TEMARIO 2 Métodos y tecnicas microbiologicas basicas 2.1 Aislamiento y seleccion de microorganismos 2.1.1 Reservorio de microorganismos microorganismos 2.1.1.1 Agua, suelo y aire 2.1.1.2 Animales y plantas 2.1.1.3 Colecciones 2.1.2 Metodos y tecnicas de aislamiento y seleccion 2.1.2.1 Estria en placa 2.1.2.2 Vertido en placa 2.1.2.3 Extension en placa con varilla de vidrio 2.1.2.4 Enriquecimiento poblacional 2.1.2.5 Diluciones en serie 2.1.2.6 Micromanipulacion 2.1.2.7 Otros 2.1.3 Seleccion de microorganismos de interes industrial screening 2.2 Cultivo de microorganismos 2.2.1 Clasificacion de los microorganismos con base a sus requerimientos nutricionales 2.2.2 Tipos de nutrientes 2.2.2.1 Macronutrientes 2.2.2.2 Micronutrientes 2.2.2.3 Factores de crecimiento 2.2.3 Medios de cultivo 2.2.3.1 Evolucion y clasificacion de los medios de cultivo 2.2.3.2 Preparacion de medios de cultivo 2.2.4 Metodos de cultivo 2.2.4.1 Cultivo mixto 2.2.4.2 Cultivo puro o axénico 2.2.4.3 Cultivos en ambiente controlado 2.2.5 Esterilizacion y asepsia 2.2.5.1 Conceptos e importancia 2.2.5.2 Metodos de esterilizacion 2.2.5.3 Muerte termica valores D y Z 2.3 Criterios utilizados en la identificacion de microorganismos 2.3.1 Caracteres morfologicos y fisiologicos 2.3.2 Pruebas bioquimicas 2.3.3 Caracteres quimiotaxonomicos 2.3.4 Antigenos microbianos 2.3.5 Caracteres geneticos 2.4 Preservacion de microorganismos 2.4.1 Objetivos de la preservacion 2.4.2 Concepto y utilidad del cepario 2.4.3 Metodos de mantenimiento y preservacion y su viabilidad
2.1 Aislamiento y Selección de Microorganismos
2.1.1 RESERVORIO DE MICROORGANISMOS 2.1.1.1 Agua, Suelo y Aire Diversidad en Ambientes Raramente podemos encontrar a los microorganismos como cultivos puros. Cada especie de cada microorganismo se encuentra en diferentes ambientes donde existen las condiciones necesarias para su crecimiento: agua, suelo y aire, por lo que también las técnicas de aislamiento será diferente para cada ambiente y para cada especie de microorganismo. Agua El agua es un amiente donde existen diferentes microorganismos y cada uno de ellos realizan diferentes actividades en el ambiente. También, los microorganismos forman parte esencial en la cadena alimenticia, así mismo, también son instrumentos en el proceso de reciclaje de elementos presentes en el agua. Llamaremos por agua a los ambientes acuáticos a todas las extensiones de agua presentes en el globo terráqueo: mares, ríos, arroyos, aguas domésticas, aguas residuales, etc. Distribución de los Microorganismos Plancton
Es una forma de vida flotante y a la deriva en extensiones de agua. Son móviles debido a las características de flotación que presentas, algunas de ellas están cubiertas por gotas de aceite o simplemente por la estructura que presenta. Existen dos grupos principales: fitoplancton, que son todas las algas; y el zooplancton, lo constituyen los protozoos y los animales vivos diminutos. Microorganismos Bentónicos
Esta clase de microorganismos habitan en el fondo de una masa grande de agua y ésta a su vez es la región más rica en microorganismos de un estuario marino puesto que contiene millones de microorganismos por gramo de agua. El Papel de los Microorganismos Algas:
Son productores primarios
Predominan en el fitoplancton
Por fotosíntesis cambian energía radiante en compuestos químicos.
Protozoos: •
Se alimenta del fitoplancton
•
Evita la luz y hace migraciones diurnas
Presentes en la región del zooplancton
Plancton: ›
Fuente de alimento de peces, ballenas, calamares.
›
Capacidad de producir materia orgánica ”fertilidad delos océanos”.
›
›
Crecimiento dependiente de energía radiante, CO2, N2 orgánico y de compuestos de fósforo. Producen color característico de algunos mares.
