir utilizar su equipo. También me gustaría agradecer a la maestra Guille por todos los consejos recibidos durante mi estancia en la Facultad y por todo su apoyo brindado. A mis amigas a las cuales agradezco su motivación y optimismo en momentos críticos y por su sincera amistad. Y una vez más agradezco agradezco a mi Familia.

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ÍNDICE Índice de tablas Índice de figuras Índice de anexos Indice de Abreviaturas Resumen I.-Introducción II.- Antecedentes: 2.1.- Organismos productores de polímeros biológicos 2.2.-Material de almacenaje 2.3.-Estructura Química y Tipos de PHAs 2.4.- Propiedades fisicoquímicas y características de los PHAs 2.5.- Tipos de PHAs más importantes 2.6.- Organismos productores de PHAs 2.7.-Biosíntesis de Poli-β-hidroxialcanoatos 2.7.1.- Descripción de las enzimas que intervienen en la biosíntesis de PHAs 2.7.2.- Biosíntesis de PHAs-ssc 2.7.3.- Biosíntesis de PHAs-msc 2.7.4.-Formación de PHAs-msc por Pseudomonas a partir de ácidos grasos 2.7.5.- PHAs-msc formados a partir de carbohidratos 2.8.- Características de los gránulos 2.8.1.- Modelos para la formación del gránulo de PHAs 2.8.2.- Formación in vivo de partículas de poliésteres 2.9.- Degradación de los PHAs 2.10.- Biodegradabilidad 2.11.- Sobrevivencia de bacterias productoras de PHAs 2.12.- Aplicación de los Poli- β-hidroxialcanoatos 2.13.- Sustratos y costos III.-Justificación IV.-Objetivo V.-Material y Métodos 5.1.- Obtención de muestras 5.2.- Procesamiento de muestras de tejido vegetal 5.3.- Procesamiento de muestras de suelo 5.4.- Obtención y Aislamiento de cultivos puros por método de siembra en placa

Pág. v vi ix x xiii 1 5 6 7 9 10 12 13 15 17 19 19 19 21 22 22 26 27 27 28 30 33 35 36 36 37 37

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5.5.-Producción de poli-β-hidroxialcanoatos (PHAs) 5.6.-Determinación cuantitativa de poli-β-hidroxialcanoatos (PHAs) 5.7.- Evaluación cualitativa de la acumulación de poli-β-hidroxialcanoatos (PHAs) 5.8.- Análisis de crecimiento celular 5.9.-Caracterización química y bioquímica de cepas bacterianas 5.10.-Caracterización química y bioquímica de Fermentadores 5.11.- Caracterización química y bioquímica para no fermentadores VI.-Resultados 6.1.- Aislamiento de cepas bacterianas 6.2.- Caracterización química y bioquímica de las cepas productoras de PHAs y cuantificación de PHAs 6.3.- Concentración de PHAs de las cepas aisladas de Saccharum officinarum 6.4.- Concentración de PHAs de las cepas aisladas de  Musa paradisiaca 6.5.- Concentración de PHAs de cepas aisladas del cultivo de Lycopersicum esculentum

6.6.- Concentración de PHAs de cepas aisladas del cultivo de Citrullus lanatus 6.7.- Curvas de crecimiento de cepas productoras de PHAs 6.8.- Evaluación cualitativa de la acumulación de poli-β-hidroxialcanoatos (PHAs) VII.- Discusión VIII.- Conclusiones IX.- Anexos X.- Referencias Bibliográficas

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39 40 41 41 43 43 47 51 50 53 57 58 59 5.9 60 70 72 76 78 84

Índice de tablas

Tabla 1. Principales características del polihidroxibutirato, polihidroxialcanoato y el propileno (Tomada de Carminatti et al., 2006) Tabla. 2. Tiempo que tardan los PHAs en degradarse en diferentes ambientes (Tomada de Luzier, 1992) Tabla 3. Componentes del MSM suplementado con sacarosa Tabla 4. Solución de microelementos Tabla 5. Componentes del medio de cultivo para la producción de PHAs

Pag. 9 27 38 38 39

Tabla 11. Número de cepas bacterianas seleccionadas de cada cultivo

51

Tabla 12. Las 20 cepas seleccionadas de los cultivos, elegidas por sus valores óptimos en cuanto a la lectura en el espectrofotómetro UV/VIS a 214 nm Tabla 13. Cepas bacterianas identificadas como productoras de PHAs

51 54

Tabla 14. Concentración de PHAs de cepas bacterianas aisladas de Saccharum officinarum

Tabla 15. Concentración de PHAs de cepas

bacterianas aisladas de Musa paradisiaca

Tabla 16. Concentración de PHAs de las cepas bacterianas aisladas de  Lycopersicum

57 58

esculentum

Tabla 17. Concentración de PHAs de cepas bacterianas aisladas del cultivo de Citrullus

59

lanatus

Tabla 18. Cepas con mayor producción de PHAs de cada cultivo Tabla 19. Cepas seleccionadas como mejores productoras, analizando su producción y curva de crecimiento

60 69 69

v

Índice de figuras Pag. Fig. 1. Estructura química general de los PHAs, generalmente están compuestos de (R )- βácidos grasos hidroxi, donde el grupo R puede variar desde metil hasta un tridecil

7

Fig. 2. Polihidroxialcanoatos más conocidos (Tomada de Segura et al., 2007)

8

Fig. 3. Micrografías de transmisión electrónica de gránulos de PHB. A y B, producidos por (Cetin et al., 2006); C, PHB producidos por W. eutropha (Tomada de Tian

 R. esphaeroides et al., 2005)

Fig. 4. Proteínas requeridas para la homeostasis de PHA (Tomada de Stubbe y Tian 2003)

11 13

Fig. 5. Biosíntesis y degradación de PHB. En condiciones de exceso de energía, el NADH inhibe la despolimerización de PHB y el ciclo de los ácidos tricarboxilicos (TCA). La disminución de la concentración de CoA-SH aumenta la inhibición de la acetil-Coaciltransferasa que cataliza la condensación del a cetil-CoA en acetoacetil-CoA y la síntesis de PHB. En deficiencia de energía, el control actúa en el otro sentido. Los signos (+) y (-) corresponden a una regulación positiva o negativa (Tomada de Cabello, 2007)

18

Fig. 6. Ruta biosintetica para PHAs-msc a partir de hidratos de carbono. Esta vía está ligada a la biosíntesis de los ácidos grasos, puesto que la biosíntesis de estos procede de la vía (R)3-hidroxiacil-ACP. El (R)-3-hydroxyacyl-ACP es convertido (R)-3-hidroxiacil-CoA por un acil-ACP:CoA transacilasa codificado por el gene  phaG (Tomada de Madison y Huisman, 1999)

21

Fig. 7. Modelo Micela, la formación de gránulo PHB, las esferas coloreadas mostradas sobre PHB amorfo representan las proteínas que están asociadas a la superficie del gránulo. Esferas grises PhaC; esferas azules PhaP; esferas rojas PhaR esferas verdes, PhaZ1a, esfera púrpura, PhaZ1b, esfera de naranja, PhaZ1c. (Tomada de Tian et al., 2005)

24

Fig. 8. Modelo “Budding”, donde se puede observar la formación del gránulo (Tomada de Tian et al., 2005)

25

Fig. 9. Degradación de P (3HB-3HV) en aguas residuales bajo condiciones aeróbicas. Las botellas hechas de P (3HB-3HV) fueron incubadas durante el verano (temperatura promedio de 20°C). El progreso de degradación es demostrado con las botellas que han sido sujetas a este tratamiento para 0, 2, 4, 6, 8, y 10 semanas (de la izquierda a la derecha) (Tomada de Madison y Hiusman, 1999)

27

Fig. 10. Productos elaborados utilizando los polihidroxialcanoatos como materia prima (Tomada de Segura et al., 2007)

29

Fig. 11. La gráfica muestra el número de aislados bacterianos de los diferentes cultivos de donde se obtuvieron las cepas bacterianas

50

Fig. 12. Distribución porcentual de cepas bacterianas aisladas de los cultivos de  Musa

50

vi

 paradisiaca, Saccharum officinarum,  Lycopersicon esculentum, Citrullus lanatus y  Nicotina tacabum L

Fig. 13. Porcentaje de aislamiento de cepas bacterianas de cada cultivo

53

Fig. 15. Pruebas básicas realizadas a las cepas bacterianas; a) Prueba de movilidad, b) prueba de catalasa, c) prueba de oxidasa

55

Fig. 16. a) Prueba de Indol, el primer tubo es un reacción negativa, fue observado en todas las cepas caracterizadas, el segundo tubo reacción positiva característica de E. coli que fue seleccionado como control positivo b) Prueba RM el primer tubo muestra una reacción positiva característico de algunos organismos fermentadores, el segundo tubo es reacción negativa característica de organismos no fermentadores c) Prueba VP, en el primer tubo reacción positiva, la reacción negativa se puede apreciar en el segundo tubo característico de organismos no fermentadores

55

Fig. 17. Es un tubo de TSI, donde se puede observar claramente la producción de H 2S; una característica fundamental para identificar a Shewanella putrefaciens, además se observa la reacción Alc/Alc característico de un organismo no fermentador a 24 h de incubación a 35°C

56

Fig. 18. a) Placa de Miuller-Hington, se puede apreciar el pigmento piocianina producido por P. aeuroginosa; b) Placa de Agar sangre, se observa la pigmentación amarilla de las colonias pertenecientes a P. cepacia; c) Prueba de acides de hidratos de carbono y alcoholes de P. cepacia

56

Fig. 19. Curva de crecimiento de E. gergoviae (IIBUV-ECP61) aislada de Citrullus lanatus

61

Fig. 20. Curva de crecimiento de  E. hormaechei (IIBUV-ECP60), aislada del cultivo de Citrullus lanatus

Fig. 21. Curva de crecimiento de la cepa identificada como Citrobacter spp. (IIBUVEMP54), aislada del cultivo de  Musa paradisiaca

61 62

Fig. 22. Curva de crecimiento de E. aerogenes (IIBUV-EMP57) aislada del cultivo de  Musa  paradisiaca

62

Fig. 23. Curva de crecimiento de P. pseudomallei (IIBUV-ELP25), aislada del cultivo de  Lycopersicum esculentum

Fig. 24. Curva de Crecimiento de  E. hormaechei (IIBUV-ELP27), aislada de L. esculentum

63 64

Fig. 25. Curva de crecimiento de Pseudomona aeruginosa (IIBUV-ESP5), aislada de Saccharum officinarum , además podemos observar las concentraciones de PHAs obtenidas a las 24, 48 y 72 horas

Figura 26.-  Curva de crecimiento de  E. spp . (IIBUV-ESP6) aislada del cultivo de

64 Saccharum

officinarum

Fig. 27. Curva de crecimiento de  E. hormaechei  (IIBUV-ESP3) aislada del cultivo de Saccharum officinarum

65 65

vii

Fig. 28. Curva de crecimiento de la cepa S. putrefaciens (IIBUV-ESP1), aislada del cultivo de S. officinarum

66

Fig. 29. Curva de crecimiento de la cepa identificada como P. cepacia (IIBUV-EMP 28) aislada de Musa paradisiaca

67

Fig. 30 Curva de crecimiento de  Alcaligenes spp. (IIBUV-EMP53), aislada del cultivo de Musa paradisiaca

67

Fig. 31. Curva de crecimiento de la cepa bacteriana identificada como P. pseudomallei (IIBUV-ESP2), aislada del cultivo de Saccharum officinarum

68

Fig. 32. Curva de crecimiento de la cepa  A. latus (IIBUV-EMP30), aislada del cultivo de  Musa paradisiaca

68

Fig. 33. Tinción lipofilica con Sudán negro. Se observan gránulos PHA a un aumento de 100X, en la cepa bacteriana P. cepacia en un cultivo de 24 hrs

70

Fig. 34. Tinción lipofilica con Sudán negro, se observan gránulos PHA a un aumento de 100 x, en la cepa bacteriana Enterobacter hormaechei en un cultivo de 72 hrs

71

viii

Índice de anexos

Tabla 6. Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotómetro UV/VIS a 214nm de las 15 cepas bacterianas aisladas Saccharum officinarum, las 6 cepas que obtuvieron las mayores lecturas fueron seleccionas (sombreadas) para su determinación cuantitativa y cualitativa en cuanto a producción de PHAs, así como su caracterización química y bioquímica

Pag

78

Tabla 7. Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotómetro UV/VIS a 214nm de las 12 cepas bacterianas aisladas  Lycopersicum esculentum, las 2 cepas que obtuvieron las mayores lecturas fueron seleccionas (sombreadas) para la determinación cuantitativa y cualitativa de PHAs, así como su caracterización química y bioquímica

79

Tabla 8. Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotómetro UV/VIS a 214nm de las 30 cepas bacterianas aisladas  Musa paradisiaca, las 8 cepas que obtuvieron las mayores lecturas fueron seleccionas (sombredas) para determinar cuantitativa y cualitativa la producción de PHAs, así como su caracterización química y bioquímica

79

Tabla 9. Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotómetro UV/VIS a 214nm de las 11 cepas bacterianas aisladas Citrullus lanatus, las 3 cepas que obtuvieron las mayores lecturas fueron seleccionas (sombreadas) para la determinación cuantitativa y cualitativa de PHAs, así como su caracterización química y bioquímica

81

Tabla 10. Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotómetro UV/VIS a 214nm de las 2 cepas bacterianas aisladas  N. tabacum, las 2 cepas aisladas de este cultivo presentaron valores muy bajos por lo cual no se seleccionaron para determinar cuantitativa y cualitativamente a PHAs, así como su caracterización química y bioquímica

82

Tabla 20.-Cepas bacterianas no seleccionadas debidoa su baja concentracin de PHAs, además de que su cinetica de crecimiento mostró que concentraciones relativamente mayores de PHAs fue hasta las 72 h por lo cual no es factible. Fig. 14. a. Tubos Eppendorf con muestra de la de la cepa  E. hormaechei, aislada de S. officinarum  utilizados para la lectura en el espectrofotómetro UV/VIS a 214nm, por el método espectrofotométrico de Law y Slepecky (1961) modificado por Martínez et al., 2004

82

Figura 14.b.Tubos Eppendorf con muestra de la de la cepa IIBUV-EMP 31  aislada de M. seleccionada), utilizados para la lectura en el espectrofotómetro UV/VIS A 214 nm, por el método espectrofotométrico de Law y Slepecky (1961) modificado por Martínez et al., 2004

 paradisiaca ( no

82

ix

Abreviaturas

x

AMC

Acetil-metilcarbinol

 B. megaterium

 Bacillus megaterium

C/N

Relación carbono- nitrógeno

CO2

Dióxido de carbono

C-3

Tercer átomo de carbono

C1

Metil

C13

Tridecil

Da

Daltons

EDP

Ruta metabólica de Entner- Doudoroff

EDTA

Ácido-etilen-diamino-tetra-acético

Fig.

Figura

h

Hora

H2O

Agua

H2O2

Peróxido de hidrogeno

H2S

Ácido sulfurico

ICI

Industrias Química Imperial

KCN

Cianuro de Potasio

kDa

Kilodalton

Kg

Kilogramo

Kg/km2

Kilogramo/kilometro cuadrado

ml.

mililitro

MSM

Medio de sales minerales

Mw

Peso molecular

NADH

Nicotinamida adenín dinucleótido reducida

NAD+

Nicotinamida adenina dinucleótido oxidada

NH4

Amonio

nm

Nanómetro

mM

milimolar

O2

Oxígeno molecular

pH

Potencial de hidrógeno

PhaC

Sintasa

PhaP

Fasinas

CoA

Coenzima A

PHAs

Poli-β-hidroxialcanoatos

PHAsSCL

Polihidroxialcanoatos de cadena de longitud corta

PHAsMCL

Polihidroxialcanoatos de cadena de longitud media

Pha P

Fasina

PhaC

Sintasa

Pha Z

Depolimerasa

PHB ó P (3HB)

Poli- β-hidroxibutirato ó poli-3-hidroxibutirato

PHV

Polihidroxivalerato

PHB-V

Poli(hidroxibutirato-co-valerato)

P(HHX-co-HO)

Poli-β-hidroxihexanoato-co-octanoato

PHO

Poli-β-hidroxioctonoato

R

Radical

 R. eutropha

 Ralstonia eutropha

RM

Prueba de Rojo de Metilo

rpm

Revoluciones por minuto

spp.

Especie

TCA

Ciclo de los ácidos tricarboxilicos ó Ciclo de Krebs

(Tg)

Temperatura de transmisión vítrea

TSA

Agar de Soya y Tripticaseina

TSI

Agar Triple azúcar y hierro

TTC

2,3,5-cloruro de trifeniltetrazolio

UV

Ultravioleta

VP

Prueba de Vogues-Proskauer

Zn

Zinc

µg

Microgramo

xi

xii

µl

Microlitro

µm

Micrometro

°C

Grados centígrados

3HO

3-hydroxioctonoato

3HD

3-hidroxidecanoato

Resumen

Actualmente, varios estudios han demostrado la producción de polihidroxialcanoatos (PHAs) por una variedad amplia de procariotas, así como también por varias plantas y animales. Sin embargo, sólo los microorganismos acumulan PHAs de peso molecular alto; la capacidad de acumular PHAs favorece su establecimiento y sobrevivencia bajo condiciones de estrés. Estos polímeros son considerados como buenos candidatos para remplazar a los plásticos obtenidos a partir de hidrocarburos. Las investigaciones más recientes en esta área centran su atención hacia dos objetivos: la optimización de los parámetros de cultivo de organismos productores de PHAs, y la selección de linajes bacterianos con la capacidad de producir altas concentraciones de PHAs. En este trabajo a partir de muestras de cultivos de  Musa paradisiaca, Saccharum officinarum, Lycopersicum esculentum, Citrullus lanatus y  Nicotina tabacum se

aisló un total de 70 cepas bacterianas, las

cuales fueron caracterizadas para la producción de PHAs mediante el método espectrofotométrico reportado por Law y Slepecky (1961) y modificado por Martínez et al., (2004). Concluida la primera etapa, se seleccionaron 20 cepas bacterianas que presentaron concentraciones óptimas de PHAs, las cuales fueron caracterizadas por tinción de Gram y análisis bioquímicos y se les realizo la prueba de Tinción Lipofílica con Sudán Negro. Los análisis bioquímicos de las cepas bacterianas productoras de PHAs permitieron establecer que estos aislados pertenecen a los géneros de Pseudomonas, Citrobacter, Enterobacter  y Alcaligenes. Además de la identificación de los aislados bacterianos, se determinó su cinética de crecimiento y el análisis de las curvas de crecimiento permitió establecer que cepas producían PHAs en menor tiempo. Al final de este estudio se concluyo que el 10% de las 70 cepas bactaerianas aisladas de los cultivos presentan concentraciones elevadas de PHAs.

xiii

I.- I n t r o d u c c i ó n. La basura generada por las actividades humanas hasta mediados del siglo XX consistía principalmente de desechos biodegradables o reciclables (Frías et al., 2003). Los polímeros sintéticos se han hecho significativos desde los 40’s, y desde entonces han ido substituyendo al cristal, la madera y otros materiales de construcción, y aún a metales en muchos usos industriales, domésticos y ambientales (Caín, 1992; Poirier et al., 1995). Al incorporarse el plástico a la vida cotidiana e ir aumentando su utilización en diferentes áreas, una parte considerable de los desechos producidos comenzó a acumularse en el ambiente, debido a la resistencia de estos materiales a la corrosión, a la intemperie (Segura et al., 2007) y por el carácter recalcitrante a la degradación de la mayoría de los polímeros sintéticos (Lasala et al., 2004a). Además, el crecimiento exponencial de la población humana ha llevado a la acumulación de enormes cantidades de material de desecho no degradables en nuestro planeta, y trayendo como consecuencia que las condiciones de vida en la biosfera estén cambiando drásticamente (Arshad et al., 2007; Zinn et al., 2001).

