BAB VIII. PETA RESTRIKSI
Di dalam Bab VIII ini akan dibahas pengertian dan kegunaan peta restriksi serta komponen-komponen yang diperlukan dan cara pembacaannya. Setelah mempelajari pokok bahasan di dalam bab ini mahasiswa diharapkan mampu menjelaskan 1. pengertian dan kegunaan peta restriksi, 2. komponen-komponen reaksi restriksi, 3. pembacaan peta restriksi Pengetahuan awal yang diperlukan oleh mahasiswa agar dapat mempelajari pokok bahasan ini dengan lebih baik adalah dasar-dasar teknologi DNA rekombinan dan konstruksi perpustakaan genom, yang masing-masing telah dibicarakan pada Bab V dan VI. Pengertian dan Kegunaan peta restriksi Peta restriksi merupakan peta yang terdiri atas situs-situs pemotongan enzim restriksi pada suatu urutan DNA. Pembuatan peta restriksi membutuhkan penggunaan enzim restriksi. Dalam biologi molekuler, peta restriksi digunakan untuk membuat plasmid rekombinan, mengetahui orientasi insert, membuat marker DNA, serta menduga kedekatan kekerabatan suatu individu. Untuk mendapatkan peta restriksi dapat ditempuh dua cara. Cara pertama, apabila belum diketahui urutan DNAnya, maka sampel DNA dipotong menggunakan beberapa enzim restriksi berikut kombinasinya. Umumnya maksimum kombinasi enzim restriksi adalah tiga jenis enzim. Meskipun demikian, pemilihan jenis enzim restriksi lebih bersifat coba-coba. Cara yang kedua, apabila sudah diketahui urutan DNAnya, maka hanya dengan menggunakan software baik online (program NEBcutter di alamat http://tools.neb.com/NEBcutter) maupun offline (program BioEdit) sudah dapat diketahui peta restriksinya. Cara kedua ini lebih praktis karena enzim restriksi yang akan digunakan sudah bisa ditentukan jenisnya terlebih dahulu. Pembuatan plasmid rekombinan umumnya tidak mengalami kendala pada pemilihan enzim restriksi. Hal ini karena setiap produsen plasmid sudah menyertakan peta restriksinya lengkap dengan sekuensnya. Situs pemotongan enzim-enzim restriksi
119 pada plasmid dalam MCS (Multiple Cloning Site) memudahkan para pengguna dalam menentukan jenis enzim restriksi yang akan digunakan.
Gambar 1. Contoh plasmid dengan situs-situs pemotongan enzim restriksi
Gambar 1 menunjukkan situs-situs pemotongan enzim restriksi pada plasmid pUC19.
Hal ini menunjukkan bahwa bila kita ingin membuat plasmid pUC19
rekombinan, maka DNA asing bisa dimasukkan ke dalam plasmid tersebut apabila baik DNA asing maupun plasmid pUC19 sama-sama dipotong dengan satu atau dua enzim restriksi yang ada di dalam MCS. Namun, jika untuk memotong plasmid dan DNA asing akan digunakan enzim yang berbeda, maka kedua enzim tersebut harus menghasilkan ujung-ujung fragmen hasil pemotongan yang kompatibel. Hal ini dimaksudkan agar fragmen DNA asing dapat diligasikan ke plasmid sehingga terbentuk plasmid rekombinan. Untuk mengetahui arah orientasi insert, hal yang perlu diperhatikan adalah bahwa urutan nukleotida insert harus sudah diketahui terlebih dahulu. Biasanya dua enzim restriksi digunakan dan salah satunya hanya akan memotong vektor sedangkan lainnya akan memotong insert.
Perbedaan ukuran pita yang ditunjukkan selanjutnya dapat
dianalisis orientasi insertnya.
120 Contoh kasus. Suatu DNA asing yang sudah diketahui urutannya disisipkan pada pUC19 pada situs SmaI.
Untuk mengetahui orientasi DNA insert , dilakukan
pemotongan dengan enzim restriksi selain SmaI tetapi masih ada dalam MCS, misalnya EcoRI serta BamHI yang diketahui dapat memotong insert.
