PROBLEMAS DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. Unidad Internacional= cantidad de enzima necesaria para transformar un micromol de sustrato por minuto. 1 U= 1 µmol/min. Actividad específica= AE= Unidades de enzima por mg prot. totales= U/mg. Actividad total= AT= Unidades totales de enzima en el extracto= U. Porcentaje de recuperación= (ATfinal/ATinicial) x 100. Factor de purificación= AEfinal/AEinicial. Número de recambio= (µmoles de sustrato/min)/µmoles de enzima x sitios activos= min-1. 1. Una reacción transcurre con una velocidad máxima de 5 mmoles de sustrato transformado por minuto y litro de medio. Si el sustrato está en exceso: ¿Qué cantidad se habrá transformado al cabo de 10 min de reacción si el recipiente contiene 20 litros de medio? Sol.: 1 mol 2. Una preparación enzimática tiene una actividad específica de 74 U/mg de proteína y contiene 21 mg de proteína/ml. Calcular la velocidad de reacción en una mezcla de reacción estándar que contiene: a) 5 µl de la preparación enzimática; b) 25 µl de la preparación enzimática c) 50 µl de la preparación enzimática. Sol.: a) 7,77 µmoles/min; b) 38,85 µmoles/min; c) 77,7 µmoles/min 3. Una preparación enzimática tiene una actividad específica de 42 U/mg de proteína y contiene 12 mg de proteína/ml. Calcular la velocidad inicial máxima de la reacción en una mezcla de reacción estándar que contiene: a) 20 µl de la preparación enzimática. b) 10 µl de la preparación enzimática. c) 60 µl de la preparación enzimática. Sol.: a) 10,08 µmoles/min; b) 5,04 µmoles/min y c) 30,24 µmoles/min. 4. Una disolución al 2% de sacarosa se digiere a pH 5 con 25 µg de invertasa. La velocidad inicial máxima de liberación de productos reductores fue de 29 mg/min. Calcular la actividad específica de la preparación enzimática (expresada como desaparición de sustrato). (Pm de sacarosa: 342,2; Pm de glucosa: 180). Sol.: A.E.= 3388 U/mg de proteína. 5. Un extracto de bacterias contiene 24 mg de proteínas por mililitro. 20 µl de este extracto en un volumen estándar de incubación de 0,1 ml catalizan la producción de 1,6 µmoles de producto en un minuto. Calcular: a) La concentración del enzima en U/ml de extracto. b) La actividad específica del enzima en el extracto.
c) La actividad total del enzima si tuviéramos 200 ml de extracto. Sol.: a) 80 U/ml; b) 3,3 U/mg; c) 16000 U. 6. Un extracto enzimático crudo contiene 20 mg de proteína/ml. 10 µl de ese extracto en un volumen de reacción de 0,5 ml catalizaron la producción de 3 µmoles de producto en un minuto en condiciones óptimas de trabajo. Calcular: a) La velocidad de reacción en µmoles/min/ml. b) La concentración del enzima en U/ml de extracto. c) La actividad específica del extracto. d) La actividad total del extracto si tenemos 100 ml del mismo. Sol.: a) 6 µmoles/min/ml; b) 300 U/ml; c) 15 U/mg prot; d) 30000U. 7. Un extracto de bacterias contiene 50 mg de proteínas por mililitro. 50 µl de este extracto en un volumen estándar de incubación de 1 ml catalizan la producción de 3,8 µmoles de producto en un minuto. Calcular: a) La concentración del enzima en U/ml de extracto. b) La actividad específica del enzima en el extracto. c) La actividad total del enzima si tuviéramos 200 ml de extracto. Sol.: a) 76 U/ml; b) 1,52 U/mg de proteína; c) 15200 U. 8. Al hacer una purificación de una enzima el extracto crudo tiene una actividad total de 45 U y una actividad específica de 29 mU/mg. En el último paso de purificación se obtuvo una actividad total de 19,8 U y una actividad específica de 780 mU/mg. Calcular: a) Cantidad de proteínas en mg en ambas fracciones. b) Porcentaje de recuperación. c) Factor de purificación. Sol.: a) 1551,7 mg y 25,38 mg; b) 44,0%; c) 26,9 veces 9. Al hacer una purificación de una enzima el extracto crudo tiene una actividad total de 53,70 U y una actividad específica de 20 mU/mg. En el último paso de purificación se obtuvo una actividad total de 24,16 U y una actividad específica de 604 mU/mg. Calcular: a) Cantidad de proteínas en mg en ambas fracciones. b) Porcentaje de recuperación. c) Factor de purificación. Sol.: a) 2685 mg y 40 mg; b) 44,9%; c) 30,2 veces 10. Un extracto crudo contiene 25 mg de proteínas/ml. 35 µl de este extracto catalizaron la transformación de 0,22 µmoles de sustrato por minuto. 85 ml de este extracto se fraccionan con sulfato amónico. La fracción que precipitó entre el 25 y el 50% de sulfato amónico se redisolvió en 15 ml. Estos 15 ml contienen 67 mg de proteínas por ml y 35 µl de este extracto catalizan la transformación de 0,9 µmoles/min. Calcular: a) El porcentaje de recuperación de la enzima en la fracción precipitada. b) El factor de purificación obtenido en el fraccionamiento con sulfato amónico. Sol.: a) 72,19%; b) 1,5 veces.
