FILIPE MATOS PEREIRA LIMA JOÃO MARCOS LENHARDT SILVA LEONARDO VIANA DAS CHAGAS LIMA RAFAEL MARTINS DE PAULA RICARDO MELLEGARI DE OLIVEIRA
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Relatório acadêmico apresentado a disciplina de Bioquímica do curso de Bacharelado em Química Tecnológica / Licenciatura em Química da Universidade Tecnológica Federal do Paraná - UTFPR – para obtenção de nota parcial. Profª. Drª. Adriane Martins de Freitas.
CURITIBA 2010
1 CONSTRUÇÃO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO Preparou-se seis soluções a partir de uma solução padrão de glicose (1 mg/mL), com diferentes diluições como apresentado na tabela t abela 1: Tabela 1 – Concentração soluções padrões de glicose. Tubo Volume de solução Volume de água de Glicose (1 mg/mL) destilada 1 (Branco) 1,5 mL 2 0,1 mL 1,4 mL 3 0,2 mL 1,3 mL 4 0,4 mL 1,1 mL 5 0,8 mL 0,7 mL 6 1,0 mL 0,5 mL Fonte: Autoria própria.
Concentração 0 0,0667 mg/mL 0,133 mg/mL 0,267 mg/mL 0,533 mg/mL 0,667 mg/mL
Após a adição de 1,0 mL de DNS, aquecimento em banho-maria fervente por cinco minutos e adição de 7,5 mL de água destilada, as absorbâncias das soluções 1 a 6 foram medidas em um espectrofotômetro em um comprimento de onda de 540 nm, os valores obtidos foram relacionados na tabela 2: Tabela 2 – Absorbância soluções padrões de glicose. Tubo Concentração Absorbância Branco 1 (Branco) 0 0 2 0,0667 mg/mL 0,01 3 0,133 mg/Ml 0,04 4 0,267 mg/mL 0,13 5 0,533 mg/Ml 0,24 6 0,667 mg/Ml 0,34 Fonte: Autoria própria.
Com os dados da tabela 2 confeccionou-se um gráfico de absorbância pela concentração concentração de glicose (curva de calibração):
Figura 1 – Curva de calibração. Fonte: Autoria Própria.
Fez-se uma regressão linear dos dados obtendo-se uma reta com um coeficiente de correlação R = 0,996 e uma equação da reta: Absorbância = 0,53256 [Glicose] – 0,02556
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2 EFEITO DA VARIAÇ ÃO DO TEMPO DE INCUBAÇÃO Preparou-se 5 soluções de sacarose de acordo com a tabela 3: Tabela 3 – Conteúdo das soluções.. Tubo Tampão Água Acetato destilada (pH = 4,7 / 0,05 mol/L) 1 (Branco) 1,0 mL 1,0 mL 2 1,0 mL 0,8 mL 3 1,0 mL 0,8 mL 4 1,0 mL 0,8 mL 5 1,0 mL 0,8 mL Fonte: Autoria própria.
Sacarose (0,2 mol/L)
Solução enzimática (0,05 mg/mL)
0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL
0,2 mL 0,2 mL 0,2 mL 0,2 mL
A cada solução foi adicionado 0,2 mL de uma solução de enzima invertase (exceto tubo 1) e então levou-se as mesmas para um banho de água a cerca de 30ºC
(exceto tubos 1 e 2). Contou-se o tempo a partir da adição da solução enzimática, o tempo de encubação de cada solução foi relacionado na tabela 4: Tabela 4 – Tempo de Incubação. Tubo Tempo de Incubação 1 (Branco) 0 min 2 0 min 3 1 min 4 3 min 5 8 min Fonte: Autoria própria.
Após o tempo de incubação adicionou-se 1,0 mL de DNS e então os tubos foram levados ao banho fervente por cinco minutos (desnaturação das proteínas e fim da ação catalítica da enzima). Após o banho esperou-se que a soluções esfriassem e adicionouse 6,5 mL de água destilada. As absorbâncias das soluções foram então medidas, os resultados foram apresentados na tabela 5: Tabela 5 – Absorbância Soluções de Sacarose/DNS. Tubo Absorbância Absorbância (Sem o Branco) 1 (Branco) 0,08 0 2 0,09 0,01 3 0,18 0,10 4 0,56 0,48 5 0,87 0,79 Fonte: Autoria própria.
Com os dados da tabela 5 e a equação 1 determinou-se as concentrações de produtos da hidrólise da sacarose após a ação da enzima, os resultados foram relacionados relacionados na tabela 6: Tabela 6 – Concentração Soluções de Sacarose hidrolisada. Tubo Concentração Tempo de (mg/mL) Incubação 1 (Branco) 0 0 2 0,0668 0 3 0,236 1 min 4 0,949 3 min 5 1,53 8 min Fonte: Autoria própria.
