UNIVERSITATEA " Lucian Blaga '' DIN SIBIU FACULTATEA DE ȘIINȚE AGRICOLE, INDUSTRIE ALIMENTARĂ ȘI PROTECȚIA MEDIULUI
TEHNICI CROMATOGRAFICE HPLC
Studenți:
-SIBIU-
2012
CUPRINS Cuprins..............................................................................................................................................2 Cap. I Introducere.............................................................................................................................4 Cap II Principiul de cromatografie de lichide..................................................................................6 2.1 Sistemul de livrare.....................................................................................................................8 2.2 Pompe pentru HPLC...................................................................................................................8 2.2.1 Sisteme de injecţie a probei.....................................................................................................9 2.3 Coloanele în LC..........................................................................................................................9 2.3.1 Corpul coloanei şi mecanisme de separare..............................................................................9 2.4 Faza staţionară..........................................................................................................................11 2.5 Faza mobilă...............................................................................................................................12 2.6 Detectori...................................................................................................................................13 2.6.1 Detectori spectrofotometrici în UV-VIS...............................................................................14 2.6.2 Detectori refractometrici........................................................................................................15 2.6.3 Alţi detectori..........................................................................................................................15 2.7 Analiza cantitativă ...................................................................................................................16 Cap III Aplicaţii..............................................................................................................................18 3.1 Autenticitatea sucurilor de fructe.............................................................................................18 3.1.1 Detectarea de zaharuri ..........................................................................................................18 3.1.2 Detectarea de acizi.................................................................................................................19 3.1.3 Detectarea de compuşi fenolici..............................................................................................21 3.2 Fructe citrice.............................................................................................................................21 2
3.3 Alte fructe.................................................................................................................................22 3.3.1 Detectarea de antociani..........................................................................................................23 3.3.2 Detectarea de carotenoizi.......................................................................................................23 3.4 Autenticitatea vinurilor.............................................................................................................24 3.5 Autenticitatea mierii.................................................................................................................26 3.6 Autenticitatea uleiurilor, untului și cafelei...............................................................................27 3.6.1 Uleiurile vegetale...................................................................................................................27 3.6.2 Untul de cacao și cafeauă......................................................................................................28 3.7 Autenticitatea brânzei și laptelui..............................................................................................29 Cap IV Concluzii............................................................................................................................31 Bibliografie....................................................................................................................56
3
Cap. I Introducere Istoria de cromatografie datează din inceputul secolul al XIX-lea. Inaintea anilor 1970, cromatografia cu coloana deschisa a fost utilizată în scop comercial în laboratoare. Termenul HPLC provine din cauza tehnicii de înaltă presiune utilizata pentru reducerea timpului care ia analizei sa se faca. După numeroase etape de dezvoltare, instrumente au devenit capabile să funcţioneze la presiuni de până la 6000 psi (400 bar). Cu o ameliorare de coloane şi detectoare, o dezvoltare esenţială a fost realizat in privirea performanţei, astfel încât tehnica a fost redenumita cromatografie de lichide de înaltă performanţă (HPLC), în mijlocul anilor 1970 până la sfârşitul lunii. În această perioadă, metode noi, inclusiv cromatografie de lichid de etapa inversa, au permis o separare mai bună între compuşi foarte similari. Prin anii 1980, calculatoarele şi de automatizare au adăugat comoditate in analiza HPLC. La începutul secolului al XXI-lea, un nou nivel de performanţă a fost realizat prin continuarea îmbunătăţirii tehnologii de coloana care a dus la utilizarea adsorbantilor cu paricule mai mici (1,7µ m), şi dezvoltare a instrumentelor care permit aplicarea de înaltă presiune până la 1000 bar pentru a livra solventi. Rezoluţia, viteza şi sensibilitatea au crescut. Aceasta tehnologie noua se numeste cromatografie lichida ultra-performanta. (lori.academicdirect, 2012). Cromatografia de lichide de înaltă performanţă (HPLC) acoperă azi, în proporţie aproximativ 80%, analiza substanţelor moleculare: organice, organo-metalice şi anorganice inclusiv compuşii foarte polari sau labili termic precum şi compuşii cu masă moleculară ridicată (naturali sau sintetici). De aceea, împreună cu cromatografia de gaze constituie un punct de sprijin important în analizele chimice moderne. Deşi eficacitatea coloanelor nu o egalează încă pe cea din GC, prin faptul că se poate modifica, pe lângă faza staţionară, şi faza mobilă, cromatografia de lichide (LC) face posibile separări şi analize uneori imposibil de realizat prin alte tehnici. Cuplajul cu spectrometria de masă a transformat, în ultimul timp, această metodă în principalul mijloc de analiza a compuşilor moleculari naturali sau sintetici, constituind unul din pilonii pe care se sprijină chimia sintetică actuală şi pe care s-a dezvoltat biochimia şi biotehnologia modernă. ( traducere). Metoda constituie o evoluţie a unei metode mai vechi, cromatografia pe coloană clasică, care servea în primul rând la izolarea preparativă a compuşilor naturali. Prin introducerea pompelor şi în consecinţă, lucrându-se la presiuni tot mai ridicate (200atm), dezvoltarea unor faze staţionare performante, de dimensiuni tot mai mici (recent constituite din granule de faze staţionare sferice, cu diametre 2-5μm), în coloane tot mai scurte (3-10cm) s-a ajuns, începând cu anul 1969, la configuraţia actuală (fig. 1.1). Se poate observa că din rezervoarele conţinând unul sau mai mulţi solvenţi pompa (sau pompele), alimentează coloana cu eluent (de regulă un amestec de doi sau mai mulţi solvenţi). În imediata vecinătate a coloanei se introduce proba, automat, prin intermediul unui ventil cu by pass. În coloana aflată într-o etuvă termostat, are loc separarea propriu-zisă. Efluentul coloanei intră într-un detector de unde componentul, dacă este separat complet, poate fi colectat şi izolat, cu ajutorul unui colector de fracţiuni. Semnalul este înregistrat fie cu un înregistrator, fie direct în memoria unui calculator. În esenţă, un cromatograf analitic HPLC are structura din fig. 1.2 unde nu s-a mai prezentat colectorul de fracţiuni, interesant doar din punct de vedere preparativ. Se poate observa asemănarea cu GC singura deosebire majoră constituind-o sursa de eluent - pompa. În cele ce urmează se vor prezenta cele
4
mai importante aspecte deoarece volumul de informaţii publicate este deosebit de amplu, un mare număr de date existând chiar pe reţeaua Internet . (lori.academicdirect, 2012).
Fig. 1.1 Prezentarea schematică a unui cromatograf de lichide (HPLC) modern (lori.academicdirect, 2012)
Solvent → Pompă → Injector → Coloană → Detector → Înregistrator Fig. 1.2. Schema bloc a unui cromatograf HPLC (C. Luca1983).
5
Cap II Principiul de cromatografie de lichide Cromatografia de lichide este o metodă de separare care foloseşte o coloană umplută cu suport solid (adsorbant) şi un lichid care se deplasează prin suportul de bază. Compuşii se misca din partea de sus a coloanei care au cu etapa mobilă, prin mediul adsorbant, timp în care compuşii individuali se separă. Suportul solid, peste care etapa mobilă curge continuu, se numeşte etapa staţionară. Migraţia compuşilor la viteze diferite prin etapa staţionară este datorita diferenţei de distribuire a acestora între etapa mobilă şi etapa staţionară. Menţinerea unui compus este determinată de marimea coeficientului de partiţie dintre cele două etape; mai anume, menţinerea depinde de nivelul de interacţiune dintre compus şi etapa staţionară. Informaţiile obţinute de la un proces de cromatografie este evidenţiat de o cromatogramă, care este o înregistrarea profilului de concentraţiei ai compuşilor de probă. Cromatograma (Figura 2.1) este seria de modele (vârfuri normale Gauss) de compuşi genera ţ i de un detector care detectează schimbările în concentraţia individuală a compusilor la capătul coloanei în funcţie de timp (sau volumul etapeii mobile). Cromatograma furnizează informaţii complexe despre o probă, cum ar fi numărul de compuşi separaţi, cantitatea ( maximul înălţimii sau maxima ariei) şi identitatea (parametrii de retenţie) de compuşi individuali. (H. Nașcu, 2003).
Fig. 2.1 Varfurile cromatogrfice si atributia lor. , timpul de retenţie; jumătatea vârfului înălţimii,
, timpul pauză sau timpul mort al coloanei.
vârful înălţimii, w vârful lăţimii,
, varful lăţimii măsurat la
vârful lăţimii măsura la 4,4% a vârfului (lori.academicdirect,
2012) Durata de timp necesară pentru un compus să treacă printr-o coloană cromatografică se numeşte timpul de retenţie ( ). Molecule diferite iau timp diferit pentru a se muta prin coloană în etapa staţionară, dar aceeaşi cantitate de timp în etapa mobilă. Acest timp din etapa mobilă se numeşte timpul mort al coloanei sau timpul pauză al coloanei ( ).Timpul petrecut de
6
molecule în etapa staţionară se numeşte timpul de retenţie corectat (
), si se calculează ca
tR= tR−t0
diferenţă între timpul de retentie si timpul mort.
Cum lichidele pot fi considerate a fi incompresibile, în cromatografie de lichid, retenţia este de obicei măsurată în unităţi de timp pentru confort. Raportul dintre timpul de retenţie corectat şi timpul mort este egal cu factorul de capacitate al compusului, care caracterizează separarea. Factorul de capacitate (k) se calculează după cum urmează: k= tR ′/ t0 = ( tR - t0 ) / t0. Retenţia relativă a două componente vecine este descris de: ∝ = tR′( peak1)/ tR′(peak2) =k(peak1) / k(peak2). unde α este factorul de separare. Factorul de separare este de asemenea cunoscut sub numele de retenţie relativă sau selectată. In timp ce moleculele migrează prin coloană, zona de compuşi se extinde continuu în timpul trecerii acestor compusi. Eficienţa cromatografiei este măsurată in functie de lărgirea aceste zone, care poate fi exprimată prin numărul de placa teoretic (N) sau de înălţime echivalentă cu placa teoretică (H sau HETP). Placa teoretica este proporţională cu lungimea coloanei (L): N=L/H.
O valoare H mai mică indică o coloană mai eficientă, cu o valoare N mai mare. Eficienta coloanei se referă la performanţa etapeii staţionare, furnizand informaţii despre performanţele sale cinetice şi cât de bine este coloana ambalata. (C. Luca, ș.a.,1983). Descrierea matematică a eficienţei coloanei cromatografice se obţine din ecuaţia van Deemter: H=A+ B/u +Cu unde u este viteza liniară a etapeii mobile. A este termenul de difuzie eddy, reprezentând mai multe cai pe care un compus poate sa ia prin coloană. Viteza de fază mobilă afectează, de asemenea, difuzarea Eddy. O rata mai mare de miscare rezultă în marirea zonei de largire. B este termenul pentru difuzarea longitudinal, care descrie o un proces de largire a bandei care este invers proporţional cu viteza din etapa mobilă. HPLC în acest termen este neglijabil, deoarece coeficientii de difuzie al lichidelor sunt foarte mici comparativ cu cele ale gazelor (ca în cromatografia de gaze). C este coeficientul transferului de masă. În scopul de a obţine o valoare H mică şi a permite separarea eficientă sa fie realizata, ar trebuie sa fie utilizate ajutorul particulelor mici, eluent de vascozitate scazuta, o coloană mai lungi şi o temperatură mai mare. Numărul teoretic de placă poate fi măsurată prin mai multe metode, aplicand următoarea formulă: N= a(tr/w)2 unde a este o constantă, în funcţie de înălţimea vârfului (în cazul în care acesta este măsurat), este timpul relativ de retenţie al vârfului şi w este vârful lăţimii (figura 2.1). Valoarea a depinde 7
de metoda de calcul; poate fi 5.57, 25, 16 atunci când lăţimea maximă este măsurată la jumătatea înălţimii a vârfului (
), cand înălţimea vârfului e 4,4%, si la linia de bază, respectiv. Vârful
lăţimii (w) este distanţa dintre intersecţia de bază şi linia tangenta cu ambele părţi ale vârfului. Multe varfuri cromatografice nu prezintă modelul de distribuţie gaussiană normal. Placa teoretică nu este afectata de anomalii cromatografice (Figura 2.2), cum ar fi vârf "de coada" şi "frontal".
Fig. 2.2 Anomaliile de vârf cromatografice. As, factorul de asimetrie; w10%, lăţimea maximă măsurată la o distanta de 10% de la inălţimea vârfului ( ). (lori.academicdirect, 2012) Formula pentru asimetria de un vârf, adică a factorului de asimetrie, poate fi calculată din forma vârfului: As= b/a unde a este distanţa dintre maxima vârfului şi faţă vârfului, măsurată la o distanta de 10% de la înălţimea vârfului, iar b este distanţa maximă dintre vârf şi coada vârfului măsurată la o dinstanta de 10% de înălţimea vârfului. Gradul de separare a două vârfuri se caracterizează prin separarea relativă, şi anume rezoluţia.Rezoluţia a două vârfuri poate fi calculată din cromatografice variabile reglabil, cum ar fi factorul de selectivitate, eficienţa şi capacitatea compuşilor separati prin următoarea formulă: Rs=N1/2/4(∝−1)/∝k′/1+k′ unde k’ este media de factor de capacitate a celor două vârfuri de interes. În cazul în care
este
1.25, separarea a două vârfuri este considerat satisfăcător. Acesta constă dintr-o livrare de sistem, coloane, detectoare, şi un sistem de operare şi control. (C. Luca, ș.a.,1983). 8
2.1 Sistemul de livrare Sistem de livrare in cromatografie de lichide constă dintr-o pompa de inalta presiune, supape, regulatoare de curgere , o cameră de amestec, un amortizor de impulsuri şi traductoare de presiune.Sistemul trebuie să fie capabil să ofere solvenţi din rezervoare prin tot cromatograful la o presiune ridicată (până la 500 bar), la o gamă largă de curgere (0.1 - 10 mk min -1), cu fluctuatii de curgere minime, asigurarand reproductibilitatea timpul de retenţie şi stabilitatea iniţială a detectoarelor. Prin amestecarea a solvenţilor în camera de amestecare, pompa de înaltă presiune asigură o compoziţie constantă a eluentului în timpul separarii isocratice, în timp ce marirea puterii eluentului cu timpul ar trebui să fie realizata în perioada de eluare a gradientului. Instrumentele sofisticate sunt echipate cu un degazor cu solvent, prin aplicarea unei epurări heliu sau vid.Unii factori care afectează performanţa sistemului de livrare pot fi controlati prin pregătirea eluentului. Degazarea eluentului este folosit pentru a preveni formarea de bule de gaz în etapa mobilă. Bule formate de obicei din oxigen, pot provoca degradare a probelor şi a etapelorlor prin care trec, şi în plus afectează sensibilitatea şi stabilitatea detectoarelor de bază. Degazare poate fi realizată prin aplicarea unui vacuum, tratamente cu ultrasunete sau prin epurare cu heliu. Solventul refluxiv a fost dovedit a fi cea mai eficientă metodă de reducere a concentraţiei de oxigen. Particule solide în eluent pot provoca tulburări în timpul separării, afectând, astfel, presiunea şi randamentul solventului de livrare şi care să ducă la fluctuatia ratei de curgere. Prin urmare, filtrarea particulelor solide din solvenţi sau a se lua soluţii de probă este un pas important înainte de analiză. (lori.academicdirect, 2012) 2.2 Pompe pentru HPLC Pompa este considerată una dintre cele mai importante componente ale HPLC deoarece permite realizarea unui debit constant al eluentului prin întreg sistemul: injector, coloană, detector mărind deosebit de mult viteza separării. Într-un cromatograf de lichide pot exista una sau mai multe pompe, fiecare furnizând o presiune care poate atinge 20mii kPa (cca. 200atm). Presiunea deosebită este necesară deoarece coloana are o umplutură de fineţe mare şi, în lipsa presiunii, debitul ar fi nepractic de mic. Diagrama bloc a instrumentului HPLC arată ca în figura 2.3.(traducere).
