Instituto Tecnológico de Morelia
Alumno: Osmar Wilebaldo Solís Morales
Profesor: Juan Carlos González Hernández
Materia: Cinética Química Biológica
Unidad: IV
Trabajo: Inmovilización de enzimas
Índice Introducción Contenido 1.-) Aspectos generales sobre la inmovilización inmovilización de enzimas. 2.-) Ventajas e inconvenientes. inconvenientes. 3.-) Métodos de inmovilización. 4.-) Soportes de inmovilización. 5.-) Adsorción.
5.1.-) adsorción por interacción hidrofòbicas. 5.2.-) adsorción por interacciones iónicas. 5.3.-) adsorción por afinidad. 5.4.-) adsorción por coordinación a un metal. 6.-) Atrapamiento. 7.-) Unión covalente. 7.1.-) Formación de enlaces diazo. 7.2.-) Formación de enlaces tipo peptídico. 7.3.-) Formación de enlaces de Schiff. 7.4.-) método de alquilación o arilación. 7.5.-) Reacciones de intercambio tio-disulfuro. 8.-) Entrecruzamiento o Reticulado. 9.-) Comparación entre los métodos de inmovilización. 10.-) Elección del método. 11.-) Propiedades de las enzimas inmovilizadas. 12.-) Actividad catalítica. 13.-) Especificidad por el sustrato. 14.-) Constantes cinéticas. 14.1.-) Constante de Michaelis (K m ). 14.2.-) Velocidad máxima (V max ). max 15.-) Temperatura y pH. 16.-) Estabilidad. 17.-) Aplicación de las enzimas inmovilizadas.
Referencias
Introducción Las enzimas son biomoléculas especializadas en la catálisis de las reacciones quimias que tiene lugar la célula. Son muy eficaces como catalizadores ya que son capaces de aumentar la velocidad de las reacciones químicas mucho más que cualquier catalizador artificial conocido, y además son altamente específicos ya que cada uno de ellos induce la transformación de un solo tipo de sustancia y no de otras que se pueden encontrar en el medio de reacción. La estabilidad estructural de las enzimas durante las reacciones bioquímicas son algunos de los desafío principales en el estudio de los biocatalizadores. Se han desarrollado diferentes técnicas con el fin de inmovilizar las enzimas que contengan un eficiencia funcional y mayor reproducibilidad. De esta manera la inmovilización de enzimas se refiere al hecho de limitar o retardar el movimiento. La enzima inmovilizada es aquella que esta confinada en un espacio definido, que retiene su actividad catalítica y puede ser reutilizada de forma continua. La inmovilización se remonta al estudio de las biopelículas, las cuales son una superficie de conexiones de comunidades microbianas que consisten en múltiples capas de célula incrustada en matrices hidratadas.
En 1985 se llevó a cabo la inmovilización de múltiples enzimas para su uso, por ejemplo en la producción de L-aminoácidos a partir de ceto-ácidos a partir de reactores de membrana. Los componentes principales de un sistema de inmovilización enzimático son la enzima, la matriz o soporte y el método de fijación. Alguna de sus propiedades como la actividad catalítica o la estabilidad térmica llegan a ser alteradas, sin embargo puede conservar su funcionalidad durante varios ciclos.
Figura 1. Componentes de un sistema de inmovilización: enzima, soporte y técnica de inmovilización.
Debe tener en cuenta el conocimiento de las propiedades de los materiales del soporte y los procesos de inmovilización. 1.-) Aspectos generales sobre la inmovilización de enzimas. Según IUPAC la inmovilización es una “técnica utilizadas para conseguir la fijación física o química de células, orgánulos, enzimas u otras proteínas en un soporte sólido, una matriz solida o mediante retención de una membrana, con el fin de aumentar su estabilidad y hacer posible su uso repetido o continuado”
Concretamente las enzimas inmovilizadas pueden ser definidas como “enzimas físicamente confinadas o localizadas en una cierta región definida del espacio con retención de su actividad catalítica y que puede ser usadas repetidamente y de modo continuo” (Chibata, 1978)
El biocatalizador es más caro que la enzima nativa.