11. Se dispone de 200 ml de una disolución proteica al 2%, conteniendo una enzima que se desea purificar. La mitad de la muestra se somete al método A, consistente en precipitaciones fraccionadas, y se obtienen 5 ml de disolución final, de concentración proteica igual a 5 mg/ml y actividad enzimática igual a 2000 U/ml. La otra mitad se somete al método B, consistente en cromatografía de intercambio iónico, y se obtienen una disolución final de 10 ml, de riqueza proteica igual a 10 mg/ml, y con un actividad enzimática igual a 2000 U/ml. Se desea saber: a) Cuál de los métodos ha aportado el enzima más puro. b) Por cuál de los métodos se ha obtenido mayor cantidad de proteína. Sol.: a) A enzima más puro; b) B mayor cantidad de proteína. 12. Para purificar un determinado enzima, a partir de un extracto crudo que lo contiene, se ensayan sucesivamente precipitaciones fraccionadas, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de exclusión, con los resultados que registra la siguiente tabla: ________________________________________________________________ Volumen de disolución (proteína) Actividad enzimática (ml) (mg/ml) (U/ml) _________________________________________________________________ I 2000 10 50 II 500 5 160 III 100 4 400 IV 50 2 700 V 10 9,1 3200 __________________________________________________________________ a) Calcular el porcentaje de recuperación del enzima después de cada una de las manipulaciones a las que se le ha sometido b) Indicar si procede seguir purificando el enzima o cabe esperar haber alcanzado su homogeneidad electroforética. Sol.: a) AT(I)= 80%, AT(II)= 40%, AT(III)= 35%, AT(IV)= 32%; b) no procede seguir purificando. 13. Smith y colaboradores han logrado purificar hasta homogeneidad la nitrato reductasa de la cianobacteria Anacystis nidulans mediante un procedimiento que se resume en la tabla siguiente: V (ml) Prot (mg) AE (U/mg) Fracción Extracto crudo 195 10126 0,087 Enzima solubilizada 175 5596 0,120 Precipitado etanol (50-70%) 38 152 3,400 Eluato en cromatografía en DE-S2 95 43 10,19 Eluato cromatográfico en Fd-sefarosa 60 0,46 588,70 Eluato concentrado de filtración en ACA49 1,15 0,26 874,80 A partir de estos datos calcular: a) Actividad total en unidades después de cada paso de purificación. b) Porcentaje de recuperación final. c) Número de veces que se ha logrado purificar el enzima. Sol.: a) 880,9 U; 671,52 U; 517 U, 438,17 U; 270,8 U; 227,4 U; b) 25,9%; c) 10055 veces.
