LAPORAN PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI KARAKTERISASI BAKTERI ANAEROB
Dosen Asistensi:
Drs. Agus Supriyanto, M. Kes.
Disusun oleh :
1. Yoestini Marine P.
(081014003)
2. Farida Ayu Rokhimaningrum
(081014006)
3. Desak Nyoman S. S. D.
(081014010)
4. Oksyana S.
(081014011)
5. Syarif Maturindo
(081014115)
PROGRAM STUDI S-1 BIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS AIRLANGGA SURABAYA 2013
ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ANAEROB
I.
TUJUAN
Mengisolasi dan mengarakterisasi bakteri anaerob.
II.
DASAR TEORI
Bakteri anaerob adalah jenis bakteri yang hanya mampu hidup pada kondisi tidak ada oksigen. Bakteri akan mati bila terkena oksigen karena oksigen menjadi toksik bagi bakteri ini. Habitat dari bakteri anaerob berada di dalam saluran pencernaan (Escherichia coli) atau di bawah permukaan tanah ( Paracoccus) (Black 1999). Mikroba anaerob obligat dapat hidup melalui proses fermentasi, respirasi anaerob, atau proses methanogenesis. Mikroba anaerob obligat yang sensitif terhadap oksigen memperoleh energi dan melakukan metabolisme dengan menggunakan beberapa alternatif akseptor elektron untuk respirasi seluler seperti sulfat, nitrat, besi, mangan, merkuri, dan karbon monoksida. Ada beberapa hipotesis mengenai anaerob obligat yang sensitif terhadap oksigen: 1. Oksigen terlarut akan meningkatkan potensial redoks dari larutan. Potensial redoks tinggi menghambat pertumbuhan beberapa bakteri anaerob obligat Sebagai contoh, methanogen tumbuh pada potensial redoks lebih rendah dari -0,3 V. 2. Sulfida merupakan komponen penting dari beberapa enzim. Molekul oksigen mengoksidasi sulfida untuk membentuk disulfida, sehingga menonaktifkan enzim tertentu. Mikrooorganisme ini tidak dapat tumbuh tanpa enzim yang dinonaktifkan tersebut. 3. Terhambatnya pertumbuhan mikroba anaerob obligat akibat kurangnya keseimbangan dalam biosintesis, karena elektron yang akan digunakan untuk biosintesa habis untuk mengurangi oksigen (Kim and Geoffrey, 2008). Pernafasan anaerob sendiri terjadi pada mikroba (bakteri) dapat terlaksana melalui dua cara yaitu: pernafasan anaerob antar molekul dan pernafasan anaerob intra molekul. Pernafasan anaerob antar molekul hapir sama dengan pernafasan aerob,
namun berbeda dalam sumber oksigen yang diperlukan untuk mengoksidasi substrat. Pada anaerob antar molekul oksigen diperoleh dari suatu senyawa bukan udara bebas. Telah dikembangkan berbagai macam metode yang dapat meniadakan oksigen sehingga bakteri anaerob dapat doitumbuhkan dan dibiakkan di laboratorium. Pada hakikatnya metode-metode ini didasarkan pada 2 macam pedekatan, yaitu: 1) Peniadaan oksigen dari medium dan lingkungan tempat hidupnya. 2) Mengusahakan agar tegangan oksidasi dan reduksi (O-R) di dalam system pembiakannya terjaga rendah sehingga biakan terlindungi dari pengaruh toksik oksigen. Pada umumnya teknik penumbuhan dan pembiakan bakteri anaerob menggunankan suatu alat yang disebut “ special anaerobic jar ”.
III.
BAHAN DAN ALAT Alat:
1. Cawan petri 2. Pipet volume 3. Bunsen 4. Anaerobic jar 5. Gas pack 6. Timbangan analitik 7. Vortex Bahan:
1. Tanah gembur 2. Kotoran kuda 3. Kotoran sapi Media:
1. Media TSA 2. Media NA modifikasi, dengan komposisi a. Nutrient agar = 15 gr/l b. Malt ekstrak
= 10 gr/l
c. Yeast ekstrak = 10 gr/l d. Dextrose
IV.