2.-) Ventajas e inconvenientes Como ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas podemos destacar:
El aumento de la estabilidad de la enzima. La posible reutilización del derivado, por lo que disminuye los costes del proceso. La posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control, adaptado a la aplicación de la enzima inmovilizada.
inconvenientes Como proceso de inmovilización:
del
La alteración de la conformación de la enzima respecto de su estado nativo. La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir distintas fracciones de proteínas inmovilizadas con un diferente número de uniones. Siempre suele haber una pérdida de inactividad de la enzima durante la inmovilización.
Tabla 1. Ventajas e inconvenientes del sistema de inmovilización de enzimas.
3.-) Métodos de inmovilización. Los numerosos métodos empleados para llevar a cabo la inmovilización de enzimas se han clasificado atendiendo a diversos criterios, como por ejemplo, la naturaleza física o química de la inmovilización (arroyo, 1998) o su carácter reversible o irreversible (brena y batista-viera, 2006).
Existen cinco métodos principales para inmovilización de enzimas o células: adsorción, unión covalente, entrecruzamiento, encapsulamiento y atrapamiento.
Algunos grupos funcionales de la enzima pueden dar lugar a fuertes enlaces covalentes que la unan a un soporte o a otras moléculas de la enzima, la inmovilización también puede ocurrir por adsorción de la enzima a un soporte. Las enzimas pueden ser inmovilizadas por atrapamiento, donde la enzima no da lugar a ningún tipo de enlace si no que esta retenida físicamente. Todos estos métodos se detallaran a continuación.
Adsorción
Los métodos más utilizados de inmovilización son:
Figura 2. Método de adsorción.
Atrapamiento
Tabla 2. Clasificación de los distintos métodos de
Figura 3. Método de
inmovilización de enzimas.
Atrapamiento
Unión covalente
Buena resistencia tanto al pH como a la presión. Buena disponibilidad. Bajo coste.
Dependiendo de las características físicas del soporte:
Diámetro de partícula Resistencia mecánica. Compresión.
También conociendo el tipo de reactor: Figura 4. Método de unión
covalente.
El proceso de inmovilización ideal para una enzima es aquel que le permite conservar una alta actividad catalítica en el paso del tiempo para ser utilizada continuamente. Dependiendo de la estructura de la proteína y del material, así como de las condiciones de reacción será el método de inmovilización a utilizar. 4.-) Soportes inmovilización.
de
La naturaleza de los soportes de inmovilización y el tipo de unión de la enzima con estos afecta de modo determinante al comportamiento de la enzima inmovilizada. Algunas de las características ideales de las que debería constar un buen soporte de inmovilización son:
Tanque agitado. Lecho empaquetado. Tanque continuo descontinuo.
o
Los soportes de inmovilización se pueden clasificar en dos grupos: soportes orgánicos y soportes inorgánicos. Los soportes de inmovilización inorgánicos presentan una alta estabilidad mecánica, química y frente a los ataques bacterianos. Mientras que los soportes orgánicos son mas versátiles, pueden ser diseñados y sintetizados en el laboratorio para provocar el tipo de interacción enzima-soporte deseado, la mayoría de los soportes de inmovilización empleados en aplicaciones industriales son de este tipo “orgánicos”.
Buena estabilidad mecánica. Adecuado tamaño de partícula y porosidad. Tabla 3. Clasificación de los distintos soportes de inmovilización.
5.-) Adsorción. Es el método más simple de inmovilización, se basa en enlaces débiles aunque tiene cierta eficacia en los procesos. Intervienen las fuerzas de Van der Waals, interacciones iónicas, y puentes de hidrogeno. Esta técnica es de bajo costo, fácil preparación, el soporte se puede recargar, pero uno de los inconvenientes es que el enlace es reversible y solo se puede monitorear la reacción en periodos cortos. Otros de los inconvenientes por mencionar son: hay fuga del biocatalizador, enlace inestable, no es posible controlar lo anterior y por lo tanto tiene un índice de reproducibilidad bajo.