14. En la purificación de la nitrito reductasa de espinaca, Ramírez et al. obtuvieron los resultados que se recogen en la siguiente tabla: Fracción Vol (ml) Prot (mg/ml) AE (mU/mg) I Homogenado 1100 44 8,2 II Precipitación acetónico 120 11 215 III Eluato libre de ferredoxina 140 8 272 IV Eluato de DEAE-celulosa 17,5 32 400 V Eluato de DEAE-celulosa 135 0,28 3250 A partir de estos datos calcular: a) Actividad total en unidades después de cada paso de purificación. b) Porcentaje de recuperación final. c) Número de veces que se ha logrado purificar el enzima. Sol.: a) AT(I)= 397 U; AT(II)= 284 U; AT(III)= 305 U; AT(IV)= 224 U; AT(V)= 123 U b) 31% c) 396,3 veces 15. La siguiente tabla muestra los valores obtenidos al purificar la aldolasa de músculo esquelético de rata: Fracción V (ml) Prot (mg/ml) AT (U) I Extracto crudo 1290 62,3 29,7 II Sobrenadante de 27000 g 1200 34,2 27,0 III Eluato de DEAE-celulosa 1150 29,7 31,0 IV Eluato de gel de fosfato cálcico 210 3,0 37,2 V Precipitado de SO4(NH4)2 (0-50%) 30 36,3 24,3 VI Eluato de alúmina Cr 14,5 1,3 8,1 VII Filtración en agarosa 20,5 0,15 2,0 A partir de estos datos calcular: a) Porcentaje de recuperación final. b) Número de veces que se ha logrado purificar el enzima. Sol: a) 6,7% b) 1760 veces 16. La deshidrogenasa del 3-fosfato de gliceraldehído es un enzima tetramérico de Pm 40000 que contiene cuatro sitios activos. En condiciones óptimas, 5 µg del enzima puro catalizan la conversión de 2,8 µmoles de 3-fosfato de gliceraldehído en fosfato de 3fosfogliceroilo por minuto. Calcular: a) la actividad específica del enzima y b) el número de recambio de cada sitio activo. Sol.: a) 560 U/mg b) 5600 min-1 17. La α-quimotripsina (Pm 24000) hidroliza el L-tirosinilbenzoato de etilo con una actividad específica de 45,0 µmoles/min por miligramo de enzima. Dado que la αquimotripsina tiene un sitio activo, ¿Cual es su número de recambio? Sol.: 1080 min-1 18. Una solución al 1% de almidón se digiere a pH 6,7 con 15 µg de amilasa (Pm 152000). La velocidad inicial máxima de liberación de maltosa (Pm 342) fue de 8,5 mg/min. Calcular el número de recambio de dicha enzima. Sol.: 251824,1 min-1
19. La catalasa cataliza la descomposición de 5x106 moles de H2O2 por minuto y por mol de enzima y posee cuatro sitios activos por molécula de enzima. Calcular la actividad por centro catalítico de dicho enzima. Sol.: 1,25x106 min-1 20. a) Calcular el número de recambio de un enzima (Pm 30000), si 1,5 µg de enzima contenidos en alícuotas de 0,5 ml de una preparación enzimática actuaron sobre el sustrato específico con una velocidad máxima inicial de 3 µmoles de sustrato transformados por minuto. b) ¿Cuál sería la actividad total de la preparación enzimática si su volumen fuera de 100 ml?. c) Cuál sería la actividad específica?. Sol.: a) 60000 min-1; b) 600 U; c) 2000 U/mg. 21. En una reacción enzimática en la que un sustrato (S) se isomeriza para dar un producto (P), usando 2,5 mg de enzima (Pm 125000) se encontró una velocidad inicial máxima de 275 µmoles/min. Calcular el número de recambio de dicha enzima en esas condiciones. Sol.: 13750 min-1. 22. La nitrito reductasa de espinaca se ha logrado purificar unas 2000 veces. Suponiendo que la enzima es 100% pura, calcular su número de recambio si 8 µg de enzima reducen 0,15 µmoles de nitrito/min (Pm enzima 60000). Sol.: 1125 min-1. 23. Una enzima tiene un peso molecular de 60000 y 6 sitios activos por molécula. La velocidad inicial de la reacción que cataliza es 12 µmoles de sustrato cada 2 minutos en presencia de 18 µg de enzima. Calcúlese la actividad molecular por centro catalítico de la enzima. Sol.: 3333 min-1. 24. Calcular el número de recambio de una enzima (Pm 100000) sabiendo que una preparación pura del enzima tiene una actividad específica de 500 U/mg de proteínas. Calcular a partir de la siguiente tabla de purificación la recuperación y el factor de purificación. V(ml) A.T. (U) Prot. (mg/ml) Fracción I 1000 500 10 II 500 300 3 -1 Sol.: a) 50000 min ; b) 60%; c) 4 veces.