= 10 gr/l
PROSEDUR KERJA
1.
Ambil
secukupnya
sampel
(tanah,
kotoran
sapi,
kotoran
kuda)
dengan
menambahkan 90 ml aquadest. Homogenkan degan vortex kurang lebih 1 menit. 2.
Ambil 1 ml, dan masukkan dalam cawan petri kemudian tambahkan media NA modifikasi dalam cawan petri, kemudian homogenkan, biarkan hingga padat.
3.
Ulangi langkah ke 2 untuk media TSA.
4.
Letakkan cawan petri dalam anaerobic jar dan masukkan gas pack dalam anaerobic jar. Tutup dan amati pertumbuhan dalam 24-48 jam kemudian.
5.
Deskripsikan karakteristik makroskopis koloni bakteri tumbuh pada media.
6.
Deskripsikan karakteristik morfologi koloni bakteri yang tumbuh pada med ia.
V.
HASIL PENGAMATAN
Tabel 5.1 Karakteristik makroskopis dan mikroskopis koloni bakteri anaerob dari sampel tanah No. Sampel
Jenis Media
Karakter Makroskopis
Karakter Mikroskopis
Bentuk
x
Bentuk
Basilkokus
Warna
putih
Warna
Merah
NA
X Elevasi Tepi
X
konvek Gram
-
Bentuk
basilkokus bergerom bol
Warna
merah
Gram
-
Bentuk
basil
Warna
Ungu
Gram
+
Bentuk
basilkokus bergerom bol
Warna
merah
Gram
-
rata
1
TSA
Bentuk
x
Warna
putih
Elevasi
konveks
Tepi
rata
Permukaan, tengah, dasar media
NA
Bentuk
X
Warna
putih
Elevasi
flat
Tepi 2
rata
Permukaan, tengah, dasar media
TSA
Bentuk
x
Warna
putih
Elevasi
flat
Tepi
X
Rata
Tabel 5.2 Karakteristik makroskopis dan mikroskopis koloni bakteri anae rob dari sampel feses kuda. No. Sampel
Jenis Media
Karakter Makroskopis permukaan, tengah, dasar media
NA
Bentuk
punctiform
Warna
krem
Elevasi
konveks
Tepi 1
Bentuk
basil berantai
Warna
merah
Gram
-
Bentuk
Basil berantai
Warna
merah
Gram
-
entire
permukaan, tengah, dasar media
TSA
Karakter Mikroskopis
Bentuk
bulat
Warna
krem
Elevasi
konveks
Tepi
entireundulate
Tidak ada koloni yang tumbuh
Bentuk
Bentuk NA
Warna
Warna
Elevasi Gram Tepi 2
TSA
Bentuk
bulat
Warna
putih
Elevasi
konveks
Tepi
rata
Bentuk
basil
Warna
merah
Gram
-
Tabel 5.3 Karakteristik makroskopis dan mikroskopis koloni bakteri anaerob dari sampel feses sapi. No. Sampel
Jenis Media
Karakter Makroskopis Bentuk
bulat
Bentuk
basil
Warna
putih
Warna
merah
Elevasi
flatkonvek
Gram
-
NA
1
Karakter Mikroskopis
Tepi
rata
Bentuk
bulat
basil-kokus (merah)
Warna
putih
basil (ungu)
Elevasi
flat
TSA
Gram
-/+
Bentuk
basil
Warna
merah
Gram
-
Permukaan, tengah, dasar media bulatBentuk punctifor m
Bentuk
basil berantai
Warna
krem
Warna
merah
Elevasi
Konveks Gram
-
Tepi
undulateentire
Tepi
rata
Permukaan, tengah, dasar media
NA
Bentuk
punctifor m
Warna
krem
Elevasi
konveks
Tepi 2
TSA
entire
VI.
