B. PHẢN ỨNG TỦA CỦA PROTEIN
I. TỦA THUẬN NGHỊCH I.1. Cách làm: -Cho vào ống nghiệm 3ml lòng trắng trứng trứng nguyên nguyên chất, thêm vào 3ml dd (NH ) SO bảo hòa , lắc đều. Để 5 phút, lọc qua giấy lọc đã thấm ướt bằng dd (NH ) SO bảo hòa. Cho vào dịch lọc một ít tinh thể (NH ) SO . Lắc đều. 4 2
4
4 2
4 2
4
4
I.2. Quan sát: -Khi cho dd (NH ) SO bảo hòa vào protein trứng thấy xuất hiện kết tủa trắng. - Khi lọc, kết tủa trắng bị giữ lại (chính là globulin) - Dung dịch nước lọc khi cho tinh thể (NH ) SO vào có hiện tượng kết tủa trở lại (chính là albumin). 4 2
4
4 2
4
I.3. Giải thích: -Trong protein trứng có cả albumin và globulin. Đây là những protein mang tính axit yếu. Ở điều kiện bình thường, trong trạng thái dung dịch, phân tử P tích điện -, bên ngoài được bao bởi một lớp áo nước với đầu + quay vào và đầu – quay ra, nên lơ lững trong môi trường. H O O C -
R - COOH - N H 2
-
Thủy phân
O O - C
H+ , OH-
R – COO- N H
3 +
Lớp áo nước
-Khi cho các muối (NH ) SO có nồng độ cao vào, thì muối sẽ tạo các ion NH và SO . Các ion này sẽ trung hòa các tiểu phân tử protein trứng đồng thời lấy lớp áo nước bên ngoài tạo ra hiện tượng tủa. - Sở dĩ globulin tạo kết tủa trước vì nó có trọng lượng phân tử lớn, lớp áo nước bên ngoài lớn nên tạo các ion NH và SO dễ và nhanh dẫn đến sự trung hòa điện gây ra tủa. - Khi lọc, ta được dung dịch bán bảo hòa albumin. Nên khi cho tinh thể (NH ) SO vào tức làm cho dung dịch lọc ở trạng thái bảo hòa, lúc này albumin có hiện tượng kết tủa. 4 2
+ 4
+ 4
4
24
2-
4
4 2
4
I.4. Kết luận: -Phản ứng tủa bằng phương pháp muối kết chỉ thực hiện được trong môi trường axit yếu hoặc kiềm yếu. - Dùng phản ứng tủa thuận nghịch này để chiết protein dưới dạng tinh khiết, điều chế những sản phẩm men, nội tiết tố. Vì trong quá trình, muối kết protein không mất đi các tính chất vật lí, hóa học và sinh học đặc hiệu.
II. TỦA KHÔNG THUẬN NGHỊCH II.1. TỦA PROTEIN BẰNG PP ĐUN SÔI II.1.1. Cách làm: cho vào 5 ống nghiệm mỗi ống 5 giọt dd protein trứng. - Ống nghiệm 1: đun sôi. - Ống nghiệm 2: thêm 1 giọt axit axetic 1%, đun sôi. - Ống nghiệm 3: thêm 5 giọt axit axetic 1%, đun sôi. - Ống nghiệm 4: thêm 5 giọt axit axetic 1% và 2 giọt dd NaCl bảo hòa, đun sôi. - Ống nghiệm 5: thêm 2 giọt NaOH 10%, đun sôi.
II.1.2. Quan sát: - Ống nghiệm 1: dd có màu trắng trong, không tủa. - Ống nghiệm 2: có kết tủa trắng đục. - Ống nghiệm 3: dd trong suốt, không tủa. - Ống nghiệm 4: kết tủa trắng - Ống nghiệm 5: không tủa.
I.1.3. Giải thích: - Ống nghiệm 1: dd có màu trắng trong, không tủa vì các tiểu phân tử protein bị mất lớp áo nước bao bên ngoài nhưng vẫn còn tích điện.
