Cromatografía de exclusión molecular o filtración filtració n en gel: Objetivo: Separación de proteínas por cromatografía en columna según el tamaño y la forma. Fundamento: La cromatografía es una técnica que permite la separación de moléculas diferentes presentes en una misma muestra. El método está basado en la circulación de una fase móvil (que arrastra a la mezcla de compuestos a separar), a través de una fase estacionaria. Dependiendo de la afinidad relativa que por ambas fases tengan los distintos compuestos presentes en la mezcla resultará su separación. La cromatografía de exclusión molecular (a menudo también llamada filtración en gel o de tamiz molecular) es una técnica empleada en la separación de proteínas y ácidos nucleicos. Este tipo de cromatografía se realiza en columnas cilíndricas rellenas con algunos de los geles que se fabrican con este fin y que pueden ser de varios tipos: dextranos con enlaces cruzados (sephadex), poliacrilamida, agarosa, difiriendo cada uno de ellos en el valor de su límite de exclusión, siendo éstos entre 0,7 y 800 kD, 0,2 y 400 kD y hasta 40.000 kD respectivamente. Todos estos geles (fase estacionaria) se hallan constituidos por gránulos de un material esponjoso hidratado, que contiene poros con un diámetro determinado. Cuando se hace pasar una mezcla de moléculas de distinto tamaño, a través de una columna de filtración en gel; aquellas moléculas con un tamaño mayor que el diámetro de los poros de las partículas, sólo podrán moverse en su camino, a través de la fase estacionaria, en el espacio que queda entre las partículas; y por lo tanto, no se verán retrasadas en su descenso. En cambio aquellas moléculas capaces de penetrar en las partículas se verán retrasadas por la fase estacionaria; en mayor medida, cuanto menor sea su tamaño. Por lo tanto, las l as moléculas eluyen en este tipo de cromatografía por orden decreciente de tamaño molecular. Técnica: Se empaqueta el gel dentro de la columna: con la columna cerrada se coloca una pequeña cantidad de un buffer adecuado (pH 7) y luego se añade lentamente la cantidad necesaria del gel previamente hidratado en el mismo buffer, evitando la formación de burbujas de aire dentro de la columna. Colocando un recipiente debajo, se lava la columna y se regula la velocidad de flujo. A continuación, se marcan diferentes tubos en los que se recogerá la muestra eluída y se procede a la elución de la columna. Para ello, se deja que la columna gotee hasta eliminar el buffer de la parte superior del gel y, posteriormente, se siembra la muestra sobre el mismo, previamente teñida con un colorante apropiado, con pipeta Pasteur dejando gotear nuevamente hasta que toda la solución del analito ingrese en el gel. Por encima de la siembra se deja goteando el solvente de elución desde una ampolla de decantación para lograr la corrida de la muestra y evitar la deshidratación de la fase estacionaria.
Se recogen las distintas fracciones del eluído en los tubos numerados, logrando así la separación por tamaño de las moléculas contenidas en la muestra. Debemos recordar que previo a realizar la experiencia con nuestra muestra problema se debe llevar a cabo la calibración de la columna cromatográfica. Esto se hace con una elución que contenga moléculas de peso molecular conocido, coloreadas y con el buffer a utilizar.
a) Gránulo del gel, puntos rosados: partículas pequeñas. Puntos azules: Partículas de mayor tamaño. b) Sembrado de la muestra. c) Y d) Elución de las partículas según su tamaño. d) Diagrama de elusión: cromatograma. Factores que influyen en la separación: - Longitud de la columna. La capacidad de separación de sustancias de diferente tamaño aumenta con la longitud de la columna. - Flujo. La resolución de la separación disminuye al aumentar el flujo del líquido con que son arrastradas las moléculas a lo largo de la columna. Normalmente el flujo oscila entre 2 y 10 cm h-1. - El volumen de la muestra a cromatografiar debe ser pequeño comparado con el volumen total de la columna. Las mejores separaciones se obtienen aplicando volúmenes de muestra iguales o menores al 5% del volumen total. - Empaquetado del gel en la columna. Las propiedades separadoras del gel se alteran profundamente, e incluso desaparecen, cuando un gel no está empaquetado homogéneamente en la columna o se encuentra excesivamente comprimido.
Interpretación de resultados : Puede caracterizarse cuantitativamente el comportamiento de una molécula sobre una columna de gel particular. Si : VX =volumen ocupado por los gránulos del gel. V0 =volumen vacio (volumen de disolvente del espacio que rodea los gránulos). Vt =volumen del lecho total de la columna Vt = V0 + Vx V0 es típicamente 35% de Vt aproximadamente. El volumen de elución de un soluto determinado Ve es el volumen del disolvente necesario para eluir el soluto desde la columna luego de ser sembrado. El volumen vacío de una columna se mide como volumen de elución de un soluto cuya masa molecular es mayor que el límite de exclusión del gel. Por lo tanto, la relación Ve/V0 (volumen de elución relativo) es característica de cada soluto sobre un gel determinado, ya que dicha relación es independiente de la columna utilizada. Una vez recogidas todas las muestras, se mide su absorbancia en el espectrofotómetro, calculando con esto la concentración (ley de Lambert- beer). Luego se realiza el cromatograma, indicando en el eje de las abscisas el volumen de elución y en el eje de las ordenadas la concentración.
Aplicaciones: Determinación del peso molecular de proteínas: al existir una relación lineal entre el volumen de elución relativo de una sustancia y el logaritmo de su masa molecular en un intervalo considerable de masas moleculares, pueden graficarse dichos valores para una determinada columna de filtración con gel empleando macromoléculas de masas moleculares conocidas y así determinar la masa molecular de una sustancia desconocida por su posición en la curva. La precisión de esta técnica depende de la validez de la hipótesis implícita de que las macromoléculas, la conocida y la desconocida, tienen forma idéntica.
Desalado de proteínas: una proteína precipitada, por ejemplo, con sulfato de amonio puede liberarse con facilidad de la sal por disolución del precipitado en un volumen mínimo de buffer adecuado y sembrando esta solución en una columna de gel con un límite de exclusión inferior al de la masa molecular de la proteína. Así, por elución de la columna, la proteína precederá al sulfato de amonio pudiendo así separarlos. Purificación de macromoléculas: esta técnica es útil durante la etapa final de los procesos de purificación de proteínas, por ejemplo. Separación de sustancias de diferentes pesos moleculares.
Bibliografía: Biochemistry Voet-Voet Principios de Bioquimica Lehninger Integrantes: Almeyda Daiana, Boccadelli Barbara, Buzzatto Micaela, Dinni Florencia, Echeverria Carla, Jimenez Elisa, Nabaes Mercedes, Nacir Amira, Peucelle Carla, Ponce Eliana, Rodriguez Catherine, Valdez Joaquín.