En el pasado inmediato, era importante descubrir materiales cada vez más durables para su uso diario; entre estos están los plásticos debido a que por sus propiedades son utilizados en una gran cantidad de aplicaciones, además de que su costo es bajo. Por lo anterior, el uso de los plásticos sigue en aumento en todo el mundo (más de 100 millones de toneladas/año de plásticos producidos). El aumento en su consumo no solo se debe a sus propiedades mecánicas y térmicas favorables, sino principalmente a la estabilidad y durabilidad de los mismos (Rivard et al., 1995). En consecuencia, el uso indiscriminado de estos materiales tiene como consecuencia que una grande cantidad de residuos de plástico sean descartados al medio ambiente, aproximadamente el 20% del volumen total. Actualmente, en promedio el consumo de plásticos  per capita  en el mundo es de 19kg, pero estos valores se modifican si se toman en cuenta determinadas regiones, así en EUA es de 80kg, en Europa de 60 kg y en India de 2 kg (Franchetti y Marconato, 2006). A causa de su persistencia en nuestro ambiente, los ecosistemas son ahora más sensibles al impacto de plástico desechado sobre el ambiente, incluyendo efectos deletéreos sobre la fauna y sobre las calidades estéticas de ciudades y bosques (Frías et al., 2003).

1

La degradación de los plásticos sintéticos es muy lenta, por ejemplo, la descomposición de productos orgánicos tarda 3 ó 4 semanas, la de las telas de algodón 5 meses, mientras que la del plástico puede tardar hasta 500 años o más dependiendo de su tipo. Además, en buena medida la “degradación” de estos plásticos simplemente genera partículas más pequeñas que, a pesar de ya no ser evidentes, se acumulan en los ecosistemas; al respecto, recientemente se han realizado estudios sobre la presencia de “microplásticos” o fragmentos de plástico de tamaño inferior a 5 milímetros, y han demostrando que éstos se están acumulando de forma considerable en los mares, en la arena de las playas y estuarios. Los más abundantes son los microfragmentos de acrílico, polipropileno, polietileno, poliamida (nylon), poliéster, polimetacrilato, etc. (Frías et al., 2003); la presencia de estos polímeros en los mares es variable, pero hay reportes de que su abundancia va de 3 a 5 kg/km 2 hasta 30 kg/km 2, lo que sí es seguro es que esa cantidad aumenta considerablemente cada año. En el norte del océano Pacífico se ha determinado que la cantidad de microplásticos se ha triplicado en la última década, y cerca de la costa de Japón la cantidad se multiplica por diez cada 2 o 3 años. Se calcula que cientos de miles de las muertes de mamíferos marinos al año se deben a esta causa; también se determinó que 82 de 144 especies en aves estudiadas contenían fragmentos de plástico en sus estómagos, y en algunas de estas especies hasta el 80% de los individuos de una población los presentan (Frías et al., 2003). Además, se ha demostrado que los plásticos acumulan compuestos químicos tóxicos como los bifenilos policlorados, el diclorodifenil dicloroeteno y los nonifenoles, que no son muy solubles en agua y por lo tanto se adhieren y acumulan en los plásticos. Así, los fragmentos de plástico funcionan como transportadores de contaminantes a los mares y otros cuerpos de agua (Frías et al., 2003). En la actualidad, y dado a que la acumulación de plásticos se ha incrementado de manera alarmante en los últimos años, se están implementando medidas dirigidas a enfrentar esta problemática. Una de las estrategias que se ha utilizando para deshacerse de los plásticos derivados del petróleo es la incineración, pero la quema de estos materiales es altamente contaminante y causa efectos negativos en el ambiente, tales como el incremento de CO 2 en la atmósfera y la liberación de compuestos químicos muy peligrosos, como las dioxinas, el cloruro y el cianuro de hidrógeno. Otra estrategia es reciclar, en lo posible, la mayor variedad y cantidad de plásticos, algunos de los principales inconvenientes de esta alternativa son que para su 2

reciclaje los plásticos deben ser manejados adecuadamente, no sólo en su recolección y procesamiento, sino en la limpieza, selección y separación adecuada de los diferentes materiales a reciclar, lo cual en la mayoría de los casos no sucede. Aunado a lo anterior, los artículos plásticos no se pueden reciclar indefinidamente, sólo se pueden reciclar tantas veces como lo permitan las condiciones físicas y químicas en las que queda el material después de su procesamiento. En México se estima que del total de los plásticos que son desechados, únicamente se colecta el 12% (Segura et al., 2007). En países como México y algunos otros de América Latina el reciclado de plásticos aún se encuentra en su primera etapa, pero en países como Alemania, Japón y Estados Unidos de América se han desarrollado programas de recolección de residuos que han tenido éxito después de varios años (Frías et al; 2003). De acuerdo con el Instituto Nacional de Recicladores, A.C. (INARE), uno de los mayores problemas a los que se enfrenta nuestro país en materia ambiental, es el consumo de plástico; (Frías et al; 2003). La contaminación ambiental por los plásticos sintéticos es un problema con repercusión mundial muy grande, como una solución adecuada a estos problemas se plantea la sustitución de estos materiales, que además de ser de naturaleza química se obtienen por procesos industriales altamente contaminantes, por polímeros de tipo natural (Carballo et al.,  2003). Actualmente los polímeros naturales más utilizados son las mezclas de almidón, como los ácidos polilácticos y los polihidroxialcanoatos (PHAs). El potencial que presentan los PHAs se debe a que son poliésteres de origen natural, producidos por bacterias, y por lo tanto son biodegradables (Lasala et al., 2004a); se caracterizan por ser compuestos biocompatibles, con propiedades físicas similares a los termoplásticos sintéticos y a los elastómeros actualmente en uso, como el polipropileno y el caucho sintético (Rojas et al.,  2006).  Los PHAs en una gran variedad de especies bacterianas constituyen materiales de reserva no nitrogenados (Carballo et al., 2003). La degradación de estos biopolímeros, en primera instancia se lleva a cabo por acción de microorganismos tales como hongos, bacterias y algas, generando bióxido de carbono (CO 2), concentraciones no significativas de gas metano, diferentes componentes celulares y otros productos, según lo establecido por la “American Standard for Testing and Methods” (ASTM-D833). De forma similar, estos materiales se degradan en CO 2, H2Oy biomasa como resultado de la acción de organismos vivos, como se acaba de mencionar, o de sus enzimas (Franchetti y Marconato, 2006). La producción de polímeros no contaminantes al medio ambiente 3

(biopolímeros), se ha impulsado de forma significativa en ciertos países desarrollados mediante la aprobación de leyes que obligan a que se reemplace cierta cantidad de materiales construidos a partir de polietileno y poliestireno, por plásticos degradables (Lasala et al., 2004a).

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II.- A n t e c e d e n t e s

2.1.- Organismos productores de polímeros biológicos. Los procariotas han desarrollado numerosos mecanismos de resistencia bajo condiciones de estrés. Por ejemplo, muchos microorganismos en su ciclo biológico tienen la capacidad inherente de permanecer en etapas de “reposo” (cistos o esporas) que les permiten sobrevivir en ambientes desfavorables para llevar a cabo su ciclo de vida, por lo general condiciones de falta de agua (disecados) o la falta de algún nutriente. Otros como la espiroqueta Spirosymplokos deltaiberi aumenta y forma cuerpos refráctales resistentes a la exposición al aire; alternativamente, otras bacterias exhiben una versatilidad metabólica amplia que les permite hacer frente a fluctuaciones químicas que se presentan en su ambiente. Por otro lado, en algunos otros casos la acumulación de polímeros almacenados intracelularmente es otra estrategia bacteriana que incrementa la supervivencia de muchos microorganismos en un ambiente cambiante (Berlanga et al., 2006). Consecuentemente, la necesidad de algunos organismos de adaptarse a fluctuaciones ambientales extremas da como resultado la producción y utilización de componentes sintetizados y almacenados dentro de los mismos organismos; esto, puede explicar la acumulación in situ de Poli-β-hidroxialcanoatos (PHAs) en muchos organismos presentes en diferentes ambientes (Berlanga et al., 2006; Navarrete et al., 2000). Los PHAs en los microorganismos sirven como una fuente endógena de carbono y energía durante etapas de inanición-hambre (Berlanga et al., 2006). Varios estudios han demostrado la producción de PHAs por una variedad amplia de procariotas, así como también por varias plantas y animales. Sin embargo, solo los procariotas acumulan PHAs de peso molecular alto en gránulos citoplasmáticos; además, las bacterias que producen PHAs tienen la ventaja de almacenar nutrientes a un costo de mantenimiento relativamente bajo y con la seguridad de obtener el aporte de energía cuando sea necesario (Berlanga et al., 2006). Rrecientemente, la explotación comercial de estos poliésteres biodegradables se ha convertido en un área sumamente interesante (Moreno et al., 2007; Page et al., 1992).

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2.2.-Material de almacenaje Los poli -β-hidroxialcanoatos (PHAs) representan una de las ocho clases de biopolímeros que son producidos y acumulados en una gran variedad de bacterias y archae (Ewering et al., 2002); los microorganismos que capaces de acumular PHAs, normalmente son bacterias de tipo Gramnegativas y Gram-positivas que se encuentran en diferentes ecosistemas, como: agua de mar, suelo, efluentes, etc. (Carminatti et al., 2006). Estos biopolímeros son almacenados intracelularmente en gran cantidad por una gran variedad de microorganismos sin afectar la presión osmótica de las células (Carminatti et al., 2006), ya sea como material de reserva de energía y de carbono o como equivalentes de reducción (Aldor y Keasling, 2003; Choi y Lee, 1999; Quagliano y Miyasaki, 1997; Moreno et al., 2007; Rojas et al.,

2006; Steinbüchel y Füchtenbusch, 1998). Los PHAs al ser depositados intracelularmente en

formas de cuerpos de inclusión, pueden llegar a representar más del 90% del peso seco celular (De Almeida et al., 2004). La síntesis de estos biopolímeros se induce cuando se presentan condiciones de crecimiento no balanceado durante el ciclo de crecimiento de algunos organismos, las cuales son principalmente ocasionadas por la ausencia de algún o algunos nutrientes en el medio, como por ejemplo nitrógeno, fosforo o magnesio, y por un exceso en la fuente de carbono principal (Aldor y Keasling, 2003; Choi y Lee ,1999; Quagliano y Miyasaki, 1997; Moreno et al., 2007; Rojas et al.,

2006; Steinbüchel y Füchtenbusch, 1998). La síntesis de estos compuestos, generalmente

involucra reacciones catalizadas por enzimas o reacciones de crecimiento de la cadena del polímero a partir de monómeros activados que son formados dentro de las células por procesos metabólicos complejos (Franchetti y Marconato, 2006). Cuando la fuente de carbono externa se agota o si el nutriente limitante se suministra nuevamente, el PHA es depolimerizado y posteriormente metabolizado como fuente de carbono y energía (Park et al., 2001). La degradación de PHAs cumple un papel muy importante en la supervivencia bacteriana y en los mecanismos de resistencia al estrés, en condiciones de baja concentración de nutrientes, la utilización de dicho polímero se considera una estrategia desarrollada por las bacterias para incrementar su supervivencia en ambientes cambiantes y adversos (De Almeida et al., 2004).

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2.3.- Estructura Química y Tipos de PHAs. Los PHAs, primariamente, son moléculas lineales largas formadas por monómeros de un ácido graso 3-hidroxilo unidos entre si por enlaces ésteres (Madison y Huisman, 1999). Así, los PHAs son poliésteres de ácidos 3-hidroxi-alcanoicos formados por la policondensación del grupo carboxilo de un primer monómero con el grupo hidroxilo ubicado en el carbono β de un segundo monómero (Rojas et al., 2006). La mayoría de estos monómeros poseen el grupo hidroxilo en la posición 3 (C3) ó carbono β, aunque en algunos PHAs este grupo sustituido fue encontrado en las posiciones 4, 5 ó 6 (Carminatti et al., 2006). El átomo de carbono del hidroxilo sustituido es de configuración R, excepto en algunos casos especiales donde no hay quilaridad; Además, en este carbono está posicionado un grupo alquilo, el cual puede variar desde un metil (C1) hasta un tridecil (C13) (figura 1) (Madison y Huisman, 1999). La cadena principal de los PHAs presenta centros quirales con un radical R, así si este radical es un metilo (CH 3-) se forma el polihiroxibutirato (PHB), si es un etilo (C 2H5-) se trata del polihidroxivalerato (PHV), etc. (Hermida y Díaz, 2004). La quilaridad del carbono β de la cadena lineal de estos poliésteres permite que presenten actividad óptica y que se comporten de forma isotáctica (Moreno et al., 2006).

Figura 1. Estructura química general de los PHAs, generalmente están compuestos de (R )-β-ácidos grasos hidroxi, donde el grupo R puede variar desde metil hasta un tridecil.

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Basándose en el número de átomos de carbonos y las unidades monoméricas, los PHAs se pueden dividir en dos grupos: 1. PHAs de cadena corta (HAs SCL – del inglés HydroxiAcids of Short-Chain-Lenght) que contienen de tres a cinco átomos de carbono en su cadena principal. 2. PHAs de cadena media (Has MCL – del inglés HydroxiAcids of Medium-Chain-Lenght), que comprenden de seis a dieciséis átomos de carbono en su cadena principal (Ojumu et al., 2003).

A la fecha, se han identificado alrededor de 130 tipos diferentes de PHAs (Niamsiri et al., 2004; Sheu et al., 2000). Los PHAs más conocidos son el PHB, PHV, y el polihidroxibutiratocovalerato (PHB-V) (Franchetti y Marconato, 2006) y el poli- β-hidroxihexanoato-co-octanoato (PHHX-co-HO) (Moreno et al., 2006), ver figura 2.

Figura 2. Polihidroxialcanoatos más conocidos (Segura et al., 2007).

2.4.- Propiedades fisicoquímicas y características de los PHAs Debido a que los PHAs son polímeros alifáticos, dependiendo de la composición del polímero y del tamaño de los grupos alquilos ramificados, muestran una gran variedad de propiedades desde comportarse como materiales rígidos y quebradizos a plásticos con propiedades de impacto como

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elastómeros resistentes. Debido a las diversas propiedades que presentan, en años recientes los PHAs han atraído la atención, no solo porque poseen propiedades similares a los plásticos convencionales sino porque son completamente biodegradables (Tabla 1).

Tabla 1: Principales características de los polímeros polihidroxibutirato P(3HB), polihidroxioctanoato (PHO) y el propileno (PP). (Carminatti et al., 2006).

Las propiedades físicas y mecánicas de estos materiales dependen de su composición monómérica, peso molecular y la distribución del peso molecular del polímero, siendo las dos últimas características las más importantes para su comercialización adecuada. El peso molecular de estos polímeros, varía de 2x10 5  a 6x10 3 Dalton (Da), y en consecuencia sus características físicas dependen de los microorganismos que los producen, de las condiciones de crecimiento, de la posición del radical R o del grupo hidroxilo (n), así como del grado de polimerización. Dentro de las propiedades termoplásticas destacan: el elevado punto de fusión, baja rigidez, resistencia alta a la presión, además de propiedades como la temperatura de transición vítrea (T g), cristalinidad y tiempo de cristalización. Los polímeros de cadena de longitud media, PHAs MCL, difieren de los de cadena de longitud corta, PHAs SCL, posen menor nivel de cristalinidad y son más elásticos (Carminatti et al., 2006). En la década de los 60’s se descubrieron las propiedades termoplásticas de estos materiales por lo que el interés sobre el plástico biodegradable aumento, y así se produjo a nivel comercial P(3HB) por la empresa W.R. Grace Co. Durante la época de los 70’s se presentó la primera crisis del petróleo y la British Chemical Giant e Industrias Química Imperial (ICI) iniciaron la 9

investigación formal de las propiedades del polímero presente en las bacterias para poder moldearlo (Katircioglu et al., 2003). A partir de 1974, se descubrieron otros hidroxialcanoatos y en 1976 la empresa ICI inició el desarrollo de metodologías para la producción y aplicación de P(3HB); esta misma empresa producía PHAs con el nombre comercial de Biopol®. En Alemania, en 1990, fue lanzado al mercado un embase de “shampoo” fabricado a partir de plásticos biodegradables; en 1991 en se iniciaron las investigaciones para producir P(3HB) a partir de procesos fermentativos (Carminatti et al., 2006). La gran mayoría de los microbios sintetizan PHAs-ssc conteniendo primariamente unidades de 3HB o PHAs-msc conteniendo 3-hydroxioctonoato (3HO) y 3-hidroxidecanoato (3HD) (Madison y Huisman, 1999).

2.5.- Tipos de PHAs más importantes En 1926 en el Instituto Pasteur, el microbiólogo Maurice Lemoigne obtuvo por vez primera a partir de Bacillus megaterium un compuesto determinado como PHAs. Fue el primer polímero de este tipo que se aisló y se le denominó ácido 3-hidroxibutirico (P[3HB]); en 1958, Macre y Wilkinson estudiando  Bacillus megaterium  verificaron que este microorganismo almacena este homopolimero, y concluyeron que el P(3HB) era una fuente de reserva de carbono y energía (Katircioglu et al., 2003). El poli-β-hidroxibutirato (PHB) es uno de los PHAs más abundantes, y es el que se ha estudiado más extensamente (Berlanga et al., 2006; Cetin et al., 2006; Floccari et al., 1995). Es un poliéster de almacenaje que se produce como cuerpo de inclusión insoluble en el citoplasma. Las inclusiones de PHB aparecen como cuerpos transparentes y refringentes al observar y explorar por medio de microscopia de transmisión electrónica secciones delgadas de bacterias conteniendo PHB, ver figura 3 (Cetin et al., 2006). Reusch y Sadoff (1983) demostraron que el PHB es una molécula importante en el citoplasma y la pared celular (Katircioglu et al., 2003); puede ser sintetizado por muchas bacterias a partir de diferentes fuentes de carbono (Haywood et al., 1990).

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B

A

C

Figura 3. Micrografías de transmisión electrónica de gránulos de PHB. A y B, producidos por R. esphaeroides esphaeroides (Cetin et al., 2006); C, gránulos producidos por W. eutropha  (Tian et al., 2005).

El homopolímero P(3HB) posee unidades monómericas con una configuración D(-) debido a la esteroespecificidad de las enzimas involucradas en su síntesis (Moreno et al., 2007); es un polímero

lineal

y

cristalino

acumulado

intracelularmente

por

muchas

especies

de

microorganismos en respuesta a un exceso de carbón y energía, y como un mecanismo de almacenaje (Ramsay et al., 1988), por lo que tiene un papel fisiológicamente importante. Desde el punto de vista aplicativo ha sido s ido valorado como un termoplástico termoplástico biodegradable biodegradable natural (Page et al., 1997). Dentro de la célula el P(3HB) existe en estado fluido y amorfo, pero después de

extraerlo de la célula con solventes solventes orgánicos es altamente cristalino, en este estado es tado es rígido por lo cual es un material quebradizo. Las propiedades físicas y químicas del PHB son similares a las del polipropileno, sin embargo, otros PHAs pueden tener subunidades de β -hidroxiácidos de cadena larga, ordenados de C 5 a C10. La adición de un porcentaje pequeño de subunidades laterales de cadena larga dentro del PHB causa un incremento en la flexibilidad de estos copolímero, marcando esta opción como un substituto substituto para p ara la mayoría de los termoplásticos termoplásticos (Page et al., 1992). Desafortunadamente, el proceamiento del homopolimero del PHB presenta dos inconvenientes: el primero de ellos es que la fusión se lleva a cabo a temperaturas suficientemente altas que

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provocan una disminución en su peso molecular volviéndolo frágil (Ramsay et al., 1988), lo cual limita el procesamiento del homopolímero (Galindo, 2007). Sin embargo, el PHB es un termoplástico que presenta muchas propiedades deseables, por ejemplo: se le pueden adicionar facilmente fibras de vidrio para incrementar su potencia. Además tiene la ventaja de ser ópticamente activo, por ejemplo contiene esteroisómeros idénticos como monómeros por lo que tiene propiedades piezoeléctricas; también, inmunológicamente es compatible con el tejido humano. Por otra parte, como el PHB es biodegradable es probable que permita que otros polímeros que generalmente no son considerados como biodegradables, adquieran parcialmente esta propiedad al ser mezclados con el PHB. Estudios realizados mostraron que algunas bacterias en ambientes naturales, como sedimentos estuarinos, pueden acumular copolímero de ácidos poli3-hidroxialcanoatos, este tipo de polímeros tienen una fusión baja y son más flexibles que el homopolimero PHB (Ramsay et al., 1988). Otros tipos de PHAs, como los PHAs-msc, se diferencian del P(3HB) por su nivel de cristalinidad bajo, y como además son más elásticos presentan un rango diferente de aplicaciones (Galindo, 2007), ejemplos de este tipo de PHAs son: poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) (PHBV), poliéster de origen bacteriano de creciente importancia por ser biodegradable y biocompatible, y aunque puede sustituir a polímeros petroquímicos aún no es económicamente competitivo (Hermida y Díaz, 2004). Otro PHAs importante es el poli- β-hidroxioctonoato (PHO), el cual se caracteriza por tener una temperatura de transición vítrea de -35°C por lo cual es un elastómero, amorfo y pegajoso a temperatura ambiente, lo cual si bien es cierto dificulta su procesamiento permite que pueda ser usado como látex, además es muy estable debido a que tiene una densidad muy cercana a la del agua. La temperatura de fusión reportada para los PHAsmcl está entre 39 y 61°C; el peso molecular depende de la fuente de carbono, el método de recuperación recuperación y la l a cepa empleada empleada (Moreno et al., 2006).