SR, rezervorul de solvent; HPP, pompa de inalta presiun; I, injectorsul; C, coloana; OCS, operatia si systemul de control; DP procesarea datelor Fig. 2.3 Diagrama bloc a instrumentului HPLC (. S. Gocan,2002).
9
Există în uz două tipuri principale de pompe, clasificate astfel în funcţie de debit: pompe cu presiune constantă (şi debit variabil) şi pompe cu debit constant. Pompele cu presiune constantă sunt mai simple (a se citi ieftine) şi nu prezintă pulsaţii în funcţionare (care nu ar permite obţinerea unei linii de bază netede). Acestea, prezintă dezavantajul că debitul trebuie frecvent modificat pentru a se menţine cât mai constant, ceea ce la separări de durată pune probleme, deoarece prin obturarea coloanelor debitul se modifică continuu. Se înţelege că orice modificare de debit (datorită viscozităţii sau temperaturii eluentului şi a structurii umpluturii) afectează timpul de retenţie şi totodată semnalul detectorilor, în majoritate sensibili la concentraţie. (wikipedia, 2012) Pompele cu debit constant nu mai prezintă dezavantajele de mai sus. De-a lungul timpului s-au selecţionat două variante: pompele cu piston (alternative) şi pompele de tipseringă (cu deplasare pozitivă). La primele, cele mai utilizate, mişcarea du-te-vino a pistoanelor şi a supapelor cu bilă permit o funcţionare indefinită dar presupun existenţa unor atenuatoare de pulsaţii - dispozitive care să elimine micile variaţii de debit. Acestea constau dintr-o alternanţă de mai multe rezistenţe, de exemplu tuburi subţiri şi capacităţi - care pot fi incinte cu pereţi elastici, fie chiar manometre. Pompele cu presiune constantă, asemănătoare cu o seringă dar având o capacitate mai mare, pompează continuu pe toată durata separării, pistonul deplasându-se cu o viteză liniară constantă dar după fiecare cursă este necesară oprirea debitului şi reumplerea cu solvent a corpului pompei. ( traducere) Deşi solvenţii utilizaţi se degazează pentru a se reduce efectele corozive ale oxigenului, datorită presiunilor ridicate la care se lucrează, coroziunea este totuşi deosebită. De aceea aceste pompe (corpul, cilindrii, garniturile şi supapele) se execută din materiale rezistente la coroziune: safir, agat, teflon sau aliaje speciale. (hplc.chem.shu.edu, 2012) 2.2.1 Sisteme de injecţie a probei În cazul HPLC injecţia probei trebuie făcută într-un timp cât mai scurt, pentru a nu deranja regimul dinamic al eluentului prin coloană şi detector. Dificultatea provine de la presiunea ridicată la care lucrează coloana (20mii kPa). Sistemul cel mai utilizat în cromatografele de lichide este ventilul cu 6 căi, numit şi ventil de introducere a probei, prevăzut cu bucle interschimbabile (fig. 2.4).
10
Fig. 2.4 Ventilul pentru introducerea probei (cu 6 căi); lucrează în două etape: A - alimentarea buclei cu proba; B - după o rotire cu 60° în sensul acelor de ceasornic, antrenarea probei din buclă în coloană (lori.academicdirect, 2012) Deoarece eluentul aderă la pereţi, pentru completa îndepărtare a sa în momentul alimentării buclei cu probă, este necesară injectarea prin buclă a unui volum de cel puţin de trei ori volumul acesteia, înainte de comutarea pe analiză. Bucla lucrează în două etape. Etapa A în care bucla este umplută cu probă cu ajutorul unei seringi sau în alt mod. Apoi are loc comutarea pe analiză când prin rotire cu 60°, în direcţia acelor de ceasornic, manual sau automat, bucla este parcursă de eluentul de la pompă şi conţinutul acesteia este antrenat în coloană. Volumul probelor pentru coloane obişnuite (25cmx4.6mm) este de 10-50μl. Evident aceste ventile sunt confecţionate din materiale rezistente la coroziune şi la solvenţi (oţel inoxidabil, tantal, teflon etc). (H. Nașcu, 2003). 2.3 Coloanele în LC Locul în care se petrece separarea propriu-zisă şi - în funcţie de calitatea acesteia - se măreşte sau micşorează raportul semnal/zgomot, este coloana cromatografică. Deşi mulţi autori denumesc coloana “piesa cea mai importantă” dintr-un cromatograf, acesta din urmă, fiind format dintr-o serie de componente, rezultă că fiecare compartiment în parte, contribuie separat la obţinerea rezultatului analitic. Pentru un practician din domeniul LC însă, locul unde acesta intervine efectiv şi unde se concepe logic separarea este într-adevăr coloana. (S. Gocan,2002). 2.3.1 Corpul coloanei şi mecanisme de separare Materialul din care se confecţionează corpul coloanei în LC trebuie să asigure acesteia rezistenţa mecanică adecvată presiunilor înalte (20mii kPa) precum şi rezistenţa la coroziune faţă de faza mobilă. În majoritatea cazurilor a fost preferat oţelul inoxidabil 316 lucios. Acesta rezistă la majoritatea solvenţilor, excepţie făcând doar sărurile halogenilor, în special în soluţie puternic acidă. Alte alternative o constituie coloanele compozite: sticlă sau plastic în interior - oţel inoxidabil sau material plastic în exterior. ( traducere) Din punctul de vedere al geometriei (fig. 2.5), aceste coloane sunt cilindrice, iar dimensiunile depind, în primul rând, de dimensiunea granulelor şi porozitatea umpluturii. Astfel diametrul coloanelor variază între 0.3-5cm iar lungimea poate fi între 3-25cm. Pentru scopuri preparative, în cazul unor componente necunoscute, se utilizează chiar diametre mai mari.
Fig. 2.5. Aspectul coloanelor din LC: coloană analitică (stânga), semipreparativă (dreapta) (lori.academicdirect, 2012)
11
Cu cât umplutura este mai fină, cu atât coloana este mai scurtă. Pentru a se reţine eventualele impurităţi sau componenţi care nu pot părăsi coloana (fiind reţinuţi practic ireversibil) se folosesc adesea precoloane care, fiind de dimensiuni mai mici (acelaşi diametru şi lungimi de 0.4-1cm), pot fi înlocuite mai des, evitându-se astfel scoaterea prematură din funcţie a coloanei principale. Pentru a nu fi antrenată faza staţionară în afara coloanei, aceasta este blocată la capete de două discuri metalice, poroase, având diametrul porilor între 0.5- 10μm. De asemenea pentru a nu se lărgi prea mult prin coloană zona cromatografică (cu diluarea ce are loc simultan), tot volumul mort ale acesteia (goluri în coloană, tubul de aducţiune de la injector, tubul de evacuare spre detector) trebuie redus la minim. Se cunosc până în prezent mai multe mecanisme de separare prin coloane, care depind mult de fazele mobilă şi staţionară. Mai exact, depind de natura fenomenului fizico-chimic pe care se bazează retenţia diferenţiată şi separarea. Metodele LC (HPLC) se pot clasifica, după mecanismele principale amintite, astfel: de adsorbţie, de repartiţie, ionică, şi de excluziune sterică.Se disting două moduri de realizare a cromatografiei de repartiţie: ÷ Cromatografie de repartiţie directă (sau cu faze normale - clasică); ÷ Cromatografia de repartiţie cu faze inversate - metoda preferată în zilele noastre - pe care se realizează cele mai numeroase separări. (S. Gocan,2002). În primul caz faza staţionară este formată dintr-un lichid polar iar faza mobilă dintrun solvent organic nepolar iar în al doilea, situaţia se inversează: lichidul imobil este nepolar iar faza mobilă este un amestec de solvenţi polari. De exemplu, una dintre cele mai răspândite faze inversate este cea staţionară - silicagel, iar cea mobilă - un amestec apă, metanol, acrilonitril (sau tetrahidrofuran). O separare reuşită pe o astfel de fază este prezentată în fig. 2.6. • Coloană: Supelcosil (SiO2) LC-ABZ, 25x4,6cm; • Granulaţia: 5μm, t = 40°C; • Eluent: 10 până la 90% acetonitril în apă 0.5%/min; • Detector: UV la 225nm; • Debit: 1mL·min-1;
12
Fig. 2.6. Separarea unor pesticide prin HPLC (lori.academicdirect, 2012) Componente 1. Izoproturon 2. Profam 3. Propazin 4. Terbutilazină 5. Linuron 6. Propanil 7. Prometrin 8. Fenamifos 9. Fenitrotion 10. Cafeină 11. Metamitron 12. Fenuron 13. Metoxuron 14. Simazin 15. Bromacil 16. Cianazin 17. Atrazin 18. Carbaril Cromatografia ionică (IC) are mai multe variante. Cea mai frecvent întâlnită astăzi foloseşte în calitate de fază mobilă solvenţi apoşi diluaţi de electroliţi iar ca fază staţionară schimbători de ioni. Metoda va fi descrisă într-un capitol separat datorită implicaţiilor actuale în analizele de ape legate de protecţia mediului. O altă variantă denumită cromatografie prin perechi de ioni foloseşte faze staţionare capabile să fixeze anumiţi ioni care fixează ioni de semn contrar (perechi de ioni). Acest mecanism se preferă în cazul substanţelor ionice sau ionizabile. În fine, mai există cromatografia de afinitate, o variantă considerată uneori un mecanism separat, se bazează pe afinitatea extrem de specifică a unor molecule cu alte molecule fixate pe suport. Deşi este vorba de interacţiuni coordinative sau alte afinităţi de natură biochimică dintre suport şi componentele de separat mecanismul poate fi asemănat cu adsorbţia sau chiar cu schimbul ionic dar mult mai specific. Suportul este materialul pe care ligandul este fixat (ideal este ca acesta să fie rigid, stabil şi să aibă o suprafaţă mare). De exemplu agarul este cel mai cunoscut suport, de asemenea se mai foloseşte celuloza, dextranul şi poliacrilamida. Ligandul este fixat pe gelul de
13
agaroză fiind un polimer al D-galactozei şi al 3,6-anhidro-L-galactozei şi poate fi folosit la o presiune de 1atm şi într-un interval de pH de la 4 la 9. Avându-se în vedere complexitatea problemei şi diversitatea acestor perechi de faze mobile şi staţionare, vom limita în cele ce urmează discuţia doar la cele mai utilizate dintre acestea pentru domeniul analizei poluanţilor mediului. În funcţie de componentele de separat şi tipul de mecanism preferat, faza mobilă se alege folosind schema din tabelul 2.1. (C. Luca, ș.a., 1983). Tabelul 2.1. Tipurile de mecanisme de separare cunoscute în LC (C. Luca, ș.a, 1983).
Masă moleculară
Solubilă în Apă
Caracter Ionică Neionică
Cromatografie ionică (IC) cu perechi de ioni
Solvenţi organici
Polară
• cu fază inversă • cu fază polară legată • lichid-solid (CLS) • excluziune sterică • CLS • IC • excluziune sterică Excluziune sterică Schimb ionic Interacţiuni hidrofobe
<2000 Proba Nepolară
Apă
-
Solvenţi organici
-
> 2000
2.4 Faza staţionară Silicagelul (SiO2) este considerat materialul cel mai important utilizat ca fază staţionară. Acesta a devenit, în ultimii 20 de ani, doar suportul adevăratelor faze - fazele chimic legate - ceea ce nu schimbă importanţa sa. Silicagelul s-a obţinut la început în formă granulară, neregulată, apoi în formă sferică (fig. 2.7). Indiferent de formă, granulaţia trebuie să fie uniformă (se elimină partea fină) pentru că astfel caracteristicile curgerii eluentului sunt mult îmbunătăţite. Obţinerea silicagelului sferic se face plecând de la soluţii conţinând silicat de sodiu dar şi alţi compuşi hidrolizabili ai siliciului (tetraclorură de siliciu, silicat de etil etc.). De la aceştia, printr-o reacţie cu apa urmată de o pulverizare şi apoi de o sinterizare, procese vizibile, se obţin granule cu aspect sferic. ( Amelio M., ș.a,1993) .
14
Fig. 2.7. Aspectul granulelor de silicagel folosite frecvent la umplerea coloanelor din HPLC (lori.academicdirect, 2012) Puritatea sa avansată este o condiţie a bunei funcţionări a materialului în LC deoarece prezenţa unor ioni metalici modifică structura determinând apariţia unor centre de adsorbţie puternice şi de aici apariţia unor cozi ale picurilor. Silicagelul are o structură tridimensională cu o reţea de bază, tridimensională, formată din legături Si-O-Si iar pe suprafaţa porilor sau cea exterioară mai prezintă grupe silanol, ≡Si-OH. Punţile de oxigen apar între atomii de siliciu cu ocazia polimerizării acidului silicic, Si(OH)4. În ultimul timp a mai apărut un tip de fază staţionară cu performanţe ridicate. Este vorba de coloanele monolit, realizate din aceleaşi materii prime şi printr-o tehnologie asemănătoare din punct de vedere chimic. Coloana este formată direct în tubul rigid (metalic), de unde şi numele. Aceasta nu mai are granule după cum se poate observa din fig 2.8. Prin noua tehnologie, s-au obţinut coloane cu performanţe superioare faţă de cele umplute cu granule. (S. Gocan, 2002).
Fig. 2.8. Aspectul la microscopul electronic al coloanelor monolit (lori.academicdirect, 2012) Există trei tipuri de grupe silanol superficiale I- legate, II- reactive şi III- libere cu tăria relativă I < III < II. În funcţie de tehnologia de obţinere diferă şi porozitatea internă, suprafaţa specifică, rezistenţa la compresiune şi polaritatea. Silicagelul este considerat, în general, un material puternic polar. Grupele funcţionale de pe suprafaţă au un caracter acid (pK a pentru grupele silanol este similar fenolului). Pentru a se reduce cozile picurilor pe care le dau centrele de adsorbţie puternice, silicagelul se poate dezactiva, de exemplu prin adaos controlat de apă (38% apă). Câteva mărci de silicagel comercial sunt prezentate în tabelul 2.2. ( traducere)
15
Tabelul 2.2 Câteva dintre cele mai cunoscute tipuri de silicagel pentru HPLC(S. Gocan,2002). Marca
Diametrul porilor
Suprafaţa specifică
pH-ul în suspensie 10%
Tipul particulelor
Zorbax 300 Vydac TP Hypersil Spherisorb Polysil LiChrosorb Rosil Rsil
30 32 12.5 8 6 10 8 6
39 82 149 190 245 297 357 433
5.4 4.1 8.2 7 6.5 6.7 8.4 8.0
Sferice Sferice Sferice Sferice Neregulate Neregulate Sferice Neregulate
Se poate observa că suprafaţa specifică scade cu creşterea diametrului porilor iar pHul acestora se situează în domeniul 5.4-8.4. Alţi adsorbenţi mult mai puţin utilizaţi sunt alumina, oxidul de zirconiu, cărbunele macroporos, polimerii poroşi (de ex. spuma poliuretanică). ( traducere) Fazele staţionare chimic legate au apărut în urma încercărilor mai puţin eficace de utilizare a unor faze staţionare lichide depuse pe un suport poros solid - permeabil pentru eluent (a fost preferat kieselgur-ul sau pământul diatomitic - în esenţă tot SiO2 dar cu pori mari şi o suprafaţă mult mai mică. Deoarece în toate aceste încercări faza staţionară era spălată de pe suport de către eluentul în mişcare şi în felul acesta deranja funcţionarea detectorului, s-a recurs la soluţia creării unor faze care să fie fixate prin legături chimice - mult mai puternice decât cele fizice. Aspectul unei faze staţionare chimic legate poate fi imaginat ca în fig. 2.8, adică catenele legate alcătuiesc o adevărată pădure de molecule care se comportă fizic asemănător unui strat subţire, aderent la suport (imposibil de dizolvat) dar cu o valoare a factorului de capacitate k mai favorabilă. Dacă grupările silanol ≡Si-OH de pe suprafaţa silicagelului sunt puse în situaţia de a reacţiona cu anumiţi derivaţi organometalici, se poate realiza sinteza unor faze chimic legate. Cele mai stabile legături sunt cele care au la bază apariţia structurilor legate prin intermediul unei punţi: ≡Si-O-Si≡. Obţinerea acestora se realizează prin reacţii de condensare la care participă grupele silanol - superficiale, efectuate în prezenţa unor clorsilani. Un exemplu este reacţia: ≡SiOH + ClSi(CH3)2R -HCl→ ≡Si-O-Si(CH3)2-R, unde cel mai frecvent R = C8H17 sau C18H37. Prin astfel de reacţii (astăzi se cunosc mai multe variante) suprafaţa silicagelului se acoperă cu un strat monomolecular de dimetil-alchilsiloxan nepolar. Pentru se mări şi mai mult stabilitatea s-a recurs la soluţia legării radicalului de hidrocarbură R prin intermediul mai multor legături cu suprafaţa silicagelului. Stratul de hidrocarbură grefat de suport se comportă ca un strat foarte subţire, uniform, de lichid nepolar dar mult mai stabil. Aceste faze stau la baza cromatografiei cu faze inversate. Polaritatea acestor faze se poate regla prin legarea în cadrul unor catene laterale ale radicalului de hidrocarbură R, de exemplu a unor funcţiuni aminopropil, cianopropil, benzil, creându-se astfel o mare diversitate de faze staţionare. ( Nașcu, 2003).