Gambar 2. Penentuan orientasi insert 3 kb dalam plasmid pUC19 (ukuran pUC19 2,68 kb). Keterangan hasil elektroforesis: M adalah marker, 1 adalah plasmid yang dipotong dengan EcoRI, 2 adalah plasmid dari koloni 1 yang dipotong dengan EcoRI-BamHI, 3 adalah plasmid dari koloni 2 yang dipotong dengan EcoRI-BamHI Hasil elektroforesis di atas menunjukkan bahwa plasmid dari koloni 1 (sumur 2) menunjukkan arah orientasi insert dari B ke A karena didapatkan dua pita dengan ukuran sekitar 4 kb dan 2 kb. Pita 4 kb berasal dari 3 kb plasmid pUC19 dan 1 kb insert yang terpotong, sedangkan pita 2 kb berasal dari sisa potongan insert. Sementara itu, plasmid dari koloni 2 (sumur 3) menunjukkan arah orientasi insert dari A ke B karena didapatkan dua pita dengan ukuran sekitar 5 kb dan 1 kb. Pita 5 kb berasal dari 3 kb plasmid pUC 19 dan 2 kb insert yang terpotong, sedangkan 1 kb berasal dari sisa potongan insert. Pembuatan marker DNA juga bisa dilakukan dengan memanfaatkan peta restriksi suatu DNA yang sudah diketahui urutannya.
Salah satu contoh DNA yang sering
digunakan sebagai marker DNA adalah DNA bakteriofag λ atau DNA λ.
121
Gambar 3. Marker DNA dari DNA λ strain X174RFDNA yang dipotong dengan HaeIII Marker DNA dari DNA λ strain X174RFDNA yang dipotong dengan HaeIII akan menghasilkan 5 pita dengan ukuran 1353 pb, 1078 pb, 872 pb, 603 pb, dan 310 pb yang sudah bisa diketahui sebelumnya lewat hasil sekuensing. Seperti halnya fungsi marker DNA lainnya, marker ini dapat digunakan untuk menduga ukuran DNA lain seperti untuk mengetahui ukuran produk PCR dan sebagainya. Fungsi lain peta restriksi adalah menduga kedekatan kekerabatan antarindividu. Seperti diketahui bahwa makin dekat hubungan kekerabatan suatu individu dengan individu lain, maka urutan DNAnya makin mirip. Oleh karenanya, pola-pola pita restriksi yang dihasilkan pada pemotongan DNAnya juga menunjukkan kemiripan. Namun, tidak ada suatu individu yang memiliki urutan DNA yang tepat sama dengan individu lainnya sekalipun berasal dari satu induk, kecuali individu tersebut adalah kembar identik. Pada individu kembar identik pola pita restriksi akan sama persis satu sama lain. Teknik untuk menduga kedekatan kekerabatan antarindividu dengan menggunakan enzim restriksi sering disebut dengan teknik RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). RFLP selain digunakan untuk menduga kedekatan kekerabatan juga dapat digunakan untuk mendeteksi penyakit serta membantu memecahkan masalah kriminal. Berikut salah satu penggunaan RFLP untuk mendeteksi penyakit anemia sickle cell.
122
Gambar 4. RFLP gen β globin yang dipotong dengan enzim restriksi MstII Gen β globin manusia sepanjang 1,4 kb memiliki situs enzim restriksi MstII. Orang yang menderita penyakit anemia sickle cell mengalami mutasi pada gen tersebut Kodon keenam gen β globin manusia normal menyandi asam amino glutamat (GAG), sedangkan pada penderita anemia sickle cell kodon tersebut mengalami mutasi menjadi kodon penyandi asam amono valin (GTG) sehingga menyebabkan hilangnya situs restriksi MstII. Saat gen β globin dipotong dengan MstII, pada manusia normal akan diperoleh pita berukuran 1,2 kb dan 200 pb, sedangkan pada penderita penyakit anemia sickle cell akan diperoleh pita berukuran 1,4 kb. Sementara itu, pada carrier akan diperoleh tiga pita, masing-masing dengan ukuran 1,4 kb; 1,2 kb; dan 200 pb.