2.6.- Organismos productores de PHAs La acumulación de estos polímeros se ha reportado que se lleva a cabo en una larga lista de géneros (Quagliano y Miyasaki, 1997). Estos poliésteres son sintetizados por varios microorganismos, microorganismos, tales como  R. eutropha eutropha  (Carminatti et al., 2006), Alcaligenes  Alcaligenes latus (Page et al.,

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1997) , , bacterias del género  Azotobacter  Azotobacter (Lakshman y Ramachandriah, 2003), bacterias Metilotróficos Metilotróficos (Carminatti (Carminatti et al., 2006; Choi y Lee, 1999), Comamonas acidovorans y P. putida (Franchetti y Marconato, 2006), y P. oleovor o leovorans ans (Haywood et al., 1990), entre otras. Bacterias del género Pseudomonas   pueden producir PHAs de cadena media o larga a partir de substratos conteniendo alcanos o ácidos alcanoicos (Carminatti et al., 2006; Haywood et al., 1990). Algunas especies de Pseudomonas spp. pueden incorporar tanto monómeros de PHAs-ssc como PHAs-mss en la misma cadena polimérica, normalmente, estos PHAs se forman cuando estas cepas son cultivadas con una fuente de carbono no relacionada, como lo son los carbohidratos o 1,3-butaneidol; en este tipo de PHAs mezclados la acumulación de ellos es individual, es decir, hay gránulos compuestos de P(3HB) y gránulos compuestos de otro tipo de PHAs (Madison y Huisman,1999).

2.7.-Biosíntesis de Poli-β-hidroxialcanoatos La producción de PHAs competitivamente económicos y con propiedades nuevas ha sido la motivación para que muchos grupos de investigación estudien la síntesis, degradación y homeostasis de PHAs en microorganismos (Tian et al., 2005 ). La regulación de la producción producción de PHAs es considerablemente compleja, se lleva cabo en diferentes niveles fisiológicos a través de la inhibición de cofactores de las enzimas y la disponibilidad de metabolitos, a nivel genético a través de factores- σ  alternativos, sistemas reguladores de dos componentes, y moléculas de autoinducción (Fig. 4). Otro nivel de regulación relaciona el tamaño del gránulo y el control del peso molecular por medio de las polimerasas de PHA y las fasinas (Madison y Huisman, 1999).

Figura 4. Proteínas requeridas para la homeostasis de PHA (Stubbe y Tian 2 003).

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La mayoría de los PHAs sintetizados vía microbiana están constituidos por monómeros intermediarios de rutas bioquímicas establecidas, como el ciclo de biosíntesis o β-oxidación de ácidos grasos, el ciclo de los ácidos tricarboxilicos (TCA) o a través de la biosíntesis de aminoácidos polimerizados por una clase especial de enzimas llamadas polimerasas (Rojas et al., 2006). Las vías de biosíntesis y degradación de PHAs incluyen las enzimas clave de estos procesos, las PHA-sintasas (PhaCs síntesis de PHA), y PHA-depolimerasas (PhaZs degradación de PHA). Ambos grupos de enzimas han sido estudiadas por muchos grupos de investigación por cerca de tres décadas (Jendrossek et al., 2006), todos los microorganismos que sintetizan PHAs contienen un sistema de depolimerasa intracelular que consiste de un dímero de una PHAdepolimerasa y una hidrolasa (Stubbe y Tian, 2003). La síntesis de PHAs requiere de la PHA-sintasa (PhaC), la cual usa β-hidroxiacil-CoA como substrato para la polimerización; la producción de tales substratos puede ocurrir a través de varias rutas metabólicas incluyendo: la simple que utiliza la enzima β-cetiolasa (codificada por  phaA) y acetoacetil-CoA reductasa (codificada por  phaB), la β-oxidación, y una ruta de síntesis de ácidos grasos de novo (Sheu et al., 2000). En general, los mecanismos de iniciación, elongación y terminación de la cadena en la mayoría de los sistemas, aún no son comprendidos adecuadamente, y quedan muchas preguntas por contestar: ¿La función de las proteínas involucra la homeostasis del polímero?, ¿Cómo estos modulan la fase de transición y el flujo del unión monomerica?, ¿Interceptan fuera del metabolismo central bajo diferentes estados metabólicos? (Stubbe y Tian, 2003). A partir del acetil-CoA obtenido del catabolismo de carbohidrato, diversas bacterias sintetizan el homopolimero 3-hidroxibutirato (3HB) que incluye la acción de tres enzimas. Inicialmente, se condensan dos moléculas de acetil-CoA por acción de la 3-cetotiolasa, generando acetoacetilCoA que sufre una reducción para formar 3-hidroxibutiril-CoA que se une a la cadena polimérica en crecimiento (Floccari et al., 1995). La sintasa (PhaC) y fasina (PhaP) son proteínas que juegan un papel importante en la producción de PHB y la formación del gránulo (Stubbe y Tian, 2003) .

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2.7.1.- Descripción de las enzimas que intervienen en la biosíntesis de PHAs  PHA-Sintasa . Las PHA-sintasas son enzimas cruciales en todos las vías para la síntesis de PHAs,

estas sintasas se pueden clasificar bajo diferentes criterios, como son secuencia de aminoácidos y la especificidad por su substrato in vivo (Sheu et al., 2000). Los grupos principales son:

•

Clase I/Clase II. Estas sintasas de poliésteres comprenden enzimas que constan de un sólo tipo de subunidad (PhaC), con pesos moleculares (M W) entre 61 y 73 kDa (Qi y Rehm, 2001).

•

Clase III. Grupo de poliéster-sintasas que comprende las enzimas que consta de dos diferentes tipos de subunidades: la subunidad PhaC (Mw de alrededor de 40 kDa) que muestran una similitud a nivel de secuencia del 21-28% con las enzimas clase I y II; y por la subunidad PhaE (Mw de alrededor de 40 kDa) sin similitud con otras poliéster-sintasas.

•

Clase IV. Estos sintasas son similares a las enzimas que pertenecen a la clase III, pero la subunidad PhaE se sustituye por PhaR (Mw de aproximadamente 20 kDa) (McCool y Cannon, 2001).

 β -cetoacil-CoA tiolasa . La enzima β-cetoacil-CoA

tiolasa cataliza el primer paso en la formación

de P(3HB); esta tiolasa biosintetica (acetil-CoA: acetil-CoA-acetil transferasa) es miembro de una familia de enzimas que participan en la divison tiolitica de sustratos en acil-CoA más acetilCoA. Estas β-cetoacil-CoA tiolasas se encuentran representadas en toda la naturaleza, y están presentes desde eucariotas superiores hasta levaduras y procariotas. En base a su especificidad por el sustrato se dividen en dos grupos:

•

El primero agrupa a las tiolasas con una amplia especificidad de β-cetoacil-CoA que van desde cadenas de cuatro a dieciséis carbones (C4 a C16). Esta clase de enzimas están involucradas principalmente en la degradación de los ácidos grasos y se encuentra en el citoplasma de procariotas, en la mitocondria y en los peroxisomas de los mamíferos y las células de plantas.

15

•

El segundo grupo de β-cetoacil-CoA tiolasas se considera biosintético y tiene una especificidad estrecha por la longitud de la cadena, de C3 a C5.

En la naturaleza, estos tiolasas biosintéticas están especializadas en diversas funciones, entre las que se encuentran la formación de cetonas, esteroides, isoprenoides, síntesis y biosíntesis de P(3HB). La tiolasa que participan en la formación de P(3HB) principalmente es una tiolasa biosintetica con la especificidad de acetoacetil-CoA.

 Acetoacetil-CoA reductasa . 

La acetoacetil-CoA reductasa es una (R)-3-hidroxiacil-CoA

deshidrogenasa que cataliza el segundo paso en la vía biosintetica de P(3HB) mediante la conversión de acetoacetil-CoA en 3-hidroxibutiril-CoA (Madison y Huisman, 1999)

 PHA-polimerasa. En

general, las polimerasas tienen masas moleculares de alrededor de 63,000

Da a excepción de las polimerasas de C. vinosum, T. violace y Synechococcus   spp. que se componen de dos subunidades con una masa molecular de 40 y 45 kDa (Madison y Huisman, 1999).

 Fasinas.  Las

proteínas PhaP desempeñan su papel como proteínas estructurales, se encuentran

conectadas no-covalentemente al corazón de poliéster de gránulos por su dominio amino terminal (N-terminal), además promueven la biosíntesis de PHAs y su número de copia tiene impacto sobre el tamaño del gránulo de PHA. La simulación de la cinética del proceso de autoensamblaje mostró que las fasinas tienen impacto con la cinética de formación de los gránulos reduciendo la fase de retraso (Jurasek y Marchessault, 2004). PhaP es una proteína abundante asociada al gránulo y puede tener también una función de protección para reducir la adherencia de proteínas citoplasmáticas a la superficie del gránulo (Madison y Huisman, 1999). Con el desarrollo de la genética de estas vías a partir de 1987, se amplió el conocimiento sobre el metabolismo, la bioquímica y la fisiología de los PHAs. Se cree que cuando la primera bacteria formadora de PHAs usó esta vía, el objetivo de la ruta probablemente era diferente a la de la síntesis de un material de almacenaje, la formación de PHAs probablemente era una ruta

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metabólica menor en estos organismos, posiblemente como resultando de un sólo lado de la reacción. Cuando la formación de PHAs se convirtió en benéfico para el microorganismo, la evolución la seleccionó para mejorar las condiciones de supervivencia de los microorganismos (Floccari et al., 1995 ). No todas las bacterias usan la misma ruta biológica para la biosíntesis de PHAs, ya que sus tipos metabólicos indudablemente varían. Sin embargo, organismos como  R. eutropha y  Z. ramigera, de

manera generalizada utilizan tres pasos para la biosíntesis de PHAs

que incluyen las reacciones catalizadas por la tiolasa, reductasa y las polimerasas (Madison y Huisman, 1999).

2.7.2.- Biosíntesis de PHAs-ssc Aunque la acumulación de P(3HB) esta ampliamente distribuida entre los procariotas, las investigaciones bioquímicas referentes a los mecanismos enzimáticos de la β-cetoacil-CoA tiolasa, acetoacetil-CoA reductasa y P(3HB) polimerasa se han centrado en sólo dos de los productores naturales,  Zoogloea ramigera  (Mandon et al., 1998) y  Ralstonia eutropha, anteriormente conocida como  Alcaligenes eutrophus  (Peoples y Sinskey, 1989). La ruta biosintética para PHB en  Alcaligenes eutrophus (Fig. 5) es muy semejante a la síntesis de PHB en otras bacterias (Mandon et al., 1998; Carminatti et al., 2006), el proceso inicia con la condensación de dos moléculas acetil-CoA (Peters y Rehm, 2005). Sin embargo, en estas bacterias el acetil-CoA se a dirigido hacia la síntesis de PHAs y no al TCA, este es un efecto de las condiciones ambientales, especialmente cuando la limitación por oxígeno hace que la relación NADH+ /NAD+ aumente. El NADH+  inhibe las enzimas citrato sintasa e isocitrato deshidrogenasa, logrando que el acetil-CoA no entre en TCA (Cabello, 2007) y entonces es convertido a acetoacetil-CoA catalizado por la enzima β-cetotiolasa. Posteriormente, el acetoacetil-CoA se reduce a (R)-3-hidroxibutiril-CoA por medio de la actividad de la acetoacetilCoA reductasa NADPH-dependiente, estas enzimas han sido encontradas y estudiadas en varias bacterias acumuladoras de PHB (Peters y Rehm, 2005). Finalmente, la PHB-sintasa, codificada por el gen phbC polimeriza los residuos de β-hidroxibutiril a una molécula poliéster. La molécula PHB puede ser depolimerizada y convertida de vuelta a la vía del acetil-CoA por acción de una PHB-depolimerasa y una β-hidroxibutirato dehidrogenasa NAD-dependiente. La

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regulación de la síntesis de PHB y la degradación esta controlada a nivel de β-cetotiolasa y de βhidroxibutirato dehidrogenasa, permitiendo una modulación rápida del nivel de poder reductor en la célula. La adecuada sincronización del poder reductor puede prevenir la inhibición de varias enzimas de TCA (Mandon et al., 1998; Carminatti et al., 2006, Peters y Rehm, 2005).

Figura 5. Biosíntesis y degradación de PHB. En condiciones de exceso de energía el NADH inhibe la despolimerización de PHB y el ciclo de los ácidos tricarboxilicos (TCA). La disminución de la concentración de CoA-SH aumenta la inhibición de la acetil-Co-aciltransferasa que cataliza la condensación del acetil-CoA en acetoacetil-CoA y la síntesis de PHB. En deficiencia de energía, el control actúa en el otro sentido. Los signos (+) y (-) corresponden a regulación positiva o negativa (Cabello, 2007).

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2.7.3.- Biosíntesis de PHAs-msc PHAs-msc no fueron descubiertos hasta 1983, cuando Witholt et al. encontraron que creciendo a P. oleovorans  en octano al 50% se formaba un material flexible. La composición de estos PHAs

y su relación directa con la estructura del sustrato de crecimiento sugiere que la ruta de biosíntesis de PHA-msc es una rama directa de la ruta de oxidación los ácidos grasos. En esta ruta los ácidos grasos son degradados para remover unidades de C2 que forman el acetil-CoA (Madison y Huisman, 1999).

2.7.4.-Formación de PHAs-msc por Pseudomonas a partir de ácidos grasos Se han probado sustratos baratos para la producción de PHAs por especies de Pseudomonas , un ejemplo de lo anterior es el sebo, una grasa barata con potencial de sobrecapacidad de producción ya que es una mezcla de triglicéridos con ácidos oleico, esteárico, y palmítico como componentes principales de ácidos grasos, el sebo representa un sustrato interesante para la producción de PHAs. En este sentido, algunas de las cepas caracterizadas como Pseudomonas convierten el sebo hidrolizado a PHAs en niveles entre 15 y 20% de su peso seco; estos organismos no secretan una enzima lipasa para facilitar la hidrólisis del sebo, sin embargo P. resinovorans proporciona tanto actividad de lipasa como de PHA-sintasa (Madison y Huisman, 1999).

2.7.5.- PHAs-msc formados a partir de carbohidratos Inicialmente, fue sorprendente observar que cepas de P. putida fueron capaces de acumular PHAs a partir de glucosa y otros azúcares siendo esta especie la primera productora de PHA-msc, a diferencia de P. oleovorans que es incapaz de sintetizar este tipo de PHAs debido quizá a que la ruta de PHA-msc podría estar basada exclusivamente en la ruta metabólica de los ácidos grasos. Varios estudios mostraron que cepas de P. putida y P. aeuroginosa son capaces de convertir acetil-CoA a monómeros de cadena de longitud media para la síntesis de PHAs; de hecho, ahora la regla es que, P. oleovorans   es la excepción entre Pseudomonas   por su incapacidad para sintetizar PHAs a partir de azúcares.

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Los PHAs formados a partir de gluconato o azúcares relacionados tienen una composición diferente a los PHAs formados a partir de ácidos grasos, es decir el 3-hidroxioctanoato es el componente principal de los PHAs formados a partir de ácidos grasos, mientras que a partir de azúcares se acumulan PHAs en los cuales el 3-hidroxidecanoato es el monómero principal y pequeñas cantidades de monómero insaturado están presentes. Cuando P. fluorescentes   es cultivada en azúcares, el PHA formado consiste principalmente de monómeros de C10 y C8. Algunas pruebas sugieren que estos monómeros son derivados de los intermediarios de la biosíntesis de los ácidos grasos, y que la composición de PHAs es probablemente una reflexión del fondo de los intermediarios biosintéticos de la ruta de los ácidos grasos. Además, la corroboración de la participación de la biosíntesis de ácidos grasos en la formación de PHAs por glucosa y la β-oxidación desde los ácidos grasos se obtuvo mediante experimentos de inhibición. P. putida es

capaz de sintetizar PHAs ya sea a partir de glucosa o de ácidos grasos cuando están

presentes como fuentes de carbono en exceso. Sin embargo, cuando la cerulina (un ácido graso inhibidor de síntesis) es añadido a esas suspensiones de células los PHAs no se forman a partir de la glucosa, lo que sugiere que los PHAs se siguen sintetizando a partir de ácidos grasos. Del mismo modo el ácido acrílico, bloqueador de la β-oxidación, impide la formación de PHAs desde octanoato pero no a partir de la glucosa. Estos experimentos confirmaron que la formación de PHAs a partir de la glucosa está ligada a la biosíntesis de los ácidos grasos, y puesto que la biosíntesis de ácidos grasos procede de la vía (R)-3-hidroxiacil-ACP se requiere una actividad enzimática nueva para convertir este intermediario a (R)-3-hidroxiacil-CoA; recientemente, Rehm et al.  (1998) determinaron que el producto génico de phaG es el responsable de esta conversión (Fig. 6) (Madison y Huisman, 1999).

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Fig. 6. Ruta biosintetica para PHA-msc a partir de hidratos de carbono. Esta vía está ligada a la biosíntesis de los ácidos grasos, puesto que la biosíntesis de éstos procede de la vía (R)-3-hidroxiacil-ACP. El (R)-3-hydroxyacyl-ACP es convertido a (R)-3-hidroxiacil-CoA por una acil-ACP:CoA transacilasa codificado por el gene phaG (Madison y Huisman, 1999).

2.8.- Características de los gránulos Debido a que los PHAs son de naturaleza lipídica, estos bioplásticos se acumulan como materiales de almacenamiento en forma de gránulos líquidos amorfos y móviles. El número y tamaño de los gránulos, la composición del monómero, la estructura macromolecular y las propiedades físico-químicas varían dependiendo de la especie del organismo productor (Arshad et al., 2007).

Según Byrom (1994), se han observado aproximadamente de 8 a 13 gránulos por célula de  Alcaligenes latus,

los cuales presentan un diámetro de 0.2 a 0.5 µm (Jendrossek et al.,  2006;

Ojumu et al., 2003). Hay muchos métodos de detección fenotípica para los gránulos

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intracelulares de PHA los cuales son aplicados para identificar los PHAs producidos, incluyen la tinción de Sudán Negro y tinción con Azul Nilo A (Ojumu et al., 2003; Sheu et al., 2000). Los gránulos de PHAs están rodeados por una membrana de fosfolipidos con una serie de proteínas integradas (Berlanga et al., 2006; Pötter y Steinbüchel, 2005) o están unidos a una poliéster-sintasa, Pha-depolimerasa intracelular, fasinas, proteínas anfipáticas, proteínas PHAreguladoras especificas y proteínas adicionales con función desconocida. Además requieren depolimerasas intracelulares para la movilización del poliéster de reserva y están conectados a la superficie del gránulo; el dominio carboxilo terminal (C-terminal) une estas proteínas al corazón de poliéster por interacción hidrófoba (Jurasek y Marchessault, 2004).

