CENTRO PAULA SOUZA ETEC CONSELHEIRO ANTONIO PRADO TÉCNICO EM QUÍMICA
ANÁLISE QUÍMICA INSTRUMENTAL
DETERMINAÇÃO DE CAFEÍNA EM BEBIDAS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
Ana Laura - Nº 02 Arnaldo - Nº 04 Hosana - Nº 15 Lucas Oliveira - Nº 22 Lucas Stefano - Nº 23 3º TD - Noite
CAMPINAS – SP
Maio 2012
CENTRO PAULA SOUZA ETEC CONSELHEIRO ANTONIO PRADO TÉCNICO EM QUÍMICA
DETERMINAÇÃO DE CAFEÍNA EM BEBIDAS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
Requisito para a matéria de Análise Química Instrumental, Prof. Paulo Costa Ana Laura - Nº 02 Arnaldo - Nº 04 Hosana - Nº 15 Lucas Oliveira - Nº 22 Lucas Stefano - Nº 23 3º TD - Noite
CAMPINAS – SP 2
Maio 2012 SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
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2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
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2.1 A Cafeína
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2.2 O Café
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2.3 A Coca-Cola
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2.4 O Refrigerante de Guaraná
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2.5 Curiosidades: Cafeína
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2.6 Questão: Por que a cafeína estimula o cérebro humano?
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2.7 CLAE (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência)
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3 PROCEDIMENTO 3.1 Determinação de cafeína em bebidas por CLAE
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4 RESULTADOS
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5 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
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6 CONCLUSÃO
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7 ANEXOS
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7.1 Figuras e Imagens 7.2 Tabelas adicionais 8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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1 INTRODUÇÃO:
De todas as drogas existentes, a cafeína é a mais consumida no mundo atualmente. O ser humano aprecia tanto as bebidas que contém esse composto, que uma das principais refeições diárias foi nomeada em sua homenagem: café da manhã. As bebidas cafeinadas exercem um fascínio na raça humana desde os primórdios da civilização. Seus efeitos estimulantes eram conhecidos antes mesmo da invenção da escrita, e o estudo de seu uso nos remete a uma viagem que vai desde à Pré-História até a sociedade contemporânea. A cafeína pode ser encontrada, não somente no café, mas em muitas outras bebidas como chás, refrigerantes do tipo cola, refrigerantes do tipo guaraná, bebidas energéticas, chimarrão, milk-shakes, chocolate quente, achocolatados, entre muitas outras. O consumo da cafeína está de tal forma difundido em nossa sociedade, que a maioria dos brasileiros adultos consome doses diárias acima de 300 mg, e um grande número deles são viciados. Muito se tem discutido sobre o real efeito deste alcaloide no organismo, e muitos mitos foram criados ao longo dos séculos, muitos advindos da sabedoria popular. Há algumas questões fundamentais para quem deseja estudar o assunto. Algumas delas são: o que a ciência sabe atualmente sobre a cafeína? Qual seu efeito no organismo? É seguro ingerir cafeína? Ela pode causar dependência? Porque essa droga é tão popular? Qual a quantidade de cafeína presente em alimentos que consumimos diariamente? Essa quantidade pode causar algum efeito indesejável?
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Buscar a resposta para essas e muitas perguntas, fornecer dados precisos através da análise por HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) ou CLAE (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) e lançar discussões pertinentes são os objetivos deste relatório, bem como abordar o real papel da cafeína, descobrindo o verdadeiro impacto na saúde do ser humano e desmistificando a imagem de vilã absoluta que foi atribuída a esse composto nas últimas décadas pelos adeptos do viver saudável, sem contudo subestimar o seu potencial de alcaloide vegetal.
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2 REVISÃO BILBIOGRÁFICA 2.1 A CAFEÍNA
A Cafeína é um alcalóide vegetal presente em plantas do gênero Cola (Cola nítida, Cola vera, Cola acuminata) plantas da família do café (Coffea arabica e a Coffea canephora) entre outras. Entre os vários alcalóides existentes na natureza, encontram-se as metilxantinas, da qual a cafeína faz parte. Existem 3 metilxantinas particularmente importantes: a 1,3,7trimetilxantina (cafeína), a 1,3-dimetilxantina (teofilina) e a 3,7-dimetilxantina (teobromina). Todos são derivados da purina (o grupo xantina é a 2,6-dioxopurina) e inibem a enzima fosfodiesterase. Teobromina e teofilina são duas dimetilxantinas, com dois grupos metilas somentes, em contraste à cafeína, que possui três. Ambas têm efeitos similares à cafeína, porém bem menos acentuados. A teobromina é encontrada no chocolate, no chá, na noz moscada, mas não no café. No cacau, a concentração de teobromina é 7 vezes maior do que de cafeína! A teofilina possui mais efeitos no coração e na respiração, sendo, por isso, mais empregada em medicamento para asma, bronquite e enfisemas do que a cafeína. É encontrada, também, no café. No organismo, estes compostos são facilmente oxidados para o ácido úrico e outros derivados. A cafeína é um pó branco cristalino muito amargo. Na medicina, esse composto é utilizado como um estimulante cardíaco e também como um diurético. A cafeína é conhecida popularmente por fornecer energia rápida, ou uma acentuação no estado de alerta. Graças a essa fama, milhares de profissionais que travam
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batalhas contra o sono - motoristas e estudantes, por exemplo - tomam grandes quantidades de café para permanecerem acordados. A cafeína é uma droga que causa dependência tanto física como psicológicamente. Ela opera através de mecanismos similares aos das anfetaminas e da cocaína. Seus efeitos, entretanto, são mais fracos do que estas drogas, muito embora ela aje nos mesmos centros receptores do sistema nervoso central (SNC). Sentir necessidade diária de tomar café pode significar o início do vício.
