Dicroísmo Circular
El dicroísmo circular es una técnica de espectroscopia de absorción electrónica, basada en el cambio de configuración electrónica molecular de un estado fundamental a un estado excitado, debido a la absorción de radiación electromagnética polarizada. La teoría de dicroísmo circular fue desarrollada por Biot Neumann y Fresnel Snatzke en el año 1990. La finalidad de este trabajo es la de conocer acerca de esta técnica, los aspectos instrumentales y aplicaciones que posee, como lo son el análisis de proteínas, ácidos nucleicos y los análisis nanoestructurales, ya que ayuda a determinar sus composiciones y las interacciones de estas moléculas.
Cuáles son los antecedentes históricos de la técnica del dicroísmo circular Cuál es la instrumentación para la técnica del dicroísmo circular Como se da la preparación de la muestra Como ayuda el DC en el análisis de proteínas, ácidos nucleicos y nanoestructuras.
La teoría de la actividad óptica ha recorrido un largo camino desde que este fenómeno se observó por primera vez por Arago en 1811. Posteriormente, Jean Baptiste Biot demostró que el plano de polarización de la luz se alteraba después de pasar a través de un cristal de cuarzo (Biot, 1812). Louis Pasteur interpretó estas observaciones a nivel molecular, en 18 48, época en la cual no se comprendía la conformación tridimensional de las moléculas (Fasman, 1996). Sin embargo, Pasteur demostró que el ácido tartárico existe en dos formas asimétricas que giran gi ran el plano de polarización en diferentes direcciones. En 1874, Le Bel y Van`t Hoff (Van‘t Hoff , 1875) relacionaron el poder rotatorio a la disposición asimétrica de los sustituyentes de un átomo de carbono saturado, identificando los fundamentos de la estereoquímica. Mediante la definición de quiralidad, la química fue reconocida como una herramienta poderosa, capaz de explicar las propiedades de los azúcares y de muchos otros compuestos orgánicos y, que posteriormente condujo al desarrollo de nuevas metodologías analíticas, tales como la dispersión óptica rotatoria (ORD) y la espectroscopia de dicroísmo circular (Berova, 2000). La primera teoría adecuada del poder óptico rotatorio fue presentada por Born, investigada exhaustivamente por Kuhn y luego reformulada por Rosenfeld en 1928 19 28 (Rosenfeld , 1928), quien introdujo la ecuación, con su mismo nombre, para el cálculo de la fuerza rotacional de una transición, que está relacionada a su intensidad en el espectro DC (Martínez, 2012). Debido a la sensibilidad del DC y ORD para la estructura secundaria de proteínas, se intentó hacer la predicción del espectro óptico de los polipéptidos. En 1956, Fitts y Kirwood calcularon la rotación óptica de un péptido helicoidal usando la teoría de la polarizabilidad, mientras que Moffitt en los años 50s hizo el cálculo empleando la Teoría del exciton. Moffitt demostró que el acoplamiento del dipolo eléctrico que permite transiciones electrónicas, en una disposición helicoidal, conduce a una transición que está en una combinación en fase, con una polarización neta paralela al eje de la hélice, y dos transiciones que están en una combinación fuera de fase, con una polarización neta perpendicular al eje de la hélice (Amano, 2014). Así, correctamente predijo la naturaleza de la α-hélice dextrógira en proteínas. Esto sucedió años antes de que se resolviera, por primera vez, la estructura cristalográfica de una proteína por rayos X. Sin embargo, esta aproximación no se desarrolló fácilmente con un método cuantitativo. En 1961, Doty estableció la dependencia de ORD en el contenido de α-hélices e identificó las transiciones tr ansiciones electrónicas del grupo peptídico como la fuente más probable de poder rotatorio de las proteínas. Después confirmó, experimentalmente, los cálculos de Moffitt de la división del excitón, al resolver las tres bandas electrónicas del péptido y atribuyéndolas atr ibuyéndolas a las transiciones n * y *, respectivamente (Holzwarth & Doty P, 1965).