2.8.1.- Modelos para la formación del gránulo PHAs Existen varias proteínas involucrada en la regulación de la biosíntesis del polímero y en la formación de los gránulos intracitoplasmáticos, una de ellas son las fasinas que se encuentran asociados a los gránulos de PHA; estas proteínas podrían afectar el tamaño y la pureza de los gránulos, ya que son importantes para la forma que el gránulo adquiere intracelularmente e impide que otras proteínas pueden asociarse a el inespecíficamente, lo cual simplifica la purificación del polímero (De Almeida et al., 2004). Gerngross y Martin (1995) demostraron por primera vez la síntesis in vitro de PHAs (Hezayen et al.,

2002; Madison y Huisman, 1999) y el autoensamblaje de los gránulos utilizando únicamente

poliéster sintasa purificada y su substrato. Este estudio definió que la poliéster sintasa posee todas las características requeridas para la auto-reorganización en partículas esféricas (Hezayen et al., 2002).

2.8.2.- Formación in vivo de partículas de poliésteres La biosíntesis de PHA in vivo empieza cuando el sustrato, tioesteres de (R)-3-hidroxiacil-CoA, está disponible intracelularmente y la poliéster sintasa se está expresando de forma constitutiva aún a niveles bajos, por lo que la disponibilidad del sustrato favorece que esta enzima comience a catalizar la polimerización de poliésteres de alto de peso molecular (n> 1000). Por otro lado, el

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crecimiento de la cadena del poliéster, cuyos residuos están covalentemente ligados a la enzimas (Hezayen et al., 2002), se da cuando la enzima inicialmente soluble se convierte en una molécula anfipática. Actualmente se han descrito dos modelos de formación de gránulos de PHA: el modelo micela y el modelo en ciernes “budding”. Ambos modelos consideran la posición definida de la poliéster sintasa, y en cierta medida la proteína fasina, sobre la superficie del gránulo. El modelo de micela es apoyado por la formación de gránulos de PHA in vitro  y en ausencia de membranas (Fig. 7). En primer lugar, un aumento de la concentración de 3-hidroxibutiril-CoA en el citoplasma promueve la interacción con la P(3HB)-polimerasa, teniendo como resultando el cebado de la enzima por un mecanismo desconocido. Durante una primera fase, los oligomeros de HB son formados lentamente y extruidos por la enzima. A continuación estos oligomeros forman micelas con otros oligómeros incrementando la longitud e hidrofobicidad, en consecuencia, la enzima rápidamente procede con la síntesis de P(3HB), una mayor extrusión del P(3HB) incrementando el tamaño del gránulo. Finalmente, se cree que las micelas se unen en grandes gránulos y estos pueden ser visualizados por medio de microscopía (Tian et al., 2005). Cuando la activación de la PHA-polimerasa se reduce en el proceso de cebado, se combina con una polimerización rápida y la actividad enzimática que forman las estructuras de micelas, con lo cual se asegura la formación de materiales "de alto peso molecular” (Madison y Huisman, 1999). Los PHAs se consideran como macromoléculas osmóticamente inertes cuya relevancia depende su peso molecular alto (Stubbe, 2003; Tian et al., 2005).

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Figura 7. Modelo de Micela para la formación de gránulos de PHB, las esferas coloreadas mostradas sobre PHB amorfo representan las proteínas que estan asociadas a la superficie del gránulo. Esferas grises PhaC; esferas azules PhaP; esferas rojas PhaR; esferas verdes, PhaZ1a; esfera púrpura, PhaZ1b; esfera de naranja, PhaZ1c (Tian et al., 2005).

El modelo budding o “ciernes” fue propuesto recientemente, los primeros estudios de microscopia electrónica mostraron la presencia de un material parecido a una membrana rodeado a los gránulos de PHAs en células intactas o gránulos aislados (Fig. 8). Estas observaciones son las que se pruebas que sustentan el modelo en ciernes ó “Budding”, en el cual se postula que la sintasa hidrofóbica está ligada a la cara interior de la membrana plasmática, provocando se desarrolle una membrana que cubre la superficie del gránulo, está cubierta de una capa lipídica; en este modelo, la biología del sistema y las propiedades físicas del polímero son requeridas para la formación del gránulo (Stubbe, 2003; Tian et al., 2005). En general, estudios in vivo apoyan el modelo en ciernes localizando la formación del gránulo cerca de la membrana citoplasmática de la célula (Gerngross et al., 1993).

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Fig. 8. Modelo “Budding”, donde se puede observar la formación del gránulo (Tian et al., 2005)

En los dos modelos que se han propuesto para explicar la formación de los gránulos de PHAs, la poliéster sintasa es convertida en una molécula anfipática durante la síntesis de la cadena del poliéster, y el proceso de autoensamblaje ocurre en la membrana o en el citosol, de tal forma que pequeñas inclusiones insolubles en agua y esféricas forman el núcleo del poliéster amorfo con la poliéster sintasa conectada covalentemente a la superficie (Gerngross et al., 1993). Varios reguladores PHA-especificos como PhbR de C. necátor , PhaF de Pseudomonas  y PhaR de Paracoccus denitrificans   fueron

encontrados unidos de forma no-covalente a los gránulos de

PHA. Además, se han localizado proteínas adicionales asociadas a los gránulos en Pseudomonas , cuya función aún no es clara, pese a que la expresión de sus genes es co-regulada con otros genes de la biosíntesis de PHA, estas proteínas (PhaI, PhaD, PhaS) son consideradas como proteínas estructurales también implicadas en la biosíntesis y la movilización, aunque no son esenciales para la formación del gránulo PHA, la regulación de genes para la biosíntesis y la movilización de PHA. Sin embargo, sólo las poliéster sintasas conectadas covalentemente son integradas o asociadas con una monocapa de fosofolípidos que rodea el corazón del gránulo de PHA según un modelo, mientras que el otro modelo perfila una estructura mucho más compleja con dos membranas formadas de fosfolípidos (Rehm, 2003). 25

2.9.- Degradación de los PHAs Puesto que el origen de los PHAs es biológico, estos son completamente degradables (Niamsiri et al.,

2004; Sudesh et al., 2000). En la naturaleza un consorcio amplio de microorganismos son

capaces de degradar los PHAs hasta CO 2, H 2O y humus en condiciones aeróbicas (Carminatti et al.,

2006; De Almeida et al.,  2004; Madison y Huisman, 1999), en condiciones anaerobias

también se produce metano (Carminatti et al., 2006; Madison y Huisman, 1999; Moreno et al., 2007) mediante la acción de PHA-depolimerasas y PHA-hidrolasas extracelulares (Carminatti et al.,

2006; De Almeida et al., 2004; Madison y Huisman, 1999). Las actividades de estas enzimas

pueden variar y dependen de la composición del polímero, su forma física (amorfa o cristalina), las dimensiones de la muestra son importantes y las condiciones ambientales (Fig. 9) (Carminatti et al., 2006; Madison y Huisman,

1999; Moreno et al., 2007).

Figura 9. Degradación de P(3HB-3HV) en aguas residuales bajo condiciones aeróbicas. Las botellas hechas de P(3HB-3HV) fueron incubadas durante el verano (temperatura promedio de 20°C). El progreso de degradación es demostrado con las botellas que han sido sujetas a este tratamiento para 0, 2, 4, 6, 8, y 10 semanas (de izquierda a derecha) (Madison y Hiusman, 1999).

Las velocidades de biodegradación dependen de una serie de factores, incluyendo área superficial, actividad microbiana, ambiente propicio, pH, temperatura, nivel de la mezcla y presencia de otros nutrientes (Tabla 2). La degradación de estos materiales suministra a los microorganismos degradadores precursores de componentes celulares y de energía (Carminatti et al., 2006), además de que la

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producción de PHAs se basa en la utilización de recursos renovables

(Carminatti et al., 2006; De Almeida et al.,  2004). Lo anterior contraste con los residuos termoplásticos sintéticos que se acumulan en grandes cantidades en el ambiente y su degradación es lenta; adicionalmente, estos plásticos derivados de los hidrocarburos utilizan las escasas reservas petroquímicas del planeta (De Almeida et al., 2004).

2.10.- Biodegradibilidad Aparte de las propiedades poliméricas típicas, una característica importante de los PHAs es su Biodegradibilidad (Madison y Huisman, 1999), por lo que han sido extensamente estudiados por la academia y la industria (Sheu et al.,  2000). Los polihidroxialcanoatos se consideran buenos sustitutos de los plásticos derivados del petróleo por ser completamente biodegradables después de desecharlos una vez de haber sido utilizados (Cho et al., 1997; Park et al., 2001). Los tiempos de permanencia de los PHAs en diferentes ambientes naturales se resumen en la tabla 2 .

Tabla. 2. Tiempo que tardan los PHAs en degradarse en diferentes ambientes (Luzier, 1992).

2.11.- Sobrevivencia de bacterias productoras de PHAs Trabajos relacionados en el laboratorio con cepas silvestres y cepas deficientes (mutantes) en la síntesis de PHB de  R. eutropha y  B. megaterium, demostraron que las que eran capaces de sintetizar el polímero de reserva tenían mayor sobrevivencia en agua de río y mayor capacidad de competencia con las bacterias autóctonas, que sus correspondientes mutantes. Estos experimentos sugirieron que la síntesis y la utilización del polímero aumentaban la sobrevivencia y la 27

capacidad de competencia bacteriana en ambientes cambiantes naturales. Los PHAs juegan un papel importante en la supervivencia bacteriana ante condiciones de estrés. Sin embargo, aunque ya se ha establecido que estos polímeros se utilizan como fuente de carbono cuando los microorganismos que los producen se enfrentan a condiciones de inanición, se conoce poco acerca de los mecanismos mediante los cuales la utilización de PHAs favorece la supervivencia bacteriana en condiciones desfavorables. En un trabajo realizado con  R. eutropha en 1967, se sugirió que existía una asociación entre la utilización de los PHAs y la fosforilización oxidativa (De Almeida et al., 2004). Se sabe que ante condiciones adversas, las bacterias son capaces de responder con diversos mecanismos de control activos que les permiten hacer frente a dichas condiciones, uno de estos mecanismos es la respuesta general a estrés que se induce en bacterias Gram-negativas ante condiciones de estrés ambiental, tales como las provocadas por escasez de nutrientes, estrés osmótico, estrés oxidativo y cambios bruscos de temperatura. Dado que los PHAs son un reservorio de carbono, energía y equivalentes de reducción, tanto su síntesis como su degradación tienen un efecto importante sobre el metabolismo central de la célula procariota (De Almeida et al., 2004), ya que evolutivamente la bacteria no desarrolló la capacidad de producir PHAs como medio para la síntesis de plásticos útiles a la humanidad, la producción y acumulación de PHAs por la bacteria debe haberse desarrollado de un fenotipo ventajoso relacionado con la deposición de estos materiales, y además como material de almacenaje de carbono y equivalentes de reducción (Madison y Huisman, 1999).

2.12.- Aplicación de los Poli-β-hidroxialcanoatos En general estos biomateriales se caracterizan por ser biocompatibles y biodegradables; estas propiedades les confieren un potencial industrial grande para ser utilizados como sustitutos de los plásticos sintéticos, además de utilizarse en un espectro amplio de aplicaciones biotecnológicas (Niamsiri et al., 2004; Rojas et al., 2006, Sheu et al., 2000). La producción actual de PHAs vía fermentación microbiana todavía no puede competir con los métodos utilizados para la producción comercial de plásticos, por lo que lograr el aprovechamiento de los PHAs en esta y otras aplicaciones es de importancia crucial.

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La gama tan amplia de propiedades físicas de la familia de los polímeros biológicos, específicamente PHAs, aunado a la posibilidad de obtener buenos rendimientos por la composición y mezcla, proporcionan una gama mur extensa de posibles aplicaciones finales, tal como se describe en numerosas patentes. Los esfuerzos iníciales se centraron en las aplicaciones de moldeo, particularmente para los consumidores de envases tales como botellas, envases cosméticos, plumas, etc. (Fig. 10).

Figura 10. Productos elaborados utilizando polihidroxialcanoatos como materia prima (Segura et al., 2007).

Una de las áreas de aplicación de PHAs es su monómero quiral como intermediario para la síntesis de algunos productos farmacéuticos y pesticidas. Sin embargo el proceso de producción es complicado y la eficiencia baja, por estos motivos se buscan otras alternativas más atractivas (Madison y Huisman, 1999). Como ya se mencionó líneas arriba, el monómero P(3HB) se ha encontrado en gran variedad de plantas y tejidos de origen animal, así como en el plasma humano y también se ha encontrado asociado con lipoproteínas de baja densidad pero no con lipoproteínas de alta densidad. Adicionalmente, una parte significativa de P(3HB) se ha encontrado asociada con la albúmina del suero; se piensa que dichas moléculas de lípido y albumina que actúan como transportadores de P(3HB) en la sangre, específicamente con la albumina que es el portador principal (Madison y Huisman, 1999). Según Sotavento (1996) el producto de degradación del PHB es el D(-)-3hidroxibutirato, el cual se ha encontrado en cantidades relativamente grandes en el plasma de la sangre humana, por lo tanto, es sumamente plausible que la implantación de PHB en tejidos de mamíferos no sería tóxico (Ojumu et al., 2003). Otras aplicaciones médicas son utilizarlo para la 29

liberación controlada de medicamentos (Carminatti et al., 2006), aunque la gama de aplicaciones industriales para utilizarlo en el empaquetamiento de fármacos es muy baja (Quagliano y Miyasaki, 1997). Estos materiales se han utilizado en implantes re-absorbidos y en la ingeniería de tejidos; el uso de PHAs en el área biomédica es común en suturas quirúrgicas como monómeros que se degradan en el cuerpo humano formando productos que son reabsorbidos por los organismos. Además, en la agricultura los PHAs pueden ser utilizados como productos de liberación de reguladores de crecimiento de plantas ó pesticidas; los PHAs también puede utilizarse para sustituir polímeros petroquímicos en el tóner ó como conductores de iones de polímeros; también pueden ser utilizados como un látex, por ejemplo, para el revestimiento de aplicaciones de papel o puede ser utilizado para producir sustitutos lácteos o agentes de sabor en los alimentos. Además de la amplia gama de propiedades de estos materiales y las consiguientes aplicaciones, los PHAs prometen ser una nueva fuente de moléculas pequeñas que pueden ser hidrolizados químicamente y los monómeros se pueden convertir en productos comercialmente atractivos, tales como moléculas de β-hidroxiácidos, ácido 2-alkenoico, β-hidroxialcanoles, β-acilactonas, βaminoácidos, ésteres y β-hidroxiácido; la última clase de productos químicos está recibiendo mucha atención por sus posibles aplicaciones como disolventes biodegradables (Madison y Huisman, 1999).

2.13.- Substratos y costos Debido a los problemas ambientales que ha ocasionado la acumulación de plásticos no biodegradables, los PHAs como polímeros biodegradables han cobrado mucha importancia. Sin embargo, presentan una gran desventaja en cuanto a su comercialización, lo que deriva en su costo de producción muy elevado comparado con materiales plásticos sintéticos de origen petroquímico (Wang y Lee, 1997; Choi y Lee, 1999) como el polipropileno, polietileno (Chen y Page, 1997) u otros polímeros biodegradables como el ácido poliláctico (Wang y Lee, 1997). Últimamente, el interés por estos polímeros ha aumentado en todo el mundo, a pesar de su alto costo en relación a los polímeros convencionales, basta comparar el costo de producción de PHB estimando en US $2.65/kg para una planta de 100.000 ton/año utilizando sacarosa como substrato 30

y el valor del propileno US $ 1.00/kg (Franchetti y Marconato, 2006). Sin embargo, el precio alto de los PHAs comparado con el plástico obtenido a base de petróleo es justificado por sus grandes ventajas (Arshad et al., 2007); además, los PHAs se pueden procesar con el mismo equipamiento que se emplea para los termoplásticos sintéticos de uso convencional (Hermida y Díaz, 2004). La producción comercial de Bioplásticos PHAs ha sido conducida por Zeneca BioProductos en Billingham, Reino Unido (Chen y Page, 1997). En los últimos años gran parte de las investigaciones realizadas sobre los PHAs se han concentrado en reducir los costos de producción y aumentar la productividad utilizando diversas estrategias, entre ellas se encuentra el rastreo de nuevas cepas productoras (De Almeida et al., 2004). Para esto, es importante la selección de microorganismos que permitan la producción industrial de PHAs y además cumplan con otras consideraciones importantes como: competencia celular, habilidad para usar fuentes de carbono de precio bajo, velocidad de crecimiento, habilidad para la síntesis del polímero y el porcentaje de acumulación del polímero (Khanna y Srivastava, 2005; Moreno et al., 2005). Nuevas cepas que puedan usar substratos económicos y con alto porcentaje de acumulación deben ser aisladas para resolver estos problemas. En este punto, el interés se ha centrado en bacterias Gram-negativas presente en muestras de suelo donde es cultivada la caña de azúcar debido a la riqueza microbiana presente, y a la presión selectiva causada por el desbalance de la proporción carbono/nitrógeno generada por la descomposición de residuos en el suelo, principalmente por un exceso de carbono y una limitación de nitrógeno (De Lima et al., 1999; Moreno et al., 2007). Se ha demostrado que uno de los principales factores que afectan e impactan el costo final de los PHAs son los costos del substrato, principalmente la fuente de carbono (Moreno et al., 2007; Khana y Srivastava, 2005; Arshad et al., 2007). Varios estudios han demostrado que los residuos de la agricultura y comida pueden ser utilizados como substratos para reducir costos (Niamsiri et al.,

2004). Se pueden utilizar los carbohidratos, sobretodo los provenientes de fuentes naturales

renovables como glucosa, sacarosa o bien desechos de la industria alimenticia como mosto de uva u olivo, melaza de caña de azúcar, etc. (Chen y Page, 1997).

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Actualmente, en un esfuerzo para reducir el costo de P(3HB) el interés industrial ha iniciado programas para desarrollar sistemas de producción de este polímero en plantas de cosecha, por lo que las perspectivas de producir P (3HB) son alentadoras, ahora que varios estudios han descrito la síntesis de PHAs en la levaduras, células de insecto y varias especies de plantas. Aunque la síntesis de P(3HB) se ha alcanzado en plantas, los resultados obtenidos hasta ahora, claramente indican que es un camino largo en contraste con la utilización de microorganismos como las bacterias, debido aque el metabolismo en las plantas es categorizado y esto complica las tareas extras (Madison y Huisman, 1999). En conclusión, la reducción de los costos de producción de los poli- β-hidroxialcanoatos, depende de la obtención de linajes altamente eficientes, la conversión del substrato al producto deseado, la utilización de substrato de bajo costo, y el desarrollo de procesos de extracción-purificación para la obtención y recuperación del producto (Carminatti et al., 2006).

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III.- JUSTIFICACIÓN Actualmente en el mundo y específicamente en nuestro país, existe un problema relevante, relacionado con la contaminación presente en agua, aire y suelo, mismo que se agrava puesto que la basura contiene gran cantidad de materia orgánica e inorgánica que generalmente se mezcla durante el proceso de recolección, lo que dificulta el manejo final. La contaminación ambiental se debe principalmente a las enormes cantidades de plástico que se generan diariamente y que reciben un tratamiento inadecuado. En México, la cifra anual para consumo de artículos de plásticos terminados es de 4,809 miles de ton (ANIPAC, 2006), estas cifras se reportaron en el 2006 y se presume que han aumentado en los dos últimos años, lo que sugiere un incremento importante en la acumulación de este material dando lugar a problemas ambientales serios. Por lo tanto, muchas de las ventajas de estos polímeros como la facilidad de que pueden ser trabajados o moldeados, su impermeabilidad, su baja densidad y conductividad eléctrica, así como la resistencia a la corrosión, intemperie y a diversos factores químicos y biológicos, se convierten en una gran desventaja en el momento en que se desechan, reflejándose como un problema de magnitud considerable al contaminar el medio ambiente. Lo anterior a despertado el interés de quienes laboran en la investigación ,  dando origen a la búsqueda de alternativas que lleven al desarrollo de un producto con características similares a las que presenta el plástico pero que no impacte negativamente al ambiente ; es decir, que sea preferentemente biodegradable y que su producción sea de recursos renovables y no a través de un recurso finito, como los hidrocarburos que sirven de materia prima para la producción de plásticos sintéticos. La producción y obtención de un “plástico natural” al precio y costo adecuados, recae en la familia de los polihidroxialcanoatos (PHAs), poliésteres que por sus características parecen ser el sustituto perfecto para el plástico. Sin embargo, su utilización no se ha dado ampliamente debido a lo difícil del aislamiento de las cepas bacterianas que los sintetizan y a los altos costos de producción, ya que las bacterias para generar algún tipo de polihidroxialcanoatos necesitan de una fuente de carbono y esta es costosa, por lo cual en este trabajo se pretende obtener, aislar y caracterizar cepas bacterianas prometedoras en la producción de PHAs.