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2.2 O CAFÉ
A infusão realizada com as sementes do café torradas é uma das bebidas mais consumidas no mundo todo. Só no Brasil foram consumidas mais de 17 milhões de sacas de café em 2007. Mas nem sempre foi assim. No início, até o ano 1.000 d.C., o café, originário da Etiópia, era usado somente para alimentar os rebanhos durante as longas viagens, para reduzir a necessidade de descanso que o rebanho possuía. Estava ali sendo descoberta sua poderosa ação estimulante, conseguida através (entre outros compostos) da cafeína. Diz uma das lendas sobre o café que um dia um pastor da Absínia (local que atualmente chama-se Etiópia), chamado Kaldi, resolveu levar até um monge conhecido seu, o fruto de uma planta que, segundo ele, deixava o rebanho alegre e disposto quando a ingeriam, permitindo-os locomover-se por longas distâncias sem descanso. O monge intrigado resolveu experimentar uma infusão daqueles frutos amarelo-avermelhados e percebeu que realmente a infusão dos frutos lhe ajudava a ficar mais tempo acordado durante suas meditações. A partir daí o fruto começou a ser utilizado como alimento cru e estimulante, mas ainda demoraria um pouco até que seu uso se disseminasse. Não há corroboração histórica para esse mito, mas o fato é que o café começou a ser cultivado pela primeira vez em monastérios islâmicos no Yêmen, Península Arábica. Dali ele foi levado até Constantinopla pelo Império Otomano, local onde foi fundada a primeira cafeteria do mundo, chamada de Kiva Han. No século XIV, quando chegou ao continente europeu, o café era chamado de “vinho da Arábia” pois os árabes lhe chamavam de qahwa, que em sua língua significa “vinho”. Mas o “café torrado como consumimos hoje, só surgiu no século XVI. 8
O mundo árabe aceitou prontamente a disseminação da nova bebida. Uma vez que sua religião não permite o consumo de bebidas alcoólicas, o café passou a ser consumido até mesmo nos cultos religiosos. Desta forma, foram surgindo locais especializados em servir a bebida, principalmente na cidade de Meca, onde logo foram surgindo inúmeras Kaveh Kanes, as primeiras cafeterias. Até o século XVIII o café era considerado uma preciosidade pelos árabes que sabiam de seu potencial energético e eram os únicos que tinham ciência das técnicas necessárias para cultivar a planta com sucesso e dominavam a produção da bebida a partir das sementes. Mesmo com tanto protecionismo, o café conseguiu romper as barreiras geográficas e culturais e seu comércio (bebida e grãos) chegou à Europa levada pelos vienenses que fundaram a Botteghe del Caffé, principal responsável pela popularização do hábito de torrar e moer o café. Foram os vienenses também, que inventaram o costume de beber o café coado, adoçado e com leite. Daí vem o nome recebido: café vienense. Os habitantes dos Países Baixos foram, contudo, os pioneiros ao levar a planta até a Europa e a conseguir cultivar as primeiras mudas, vindas de Mokha na Península Arábica, no jardim botânico de Amsterdã. É igualmente mérito dos holandeses, levar o café para o novo continente (onde alcançaria sua maior popularidade), para a América do Norte, na chamada Nova Amsterdã (atual cidade de Nova York) e para o estado da Filadélfia. A partir de então, o café se alastrou rapidamente para o resto do mundo. Primeiramente para as colônias holandesas em Java, depois, para Sumatra, e então para as ilhas francesas de Sandwich e Bourbon, até chegar ao Brasil que se tornaria, mais tarde, o maior produtor mundial de café e um dos maiores consumidores de seus grãos torrados e moídos. 9
2.3 A COCA-COLA
A Coca-Cola foi lançada em 1886, em uma criação de John Pemberton, farmacêutico de Atlanta, quando ele criou uma bebida com o intuito de curar dores de cabeça. Levou a bebida a uma farmácia, a Jacob’s Pharmacy, onde o xarope era misturado
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com água carbonatada e oferecido pelos clientes pelo valor de US$ 0,05. Frank Robinson, contador de Pemberton, batizou a bebida de Coca-Cola escrevendo o nome à mão mesmo. Cem anos depois, Pemberton vendeu a empresa para Asa Gringgs Candler, sem ter idéia do sucesso que sua bebida faria. Candler batizou a empresa de “The Coca-Cola Company” tornando-se o primeiro presidente e o primeiro a dar visibilidade à marca. Asa Candler rapidamente popularizou a Coca, fornecendo aos farmacêuticos relógios, balanças e calendários com a marca. Em 1894, Joseph Biedenharn, tem a brilhante idéia de colocar a bebida em garrafa, no começo Candler não coloca muita fé, mas anos depois a novidade veio para ficar até que uma empresa de Indiana inicia a fabricação de garrafas contour (embalagem de vidro), possibilitando ao consumidor reconhecer a marca até de olhos vendados. Robert Woodruff assumiu a presidência da “The Coca-Cola Company” em 1918 quando Candler a vendeu. Ele era um gênio do marketing e fez a bebida se tornar ainda mais conhecida. Durante a Segunda Guerra Munidal, Woodruff determinou que a CocaCola fosse vendida para todo combatente norte-americano onde quer que ele estivesse a US$ 0,05. Europeus também experimentaram a bebida, resultando na explosão da bebida na Europa, logo após a Guerra. Até os dias de hoje a Coca-Cola é um sucesso de vendas, com tantas parcerias, encontra-se em qualquer canto do mundo todo e ainda busca perfeição a cada nova invenção que cria. A Coca-Cola tradicional tem em sua composição aromatizantes naturais, água gaseificada, açúcar, cafeína, extrato de noz de cola, corante caramelo IV, acidulante ácido
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fosfórico (INS 338). Não contem glúten e não contém quantidades significativas de proteínas, gorduras totais, gorduras saturadas, gorduras trans e fibras alimentares.