16
2.5 Faza mobilă Faza mobilă sau eluentul în LC nu reprezintă un mediu inert ca gazul purtător din GC. De aceea alegerea fazei mobile se face aici în perfectă concordanţă cu faza staţionară. Astfel faza mobilă diferă destul de mult în funcţie de tipul interacţiunilor componentelor separate cu faza staţionară din coloană. Singurele caracteristici generale sunt următoarele: faza mobilă trebuie să aibă o viscozitate coborâtă, aceasta trebuie să dizolve bine componentele, nu trebuie să afecteze funcţionarea coloanei şi trebuie să permită funcţionarea detectorului. . Unii eluenţi provoacă migrarea unui anumit component mai repede prin coloană. Se spune că aceştia au o tărie relativă mai mare sau, altfel spus, au o putere de eluţie mai ridicată. Această denumire provine de la faptul că factorul de capacitate, k, este mai mare şi de aceea componentul migrează mai repede. Dar totul depinde de trio-ul component - fază mobilă - fază staţionară. Astfel, pe o fază staţionară polară, folosind o fază mobilă nepolară, se vorbeşte de cromatografie de repartiţie normală (sau cu faze directe). Din contră, pe o fază staţionară nepolară utilizându-se o fază mobilă polară se vorbeşte de cromatografie de repartiţie cu faze inverse (sau inversate). În acest ultim caz au devenit uzuale fazele mobile formate din amestecuri metanol - apă care în cromatografia de repartiţie sunt considerate printre fazele mobile mai puţin tari. ( Amelio M. ș.a.,1993) . Pe o fază staţionară polară, amestecul metanol-apă face parte dintre cei mai tari eluenţi cunoscuţi. În tabelul 2.3 se prezintă câţiva dintre cei mai întâlniţi solvenţi şi ordinea în care creşte tăria lor relativă, în cele două tipuri de cromatografie de repartiţie. În cromatografia ionică (IC) se folosesc soluţii diluate de electroliţi ca: NaOH, NaHCO3, HCl, iar în cea de excluziune sterică solvenţi simpli - evident compatibili cu polimerii, separaţi unii de alţii după dimensiuni. O altă cale de îmbunătăţire a separărilor existentă în LC (cale inexistentă în GC) este folosirea gradienţilor de eluţie. De exemplu, în GC, prin modificarea eluentului gazos nu se constată nici o îmbunătăţire a calităţii separării, în sensul măririi selectivităţii. În HPLC, din contră, solventul are o contribuţie importantă în procesul de separare, dar nu trebuie neglijată importanţa decisivă a cuplului fază mobilă - fază staţionară. Deşi unii compuşi sunt reţinuţi slab prin coloană, ieşind destul de repede, cei reţinuţi puternic ies din coloană după un timp câteodată nepractic de lung, lucru care determină diluarea în eluent a componentul în urma parcurgerii coloanei, aceasta micşorându-se calitatea analizei. De aceea s-a recurs la introducerea treptată peste primul solvent (eluent), a unui al doilea solvent mai tare sau a celui de-al treilea, ceea ce în limbajul de specialitate se numeşte gradient de eluţie (sau de concentraţie). (lori.academicdirect, 2012) Tabelul 2.3 Câteva faze mobile (monocomponente) utilizate în cromatografia de repartiţie în ordinea tăriei lor relative în LC de repartiţie cu faze normale (lori.academicdirect, 2012) Faze normale
Solvenţi Hexan Benzen Triclormetan Clorură de metilen Eter etilic Acetat de etil Acetonitril
17
Faze inversate
Capacitate
Metanol Apă de
dizolvare (tărie)
La ora actuală soluţia la care s-a recurs în practică constă, în general, dintr-un sistem de ventile electromagnetice care permite intrarea solvenţilor în aceeaşi pompă, prin intermediul unei camere de amestecare aflate la joasă presiune. Este posibil şi un alt montaj în care fiecare solvent are pompa proprie, comandată de un dispozitiv de control al debitului. Aceşti solvenţi intră în camera de amestec şi de aici în coloană. ( traducere). 2.6 Detectori Tehnica HPLC s-a dezvoltat o dată cu perfecţionarea detectorilor. Am amintit că detectorii în cromatografie sunt instrumente analitice specializate, situate la ieşirea eluentului dintr-o coloană şi care pot înregistra continuu substanţele separate de către aceasta. Deci detectorii constituie acea parte a instrumentaţiei care permite să se observe modul cum decurge separarea prin coloană fără a se vedea componenţii propriu zişi ci doar semnalul lor. Întrucât coloanele de separare performante au capacităţi de încărcare mici, sistemul de detecţie trebuie să fie unul foarte sensibil. Totodată, pentru că în LC volumul de probă este de ordinul microlitrilor (8-10μl), volumul detectorilor trebuie să fie de volum apropiat pentru a se putea sesiza în mod continuu picul cromatografic. În calitate de instrumente se poate utiliza, în principiu, oricare dispozitiv de analiză chimică cunoscut, pentru probe lichide, precum şi orice combinaţii de instrumente fizice. De exemplu, în ultimul timp, combinaţia dintre un detector refractometric şi unul bazat pe difuzia luminii este extrem de eficace în analiza polimerilor în amestec cu monomeri sau oligomeri dintr-un material. Există chiar posibilitatea creşterii sensibilităţii detecţiei printr-o reacţie chimică în urma adăugării, cu un debit controlat, a unui reactiv potrivit. Tehnica se numeşte derivatizare şi se poate practica chiar înainte de introducerea probei în coloană, dar şi după ieşirea din coloană a componentelor separate. Metoda a fost utilizată până în prezent în special legată de metodele spectrofotometrice (colorimetrice) sau fluorimetrice şi mai ales pentru analiza unor amestecuri de compuşi numeroşi având aceleaşi funcţiuni reactive (de exemplu aminoacizi). Caracteristicile detectorilor sunt asemănătoare cu ale celorlalte instrumente analitice şi oarecum similare cu cele descrise la metoda GC. ( hplc.chem.shu.edu, 2012). 2.6.1 Detectori spectrofotometrici în UV-VIS Acest grup de detectori sunt cei mai folosiţi detectori până în prezent, atât în LC, cât şi în HPLC. Pentru a putea fi utilizaţi, compuşii separaţi cromatografic trebuie să fie coloraţi - adică să absoarbă lumina pe domeniul de lungimi de undă al detectorului. Pe de altă parte, eluentul trebuie să fie practic transparent pentru acelaşi domeniu spectral. Legea fizică pe baza căreia funcţionează aceşti detectori a fost prezentată - este vorba de legea Lambert-Beer (A = εlC). Deci unităţile vor fi unităţi de absorbanţă, adimensionale. De aceea limita de detecţie sau zgomotul de fond se prezintă în cazul acestor detectori în AUFS (de la Absorbance Units Full Scale). Astfel în cadrul instrumentelor actuale sensibilitatea este de 0,001 AUFS cu zgomotul de fond de 1%. Motivul principal al popularităţii acestor detectori este acela că numeroasele substanţe organice, anume cele care conţin legături duble (electroni π), respectiv au grefate funcţiuni organice cu electroni neparticipanţi, absorb lumina în UV-VIS. Este vorba de toate hidrocarburile olefinice şi aromatice precum şi derivaţii tuturor hidrocarburilor cu diferite funcţiuni organice (=C=O, =C=S,
18
-N-O, -N=N-, -NH2). Între acestea se includ şi numeroasele combinaţii de interes biologic ca enzime, acizi nucleici etc. Un mare avantaj al acestor detectori este faptul că sunt insensibili la micile variaţii de debit şi temperatură. Celula de detecţie face parte dintr-un spectrofotometru şi are un volum extrem de mic, de 8-10μl, respectiv un diametru interior de 1mm la o lungime a celulei de10 mm. (Al. Crișan, 1983). Se pot distinge şi în cazul acestei clase de detectori mai multe tipuri de detectori Detectorii monocromatici au fost primii utilizaţi, fiind mai ieftini deoarece lucrează doar la o lungime de undă. Modelul cel mai răspândit se compune dintr-o sursă luminoasă cu deuteriu sau cu vapori de mercur, un monocromator care separă un domeniu îngust (de ex. linia 254nm a mercurului) şi un detector. Schema bloc a unui astfel de detector este prezentată în fig. 2.9.Detectorii policromatici mai frecvent utilizaţi în cromatografele HPLC moderne permit şi selectarea lungimii de undă la care se lucrează, dar chiar pot înregistra electronic absorbanţa celulei la mai multe lungimi de undă simultan. Acest mod de lucru dă o mai mare siguranţă analizei, în sensul că permite stabilirea purităţii, adică dacă picul constituie un semnal dat de o singură substanţă sau de un amestec (ceea ce se cunoaşte sub numele de stabilirea purităţii picului). Aceşti detectori conţin celula amintită montată într-un spectrofotometru cu reţea de diode. Sursă→ Monocromator→Celulă→Înregistrator Fig. 2.9. Schema bloc a unui detector HPLC spectrofotometric (hplc.chem.shu.edu, 2012)
2.6.2 Detectori refractometrici Detectorii refractometrici, au la bază legile refracţiei luminii. Principiul de funcţionare al acestor detectori are la bază legea lui Fresnel - de transmitere a luminii prin medii transparente având un indicele de refracţie dat. Astfel, un fascicul luminos (mono sau policomponent) trece printr-o celulă cu două compartimente unul conţinând doar eluentul pur iar celălalt faza mobilă care părăseşte coloana .Diferenţa dintre indicii de refracţie pentru soluţiile aflate în cele două compartimente vor fi practic nule, atâta timp cât din coloană iese doar eluentul pur, dar diferită în momentul în care în eluent mai apare un component separat - antrenat de către eluent din coloană. În momentul ieşirii unui component are loc o deplasare a poziţiei fascicolului emergent din detector - deplasare care este proporţională cu concentraţia şi sesizată de către detectorul D. În cazul acestui tip de detector sunt posibile şi picuri negative, ceea ce face necesară aducerea liniei de bază la jumătatea scalei lucru care, pe lângă sensibilitatea relativ coborâtă (10 -5mol·L-1), constituie un dezavantaj. Acest detector este universal, dar nu poate fi utilizat în cromatografia cu gradienţi deoarece, în acest caz, compoziţia eluentului la intrarea în coloană diferă de cea de la ieşire şi se modifică continuu, neexistând o linie de bază. De asemenea fenomenul este foarte sensibil la temperatură (±0.0001°C) fiind necesară termostatarea, atât a detectorului cât şi a coloanei. (Luca Al. ș.a., 1983).
19
2.6.3 Alţi detectori Pe lângă cei amintiţi, mai răspândiţi, în practica analitică se mai întâlnesc şi alţi detectori prezentaţi schematic în tabelul 2.4. Dintre aceştia o menţiune specială trebuie făcută pentru cei bazaţi pe spectrometria de masă şi FT-IR , care au permis determinări calitative uneori imposibil de realizat prin alte variante de detecţie în lipsa etaloanelor cunoscute. Aceşti detectori permit ca, pe baza unei baze de date formată din spectre cunoscute, să se obţină compuşii cei mai apropiaţi (3 dintre aceştia), din toate substanţele chimice cunoscute, care ar putea fi prezenţi în probă. (lori.academicdirect, 2012)
Tabelul 2.4. Alţi detectori utilizaţi în LC (lori.academicdirect, 2012) Detectori LC Fluorimetrici Electrochimici (Amperometrici)
Limita de detecţie 1-10pg
Caracteristici Sensibilitate 10-10M Este necesară uneori derivatizarea Sensibilitate 10-10M Compuşi oxidabili sau reductibili Necesare coloane capilare Necesară pulverizarea Preţ de cost ridicat Preţ de cost ridicat Adecvaţi pentru macromolecule Pentru substanţe optic active Doar pentru ioni sau compuşi ionizabili -
10pg = 1ng
Bazaţi pe Spectrometria de 100pg - 1ng Masă FT-IR Difuzia luminii
1μg 10μg
Activitate optică Electrozi ion selectivi
1ng 10ng
Fotoionizare
1pg - 1ng
Înainte de separarea componentelor studiate, probele trebuie să fie pregătite astfel încât acestea sunt într-o formă adecvată pentru separare şi detectare. Uneori, diluţie şi/sau filtrarea simpla este suficientă. Multe metode care utilizează diferite proprietăţi fizice pot fi aplicate pentru a izola compuşi de interes. Una dintre tehnicile cele mai frecvent utilizate pentru izolarea componentelor nevolatile este technical de extracţie. În funcţie de etapa de matricea probei care conţine compuşii de interes, extracţie lichid-lichid sau solid-lichid poate fi folosita (tabelul 2.5) . (S. Gocan, 2002).
20
Tabelul 2.5 Detectoare folosite in cromatografie de lichide de performanta înalta (S. Gocan,2002). Limita Detectoare detectoarelor Detector Indicele de refracţie (RI) - foloseste cabilitatea compuşilor de a indoi sau a refracta lumina ~10-100ng Detectro de luminia difuzată (LS) sau detector de lumină- difuzată evaporatoare (ELS) - măsoară lumina difuzată de particule într-o soluţie sau, după nebulizare într-un tub încălzit înaintea celulelor de detectare.