Basados en los estudios mencionados, se ha vuelto factible calcular el espectro de DC de moléculas y hoy en día, se emplea de manera rutinaria para moléculas pequeñas, por ejemplo, para determinar la configuración absoluta de compuestos sintetizados o aislados. Sin embargo, la estimación del DC de proteínas sigue siendo un reto, debido a su tamaño y flexibilidad. (Universidad de Alicante, 2013). Para el cálculo del espectro óptico de moléculas grandes, tales como proteínas y cristales, se han desarrollado varios métodos que hacen frente al tamaño de estos sistemas. El modelo de interacción del dipolo considera que los átomos y cromóforos actúan como dipolos oscilatorios puntuales, que interactúan entre sí durante los momentos dipolares inducidos en presencia de un campo eléctrico. Toda la instrumentación para DC disponible comercialmente utiliza la técnica de modulación dada a conocer por Grosjean y Legrand. La luz de un monocromador es polarizada linealmente, luego pasa a través de un dispositivo de modulación, un modulador, que convierte la luz polarizada linealmente a luz polarizada circularmente, alternando entre luz polarizada circularmente a la izquierda (lcpl) y luz circularmente polarizada a la derecha (lcpr) a la frecuencia de modulación. La luz incidente en la muestra se modula entre polarización circular derecha e izquierda, entonces si la muestra presenta DC, la intensidad de la luz detectada por el fotomultiplicador también se va a modular a la misma frecuencia. (Fina, 2012). La corriente en el circuito del fotomultiplicador consistirá, por tanto, de una pequeña corriente alterna (ac) y una corriente directa larga (dc). Los componentes de estas corrientes están separados y el componente de la ac se amplifica. La razón de las corrientes ac y dc es directamente proporcional a la diferencia en absorbancia para rcpl y lcpl. El componente dc se mantiene a un nivel constante por un sistema servo que ajusta el alto voltaje aplicado al fotomultiplicador. (Denicola, 2014). Así, ∆ε es directamente proporcional al componente ac y por lo tanto a la ganancia del amplificador. Un sistema Peltier controla la temperatura. También se requiere un conjunto de celdas de cuarzo de alta calidad con buena transmisión en el UV lejano (ya sean rectangulares o cilíndricas) con longitudes de trayectoria que van de 0.1 a 10 mm. Las micro o semimicro celdas con longitud de trayectoria de 10 mm se utilizan particularmente para mediciones de DC en el UV cercano empleando volúmenes pequeños (0.25 ml). Las celdas con longitudes de trayectoria menores a 1 mm siempre se deben calibrar. (Universidad Nacional de San Luis, 2013). Esto se hace fácilmente usando la celda para registrar un espectro de absorción convencional de cualquier solución con absorbancia conocida con precisión. Las celdas tienen algo de deformación intrínseca que da lugar a artefactos de DC significativos, y aunque se puede tolerar la deformación moderada, es posible eliminar los efectos de la deformación al orientar la celda siempre en la misma dirección que el instrumento. Las celdas se deben limpiar inmediatamente después de usarlas para evitar la acumulación de depósitos de proteína difíciles de eliminar. Después de limpiar las celdas se deben enjuagar con agua destilada, luego con etanol, y secarlas usando una bomba de aire o mediante evaporación. Todos los reactivos empleados deben ser de la más alta pureza posible. Es particularmente importante que cualquiera de los solventes orgánicos empleados sea de pureza espectroscópica y se debe verificar la ausencia de impurezas. (Billardon & Badoz, 1966) Todas las muestras deben de ser de la más alta pureza posible. Se pueden obtener resultados erróneos incluso cuando existan niveles relativamente bajos de impurezas, si estos tienen señales de DC fuertes. Por ejemplo, señales débiles de proteínas en el UV-cercano pueden saturarse por señales fuertes de niveles relativamente pequeños de ácidos nucleicos contaminantes. (Universidad Nacional de San Luis, 2013). Uno de los principales problemas en las medidas de DC es que las señales se distorsionan significativamente si no llega la suficiente luz al fotomultiplicador y, en términos prácticos, esto quiere decir que no se pueden hacer