2.4 O GUARANÁ:
O guaraná, de nome científica Paullinia cupana, é uma fruta típica do estado do Amazonas. A árvore que dá essa fruta pode chegar à 10m de altura e seus frutos assumem a forma de cachos. 12
Desde da época dos índios o fruto era apreciado pelas suas características estimulantes. Moíam as sementes até virar uma pasta, moldavam em forma de bastão, deixavam secar até ficar duro e depois raspavam. Obtendo um pó, usado para a produção de uma bebida. Acreditava-se que essa bebida garantia vida longa. Refrigerante é produzido industrialmente, a partir de água mineral e açúcar, podendo conter edulcorantes, extrato ou aroma sintetizado de fruta ou outros vegetais e gás carbônico.No século XVI, a fabricação e elaboração do mesmo só podia ser feita por farmacêuticos, pois eram os únicos que tinham conhecimento de química e medicina. O processo de processamento de xarope de fruta teve inicio em 1905, e em 1906 foi lançado, pela F. Diefenthaller, uma fábrica de refrigerantes de Santa Maria, no Rio Grande do Sul, o Guaraná Cyrilla.Em 1921 foi lançado no Brasil Guaraná Champagne Antártica atualmente o Guaraná Antártica. Com o passar do tempo os métodos foram aperfeiçoados desde o plantio até a produção do refrigerante.
Informação Nutricional: Porção de 200 ml (copo) Quantidade porção
por% VD*
Valor 80 KCal = 336 KJ 4 Energético Carboidrato Sódio
20 g 11 mg
7 0
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* Valores diários de referência com base em uma dieta de 2000 Kcal ou 8400 KJ. Seus valores diários podem ser maiores ou menores, dependendo de suas necessidades energéticas. Não contém quantidades significativas de proteínas, gorduras totais, gorduras saturadas, gorduras trans e fibra alimentar. Pesquisas feitas mostram que o venda de refrigerantes cresce a cada ano. Famílias passaram a consumir os mesmos de forma irregular, causando doenças como diabetes, aceleração cardiovascular entre outras prejudicando a saúde. Guaraná Antártica é a segunda marca mais vendida no Brasil e está entre a 15 marcas mais vendidas no mundo.
2.5 CURIOSIDADES: CAFEÍNA Retirado do banner “15 Things You Should Know About Caffeine”* (15 coisas que você deveria saber sobre cafeína – ver anexos) *Tradução nossa
Isolada do café pela primeira vez em 1820, cafeína é a droga escolhida por um grande número de pessoas, visto que pode ser encontrada em vários tipos de bebidas e
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medicamentos. Não são todos, entretanto, que param para analisar o que ela é e faz ao nosso organismo. •
O delicioso nome químico da cafeína é 1,3,7-trimetilxantina.
•
A cafeína é encontrada naturalmente em 60 tipos diferentes de plantas, entre elas: sementes de café (a fonte mais comum na América), folhas de chá, guaraná (fonte de cafeína para energéticos), erva-mate, noz-de-cola.
•
A cafeína é extraída através do cozimento das sementes e das folhas em alta pressão com CO2 para obter o composto em pó.
•
90% dos americanos consomem cafeína de alguma forma todos os dias.
•
A cafeína aumenta seus níveis de dopamina, o que faz você se sentir mais feliz, e bloqueia os receptores de adenosina, o que impede que você fique sonolento.
•
A cafeína apresenta uma melhora temporária na capacidade de aprendizagem. Isso inclui compreensão, memória, reflexos, clareza de pensamentos.
•
A cafeína trabalha nas mesmas partes do cérebro que a cocaína, as anfetaminas e a heroína. Ela apenas tem efeitos mais suaves.