Detector ultra violet (UV) vizibil - foloseste capacitatea compuşilor de a absorbi lumina. Detector de lungime de undă fixă - măsoara la o lungime de undă, de obicei, 254 nm Detector de lungime de undă variabilă - măsoară la o lungime de undă o dată, folosind game largi ale lungimi de undă Detector de raza foto diod (PDA) - creează spectrul UV şi / sau spectrul vizibil în intervale facultative de lungimi de undă simultan, adecvate pentru identificarea unor compuşi (în primul rând de carotenoizi) ~0.1 ng Detector electrochimic – masoara compuşi care trec prin oxidare sau reactii de reducere care trec prin electrozi de potenţial electric diferit ~0.01-0.001 ng Detector de conductivitate - masoara conductivitatea de compuşi într-o soluţie Detector fluorescent – măsoara compuşi care absorb lumina apoi re-emit la o anumita lungime de undă Detector de spectrometrie de masă (MS) - masoara compuşi ionizati, care trece printr-un analizor de masă şi detectează curentul de ioni; creează spectrul MS ai compuşilor analizati; este una dintre metodele cele mai potrivite de identificare a compuşilor Metode de ionizare: impact electronic (EI) - foloseste curent de electroni sau fascicul de creat în conformitate cu potenţial electric ridicat Ionizare chimică (CI) - foloseste gaz ionizat pentru a elimina electronii din
21
~1-10 ng ~0.01-0.001 ng ~0.1-0.001 ng
compuşii, metoda mai putin agresiva Bombardament atom rapid (FAB) - foloseşte atomi de xenon accelerat la viteza mare Pentru a fracţiona o probă după extracţie cu solvent, cromatografia de lichid sau de extracţie în fază solidă poate fi utilizată. În tehnica din urmă, cartuşe mici umplute cu sorbenţi particule mici sunt utilizate prin aplicarea solvenţilor potriviti pentru simplificarea matricei sau pentru izolarea componentelor de interes. Un număr mare de absorbanţi pot fi găsiti în piaţă, cum ar fi dioxid de siliciu pe baza de legat-fază sorbenţi sau polimeri macroreticular poroase, adsorbanţi spumă poliuretanică sau răşinile de ioni schimbătoare. Avantajele etapei solide de extracţie sunt posibilitatea de îmbogăţire a unui analit foarte diluat, şi de economisire a timpului de automatizare. Derivatizarea compuşilor este necesară în HPLC , mai ales pentru a îmbunătăţi reactia detectoarelor. Derivatizare poate fi efectuata înainte de (pre-coloană) sau după (postcoloană) separare. Reactivii utilizat pentru detectarea vizibila UV ar trebui să conţină un grup cromofor, cu un coeficient mare molar de absorbţie. Reactivii trebuie să fie mici şi ne-polari, în scopul de a nu modifica caracteristicile de separare a moleculelor de interes. Grupul cromofor în structura chimică a moleculei de reactiv este în primul rând un derivat de un inel de benzen. Reactivii aplicati în detectarea fluorescente ar trebui să aibă o reactie fluorescenta semnificativa. Derivatele fluorescente sunt utilizate în principal stabilirea de amine şi aminoacizi, şi în etichetarea proteinelor şi enzimelor sau peptidelor. Unii compuşi fluorescenti sunt, de asemenea, utilizati pentru derivatizare de acizi şi alcooli. Reactivii utilizati pentru detectarea electrochimică pot fi gasiti printre cele utilizate în detectarea UV-vizibil şi fluorescent. Reactivii de oxidare sunt favorizati peste cei reductivi, din cauza dificultăţilor în excluderea de oxigen de la ambele probe şi faza mobilă. (Amelio M.,1993). 2.7 Analiza cantitativă Unul dintre scopurile mai esenţiale ale metodelor cromatografice este de a determina cantitatea de componente într-o soluţie de probă. Analiza cantitativă se bazează pe determinarea de magnitudine a semnalului detectorului pentru compusii de interes. Semnalul ar trebui să se schimbe liniar cu cantitatea de compuşi, şi semnalul poate fi măsurat ca înălţimea sau suprafaţa de un vârf cromatografic. Majoritatea instrumentelor HPLC achiziţionate în piaţă includ integratori sau computere care pot efectua achiziţii şi management. Precizie de analiză cantitativă în HPLC este afectată de mai mulţi factori, cum ar fi precizia de injectare, precum şi procesele de separare şi de detectare. Mai mult, erorile pot proveni, de asemenea, de la metodele de preparare a probei şi de calibrare. Detectoarele genereaza semnale pentru compuşi diferiţi cu sensibilitati diferite, şi, prin urmare, curbele de calibrare trebuie să fie elaborate pentru fiecare vârf de interes separat. În acest caz, cuantificarea se bazează pe o comparaţie a vârfului acelei zone/înălţimea probei, cu curba de etalonare a unui standard de analit în cauză. Utilizarea standardelor interne este deosebit de important pentru cuantificarea analizelor de concentraţie scăzută, şi / sau în cazul în care o gamă largă de concentraţii de compuşi este de aşteptat în eşantion. Erorile datorate preparararii probelor (extracţie, derivatizare) sau injectare pot fi reduse prin aplicarea unui standard de interior. Pentru a obţine rezultate valoroase folosind metoda standard de interior, vârfuri care sunt complet separate sunt necesare. O condiţie esenţială pentru un standard de interior este ca vârful să fie complet separat de alte vârfuri de interes. În al doilea rând, standardul de interior ar trebui să scadă într-o zonă goală de cromatograma a probei, şi trebuie să fie cât mai aproape posibil de compuşii analizati. Validarea unei metode analitice este o asigurare de analiză 22
precisă. Aceasta înseamnă că o metodă validată este corectă, specifică, reproductibila şi robusta, peste intervalul specificat în cazul în care proba va fi analizată. (Amelio M., ș.a.,1993).
Cap III Aplicaţii 3.1 Autenticitatea sucurilor de fructe Autentificarea sucurilor de fructe procesate este frecvent utilizat în prezent în Europa, în scopul de a detecta falsificarea, în conformitate cu codul de bune practici pentru sucurile de fructe şi legume (Asociaţia Industriei de suc şi nectaruri din fructe şi legume ale Uniunii Europene, AIJN, 2003 ). Acesta reprezinta o colectie de valori minime şi maxime şi / sau zone care precizează criteriile de autenticitate în analiza multicomponentilor. (Andrade P.B. ș.a.,1998) În Europa, AIJN şi mai multe sisteme de auto-control formează Sistemul European de Control de Calitate (EQCS) pentru industria de sucuri de fructe. Obiectivele principale ale sistemului de control sunt de a asigura o concurenţă loială şi liberă, în industria de suc, de a armoniza activitatea cu interpretarea constantă a rezultatelor analitice, precum şi pentru a îmbunătăţi sistemul de avertizare de falsificare. (H. Nașcu, 2003). Cu toate acestea, în ciuda tuturor regulilor şi reglementelor actuale, posibilitatea de alterare nu poate fi eliminata din industria alimentară. Diluare cu apă, care este cea mai simpla metoda de alterare a sucurilor de fructe, a fost folosit de mai mulţi ani. Având în vedere creşterea de informaţii cu privire la compoziţia chimică a fructelor, metode mai rafinate sunt folosite acum pentru alterare. Suplimentarea cu sucuri mai ieftine sau cu pastă de spălare şi extract de coaja este o practică sofisticata. Una dintre diferenţele de alterare a diferitelor sucuri este în materialul utilizat pentru sucurile fraudate. Din cauza costului mai mic de concentrat de mere, acesta poate fi folosit ca un corp străin; în alte situaţii, produse de suc de mere pot cădea pradă la alterarea cu un suc mai ieftin (Andrade P.B., ș.a., 1998). Lupta împotriva fraudei necesită cunoştinţe precise şi extinse în ceea ce priveşte compoziţia chimică minora şi specifica de fructe sau suc de fructe. Prin urmare, unul din obiectivele de cercetare este de a studia componentele individuale minore sau grupurile de componente specifice soiului şi / sau specii de materii prime. Una dintre cele mai bune
23
instrumente de analiză pentru acest scop este cromatografia de lichide de inalta performanta. La data de fata, numerosi compuşi au fost investigati pentru adecvarea acestora în evaluarea autenticitatea sucurilor.Acizi organici (în special acid isocitric), componente de zahăr şi acizi amino liberi au fost investigate de mai multi lucrători. Potenţialul de compuşi flavonoide şi carotenoide pentru detectarea fraudei în sucuri a fost deosebit de studiata. Metode chemometrice în evaluarea de compoziţia acestor compuşi specifice pot oferi un instrument eficient pentru stabilirea autenticităţii produselor din fructe, cu o diferenţiere de probe în funcţie de specie, origine geografică, etc. (C. Luca, ș.a., 1983). 3.1.1 Detectarea de zaharuri O metodă de alterare în industria de suc este adăugarea de mediu şi de sfeclă de zahăr invertit de medie sau mare contrentatie sau sirop de porumb cu multă fructoză. Utilizarea acestor substanţe naturale pentru fraudă înseamnă ca metode sofisticate de detectare sunt necesare. Aplicarea raportului stabil izotop de carbon este metoda cea mai acceptată şi eficienta pentru detectarea de alterare cu astfel de siropuri naturale. Cu toate acestea, mai multe aplicaţii de HPLC sunt utilizate pentru a identifica suplimentelor de zahăr în sucurile de fructe. (academicdirect.org). Cele mai importante glucide sunt prezente în sucurile de glucoză, fructoză şi zaharoză. Unele fructe, cum ar fi mere, pere, gutui, vişine, caise şi prune conţin alcool, carbohidrati, şi sorbitol. Mai multe coloane sunt disponibile pentru analiza HPLC de reducere a compuşilor de zahăr. O coloană de analiză carbohidrati sau coloana de schimb de ioni de legat in cruce cu calciu permite analiza completa a zaharurilor reducătoare menţionate mai sus. Investigarea raportului de reducere de zahăr nu oferă întotdeauna rezultate precise, deoarece reducerea raporturi de zahăr se poate schimba în specii de fructe, în funcţie de varietatea lor, maturitatea, starea în creştere, de origine geografică, etc. (Andrikopoulos N.K. , 2002). Determinarea raportului de componente de zahăr sau al proporţiei de zahăr şi sorbitol poate duce la succes în determinarea suplimentarii cu îndulcitori . Determinarea de sorbitol în sucul de produse care în mod natural nu conţin sorbitol indică adăugarea de alte fructe. De exemplu, în suc de coacăze negre, adaosul de 10% de suc de vişine poate fi detectat pe baza nivelului de sorbitol. Abateri in măsuratorile de sorbitol/zaharoaă şi sorbitol/ raporturi de zahăr totale pot fi folosite pentru a detecta adaosul de suc de pere la sucul de mere. Alterarea de concentrat de suc de mure şi vinuri, cu suc de fructe care contine sorbitol, poate fi, de asemenea, detectat prin determinarea conţinutului de carbohidraţi şi sorbitol. Altă abordare a acestei probleme este investigarea şi determinarea de oligozaharide din sucul de fructe prin HPLC. Aceasta pare a fi o metodă eficientă pentru a indica alterare cu indulcitori nedeclarate. Sucul de portocale este un exemplu de suc, care este bogat în zaharoză, şi, prin urmare, sucurile portocalii sunt sensibile la adăugarea de mediu, inclusiv siropuri invertite de zaharoză. Investigarea modelelor oligosaccharide de suc de portocale alterat poate duce la identificarea de fraudă. (traducere)
24
Unele oligozaharide, care sunt prezente în concentraţii mult mai mari din sfeclă de zahăr invertit decât în sucuri, pot fi analizate pe coloana de schimb de anioni umplute cu un tip de răşină de amine cuaternare, după cum s-a arătat de mai multi. Carbohidratii absorb slab în lumină UV şi lumina vizibila. Cu toate acestea, sensibilitatea detectorilor de indice de refractie este în mod normal, prea mic pentru a detecta compusi minoro, cum ar fi oligozaharide. In mod invers, un detector de impulsuri amperometrică cuplat cu cromatografie de lichid, oferă una dintre cele mai bune metode de detectare de carbohidrati adăugati la sucuri în scopul de alterare. Unele metode HPLC de analiză de zahăr cu pregătirea eşantionului sunt prezentate în tabelul 3.1. După cum se indică în tabelul 3.1, profilul oligosaccharide este util în screening-ul sucurilor citrice şi de ananas pentru alterarea potenţial. Metodele descrise în Tabelul 3.1 oferă o estimare bună a adaugarii de sfeclă de zahăr la sucurile citrice. O limitare a acestor metode este că zaharide endogene pot interfera cu cele de sfeclă de zahăr scăzut si zahăr mediu invertit. Sensibilitatea ridicată a detectorului a impulsuri amperometrice pot fi, de asemenea, folosite pentru a detecta adăugarea de spălări paste enzimei tratate din suc. Fragmentul oligogalacturonide produs din degradarea pectinei în timpul tratamentului enzimatic poate fi detectat chiar şi atunci când un nivel scăzut de pulp spala (10%), se adaugă la un suc. (Andrade P.B, ș.a., 1998). Tabelul 3.1 Metode cromatografice de lichide de înaltă performanţă pentru separare a mono-, di- şi oligozaharide (Andrade P.B. ș.a 1998). Zaharuri Pregătirea Stare de separare HPLC Detectia Referint probei * e Rafinoză Portocale: nici o Coloana: Supelcosil LC18, Detector H2O2 1 pregatire probei isocratic eluţie, faza mobilă: sensibil 0.2 mol l-1 Puffer fosfat (pH 6.3) electrochimic, cuplare cu enzima-reactor în cazul în care H2O2 este produsa din rafinozei de galactosidase Zaharuri Grapefruit: nici o CarboPac PA1 (Dionex) coloană Detector pulsat 2 reduse pregatire a probei de schimb de anioni, eluţie amperometric isocratica, faza mobilă: 0,14 mol l-1 NaOH, temperatura ambiantă Mere, Pere: nici a) Coloana Du Pont Zorbax de Detector de 2a, 3b, 4c o pregatire a amine cu coloana de paza amine, indicele de probei eluţie isocratica, faza mobilă: refracţie acetonitril / apă (76/24), b) Coloană Capcell-Pak-NH2, eluţie isocratica, faza mobilă: acetonitril / apă (80/20), c ) Coloană CarboPac PA1, eluţie isocratica, faza mobilă: 60 mmol l-1 NaOH
25
Oligozaha ride
Mărul trece prin cartuş C18 SEPPAK activat
Coloana Aminex HPX-87C de analiza monozaharida cu CarboC, micro-coloana de paza, eluţie isocratica, faza mobilă: 200 mg L-1 Ca(NO3)2
Detector de UVvizibile
5
Mure si prune: utilizarea cationand si coloane de schimb de anioni dupa extracţia cu Grapefruit4, portocala7,8: prin educaţie şi răşină schimbătoare de anioni şi în plus cartuş C18 SepPak
Coloană Aminex HPX-87 de cationi de schimb în formă Ca, eluţie isocratica, faza mobilă: apă deionizată, temperatura coloanei: 86.9°C
Detector de indicele de refracţie
6
Două Coloane CarboPac Pa1 de schimb de anioni, cu paza7,4, CarboPac PA1 conectate în serie8, gradient de eluţie, faza mobilă: A: 100 mmol l-1 NaOH. B: 100 mmol l-1 NaOH conţinand 100 sau 200 mmol NaOAc, C: 300 mmol L-1 NaOH4,7,8, post-coloană reactiv: 300 mmol NaOH L-1, sistemul de livrare este utilizat pentru a reduce derivarea de referinţă4,7, introducerea unui ventil de comutare pentru a devia deşeuri de zaharuri simple8
Detector pulsat amperometric
4,7,8
Portocala: sucul este amestecat cu răşină de Celită, centrifugare, supernatantul este eluat printr-un cartuş C18 SPE, eluentul este trecut prin cationi şi cartuşe de schimb de conectate în serie
Două coloane CarboPac Pa1 de schimb de anioni, cu gardele de CarboPac PA1 conectate în serie (supapa de comutarea fost inclusă între cele două coloane analitice), faza de eluţie isocratica mobil: 300 mmol L-1 NaOH, temperatura: 30 °C.