Los soportes más utilizados se encuentran la carboximetilcelulosa, el almidón, el colágeno, sepharosa modificada, resinas de intercambio iónico, silica gel, oxido de aluminio, titanio, tierra de diatomeas, cerámica, hidroxiapatita, cerámica, etc. Todos los soportes dan bajas cantidades de proteínas (1 mg/g de soporte). 5.1.-) adsorción por interacción hidrofòbicas. La adsorción mediante interacciones hidrofòbicas tiene lugar debido a la afinidad que presenta entre si los grupos no
polares presentes en la enzima y el soporte. La fortaleza de la adsorción será mayor cuanto mayor sea el carácter hidrofóbico de ambos, el soporte y la enzima. 5.2.-) adsorción interacciones iónicas.
por
La adsorción de una enzima a un soporte mediante interacción iónica está basada en los principios que rigen las interacciones de naturaleza electrostática. Las cargas de la enzima interacción con aquellas de signo opuesto del soporte, dando lugar así a la inmovilización de la enzima. Cuando los soportes empleados poseen un gran número de cargas y los sustratos y productos de la reacción enzimática también están cargados, la cinética enzimática suele verse distorsionada y pueden ocurrir problemas difusionales. 5.3.-) afinidad.
adsorción
por
El principio de afinidad entre biomoléculas complementarias se ha aplicado también a la inmovilización de enzimas (Brena y batista-viera, 2006). La mayor ventaja de este método se encuentra en el alto grado de selectividad de la interacción ligando-enzima. Sin
embargo se requiere la unión covalente al soporte o matriz de un ligando de afinidad que suele ser caro. Este ligando unido al soporte es selectivo y se une por afinidad a la enzima, quedando esta inmovilizada. 5.4.-) adsorción por coordinación a un metal. Al depositar sobre un soporte solido ciertas sales o hidróxidos de metales de transición como mercurio, cobre, níquel, titanio o zirconio, se puede producir la coordinación del metal a determinados grupos nucleofilicos del soporte y posteriormente a la enzima, a este tipo de inmovilización se le conoce como inmovilización por unión a un metal. La precipitación de estas sales o hidróxidos de metales al soporte (celulosa, quitina, ácido algínico, silicatos) suele llevar a cabo mediante calentamiento o neutralización. El método es bastante simple y la actividad específica de las enzimas inmovilizadas por este método es bastante alta. Además, se trata de un método reversible, pues la elución de las proteínas inmovilizadas se pueden conseguir fácilmente por competición con ligando solubles o disminuyendo el pH. Sin embargo, la estabilidad operacional alcanzada es
variable y los resultados no son fácilmente reproducibles. 6.-) Atrapamiento Esta técnica consiste en la inclusión de la enzima por unión covalente o no, dentro de geles, fibras, matrices solidas porosas constituidas por prepolimeros fotoentrucruzables o polímeros del tipo poliacrilamida, colágeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano. Además minimiza la lixiviación de la enzima y mejora su estabilidad, pero con frecuencia resulta en limitaciones de transporte de sustrato/analito al sitio activo de la enzima. Esta técnica permite la posibilidad de adaptar el material de encapsulación para proporcionar el microambiente óptimo para la enzima. La encapsulación eficiente se ha realizado empleando alginato de calcio, que previene la perdida de la enzima y aumenta la estabilidad mecánica. El proceso de inmovilización se lleva a cabo mediante la suspensión de la enzima en una solución monómera, seguidamente se inicia la polimerización por un cambio de temperatura o mediante la adición de reactivo químico. El
atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen ser más resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada en el interior de un gel, mientras que en el segundo caso la enzima se encuentra ocluida dentro de las microcavidades de una fibra sintética. Como ventaja adicional, la enzima no sufre ninguna alteración en su estructura. Pero requiere de un control riguroso de las condiciones de polimerización, así como la comprobación de que la naturaleza del proceso no altera los grupos reactivos de la proteína. El atrapamiento por medio de nano materiales ha revolucionado el área de inmovilización de enzimas y ha ampliado el rango de aplicación en el campo de la química fina, biomedicina, biocombustibles, biosensores y medicina. 6.-1) Atrapamientos en gel o fibras. Uno de los métodos más utilizados para lograr la inmovilización de una enzima es su atrapamiento en n gel polimérico. Los geles empleados mayoritariamente son geles de carragenos, alginato, agarosa y poliacrilamida. En todos los