•
Por outro lado, a cafeína também tem efeitos colaterais: o
Insônia: o efeito estimulante da cafeína mantém o cérebro, evitando assim, o sono.
o Da mesma forma, as propriedades diuréticas da cafeína impedem você de dormir, pois tem que urinar o tempo todo. o Diarreia: A cafeína acelera o processo de digestão forçando o alimento para fora do tubo digestório rápido demais. •
A cafeína beneficia os atletas: 5 mg por kg melhora a resistência por reduzir a queima de glicose e aumentar a queima de gordura.
•
O Comitê Olímpico Internacional baniu a cafeína das competições. 15
•
Uma dose alta de cafeína pode ser letal: a dose letal de cafeína para um ser humano é algo em torno 150-200 mg por quilograma de massa corporal. Isso corresponde a 100 xícaras de chá em 4 horas. Em 2007, um homem morreu após uma overdose de pílulas No-Doz (suplementos de cafeína. N. do T.).
•
A cafeína é completamente absorvida depois de 30 a 40 minutos, e seus efeitos diminuem após 3 horas.
•
Estima-se que 12.000 toneladas de cafeína são consumidas todo ano, sendo 54% proveniente de cafés, 43% de chás e 3% de alimentos e outras fontes. A média de consumo dos americanos é de 280 mg de cafeína por dia, 2 ou 3 xícaras de café.
•
A cafeína causa dependência física. O período de abstinência tem inicio entre 12 e 24 horas e pode durar de 2 a 9 dias. Os sintomas incluem: dor de cabeça, cansaço, depressão, irritabilidade e perda de energia.
•
Produtos descafeinados ainda possuem cafeína em sua composição. Nos Estados Unidos, “Descafeinado” significa que menos de 2,5% do produto é cafeína.
•
Hitler recebeu injeções de glicose e cafeína para manter a energia durante os últimos dias da Segunda Guerra Mundial.
2.6 QUESTÃO: POR QUE A CAFEÍNA ESTIMULA O CÉREBRO HUMANO?
Um neurotransmissor natural chamado adenosina, ao ligar-se aos seus receptores, diminui a atividade neural, dilata os vasos sanguíneos, entre outros. A cafeína se liga aos receptores da adenosina e impede a ação da mesma sobre o Sistema Nervoso Central. A cafeína estimula a atividade neural e causa a constrição dos vasos sanguíneos, pois bloqueia a ação da adenosina. Muitos medicamentos contra a dor de cabeça, tal como a 16
Aspirina Forte, contém cafeína, que por provocar a constrição dos vasos sanguíneos, aliviará a dor. Com o aumento da atividade neural, a glândula pituitária "pensa" que algum tipo de emergência está ocorrendo, e libera grandes quantidades de adrenalina, que causa uma série de efeitos no corpo humano, como a taquicardia, aumento da pressão arterial, abertura dos tubos respiratórios (por isso muitos medicamentos contra a asma contém cafeína), aumento do metabolismo e contração dos músculos, entre outros. Outro mecanismo de ação da cafeína atua através do bloqueio da enzima fosfodiesterase, responsável pela quebra de mensageiros AMP cíclico (monofosfato cíclico de adenosina) do cérebro, fazendo com que os sinais responsáveis pela excitação da adrenalina persistem por muito mais tempo, ou seja, demorem mais para serem degradados pelo organismo. A cafeína, a adenosina e o monofosfato cíclico de adenosina possuem fórmulas estruturais extremamente similares (ver anexos). A ingestão da cafeína também é responsável pelo aumento da concentração de dopamina no sangue (de modo análogo ao das anfetaminas e da cocaína), por provocar uma diminuição da recaptação desta no Sistema Nervoso Central. A dopamina também é um neurotransmissor (relacionado com o prazer) e médicos e pesquisadores suspeitam que seja justamente este aumento dos níveis de dopamina que leve o individuo a viciar-se em cafeína. A cafeína, em curto prazo, impede que você durma porque bloqueia a recepção de adenosina; lhe dá mais "energia", pois causa a liberação de adrenalina, e traz uma sensação de bem estar, devido à manipulação da produção de dopamina. Os únicos problema decorrentes do consumo de cafeína (excetuando-se os de grau alérgico) só podem ser observados a longo prazo. O mais importante é o efeito que a cafeína tem sobre o sono. A recepção de adenosina é muito importante para o sono, 17
principalmente para o sono profundo. O tempo de meia-vida da cafeína no organismo é de 6 horas. Portanto, quando uma pessoa bebe uma quantidade x de café (200 mg de cafeína, por exemplo) por volta das 15:00h, cerca de 100 mg desta cafeína ainda estarão em seu corpo às 21:00h. Isso não impede que o sono aconteça, mas provavelmente não haverá proveito integral dos benefícios que somente o sono profundo traz. No dia seguinte, a quantidade de cafeína necessária para que aconteça o mesmo efeito será maior, e assim gradativamente, este círculo vicioso continua, dia após dia. Ao tentar parar o consumo de cafeína, poderão ser observados sintomas de depressão e, em alguns casos, cefaleia intensa - causada pela excessiva dilatação dos vasos sanguíneos no cérebro. Estes efeitos colaterais negativos fazem com que o corpo procure consumir mais cafeína. Esta é a principal razão que leva os fabricantes de refrigerantes a adicionar cafeína aos seus produtos - o consumidor, caso não controle a ingestão deste tipo de bebida, se torna viciado, sente necessidade constante de ingerir cafeína, passa a fazer disto um hábito e, consequentemente, as vendas aumentam exponencialmente. Existem alguns estudos indicam que o consumo de cafeína durante a gravidez pode ser prejudicial para o feto, porém os cientistas garantem que os males só aparecem se o consumo for exagerado. A cafeína pode ser letal, se ingerida em grande quantidade. A dose necessária para matar 50% de certo grupo de indivíduos é de 75mg/kg. As estatísticas são muitas, e variam bastante, mas para matar um adulto de cerca de 80 Kg, seriam necessárias mais de 40 xícaras de café.