Detector pulsat amperometric
9
26
Sucuri de citrice: trec prin cartuş On-guard H
OligoSucuri de citrice: galacturon trec prin cartuş ide
Coloană CarboPac PA-100 cu coloană de paza, gradient de eluţie, faza mobilă: A: 2 mmol de acetat de sodiu la 100 mmol L-1 NaOH, B: 400 mmol de acetat de sodiu la 100 mmol L-1 NaOH coloană cu CarboPac PA-100 de paza, gradient de eluţie, faza mobilă: A: 2 mmol de acetat de sodiu la 100 mmol L-1 NaOH, B: 800 mmol de acetat de sodiu la 100 mmol L-1 NaOH
Detector pulsat amperometric
10
Detector pulsat amperometric
10
3.1.2 Detectarea de acizi În funcţie de specia fructului, acizi organici principali gasiti in fructe sunt: acid tartric (struguri), acid citric (fructe citrice, caise) şi acid malic (mere, pere, gutui, struguri, caise). Pentru portocale, în funcţie de soi, de gradul de maturitate, condiţiile climatice, de origine, etc, nivelurile de acid citric poate varia între 7,6 şi 11,5 gl -1. În unele cazuri, valorile maxime de acid citric pot fi depăşit destul de mult. Acid D-isocitric poate fi găsit în concentraţii mici, în cele mai multe sucuri de fructe, cum ar fi suc de portocale (65-200 mg l -1), suc de grapefruit (140 - 350 mg mg l-1), suc de lămâie (230-500 mg l-1), suc de ananas (80-250 mg l-1), suc de caise (75-200 mg l1) , suc de rosii (65 -150 mg l-1), suc de coacăze negre (160-150 mg l-1) şi suc de piersici (30-160 mg l-1). Deoarece acidul D-isocitric nu este folosit ca un corp străin, din cauza costurilor mari de producţie,aceşti compuşi ar putea fi folositi pentru a estima conţinutul de fructe de suc din produse.Raporturile de acid citric şi acid isocitric caracterizeaza speciile de fructe enumerate mai sus, chiar dacă valorile se schimba datorita varietatii, originei, etc. ( traducere). În mere, acidul organicprincipal este L-malic. Acid malic srodus sintetic constă din raceme de amestec D/L . Datorita faptului ca acidul L-malic costa mult mai mult în comparaţie cu amestecul D/L descurajează utilizarea de acid L-malic ca adulterant. Prin urmare, măsurarea acidului D-malic este suficient pentru a detecta adăugarea ilegala de acid malic sintetic. Un raport de acid L-malic/ acid malic total sub valoarea de 0,9 indică un suc de mere neautentic. Într-un studiu de colaborare facut de 14 laboratoare folosind 10 probe de sucuri de mere, utilizarea raportului a fost recomandata pentru testarea autenticitatii. În ananas, raportul acidului citric/ acidului L-malic este de aproape 2, şi această valoare poate fi, prin urmare, utilizata ca un index de autenticitate a produselor de ananas . Mai multe tipuri de coloana HPLC sunt disponibile pentru separarea acizilor. Coloana folosita de cele mai multe ori este etapa de suprimare a ionilor inversă. Etapa mobila utilizata pentru separare este de 0,2 M fosfat-amortizor (pH 2.2 - 2.4). Celelalte tipuri de coloană comune sunt cele umplute cu polimer pe bază de schimb de răşină de ioni. Faza mobilă aplicat pentru acest tip de coloane este, de obicei, sunt acizi anorganici (H 2SO4, H3PO4) de o concentratie de 0,005 mol l-1. Pentru aceste coloane, in pregatirea probelor nu se implică proceduri complicate de extracţie. (wikipedia, 2012).
27
Shui şi Leong (2002) au conceput o metodă HPLC pentru separarea de acizi şi compuşi fenolici, în sucurile de fructe într-un singur pas de separare (în probele de mere), şi a indicat că metoda ar putea sa fie folosita pentru a evalua autenticitatea de sucuri. ( traducere) Cu toate acestea, pentru determinarea acidului isocitric, mai multe metode HPLC sunt descrise în literatura de specialitate. Printre acestea, metoda simpla enzimatică este de preferat în laboratoarele de analiză, deoarece pregătirea probelor înainte de analiză cromatografică este foarte complicata pentru alte metode. (Andrade P.B. , ș.a., 1998). 3.1.3 Detectarea de compuşi fenolici Constituenti fenolici sunt metaboliţi secundari de plante. Ei au un rol important in aroma şi culoarea plantelor, produselor chimice şi sunt semnificative componente nutritive. Compoziţia specifică şi nivelul de compuşi fenolici pot fi utilizati ca un indicator de suc fructe de alterare. Ele pot fi împărţite în două grupe majore – fenolici acizi şi compuşi conexene, precum şi flavonoide. Acizi fenolici includ instrumentele financiare derivate de la acid cinamic (cum ar fi pcumaric, cafeic, ferulic, clorogenic, p-cumaroylquinic şi de acid neochlorogenic) şi derivate ale acidului benzoic (cum ar fi p-hidroxi benzoic, protocatechuic, vanilic şi acid galic). "Cinnamics" apar în natură sub formă de ester cu alţi compuşi (de exemplu, ester al acidului cafeic cu acidul clorogenic sau cu acid quinic), în timp ce "bensoics", apar de obicei în formă liberă. Flavonoidele , care sunt în mare parte pigmenţi biologici, aparţin derivaţilor fenil ale structurii benzopyrane (Figura 3.1). (Andrikopoulos N.K. 2002).
28
Fig. 3.1 Structura flavonoizilor (Andrikopoulos N.K. 2002 ). Aşa cum se vede în figura 3.1, structura benzopyrane constă din două inele de benzen cuplate impreuna printr-un inel heterociclic de şase membri care conţin un atom de oxigen. Principalele grupe de flavonoizi diferă în inelele heterociclice. Grupări hidroxil fenolice poat să aparţină la inelul de la pozitia 3, 5, 6, 7, 3’ , 4’ , si 5’ , care poate fi gratuita, metilica sau legata de zahăr. Flavonoidele sunt sintetizate în plante, şi compoziţia lor variază în funcţie de speciile de plante Flavanones, flavonols şi anthocyanidines sunt grupurile de flavonoizi, care apar mai ales în forma glycosilated în fructe. Flavonoli glicozide se găsesc în principal în coaja fructelor. Alte grupuri alte flavonoide care apar pe scară largă în fructe sunt flavan-3-etanoli (catechine), (procyanidins condensat taninuri), format de polimerizare de flavan-3-etanoli sau / şi flavan-3 ,4diolilor.Speciile de plante (chiar cultivari) au fiecare o compoziţie caracteristică de flavonoide, care este la fel de specific ca o amprentă digitală şi, prin urmare, este potrivita pentru studiile 29
chemotaxonomic. Aceste grupuri de componente pot fi utilizate în teste de autenticitate, în ciuda mai multor componentilor care nu sunt încă identificati. (Andrade P.B. , s.a., 1998). 3.2 Fructe citrice Glicozidele flavanone sunt cele mai abundente în citricele flavonoide. Compnentele de zahăr sunt mono-sau di-zaharide de ramnose şi / sau glucoză . Flavonele polymethoxylated pot fi găsite cu distribuţii specifice în citrice, în special în partea de flavedo din fructe. Glicozidele flavanone şi flavonele polymethoxylated care au fost identificate în fructe citrice sunt prezentate în tabelul 3.2. Glicozidele flavanone pot fi determinate prin diferite metode analitice, dintre care HPLC este una dintre cele mai eficiente pentru separarea şi determinarea cantitativă a acestora. Procedura originala a fost dezvoltata de Fisher şi Wheaton (1976), care au angajat coloană C18 cu fază inversă de apă şi de eluare a acetonitril isocratice. Recent, aceasta faza mobilă a fost modificata cu alţi solvenţi de volume mici, pentru a permite separarea de glicozide flavanone într-un timp rezonabil. Tabelul 3.3 rezumă unele metode cromatografice cu pregătirea probelor. Detectare de compuşi efectuate cu metoda HPLC este aproape întotdeauna de detecţie UV la 260-283 nm. În portocale dulci, glicozidele flavanone majoree sunt hesperidina şi narirutin. Hesperidina pot fi găsite în cea mai mare cantitate. Deoarece hesperidina este insolubil, el poate fi găsit în sucuri, în formă de suspensie fina. Modelele flavanone glicozide în portocale şi mandarine sunt similare. Grapefruitul contine hesperidina, narirutin, naringin şi neohesperidinei; cu toate acestea, cantitatea de hesperidina şi neohesperidinei este foarte mică. Naringin şi neohesperidinei apar rar sau nu poat fi detectate în suc de portocale. Diferenţele în compoziţia de glicozide flavanone dintre portocale oferă un instrument pentru detectarea de adaosul de suc de grapefruit la sucul de portocale. Într-un alt studiu de colaborare, de către 15 laboratoare, s-a stabilit că determinarea de naringin şi neohesperidinei în suc de portocale, metoda de HPLC este o metodă fiabilă pentru detectarea prezenţei de suc de grepfrut în sucul de portocale . (Andrade P.B., 1998). Tabelul 3.2 Flavonoidele din unele specii de citrice şi hibrizi (Andrade P.B. , ș.a , 1998) . (Poli) flavone methoxylated, flavone
Flavanone glicozide
Sucuri Citirice
Didymin
Clementine (7), grapefruit (2,9), lamaie (9), mandarine (4), portocala (2,4,7), ortanique (7), satsuma (7), portocala acra (4), tangelo (4), tangor (2,4)
Eriocitrin
Grapefruit (9), lamaie (9), mandarine (4), portocala (4), portocala acra (4), tangelo (4), tangor (4)
Hesperidin
Clementine (7), grapefruit (3,2,9), lamaie (6,9), mandarine (3,4,6), portocala
30
(3,2,4,6,7), ortanique (7), pummelo (6), satsuma (7), tangelo (3,4), tangor (3,2,4) Naringin
Grapefruit (1,3,2,9), lamaie (6,9), mandarine (6), portocala (3,4,6), pummelo (6), acra portocala (3,4), tangelo (3,4)
Narirutin
Clementine (7), grapefruit (1,3,2,9), lamaie (9), mandarine (4), portocala (3,2,4,7), ortanique (7), pummelo (3), satsuma (7), portocala acra (4), tangelo (3,4), tangor (3,2,4)
Neoeriocitrin
Grapefruit (9), portocala (4), portocala acra (4), tangelo (4) Grapefruit (2), lamaie (6), mandarine (6), pummelo (6), portocala (6), portocala acra (4), tangelo (4)
Neohesperidin
Poncirin
Grapefruit (2,9) Portocala (8) Lamaie (6), mandarine (6), portocala (6), ortanique (6), pummelo (6) Clementine (7), portocala (5,7), ortanique (7), satsuma (7), tangelo (5) Portocala (2), tangor (2)
Apigenin * -7-O glucoside Diosmetin-7-O rutinoside (diosmin) Heptamethoxyfl avone Hexamethoxyfl avone Hexamethyl-O-gossypetin
Clementine (7), portocala (7), ortanique (7), satsuma (7)
Hexamethyl-O-quercetagetin
Clementine (7), portocala (7), ortanique (7), satsuma (7) Clementine (7), portocala (7), ortanique (7), satsuma (7) Lamaie (6), mandarine (6), portocala (6), ortanique (6) Portocala (8)
Isosinensetin Luteolin * Luteolin * -7-O-glucoside
31
Nobiletin
Clementine (7), portocala (2,5,7), ortanique (7), tangelo (5), tangor (2)
Scutellarein* and heptamethoxyfl avone
Portocala (2), tangor (2)
Sinensetin
Clementine (7), lamaie (6), portocala (2,5,6,7), ortanique (7,6), pummelo (6), tangelo (5), tangor (2)
Tangeretin
Clementine (7), portocala (2,5,7), ortanique (7), tangor (2), tangelo (5)
Tetramethyl-O-isoscutellearin
Clementine (7), ortanique (7)
Tetramethyl-O-scutellarein
Clementine (7), portocala (5,7), ortanique (7), tangelo (epi-), mesocarp (5)
Tabel 3.3 Separarea HPLC a glicozidelor flavonoide și a flavonilor polymethoxylati (traducere) Componente Pregătirea probei Separarea HPLC Referințe Extracția sucului cu benzen de Coloana: Novapak RP C18, trei ori, centrifugarea, separarea gradientul de eluare, faza stratului de benzen, uscarea sub mobilă:A: (84/16), B: apa/ N2 la 40°C, dizolvarea acetonitril/ tetrahidrofuran PMF (42/42/16), A/B de la 100/0 la 1, 2, 3, 4 0/100, temperatura: 35°C, detector PDA:340 nm. Extracția de suc cu benzen, Coloana: Luna II C18, eluția de FG si FMF cu gradientul de eluție, faza apă/acetonitril (4/6) pe un pachet mobilă: A: apa/ tetrahidrofuran C-18 Sep de cartușe active + (98.75/1.25), pH: 3,5 cu H3 PO standarde interne 4, B: acetonitril/ FMF și FG tetrahidrofuran (98.75/1.25), 5 A/B de la 100/0 la 30/70, temperatura mediului ambiant, detectorul PDA: 280 nm(FGS), 330 nm (FMF) Diluarea probelor de suc cu Coloana: C18 cu precoloana dimetilformamida, introducerea din aceeași rășină, gradientul
32
PMF și FG
de eluție, faza mobilă: A: acetonitril, B: apa/ acid acetic (96/4), A/B de la 0/100 la 70/30, detectorul PDA: 280 nm (FG), 330 nm (PMF) Coloana: Lichrospher R 100RP 18, gradientul de eluție, faza mobilă: A: 0.5% acid acetic în apă, B: 0.5% acid acetic în soluție apă-acetonitril (50/50), A/B de la 95/5 la 0/100, temperatura mediului ambiant, detectorul PDA: 280nm, 330 nm
în baie de apă la 90°C, centrifugare
Glicozide flavonoide
Coloana: Nucleosil C18, eluție izocratică, faza mobilă: apa/ acetonitril/ tetrahydrofuran/ acid acetic (80/16/3/1) detector PDA: 280 nm Coloana: μ Bondapack C18, izocratic, faza mobilă: apa/ acetonitril (80/20), detector PDA: 280 nm
Nu se pregătește filtrarea probelor
Glicozide flavonoide
Glicozide flavonoide
Coloana: Supelco C18 cu Speroi-5 C-18 pre-coloana, eluție izocratică, faza mobilă: apa/ acetonitril/ acid acetic glacial (79.5/20/0.5), detector PDA: 280nm
Centrifugare
Eșantion + standard intern (rhoifolin) de centrifugare, extracția solidelor cu metanol de două ori, centrifugarea, colectarea de supernatanți, diluare Eșantion + standard intern (rhoifolin) + metanol, încălzire la 55° C în baie de apă, centrifugare, extrația de solide cu metanol în baie de apă,
33
Coloana: Alltima C18, eluție izocratică, faza mobilă: apa/ acetonitril/ 2-propanol/ acid formic 158/23/19/0.2, detector PDA: 283 nm, 335 nm
6
7
8
9
10
11
centrifugare, combinarea supernatanților, diluare, filtrare Eșantion uscat la rece + 62.5% metanol conținând BHA (tertbutyl-4-hidroxianysol), sedimentare, diluare cu apă
Punerea sucului de fructe în baie de apă fiartă, centrifugare
Punerea sucului pe cartușul SepPack C-18, spalarea cartușului cu 10% metanol, eluția glicozidelor flavonoide cu metanol
Coloana: Purospher RP C 18, gradient de eluție, faza mobilă: A: apa cu 1% acid formic, B: 100% acetonitril, A/B de la 95/5 la 40/60, detectoare: PDA din compuși cu UV maxime, spectometru de masă Coloana: Novapak RP C18, gradient de eluție, faza mobilă: A: 80 ml 0.25 mol-1 K2HPO4 + 400μl 80% H3PO4 diluat cu 2l apă; B: 40 ml 0.25 mol l-1 K2HPO4 + 200 μl 85% H3PO4 + 507.65 g acetonotril diluat cu 1 l apă , A/B de la 100/0 la 0/100, detectorul PDA: 280 nm. Coloana: Zorbax ODS C18, eluție izocratică, faza mobilă: apa/ acetonitril/ acid acetic glacial (79.5/20/0.5), detector: lungimea de undă fixă UVvizibil: 280 nm
12
4, 13, 14,15
16
Deoarece există mai multe soiuri care conţin naringin şi poae fi în mod legal în suc de portocale comercial, utilizarea de naringin numai pentru a detecta prezenţa de suc de grapefruit este în mod clar imposibil. Cu toate acestea, raportul naringin / neohesperidinei poate fi folosit pentru a diferenţia sucuri de portocale, care pot include suc de grapefruit adăugat sau alte naringin care conţin soiuri de citrice. Adaosul de Citrus aurantium şi / sau C. bergamia la portocale (C. sinensis), poate fi detectat prin prezenţa de naringin şi lipsa de prezenţă a unor alte flavonoide specifice. Adaosul de tangerine (mandarine), sau un hibrid de portocale şi tangerine poate fi stabilit de un raport scăzut de hesperidina / narirutin . (traducere) Compoziţia de flavone polymethoxilate în sucurile de citrice diferă foarte mult.Variaţia specifică a modelului flavone polymethoxilated prevede un alt instrument de diferenţiere de sucuri citrice. Ooghe ș.a. (1994) au stabilit, în studiul lor, care determinări de glicozide flavanone şi flavone polymethoxylated sunt tehnici complementare. Folosind aceste două grupuri de compuşi, împreună cu diferite modele, oferă o şansă bună de a detecta alterarea sucurilor de portocale.Compoziția de flavoni polimetoxilați în sucurile de citrice diferă foarte mult. Variația specifică a flavonilor polimetaxilați prevede un alt instrument pentru diferențierea sucurilor citrice.