casos, la enzima queda retenida en los huecos intersticiales del soporte polimérico. La técnica consiste generalmente en disolver estos polímeros en agua, añadir la enzima desea en disolución y posteriormente enfriar la mezcla. En caso de los polímeros de acrilamida, la polimerización gel puede iniciarse a partir de un reactivo químico, directamente en presencia de la enzima. También se puede llevar a cabo en el atrapamiento de la enzima en geles de sílice obtenidos mediante procesos sol-gel, que consisten en la hidrolisis en agua de un alcoxido de silicio y un proceso posterior de policondensación (Gupta y Chaudhury, 2007; Brady y Jordan, 2009). 6.-2) micro encapsulación. La micro encapsulación consiste en rodear la enzima con una membrana semipermeable que permite el paso de moléculas de sustrato y de producto, pero no de la propia enzima (Arroyo, 1998). Estas membranas semipermeables pueden ser permeables o no permeables. 7.-) Unión covalente La inmovilización por unión covalente, se basa en el entrecruzamiento de la enzima
y el material del soporte produciendo un enlace fuerte y estable. Este enlace covalente es formado entre el grupo funcional de la matriz del soporte y la superficie de la enzima que contiene residuos de aminoácidos. Los residuos de aminoácidos que intervienen en la formación del enlace, son los grupos amino (NH2) de la lisina o arginina, el grupo carboxilo (COOH) del ácido aspártico o acido glutámico, los grupos sulfhidrilos de cisteína, los grupos hidroxilos (OH) de la serina o treonina. De entre los 20 aminoácidos diferentes que se encuentran en la estructura de las enzimas, los más empleados para la formación de enlaces con el soporte son principalmente la lisina, la arginina, la cisteína, la tirosina y la histidina, y en menor medida la metionina, el triptófano, la arginina y el ácido aspártico y glutámico. El resto de aminoácidos, debido a su carácter hidrófobo, no se encuentran expuestos hacia el exterior de la superficie proteica, y no pueden intervenir en la unión covalente. Los materiales utilizados en esta técnica incluyen la poliacrilamida, agarosa y silica, los polímeros de polisacáridos,
estos últimos son muy populares para la inmovilización de enzimas. La unión covalente requiere de dos pasos: la activación del material de soporte que se lleva a cabo por la adición de un compuesto reactivo y el segundo es la modificación del esqueleto del polímero para activar la matriz. Hay que prestar especial atención a que estos enlaces covalentes que se forman entre enzima y el soporte no afecten al centro activo de la enzima, pues en caso de hacerlo podría perder su actividad catalítica. La presencia de inhibidores u otros compuestos en el medio de reacción puede ayudar a evitar la pérdida de actividad, también son cruciales en el proceso de inmovilización parámetros como el tiempo de reacción, la temperatura, el pH o tampón utilizado. La inmovilización de enzimas mediante unión covalente a un soporte puede tener lugar mediante enlaces de distinta naturaleza (tipo diazo, peptídico, base Schiff, alquilación, arilacion o disulfuro) y la con la intervención de diversos reactivos, tal y como se muestra en la siguiente tabla 4.
Alguno de los soportes que se han empleado para llevar a cabo este tipo de inmovilización han sido los derivados de polisacáridos como paminobencil celulosa, maminoanisol celulosa, maminobencil-oximetil celulosa. 7.2.-) Formación de enlaces tipo peptídico. Tabla 4. Clasificación de los distintos tipos de unión covalente a un soporte
7.1.-) Formación de enlaces diazo. Este método consiste en la funcionalización del soporte con grupos diazonio capaces de enlazarse con restos amino, tirosil o histidil de la enzima. El soporte debe contener grupos amino aromático, que pueden ser introducidos mediante un espaciador, de modo que estos grupos amino se diazotan con ácido nitroso como paso precio a la inmovilización.
Figura 5. Acoplamiento diazo entre el soporte de inmovilización y la enzima
Este método de inmovilización está basado en la formación de enlaces peptídicos o de naturaleza similar entre el soporte de inmovilización y la enzima. Se trata de unir la enzima al soporte, mediante el mismo tipo de enlace que existe entre los distintos aminoácidos que forman a la proteína. Para ello, es necesario llevar a cabo la activación del soporte de inmovilización, mediante el uso de reactivos como: bromuro de cianógeno, carbonil dimidazol y cloroformiato en el caso de que le soporte contenga grupos hidroxilo, o reactivos tipo carbodimida si el soporte contiene grupos carboxilo. Existen otros reactivos, no tan empleados debido a su toxicidad o inestabilidad de los derivados generados, que también permiten la activación de determinados soportes que contienen grupos carboxilos o
amino para dar lugar a la formación de enlaces peptídicos con la enzima.
Figura 6. Diversos métodos de inmovilización enzimática mediante la formación de enlaces tipo peptídicos.