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2.7 CLAE (CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA) ou HPLC (High-Performance Liquid Cromatography)
INTRODUÇÃO A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é um tipo de cromatografia líquida que emprega pequenas colunas, recheadas de materiais especialmente preparados e uma fase móvel que é eluída sobre altas pressões. Ela tem a capacidade de realizar separações e análises quantitativas de uma grande quantidade de compostos presentes em vários tipos de amostras, em escala de tempo de poucos minutos, com alta resolução, eficiência e sensibilidade. Somente a partir dos anos 70 se conseguiu um avanço considerável da cromatografia líquida moderna que até então era essencialmente 19
subdesenvolvida, apesar de que um dos primeiros experimentos sobre cromatografia, no inicio do século, foi o tipo que é hoje chamado cromatografia líquida clássica. O avanço foi gradual e atingiu o atual nível de sofisticação que a CLAE apresenta, devido ao revolucionário desenvolvimento tecnológico da prática deste tipo de cromatografia. Desde 1968 tornou-se possível rechear colunas com partículas de pequeno tamanho, necessárias para alta resolução e, também, adquirir equipamentos que funcionam nas altas pressões necessárias para obter uma boa velocidade de eluição. Nos últimos dez anos ocorreu o desenvolvimento de vários detectores espectrofotométricos que operam em comprimentos de onda variável até 190 nm, e houve um aumento na utilização dos detectores por fluorescência, eletroquímicos, e por fluorescência induzida por laser, bem como acoplamento com o espectrômetro de massas. Com estes, tornou-se possível a detecção da maioria dos compostos e a análise de traços em amostras complexas, como sangue, urina, solo, alimentos, petróleo, etc. Hoje em dia são comuns estudos com partículas pequenas, a execução da CLAE com fase reversa e, particularmente, o uso de equipamentos para uma perfeita eluição com gradiente, bem como de métodos especiais, tais como a formação de pares iônicos. Como resultado, dificuldades anteriores ou separações difíceis de compostos como corantes polares, isômeros, drogas básicas e seus metabólitos são agora rotina.
O PROCESSO CROMATOGRÁFICO O processo cromatográfico consiste na partição dos componentes de uma mistura entre a fase móvel e a fase estacionária. No caso da cromatografia gasosa o fluido é um gás e na cromatografia líquida o fluido é um solvente. Na cromatografia líquida a fase estacionária é constituída de partículas sólidas empacotadas em uma coluna, a qual é atravessada pela fase móvel. São as forças físicas e químicas que atuam entre os solutos e 20
as duas fases são responsáveis pela retenção dos solutos sobre a coluna cromatográfica. A diferença na magnitude dessas forças que determina a resolução e portanto a separação dos solutos individuais. As forças elementares que agem sobre as moléculas são de cinco tipos: •
Forças de dispersão de London ou forças de Van der Waals;
•
Interações de dipolo induzido;
•
Ligações de hidrogênio;
•
Interações dielétricas;
•
Interações eletrostáticas e coulombianas.
As variáveis que afetarem essas forças intermoleculares iram influenciar o grau de separação obtido pela passagem dos solutos através da coluna cromatográfica.
CARACTERÍSTICAS DAS FASES ESTACIONÁRIAS EM CLAE Considerando as suas propriedades físicas, os recheios para CLAE podem ser classificados de acordo com os seguintes aspectos: a) Sólidos rígidos, semi-rígidos ou não rígidos; b) Partículas porosas ou peliculares; c) Partículas esféricas ou irregulares; d) Partículas com diferentes diâmetros. Sólidos rígidos a base de sílica são os recheios mais usados atualmente. Esses recheios podem resistir a pressões relativamente altas, resultando em enchimento estável e colunas eficientes de partículas pequenas. Sólidos semi-rígidos são geralmente constituídos de partículas porosas de poliestireno entrecruzadas com divinilbenzeno. 0 semi-rígido tem sido usado para pressões até 350 bars. O maior interesse no semi-rígido atualmente é para aplicações na 21
CLAE por exclusão com fase móvel orgânica; contudo eles também são usados na troca iônica. Sólidos não rígidos, tais como agarose ou dextrose, usados em cromatografia por exclusão, são aplicados exclusivamente para a separação de moléculas grandes, solúveis em água, como as proteínas. Contudo, estes sólidos não rígidos não podem resistir as pressões usadas na CLAE. Os dois tipos de materiais, peliculares e porosos, diferem em algumas de suas propriedades e têm muitas outras em comum. Ambos podem ser introduzidos na coluna com certa facilidade, obtendo-se colunas muito eficazes. Elas podem ser utilizadas em cromatografia líquido-sólido, dependendo da atividade da sua superfície ou pode ser recoberto com alguma fase líquida e obter-se uma coluna para CLAE com fase quimicamente ligada. Além destes tem-se os materiais de recheio do tipo pelicular ou poroso para cromatografia por troca iônica. Os adsorventes peliculares, com diâmetro de partícula entre 30 e 45 μm, apresentam eficiência, rapidez, reprodutibilidade e custo similar aos adsorventes porosos (5 - 10 μm), mas têm menor capacidade e, por isto, o seu emprego tem diminuído notavelmente nos últimos anos.
