ANÁLISIS DE FARMACOS: DETERMINACIÓN SIMULTANEA DE ACETAMINOFEN, ACIDO ACETIL SALICILICO y CAFEINA EN UN COMPRIMIDO Esteban López; Lizeth Becerra; David Colorado Universidad Universidad Icesi Facultad de Ciencias Naturales Departamento de Ciencias Químicas Laboratorio de Análisis Instrumental Santiago de Cali (Colombia) - 06 de noviembre de 2013 INTRODUCCION Un medicamento 1 es la presentación farmacéutica que contiene fármacos o “drogas”, destinadas hacia la prevención,
diagnóstico y tratamiento de las patologías, en el presente informe se analizó un fármaco cuya presentación es la de comprimido, llamado Sevedol 2. Sevedol es un analgésico y antipirético, y comúnmente se prescribe para los fuertes dolores de cabeza asociados con la migraña. Este medicamento cumple su acción farmacológica gracias a sus principales componentes activos: Ácido Acetilsalicílico Acetilsalicílico (AAS), Acetaminofén y Cafeína. Para la determinación y cuantificación de estos compuestos activos se debe emplear un método que permita su separación, para evitar interferencias en los análisis; para el presente informe se empleó la técnica de HPLC para la determinación simultanea de estos compuestos activos en un comprimido de Sevedol. La técnica de HPLC posee esta ventaja gracias al uso de una columna de cromatografía 3, que permite la separación de los compuestos gracias a su diferencia en el momento dipolar de la molécula, debido a que, generalmente, y para el presente informe, la columna está compuesta de una fase estacionaria apolar (solido) y una fase móvil polar (liquido); los compuestos son transportados por la fase móvil y son
retenidos por la fase estacionaria según la afinidad de cada compuesto por cada una de las fases. Por lo tanto, la separación de los compuestos activos en un comprimido de Sevedol se da gracias a la polaridad de cada uno, es decir que el compuesto más polar será el más retenido por la fase polar y el último en salir de la columna, por el contrario, el compuesto más apolar será fácilmente transportado por la fase apolar y el primero en salir de la columna.
Figura 1 – Esquema de un equipo de HPLC
Figura 2 – Retención de compuestos por diferencia de polaridad en una columna columna cromatográfica cromatográfica
RESULTADOS Para poder determinar la cantidad de compuesto activo en un comprimido de Sevedol, se realizaron curvas de calibración para cada compuesto activo por separado a partir de muestras estándar de cada compuesto activo: Ácido Acetilsalicílico Tiempo de Concentración Área retención 0,25 0,75 0,5 1 0,125 Estándar
5944 29148 19320 56723 5920 31479
1,37 1,41 1,33 1,36 1,23 1,64
Area
350000 300000 250000 200000 150000 100000
y = 283248x - 26734 R² = 0.9313
50000 0 0
0.4
0.6
0.8
1
1.2
Concentracion (mg/L) Grafico 2 – Curva de calibración: Área Vs Concentración obtenida por HPLC para el Acetaminofén
Cafeína Concentración
Área
Tiempo retención
0,125
32798
2,15
0,75 0,5 1
159476 108069 305457
2,18 2,15 2,15
0,25
39864
2,16
Estándar
115021
2,15
Tabla 1: determinación por HPLC de la muestra estándar de AAS
60000 50000 40000 30000 20000 10000 0
0.2
Area
Tabla 3: determinación por HPLC de la muestra estándar de Cafeína
y = 56617x - 6312.8 R² = 0.9279 400000 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
Area
1.2 300000
Concentracion (mg/L) Grafico 1: Curva de calibración: Área Vs Concentración obtenida por HPCL para el Ácido Acetilsalicílico
200000 100000
Acetaminofén Concentración
Área
Tiempo retención
0,125
31707
1,88
0,75
149962
1,91
0,5
102139
1,88
1
288430
1,88
0,25
37618
1,9
Estándar
126365
1,88
Tabla 2: determinación por HPLC de la muestra estándar de Acetaminofén
y = 300860x - 28819 R² = 0.9333
0 0
0.5
1
Concentracion (mg/L) Grafico 3: Curva de calibración: Área Vs Concentración obtenida por HPCL para la Cafeína
Para la preparación de la muestra problema se tomó un comprimido entero de Sevedol (0,7311g), se macero y se tomaron 0,1014g del comprimido, los cuales se disolvieron en 100ml de fase móvil (metanol); es decir 1014mg/L de Sevedol (dilución 1). Para facilitar la determinación simultanea de los compuestos, se realizó una segunda dilución de la muestra problema
1.5
con el objetivo de disminuir la concentración de los analitos. Se tomó entonces 450μL de la muestra problema
y se llevó a un matraz aforado de 100ml completando el volumen hasta el aforo con fase móvil (dilución 2).