- Ống nghiệm 2: có kết tủa trắng đục vì khi cho 1 giọt axit axetic 1% sẽ tạo nên môi trường axit yếu. Nhóm -COO bị ức chế sự phân ly nên tiểu phân tử protein mất điện tích. pH của môi trường đạt gần tới điểm đẳng điện. -
H O O C -
R - COOH - N H 2
-
Thủy phân
O O - C
H+
R – COO- N H
3 +
Axit yếu
H O O C -
R – COO- N H
3 +
- Ống nghiệm 3: khi cho 5 giọt axit axetic 1% sẽ tạo nên môi trường axit mạnh. Do tính háo nước của axit và môi trường axit mạnh có nhiều ion H+ nên protein bị khử nước. Các nhóm -COO- được trung hòa còn các nhóm NH3+ không được trung hòa. Phân tử protein vẫn còn tích điện dương. Do đó không tạo kết tủa.
H O O C -
R - COOH - N H 2
-
Thủy phân
O O - C
2H+
R – COO- N H
3 +
Axit mạnh
H O O C -
R – COOH - N H
3 +
-Ống nghiệm 4: khi cho 5 giọt axit axetic 1% và 2 giọt NaCl bảo hòa sẽ tạo nên môi trường trung hòa về điện. Do đó tạo kết tủa. - Ống nghiệm 5: khi thêm 2 giọt NaOH 10% sẽ gây môi trường kiềm. Nhóm NH3+ được trung hòa. Vì vậy khi đun sôi điện tử âm cuat tiểu phân tử protein vẫn còn. Protein tích điện âm không tạo tủa.
II.1.4. Kết luận: -Phần lớn protein bị đong tụ khi đun trong môi trường trung tính hay axit yếu. - Trong môi trường kiềm mạnh hay axit mạnh, protein còn tích điện nên không tạo tủa. - Protein dễ dàng tạo tủa khi pH môi trường đạt điểm đẳng điện. - Nồng độ muối và pH môi trường đóng vao trò quan trọng trong tạo tủa của protein.
II. TỦA KHÔNG THUẬN NGHỊCH II.2. TỦA PROTEIN BẰNG DUNG MÔI HỮU CƠ II.2.1. Cách làm: cho vào 2 ống nghiệm - Ống nghiệm 1: 5 giọt dd protein trứng 1%, 15-20 giọt rượu etylic 96 , thêm 2 giọt NaCl bảo hòa. Lắc đều. - Ống nghiệm 2: 5 giọt dd protein trứng 1%, 15-20 giọt axeton, thêm 2 giọt NaCl bảo hòa. Lắc đều. 0
II.2.2. Quan sát: - Ống nghiệm 1: dd trong ống nghiệm khi thêm rượu etylic 96 có màu hơi đục nhưng không tạo tủa. Nhưng khi thêm NaCl bảo hòa thì xuất hiện kết tủa trắng. - Ống nghiệm 2: tương tự như ống 1 nhưng có màu đục hơn và có kết tủa nhiều hơn. 0
I.2.3. Giải thích: - Các phân tử protein bị mất nước và kém bền trong dung dịch là do rượu etylic và axeton là những chất háo nước. Chúng sẽ lấy nước của protein. - Khi cho NaCl bảo hòa, đay là chất điện giải mạnh, tạo ion Na và Cl Các ion này sẽ trung hòa điện tử của các tiểu phân tử protein, tạo tủa. - Sở dĩ ống nghiệm 2 có tủa nhiều hơn là vì axeton háo nước hơn rượu etylic. Nó lấy lớp áo nước của protein dễ dàng nên tạo nhiều tủa hơn. +
-.
II.2.4. Kết luận: Điều kiện để tạo tủa là protein phải trung tính hay có tính axit yếu và tốt nhất là phải có chất điện giải mạnh.
II. TỦA KHÔNG THUẬN NGHỊCH II.3. TỦA PROTEIN BẰNG AXIT HỮU CƠ II.3.1. Cách làm: cho vào 2 ống nghiệm - Ống nghiệm 1: 5 giọt dd protein trứng 1%, 2 giọt axit sunfoxalisilic 20%. - Ống nghiệm 2: 5 giọt dd protein trứng 1%, 2 giọt axit tricloaxetic 10%
II.3.2. Quan sát: - Ống nghiệm 1: dd trong ống nghiệm có kết tủa đục. - Ống nghiệm 2: tương tự như ống 1 nhưng có kết tủa ít hơn.