Figura 1- Formas mais comuns de partículas para cromatografia de líquidos.
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Figura 2- Diferentes formas e tamanhos dos materiais para empacotamento de colunas. Para obter distribuição homogênea do recheio em toda extensão da coluna, o que aumenta a eficiência da separação, as partículas devem ter a menor variação de diâmetro possível. As partículas esféricas são melhores do que as irregulares, mas estas têm menor custo. O tamanho da partícula controla o processo de difusão das moléculas da amostra ao penetrar e sair dos poros da partícula. Quanto maior o tamanho da partícula porosa, mais lento o processo de difusão e, como conseqüência, mais lenta a transferência de massa entre a fase estacionária e a fase móvel. Isto acontece porque, à medida que aumenta o tamanho da partícula, aumenta também a profundidade dos poros e conseqüentemente a amostra demora mais tempo para sair destes poros profundos. Ao mesmo tempo deve-se considerar que um aumento da vazão da fase móvel, para obter-se análises rápidas, faz com que as moléculas da amostra nesta fase migrem rapidamente, em comparação com as da fase estacionária (independente dos poros). Isto resulta no alargamento dos picos. Conforme diminui o tamanho da partícula, a profundidade dos
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poros diminui e a saída dos poros acontece mais rapidamente, permitindo obter análises rápidas, sem perda na eficiência. Estas explicações justificam porque na CLAE utilizam-se somente materiais porosos cujas partículas tem tamanho menor do que 30 μm, com exceção da troca iônica. Outros tipos de materiais utilizados são partículas esféricas, geralmente vítreas, não porosas, recobertas por uma camada muito fina de um adsorvente poroso. Este tipo de material e denominado de película de camada porosa, de porosidade superficial ou de centro não poroso.
AS TÉCNICAS DA CLAE Há cinco tipos de fases estacionárias com diferentes mecanismos que regem as separações cromatográficas na CLAE. Mediante a simples troca de coluna e fase móvel é possível utilizar um deles.
CROMATOGRAFIA LÍQUIDO-SÓLIDO OU POR ADSORÇÃO O mecanismo de separação da cromatografia líquido sólido (CLS), ou adsorção, se baseia na competição que existe entre moléculas da amostra e as da fase móvel em ocupar os sítios ativos na superfície de um sólido (fase estacionária). Para que a molécula do soluto possa ser adsorvida na fase estacionária, primeiro uma molécula da fase móvel deve ser deslocada da superfície. Se assumir que o adsorvente possui uma superfície polar (por exemplo: sílica ou alumina), grupos apolares (por ex.; hidrocarbonetos) terão pouca afinidade por essa superfície e não irão deslocar a molécula da fase móvel; por isso, não serão retidos. Grupos funcionais polares capazes de formar pontes de hidrogênio terão fortes afinidades pela superfície e serão fortemente retidos. Moléculas polarizáveis (por ex.: moléculas aromáticas) irão apresentar interação 24
dipolo induzido-dipolo com a superfície do adsorvente e, portanto, também serão retidas; o grau de retenção depende da polarização de cada molécula ou grupo funcional. É importante que as partículas da fase estacionária apresentem uma grande área de superfície, isto é, um grande número de sítios ativos. A atividade da superfície de muitos sólidos (incluindo a sílica e alumina) se encontra com freqüência afetada pela retenção de certas moléculas de alta polaridade como álcoois, fenóis, água, etc., e, devido a eles, em determinadas ocasiões, é difícil reproduzir os resultados obtidos nas análises, porque as propriedades da superfície sofrem mudanças. Em conseqüência, a superfície da sílica empregada na CLAE é habitualmente submetida a determinados processos de desativação com o propósito de diminuir a retenção de moléculas muito polares e, assim, se mantém a superfície em condições uniformes, o que contribuirá para melhorar a reprodutibilidade das análises. Muitas vezes, devido a uma forte adsorção ou retenção de alguns componentes da amostra no sólido ativo, é necessário aumentar a polaridade da fase móvel de uma maneira constante e uniforme, com o qual se consegue um incremento de solubilidade dos componentes da amostra na fase móvel. A essa variação dá-se o nome de eluição por gradiente ou programação da fase móvel. Para a maioria das separações realizadas por adsorção (CLS) usa-se partículas porosas, na faixa de 5-10 μm, alem de se empregar, às vezes, os materiais maiores (30-40 μm), como película porosa. Quase todas estas separações são limitadas a alguns tipos de adsorventes: sílica e alumina. A retenção e a separação nestes adsorventes são geralmente similares, os componentes mais polares da amostra serão retidos preferencialmente. Na modalidade de cromatografia por partição com fase líquida, é preferível usar suportes que sejam inertes; mas não existem suportes inertes com rigidez e uniformidade requeridas pela CLAE. Usa-se a sílica, sabendo-se que tem pontos adsorventes que 25
necessitam ser completamente cobertos ou inativados, como em CG. Os poros deverão ser suficientemente grandes para permitir total acesso das moléculas do soluto à fase estacionária contida dentro da estrutura dos poros, mas suficientemente pequeno para resistir a remoção do líquido estacionário pelo arraste mecânico da fase móvel.