34
Ooghe ș.a ., 1994 au stabilit prin studiul lor că determinările glicozidelor flavonoide și flavonilor polimetaxilați sunt tehnici complementare. Folosind aceste două grupuri de componente împreună cu modele variate oferă o șansă bună de detectare a alterării din sucurile citrice. ( traducere) 3.3 Alte fructe Pe langă fructele citrice, alte fructe studiate include mărul, părul, gutuie, prune, caise, piersici și fructe de pădure. Tabelul 3.4 enumeră compușii fenolici din aceste fructe.Acești compuși fenolici sunt deasemenea specifici “amprente” de detectare a alterării din sucurile acestor fructe. Există unul sau două componente cheie printre fenoli specific unui singur tip de fructe. Florizina (Phloretin 2'-glucozide), de exemplu, apare numai la măr în timp ce glicozidele isorhamnetin și arbutin (glicozida hidrochinina) sunt specifice perelor. Determinarea acestor componente este un instrument util pentru detectarea alterării. Multe metode HPLC pot fi utilizate pentru separarea și determinarea compușilor fenolici, după cum este raportat în literatura de specialitate.
35
Tabel 3.4 Compuși fenolici ai fructelor și/sau al produselor din fructe (Andrade , P.B., 1998). Acizi fenolici si derivati, aldehide
Specii de frute Referințe Acid cafeic Isomerii acidului clorogenic 4-O-acid cafeoylquinic 5-O-acid cafeoylquinic Ester cafeoyl Acid caftaric Acid cinamic Acid clorogenic Acid p-coumaric Ester coumariol (din acid tartaric) Acid coumaroylquinic Acid coutaric 3,4- aldehida dihidroxibenzoică Acid elagic Derivații acidului elagic Acid ferulic Ester feruloyl(din acid tartaric) Glucoza feruloyl Acid galic 2-S- acid glutathionylcaftaric Acid phidroxibenzoic Acid sinapic Aldehida siringica Acid vanilic Aldehida vanilica
Mere 1
2 +
3
4 +
5 +
10
6 +
12 +
Pere 1
2 +
5 +
8 +
6 +
12 +
Gutui 1
9
+
+
6 +
Caise
Piersici
Ananas
Portocale
Căpșuni
5 +
5 +
12 +
12 +
Struguri albi 5 5 + +
4 +
+
+
+
+
+ +
+ +
+ +
4
12 +
5
11
11
Zmeură 12 +
+
+
+
+ +
+ +
+
+ +
+ + +
+
+ +
+
+
+
+
+ + +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+
+
+
+ +
+
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+
+
t + +
t
+
+
t
+
+
+
+
+ +
+ +
+
+
+
+
+ +
+
+
b
+
n t
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ + +
t
+
n
+
+
+
+
+
+
+
+
+ +
+ +
t
t
+
+
+ + +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Referințe aesculetin
1
2
3
4
5 +
10
6
12
Pere 1
2
5
8
6
12
Gutui 1
9
6
Struguri albi 5 5 +
Caise
Piersici
Ananas
Portocale
Căpșuni
4 +
5 t
5
12
12
+
+
scopoletin
Hidrochinina
(+) - catechin Isomeri catechincatechin-gallate Catechin-gallate (-) -epicatechin (-) -epigallocatechin (-) –epigallocatechin gallate Procyanidina B1 Procyanidina B2 Procyanidina B3 Procyanidina B4 Floretin 2' – glucozide (phloridzin) Floretin 2' – xylosilgalactoside Floretin 2' – xylosilglucozide Hidrochininaglucozida (arbutin)
Glicozide flavonol
Dihidrochalcones
Catechine / procianidine cumariniceAnticoagulante
Tabel 3.4 Compuși fenolici ai fructelor și/sau al produselor din fructe (Continuare) Specii de fructe Mere
2,3-dihidroquecetin rhamnoside 2,3-dihidrokempferol - rhamnoside Glucozidaisorhamnetin Glucozida-
+
+
+
+ + +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+
+
+
+ + + +
+
+ + + +
+
+
+
+ +
+
+
+
+ +
+
+ + + +
+
+
36
+
+
4
5
t
+
+
12
+
11
11
Zmeură 12
isorhamnetin Kemferol 3-O-rutinozide kemferol 3-O-glucozide kemferol glicozid miricetin 3-O-ramnoside quercetin
+ +
+ +
+
+
+
+
+
+
37
+
+ +
+
Glicozide flavonol Flavonoli
3-O-galactozide quercetin 3-Oglucozide quercetin 3-O-glucuronide quercetin 3-O-ramnoside quercetin 3-O-xyloside quercetin 3-O-arabinoside quercetin glicozide quercetin 3-O-rutinoside (rutin) kemferol
+
+
+
+
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+ +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ +
+
+ +
+
+
+
+
+
+
+
+
myricetin quercetin
+
+ +
+
+
+
+ +
+
+ +
+
+
+
+
+
+
t, urma; bd, hidroxil benzoic acid derivativ; n, nedetectate în toate variantele. 1, Andrade et al ., 1998 ; 2, Escarpa and Gonzalez, 1999 ; 3, Shui and Leong, 2002 ; 4, Dragovic-Uzelac et al ., 2005 ; 5, de Simone et al ., 1992 ; 6, McRae et al ., 1990 ; 7, Thavarajah and Low, 2006 ; 8, Tanrioven and Eks﹐i, 2005 ; 9, Silva et al ., 2000 ; 10, Spanos and Wrolstad, 1992 ; 11, Versari et al ., 1997 ; 12, Mattila et al ., 2006 .
Cea mai comună utilizare a metodelor este ( tabelul 3.5) aceea de a studiat compoziția chimică a merelor, datorită popularității sale și a prețului scăzut și deoarece piureul de mere sau sucul este cel mai favorizat alterării naturale față de alte sucuri de fructe. Folosind detectoarele colriometrice ale matricei de elctrozi, Sontag și Bernwieser (1994) au concluzionat ca compozițiile fenolice ale merelor și perelor sunt foarte simple dar diferite, și prin urmare este posibilă detectarea alterării nectarului de pere cu suc de mere până la nivelul de 1%. Dragovic ș.a , (2005) au dovedid în studiul lor că adaosul piureului de mere la piureul de caise în timpul procesării nectarurilor de caise și dulcețurilor poate fi ușor detectat prin prezența Phloretin 2'glucozide și a Phloretin 2'-xiloglucozide. Phloretin 2'-xiloglucozide poate fi folosit în particular ca un marker în detectarea alterării nectarului de caise ce conțin 10% din piureul de mere. În dulcețurile de caise se poate detecta minim 20% din piureul de mere. În anumite situații sucul de mere poate fi alterat cu suc de pere. Deoarece arbutinul și glicozidele isorhamnetin sunt caracteristice sucului de pere, pot fi folosite ca indicatori ai alterării sucului de mere cu suc de pere. Silva ș.a .(2000) au studiat câteva eșantioane de gemuri procesate de gutui care conțineau și arbutin și, au sugerat că aceste eșantioane de dulcețuri au fost alterate cu piure de pere. (Andrade P.B. , ș.a , 1998). Tabel 3.5 Separarea HPLC a compusilor fenolici din esantioanele fructelor ( traducere) Fructe Prepararea Separarea HPLC Detectarea esantioanelor Mar, gutui, para, Evaporarea la Coloana: Detector PDA pruna, piersici, uscare a butanolului Spherisorb ODS2, 280, 350 nm portocale acre, extras din gradient de elutie, caise, capsuni esantioane, dilutia faza mobila: A: cu apa acida (pH2, apa/acid formic HCI), filtrarea, (19/1), B: metanol, trecand prin A/B de la 95/5 la Amberlie XAD-2, 20/80 dupa spalarea coloana: coloanei cu apa Lichrochart100 RP (pH2 cu HCI) elutie – 18, gradient de 38
Referinte
1, 2, 3
fenolica fractie cu metanol, evaporare, re-dizolvare
Mar, para
Mar, para, gutuie
Mere, pere, portocale, piersici, caise, struguri,
Izolarea flavonoidelor: extragerea esantioanelor cu metanol (ce contin 1% BHT) in intuneric, hidroliza de glicozide: extragerea esantioanelor de acetat de etil, hidroliza cu 2 mol lHCI, curatat cu Sep-Pack C18, izolarea procianidelor: elutia diluata a probelor pe Sephadex LH-20 cu 20% metanol Centrifugarea sucului + standardul intern (etil syringate), sau extragerea sucului cu metanol , elutia compusilor fenoliciprin coloana de poliamide cu metanol, evaporare, re-dizolvare
elutie, faza mobila: A: apa/ acid formic (95/5), B: metanol, A/B (95/5) de la A/B 95/5 la 20/80 Coloana: Nucleosil Detector PDA, 120, C18, gradient 280 nm de elutie, faza mobila: A: 0,01 mol l-1 acid fosforic, B: metanol sau acetonitril, A/B de la 95/5 la 0/100 sau de la 98/2 la 65/35
Coloana: Lichrospher100 C18, elutie isocratica, faza mobila: metanol/acid acetic glacial/ apa (35/2/63)temperatur a coloanei: 32 º C coloana: Hypersil ODS, C18, gradient de elutie sau elutie isocratica, faza mobila: A: acid acetic 1%, B: acetonitril, A/B (81/19) sau A/B de la 85/15 la 75/25 Concentratia Coloana: Nova-Pak sucului, extractia cu C18, gradient de eter etilic, apoi cu elutie pentru fenolii
39
4
Detector matrice pentru electrodul colorimetric detector PDA, 284 nm 6, 5, 8
Detector PDA , 280nm, 340 nm
7
ananas
acetat de etil, evaporarea dupa punerea in comun a fractiilor
cu greutata moleculara mica si flavan-3-ols, faza mobila: A: 2% acid acetic, B: metanol/ acid acetic/ apa (30/2/68), A/B de la 254 nm, 365 nm 100/0 la 15/85, elutie isocratica pentru glicozidele flavanol, faza mobila: A: 2,5 % acid acetic, B: tetrahidrofuran/apa/ acid acetic (50/47.5/2.5), A/B (65/35), elutie isocratica pentru agliconii flavanol, faza mobila: apa/metanol/acid acetic (57.5/37.5/5/5)
Para, strugure
Para: izolarea fenolilor folosind C18 Sep-Pak, evaporarea, redizolvarea, strugure: filtrare pentru acizi fenolici si glicozide flavonol, izolarea procianidelor folosind Sephadex LH-20, evaporare, re-dizolvare.
Coloana: Supelcosil Detector PDA, LC-18 cu ODS 280 nm, 320 nm coloana de paza, gradient de elutie, faza mobila: A: 0,07 mol l-1 KH2PO4 (pH: 2.5 cu acid fosforic), B: metanol, A/B de la 98/2 la 60/40
9 10
3.3.1 Detectarea de antociani Antocianii sunt pigmenți de tip flavonoid responsabili pentru culoarea de la roșu la albastru-închis a fructelor, florilor și legumelor. Ele sunt glicozide de antocianidine. Antocianinele sunt prezente în conținut ridicat în fructe de pădure, căpșuni, zmeură, mure, coacaze negre și roșii. Figura 3.2 prezintă structura antocianidelor, cu cea mai frecventă
40
combinație de grupuri secundare și numele lor. Există un interes special în antocianii naturali din industria alimentară deoarece ei pot fi folosiți ca alternativă la coloranții sintetici. Există câteva metode analitice disponibile în literatura de specialitate bazate pe structura și concentrația antocianidelor în fructe, dar informații cu privire la astfel de metode sunt incomplete, în parte din cauza limitării în metodele de analiză. ( traducere)
Fig.3.2. Structura anticianizilor (C. Luca, ș.a, 1983). Wu și Prior (2005) au efectuat un studiu sistematic pentru a identifica și caracteriza antocianinii în diverse fructe de pădure (afine, căpșuni, mure, zmeură), prune, piersici, cireșe, mere și nectarine. Codul de bune practici (AIJN, 2003) definește protocoale pentru determinarea HPLC modelelor de antociani folosind calistephine ca standard intern. Compoziția acestor acizi – precum compuții ce oferă anumite amprente pe cromatograma HPLC, în același mod ca și compușii fenolici despre care am discutat mai sus. Întrucât condițiile de prelucrare și depozitare afectează compoziția de antociani, acestea pot fi utilizate ca markeri pentru a stabilii autenticitatea produselor din fructe . (C. Luca, ș.a, 1983). 3.3.2 Detectarea de carotenoizi Alt grup de pigmenți distribuiți pe scară largă în rândul organismelor vii sunt carotenoizii. Carotenoizii sunt sintetizați numai în plante și se crede că animalele nu sunt capabile să sintetizeze carotenoizi, în afară de unele specii de bacterii. Culoarea fructelor citrice se datorează în mare parte carotenoidelor, care sunt galbene până la roșii. Carotenoidele pot fi distruse în timpul prelucrării și, prin urmare, coloranții pot fi adăugați produselor din sucuri pentru îmbunătățirea culorii lor finale sau mascarea deficiențelor . Cei mai comuni aditivi sunt βcaroten si β-apo-8'-carotenal, licopen sau extracte naturale carotenoide cum sunt florile de gălbenele, boia de ardei , extract de coajă de citrice sau suc de mandarine sau tangerine. Adaosul extractului de mandarine sau tangerine este permis până la 10% în sucul de portocale, în unele țări, dar este interzisă în Europa. Extrastul de boia de ardei este folosit pentru colorarea băuturilor
41
de portocale, în Europa. Mulți cercetători au studiat profilurile carotenoidelor din citrice folosind HPLC. Tabelul 3.6 rezumă condițiile de pregătire a eșantioanelor și de separare HPLC în aceste studii. Dintre toți carotenoizii prezenți în sucul de portocale, β-cryptoxantin are cele mai mari concentrații. Marea majoritate a carotenoidelor din sucul de portocale care conțin grupuri de OH pot forma esteri acizi grași, cum ar fi acizii lauric, miristic și palmitic. Concentrația carotenoizilor individuali depinde în mod semnificativ de soiul fructului și originea geografică. (Andrade P.B. , ș.a , 1998). Într-un studiu realizat de Philip ș.a. (1989) s-a stabilit că raportul calculat dintre esterii criptoxantin și diesterii luteina ar putea fi utilizat pentru a detecta adaosul de suc de tangerine în sucul de portocale la nivelul peste 25%. Folosind această metodă, adăugarea carotenoidelor sintetice β-caroten si β-apo-8'-carotenal ar putea fi detectate la nivel de peste 5 mg kg -1 în concentratul de suc de portocale. În plus, Pan ș.a. (2002) pot detecta adaosul de 100g kg-1 tangelo la sucul de portocale pe baza raportului între flavonii polimetaxilati și carotenoizi, analiza canonică de discriminare. Separarea HPLC a carotenoidelor din sucul fructelor citrice se realizează conform tabelului 3.6. ( traducere) Tabelul 3.6 Separarea HPLC a carotenoidelor din sucul fructelor citrice (traducere). Pregătirea eșantioanelor Separarea HPLC Referințe Omogenizarea probelor cu metanol, Coloana: Waters Resolve C18 cu filtrarea, extragerea rezidurilor cu coloana de pâză din aceeași rășină, acetonă, adaosul de 10% de HCI gradient de eluție, faza mobilă: A: metanolic combinat filtrat, extracție metanol, B: acetat de etil, A/B de la 1 cu eter de petrol, evaporarea, 100/0 la (0/100), detector: lungime de dizolvarea rezidurilor în acetonă undă variabilă – detector de radiații UV, 465 nm Precipitații de suc cu soluție apoasă Coloana: YMC C30 nelimitat, gradient de ZnSO4H2O + K4 [Fe(CN6)]3H2O, de eluție, faza mobilă:A: eter metil-tertcentrifugare, extracție de precipitat cu butyl, B: metanol, C: apa, A/B/C de la acetonă, extracție de supernatant cu 5/90/5 la 50/50/0; detector PDA,290, eter de petrol, evaporare de petrol, 350, 430, 486 nm 2, 3 reziduri de hidroliză cu 10% metanol KOH, extracție de carotenoizi cu eter etilic, evaporare. Dizolvare de reziduri. Extracția de suc cu acetat de etil ce Coloana: Vydac 201TP54 C18 cu conține BHT, evaporare, dizolvare coloana de pâză Alltima C18, eluție isocratică, faza mobilă: acetonitril/metanol/1,2-diclormetan (30/35/5) cu 0,1% BHT, 0,1% amină 4 trietil, și 0,05 mol acetat de amoniu, detector: detector de scanare a spectrului de focus, 450 nm Centrifugarea sucului, extracția de Coloana: Du Pont Zorbax ODS, gradient două ori a rezidurilor cu metanol, de eluție, faza mobilă: acetonitril, hidroliza cu 10% metanol KOH, clorura de metilen, tetrahidrofuran și extracția de carotenoizi cu clorură de acetat de etil, detector: detector PDA, 5
42
etilenă, evaporare, dizolvare, eșantion 465 nm curat cu C18 coloana de metanol/ apa 95/5 urmată de clorura de metilen BHT, 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol; PDA, matrice fotodiodică. 1, Philip et al ., 1989 ; 2, Rouseff et al ., 1996; 3, Mouly et al ., 1999b ; 4, Pupin et al ., 1999 ; 5, Fisher and Rouseff, 1986 .