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Lo anterior, nos lleva a reflexionar que una vez que sean superados los obstáculos que se presentan en el campo de la investigación con respecto a la producción de PHAs, en cuanto a su producción en masa y abatimiento de costos, la utilización de los plásticos actuales se verán reducidos con lo cual podremos observar efectos positivos en el medio ambiente, puesto que los desechos de los PHAs podrán ser degradados y absorbidos sin afectar nuestros ecosistemas.

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IV.- OBJETIVOS

4.1.- Objetivo General Obtener, aislar y seleccionar cepas bacterianas autóctonas capaces de producir poli- βhidroxialcanoatos (PHAs).

4.2.- Objetivos particulares a. Obtener y aislar cepas bacterianas a partir de muestras obtenidas de cultivos de Saccharum officinarum, Lycopersicon esculentum, Citrullus lanatus ,  Nicotina tacabum L. y Musa paradisiaca.

b. Seleccionar cepas bacterianas capaces de producir poli- β-hidroxialcanoatos (PHAs). c. Cuantificar los PHAs producidos por las cepas bacterianas encontradas. d. Caracterizar mediante pruebas químicas y bioquímicas las cepas bacterianas seleccionadas.

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V.- MATERIALES Y MÉTODOS. 5.1.- Obtención de muestras Se procesaron muestras de diferentes tipos de tejido vegetal afectado, es decir que presentaran necrosis. Las muestras seleccionadas fueron de hoja y seudotallo provenientes de plantas de  Musa paradisiaca;

además, se colectaron muestras de suelo del área de la rizosféra adyacente al

cultivo de plátano, en la localidad de Xalapa, Ver. Aparte de las muestras colectadas de  Musa  paradisiaca ,

también se colectaron muestras provenientes del suelo de cultivos de Saccharum

officinarum, Lycopersicon esculentum

y Citrullus lanatus  en la localidad de Tamarindo, Ver. y

muestras de suelo pertenecientes a cultivos de  Nicotina tabacum L. en la región de San Andrés Tuxtla, Ver. Las muestras de los diferentes tipos de tejido vegetal afectado (seudotallo, hoja) se seleccionaron de la planta, teniendo la precaución de tomar fragmentos que presentaran los síntomas iniciales de alguna enfermedad, acompañados de tejido sano con el fin de disminuir la presencia de microorganismos saprófitos presentes en la planta; Los fragmentos de tejido se obtuvieron con ayuda de bisturí y pinzas previamente esterilizados. Las muestras de suelo se colectaron en el área cercana a la rizósfera a una profundidad de 15-20 cm. Las muestras tanto de suelo como de tejido vegetal se colocaron en bolsas plásticas etiquetadas y se conservaron a 4°C, al final de la colecta las muestras fueron transferidas al Laboratorio de Microbiología en el Instituto de Investigaciones Biológicas para su posterior procesamiento.

5.2.- Procesamiento de muestras de tejido vegetal. Los fragmentos de tejido que se utilizaron fueron de un tamaño de 1 x 1cm, se lavarón en un vaso de precipitado de 250 ml conteniendo agua destilada durante 30 minutos y en agitación. Posteriormente los cortes se trasladaron a un matraz Erlenmeyer de 250 ml conteniendo solución de hipoclorito de sodio al 1% durante un minuto para evitar la contaminación externa. A continuación, se realizó u n lavado con agua destilada estéril en un vaso de precipitado de 250 ml y enseguida el tejido se sumergió durante un minuto en una solución de etanol al 70%. Finalmente, los cortes se enjuagaron una vez con agua destilada estéril para remover los residuos de los desinfectantes utilizados. Este procedimiento se llevó a cabo con material esterilizado y en condiciones estériles. 36

Con el fin de obtener las bacterias presentes en el tejido vegetal, los fragmentos de tejido tratados fueron macerados en un mortero con una solución buffer de fosfatos (23.0 g KH 2PO4, 43.2, Na2HPO4·7 H20, en 1000 ml de H2O). La suspensión obtenida del macerado de los tejidos se sembró en condiciones estériles con un asa estéril en placas de Agar Soya Triptocaseina (TSA).

5.3.-Procesamiento de muestras de suelo Se prepararon suspensiones de las muestras de suelo adicionando 3gr de suelo en 30 ml de buffer de fosfatos mezclando muy bien con el vortex. Se tomo 1ml de esta suspensión y se sembró en placas de TSA. Las cajas se incubaron a 30°C durante 24 h para obtener el ccrecimiento de colonias de bacterias (Gómez, 2005).

5.4.- Obtención y Aislamiento de cultivos puros por métodos de siembra en placa Una vez crecidas las colonias, obtenidas tanto de las muestras de tejido vegetal como de suelo, se efectuó la siembra individual de cada colonia obtenida en medio TSA para lograr la purificación de las bacterias. Se utilizó la siembra por estría (Koneman et al., 1998), ya que por lo general es el método más útil de siembra en placa. Este procedimiento se realizó en repetidas ocasiones hasta purificar las colonias. Una vez obtenidas las cepas purificadas, fue necesario sembrarlas por duplicado en tubos inclinado conteniendo medio TSA para su conservación y posterior utilización.

5.5.-Producción de poli-β-hidroxialcanoatos (PHAs) Una vez aisladas y purificadas las cepas se procedió a iniciar la etapa de cultivo para realizar las pruebas de la determinación cuantitativa de PHAs. La cuantificación se realizó con el método espectrofotométrico de Law y Slepecky (1961) modificada por Martínez et al. (2004). Determinación de la Producción de poli- β-hidroxialcanoatos (PHAs) por cada cepa bacteriana. Condiciones del medio de crecimiento para la obtención de biomasa. Primera etapa: Las cepas bacterianas aisladas se cultivaron en 50 mL de medio MSM (Tabla 3), el cual se caracteriza por no presentar un desbalance en las cantidades de Nitrógeno/Carbono. Este medio permitió aumentar la cantidad de biomasa a partir de la cual se extrajo un inóculo que 37

se utilizó en la siguiente etapa, la de producción de PHAs. El medio utilizado es una modificación del medio usado por Barbosa et al.,. (2005) donde la fructosa fue remplazada por sacarosa. Tabla 3. Componentes del medio MSM suplementado con sacarosa Reactivo:

Cantidad:

Fuente de carbono Sacarosa

10 g/L

NH4SO4

2.75 g/L

K2HPO4

2.0 g/L

NaH2PO4

1.6 g/L

MgSO4 .7 H2O

0.5 g/L

Solución de microelementos (Tabla 4)

2.0 ml/L

Tabla 4. Solución de microelementos Reactivo

Cantidad

FeSO4

2.0 g/L

MnCl2 4 H20

0.03 g/L

CaCl22 H20

2.0 g/L

CuCl 2 H20

0.01 g/L

ZnSO4 7 H20

0.1 g/L

CoCl 6 H20

0.2 g/L

NiCl2 6 H20

0.02 g/

Na2MoO4 2 H2O en HCl 0.1 N

0.03 g/L

El medio de cultivo se inoculó con la cepa bacteriana en estudio y se incubó a 28-30ºC y 200rpm durante 24 h (Barbosa et al., 2005). Segunda etapa: Para determinar la producción de PHAs se utilizó medio MSM pero con un desbalance en las cantidades de C/N; se utilizó “Sacarosa” como fuente de carbono a una 38

concentración de 40 g/l y el nutriente limitado fue NH 4SO4, del cual se utilizó una concentración de 1.11 g/L, consultar Tabla 5 (Haywood et al., 1990) Tabla 5: Componentes del medio de cultivo para la producción de PHAs. Reactivo

Cantidad

Fuente de carbono a evaluar: Sacarosa

40 g/L

NH4SO4

1.11 g/L

K2HPO4,

4.3 g/L

KH2PO4

1.6 g/L

MgSO4·7H2O

1.2 g/L

Ácido Cítrico

1.7 g/L

Solución de microelementos (Tabla 4)

10 ml/L Barbosa et al., 2005.

Condiciones de las Fermentaciones para la producción de PHAs. Para cada experimento se usó 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL con 47.5 mL de medio MSM con el cociente C/N antes mencionado y al cual se le agregaron 2.5 mL de inoculo (representando el 5% del cultivo total) para llegar a un volumen de 50 mL. Las condiciones de cultivo fueron: 28 a 30ºC, pH de 7 y agitación de 225 rpm durante 72 horas. A los tiempos de 24, 48 y 72 horas se tomaron muestras para los análisis de crecimiento celular y determinación cuantitativa de PHA (Martínez et al., 2004).

5.6.-Determinación cuantitativa de poli-β-hidroxialcanoatos (PHAs) por el método espectrofotométrico de Law y Slepecky (1961) modificada por Martínez et al . (2004) Para cuantificar el PHA producido y acumulado por cada cepa bacteriana, se tomaron 3 muestras de 1 ml cada una a las 24, 48 y 72 horas y se midió la densidad óptica a 600nm. Cada muestra de 1 ml se centrifugó a 10,000 x g durante 5 min en una microcentrífuga Eppendorf, la pastilla de células se lavó con tampón fosfato y se digirió en solución de hipoclorito de sodio al 5% (Cl -) + EDTA 10mM, incubando durante 1.5 h a 37ºC. Posteriormente se centrifugó y se lavó con 0.2 ml de agua destilada y después con acetona (0.2ml). Finalmente, 39

el sedimento se lavó con 0.2 ml de etanol y se dejo secar. Cada muestra se digirió con ácido sulfúrico al 80% durante 30 minutos a 90ºC y se determinó la absorbancia a 214nm en un espectrofotómetro UV/VIS (Martínez et al., 2004).

Realización de la curva patrón para la cuantificación de PHAs La curva patrón utilizada como referencia en la determinación de PHAs producidos por las cepas bacterianas, es realizada a partir de una solución estándar de 1mg/ml del homopolimero PHB disuelto en H 2SO4  al 80%; a partir de esta solución concentrada se hicieron las diluciones. La absorbancia de cada dilución se determinó en el espectrofotómetro UV/VIS a 214 nm. Después de evaluar la producción de PHAs por el método espectrofotométrico de Law y Slepecky (1961) modificado por Martínez et al., (2004), se seleccionaron las cepas bacterianas con mayor producción. A estas se les determinó cualitativamente la acumulación de PHAs mediante la técnica de tinción lipofílica con Negro Sudán B (Diario Oficial de la Unión Europea 1997; Pandolfi y Pons, 2007), cinéticas de crecimiento y caracterización mediante pruebas químicas y bioquímicas.

5.7.- Evaluación cualitativa de la acumulación de PHAs mediante de tinción lipofílica con Negro Sudán B. Las cepas bacterianas seleccionadas fueron sembradas en los medios utilizados para determinar la producción de PHAs, MSM sin desbalance de C/N y MSM con desbalance de C/N, con las mismas condiciones y parámetros. Después de obtener cultivos a las 24, 48 y 72 h, se preparon frotis de cada cepa seleccionada. Los frotis se dejaron secar y se pasaron varias veces con rapidez sobre la llama hasta que el frotis este fijado. Cada preparación se baño con una solución de Negro Sudán B al 0.3% en etanol del 70%, y se incubó durante 10 min a temperatura ambiente. Se escurrió la solución de tinción y las preparciones se lavaron suavemente con agua destilada; el agua sobrante se eliminó con un pañuelo de papel (Pandolfi y Pons, 2007). Los frotis se sumergieron brevemente en xilol, se secaron con un pañuelo, y finalmente se cubrieron con safranina acuosa al 0.5% (p/v) dejando incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Lavar ligeramente con agua destilada 1 vez, secar y tapar con un portaobjetos (Diario Oficial de la Unión Europea 1997). Cada preparación se examinó con Microscopio Óptico Nikon a un aumento 100x y bajo aceite de inmersión. 40

5.8.- Análisis de crecimiento celular Las curvas de crecimiento de las 14 cepas bacterianas seleccionadas aleatoriamente de un total de 20 se hicieron durante 108 h y se les dio seguimiento por medio de espectrofotometría a 600nm (Spectronic 20, Milton Roy Company).

5.9.-Caracterización química y bioquímica de cepas bacterianas presuntas productoras de PHAs. A las cepas bacterianas aisladas y que fueron positivas para la producción de PHAs, se les realizaron las siguientes pruebas químicas y bioquímicas: Tinción de Gram, Movilidad, Catalasa, Citocromooxidasa, Prueba Oxidativa-Fermentativa de acuerdo al manual de Bergey´s (Hendricks y Holt, 1994), para determinar a que grupo pertenecen. Tinción de Gram.   Permitió

catalogar el grupo al que pertenecen las bacterias aisladas y

purificadas. Esta prueba además de determinar si se trata de bacterias Gram negativas o Gram positivas, permite observar la morfología celular que presenta cada cepa seleccionada, ya sean bacilos o cocos.  Movilidad .

Esta prueba se realizó utilizando el medio de cultivo con TTC (2,3,5-cloruro de

trifeniltetrazolio) que permite determinar si la cepa presenta movilidad. Un resultado positivo (célula móvil) produce una nube turbia rosa que difunde en todo el medio ya que el TTC actúa como un aceptor artificial de electrones para las enzimas ligadas al nucleótido piridina en la cadena biológica oxidativa. El TTC es un compuesto incoloro, soluble en agua que es tomado por las células bacterianas que lo reducen enzimáticamente con la liberación de ácido formazán, un compuesto rojo altamente pigmentado, por lo que la pigmentación permite observar macroscópicamente la movilidad de la cepa. Se utilizó este medio debido a que en el medio MIO, la turbidez que representa la movilidad en algunos casos es difícil de interpretar. Catalasa.  La

presencia de la enzima catalasa se realizó por el método del portaobjeto y a

temperatura ambiente (22-25°C). Para ello, con una aguja de inoculación se recogió el centro de una colonia pura de 18 a 24 h de crecimiento y se colocó sobre un portaobjeto, con una pipeta 41

Pasteur se agregó una gota de peróxido de hidrogeno (H 2O2) al 3% sobre los microorganismos colocados en el portaobjeto. La reacción positiva se determina por el burbujeo inmediato que se produce por la formación de O 2, actividad de la enzima. Citocromooxidasa .  Los

citocromos, hemoproteínas que contiene hierro, actúan como el último

vínculo de la cadena respiratoria aerobia transfiriendo electrones (hidrógeno) al oxígeno, con la formación de agua. El sistema de citocromos se halla en microorganismos aerobios, o microaerófilos, y anaerobios facultativos, de modo que la prueba de oxidasa es importante para identificar microorganismos que carecen de la enzima o son anaerobios obligados. La prueba es muy útil para evaluar colonias que se sospecha pertenecen a la familia  Enterobacteriaceae  (todas negativas) y para identificar colonias que se sospecha pertenecen a otros géneros como el de Pseudomonas.

La prueba se realizó por medio del procedimiento indirecto con tira de papel filtro, en el cual se agrega 1 gota del reactivo de Reactivo de Kovac (clorhidrato de tetrametil-p-fenildiamina). Las colonias bacterianas que tienen actividad de citocromooxidasa desarrollan un color morado en el sitio de inoculación en 10 segundos; el resultado negativo se caracteriza por no presentar el color o por el desarrollo de color después del tiempo establecido.  Prueba

Oxidativa-Fermentativa

(Hugh

y

Leifson).

Esta prueba determina si los

microorganismos en estudio degradan los azúcares por la vía fermentativa u oxidativa. Para la prueba OF se requieren dos tubos, cada uno inoculado con el microorganismo desconocido, un tubo se cubre con aceite mineral y el otro tubo se deja expuesto al aire; ambos tubos se incuban a 35°C y la producción de ácidos orgánicos se detecta por la aparición de un color amarillo. En el caso de microorganismos oxidativos, la producción de ácidos se lleva a cabo en el tubo abierto, sin aceite mineral, y en los microorganismos que degradan el carbohidrato por la vía fermentativa el color amarillo se aprecia en el tubo cubierto con aceite mineral (Koneman et al., 1998). Conforme al manual de Cowan y Steel´s (1993), Diagnóstico microbiológico clínico de Koneman et al.  (1998),

Bacterial Identification de Cullimore (2000), Libro de pruebas bioquímicas de

Identificación Bacteriana de MacFaddin et al.  (2003), se prosiguió con la la realización de las pruebas diferenciales para determinar el género y en algunas casos la especie a la cual pertenecen 42

los

aislados

obtenidos

de

las

familias  Enterobacteriaceae,

Pseudomononadaceae,

 Alcaligeneaceae y el género , Shewanella.

5.10.-Caracterización química y bioquímica de Fermentadores Pruebas diferenciales para la familia Enterobacteriaceae .

Las pruebas diferenciales permitieron

determinar diferentes géneros de la familia, incluso algunas especies.  Pruebas en Agar con hierro de Kligler (KIA)/Triple azúcar y hierro (TSI).  El medio KIA y TSI

son medios de cultivo diferenciales en tubo que cumplen un doble propósito: a) la determinación de la fermentación de hidratos de carbono y b) la determinación de H 2S. Un microorganismo puede utilizar varios sustratos incorporados en el medio, y el patrón de sustratos metabolizados se usa para diferenciar entre los diversos grupos, géneros o especies de la familia  Enterobacteriaceae.

El KIA contiene dos hidratos de carbono (glucosa y lactosa) y el TSI

(glucosa, lactosa y sacarosa), la fermentación tiene lugar tanto en aerobios (en el pico de flauta) como en anaerobiosis (en el fondo del tubo), este medio se siembra por punción y estría superficial.  Reducción de nitratos.   La

realización de esta prueba permitió observar la capacidad de las

bacterias pertenecientes a la familia  Enterobacteriaceae de reducir nitratos a nitritos. Para esto, se empleó el medio nitrato de potasio, en la variante de caldo nitrato, el cual fue inoculado con el cultivo puro que se estaba caracterizando. Se incubó a 35°C durante 24 h. Para determinar la reducción de nitratos fue necesario agregar primero los reactivos A y B de Griess, un resultado positivo se caracteriza porque se produce un color rosa a rojo obscuro en 1-2 min, y un resultado negativo se caracteriza por la falta de color. En este punto es necesario agregar una cantidad pequeña de polvo de Zn puro, la ausencia de desarrollo de color significa que el microorganismo redujo el nitrato a nitrito y posteriormente redujo el nitrito a productos no gaseosos. La desnitrificación, un resultado negativo que se caracteriza por el desarrollo de color naranja a rojo obscuro en 5-10 min confirmando el resultado negativo de la prueba, esto es que el nitrato está presente y no es reducido por el microorganismo (Koneman et al., 1998; MacFadin, 2003). 43

 Prueba de Indol .

La prueba de Indol se basa en la formación de un complejo de color rojo

cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehido, que es la sustancia química activa de los reactivos de Kovacs y Erlich. Se utilizó el medio de caseína, el cual se inoculó con un cultivo puro y se incubó a 35°C por 24h; después del tiempo de incubación se agregó el reactivo de Kovacs directamente al tubo antes de interpretar los resultados. Una reacción positiva presenta un anillo rojo en la interface del medio con la porción inferior de la fase alcohólica, sobre el medio, y es negativa cuando no hay ningún desarrollo de color en la capa de alcohol (MacFadin, 2003).  Prueba de Rojo de Metilo (RM).

Esta es una prueba cuantitativa para determinar la producción

de ácidos, pero requiere que los microorganismos produzcan ácidos fuertes (láctico, acético, fórmico) a partir de glucosa a través de la vía de fermentación de ácidos mixtos; dado que muchas especies de  Enterobacteriaceae  pueden producir una cantidad de ácidos fuertes suficientes como para que sea posible detectarlos por medio de RM durante las fases iniciales de incubación. El medio empleado fue el caldo rojo de metilo-Vogues-Proskauer, según la fórmula de Clark y Lubs, el cual se inoculó con un cultivo puro del microorganismo en estudio, y se incubó durante 72h a 35°C. Concluido el tiempo de incubación se agregaron directamente en el caldo 5 gotas del reactivo de rojo de metilo; sólo los microorganismos capaces de mantener el pH bajo (aparición de un color rojo estable) después de una incubación prolongada, superando el sistema amortiguador del pH del medio, pueden denominarse rojo de metilo-positivos (Koneman et al., 1989).