CROMATOGRAFIA LÍQUIDO-LÍQUIDO OU POR PARTIÇÃO A cromatografia líquido-líquido (CLL) foi desenvolvida por Martin e Synge em 1941 para separação de vários aminoácidos, usando fase estacionária de água em sílica e clorofórmio como fase móvel. 0 mecanismo de separação neste tipo de cromatografia, ou mecanismo de distribuição como também é chamado, baseia-se nas diferentes solubilidades que apresentam os componentes da amostra na fase móvel e na fase estacionária. Então, os componentes mais solúveis na fase estacionária são seletivamente retidos por ela, enquanto os menos solúveis são transportados mais rapidamente pela fase móvel. 0 maior inconveniente desta técnica é a solubilidade da fase estacionária na fase móvel, o que rapidamente deteriora a coluna, levando a não reprodutibilidade nas separações repetitivas. Isto pode ser resolvido de duas maneiras. A primeira é saturando a fase móvel com a fase estacionária por meio de uma pré-coluna, colocada antes do injetor, que contenha uma alta percentagem de fase estacionaria. A segunda é utilizando materiais que contenham a fase estacionária, quimicamente ligada a um suporte sólido.
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3 PROCEDIMENTO 3.1 Determinação de cafeína em bebidas por CLAE O procedimento para realização desse experimento tem início com a preparação de 5 balões contendo uma quantidade x em mL da Solução de Estoque de Cafeína que foi devidamente preparada pelo professor. Para cada balão volumétrico, adicionou-se uma alíquota diferente da solução padrão. Segue abaixo uma tabela com as quantidades adicionadas em mL e o valor teórico da cafeína contida nessas alíquotas utilizadas nessa solução:
Padrão
Concentração Teórica (μg/mL)
mL da solução padrão utilizada
1
10
2
2
20
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A preparações do padrões foi realizada da seguinte maneira: Encheu-se uma bureta de 25 mL com a Solução de Estoque de Cafeína e transferiu a quantidade já descrita na tabela acima para o primeiro balão, repetindo o procedimento para todos os balões. Após isso, adicionou-se água destilada até atingir o menisco e homogeneizaram-se as soluções. Com isso, a preparação dos padrões é finalizada. Adição dos padrões no HPLC (CLAE – Cromatografia Liquida de Alta Eficiência). Antes da injeção da primeira alíquota de solução padrão no equipamento foi necessário criar uma pasta onde as informações de leitura do equipamento estariam salvas, bem como conferir se as condições do equipamentos estavam corretas para a analise da cafeína. As condições que devem estar em parâmetros corretos são: • Solução Isocrática – É uma solução que contem dois tipos de solventes mas com a mesmas concentrações. A solução utilizada para a analise da cafeína é a solução metanol/Água
• Fluxo da fase móvel a 0,6 mL/min – É a quantidade da que o equipamento ira injetar a solução durante cada minuto da analise.
• Detecção em UV a 273 nm – É a onda de comprimento onde o pico da cafeína ira sair.
Após isso era possível adicionar as alíquotas das soluções padrão no equipamento, o que é feito através da utilização de uma seringa (de uso específico para o equipamento). 28
Aspirou-se um volume em torno de 2mL dos padrões e adicionou-se no injetor. Após essa injeção, análise já poderia ser iniciada. O mesmo procedimento foi repetido com as amostras diluídas de Coca-Cola, Café e Guaraná Antártica. O pico das amostras e dos padrões (resultado da análise pertinente ao nosso estudo) aparece após aproximadamente 9 minutos e com isso podemos dizer que para cada amostra e padrões foram utilizado cerca de 5,4 mL da solução Etanol/Água.