De forma idêntica, outra equipe, determinou a concentração de produtos da hidrólise da sacarose catalisada pela invertase, porém com os tempos de incubação indicados na tabela 7: Tabela 7 – Tempo de Incubação II. Tubo Tempo de Incubação 6 2 min 7 6 min 8 10 min Fonte: Autoria própria.
As absorbâncias obtidas foram relacionadas na tabela 8: Tabela 8 – Absorbância Soluções de Sacarose/DNS II. Tubo Absorbância (Sem o Branco) 6 0,21 7 0,85 8 0,86 Fonte: Autoria própria.
Com os dados da tabela 8 e da tabela 5 traçou-se um gráfico de absorbância (proporcional a concentração dos produtos) por tempo:
Figura 2 – Gráfico Absorbância VS Tempo. Fonte: Autoria Própria.
Observando-se o gráfico (figura 2) pode-se afirmar que a partir do tempo de 6 min a absorbância apresenta uma variação muito pequena e como a absorbância é proporcional a concentração dos produtos da hidrólise da sacarose catalisada pela invertase pode-se estender esse raciocínio a variação da concentração de produtos por um intervalo de tempo, logo, como a absorbância começa a ficar constante a partir dos 6 min pode-se afirmar que a reação atingiu um ponto em que quase todo o substrato foi convertido em produto. Todos os dados levam a conclusão geral de que a quantidade de substrato convertido é diretamente proporcional ao tempo de ação da enzima, porém até um certo limite, em qual a partir desse a concentração de produtos permanece quase constante. constante. 3 EXERCÍCIOS 3.1 Descreva a reação enzimática da invertase. Mecanismo da Invertase:
O mecanismo de ação da invertase não é totalmente conhecido, mas estudos com a enzima têm sugerido o envolvimento de um ânion carboxilato e uma histidina residual na atividade catalítica (MARQUEZ, 2007, p. 8)
Reação Simplificada:
3.2 Como se pode determinar a concentração dos produtos da reação catalisada pela invertase? Por meio da curva de calibração preparada, ou ainda por meio da equação de velocidade da enzima, pois com essa equação se pode determinar a variação da concentração concentração dos produtos formados com o decorrer do tempo de reação. 3.3 Qual o KM obtido para a invertase? Qual seu significado? O KM obtido para essa enzima e esse substrato foi de KM = 1,878 mg/mL. Os cálculos foram executados executados com base em Vida, Vi da, 2008. “(...) K M é a concentração de substrato na qual a velocidade da reação é metade da máxima, ela indica com qual eficiência uma enzima seleciona seu substratoe o trasforma em produto.” (PRATT; CORNELY, 2006, p. 197). “Quanto mais baixo o valor de KM, mais eficaz é a enzima em baixas concentraçõesde substrato; (...).” (PRATT; CORNELY, 2006, p. 197).
3.4 Qual o pH ótimo determinado para a invertase? Qual seu significado? O pH ótimo para a invertase é 4,5. Tabela 9 – Enzima / pH ótimo. Enzyme pH Optimum Lipase (pancreas) 8.0 Lipase (stomach) 4.0 - 5.0 Lipase (castor oil) 4.7 Pepsin 1.5 - 1.6 Trypsin 7.8 - 8.7 Urease 7.0 Invertase 4.5 Maltase 6.1 - 6.8 Amylase (pancreas) 6.7 - 7.0 Amylase (malt) 4.6 - 5.2 Catalase 7.0 Fonte: Worthington, Acesso em: 4 out 2010.
Significa que nesse pH a atividade como catalisador esta funcionando no máximo. O pH afeta a atividade enzimática porque altera a “ distribuição de cargas
eléctricas da enzima influenciando a conformação do centro activo e, consequentemente, a sua interacção com o substrato” ( FATORES QUE INFLUENCIAM A ATIVIDADE ENZIMÁTICA, Acesso em: 4 out 2010 ). 4 REFERÊNCIAS MARQUEZ, Líbia D. S.; Produção de Açúcar Invertido pelo Uso de Invertase Imobilizada em Resinas; Resinas; Pós-Graduação Universidade federal de Uberlândia, Uberlândia, 2007; FATORES QUE INFLUENCIAM A ATIVIDADE ENZIMÁTICA. Disponível em:. id=204&Itemid=45>. Acesso em: 4 out 2010. PRATT, C. W.; CORNELY, K., Bioquímica Essencial. Rio de Janeiro: Guanabara Guanabara Koogan, 2006.
VIDA, R. C.dos S.; Utilização do MS Excel para calcular KM e Vmax a partir do gráfico de Lineweaver-Burke. Lineweaver-Burke. Disponível em: . . Acesso em: 4 out 2010. WORTHINGTON. Disponível em: < http://www.worthingtonbiochem.com/introBiochem/effectspH.htm biochem.com/introBiochem/effectspH.html>. l>. Acesso em: 4 out 2010.