Komponen-komponen reaksi restriksi Faktor utama dalam pembuatan peta restriksi adalah DNA sampel yang murni dengan konsentrasi yang memadai, jenis enzim restriksi, dan bufer. Hasil pemotongan DNA menggunakan enzim restriksi selanjutnya diamati dengan elektroforesis. Pita-pita yang diperoleh bisa diketahui ukurannya dengan membandingkannya dengan DNA standar atau marker. Adanya kontaminasi DNA pada saat preparasi oleh kemikalia seperti etanol, kloroform, ataupun fenol bisa menyebabkan kerja enzim restriksi terhambat. Selain itu, jika DNA yang akan direstriksi jumlahnya terlalu sedikit, maka pita
123 yang diperoleh tidak nampak semua saat dielektroforesis. Demikian pula, jika DNA yang akan direstriksi jumlahnya terlalu banyak, maka saat dielektroforesis sisa DNA yang belum terpotong akan terlihat. Penggunaan enzim restriksi selain memperhatikan unit aktivitasnya juga harus memperhatikan bufer yang digunakan. Umumnya produsen enzim restriksi selalu memberikan petunjuk penggunaan bufer, terutama bila akan dikombinasikan dengan enzim restriksi lainnya. Hal ini penting sekali karena dalam bufer biasanya ditambahkan kofaktor seperti DMSO, MgSO4, albumin, ataupun urea. Namun, setiap enzim memiliki kofaktor sendiri-sendiri yang kadang kala tidak sama dengan enzim restriksi lainnya. Oleh karena itu, sangat disarankan bila ingin menggunakan kombinasi enzim restriksi sebaiknya menggunakan enzim-enzim restriksi dari satu produsen saja.
Pembacaan peta restriksi Ukuran semua fragmen yang dipotong dengan enzim restriksi bila dijumlahkan harus sama hasilnya dengan ukuran DNA sebelum dipotong. Jika saat dijumlahkan hasilnya tidak sama, dapat terjadi dua kemungkinan masalah. Masalah pertama bisa terjadi karena fragmen DNA yang berukuran kecil telah lolos dari gel karena laju migrasinya terlalu cepat. Masalah ini terjadi ketika elektroforesis berlangsung terlalu lama. Masalah kedua bisa terjadi karena gel kurang padat sehingga tidak bisa memisahkan fragmen yang ukurannya hanya berbeda beberapa basa saja. Adapun teknik pembacaan peta restriksi pada prinsipnya sama dengan pembacaan hasil elektroforesis pada umumnya. Salah satu contoh pembuatan peta rektriksi tersaji pada gambar berikut.
124
Gambar 5. Gambar peta restriksi suatu DNA yang dipotong dengan enzim restriksi HhaI, EcoRV, dan HaeIII.
Cara membaca peta restriksi: 1. Ukurlah jarak migrasi tiap-tiap pita marker dari sumur, kemudian buatlah ekstrapolasi jarak migrasi tiap pita-pita marker (cm) dengan ukuran panjang basanya. Buatlah garis-garis sejajar yang memotong pita-pita untuk membantu mengukur jarak migrasi. Catatan: Jarak migrasi DNA dalam gel agarosa mengikuti pola log10 dengan ukuannya. Dengan demikian, akan diperoleh grafik berikut
Gambar 6. Ekstrapolasi antara ukuran pita-pita marker dan jarak migrasinya
125 2. Ubahlah kurva eksponensial tersebut menjadi persamaan linier dengan cara melog tiap-tiap ukuran fragmen dari marker. Catatan: upayakan agar persamaan yang diperoleh mendapatkan nilai R2 mendekati 1. (minimal 0,99). Bila belum didapatkan, ukur ulang lagi jarak migrasinya.
Gambar 7. Ekstrapolasi antara log ukuran pita-pita marker dan jarak migrasinya. 3. Persamaan linier yang diperoleh digunakan untuk menduga ukuran pita DNA lainnya yang dielektroforesis bersamaan dengan marker. Contoh: jika diperoleh persamaan y= -0,317x + 4,464 (persamaan di atas) dan jarak migrasi DNA lain yang dielektroforesis bersama dengan marker adalah 5,06 cm, maka jarak sebenarnya adalah (anlog 2,8396 ) = 750 pb. 4. Bila seluruh pita sudah diketahui ukuran sebenarnya, maka buatlah skema peta restriksi yang mencerminkan ukuran dan posisi pemotongan enzim restriksi berikut nama enzimnya. Contoh:
126
Gambar 8. Peta situs restriksi fragmen gen endoxilanase S. costaricanus 45I-3 (linier)
Gambar 5. Peta restriksi plasmid pGEM-T Easy (sirkuler)