4 RESULTADOS
Tabela 1 – Resultados da curva de calibração utilizando o padrão cafeína. Concentração em:
Tabela 2 – Concentração real das soluções padrão em mg
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Tabela 3 – Concentração das amostras analisadas em mg/350mL. (Volume de 1 Latinha)
Gráfico 1 –
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Gráfico 2 – Curva de calibração do padrão cafeína
5 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS:
Conforme esperávamos, o café apresentou os maiores índices de concentração de cafeína, visto que a mesma é um composto muito solúvel em água a quente. Durante a preparação do café por infusão, ocorre uma melhor dissolução do composto devido à elevada temperatura da água (próxima ao ponto de ebulição, 100ªC). Como todas as outras amostras de bebidas analisadas são preparadas e consumidas a frio (entre 8°C e 20°C), o teor de cafeína é menor, já que a faixa térmica não permite concentrações tão altas do alcaloide. Pensou-se na possibilidade de as indústrias informarem no rótulo dos produtos a concentração de cafeína contida, para que o consumidor tenha conhecimento da quantidade que está ingerindo, pois ainda que seja largamente consumido, o composto 31
ainda é um alcaloide que, se ingerido em grandes quantidades, trás malefícios à saúde. Observou-se, porém, que as bebidas a base desse composto apresentam em suas informações nutricionais, apenas quantidades de carboidratos, sódio, entre outros, não fornecendo qualquer dado quantitativo ou alerta quanto ao efeito da cafeína no organismo. De acordo com estatísticas oficiais, o café está presente em 95% das residências brasileiras. O consumo médio per capita de café em nosso país atingiu (em 2010) um recorde de 4,81 kg/ano, o que representa cerca de 81 litros de café por habitante, marca muito abaixo dos países escandinavos (nórdicos) mas já acima de grandes consumidores da bebida, como Itália e Estados Unidos, de acordo com o Ministério da Agricultura. Considerando o valor obtido em nossas análise por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) juntamente com estatísticas do Departamento de Química da Universidade Federal de Santa Catarina UFSC, observa-se que o brasileiro consome cerca de 138 mg de cafeína por dia. Nível relativamente alto, embora não totalmente danoso se considerarmos que está bem distante da quantidade necessária para causar morte, que é vai de 5 a 10 g, dependendo da massa corporal do indivíduo. Seria necessário, para isso, tomar mais de 40 xícaras de café em uma única ocasião. Quando as concentrações de cafeína no plasma sanguíneo atingem níveis acima de 15 mg/L de sangue podem haver reações tóxicas, e a ingestão de altas doses do composto (overdoses de cafeína) são uma causa relativamente comum de emergências de envenenamento, com 4.183 casos relatados em 2007 pela Associação Americana de Centros de Controle de Venenos. Dentre todos esses casos, houve apenas uma morte.
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Logo, concluímos que a cafeína realmente é um potente alcaloide vegetal que pode trazer inúmeros problemas de saúde se, e somente se, consumido em excesso. O consumo ocasional, ou mesmo diário em pequenas doses, aparentemente não causa nenhum efeito colateral permanente, além da excitação temporária do sistema nervoso central.
6 CONCLUSÃO
O método de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) foi extremamente adequado e eficiente para separar e determinar a quantidade de cafeína presente nas bebidas analisadas: refrigerante do tipo cola (a saber, Coca-Cola), refrigerante do tipo guaraná (da marca Guaraná Antártica), e infusão de pó de café da marca Pilão. As principais vantagens do método são: a simplicidade, as amostras não precisam ser tratadas e/ou purificadas de uma maneira especial, como na técnica de Espectroscopia por UV/Visível, e uma certa rapidez: ocorre uma nítida separação em 11 minutos aproximadamente. A cafeína atua sobre o sistema nervoso central, apresentando sintomas como excitação, disposição, mas também irritabilidade e ansiedade, por isso é necessário um 33
controle da quantidade dessa substância nos alimentos e bebidas, como também a indicação de suas quantidades nos respectivos rótulos. Entretanto, quando ingerida em quantidade moderada não apresenta riscos à saúde.
7 ANEXOS 7.1 Figuras e Imagens
FIGURA 1 – Esquema de um cromatógrafo líquido como o utilizado no experimento.
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FIGURA 2 – Estrutura molecular da cafeína
FIGURA 3 – Estrutura molecular da adenosina
FIGURA 4 - Estrutura molecular do Monofosfato cíclico de adenosina
FIGURA 5 - Estrutura molecular da dopamina 35
FIGURA 6 – Corte de uma semente de café
7.2 Tabelas Adicionais
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8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
http://g1.globo.com/economia/mercados/noticia/2012/01/consumo-de-cafe-nobrasil-cresceu-311-em-2011-segundo-abic.html Acesso em 14/05/2012 às 23:53 http://noticias.r7.com/economia/noticias/consumo-de-cafe-no-brasil-bate-recordehistorico-20110324.html Acesso em 14/05/2012 às 23:58 http://noticias.uol.com.br/ciencia/ultimas-noticias/redacao/2011/01/28/mito-ouverdade-cafeina-em-excesso-pode-matar.htm Acesso em 14/05/2012 às 12:17 http://www.qmc.ufsc.br/qmcweb/artigos/cafeina.html Acesso em 13/05/2012 às 17:42
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http://www.infoescola.com/curiosidades/historia-do-cafe/ Acesso em 11/05/2012 às 10:30 http://analuciacava.files.wordpress.com/2011/04/cafc3a9.jpg
Acesso
em
13/05/2012 às 15:42 CIOLA, R. Fundamentos da Cromatografia a Líquido de Alto Desempenho, Ed. Edgard Blücher LTDA, São Paulo, 1998 COLLINS, C. H. Fundamentos de Cromatografia. Editora Unicamp. Campinas – SP. 2006
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