medidas confiables en muestras con una absorbancia (muestra + solvente) mayor a 1. Siempre se debe verificar el espectro de absorción de una muestra para comprobar que no se supere este límite de absorbancia. En el UV-lejano, las mediciones de absorbancia de la muestra por sí misma son generalmente bastante pequeñas, y el principal problema surge de la absorción de los componentes del amortiguador, casi todos los cuales limitarán la penetración del UV-lejano en cierta medida (Billardon & Badoz, 1966). La mayoría de los componentes de los amortiguadores generalmente permitirán mediciones de DC por debajo de 200 nm (Johnson, 1996b). Sin embargo, se deben evitar siempre que sea posible, altas concentraciones de cloro y nitrato, ciertos solventes (dioxano, DMSO), altas concentraciones (>25 mM) de algunos amortiguadores biológicos (HEPES, PIPES, MES), altas concentraciones (>0.25 mM) de quelantes comunes (EGTA/EDTA), y altas concentraciones (>1 mM) de agentes reductores (ditiotreitol y 2 mercaptoetanol). También es digno de mencionar que el agua destilada almacenada en botellas de polietileno, generalmente, conducirá a una transparencia pobre en el UV lejano debido a la presencia de polímero eluído. Los espectros de DC de proteínas de membrana se registran en su forma solubilizada en detergente para evitar artefactos derivados de la dispersión de la luz diferencial y de la absorción plana (Fasman, 1996). Los espectros de DC de proteínas en el UVlejano (260-178 nm) son intensos, y se requieren cantidades relativamente pequeñas para registrarlas. Debido a que todos los enlaces peptídicos contribuyen al espectro observado, la cantidad de material (medido en mg/ml) es efectivamente igual para cualquier proteína. Las mediciones se hacen casi invariablemente en celdas de longitud de trayectoria corta para reducir la absorción por los componentes del amortiguador. Normalmente se utilizan 200 μl de una
solución 0.1-0.15 mg/ml cuando se emplea una celda con longitud de trayectoria de 1 mm o 30 μl de una solución de 1.0 -1.5 mg/ml cuando se utiliza una celda de 0.1 mm (desmontable). Esta última es preferible para una buena penetración en el UV-lejano, pero el material generalmente no se recupera. (Lugo, 2003). Los espectros de DC en el UV-cercano de las proteínas son, generalmente, de un orden de magnitud más débil que los espectros de DC en el UV lejano. Registrarlos por tanto requiere muestras más concentradas y/o longitudes de trayectoria más largas. Los espectros se registran comúnmente bajo condiciones similares a aquellas utilizadas para medir un espectro de absorción convencional, por ejemplo, utilizar una celda de longitud de trayectoria de 10 mm y pretender un pico de absorbancia en el rango de 0.7-1.0. (Glosario Químico, 2015). Se pueden utilizar soluciones menos concentradas si las señales de DC son intensas y las muestras más concentradas, pueden de hecho, ser evaluadas utilizando celdas de longitud de trayectoria corta, cuando sea necesario. Los espectros de DC de ácidos nucleicos en el UV-cercano, los cuales son significativamente más fuertes que los de las proteínas, se deben registrar con un pico de absorción en el rango de 0.7-1.0. (Fasman, 1996). La estructura secundaria de las proteínas se puede determinar por espectroscopía de DC en la región espectral del ―UV lejano (190-250 nm). A estas longitudes de onda, el cromóforo es el enlace peptídico, y la señal se origina cuando éste se localiza en un ambiente regular plegado (Kelly & Price, 1997). La energía más débil de transición en el cromóforo del péptido es una transición n * observada a 210-220 nm, que involucra electrones no enlazantes de 0 del carbonilo. Sin embargo, la energía más fuerte es una banda de absorción centrada a 190 nm debido a la transición que involucra los electrones del carbonilo. Por lo tanto, la intensidad de las transiciones depende de los ángulos de torsión de y ψ. Las α-hélice, las hojas β, y las estructuras helicoidales aleatorias dan lugar a un espectro de DC de forma y magnitud característica, respectivamente (Kelly & Price, 1997). Existen espectros de DC particulares para revelar la estructura secundaria de cualquier proteína. Tal como se determinó, para los espirales al azar, el espectro de DC en el UV lejano es positivo a 212 nm (n ) y negativo a 195 nm ( *). El
espectro de DC de las hojas β es negativo a 218 nm ( *) y positivo a 196 nm (n ). Para una α hélice, el acoplamiento del excitón de la transición * conduce a un espectro ( *) perpendicular positivo a 192 nm, ( *) paralelo negativo a 208 nm, y negativo a 222 nm desplazado hacia el rojo (Manavalan & Johnson, 1987) . La fracción aproximada de cada tipo de estructura secundaria que está presente en cualquier proteína se puede determinar analizando su espectro de DC en el UV-lejano como una suma de múltiplos fraccionarios de tales espectros de referencia para cada tipo estructural. Aunque el espectro de DC refleja un promedio de la totalidad de las moléculas. Técnicamente, el espectro de DC en el UV lejano requiere una solución de 20-200 µL con 1 mg/mL a 50 µg/mL de proteína, en cualquier amortiguador que no tenga una absorbancia alta en esta región del espectro (Universidad de Almeria, 2011). Los nucleótidos son los principales bloques de construcción, que constituyen la estructura asimétrica de los ácidos nucleicos (RNA/DNA). El azúcar quiral de