3.4 Autenticitatea vinurilor Vinul este definit ca o băutură făcută din suc fermentat de fructe sau de plante care conține 10-15% alcool din volumul propriu. În cazul în care o băutură nu este produsă în acest fel, ea nu este vin. Autenticitatea vinurilor este în conformitate cu standardele și regulile stabilite; vinurile sunt deasemenea considerate a fi alterate în cazul în care eticheta de pe sticlă nu este exactă.Vinurile aduse ilegal pe piață pot fi alterate alterări ce pot avea loc atât înainte cât și după fermentare. Vinurile alterate pot include aditivi neautorizați, sau au fost produse prin procese neautorizate. Metodele de alterare sunt de multe ori similare cu cele folosite la sucurile de fructe, cum ar fi diluarea cu apă, sau adaosul de zahăr, acizi și coloranți interziși.Vinul este deasemenea alterat dacă nivelul substanțelor autorizate depășește limitele specifice. Pierderile și modificările din compușii caracteristici în timpul procesului de vinificare (fermentare, filtrare, clarificare) și în cursul îmbătrânirii afectează compoziția speciilor chimice specifice, astfel încât aceasta devine mai simplă și/sau diferită decât cea din sucuri. O caracteristică importantă a vinurilor o reprezintă originea geografică, care afectează foarte mult savoarea, aroma și gustul. Din acest motiv, originea geografică este considerată a fi un factor important pe piață. Protecția originii este atribuită doar produselor de înaltă calitate și detaliază regiunea geografică și/sau factorii subiectivi. Protecția calității și originii vinurilor sunt strâns legate. Câteva metode HPLC care descriu detectarea zaharurilor și sorbitolului în fructe (Tabel 3.4) pot fi adaptate pentru analizarea vinului. De exemplu, HPLC este un instrument adecvat pentru determinarea coloranților artificiali din vinuri. Mai multe componente au fost studiate ca și compuși cheie în diferențierea calității și/sau varietății. Acidul elagic poate fi privit ca un compus caracteristic îmbătrânirii în butoi a vinului și ar putea deveni un marker de maturitate. Aldehidele furale, absente în vinul natural, pot fi considerate componente tipice vinurilor din butoaie . Acidul shikimic poate fi util pentru diferențierea soiurilor de vin roșu. ( traducere) În ultimii ani, utilizând calculatorul, analiza bazată pe recunoașterea modelului (analiza componentelor principale, analiza discriminantă), tehnicile cromatografice de separare au devenit instrumente eficiente în testarea autenticității. Câțiva muncitori au studiat mai mulți cimpuși polifenolici, cum ar fi acizi fenolici și derivați, precum și flavonoide, antociani și folosind metode HPLC pentru a studia adecvarea lor pentru testarea autenticității. Se crede că aceste clase compuse pot fi utilizate pentru clasificarea și diferențierea vinurilor în funcție de soiul de struguri și/sau de originea geografică, prin metode statistice. O categorie de vinuri o reprezintă vinurile dulci sau de desert, care sunt foarte prețuite, ușoare și nobile, cu un buchet plăcut. Aceste vinuri sunt produse din struguri infectați cu Botrytis cinerea (putregai nobil). În condiții meteorologice adecvate, strugurii infectați iau o formă ca de stafidă, cunoscută în
43
Ungaria cu denumirea de struguri Aszu. Strugurii aszu conțin amine biogenice, care apar în special în timpul infectării cu Botrytis cinerea. (lori.academicdirect, 2012) Figura 3.3 reprezintă marcarea lotului și lotul de încărcare a variabilelor (amine biogenice) și specialitățile vinurilor botritizate originare din Ungaria și din străinătate. ○ Tokaji Aszu și esența Tokaji Aszu; vinuri botritizate străine; ∆ Vinuri nebotritizate (albe) ungurești; dezacord, 71%. Variabile: amine i-butil (iBa), necunoscute1 (Unk1), tiramine (Tyr), necunoscute2 (Unk2), 2-metilbutilamine (2MeBa), agmatine (Agm), necunoscute3 (Unk3), 3metilbutilamine (3MeBa), n-pentilamine (npa), feniletilamine (Phe). Compoziția de amine biogenice constă în primul rând din amine alifatice primare specifice vinurilor botritizate. Utilizarea analizei factoriale multivariată (FA) și analiza discriminantului liniar ,vinurile Tokaji Aszu ar putea fi clasificate și diferențiate față de vinurile normale și de vinurile din alte origini geografice botritizate . Specificitatea compoziției aminelor, care depinde de infecția cu Botrytis cinerea și tehnologia de vinificare, oferă baza pentru discriminare. (traducere)
Factor secundar
Factor primar (a) Marcarea lotului
Factor secundar
Factor primar
44
(b) Lot de incarcare Fig. 3.3 Marcarea lotului și lotul de încărcare a variabilelor (H. Nașcu, 2003). O metodă grafică simplă și alternativa pentru diferențiere este prezentată în Figura 3.4, care oferă rezultate similare pentru diferențierea vinurilor Tokaji de alte vinuri. Introducând logaritmul grafic al concentrației de amine din vinurile Tokaji Aszu într-o diagramă web, formele lor trebuie să fie similare fiecăruia, formele diagramei pentru vinurile de altă origine și vinurile normale sunt diferite. (H. Nașcu, 2003).
(a) Vinuri Tokaji Aszu și vinuri străine botritizate (a) Vinuri Tokaji Aszu și vinuri străine botritizate
(b) Vinuri normale Fig. 3.4. Diagrama web-paianjen a logaritmului concentrației aminelor a vinurilor normale și aszu. (H. Nașcu, 2003). 3.5 Autenticitatea mierii Mierea este un material dulce natural care este colectat din nectarul organele plantelor vii de către specia de albine Apis mellifera sau insecte. Substanța dulce este livrată la lucrătorii din stup, pe care o modifică enzimatic, înainte de depozitarea, maturarea și deshidratarea ei.
45
Directiva europeană referitoare la miere (Directiva Consiliului 2001/110/EC) stabileste reguli privind compoziția și fabricarea mierii. Pentru criteriile de calitate specifice trebuie indicată originea botanică sau regională, teritorială și topografică a produselor de miere. În meire, un grup de compuși provine din plante și ceilalți de la albine. Unii dintre acești compuși apar sau se modifică în timpul maturării mierii. (wikipedia, 2012) Ca și în cazul altor produse alimentare, mierea este predispusă la alterare. Un tip comun de fraudă este diluarea mierii cu apă sau prin adaosul de siropuri (de exemplu: siropul de porumb cu extrafructoză(HFCS). O formă sofisticată de manipulare se bazează pe hrănirea albinelor cu zaharuri și siropuri. O altă metodă este etichetarea greșită cu privire la originea florală și geografică a mierii. Carbohidrașii majori din miere sunt glucoza (26.3-39.8%) și fructoza (35.942.1%).Zaharoza (sucroza) este prezentă la 1.7-2.9 % din miere, iar rata medie de frutoză la glucoză este de 1.2/1. Pe langă aceste două monozaharide principale, mierea conține, de asemena, un număr relativ mare de carbohidrați, cum ar fi di-, tri-și tetra-zaharide. (traducere). Ca și în alte produse alimentare, compușii de zahăr din miere pot fi determinați prin diferite metode.Schimbul lichidului cromatografic-anioni cuplat cu detecția amperometrică pulsată (PAD) este cel mai bun mod de a verifica autenticitatea mierii, într-un mod similar cu metodele discutate mai sus cu privire la fructe. Analiza amprentei oligozaharidelor este extrem de bună pentru detectarea adaosului de siropuri invertite sau HFCS la miere, la niveluri scăzute de 510% .Lipp (1988 ); Swallow si Low (1990) ; Swallow și Low (1994) ; Cordella (2003) ; Cotte (2003 ). Goodall (1995) a studiat profilurile oligozaharidelor din 91 de eșantioane de miere autentică britanică, folosind analiza discriminantului canonic. Ei au stabilit că profilurile oligozaharidelor pot avea un rol potențial în identificarea originii florale de miere, cu toate acestea, ei au declarat că această procedură nu ar permite stabilirea certă a tuturor tipurilor florale. (wikipedia, 2012) Fenolii formează o clasă de compuși, similari cu cele din fructe, care dau informații despre originea florală și geografică a mierii datorată compoziției ei florale. Un număr mare de compuși fenolici au fost identificați atât în miere cât și în fructe. Pregătirea probei și separarea HPLC pentru compușii fenolici ai mierii și pentru fructe sunt similare și, în anumite cazuri, aceleași ca și cele folosite la. Compușii fenolici oferă din nou amprenta originii botanice sau geografice de miere, și a unor compuși de marcare care au fost găsiți printre flavonoide, cum ar fi hesperetin în mierea de citrice, tricetin, myricetinsi doi derivați în mierea de iarbă și pinobankin, pinocembrin și chrisin în mierea de eucalipt .Prin studierea acizilor fenolici din diferite tipuri de miere, monoflorale, Dimitrova ș.a (2007) a descoperit mai mulți compuși care servesc ca markeri în controlul calității mierii. ( traducere) 3.6 Autenticitatea uleiurilor, untului și cafelei 3.6.1 Uleiurile vegetale Uleiurile de origine vegetală pot fi împărțite în uleiuri de semințe și uleiuri de fructe. Compoziția chimică a uleiurilor este considerată a fi mai puțin complexă decât ceea ce privește elementele constitutive pentru alte elimente. Cu toate acestea, acest lucrur nu înseamnă că practicile de fraudă sunt mai puțin diverse în acest domeniu, sau ca aceste metode de fraudă nu cauzează probleme grave în evaluarea autenticității. La uleiurile vegetale, procesul de alterare cel mai des utilizat este diluarea cu ulei mai ieftin. (Andrikopoulos N.K. , 2002). 46
Principalii compuși utili ai uleiurilor vegetale pentru detectarea autenticității uleiurilor și grăsimilor triacylglycerolii și acizii grași. Componentele minore, cum ar fi (fito)sterolii sau tocoferolii, carotenoide și sterens pot fi, deasemenea, utilizați pentru detectarea alterării. Fracțiunea trigliceridelor din uleiuri și grăsimi poate fi analizată prin tehnici HPLC pe o coloană cu fază inversă. Faza mobilă utilizată de obicei pentru separarea trigliceridelor constă în principal din acetonitril, cu un solvent mai puțin polar, cum ar fi acetona sau diclormetanul. Propor ția de solvent poate varia în funcție de probele studiate. Pentru separarea izomerilor poziționali, lichidul cromatografic pentru argintarea de înaltă performanță (Ag-HPLC) pare promțător. Utilizarea unui detector de UV este dificilă din cauza absorbției scăzute a triglicerolilor. Cele mai utilizate tipuri de detectoare sunt detectoarele cu index de refracție sau detectoarele de împrăștiere a luminii. Detectorul cu index de refracție este potrivit doar pentru separarea isocratică, în timp ce detectorul de împrăștiere a luminii oferă posibilitatea utilizării gradientului de eluție. Detectoarele spectometrice de masă au început să fie folosite în laboratoare recent. Unele metode HPLC utilizate în analiza triacylglicerolilor din uleiuri și grăsimi sunt prezentate în tabelul 3.7. (Andrikopoulos N.K. , 2002) Tabelul 3.7 Separarea HPLC a triacylglycerolilor (Andrikopoulos N.K., 2002) Eșantioane: uleiuri Separarea HPLC Detector Referințe sau grăsimi Coloana: μBondapak C18, eluție isocratică, faza mobilă: acetona / Detector indice de Susan, susan sălbatic acetonitril(50/50), temperatura: 30 ºC refracție 1 Coloana: LiChroCART 100-RP-18 sau Novena C18*, eluție isocratică, faza Palmier*, untură, carnea mobilă: acetona/acetonitril (63.5/36.5), Detector indice de de pui, carnea de vită, temperatura: 30 ºC refracție 2, 3* carnea de oaie Coloana: Supelcosil LC-C18 , gradient Detector de de eluție, faza mobilă: A: acetonitril, evaporare – B: 2-propanol/hexane (2/1), A/B de la împrăștiere Limfa 75/25 la 55/45 sau * de la 90/10 la lumină, * 4 40/60 ionizarea chimică a presiunii atmosferice – MS Coloana: Supelcosil LC-18, cu precoloana ODS -5S, eluție isocratică, Măsline, canola faza mobilă: acetona/acetonitril (93/7) Detector indice de 5 refracție Coloana: Superspher RP-100 C18, gradient de eluție, faza mobilă: 1) de la acetonitril / izooctan 90/10 la Soia, rapiță, palmier, acetonitril/ etanol/ izooctan (40/35/25), semințe de in 2) de la acetonitril la acetonitril / Detector de etanol (59/41), temperatura: 50 ºC împrăștiere a 6
47
luminii Semințe de rapiță, floarea soarelui, soia, semințe de in, de palmier, macadn, migdale, semințe de mac, alune, alune braziliene, fistic Dracocephalum moldavica , Silybum arianum , ciuboțica cucului de seară, porumb, amarant Palmier, grăsimi calite trans (cis, transtriacylgliceroli)
Coloane: două Nova-Pak C18 conectate în serie, gradientul de eluție, faza mobilă: A: apa, B: acetonitril, C: 2-propanol, A/B/C de la 30/70/0 prin 0/100/0 la 0/40/60, temperatura: 40 ºC
Detector UV, 205 nm ionizarea chiumică a presiunii atmosferice – MS
7
Coloana: Nova-Pak C18, gradient de eluție, faza mobilă: A: acetonitril, B: etanol, A/B de la 100/0 la 30/70, temperatura: 40 ºC Coloana: ChromSpher Lipide TM mod de schimb între cationi și ioni de argint, faza mobilă: A: acetonitril, B: diclorometan/ 1,2-dicloretan(1/1), C: acetona, A/B/C de la 0/98/2 prin 0/40/60 la 20/80/0
Lumina laser, detector de împrăștiere
8