Suelo El suelo es otro de los ambientes donde abundan los microorganismos. Debido a que en este medio se depositan diversos residuos, ocurren cambios en la naturaleza y ambiente, todos estos cambios, sin embargo, son modulados y controlados por diferentes clases de microorganismos. Bacterias, hongos, algas, protozoos y virus son abundantes y se presentan en cantidades de miles de millones de organismos por gramo de suelo. Debido a la gran diversidad de microorganismos, al realizar un cultivo muestra sólo se puede recuperar un pequeño sector de todos los miles de microorganismos presentes. Es por ello que se requiere de muchos estudios para conocer y clasificar a los microorganismos. Esta es una labor extenuante porque, como ya mencionamos, existe un gran número de microorganismos por cada gramo de suelo. Los microorganismos principalmente realizan los cambios de materia mediante un proceso bioquímico: cambios químicos de compuestos orgánicos e inorgánicos y los procesos cíclicos del ciclo del nitrógeno y la fijación del nitrógeno.
Fijación de Nitrógeno
Transformación del N2 atmosférico en nitrógeno de un compuesto.
Microorganismos no simbióticos: Viven libres en independientes en el suelo › Microorganismos simbióticos: › — Viven en raíces de algunas plantas — Bacterias del género Rhizobium — Se establecen en las células de hospedador (raíz) —
Fijación Simbiótica del Nitrógeno
Células aumentan tamaño formando nódulos
Leguminosas, bacterias y nódulos= sistema de fijación.
Bacterias hacen el nitrógeno aprovechable por la planta
Bacterias utilizan nutrientes de los tejidos de la planta.
Aire
Este ambiente es distinto de los anteriores. Acá los microorganismos no cuentan con las condiciones necesarias para su crecimiento ni reproducción sino sólo servirá como vehículo o medio de transporte que las esparcirá por los diferentes ambientes, ya sea en forma de gotitas o acompañadas de polvo. La cantidad de microorganismos presentes en el aire está en función de las fuentes de contaminación y la sobrevivencia de los microorganismos está definida por las condiciones atmosféricas, humedad, luz solar y temperatura. Contenido microbiológico del Aire - Dentro de los edificios Está influido por las corrientes de ventilación, generalmente los microorganismos son depositados en el aire en pequeñas gotitas que fluyen de la nariz y la boca, estas partículas micrométricas quedan en el aire que posteriormente se desplazarán por la presencia de corrientes de aire y las partículas más grandes quedarán fijadas en el. También dependerá del número de personas dentro del edificio, poco número de personas indica que también habrá poco número de microorganismos, a mayor número de personar la cantidad de microorganismos también aumentará. - Atmósfera El contenido microbiano estará definido por partícula de polvo proveniente del suelo, gotas de agua provenientes de masas de agua, agentes contaminantes generados por actividades industriales, agrícolas y domésticas. Las esporas de hongos son las más abundantes en este ambiente. 2.1.2 Animales y Plantas Animales En los animales también podemos encontrar diferentes microorganismos, algunos son dañinos para la salud produciendo enfermedades, alguna curables y otras no, pero también encontramos a los que están relacionados o qué la sobrevivencia depende de la relación microorganismo-animal. Debido a la alimentación de cada animal, se dice que estos no pueden sobrevivir con preses pequeñas en relación a su tamaño: microorganismos. Los microorganismos que habitan en los animales generalmente son hospedadores de los tractos intestinales donde estos microorganismos contribuyen a la digestión y algunos a la producción de vitaminas y los desechos de los animales forman parte del ciclo del nitrógeno donde nuevamente los microorganismos desempeñan un papel importante.
No todos los microorganismos son benéficos para los animales, algunos tienen interacciones negativas. Existen las depredaciones por hongos y nematodos; las que alteran el habitad: Eutroficación: agota el oxígeno disuelto y puede provocar la muerte de los peces, alteraciones en los alimentos (bioacumulación), la producción de toxinas y las que causan infecciones. Plantas Las plantas son un habitad microbiano que varia dependiendo de la temperatura de las plantas a lo largo del día como del año. Los microorganismos no se transfieren fácilmente de planta a planta y éstos se hospedan principalmente en las raíces de la misma donde realizan las funciones simbióticas. Los microorganismos satisfacen sus requerimientos básicos para su crecimiento y reproducción; así como los microorganismos se benefician con las plantas, las plantas también tienen influencia de los microorganismos: el reciclado y la solubilización de los nutrientes minerales; síntesis de vitaminas, aminoácidos,
No todos los microorganismos son benéficos para los animales, algunos tienen interacciones negativas. Existen las depredaciones por hongos y nematodos; las que alteran el habitad: Eutroficación: agota el oxígeno disuelto y puede provocar la muerte de los peces, alteraciones en los alimentos (bioacumulación), la producción de toxinas y las que causan infecciones. Plantas Las plantas son un habitad microbiano que varia dependiendo de la temperatura de las plantas a lo largo del día como del año. Los microorganismos no se transfieren fácilmente de planta a planta y éstos se hospedan principalmente en las raíces de la misma donde realizan las funciones simbióticas. Los microorganismos satisfacen sus requerimientos básicos para su crecimiento y reproducción; así como los microorganismos se benefician con las plantas, las plantas también tienen influencia de los microorganismos: el reciclado y la solubilización de los nutrientes minerales; síntesis de vitaminas, aminoácidos, auxinas, citoquinas y giberelinas; síntesis de sustancias alelopáticas (antagónicas) inhiben crecimiento de otras plantas.
