Universidad de Chile Facultad de Ciencias Departamento de Química Química Biológica Lic. Ciencias mención Química
Laboratorio Nº4
“Cinética enzimática”
Integrantes: Álvaro Etcheverry Matías Leal. Profesora: Mª Cecilia Rojas Fecha del Entrega: Jueves 19 de Mayo de 2011
INTRODUCCIÓN
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El objetivo de este laboratorio fue el de poder observar la actividad de una enzima, específicamente la peroxidasa encontrada en los extractos de rábano ( Rhapanus sativus). La observación de la actividad enzimática se realizó cambiando el sustrato natural de esta enzima (fenoles y otros compuestos aromáticos) por otros que cambian de colo colorr al oxid oxidar arse se util utiliz izan ando do H 2O2 como como cata catali lizad zador. or. Se reali realiza zaron ron ensayo ensayoss enzimáticos en presencia de enzima, en ausencia de ella, con enzima previamente desnaturalizada, a diferentes pH y en presencia de un inhibidor. MÉTODOS Se entrega a cada grupo un extracto de rábano preparado con anterioridad en una juguera, este extracto será el complejo enzimático enzimático que se estudiará. estudiará. Para ello se prepara en un tubo de ensayo un medio de incubación de 3mL, este debe contener volúmenes proporcionales proporcionales de citrato de sodio sodio 50 mM a pH 5, guayacol 5 mM, H 2O2 0.3% y 0.2 mL de extracto de rábano, se observa que con el paso del tiempo la solución se torna de transparente a un tono pardo, dicho tiempo debe ser medido. OCH3
OCH 3
O
O
OCH 3 OH
4
+
H 2O 2
p
e
r o
x
i d
a
+
s a
O OCH3
8 H2O
O OCH 3
Figura 1: 1: Reacción de oxidación del guayacol en presencia de peroxidasa para dar el complejo coloreado tetraguayacol. Luego se realizan controles apropiados a fin de demostrar que la reacción observada anteriormente corresponde al efecto de la enzima, para ello se preparan 2 tubos con 3 mL de solución pero con algunas variables respecto al tubo de incubación, en el primero de ellos no se incluye el complejo enzimático y en el segundo se incluye pero luego de ser calentado. Finalmente se diseñan protocolos para estudiar otros efectos sobre la reacción, uno de ellos fue el uso de un inhibidor inhibidor antes de agregar la enzima. También se evalúa el efecto que tiene el pH sobre la velocidad de reacción, se preparan 2 tubos similares al tubo del medio de incubación con la diferencia de que uno de ellos tendrá citrato de sodio 50 mM a pH 4 y el otro citrato de sodio 50 mM a pH 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
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cálculo arroja que se necesitan 0,3 mL de cada uno los compuestos mencionados anteriormente, el resto de volumen se completa con agua desionizada. Además se preparan otros 2 tubos similares similares pero en uno de ellos ellos no se agrega enzima enzima y en otro se calienta la enzima a 100ºC por 5 minutos y en el otro no se agrega agua oxigenada. Tabla I: I: Composición de los Medios de Incubación Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Reactivos/Tubos Con Sin Enzima Enzima Hervida enzima Citrato de Sodio 0,3mL 0,3mL 0,3mL 0.5 M; pH 5 Guayacol 0,3mL 0,3mL 0,3mL 0,05 M H2O2 3% 0,3mL 0,3mL 0,3mL Extracto rábano 0,2mL 0,2mL (Enzima) Agua desionizada
1,9mL
2,1mL
1,9mL
En el tubo del medio de incubación, incubación, se realiza primero el ensayo de tiempo cero, es decir si, se observa si hay reacción instantánea una vez que la enzima ha sido agre agrega gada da,, en este este caso caso este este ensa ensayo yo es nega negati tivo vo,, sin sin emba embarg rgoo una una vez vez que que han han transcurrido alrededor alrededor de 10 segundos comienza comienza a observarse observarse un cambio en el color de la solución pasando de transparente a un rojo ladrillo muy tenue que a medida que avanza el tiempo se vuelve más intenso. Este resultado era de esperarse ya que en este tubo se encuentran todas las condiciones para que la reacción ocurra. El tubo 2 en el cual no hay enzima, no tiene ocurre ningún cambio apreciable ni a los 10 segundos ni pasado 2 minutos ni tampoco pasados 30 minutos. Este resultado indica que la reacción ocurre gracias al poder catalítico del complejo enzimático. En el tubo 3, se agrega enzima pero luego de ser calentada en