 Prueba de Vogues-Proskauer  

(VP). El medio utilizado fue caldo rojo de metilo-Vogues-

Proskauer, según la fórmula de Clark y Lubs; el caldo se inoculó con un cultivo puro del microorganismo en estudio, se incubo a 35°C durante 72 horas y después de este lapso se agregaron 0.6 ml de α-naftol al 5% seguidos por 0.2 ml de KOH al 40%. El tubo se sacude suavemente para exponer el medio al oxígeno atmosférico (O 2) y luego se dejó reposar durante 15 min. Esta prueba determina la capacidad de algunos microorganismos para producir un producto final neutro, acetil-metilcarbinol (AMC, acetoína), a partir de la fermentación de glucosa. 44

Microorganismos como  Enterobacter   spp. producen acetoína como producto final principal del metabolismo de la glucosa y forman cantidades menores de ácidos mixtos. En presencia de O 2 y KOH al 40%, en una reacción positiva la acetoína se convierte en diacetilo y el α-naftol sirve como catalizador para producir un complejo de color rojo; una reacción negativa se caracteriza por un color amarillo en la superficie (Koneman et al., 1998). Utilización de Citrato . El

citrato de sodio es una sal de ácido cítrico, un compuesto orgánico

simple hallado como uno de los metabólicos en el ciclo del ácido tricarboxilicos (Ciclo de Krebs), algunas bacterias pueden obtener energía de una forma que no es la fermentación de hidratos de carbono utilizando citrato como única fuente de carbono. La evaluación de esta característica es importante en la identificación de muchas   Enterobacteriaceae , la utilización de citrato se detecta en un medio con citrato por la producción de productos intermedios alcalinos. El medio de Citrato utilizado fue conforme la fórmula de Simmons, se toma una colonia aislada del medio y se inocula estriando sobre la placa de citrato, se incuba durante 24 a 48 horas a 35°C; una prueba positiva está representada por la aparición de un color azul oscuro, también puede ser positiva en ausencia de color azul pero si hay crecimiento de colonias visibles (Koneman et al., 1998).  Prueba de ureasa.  Determina

la capacidad de un microorganismo de hidolizar la urea en dos

moléculas de amoniaco por la acción de la enzima ureasa, con la resultante alcalinidad. Se utilizó el medio Agar con urea de Christensen, se utiliza un inóculo denso proveniente de un cultivo puro de 18 a 24 h, se estría toda la superficie del pico de flauta, no se debe de punzar el medio, se incuba a 35°C, el tiempo de incubación puede ser por periodos prolongados (MacFadin, 2003).  Descarboxilasas

(lisina y ornitina).  Las descarboxilasas son un grupo de enzimas específicas

capaces de reaccionar con la porción carboxilo (COOH) de aminoácidos formando aminas de reacción alcalina. Esta reacción, conocida como descarboxilacion, forma dióxido de carbono como producto secundario, cada descarboxilasa es específica para un aminoácido; lisina y ornitina fueron evaluadas.

45

El medio de Falkow fue la base empleada para determinar la capacidad de descarboxilacion de las Enterobacteriaceae , el aminoácido a evaluar se agrego a la base antes de la inoculación con el microorganismo a estudio, de manera paralela debe disponerse de otro tubo que consiste solo en la base sin el aminoácido, ambos tubos se incuban de forma anaerobia cubriéndolos con parafina a 35°C durante 24 horas. Durante los estadios iniciales de incubación, los dos tubos se vuelven amarillos debido a la fermentación de la pequeña cantidad de glucosa en el medio, si el aminoácido es descarboxilado se forman aminas alcalinas y el medio revierte a su color purpura original es una reacción positiva (Koneman et al., 1998). Crecimiento en KCN . Utilizado en la diferenciación de bacilos sobre la base de su capacidad de

desarrollarse rápidamente en presencia de cianuro. Se utilizo la base de caldo KCN de Moeller adicionado una solución al 1% de TTC para facilitar la observación del desarrollo bacteriano, se inocula el caldo y se incuba a 35°C durante 24-48 horas, en caso positivo el caldo obtiene un color rosa, que comprueba la capacidad del microorganismo de desarrollarse en presencia de KCN (Cowan y Stell´s 1993, Cullimure, 2000).  Prueba de fermentación de hidratos de carbono .  La

fermentación es un proceso metabólico

anaerobio de oxidación-reducción, en el cual un sustrato orgánico actúa como un aceptor final de hidrógeno (aceptor de electrones), en lugar de oxígeno, la fermentación de sustratos orgánicos como los hidratos de carbono y alcoholes da por resultados productos finales reducidos y oxidados. El medio base liquido estándar con rojo fenol como indicador fue el empleado, en esta prueba se utilizaron distintos azúcares y alcoholes (Sacarosa, Dulcitol, Sorbitol, Lactosa, Celobiosa, Inositol, Maltosa, Manitol, Trehalosa, D-xilosa), el medio es inoculado con el microorganismo, se incuba a 35°C durante 18 a 24 h, las reacciones son; positiva el medio vira a un color amarillo, negativo cuando se presenta un color rosa rojizo esto quiere decir que las peptonas son utilizadas con la resultante alcalinidad (MacFaddin, 2003).  Prueba de Licuefacción de gelatina a 22°C.

Determina la capacidad de un microorganismo de

producir enzimas de tipo proteolítico (gelatinasas) que licúan/hidrolizan la gelatina o muestran cambios característicos debido a los productos de degradación. La producción de gelatinasa se

46

usa como ayuda taxonómica para la identificación y la clasificación de bacterias fermentadoras y no fermentadoras. El medio de gelatina nutriente en placa fue el que se empleó, la inoculación fue por estría, se incubo a 22°C de 18 a 24 horas, la licuefacción se presenta como una turbidez en la zona alrededor del desarrollo, el resto del medio permanece límpido, el resultado positivo muestra un precipitado de color blanco lechoso, el halo es de 3 a 6 mm de ancho (MacFaddin, 2003).

5.12.- Caracterización química y bioquímica para no fermentadores Las bacterias no fermentadoras se les realizó las Pruebas en Agar con hierro de Kligler (KIA)/ Triple azúcar y hierro (TSI) para asegurar que estas cepas no son fermentadoras, ya que al ser oxidativas estas bacterias no pueden obtener sus nutrientes a partir de los hidratos de carbono de manera fermentativa, entonces, dependen de la peptona del medio, por lo cual producen dos reacciones ya sea en medio KIA/TSI, alcalino/alcalino o alcalino/ sin cambios, así como la prueba de RM/VP se realizaron obteniendo resultados negativos, característico de este grupo de microorganismos. Además se utilizó el medio Agar diferencial de Sellers para estudiar determinadas características bioquímicas útiles en la identificación de bacilos Gram negativos no fermentadores, el medio de Sellers se siembra por picadura hasta el fondo del tubo y por estría en la superficie, se incuba durante 24 horas a 35°C y se observa el color de la superficie, color del fondo, color de la banda, fluorescencia en la superficie, gas nitrógeno (MacFaddin, 2003)

Pruebas diferenciales para la determinación de Pseudomonas Crecimiento en Agar PIA Pseudomonas ,

(Pseudomonas   Isolation Agar): Utilizado para el aislamiento de

se sembró en placa las bacterias caracterizadas como no fermentadoras para

diferenciar las cepas que pertenecen al grupo de las Pseudomonas y a las que pertencen a otros géneros no fermentadores que no crecen en este medio.  Prueba de Indol : Se utilizó el mismo medio utilizado para  Enterobacterias  a diferencia de que

el

reactivo no fue el de Kovacs, sino el reactivo de Ehrlich, ya que este es más sensible para probar bacilos no fermentadores ya que tienen un producción mínima de Indol (MacFaddin, 2003) 47

Producción de pigmento piocianina en

Agar Miuller-Hington a 22°C: Las cepas bacterianas

caracterizadas como Pseudomonas   fueron crecidas en este medio para poder diferencia si producían el pigmento piocianina, se incubo a 22°C durante 48 horas (Merino, 2007).  Descarboxilasas(lisina y ornitina):  

Determina la capacidad de un microorganismo de

descarboxilar un aminoácido para formar una amina con la resultante alcalinidad; se decidió utilizar para la prueba de Ornitina descarboxilasa el método de Fay y Barry, este medio de descarboxilasa está modificado es decir “sin glucosa”, la inoculación es a partir de un cultivo puro de 18 a 24 h, los tubos inoculados son cubiertos con parafina estéril, se incuba a 37°C durante 2-4 h, una interpretación positiva se determina por el color purpura y un resultado negativo por un color amarillo. Para el caso de lisina descarboxilasa se utilizó el Método de Brooker, Lund y Blazevic, la inoculación es de una ansada densa en el medio, se cubre de parafina y se incubaron a 35°C durante 4 h, un resultado positivo se interpreta por un color verde o azul y un resultado negativo por la presencia de un color amarillo. Estos métodos son recomendados para la identificación de no fermentadores, ya que son más sensibles que el medio de Falkow (MacFaddin, 2003).  Arginina dihidrolasa :

Para detectar la presencia de arginina dihidrolasa se empleó el caldo

para arginina descarboxilasa de Falkow, pero para determinar la arginina dihidrolasa se necesita agregar el reactivo de Nessler, después de agregarlo vira el medio a un color castaño e indica que la degradación de la arginina se llevó a cabo por el sistema de arginina dihidrolasa (Cowan y Steel´s, 1993).  Prueba de Oxido-Fermentación : Es

el mismo medio realizado para las pruebas preliminares, la

diferencia son los azúcares utilizados, los cuales fueron: sacarosa, lactosa, maltosa, xilosa, manitol, inositol y trehalosa.  Reducción de nitratos y desnitrificación de nitratos y nitritos, utilización de citrato, prueba de ureasa, crecimiento en KCN, prueba de licuefacción de gelatina a 22°C:

48

Igualmente se

emplearon

los medios ya descritos en la sección de pruebas diferenciales para

 Enterobacteriaceae.

 Prueba de hidrólisis de almidón:  Determina la

capacidad de un microorganismo de hidrolizar el

almidón por medios enzimáticos, el medio para almidón empleado fue en la variante de caldo; el caldo inoculado es incubado a 35°C durante 24 h o hasta que ocurra suficiente desarrollo, después se agrega el reactivo Yodo acuoso de Lugol para poder interpretar, y se registran los resultados inmediatamente, un resultado positivo es representado por la ausencia de color, esto significa que el almidón ha sido hidrolizado a glucosa con ácidos, si se presenta un color azul en el medio es negativo, es decir, el almidón no es hidrolizado (MacFaddin, 2003). Crecimiento a 5°C y 42°C:

El medio TSA fue inoculado, e incubado a temperaturas de 5°C y 42°

C para observar si hay crecimiento de los microorganismos catalogados como Pseudomonas a estas temperaturas, ya que esto ayuda a la identificación de especies de este grupo (Pichardo et al., 1981).

 Agar base sangre: Es una

combinación de un agar base (agar nutritivo) con el agregado de 5 %

de sangre humana, el agar sangre aporta muchos factores de enriquecimiento, se usa también para ver la capacidad hemolítica de los microorganismos patógenos (que es un factor de virulencia).

Pruebas diferenciales para la especie Shewanella putrefaciens . Se realizaron las pruebas de Indol, reducción de nitratos, desnitrificación, descarboxilasas (lisina, ornitina), ureasa, prueba de Oxidativa-Fermentativa (xilosa, manitol, lactosa, sacarosa, maltosa), se emplearon los mismos medios para estas pruebas ya explicados anteriormente.

Pruebas diferenciales para la familia Alcaligeneceae Las pruebas realizadas fueron reducción de nitratos, desnitrificación de nitratos, licuefacción de gelatina a 22°C, prueba Oxidativa- Fermentativa a partir de manitol, xilosa.

49

VI.- RESULTADOS

6.1.- Aislamiento de cepas bacterianas Un total de 70 cepas bacterianas Gram negativas fueron aisladas de los cultivos, de las cuales 30 cepas fueron aisladas de  Musa paradisiaca, 15 cepas de Saccharum officinarum, 12 cepas de  Lycopersicon esculentum, 11 cepas de Citrullus lanatus y sólo 2 cepas  Nicotina tacabum L. (Fig.

11, 12).

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Figura 11.-La gráfica muestra el número de aislados bacterianos de los diferentes cultivos de donde se obtuvieron las cepas bacterianas.

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Figura 12.- Distribución porcentual de cepas bacterianas aisladas de los cultivos de  Musa paradisiaca, Saccharum officinarum , Lycopersicon esculentum, Citrullus lanatus y Nicotina tacabum L.

50

Las 70 cepas bacterianas aisladas fueron utilizadas en el proceso para determinar si producen poli-β-hidroxialcanoatos (PHAs) conforme al método espectrofotométrico de Law y Slepecky (1961) modificado por Martínez et al., 2004 (Anexo I) de las cuales sólo 20 cepas bacterianas se seleccionaron por presentar valores óptimos en cuanto a la lectura en el espectrofotómetro UV/VIS para producir PHAs, los resultados de la selección fue: 8 cepas bacterianas del cultivo de  Musa paradisiaca;

del cultivo de Saccharum officinarum  6 cepas fueron elegidas, para el cultivo

de  Lycopersicon esculentum  se seleccionaron 3 cepas, de Citrullus lanatus también se seleccionaron 3 cepas y en el caso de las cepas aisladas del cultivo de  Nicotina tacabum L . no se seleccionó ninguna cepa ya que los valores de producción resultaron muy bajos (Tabla 11 y Tabla 12). Tabla 11: Número de cepas bacterianas seleccionadas de cada cultivo.

Cultivo al que pertenecen los

Número de cepas

Número de cepas aisladas

aislados bacterianos

bacterianas aisladas de

que producen PHAs

los cultivos

considerablemente

 Musa paradisiaca

30

8

Saccharum officinarum

15

6

 Lycopersicon esculentum

12

3

Citrullus lanatus

11

2

 Nicotina tacabum L.

2

0

Tabla 12: Las 20 cepas seleccionadas de los cultivos, elegidas por sus valores óptimos en cuanto a la lectura en el espectrofotómetro UV/VIS a 214 nm (las cepas aisladas de S. offisanarum sombreadas en morado , L. esculentum en rosa , M. paradisiaca en azul y C. lanatus en verde)

Cepa

Dilución

IIBUV-ESP1

Lectura a

Lectura a

214nm (24 h)

214nm(48h)

.422

.989 .995

IIBUV-ESP2

1:10

1.036

3

1:20

.825

IIBUV-ESP

Dilución

1:20

.847

Dilución

Lectura a 214 nm( 72h)

1:100

.028 .750

1:10

.622

51

IIBUV-ESP

4

IIBUV-ESP

5

1:20

IIBUV-ESP  6 IIBUV-ELP 25

1:10

IIBUV-ELP 26 IIBUV-ELP 27

1:10

.952

1:10

.465

1:10

.677

.670

1:20

.757

1:20

.521

.655

1:10

.359

1:10

.588

.677

1:100

.106

1:100

.123

.597

.991

.813

.080

.672

.882

IIBUV-EMP28

.993

1:20

.897

1:20

.718

IIBUV-EMP 29

.345

1:20

.453

1:20

.548

.894

1:20

.720

1:10

1.004

IIBUV-EMP 30

1:20

IIBUV-EMP 52

.530

.532

.625

IIBUV-EMP 53

.383

.592

.598

IIBUV-EMP 54

.535

IIBUV-EMP 56

.993

1.078

IIBUV-EMP 57

.561

.736

1:10

.308

IIBUV-ECP 58

.990

1:10

.151

1:10

.288

1:10

.255

1:10

.486

.598

1:10

.698

IIBUV-ECP 60

1:10

.156

IIBUV-ECP 61

1:10

.120

1:10

.085

1:10

.416 .730

De acuerdo a estos resultados, el cultivo de S. officinarum,  fue de donde se obtuvo el mayor porcentaje de aislamiento bacteriano, es decir, el 40% del total de las cepas fueron seleccionadas. En cuanto a las cepas elegidas de  M. paradisiaca equivalen a un 26.66%, en el caso de  L. esculentum un

25% de los aislados fueron seleccionados, para C. lanatus solo el 18.18% fueron

elegidas y como se menciono anteriormente en el caso de  N. tabacum no se selecciono ninguna cepa debido a sus bajos niveles (Fig.13).

52

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Figura 13.- Porcentaje de aislamiento de cepas bacterianas de cada cultivo

6.2.- Caracterización química y bioquímica de las cepas

productoras de PHAs y

cuantificación de PHAs

Se

realizó la caracterizaci caracterización ón química y bioquímicament bioquímicamentee de las cepas seleccionada seleccionadass y los

resultados son: Las cepas caracterizadas de S. officinarum  fueron identificadas como Shewanella putrefaciens, Pseudomonas

pseudomallei,

Enterobacter

hormaechei,  Alcaligenes  spp.,

Pseudomonas

aeruginosa y Enterobacter spp.; para el caso de  L. esculentum es culentum las cepas aisladas corresponden a  Enterobacter  

spp.,

Shewanella

putrefaciens,

correspondientes a  Musa paradisiaca fueron

Enterobacter

hormaechei:

las

cepas

Pseudomonas cepacia, Enterobacter   spp.,

 Alcaligenes latus, Citrobacter   sp.,  Alcaligenes  spp., Citrobacter   spp., Pseudomona aeruginosa,  Enterobacter aerogenes a erogenes y por último las cepas identificada identificadass para C. lanatus fueron  Alcaligenes desnitrificans,  Enterobacter hormaechei y  Enterobacter gergoviae (Tabla 13) (Fig. 15, 16,17,

18).

53

Tabla 13: Cepa bacterianas bacterianas identificadas identificadas como productoras productoras de PHAs Tipo de cultivo

Clasificación Clasificación de la cepa

Cepas bacterianas productoras de PHAs

S. officinarum o fficinarum

 L. esculentum

 M. paradisiaca

C. lanatus

54

IIBUV-ESP1

Shewanella putrefaciens

IIBUV-ESP2

Pseudomonas pseudomallei

IIBUV-ESP 3

 Enterobacter hormaechei,

IIBUV-ESP 4

 Alcaligenes spp.

IIBUV-ESP 5

Pseudomonas aeruginosa,

IIBUV-ELP 6

 Enterobacter  spp.

IIBUV-ELP IIBUV-ELP 25

P. pseudomallei.

IIBUV-ELP IIBUV-ELP 26

Shewanella putrefaciens,

IIBUV-ELP IIBUV-ELP 27

 E. hormaechei

IIBUV-EMP 28

Pseudomonas cepacia,

IIBUV-EMP 29

 Enterobacter  spp.

IIBUV-EMP 30

 Alcaligenes latus, latus,

IIBUV-EMP 52

 spp. Citrobacter  spp.

IIBUV-EMP 53

 Alcaligenes spp.

IIBUV-EMP 54

Citrobacter spp.

IIBUV-EMP 56

Pseudomonas aeruginosa,

IIBUV-EMP 57

 Enterobacter aerogenes

IIBUV-ECP 58

 Alcaligenes desnitrificans, desnitrificans,

IIBUV-ECP 60

 Enterobacter hormaechei

IIBUV-ECP 61

 Enterobacter gergoviae

a

a) Tubo no inoculado

b

+ Movilidad

c

b) Reacción positiva a la prueba de catalasa

c) Prueba de oxidasa: izquierda reacción negativa, derecha positiva

Figura 15.- Pruebas básicas básicas realizadas a las cepas bacterianas; a) Prueba de movilidad, b) prueba de catalasa, catalasa, c) prueba de oxidasa

a

b

c

Figura 16.- a) Prueba de Indol, el primer tubo es un reacción negativa, fue observado en todas las cepas caracterizadas, caracterizadas, el segundo tubo reacción positiva característica de  E. coli que fue fue seleccionado seleccionado como como control control positivo b) Prueba RM el primer tubo muestra una reacción positiva característico de algunos organismos fermentadores, fermentadores, el segundo tubo es reacción n egativa característica característica de organismos no fermentadores fermentadores c) Prueba VP, en el primer tubo reacción positiva, la reacción negativa se puede apreciar en el segundo tubo característico de organismos no fermentadores. fermentadores.