2.1.2 MÉTODOS Y TÉCNICAS DE AISLAMIENTO Y SELECCIÓN Una vez conocidos los habitad de los microorganismos, podemos extraer algunos de ellos para su estudio, al aislamiento de un microorganismos en un medio de cultivo se le conoce como cultivo puro. Los cultivos puros se pueden lograr por diferentes técnicas de muestreo y aislamiento. También es menester mencionar que se debe tener cuidado en contar con las condiciones adecuadas para el crecimiento de las bacterias: pH, nutrientes requeridos, temperatura para el crecimiento y reproducción, etc.
2.1.2.1 Estría en Placa. El inóculo se siembra sobre la superficie de un medio del tipo del agar nutritivo, en una caja Petri, haciendo estrías con una aguja enmangada o con una asa bacteriológica. El método más utilizado es por cuadrantes (ya sea por dilución o conservación).
2.1.2.2 Vertido en Placa El inóculo se deposita en mezclas de agar fundido, posteriormente son vaciadas en cajas petri. Algunas de las colonias crecerán en la superficie del medio después del periodo de incubación.
2.1.2.3 Extensión en Placa con Varilla de Vidrio Se coloca una gota de inóculo en el centro de una caja petri con un medio del tipo agar nutritivo y utilizando un tubo de vidrio doblado o con un asa Diralsky se extiende el inóculo sobre la superficie del medio. Puede utilizarse la misma varilla de vidrio para inocular una segunda placa para asegurar una adecuada “dispersión” de las células. En algunas cajas aparecerán colonias aisladas.
2.1.2.4 Enriquecimiento Poblacional Para mejorar la probabilidad de aislar un organismo que posee una característica fisiológica o bioquímica única, se puede sembrar por estría, por extensión en placa o en masa, pasando el inóculo a través de una serie de transferencias, a un medio de una composición (y condiciones de incubación) que favorezcan el desarrollo del microorganismo deseado. El procedimiento de enriquecimiento aumenta en efecto la proporción del organismo deseado en relación con la que estaba presente en el inóculo inicial.
2.1.2.5 Diluciones en Serie Esté método permite reducir la concentración de los microorganismos cuando éste crezca demasiado. Este es uno de los métodos mas sencillo y barato y se pueden obtener un número definido de colonias.
2.1.2.6 Micromanipulación Mediante un micromanipulador se puede usar una micropipeta para obtener un solo microorganismo de una suspensión de células en un líquido, mientras se
examina la preparación con el microscopio. La célula aislada es luego transferida a un medio estéril.
Micromanipulador
2.1.3 SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS DE INTERÉS INDUSTRIAL: SCREENING Detección y aislamiento de microorganismos de interés industrial de entre una población compleja de organismos utilizando procedimientos selectivos.
Screening Primario: Detección y aislamiento de microorganismos potencialmente útiles. Screening Secundario: Estudio de los microorganismos aislados en el screening primario para separar los que tienen interés potencial de los que tienen interés real y mejorar estas cepas seleccionadas.
Para llevar a cabo un screening primario generalmente se parte de una población mixta (suelo, fermentaciones naturales, etc.) donde existe tanto una gran cantidad como variedad de microorganismos potencialmente útiles que debemos seleccionar. Para ello lo primero que hacemos es utilizar medios selectivos donde crezca el tipo de microorganismo que nos interesa aislar. A este medio se le pueden añadir inhibidores para eliminar los que no nos interesan. Por ejemplo, si queremos obtener un microorganismo aerobio lo creceríamos en presencia de O2 con lo que los anaerobios no crecerían; o bien si queremos seleccionar hongos, añadiríamos cloranfenicol, antibiótico que actúa frente a bacterias pero que no afecta a los hongos. Los parámetros generales que tenemos que tener en cuenta son la fuente de carbono, fuente de nitrógeno, aireación, temperatura, pH e inhibidores. Posteriormente se reaíslan en cultivo puro aquellos microorganismos que hemos aislado para su posterior estudio.