que con la ecuación 1, podemos determinar la concentración de cafeína en el comprimido de Severo a partir del área obtenida por HPLC, la cual es registrada en el cromatograma. Reemplazando “y” por el área obtenida
Una vez obtenidas las curvas de calibración para cada uno de los compuestos activos, se realizó el análisis por HPLC de la muestra problema (dilución 2), se obtuvieron los siguientes resultados: Muestra Problema Tiempo Área retención 10109 162098 119674
0,96 1,88 2,14
Tabla 4: determinación por HPLC de la muestra problema
Para la identificación de cada compuesto activo se empleó el tiempo de retención 4, el cual es característico para cada compuesto, debido a que el tiempo de retención va ligado con la afinidad del compuesto por la fase estacionaria. Por lo tanto, en la tabla 4, el tiempo de retención de 2,14 corresponde a la Cafeína (Véase: tabla 3); de la misma manera, el tiempo de retención de 1,88 corresponde al Acetaminofén ( Véase: tabla 2 ) y por último, y casi que por diferido, el tiempo de retención de 0,98 corresponde al AAS ( Véase: tabla 1). Se emplearon entonces las ecuaciones de las curvas de calibración, incluidas en los gráficos 1, 2 y 3. Así, para determinar la concentración de Cafeína, se empleó la ecuación del grafico 3:
Donde, según el grafico 3, la variable “y” corresponde al área y la variable “x”
corresponde a la concentración; es decir
para la Cafeína en la tabla 4, y despejando “x” se obtuvo:
Para poder determinar la cantidad, en mg, de Cafeína por comprimido de Sevedol se tuvieron en cuenta las diluciones realizadas en la preparación de la muestra problema, así como el peso de la muestra de Sevedol tomada: ()
Nota: Comp = Comprimido de Sevedol
Por una regla de tres se puede obtener la cantidad de Cafeína en un comprimido de Sevedol, ya que un solo comprimido de Sevedol pesa 0,7311g, así:
( )( )
De la misma manera que con la Cafeína, se realizó el procedimiento matemático para poder determinar la cantidad por comprimido de Sevedol para el Acetaminofén y el AAS:
Para Acetaminofén:
En resumen, la cantidad de cada componente activo por unidad de comprimido de Sevedol es:
Teniendo en cuenta las disoluciones realizadas para la muestra problema, se obtuvo: ( )
Para obtener la cantidad de (Acetaminofén) por unidad comprimido:
AC de
()( )
Para AAS:
ANALISIS DE RESULTADOS Debido a que la separación en la columna cromatográfica se da por la diferencia de afinidad de los compuestos activos hacia las fases que componen la columna, son las interacciones electrostáticas y fuerzas de Van Der Waals las que determinaron la retención de los compuestos dentro de la columna, ya que la presión a la se inyectaron las muestras en el equipo de HPLC es la misma para todas las muestras. Como se comentó con anterioridad, según los tiempos de retención obtenidos en el cromatograma para la muestra problema (Véase: tabla 4), se predijo que la primera sustancia en salir de la columna fue el AAS, seguido del AC y por último la Cafeína.
Teniendo en cuenta las disoluciones: ( )
De la misma forma que con la Cafeina y el AC, se determina la cantidad de AAS por unidad de comprimido:
Figura 2 – Ácido Acetilsalicílico
()( )
Figura 3 - Acetaminofén
Figura 4 – Cafeína
El orden en el que los compuestos activos salen de la columna también se infirió a partir de su estructura química. Así, el AAS posee dos grupos carbonilo ( ), un grupo hidroxilo ( ) y un oxígeno en forma de éter ( ), que, según la características del solvente usado como fase móvil, en este caso, metanol, facilita la formación de enlaces de hidrogeno5; los cuales son los enlaces no iónicos más fuertes. Es decir, que la fuerte interacción entre el AAS y la fase móvil disminuyeron su tiempo de retención. Además, estos grupos funcionales se encuentran expuestos, y las moléculas de agua se enlazan sin problemas de repulsión electrostática, debido, por ejemplo, a grupos apolares como lo es el metilo. Los enlaces de hidrogeno no solo se forman con el oxígeno, sino también con el nitrógeno y el flúor; en el caso del AC, su estructura posee un grupo carbonilo, un grupo hidroxilo y una amina secundaria ( ); por lo tanto, en términos prácticos, se dedujo que, a comparación con el AAS, el AC posee un sitio menos de unión para las moléculas de agua por enlaces de hidrogeno, lo que, en comparación al AAS, disminuye su afinidad por la fase móvil en relación con el ASS. En el caso de la Cafeína, se pudo observar que posee dos grupos carbonilos, lo que en relación al ASS y al AC, se infirió entonces que este compuesto posee el menor número de sitios para la formación de enlaces de