7.3.-) Formación de enlaces de Schiff. Este método de inmovilización está basado en la formación de bases de Schiff y posterior reducción de los mismos. Para ellos es necesario activar el soporte de inmovilización de modo que se obtengan grupos carbonilo capaces de reaccionar con los grupos amino presentes en la estructura de la enzima.
La activación del soporte se puede conseguir mediante oxidación con peryodato, en el caso de determinados polisacáridos o soportes activados previamente con glicidol. Otro método muy empleado consiste en utilizar un dialdehído, cuando se desea lograr la inmovilización de la enzima en soportes que contienen grupos amino Figura 7. Diversos métodos de inmovilización enzimática mediante la formación de bases de Schiff y posterior reducción. (E= enzima)
7.4.-) método de alquilación o arilación. Este método se basa en la inmovilización de una enzima mediante la alquilación o arilación de sus grupos amino, fenol o sulfhidrilos utilizando para ello reactivos espaciadores que se unen al soporte y a la enzima. Estos reactivos pueden ser oxiranos, divinilsulfona, haluros de sulfonio y triazina tal y como se detalla en la siguiente figura.
Figura 8. Diversos métodos de inmovilización enzimática mediante el método de alquilación o arilación. (E= enzima)
7.5.-) Reacciones de intercambio tio-disulfuro. El intercambio tio-disulfuro se produce entre grupos tiol presentes en la enzima y los residuos disulfuro mixtos del soporte. En primer lugar, se hace reaccionar un soporte que contiene grupos tiol con 2,2 ,dipiridildisulfuro obteniendo asi un derivado con enlaces disulfuro. Posteriormente, la enzima se enlasa por medio de sus grupos tiol y ocurre la liberación de 2tiopiridona. La característica principal de este enlace es su reversibilidad, pues a pesar de su carácter covalente, existen reactivos como ditiotreitol (DTT) que en condiciones suaves pueden romper esos puentes disulfuro establecidos entre la enzima y el soporte (Brena y Batista-Viera, 2006). En este método aporta la ventaja como la posibilidad de reutilizar el soporte, una vez que la actividad enzimática haya caído, eliminando la enzima agotada y sustituyéndola por enzima nueva. Como soportes de inmovilización ha sido empleados la agarosaglutation-2-piridil disulfuro (llamada sefarosa tíolactivada), agaraso-
mercaptohidroxipropieter-2pirdil disulfuro y agarosa-ácido adípico hidracina-N-acetilhomocisteina-2piridil disulfuro. Entre enzimas inmovilizadas por enlaces disulfuro podemos encontrar: anhidrasa Carbonica, β-galactosidasa, penicilina G-acilasa y lipasa.
Figura 9. Inmovilización enzimática mediante reacciones de intercambio tiol-disulfuro. (E= enzima)
8.-) Entrecruzamiento Reticulado.
o
La inmovilización por entrecruzamiento o reticulado ocurre en ausencia de un soporte sólido y consiste en la formación de enlaces intermoleculares entre diferentes moléculas de enzima por medio de reactivos bi-o multifuncionales. Estos reactivos pueden ser glutaraldheido, bisdiazobenzidina, entre otros que dan lugar a entrecruzamiento mediante formación de bases de Schiff, acoplamientos diazo, alquilación o enlaces peptídicos respectivamente. De todos ellos
el más usado entrecruzamiento glutaraldheído.
es el mediante
Entre las ventajas de este método se encuentran su simplicidad, y la disponibilidad de controlar el tamaño de partícula y las propiedades del producto final. Como inconvenientes podemos citar que las reacciones se realizan en condiciones relativamente severas, con lo que la conformación del centro activo de la enzima puede verse afectada, provocando una importante pérdida de actividad.
Figura 10. Inmovilización enzimática por entrecruzamiento con glutaraldehído.
9.-) Comparación entre los métodos de inmovilización. Todos los métodos de inmovilización presentan ventajas e inconvenientes con respecto al resto. No existe un método ideal y general para la inmovilización de cualquier enzima (Arroyo, 1998). Por lo tanto, la elección del método y condiciones de inmovilización
deberá realizarse en base a la enzima concreta a inmovilizar y a la aplicación posterior que se le va a dar a la preparación final obtenida. Otros factores como la naturaleza del sustrato, producto o tipo de reactor a emplear también son determinantes en la elección del método de inmovilizacion. En la siguiente tabla se muestra un resumen de las características generales de cada método de inmovilización (fortaleza del enlace, dificultad, regeneración del soporte, validez del método y coste del proceso), así como de las propiedades generales de las enzimas inmovilizadas por dicho método (actividad enzimática y estabilidad). No obstante pueden existir excepciones a estas tendencias generales debido a que un determinado tipo de enzima con un determinado tipo de soporte puede originar la aparición de características especiales distintas a las esperadas.