55

H2S

Figura 17.- Es un tubo de TSI, donde se puede observar claramente la producción de H2S; una característica fundamental para identificar a Shewanella putrefaciens, además se observa la reacción Alc/Alc característico de un organismo no fermentador a 24 h de incubación a 35°C.

C

a

b

-

-

+

c

Figura 18: a) Placa de Miuller-Hington, se puede apreciar el pigmento piocianina producido por P. aeuroginosa , b) Placa de Agar sangre , se observa la pigmentación amarilla de las colonias pertenecientes a P. cepacia, c) Prueba de

acides de hidratos de carbono y alcoholes de P. cepacia

56

6.3.- Concentración de PHAs de las cepas aisladas de Saccharum officinarum Los resultados obtenidos, en cuanto a la producción de PHAs, de las cepas aisladas de officinarum  determinados

S.

con la ayuda de la curva patrón nos permite observar que, la cepa

IIBUV-ESP3 identificada como  E. hormaechei presenta la mayor concentración de PHAs dentro de este grupo, siendo constante durante las primeras 48 horas, al cabo de las 72 horas desciende la concentración, sin embargo es una concentración óptima comparándolas con las otras cepas aisladas de este cultivo, los géneros P. aeruginosa. y  Alcaligenes  spp. también presentan concentraciones aceptables de PHAs pero estos valores están por debajo de los observados en  E. hormaechei .

En cuanto a P. pseudomallei es hasta las 72 horas cuando se presenta una

concentración relativamente alta y por último S. putrefaciens  que presentó muy baja concentración de PHA durante las 72 horas (Tabla 14) Tabla 14: Concentración de PHAs de las cepas bacterianas aisladas de Saccharum officinarum

Cepa

IIBUV-ESP1

Género/ especie S.

Concentración final de PHAs a

Concentración final de PHAs a

Concentración final de PHAs a

las 24h (µg/µl)

las 48h (µg/µl)

las 72 h (µg/µl)

3.2

8.54

8.8

86

8.55

8.15

166

167

76

8.5

39

80.8

80.7

40.0

45

8.0

26

70.5

 putrefaciens

IIBUV-ESP2

P.  pseudomallei

IIBUV-ESP3

 E. hormaechei

IIBUV-ESP4

 Alcaligenes

spp . IIBUV-ESP5

P. aeruginosa

IIBUV-ESP6

 Enterobacter sp.

57

6.4.- Concentración de PHAs de las cepas aisladas de Musa paradisiaca En este cultivo la cepa aislada que produce considerablemente mayor cantidad de PHAs es  Alcaliges latus,

seguida de Pseudomona cepacia, en esta la mayor producción de PHAs fue a

partir de las 48 horas al contrario de  Alcaligenes latus que a las 24 horas presentó una concentración elevada, otra de las cepas que presento una concentración alta es  Enterobacter  spp., sin embargo fue hasta las 72 horas de cultivo; en el caso de  Alcaligenes spp., Citrobacter  spp. y  Enterobacter aerogenes los niveles de concentración son muy bajos en comparación con las cepas ya mencionadas (Tabla 15). Tabla 15: Concentración de PHAs de las cepas bacterianas aisladas de Musa paradisiaca

Cepa

Género/especie

Concentración

Concentración

Concentración

final de PHAs a fina de PHAs a final de PHAs a IIBUV-

las 24h (µg/µl)

las 48h (µg/µl)

las 72 h (µg/µl)

8.54

168

162

2.55

75

121

167.8

163

85.8

spp .

5.45

5.50

7.70

 Alcaligenes spp.

2.8

7.15

7.25

Citrobacter spp.

5.75

8.5

31

P. aeruginosa

8.56

8.62

8.15

 E. aerogenes

4.45

8.18

23.5

P. cepacia

EMP28 IIBUV-  Enterobacter spp . EMP29 IIBUV-

 A.

latus

EMP30 IIBUV-

Citrobacter

EMP52 IIBUVEMP53 IIBUVEMP54 IIBUVEMP56 IIBUVEMP57

58

6.5.- Concentración de PHAs de cepas aisladas del cultivo de Lycopersicum esculentum La cepa con mayor concentración de PHAs para este cultivo fue P. pseudomallei, pero fue hasta las 72 horas de cultivo, al contrario de cepas encontradas en otros cultivos que presentaron concentraciones considerables a partir de las 24 h de cultivo, como fue el caso de  E. hormaechei aislada de S. officinarum  , además podemos observar que esta cepa fue aislada de este cultivo, pero presentando muy bajas concentraciones de PHA en comparación a la cepa aislada de S. officinarum.

En cuanto S. putrefaciens las concentraciones de PHAs son muy bajas, esto también

es observado en la cepa aislada de S. officinarum (Tabla 16). Tabla 16: Concentración de PHAs de las cepas bacterianas aisladas de Lycopersicum esculentum

Cepa Género/especie Concentración Concentración Concentración final de PHAs a final de PHAs a final de PHAs a las 24h (µg/µl) las 48h (µg/µl) las 72 h (µg/µl) IIBUV- P. pseudomallei

8.5

20.5

42.5

7.20

8.52

8.25

.8

8.08

8.39

ELP25 IIBUV-

S. putrefaciens

ELP26 IIBUV-  E. hormaechei ELP27

6.6.- Concentración de PHAs de cepas aisladas del cultivo de Citrullus lanatus La cepa con mayor concentración de PHA en este cultivo fue  Enterobacter hormaechei, otra cepa identificada como  Enterobacter gergovice  también produce PHAs pero no en la proporción de  E. hormaechei ,

ya que la concentración mayor se observa hasta las 72 horas y en el caso de  A.

desnitrificans  es la cepa

con menor concentración de PHAs (Tabla 17).

59

Tabla 17.- Concentración de PHAs de cepas bacterianas aisladas del cultivo de Citrullus lanatus

Cepa

Género/especie Concentración Concentración Concentración final de PHAs final de PHAs final de PHAs

IIBUV-ECP58

 Alcaligenes

a las 24h

a las 48h

a las 72 h

(µg/µl)

(µg/µl)

(µg/µl)

8.45

7.5

22.5

denitrificans

IIBUV-EMC60

 E. hormaechei

161

164

99.0

IIBUV-EMC61

 E. gergoviae

4.5

7.25

80.9

6.7.- Curvas de crecimiento de cepas productoras de PHAs

Se realizaron las curvas de crecimiento a 14 cepas elegidas aleatoriamente del total de cepas bacterianas seleccionadas durante un periodo de 108 horas a una temperatura de 28°C a 30°C. Las cepas bacterianas son:  E. gergoviae (IIBUV-ECP61),  E. hormaechei (IIBUV-ECP60), Citrobacter  

spp. (IIBUV-EMP54),  E. aerogenes (IIBUV-EMP57), P. pseudomallei (IIBUV-

ELP25),  E. hormaechei (IIBUV-ELP27), P. aeruginosa (IIBUV-ESP5),  Enterobacter spp. (IIBUV-ESP6),  E. hormaechei (IIBUV-ESP3), S. putrefaciens (IIBUV-ESP1) , P. cepacia (IIBUV-EMP

28),  Alcaligenes  spp. (IIBUV-EMP53),  P. pseudomallei (IIBUV-ESP2) y

 Alcaligenes latus (IIBUV-EMP30).

Los resultados obtenidos nos mostraron que durante la fase exponencial,  E. gergovice (IIBUVECP61), presentó las menores concentraciones, es decir, de 4.5µg/µl a las 24 h, y de 7.25 µg/µl a las 48 h de cultivo y al momento de iniciar la fase estacionaria aumentó la concentración de PHA a 80.9µg/µl a las 72 h (Fig.19).

60

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Figura 19.- Curva de crecimiento de E. gergoviae (IIBUV-ECP61) aislada de Citrullus lanatus.

Por otro lado,  E. hormaechei (IIBUV-ECP 60) presentó una concentración de 161 µg/µl de PHAs a las 24 h y de 164 µg/µl a las 48 h durante la fase estacionaria, a las 72 h inicio la fase de muerte y con ello una disminución en la concentración, obteniendo sólo 99 µg/µl (Fig. 20)

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Figura 20.- Curva de crecimiento de E. hormaechei (IIBUV-ECP60), aislada del cultivo de Citrullus lanatus.

61

La cepa identificada como Citrobacter  spp. (IIBUV-EMP54),

almacena PHAs en una

concentración de 31 µg/µl a las 72 h en su fase estacionaria, en cambio durante la fase exponencial las concentraciones son muy bajas (Fig. 21). Al igual que en Citrobacter spp ., para E. aerogenes  (IIBUV-EMP57) su mayor concentración de PHAs es a las 72 h durante fase estacionaria, sin embargo es menor la acumulación de PHAs en esta cepa (Fig. 22).

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Figura 21.- Curva de crecimiento de la cepa identificada como Citrobacter spp. (IIBUV-EMP54), aislada del cultivo de Musa paradisiaca.

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Figura 22.- Curva de crecimiento de E. aerogenes (IIBUV-EMP57) aislada del cultivo de Musa paradisiaca.

62

Interesantemente P. pseudomallei (IIBUV-ELP25), presentó una concentración superior de PHAs de 85 µg/µl durante fase de no crecimiento a las 24h, sin embargo a las 72 h vuelve a aumentar tanto la concentración celular y como de PHAs, después de este período inicia fase de muerte, pero esta concentración es baja en comparación a la obtenida a las 24h (Fig.23). ��� �������

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Figura 23.- Curva de crecimiento de P. p seudomallei (IIBUV-ELP25), aislada del cultivo de  Lycopersicum esculentum.

Para  E. hormaechei (IIBUV-ELP27) aislada de  L. esculentum y al igual que P. pseudomallei , su mayor concentración de PHAs es de 8.39 µg/µl y ocurre durante la misma fase, sin embargo esta es muy baja (Fig. 24), destaca el hecho de que en  E. hormaechei la fase estacionara inicia hasta las 72 h, además de que también fue aislada de C. lanatus, no obstante, la cepa asilada de C. lanatus

presenta concentraciones muy favorables y altas durante las 72 h (Fig. 20), en

comparación con la cepa aislada de  L. esculentum.

63

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Figura 24.- Curva de Crecimiento de  E. hormaechei (IIBUV-ELP27), aislada de L. esculentum.

Los datos correspondientes a P. aeruginosa (IIBUV-ESP5), es que su mayor concentración de PHAs es de 80.7 µg/µl a las 24h fase estacionaria, presentando menores concentraciones en las posteriores horas, además podemos observar que a las 48 h entra en fase de muerte, pero a las 72 h vuelve aumentar un poco la concentración de PHAsy celular comparando con la concentración obtenida a las 48 h (Fig. 25) esto también fue observado en P. pseudomallei  (IIBUV-ELP25), aislada de L. esculentum  (Fig. 23).

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Figura 25.- Curva de crecimiento de Pseudomona aeruginosa (IIBUV-ESP5), aislada de Saccharum officinarum , además podemos observar las concentraciones de PHAs obtenidas a las 2 4, 48 y 72 horas.

64

Concerniente a  Enterobacter   spp. (IIBUV-ESP6), se puede observar que la mayor concentración de PHAs es a las 72 h de cultivo en fase estacionaria, y las menores concentraciones es durante la fase exponencial (Fig. 26)

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Figura 26.- Curva de crecimiento de E. spp. (IIBUV-ESP6) aislada del cultivo de Saccharum officinarum. En el caso de  E. hormaechei  (IIBUV-ESP3) también inicia la fase estacionaria a las 24h y termina después de las 48 h, durante esta fase, se obtuvieron las mayores concentraciones, con lo cual podemos mencionar que  E. hormaechei  acumula PHAs considerablemente (Fig. 27). Además esta cepa aislada de S. officinarum también presenta concentraciones óptimas en comparación con la cepa obtenida de C. lanatus  identificada también como  E. hormaechei (IIBUV-ECP60) (Fig. 20).

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Figura 27.- Curva de crecimiento de E. hormaechei (IIBUV-ESP3) aislada del cultivo de Saccharum officinarum.

65

Otra de las cepas a las que también se realizó su curva de crecimiento fue S. putrefaciens (IIBUV-ESP1), que al igual que las cepas anteriores, su mayor concentraciones de PHAs fue durante la fase estacionaria hasta las 72 h (Fig.28), sin embargo las concentraciones obtenidas, al igual que en  E. hormaechei aislada de L. esculentum son de las más bajas.

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Figura 28.- Curva de crecimiento de la cepa S. putrefaciens (IIBUV-ESP1), aislada del cultivo de S. officinarum

Las siguientes cepas se diferencian de las anteriores debido a que las concentraciones de PHAs más altas son durante la fase exponencial, es el caso de P. cepacia (IIBUV-EMP 28) quien presentó la mayor concentración de PHAs a las 48 h fue de 168 µg/µl, sin embargo también presentó una buena concentración a las 72 h de cultivo, momento en que entra en fase estacionaria (Fig. 29).

66

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Figura 29.- Curva de crecimiento de la cepa identificada como P. cepacia (IIBUV-EMP 28) aislada de  Musa  paradisiaca

 Alcaligenes

spp. (IIBUV-EMP53), presentó su mayor concentración a las 24h fase exponencial

pero tan sólo es de 24µg/µ l, en las siguientes horas descendió la concentración (Fig. 30) ��� ���������

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Figura 30.- Curva de crecimiento de Alcaligenes spp. (IIBUV-EMP53), aislada del cultivo de Musa paradisiaca

67

P. pseudomallei (IIBUV-ESP2) presenta su mayor concentración a las 24 h durante fase

exponencial y durante las 48 h siguientes la concentración descendió (Fig. 31).

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Figura 31.- Curva de crecimiento de la cep a bacteriana identificada como P. pseudomallei (IIBUV-ESP2), aislada del cultivo de Saccharum officinarum .

Por último,  Alcaligenes latus presentó las mayores concentraciones de PHAs durante la fase exponencial, ya que al iniciar la fase estacionaria a las 72 h, los niveles de PHAs descendieron hasta en 50% (Fig. 32).

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Figura 32.- Curva de crecimiento de la cep a A. latus (IIBUV-EMP30) , aislada del cultivo de Musa paradisiaca

68

En la tabla 18 se muestran las cepas con mayor producción de PHAs para cada cultivo, en la tabla 19 se muestran las cepas a las que se les realizó la curva de crecimiento con las mejores concentraciones de PHA, conforme a la etapa y tiempo de producción de PHA si se comparan con las 13 cepas no seleccionadas por presentar menores concentraciones de PHAs (Anexo1, Tabla 20) Tabla 18: Cepas con mayor producción de PHAs de cada cultivo Cultivo

Cepas con mejores concentraciones de PHA

S. officinarum

E. hormaechei, E. spp. P.  pseudomallei, E. aeruginosa

 L. esculentum

P. pseudomallei

C. lanatus

E. hormaechei, E. gergoviae

 M. paradisiaca

A. lanatus, P. cepacia, C . spp.

Tabla 19: Cepas seleccionadas como mejores productoras, analizando su producción y curva de crecimiento

Cepa seleccionada

Concentraciones de PHA durante las 72 h (µg/µl)

Fase de crecimiento con mayor [ PHA]

Cultivo

P. aeruginosa

80.7,40, 45

estacionaria

S. officinarum

 E. hormaechei

166,167,76

estacionaria

S. officinarum

P. pseudomallei

86.8.55,8.15

exponencial

S. officinarum

P. pseudomallei

85,20.5,42.5

estacionaria

 L. esculentum

 E. hormaechei P. cepacia

161,164,99 8.54, 168, 162

estacionaria exponencial

C. lanatus  M. paradisiaca

 A.latus

167.8, 163, 85.8

exponencial

 M. paradisiaca

69

6.8.- Evaluación

cualitativa de la acumulación de poli- β-hidroxialcanoatos (PHAs)

mediante la técnica de tinción lipofílica con Negro Sudán B

Se logró visualizar los gránulos de PHAs de las 20 cepas seleccionadas que presentaron valores óptimos de concentración, con lo cual se confirma uno de los objetivos de este trabajo, que fue aislar cepas bacterianas capaces de producir poli- β- hidroxialcanoatos. Las cepas en que se observaron más gránulos fueron  A. latus y  E. hormaechei  aisladas tanto de los cultivo de Saccharum officinarum y Citrullus lanatus, P. pseudomallei, P. cepacia, y P. aeruginosa (Fig.

32, Fig. 33).

Gránulos PHA

Figura 33: Tinción lipofílica con Sudán negro. Se observan gránulos PHA a un aumento de 100X, en la cepa bacteriana P. cepacia en un cultivo de 24 hrs.

70

Gránulos PHA

Figura 34: Tinción lipofílica con Sudán negro, se observan g ránulos PHA a un aumento de 10 0 x, en la cepa bacteriana Enterobacter hormaechei en un cultivo de 72 hrs.

71

VII.- DISCUSIÓN De acuerdo a los conceptos vertidos por Wang y Lee (1997), quien considera a los Poli- βhidroxialcanoatos producidos por bacterias como buenos candidatos para reemplazar los plásticos obtenidos de hidrocarburos y debido a que los PHAs poseen propiedades similares a los plásticos convencionales y que tienen la propiedad de ser completamente biodegradables y como Page y colaboradores (1997) que establecieron que los biopolímeros producidos por diferentes microorganismos tienen amplia importancia en

diversas áreas de la ciencia, (economía,

agricultura, etc.), así, los datos obtenidos en este estudio cobran relevancia en cuanto a la caracterización química y bioquímica de las cepas bacterianas capaces de producir PHAs. De un total de 70 cepas aisladas y estudiadas, de las especies vegetales   M. paradisiaca, S. officinarum, L. esculentum C. lanatus;

se seleccionaron 20 aislados bacterianos por presentar las

mayores lecturas en el espectrofotómetro UV/VIS, determinando los siguientes géneros y especies:  Pseudomonas cepacia ( IIBUV-EMP28) , Enterobacter   spp. (IIBUV-EMP29),  Alcaligenes latus (IIBUV-EMP30), Citrobacter   spp.

(IIBUV-EMP52),  Alcaligenes spp. (IIBUV-

EMP53), Citrobacter spp. (IIBUV-EMP54), Pseudomonas aeruginosa   (IIBUV-EMP56) ,  Enterobacter

aerogenes  

Pseudomonas

pseudomallei  

 Alcaligenes   spp.

(IIBUV-EMP57),

Shewanella

(IIBUV-ESP2),  Enterobacter

putrefaciens  

(IIBUV-ESP1),

hormaechei  

(IIBUV-ESP3) ,

(IIBUV-ESP4)  Pseudomonas aeruginosa   (IIBUV-ESP5),  Enterobacter   spp.

(IIBUV-ELP6), P. pseudomallei . (IIBUV-ELP25 ), Shewanella putrefaciens   (IIBUV-ELP26), E. hormaechei  

(IIBUV-ELP27),   Alcaligenes desnitrificans ( IIBUV-ECP 58) , Enterobacter

hormaechei  (IIBUV-ECP60),  y Enterobacter gergoviae (IIBUV-ECP 61).