hidrogeno con el metanol (fase móvil); pues aunque se observó que presenta algunos átomos de nitrógeno, estos hacen parte de un ciclo (heterociclo), por lo cual, en cierta medida, debido a que el ciclo es aromático, los enlaces que forma el nitrógeno con los átomos de carbono completan su octeto 6, y como lo sugiere la Regla del octeto (Lewis 1917) estos átomos de nitrógeno será muy estables, es decir, poco reactivos. Además, por un lado, debido a que los enlaces de hidrogeno son enlaces covalentes, los átomos que conforman este tipo de enlace comparten sus electrones de la capa de valencia; y debido a que los átomos de nitrógeno en la Cafeína ya tiene completo su octeto, no tenderán a formar enlaces de hidrogeno con facilidad. Por otro lado, la Cafeína es la molécula con más grupos metilo de entre los compuestos activos analizados, estos grupos metilo, al ser apolares, también generan repulsión de las moléculas de agua que son polares, dificultando la formación de enlaces de hidrogeno con los grupos carbonilo aledaños a los grupos metilo en la Cafeína. Por cuanto a los posibles errores durante la práctica, se consideraron dos factores determinantes: la preparación de las disoluciones (estándar y problema) y la detección de las muestras analizadas por parte del equipo de HPLC. Como se explicó en el ítem que corresponde a los resultados, la muestra problema se tuvo que disolver considerablemente debido a que la concentración de los compuestos activos por comprimido de Sevedol es relativamente alta; esto porque el equipo de HPLC usado emplea un detector UVVis, y por lo tanto su funcionamiento está regido, en gran parte, por la ley de Lambert-Beer 7. Por lo tanto, para que la relación lineal entre absorbancia y concentración sea considerable, se
emplean muestras con concentraciones entre y .
comprimido sobre uno de los lados originados por la fractura.
Por ejemplo, para el AC, en la muestra problema, empleando la ecuación 2, se obtuvo una concentración de:
También, para evitar errores en las determinaciones individuales de cada compuesto, la muestra problema debió ser analizada. Como mínimo, por triplicado; permitiendo detectar márgenes de error o un comportamiento estadístico de los datos.
Se empleó el peso molecular del AC, que es de 151,169g/mol, para expresar esta concentración en molaridad (mol/L), es decir: ( )
()
Es decir, que el objetivo de diluir considerablemente la muestra problema para incrementar la relación lineal entre absorbancia y concentración si se cumplió; se empleó el AC como ejemplo porque es el compuesto mayoritario en el comprimido de Sevedol. Sin embargo, el problema que sí pudo haber afectado los resultados obtenidos es que el comprimido de Sevedol presenta en su campa más externa una cubierta colorida, que indica que el compuesto del que está fabricado está cubierta presenta interacción con la radiación en la región visible; posiblemente está recubierta haga parte de los excipientes del medicamento. El inconveniente con esto es que el equipo de HPLC, al usar un detector UV-Vis pudo haber captado la absorbancia por parte de estos excipientes coloridos, incrementando la concentración reportada por el equipo en cada muestra problema analizada.
CONCLUSIONES El objetivo de diluir considerablemente la muestra problema es poder acoplar los datos experimentales a una relación lineal de la Ley de Lambert-Beer, para evitar complicaciones con el límite de cuantificación. La diferencia de polaridad entre las moléculas analizadas es un factor determinante en el tiempo de retención de los compuestos dentro de la columna cromatográfica. Los errores durante la práctica también pudieron ser ocasionados por factores fisicoquímicos y termodinámicos del sistema en la columna cromatográfica. REFERENCIAS 1. J. C. Mena Aguilar; “Farmacología”; Universidad Nacional Autónoma de Méjico. 2.http://www.sopecard.org/peru/src/produc tos/30856_210.htm | Visitada el dia 05 de noviembre del 2013.
3. M. Valcárcel Cases, A. Gomez Henz; “Tecnicas
Para evadir este error se pudo haber tomado la muestra de comprimido solo en el centro de este, es decir, fracturar el comprimido y con un instrumento punzante, como una espátula, raspar el
Analiticas
de
Separacion”; REVERTE; Barcelona; 1988; pp. 437 – 441.
4.http://www.ulpgc.es/hege/almacen/dow nload/39/39360/separaciones_por_cromat
ografia_1.pdf | Visitada el dia 05 de noviembre del 2013
5.http://www.ugr.es/~olopez/estruct_macro mol/fuerzas/EH.PDF | Visitada el dia 06 de noviembre del 2013.
6.http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archiv ero/Teoriasdeenlace_20194.pdf | Visitada el dia 06 de noviembre del 2013.
7.https://www.google.com.co/url?sa=t&rct =j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja &sqi=2&ved=0CCkQFjAA&url=http%3A%2F %2Fabsorcionatomica.blogspot.com%2F2009%2F08%2Fli mitaciones-de-la-ley-de-lambertbeer.html&ei=PXODUsHdPMP7kQfl6IBw&u sg=AFQjCNGJkFXPFQith9SstX_U4Dy9yHbYQ | Visitada el dia 06 de noviembre del 2013.