los nucleótidos tiene una asimetría intrínseca y la fuerte interacción de la transición * de las bases cromofóricas con la alta energía en los azúcares produce un DC de baja intensidad (Van Holde, 1998). De hecho, el DC de ácidos nucleicos depende principalmente de la geometría de apilamiento de las bases. El DC de un dinucleósido fosfato de adenosina es aproximadamente de un factor 10 veces mayor que el DC de una adenosina. En la adenosina, el DC depende de la interacción de la adenina con su ribosa y los grupos fosfato; mientras que en los dinucleósido fosfato, el DC se origina principalmente de la interacción quiral adenina-adenina. La combinación de los extremos positivo y negativo en ambos extremos de los 260 nm se denomina banda del excitón; existe otra banda del exciton a 215 nm. (Universidad de Almeria, 2011) . Tanto el ARN-A y el ADN-A tienen espectros de forma similar, el ARN-A tiene un máximo cercano a 260 nm, un mínimo cercano a 210 nm, y un DC negativo pequeño entre 290 y 300 nm. El ADNA tiene un máximo a 270 nm, un mínimo cercano a 210 nm y un DC cero a 300 nm y más allá (Bloomfield, 2000). El ADN-B tiene un espectro de DC conservado por encima de 220 nm con componentes aproximadamente iguales positivos (275 nm) y negativos (245 nm) centrados alrededor de 260 nm (Universidad Nacional de San Luis, 2013). El máximo del ADN-B tiene menos de la mitad de la magnitud máxima del ADN-A. Por supuesto, las formas y magnitudes exactas del espectro de DC dependerá de la secuencia de bases, pero el conjunto de patrones permanecerá constante (Universidad de Alicante, 2013). El ADN-Z tiene un espectro conservado arriba de 240 nm con componentes positivos (260 nm) y negativos (290 nm) aproximadamente iguales centrados alrededor de los 280 nm. Empleando DC de vacío se ha demostrado que los ácidos nucleicos dextrógiros (ADN-A, ADN-B, ARN-A) tienen un pico positivo intenso cercano a 186 nm y un DC negativo debajo de 180 nm; las moléculas levógiras (ADN-Z, ARN-Z) tienen un pico negativo intenso a 190-195 nm, un híbrido a 184 nm, y un pico positivo por debajo de 180 nm. Los cálculos de DC para secuencias distintas a las medidas muestran que por debajo de 220 nm las dobles hélices dextrógiras tienen un DC positivo pareado y los dúplex levógiros tienen uno negativo pareado. Por lo tanto, un buen método para determinar el sentido de una hélice dúplex es medir el DC en el rango de longitudes de onda de 170 a 220 nm. En resumen, el DC es la técnica más utilizada para comparar las conformaciones de ADN o ARN y para detectar cambios cuando se cambia el solvente o la temperatura. (Bloomfield, 2000) La determinación del comportamiento conformacional de las biomoléculas adsorbidas en una superficie de nanopartículas utilizando DC merece cierta atención (Liu, 2007). Aunque de un espectro de DC no es posible determinar exactamente si una biomolécula mantiene su actividad biológica, es posible estimar el grado de desnaturalización de una proteína o ácido nucleico comparando el espectro de DC de la forma nativa y de la forma inmovilizada en una superficie.
Por ejemplo, empleando DC, se han estudiado proteínas del plasma [tales como albúmina de suero bovino (BSA) y fibrinógeno en plasma humano (FNG)] adsorbidas en diversas estructuras de nano polímeros y se demostró que el contenido de α -hélices de BSA y FNG disminuye en poli(2-metoxietilacrilato) (PMEA), PHEMA, y poli(2-etilhexilacrilato) (PEHA) comparado con BSA y FNG nativos. (Amano, 2014). Por consiguiente, el contenido de estructuras secundarias se pudo analizar cuantitativamente basándose en el espectro de DC y fue obvio que el contenido de α-hélices de BSA nativa, BSA absorbida en la superficie de PMEA, PHEMA, y PE HA fueron 51%, 37%, 15% y 8%, respectivamente. Del mismo modo, el cambio conformacional del ADN una vez que interactúa con las nanopartículas funcionalizadas se ha determinado empleando DC. Algunos estudios revelaron que nanopartículas de amonio funcionalizadas cuaternariamente cambian la señal de DC en una medida sustancial. (Universidad de Alic ante, 2013). Por ejemplo, las nanopartículas catiónicas terminadas en amina (tales como NP_L-Phe) desnaturalizan la estructura secundaria del ADN, por la disminución de la elipticidad a 280 nm después de la adición de las nanopartículas. En el caso de las nanopartículas con cadenas laterales hidrofóbicas, los espectros de DC de las cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, NP_L-Trp y NP_L-Phe) mostraron un desenrrollamiento más eficiente en comparación con las cadenas laterales alifáticas (por ejemplo, NP_L-Leu; Figura 19B). Este desenrrollamiento aumentado surge probablemente del apilamiento de los anillos aromáticos en la cadena lateral con las bases de ADN. (Amano, 2014)
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