Tabla 5. Comparación entre los distintos métodos de inmovilización.
establecida por el Working on Immobilized Biocatalysis:
10.-) Elección del método. La elección a detener en cuenta las condiciones de la reacción biocatalizada, el tipo de reactor que se vaya a utilizar, el tipo de sustrato que se tenga que ser procesado y otros factores. En general, los métodos de preparación difícil y de mayor coste proporcionan biocatalizadores más estables y duraderos; en cambio aquellos métodos más sencillos como el atrapamiento o la adsorción, donde la unión de la enzima con el soporte es débil, origina derivados inmovilizados que presentan perdidas de actividad y que deben ser repuestos continuamente. Una vez elegido el método más conveniente, los derivados que preparemos deben estar caracterizados según las indicaciones
Tabla 6. Caracterización de un derivado inmovilizado.
11.-) Propiedades de enzimas inmovilizadas.
las
Cuando se inmoviliza una enzima se producen cambios en algunas de sus propiedades como pueden ser la actividad catalítica o estabilidad térmica (Brena y Batista-Viera, 2006). Estas modificaciones pueden ser debidas a varios factores. Al
interaccionar la enzima con el soporte de inmovilización pueden producirse cambios conformacionales en la estructura tridimensional de la proteína que afectan a su centro activo. Además, las interacciones que surgen entre el soporte y el sustrato, ya sean de naturaleza electrostática, hidrofòbicas o impedimentos estéricos, contribuyen a que la interacción entre la enzima inmovilizada y el sustrato tengan lugar en un microentorno diferente al de la solución. Todos estos factores actúan conjuntamente, dando lugar a la modificación de las propiedades de la enzima inmovilizada, y resulta difícil determinar que factor provoca un determinada cambio. 12.-) Actividad catalítica. La actividad catalítica de las enzimas generalmente se ve afectada tras el proceso de inmovilización (García-Gálan et al, 20011). Para que un método de inmovilización sea útil la enzima debe mantener su actividad catalítica tras la inmovilización, aunque a menudo esta disminuye. En algunas ocasiones puede llegar a perderse completamente la actividad
enzimática debido a factores como que: la enzima al inmovilizarse lo haga de tal forma que quede impedido el paso del sustrato al centro activo, algún grupo del soporte reaccione con el aminoácido del centro activo esencial para la actividad catalítica, ocurra un cambio conformacional durante la inmovilización que da lugar a una forma inactiva o las condiciones del proceso ocasiones la desnaturalización de la enzima (Arroyo, 1998). Cuando la enzima mantiene su actividad después de la inmovilización, los cambios (disminución o aumento de la actividad enzimática) se deberá principalmente a efectos difusionales, electrostáticos, estéricos y/o del microentorno. 13.-) Especificidad sustrato.
por
el
Cuando se lleva a cabo la inmovilización de una enzima la especificidad por su sustrato puede cambiar. En general, al inmovilizar una enzima sobre un soporte polimérico, su actividad hacia sustratos de elevado peso molecular disminuye debido a impedimentos estéricos, especialmente en el caso de inmovilización por atrapamientos; mientras que si el sustrato es de bajo peso molecular no suele observarse
cambios en enzimática inmovilización .
la actividad tras la
Una solución para minimizar estos impedimentos estéricos es la introducción de un brazo espaciador o cadena alquílica de dos a ocho átomos de carbono entre soporte y enzima. No obstante, se ha observado en algunos caso que la acción de determinas enzimas inmovilizadas frente a sustratos de levado peso molecular esta favorecida respecto a sustratos de bajo peso molecular, probablemente debido a fuerzas atractivas entre sustrato y soporte de inmovilización. 14.-) Constantes cinéticas. Por lo general, las constantes cinéticas se ven alteras cuando esta es inmovilizada. El estudio cinético de la enzima tras la inmovilización resulta de vital importancia para comprender como le ha afectado dicho proceso y cuáles son sus características finales. Hay que tener en cuenta que las constantes cinéticas medidas con enzimas inmovilizadas no son verdades constantes cinéticas equivalentes a las obtenidas en un medio de reacción homogéneo con enzimas en disolución, sino que se trata de
valores aparentes debido a efectos de difusión y otros factores físicos que tiene lugar. 14.1.-) Constante Michaelis (K m ).