Aun cuando Moreno y colaboradores (2007) mencionan que no se ha reportado que la Familia  Enterobacteriaceae

sea acumuladora de PHAs, estudios realizados por Arshad y colaboradores

(2007) mostraron recientemente la caracterización bioquímica de cepas productoras de PHA pertenecientes a los géneros Citrobacter y  Enterobacter , lo cual viene a ser confirmado por nuestros resultados al demostrar la producción de PHA en especies de los géneros  Enterobacter , Citrobacter ,

esto cobra relevancia y sustenta los resultados obtenidos en este estudio referente a

estos géneros, como productoras de PHAs;

72

En cuanto a las especies pertenecientes al género Pseudomonas aisladas en este estudio se pudo confirmar que pueden producir PHAs en medios de cultivo conteniendo sacarosa, lo cual es apoyado por Madison y Huisman (1999) ya que ellos señalan que las Pseudomonas  son capaces de convertir Acetil-CoA a monómeros de cadena de longitud media para la síntesis de PHA, con la única excepción de P. oleovorans, que presenta la incapacidad para sintetizar PHAs a partir de azúcares, además indican que los PHAs formados a partir de azúcares, como es el caso de la sacarosa, fuente de carbono utilizada en este estudio, tienen una composición diferente de los PHAs formados a partir de ácidos grasos, pero son igual de eficientes; mientras que los PHAs obtenido de ácidos grasos tienen 3-hidroxioctanoato como el componente principal. En este contexto, en los PHAs obtenidos a partir de azucares el monómero principal es 3hidroxidecanoato, además algunas Pseudomonas spp. pueden incorporar tanto monómeros de PHAs-ssc como PHAs-mss en la misma cadena polimérica. Normalmente, estos PHAs se forman cuando estas cepas son cultivadas con una fuente de carbono no relacionada, como son los carbohidratos, en el caso de este tipo de PHAs mezclados, se ha demostrado que el resultado final es la acumulación individual de gránulos compuestos de P (3HB) y otros tipos de PHAs, por tanto las Pseudomonas  aisladas en esta investigación resultan ser eficientes en la producción de PHAs. Los resultados obtenidos con las cepas  A. latus y  A. spp. coinciden con los reportados por Madison y Huisman (1999), quienes reportan a la especie  Alcaligenes latus como un productor de biopolímeros que se encuentran asociados a su crecimiento. Este comportamiento es fehacientemente observado en las cepas aisladas, ya que se puede observar que la mayor concentración de PHAs es durante la fase exponencial. En cuanto al género  putrefaciens  no

Shewanella

se tienen reportes que señalen a esta como productoras de PHAs; sin embargo

debe mencionarse que esta cepa fue anteriormente clasificada como Pseudomonas putrefaciens según el esquema de   Weaver-Hollis, Koneman y colaboradores (1998), ya que el grupo de las Pseudomonas

son catalogadas como productoras de PHAs, lo que concuerda con los resultados

que se reportan . Con respecto al comportamiento de las cepas aisladas, en cuanto a las concentraciones de PHAs, hay que mencionar que difiere de una especie a otra, este comportamiento es similar al reportado por Mandon y colaboradores (1998), quienes señalan que la acumulación de PHAs en bacterias, en presencia de un exceso de fuente de carbono difiere marcadamente de una especie a otra. Así 73

también se pudo observar que la mayor acumulación de PHA se presenta en algunas cepas bacterianas en fase estacionaria y en otras en fase exponencial; de acuerdo a esto, Rojas y colaboradores (2006) menciona que cuando no existe crecimiento (fase estacionaria) debido a la ausencia total de nitrógeno en el medio, la cantidad de carbono excedente es utilizada en la síntesis de PHAs, esto fue observado en las cepas bacterianas a las que se le determinó su cinética de crecimiento;  E. gergoviae  (IIBUV-ECP61),  E. hormaechei  (IIBUV-ECP60) aisladas de C. lanatus, Citrobacter   spp.

(IIBUV-EMP54),  E. aerogenes  (IIBUV-EMP57) aisladas de  Musa

 paradisiaca , P. pseudomallei  esculentum,

(IIBUV-ELP25),  E. hormaechei  (IIBUV-ELP27) aislada de  L.

y P. aeuroginosa  (IIBUV-ESP5),  E. hormaechei  (IIBUV-ESP3), S. putrefaciens

(IIBUV-ESP1) aisladas de S. officinarum. En el caso de  P. pseudomallei (IIBUV-ELP25)  y P. aeruginosa (IIBUV-ESP5) se pudo observar un crecimiento inestable, en ciclos de incremento y pérdida de PHA, esto también es señalado por estudios realizados por Lasala y colaboradores (2004b) con la cepa  Mezorhizobium plurifarum que establecieron que esto es debido a una oxigenación elevada, que desvía el metabolismo hacia cuotas de respiración más altas, mayor oxidación del sustrato y por tanto menor disponibilidad de Acetil-CoA para la producción de PHAs. Por lo tanto a bajos niveles de oxigenación y exceso de fuente de carbono, el metabolismo energético genera elevadas concentraciones de NADH + y Acetil-CoA que deben ser convertidos en formas osmóticamente neutras que no afecten el balance redox de la célula y esto conlleva a la síntesis de PHAs. En el caso de las cepas que produjeron mayor concentración de PHAs, durante la fase exponencial por ejemplo: P. cepacia  (IIBUV-EMP 28) aislada de  Musa paradisiaca y P.  pseudomallei aislada

de S. officinarum  (IIBUV-ESP2), Durner y colaboradore(2001) y Klinke y

colaboradores (2000) confirmaron lo reportado, es decir, que algunas especies del género Pseudomonas  acumulan

PHAs durante el crecimiento exponencial. Rojas y colaboradores (2006)

explican que en esta fase, la disponibilidad de carbono intracelular se realiza por la ruta metabólica Entner- Doudoroff (EDP), ya que la ruta oxidativa de las pentosas fosfato no está activa y las reacciones para la generación de Ribosa-5-fosfato (R5P) participan de acuerdo al sentido inverso de la ruta de las pentosa fosfato (PP), por este motivo la generación de Fructosa6-fosfato (F6P) se lleva a cabo por la enzima fosfoglucosa isomerasa de la ruta glucolítica para cumplir con los requerimientos de biosíntesis de precursores donde el flujo de Acetil-CoA se dividen en tres fracciones: síntesis del polímero, síntesis de citrato en el TCA y en las rutas 74

anabólicas involucradas en la conversión de precursores a bloques de construcción como aminoácidos, lípidos, etc., que forman las macromoléculas de acuerdo a la composición celular fija. En este esquema la fracción mayor de Acetil-CoA es utilizada para la generación de PHAs, lo cual disminuye el flujo hacia el ciclo TCA y hacia las rutas anabólicas que lo consumen. En cuanto a  Alcaligenes spp . y  A. latus también presentaron la mayor producción durante la fase exponencial, estos resultados concuerdan con lo mencionado por Martínez y colaboradores (2004) para  A. latus ya que según el, las mayoría de la especies bacterianas producen muy poco PHB durante la fase exponencial de crecimiento, con excepción del género ya mencionado, lo que fue confirmado en el presente trabajo, al presentar la mayor producción de PHAs durante esta etapa de crecimiento. Además de otras especies como  Azotobacter vinelandi ,  Azotobacter chrococcum y

algunas Pseudomonas que producen PHAs durante fase exponencial.

Por último, Gómez y colaboradores (1996) validaron la eficiencia de producción de PHAs, por diversas bacterias Gram negativas aisladas de suelo de plantaciones de caña de azúcar, resultados que fueron positivos también para en este estudio, ya que de las 7 cepas seleccionadas que presentaron mayor producción de PHAs, 3 de estas fueron aisladas de plantas de Sacharum officinarum.

75

VIII. CONCLUSIONES

1.

En este trabajo se logró obtener, aislar y purificar géneros y especies bacterianas productoras de PHAs aisladas de Citrullus lanatus, Lycopersicum esculentum, Musa  paradisiaca  y Saccharum officinarum .

2.

La metodología aplicada permitió seleccionar las cepas bacterianas con capacidad de producir PHAs, así como cuantificar la concentración de los mismos para cada aislado.

3.

La aplicación de pruebas químicas y bioquímicas permitieron la caracterización de cepas bacterianas y cuyo comportamiento se desglosa posteriormente.

4.

Los géneros y especies bacterianas aisladas en el presente estudio, pertenecientes a Pseudomonas

y  Alcaligenes presentaron concentraciones óptimas de PHAs, además de

ser bacterias ampliamente estudiadas; con respecto a los géneros y especies aisladas a la Familia  Enterobacteriaceae,  arrojan resultados favorables y novedosos, debido a que existen pocos datos sobre esta familia en cuanto a la producción, esto abre un nuevo campo para estudios futuros sobre este tema. 5.

Se pudo observar que  E. hormaechei aisladas de los cultivos de S. officinarum, C. lanatus, y  L. esculentum,  no acumulan PHAs en la misma concentración durante su curva de crecimiento, mientras que la cepa aislada de  L. esculentum presentó concentraciones muy bajas en comparación con las cepas aisladas de C. lanatus y S. officinarum.

6.

Lo anterior, es debido a que las mayores concentraciones de PHAs en  E. hormaechei aislada de C. lanatus  y S. officinarum, se da por la presión selectiva que enfrenta en su ambiente, causada por el desbalance de la cantidad de carbono/ nitrógeno y por la descomposición de residuos en el suelo, que da como resultado un exceso de carbono y una limitación de nitrógeno.

76

7. Las cepas con mayor concentración son:  Alcaligenes latus aislada de  M. paradisiaca, que presentó mayor concentración de PHAs de las cepas

bacterianas seleccionadas,

obteniendo las mayores concentraciones en fase exponencial de 167. 8 µg/µl y 163 µg/µl durante las primeras 48 h, a las 72 h fase estacionaria acumulando 85.8 µg/µl.  E. hormaechei  aislada de C. lanatus mostro

concentraciones favorables durante las 72 h las

cuales fueron de 161 µg/µl y 164 µg/µl durante fase estacionaria, alcanzando los 99 µg/µl durante fase de muerte.

P. cepacia 

aislada de  M. paradisiaca  mostro PHAs

considerablemente hasta las 48 h con 168 µg/µl y 162 µg/µl en fase exponencial. P.  pseudomallei   aislada

de  L. esculentum logró biosintetizar 85 µg/µl en fase estacionaria,

20.5 µg/µl y 42.5 µg/µl y finalmente P. pseudomallei aislada de S. officinarum  mostró una concentración favorable a las 24 h de 86 µg/µl en fase exponencial. 8. Pseudomonas pseudomallei (IIBUV-ESP2) resultó sensible a la concentración de aeración, ya que presentó disminución y aumento de PHAs durante las 72 h. 9.

La determinación cualitativa mediante la tinción lipofilica con Sudán Negro resultó satisfactoria y permitió demostrar la acumulación de PHAs por las cepas bacterianas en estudio.

10. En general, podemos decir que el porcentaje final de aislamientos bacterianos que presentaron concentraciones de PHAs favorables, son el 10 % de las el 70 cepas aisladas de los Cultivos. 11. Finalmente concluimos que de los 70 aislados bacterianos, 7 aislados son consideradas de amplio aprovechamiento por sus concentraciones y análisis concernientes a curvas de crecimiento, ya que esto nos permitió observar cuales cepas acumulan PHAs en menor tiempo, así como sus altas concentraciones, las cepas son : P. aeruginosa (IIBUV-ESP 5) ,  E. hormaechei 

(IIBUV-ESP 3 ), P. pseudomallei IIBUV-ESP 2) aisladas de S.

officinarum, P. pseudomallei  

(IIBUV-ELP 25) aislada de  L. esculentum, P. cepacia

(IIBUV-EMP 28)y  Alcaligenes latus (IIBUV-EMP 30)y  E. hormaechei  (IIBUV-ECP 60) aislada de C. lanatus. 77

IX.- ANEXOS

Anexo I.- Promedio de la lectura en espectrofotómetro UV/VIS a 214 nm de las 70 cepas bacterianas aisladas

a las cuales se le aplico el método de Law y Slepecky (1961)

modificada por Martínez et al . (2004): Tabla 6: Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotómetro UV/VIS a 214 nm de las 15 cepas bacterianas aisladas Saccharum officinarum, las 6 cepas que obtuvieron las mayores lecturas fueron seleccionas (se encuentran sombreadas) para su determinación cuantitativa y cualitativa en cuanto a producción de PHAs, así como su caracterización química y bioquímica.

Cepas aisladas de

Dilución

Saccharum officinarum

IIBUV-ESP1

P( tubo 1,2,3) a

Dilución P( tubo 1,2,3) a

a 24 horas de

48 horas de

72 horas de

cultivo

cultivo

cultivo

.422

.989 .995

1:100

.028

IIBUV-ESP2

1:10

1.036

IIBUV-ESP 3

1:20

.825

1:20

.847

1:10

.622

.952

1:10

.465

1:10

.677

.677

1:100

.106

1:100

.123

IIBUV-ESP 6

.655

1:10

.359

1:10

.588

IIBUV-ESP 7

.718

.282

.168

IIBUV-ESP 8

.368

.258

.228

IIBUV-ESP 9

.127

.341

.468

IIBUV-ESP 10

.315

.324

.358

IIBUV-ESP 11

.354

.388

.263

IIBUV-ESP 12

.262

.419

.532

IIBUV-ESP 13

.293

.249

.264

IIBUV-ESP 14

.578

.540

.186

IIBUV-ESP 15

.179

.688

.775

IIBUV-ESP 4 IIBUV-ESP 5

78

P( tubo 1,2,3) Dilución

1:10

.750

Tabla 7: Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotómetro UV/VIS a 214 nm de las 12 cepas bacterianas aisladas Lycopersicum esculentum, las 3 cepas que obtuvieron las mayores lecturas fueron seleccionas ( se encuentran sombreadas) para la determinación cuantitativa y cualitativa de PHAs, así como su caracterización química y bioquímica.

Cepas aisladas de

Dilución

P( tubo 1,2,3) Dilución

P( tubo 1,2,3) a

Dilución P( tubo 1,2,3) a

 Lycopersicum

a 24 horas de

48 horas de

72 horas de

esculentum

cultivo

cultivo

cultivo

IIBUV-ELP16

.193

.512

.425

IIBUV-ELP 17

.214

.284

.125

IIBUV-ELP 18

.026

.085

.094

IIBUV-ELP 19

.071

.084

.100

IIBUV-ELP 20

.275

.415

.435

IIBUV-ELP 21

.459

.227

.187

IIBUV-ELP 22

.196

.124

.028

IIBUV-ELP 23

.343

.381

.270

IIBUV-ELP 24

.375

.420

.123

IIBUV-ELP 25

1:20

IIBUV-ELP 26 IIBUV-ELP 27

1:10

.670

1:20

.757

1:20

.521

.597

.991

.813

.080

.672

.882

Tabla 8: Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotómetro UV/VIS a 214 nm de las 30 cepas bacterianas aisladas  Musa paradisiaca, las 8 cepas que obtuvieron las mayores lecturas fueron seleccionas ( sombredas) para determinar cuantitativa y cualitativa la producción de PHAs, así como su caracterización química y bioquímica.

Cepas aisladas de Musa  paradisiaca

Dilución

P( tubo 1,2,3) Dilución P( tubo 1,2,3) a 48 Dilución P( tubo 1,2,3) a a 24 horas de horas de cultivo 72 horas de cultivo

cultivo

IIBUV-EMP28

.993

1:20

.897

1:20

.718

IIBUV-EMP 29

.345

1:20

.453

1:20

.548

79

IIBUV-EMP 30

80

1:20

.894

1:20

.720

1:10

1.004

IIBUV-EMP 31

.093

.078

.130

IIBUV-EMP 32

.537

.567

.617

IIBUV-EMP 33

.315

.404

.095

IIBUV-EMP 34

.912

.462

.493

IIBUV-EMP 35

.039

.339

.443

IIBUV-EMP 36

.356

.184

.137

IIBUV-EMP 37

.693

.275

.105

IIBUV-EMP 38

.584

.401

.632

IIBUV-EMP 39

.241

.212

.312

IIBUV-EMP 40

.565

.161

.086

IIBUV-EMP 41

.512

.075

.118

IIBUV-EMP 42

.212

.214

.320

IIBUV-EMP 43

.400

.170

.121

IIBUV-EMP 44

.404

.228

.430

IIBUV-EMP 45

.459

.132

.301

IIBUV-EMP 46

.282

.107

.100

IIBUV-EMP 47

.614

.154

.569

IIBUV-EMP 48

.705

.169

.222

IIBUV-EMP 49

.811

.221

.334

IIBUV-EMP 50

.643

.309

.559

IIBUV-EMP 51

.415

.414

.316

IIBUV-EMP 52

.530

.532

.625

IIBUV-EMP 53

.383

.592

.598

IIBUV-EMP 54

.535

IIBUV-EMP 55

.249

1:10

.085 .271

1:10

.416 .286

IIBUV-EMP 56

.993

1.078

IIBUV-EMP 57

.561

.736

.730 1:10

.308

Tabla 9: Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotómetro UV/VIS a 214 nm de las 11 cepas bacterianas aisladas Citrullus lanatus,

las 3 cepas que obtuvieron las mayores lecturas fueron seleccionas

(sombreadas) para la determinación cuantitativa y cualitativa de PHAs, así como su caracterización química y bioquímica.

Cepas aisladas de

Dilución P( tubo 1,2,3) Dilución

P( tubo 1,2,3) a

Citrullus lanatus

a 24 horas de

48 horas de

72 horas de

cultivo

cultivo

cultivo

IIBUV-ECP 58

.990

IIBUV-ECP 59

.275

IIBUV-ECP 60

1:10

.156

IIBUV-ECP 61

1:10

1:10

.151

Dilución P( tubo 1,2,3) a

1:10

.255 1:10

.288 .210

.255

1:10

.486

.120

.598

1:10

.698

IIBUV-ECP 62

.322

.352

.362

IIBUV-ECP 63

.423

.322

.288

IIBUV-ECP 64

.403

.222

.230

IIBUV-ECP 65

.192

.338

.355

IIBUV-ECP 66

.573

.257

.182

IIBUV-ECP 67

.993

1.078

.730

IIBUV-ECP 68

.561

.736

1:10

.308

81

Tabla 10: Se muestran las lecturas que se obtuvieron en el espectrofotómetro UV/VIS a 214 nm de las 2 cepas bacterianas aisladas N. tabacum, las 2 cepas aisladas de este cultivo presentaron valores muy bajos por lo cual no se seleccionaron para determinar cuantitativa y cualitativamente a PHAs, así como su caracterización química y bioquímica.

Cepas aisladas de

Dilución

 Nicotina tabacum L .

P( tubo 1,2,3) Dilución P( tubo 1,2,3) a 48 Dilución P( tubo 1,2,3) a a 24 horas de

horas de cultivo

cultivo

72 horas de cultivo

IIBUV-ENP 69

.090

.118

.130

IIBUV-ENP 70

.098

.103

.123

Tabla 20.-Cepas bacterianas no seleccionadas debidoa su baja concentracin de PHAs, además de que su cinetica de crecimiento mostró que concentraciones relativamente mayores de PHAs fue hasta las 72 h por lo cual no es factible. Cepa

IIBUV-ESP1

Género/

Concentración final

Concentración final

Concentración final

especie

de PHAs a las 24h

de PHAs a las 48h

de PHAs a las 72 h

(µg/µl)

(µg/µl)

(µg/µl)

3.2

8.54

8.8

8.5

39

80.8

S. putrefaciens

IIBUV-ESP4

 Alcaligenes

spp.

IIBUV-ESP6

 E. spp

8.0

26

70.5

IIBUV-EMP29

 Enterobacter spp.

2.55

75

121

IIBUV-EMP52

Citrobacter

spp .

5.45

5.50

7.70

IIBUV-EMP53

 Alcaligenes spp.

2.8

7.15

7.25

IIBUV-EMP54

Citrobacter spp .

5.75

8.5

31

IIBUV-EMP56

P. aeuroginosa

8.56

8.62

8.15

IIBUV-EMP57

 E. aerogenes

4.45

8.18

23.5

IIBUV-ELP25

P. pseudomallei

8.5

20.5

42.5

IIBUV-ELP26

S. putrefaciens

7.20

8.52

8.25

IIBUV-ELP27

 E. hormaechei

.8

8.08

8.39

IIBUV-ECP58  

A.denitrificans

8.45

7.5

22.5

IIBUV-EMC61

E. gergovice

4.5

7.25

80.9

82

Figura 14 a. Tubos Eppendorf con muestra de la de la cepa  E. hormaechei , aislada de S. officinarum  utilizados para la lectura en el espectrofotómetro UV/VIS A 214 nm, por el método espectrofotométrico de Law y Slepecky (1961) modificado por Martínez et al., 2004 .

Figura 14.b.Tubos Eppendorf con muestra de la de la cepa IIBUV-EMP 31  aislada de M. paradisiaca  ( no seleccionada), utilizados para la lectura en el espectrofotómetro UV/VIS A 214 nm, por el método espectrofotométrico de Law y Slepecky (1961) modificado por Martínez et al., 2004

83

X.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Aldor, L., y Keasling, J.D. (2003). Process design for microbial plastic factories: metabolic engineering of polyhydroxyalkanoates. Current Opinion in Biotechnol. 14: 475-483 2. ANIPAC

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