I.3.3. Giải thích: - Khi cho các axit hữu cơ vào dd protein trứng sẽ tạo nên môi trường axit yếu, có khả năng gây tủa. -Vì axit sunfoxalisilic có thể tủa protein, polypeptit và axit amin, còn axit tricloaxetic chỉ có khả năng tủa protein. Nên ống nghiệm 1 nhiều tủa hơn.
II.3.4. Kết luận: Một lần nữa chứng minh điều kiện để tạo tủa là protein phải trung tính hay có tính axit yếu.
II. TỦA KHÔNG THUẬN NGHỊCH II.4. TỦA PROTEIN BẰNG AXIT VÔ CƠ MẠNH II.4.1. Cách làm: cho vào 3 ống nghiệm - Ống nghiệm 1: 5 giọt HNO3đđ - Ống nghiệm 2: 5 giọt H2SO4đđ - Ống nghiệm 3: 5 giọt HCl đđ Sau đó nhỏ cẩn thận theo thành mỗi ống nghiệm 5 giọt protein trứng. Cho thêm vào một lượng dư các axit tương ứng.
II.4.2. Quan sát: - Ống nghiệm 1: xuất hiện vòng tủa trắng đục ở giữa . Khi cho thêm lượng dư axit vào vòng tủa vẫn không tan. - Ống nghiệm 2: xuất hiện tủa nhưng khi cho thêm axit dư vào thì tủa tan tạo dd có màu trắng trong. - Ống nghiệm 2: xuất hiện tủa nhưng khi cho thêm axit dư vào thì tủa tan tạo dd có màu vàng nâu.
I.4.3. Giải thích: - Khi cho các axit vô cơ mạnh vào, các axit này có tính háo nước, sẽ lấy nước của dd protein trứng làm cho protein bị biến tính, protein bị khử nước và trung hòa điện tích gây tủa. - Nhưng khi thêm lượng dư axit tương ứng vào tủa sẽ tan ra nhưng ống 1 không tan vì khi HNO vào protein sẽ tạo hợp chất nitro không tan. 3
II.4.4. Kết luận: Protein tủa do mất lớp áo nước và trung hòa điện tích.
II. TỦA KHÔNG THUẬN NGHỊCH II.5. TỦA PROTEIN BẰNG MUỐI KIM LOẠI NẶNG II.5.1. Cách làm: cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 5 giọt protein trứng, 2 giọt NaCl bảo hòa và thêm vào: - Ống nghiệm 1: 3 giọt dd FeCl 5% 3
- Ống nghiệm 2: 3 giọt (CH COO) Pb 5% 3
2
-Ống nghiệm 3: 3 giọt CuSO 5% 4
Sau đó thêm vào một lượng dư các muối tương ứng.
II.5.2. Quan sát: - Ống nghiệm 1: xuất hiện tủa màu vàng nâu, khi cho thêm lượng dư muối vào tủa tan. - Ống nghiệm 2: xuất hiện tủa màu trắng đục, khi cho thêm muối dư vào thì tủa tan từ từ. - Ống nghiệm 2: xuất hiện tủa màu xanh nhạt, nhưng khi cho thêm muối dư vào thì tủa tan.
I.5.3. Giải thích: - Các muối kim loại nặng tác dụng với protein tạo các phức chất không tan trong nước nhưng tan trở lại khi cólượng muối dư tương ứng (trừ AgNO , HgCl ). 3
2
-Hiện tượng này xảy ra do sự hấp thu ion kim loại nặng trên bề mặt các tiểu phân tử protein làm chúng cùng tích điện dương. - Muối kim loại nặng tạo tủa và làm biến tính protein do sự phá hủy sâu sắc cấu trúc bậc 2,3 của phân tử protein.
II.5.4. Kết luận: Khả năng tạo tử không tan của protein với các muối kim loại nặng được sư dụng trong những trường hợp ngộ độc muối Hg, Cu, Pb… khi cơ thể chưa hấp thu. Protein sữa, trứng thường được dùng để giải độc.