de
En muchos casos, el valor de la constantes de Michaelis, K m, aumenta tras la inmovilización, lo que significa que disminuye la afinidad aparente de la enzima inmovilizada por el sustrato. En otras ocasiones, el cambio producido en el valor de Km debido a la inmovilización es pequeño o nulo, o incluso puede llegar a disminuir ocurriendo aparentemente un aumento de la afinidad de la enzima por su sustrato. Algunas explicaciones dadas a la modificación de los valores de Km hace referencia a cambios conformacionales de la enzima, interacciones electroestáticas entre soporte y el sustrato, adsorción del sustrato al soporte y limitaciones en la difusión del sustrato y/o producto, especialmente en el caso de inmovilización por atrapamiento. 14.2.-) (V max ).
Velocidad
máxima
Dependiendo al método de inmovilización escogido y de la naturaleza del soporte, la cantidad de enzima
inmovilizada y su conformación puede variar afectando así la velocidad máxima aparente, Vmax, que muestra dicha enzima al actuar sobre su sustrato. Existen casos en los que se ha descrito una mejor de Vmax tras la inmovilización y en otros muchos se ha descrito una disminución. Este parámetro nos da una información limitada, pues cuando ocurre un aumento de Vmax no se puede saber si se debe a una mayor cantidad de enzima inmovilizada o a un aumento de su actividad, por lo que es difícil establecer comparaciones entre distintos métodos de inmovilización o diferentes soportes. 15.-) Temperatura y pH. Cuando se lleva a cabo la inmovilización de una enzima, estos valores óptimos de temperatura y pH pueden verse alterados. Un buen método de inmovilización será aquel que permita a la enzima actuar con una actividad catalítica máxima durante un mayor rango de temperaturas y pH. 16.-) Estabilidad. En muchos casos se observa un incremento en la estabilidad de las enzimas después de su inmovilización. Este fenómeno puede ser debido a una
estabilización conformacional de la enzima (ocasionada por una mayor rigidez de su estructura y prevención de la disociación de sus subunidades), a la protección que ejerce el soporte frente a proteasas del medio, a una disminución de los problemas de agregación intermolecular o a la creación artificial de un microentorno favorable para la enzima como resultado de la inmovilización. Hay diferentes estabilidades dependiendo a la interacción de algunos factores:
Estabilidad hacia reactivos. Estabilidad hacia enzimas proteolíticas. Estabilidad Térmica. Estabilidad operacional. Estabilidad durante el almacenamiento. Estabilidad frente al pH
17.-) Aplicación de enzimas inmovilizadas.
las
La inmovilización de enzimas ha dado lugar principalmente a aplicación en los campos del análisis, la medicina, la industria y el medioambiente. Entre algunas aplicaciones se encuentran:
biosensores. Tratamientos con enzimas inmovilizadas. Biocatalizadores
Referencias: http://www.bionova.org.es/biocast /documentos/tema14.pdf https://www.google.com.mx/url?s a=t&rct=j&q=&esrc=s&source=we b&cd=1&cad=rja&uact=8&sqi=2& ved=0CBwQFjAA&url=http%3A%2 F%2Fwww.researchgate.net%2Fpr ofile%2FMiguel_Arroyo%2Fpublica tion%2F237564145_Inmovilizacin _de_enzimas._Fundamentos_mtod os_y_aplicaciones%2Flinks%2F00 b7d524d21ceec982000000.pdf&ei =fyk8VbOUD8yoNtvygYgC&usg=A FQjCNEPSChoeJQ8yJP4phr_XJnV8 Xbyqg&sig2=1NjGbOHfbrpfM9usA d2S7Q&bvm=bv.91665533,d.eXY http://iqtma.cps.unizar.es//compo nents/com_docman/dl2.php?archi ve=0&file=SU5NT1ZJTElaQUNJX05 fREVfRU5aSU1BUy5wZGY= http://sgpwe.izt.uam.mx/files/use rs/uami/sho/Tema_10_Biotec_Enzi mas.pdf