un baño de agua hirviendo a 100ºC y por 5 minutos, se aprecia que no ocurren cambios ni a los 10 segundos, ni en 2 minutos ni en 30 minutos después de ser agregada la enzima, este fenómeno quiere decir que en el complejo enzimático de rábano la actividad catalítica sólo depende depende de las proteínas proteínas presentes que al ser desnaturadas desnaturadas a altas altas temperaturas temperaturas pierden su poder catalítico. Luego de que se han realizado los controles y se ha comprobado que la actividad catalítica depende del complejo enzimático de rábano y más específicamente de las proteínas presentes en el complejo se realizan un par de pruebas más. Primero en un tubo de ensayo se agregan las mismas cantidades de soluciones que en el tubo control, pero antes de agregar la enzima se agrega un inhibidor, específicamente 0,2 mL de ácido ascórbico 0,05 M. A medida que transcurre el tiempo no se aprecia ningún cambio ni a los 10 segundos, ni a los 2 minutos ni pasada media hora. Esto significa que el inhibidor tiene un efecto total sobre el complejo enzimático y no ocurre ninguna reacción de catálisis ya que este inhibidor atrapa los radicales libres. Finalmente se realiza una prueba variando el pH de la solución de citrato de
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Reactivos/Tubos Citrato de Sodio 0.5 M Guayacol 50 mM H2O2 3% Extracto rábano (Enzima) Agua destilada
Tubo 1; pH 4
Tubo Control; pH 5
Tubo 2; pH 6
0,3 mL
0,3 mL
0,3 mL
0,3 mL 0,3 mL
0,3 mL 0,3 mL
0,3 mL 0,3 mL
0,2 mL
0,2 mL
0,2 mL
1,9 mL
1,9 mL
1,9 mL
En el tubo a pH 4, a los 10 segundos de agregada la enzima se aprecia una coloración anaranjada o café claro, luego a los 20 segundos la solución ya está de un color un poco más intenso a diferencia del pH 5 que tardaba alrededor de 30 segundos en aparecer esta coloración. Luego a los 2 minutos la solución está de un color pardo muy intenso. Por su parte a pH 6, se aprecia que la coloración aparece alrededor de los 20 segundos, luego se aprecia un aumento en la intensidad de esta alrededor de los 45 segundos, finalmente trasncurridos 2 minutos se nota el color pardo intenso típico de esta reacción. Viendo estos 2 ensayos, y comparándolos con el tubo control a pH 5, se puede indicar con claridad que a medida que el pH aumenta la coloración tarda más en aparecer y al contrario a medida que disminuye el pH la coloración se produce en un lapso menor de tiempo. Interpretaciones: Se muestra en las tablas, la aparición de la coloración anaranjada en función del tiempo transcurrido. Se observa de la tabla, que en la medida que aumenta el pH, la aparición del color tarda más en aparecer. Contrariamente a menor pH, el aumento de la oxidación (coloración) es más rápido en tiempo. Final Finalmen mente te,, al agrega agregarr el inhib inhibido idorr de ácido ácido ascórb ascórbic icoo se pudo pudo ver que que la reacción después de 5 minutos no mostró ningún cambio, esto se debe a que este es un inhibidor que atrapa radicales libres, es por esto que la reacción no ocurre con facilidad. CONCLUSIONES •
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Los controles realizados afirman la importancia de la enzima y el H 2O2, ya que si se realiza el ensayo en ausencia de cualquiera de los dos compuestos la reacción no llega a término. La enzima cataliza la reacción, y el H 2O2 es el agente transportador de electrones de la peroxidasa. Se utiliza el control sin enzima para observar que la reacción no ocurre (más bien ocurre a una velocidad demasiado demasiado lenta para ser apreciada), mientras que el control con enzima desnaturalizada sirve para observar que no existen otros elementos en el extracto de rábano que puedan catalizar la reacción.
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La presencia de un inhibidor en el medio altera notoriamente el desarrollo de la reacción, que por lo que se apreció en el laboratorio no transcurrió de forma apreciable.
REFERENCIAS • •
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Guía de trabajos prácticos Bioquímica 2011. ALBERTS, B. “et al”; 2005; Introducción a la Biología Celular; 1° Edición; Editorial Médica Panamericana; México. STRYER, L. “et al”; 2001; Bioquímica; 6° Edición; Editorial Reverté; España.