Acizii grași din triacylglyceroli sunt specifici speciilor de plante. Distribuția specifică speciilor de acizi grași în triacylglyceroli permite detectarea adaosului de uleiuri de origine străină, precum și a gradului de alterare. Conținutul de trilinoleina din uleiul de măsline virgin este mai puțin de 0,3 %, în timp ce alte uleiuri (de arahide, porumb, ovaz, soia, floarea soarelui, susan, de struguri și de canola) conțin trilinoleina la niveluri mai ridicate. Uleiul de soia este detectabil la niveluri de peste 4% în uleiul de măsline bazându-se pe uleiul de trilinoleina. Salivaras și McCurdy (1992) au detectat alterarea uleiului de măsline cu ulei de canola, la niveluri de peste 7,5 % folosind analiza modelului de recunoastere a triacylglycerolilor. Bazat pe analiza HPLC a esterilor de ceară cu ajutorul testelor statistice, poate fi identificată alterarea uleiurilor de măsline cu uleiuri extrase cu solvent .În scopul studiului tocoferolilor, carotenoizilor și clorofilei, mai mulți cercetători , Tan(1989) ; Psomiadou și Tsimidou( 1998 ); Bonvehi ș.a., 2000 ) au oferit o serie de instrumente sensibile alternative pentru detectarea uleiurilor vegetale. (Amelio M. ș.a ,1993). Puspitasari-Nienaber ș.a (2002) au constatat că profilul carotenoide/caroten analizate prin HPLC cuplat cu o putere a obiectivului detectorului spectometric termal (TLS) și poate fi folosit pentru a evolua autenticitatea uleiurilor din semințe de in, susan de măsline și germeni de grâu.Concentrațiile din total β-caroten și β-caroten împreună cu raportul între isomerii trans și isomerii cis din caroten sunt indici fiabili pentru screening-ul rapid al uleiurilor. O altă frac ție foarte studiată a uleiurilor și grăsimilor o reprezintă sterolii, care pot fi utilizați pentru detectarea autenticității. Recent, unul dintre instrumentele analitice cele mai utilizate a acestor compuși cuplați este lichidul cromatografic de gaz on-line (LC-GC). Adaosul solventului extras din uleiuri la uleiurile de măsline presate la rece poate fi detectat prin investigația eritrodiolului liber și uvaolului din uleiurile de măsline. Nu este nevoie de pregătirea probei înainte de analiza LCGC, în afară de filtrare. Prin determinarea enantiomerilor filberton cuplați on-line cu HPLC-GC,
48
poate fi detectată alterarea uleiurilor de măsline cu un nivel de 5-10% de uleiuri de alune virgine și rafinate. Conform testului internațional al inelului folosind tyrosol și o componentă necunoscută ca și compuși cheie, s-a descoperit că analiza HPLC este potrivită pentru detectarea adaosului uleiului de alune presat uleiul virgin de măsline la 80% din eșantioanele studiate. . (Andrikopoulos N.K. , 2002 ) 3.6.2 Untul de cacao și cafeauă Untul de cacao este o substanță extrem de apreciată folosită nu numai în produsele alimentare, dar și în industria produselor de patiserie. Directiva 2000/36/EC a Parlamentului European permite utilizarea grăsimilor vegetale în produsele de cacao la un nivel de până la 5%, în afară de untul de cacao. În acest caz, compoziția grăsimilor vegetale permisă pentru suplimentare ar trebui să fie similară cu cea a untului de cacao. Aceste grăsimi vegetale sunt numite ca fiind echivalente cu untul de cacao (CBE). Detectarea și cuantificarea grăsimilor CBE este unul dintre principalele obiective ale testelor de autenticitate ale untului de cacao . (Andrade P.B. ș.a, 1997). Determinarea profilului triacilglicerolilor este un instrument util pentru evaluarea autenticității untului de cacao și pentru estimarea conținutului de CBE în ciocolată. Adaosul de grăsimi străine (cu excepția illipe) la untul de cacao poate fi estimat pe baza determinării triagliceridelor, cum ar fi dipalmitil-oleoil (POP), oleoil-palmitilstearil glicerol (POS) și disteariloleoil glicerol (SOS). Dionisi ș.a (2004) au elaborat un model matematic pentru a evalua cantitatea de CBE adaugată în untul de cacao. Raportul de triacilgliceroli atât din POS/PLP (dipalmitil-linoleil glicerol) și din POP/PLS (palmitil-linoleil-stearil glicerol) discriminează perfect untul de cacao și CBE-eurile până la 5% în ciocolată. Principalii traclgliceroli, POP, SOS,LOO (dioleoil-linoleil glicerol) și PSS (distearil-palmitil glicerol),au fost utilizate în analiza discriminată pentru a separa 20 de eșantioane în funcție de originea lor geografică. Unele grăsimi componete minore,cum ar fi tocoferolii individuali sau izomerii tocotrienoli, pot fi, deasemenea, folosiți ca indicatori la adaosul uleiurilor CBE în untul de cacao.Cu toate acestea, determinarea cantitativă de CBE-uri în amestecuri din untul de cacao veritabil pare a fi limitat.Distribuția și conținutul de aminoacizi în cacaoa brută variază diferit în funcție de origine, și în unele cazuri, pot fi găsite diferențele specifice țării și. (Andrade P.B. , ș.a, 1997). Cafeaua este deasemenea valoroasă și o băutură foarte populară în întreaga lume. Există două specii comerciale importante: Coffea canephora var. robusta și Coffea arabica . Arabica este considerată a fi de calitate mai bună, cu un gust fin, și care este comercializată la un preț mai mare decât robusta. După prăjire, diferențele vizuale între cele două specii dispar, prin urmare una dintre principalele ținte ale testelor de autenticitate este de a indica dacă Robusta a fost adaugată la cafeaua Arabica. HPLC este un bun instrument de analiză a triacylglycerolilor și tocoferolilor sau a acizilor fenolici, care sunt prezenți în cafea. Unele metode HPLC de analiză a acestor compuși sunt prezentate în Tabelul 3.8. (Andrade P.B. ș.a, 1997).
49
Tabelul 3.8 Separarea HPLC a untului de cacaco și a cafelei (Andrade P.B. ș.a, 1997). Componente Eșantioane Separarea HPLC Detectare
50
Ref
Triacylglyceroli
Untul de cacao
Coloana: Microsorb RP C18 și Detector PDA, Supelcosil RP C18 conectate în ESI-MS / MS serie, eluție isocratică, faza mobilă: acetonitril/2propanol/hexan (57/38/5), temperatura ambiantă
1
Coloana: Lichrospher 100-5RP 18, eluție isocratică, faza mobilă: acetonitril / cloroform (40/60)
2
Detector de evaporare a împrăștierii luminii
3
Boabe de cafea
Extract de cafea Soxhlet
Tocoferoli
Extract de cafea Soxhlet
Tocoferoli tocotrienoli
Unt de cacao, CBE
Coloana: Spherisorb ODS2 sau una sau două Hypersil ODS conectate în serie, eluție isocratică sau gradient de eluție, faza mobilă: acetonitril/diclormetan (70/30) sau de la 80/20 până la respectiv 45/54, temperatura: 30 ºC
Detector de evaporare a împrăștierii luminii
Coloana: Microsorb RP-C18 si Supercosil RP-18C, conectate în serie, eluție isocratică, faza mobilă: acetonitril/2propanol/hexan (57/38/5)
Detector PDA, ESI-MS/MS
Coloana: Superspher 100 RP18, eluție isocratică, faza mobilă: acetonitril / acetona (50/50), temperatura: 40-35 ºC Coloana: LiChrospher SI60, eluție isocratică, faza mobilă: hexane / 2-propanol (99/1), temperatura: 40-35 ºC Coloana: LiChrosorb SI60, gradient de eluție, faza mobilă: A: metil tert-butyl eter/hexane (3/100), B: metil tert-butyl eter/hexane (10/100) de la A la B
Detectorul indicelui de refracție
3.7 Autenticitatea brânzei și laptelui
51
4
5
Detector de fluorescenta, 330 nm (excitație 290 nm) Detector de fluorescență, 330 nm (excitație 290 nm)
5
6
Produsele lactate au fost consumate încă de timpuriu. Volumul mare al producției de brânzeturi și consumul de lapte, face din reglementarea autenticității produselor de brânză o problemă importantă. Etichetarea falsă a laptelui în ceea ce privește originea animală, precum și utilizarea laptelui praf reconstituit au fost subiecte de studiu ale autenticității. Originalitatea brânzei depinde de mai mulți factori, cum ar fi procesul de luare a brânzei și laptelui ca materie primă. Ambele depind de originea geografică. Confirmarea originii geografice este, prin urmare, necesară asigurării autenticității unui produs lactat. (traducere). Faza reversă a separării HPLC poate fi utilizată pentru a analiza mai multe fracțiuni de proteine, cum ar fi cazeina și/sau β-globuline sau furosine, care vin de la complexul fructolisin la începutul reacției Maillard în timpul tratamentului termic al laptelui. Aceste substanțe sunt utile pentru determinarea originii laptelui și posibila alterare a produselor din brânză. Metodele de determinare a acestor compuși sunt, în general, bazate pe schimbul cromatografic de ioni utilizând o fază mobilă acidă modificată cu acetonitril. Gradientul de eluție este, în general, aplicat în analiza consumatoare de timp. Mai multe dintre aceste metode HPLC sunt rezumate în Tabelul 3.9. Precipitații la pH4 sau hidrolizarea plasminelor sunt de obicei utilizați pentru izolarea proteinelor din lapte sau brânză. ( traducere) Tabelul 3.9 Separarea HPLC a laptelui și brânzei Compuși Metoda HPLC Coloana: Chrompack P 300 RP cu pre-coloana Chrompack P RP, gradient Lapte de bovine, de eluție, faza mobilă: A: ovine, caprine, β-lactoglobuline 0,01 % de acid amestecul lor în trifuoroacetic, B: 0,1% acid lapte și brânză trifluoroacetic în acetonitril / apa (80/50), A/B de la 64/36 la 40/60, temperatura: 45 ºC Coloana: perfuzie cu faza inversă POROS 1 10 R/glicerol preparat în Amestecuri: β-lactoglobuline laborator, gradient de lapte de vacă, α – lactalbumina, eluție, faze mobile: A: și/sau de oaie, albumina acetonitril/ apa/ acid formic și/sau de capră (5/75/20); B: acetonitril/apa (93/7), A/B de la 75/25 la 65/35, temperatura: 50 ºC Coloana: C4 Phenomenex, gradient de eluție, faza Lapte de vacă în mobilă: A: 0,1% acid brânză de β-lactoglobuline trifluoacetic, B: 0,1% acid bivoliță α – lactalbumina trifluoracetic în acetonitril, Eșantioane
52
(traducere). Detectare
Referințe
Detector PDA, 215 nm
1
Detector PDA, 280 nm
2
Detector UV, 205 nm
3
Lapte de caprine, ovine, bovine în brânza de vacă*, lapte de oaie,capră în brânză
Lapte de ovine, bovine în laptele de caprine
para-κ-cazeina *γ –cazeina și para-κ-cazeina
α-, β-, κ-cazeina
A/B de la 65/35 la 10/90, temperatura ambiantă Coloana: Shodex IEC CM825 (schimb de cationi), pori largi (100 Å), gradient de eluție, faza mobilă: A: 10 mmol acid malonic, 5 mol uree în apă (pH 6 cu NAOH), B: la fel ca la A conținând 0,5 mol l-1 NaCl, A/B de la 100/0la 0/100, temperatura: 30 ºC Coloana: Chrompack P 300 RP cu precoloana Chrompack P RP, gradient de eluție, faza mobilă: A: 0,1% acid trifluoracetic, B: acetonitril/ apa/ acid trifluoracetic (95/5/0.1), A/B de la 71/29 la 0/100 acetonitril/apa/acid trifluoracetic, temperatura: 46 ºC
Detector UV/VIS, 280 nm
Detector pentru lungimea de undă variabilă UV, 280 nm
4,5*
6,7
Analiza cazeinei prin HPLC este o metodă bine standardizată pentru detectarea adaosului de zer în chegat la laptele praf. (UE, 1990). Separarea și cuantificarea fracțiunilor majore de cazeină (γ-, α-, β- si para κ-cazeina) poate fi un instrument util pentru recunoașterea adaosului de lapte străin la lapte sau brânză. Prin analiza α –cazeinei utilizând HPLC, 20% din laptele de bovine poate fi detectat în laptele și branza de ovine. (S. Gocan, 2002). Torre ș.a, (1996) a dezvoltat o metodă HPLC bazată pe analiza de β-lactoglobuline. Metoda pare să fie utilă în detectarea de proteine omologate din zer din amestecuri de lapte de specii diferite (vacă, oaie, capră). Nivelurile ridicate de β-lactoglobuline denaturate, folsine și lactulozapoate indică un plus de lapte încălzit la temperaturi ridicate. Nivelurile ridicate de furosine indică prezența de lapte praf reconstituit.Cuantificarea β-lactoglobulinelor prin HPLC poate fi utilizată pentru determinarea originii laptelui de la diferite specii de animale – de exemplu, poate fi detectat lapte de bovine, ovine și caprine în branză și adaos de lapte de bovine la apa mozarellei de bivoliță. (hplc.chem.shu.edu, 2012).
53
Cap IV Concluzii
Cererile de HPLC pentru determinarea autenticității produselor alimentare au fost discutate aici. A fost demonstrat succesul tehnicii HPLC în analiza complexă a matricei, cum ar fi produsele alimentare. Unul dintre obiectivele în lupta impotriva alterării este acela de a dezvolta metode analitice sensibile detectării prezenței sau determinării lipsei compusului (compușilor) specific care caracterizează materiile prime de alimente de origine vegetală sau animală. Principalul avantaj al autenticiății HPLC cu privire la capacitatea sa este de a separa și detecta compusul (compușii) sau grupuri de compuși care sunt la niveluri scăzute în produsele alimentare de interes. Masa moleculară relativ scăzută a compușilor sau cei cu masă moleculară mare, cum ar fi proteinele, sunt alese ca ținte de analize, și prin utilizarea acestor compuși buni rezultatele pot fi obținute în determinarea autenticității. HPLC este un instrument excelent pentru studierea și descoperirea compușilor minori și specifici menționați mai sus. Aplicarea metodelor chemometrice oferă avantaje suplimentare în evaluarea datelor HPLC.
54
Bibliografie 1. Amelio M. Rizzo R. and Varazini F. ,1993, Separarea esterilor de ceară din uleiurile de măsline prin cromatografia lichidă de înaltă performanță. Journal of the American Oil Chemists ’ Society . 2. Andrade P.B. , Leitao , R. , Seabra , R.M. et Al, 1997, Nivelurile de acid 3,4-dimethoxycinamic ca un instrument de diferențiere a cafelei canefora respectiv.robusta și cafeaua arabica Food Chemistry. 3. Andrade P.B. , Carvalho , A.R.F. , Seabra , R.M. and Ferreira , M.A. , 1998, Un studiu anterior al profilelor fenolice din piureurile de gutui, pere, mere prin detectarea mediului diodei HPLC pentru detectarea și evaluarea autenticității piureului de gutui. Journal of Agricultural and Food Chemistry . 4. Andrikopoulos N.K. 2002 ,Compoziția speciilor de trigliceride din uleiurile vegetale comestibile comune și metodele utilizate pentru identificarea și cuantificarea lor. Food Reviews 5. C. Luca, Al. Duca, Al Crișan, 1983, Chimie Analitică și Analiză instrumentală, Editura București International. 6. H. Nașcu, 2003, Metode și Tehnici de Analiză Instrumentală,Editura U.T.PRES, Cluj-Napoca. 7. S. Gocan,2002, Cromatografie de Înaltă Performanță Partea a II a, Cromatografia de lichide pe coloană, Editura Risoprint, Cluj- Napoca. 8. *Directiva 2000/36/EC a Parlamentului European permite utilizarea grăsimilor vegetale în produsele de cacao la un nivel de până la 5%, în afară de untul de cacao. 9. *Directiva Consiliului 2001/110/EC privind regulile de compoziție și fabricare a mierii. 10*Directiva 2000/36/EC a Parlamentului European privind utilizarea grăsimilor vegetale în produsele de cacao. 11.*Hotărârea UE din 1990 privind brânzeturile. 12.* http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/index.html. 13.* lori.academicdirect.org/books/work_list.php?user=lori&id=207. 14.* http/ wikipedia.ro. .
55