PEMBAHASAN
Bakteri anerob merupakan bakteri yang tidak memerlukan oksigen untuk tumbuh. Bakteri anaerob adalah bakteri yang hanya mampu hidup pada lingkungan tidak ada oksigen karena pada bakteri ini oksigen bersifat toksik (racun) yang dapat membuat bakteri mati (Suriawiria 2005). Pada bakteri anaerob derajat toleransi terhadap oksigen diantara spesiesspesies berbeda-beda. Untuk bakteri anaerob obligat merupakan bakteri yang dapat hidup bila tidak ada oksigen sama sekali karena oksigen bersifat toksik terhadap bakteri tersebut. Anaerob fakultatif masih dapat tumbuh (walaupun sedikit saja) bila terkena udara. Kemampuan bakteri anaerob hidup dalam suasana non-oksik membuat bakteri ini menggunakan akseptor elektron selain oksigen (nitrat atau fumarat) untuk dapat menghasilkan energi dan melangsungkan proses metabolisme (Purwoko 1999). Proses metabolisme ini melibatkan enzim-enzim ekstraseluler yaitu enzim yang dihasilkan dari luar sel bakteri seperti enzim amilase yang menghidrolisis amilum menjadi monomer glukosa. Glukosa yang diperoleh akan digunakan sebagai sumber karbon setelah melalui proses siklus krebs dengan pengonversian glukosa menjadi fumarat (Meryandini et al. 2009). Organisme aerotoleran dapat hidup walaupun terdapat oksigen di sekitarnya, tetapi mereka tetap anaerobik karena mereka tidak menggunakan oksigen sebagai terminal electron acceptor (akseptor elektron terminal). Sedangkan Mikroaerofil merupakan organisme yang dapat menggunakan oksigen, tetapi hanya pada konsentrasi yang rendah (rentang mikromolar rendah), pertumbuhannya dihambat oleh level oksigen yang normal (sekitar 200 mikromolar).
Sampel Tanah
Tanah merupakan campuran yang terdiri dari bahan organik, anorganik, air dan udara yang semuanya tercampur jadi satu, sehingga sulit dipisahkan antara satu dengan yang lainnya. Mikroorganisme pada tanah memiliki peranan penting, baik dibidang ilmu tanah, ilmu pertanian dan bidang-bidang lain dari mikroba tanah adalah dalam siklus mineral, yang terdiri dari: siklus nitrogen, siklus fosfor, siklus sulfur dan siklus karbon. Bakteri anaerob tidak memerlukan oksigen karena oksigen akan bersifat toxic terhadap bakteri anaerob. Kelompok bakteri ini termasuk jenis yang sangat kuno yang hidup di dalam
agregat tanah. Bakteri anaerob menyebabkan dapat menghasilkan senyawa beracun yang dapat membatasi pertumbuhan akar dan predisposisi penyakit tanaman ke akar. Isolasi bakteri anaerob pada sampel tanah yang diambil pada kedalaman >1 meter dan ditanam pada media TSA dan NA modifikasi dengan pengulangan duplo memiliki karakteristik yang berbeda untuk makroskopis media NA modifikasi 1, yaitu warna putih, elevasi konveks, tepi rata dengan karakteristik mikroskopis berbentuk basil-kokus, warna merah dan Gram negatif. Pada media NA modifikasi 2 warna putih, elevasi flat , tepi rata dengan karakteristik mikroskopis berbentuk basil, warna ungu dan Gram positif. Sedangkan pada media TSA 1 dan TSA 2 memiliki karakteristik yang sama yaitu makroskopis warna putih, elevasi flat , tepi rata dan mikroskopis berbentuk basil-kokus bergerombol, warna merah dan Gram negatif. Hasil ini menunjukkan bahwa spesies bakteri anaerobik yang diisolasi dari tanah kemungkinan bukanlah Clostridium perfringens (atau C. welchii) dan Clostridium botulinum yang mempunyai karakteristik Gram positif, berbentuk batang, termasuk bakteri anaerobik yang membentuk subterminal endospora yang berbentuk oval yang biasa terdapat pada tanah. Hal ini dapat terjadi karena terdapat perbedaan karakteristik yaitu bakteri yang telah diisolasi dari tanah kebanyakan mempunyai Gram negatif dengan bentuk batang-kokus sedangkan kedua spesies yang umum berada di tanah yaitu C. perfringens dan C. botulinum mempunyai bentuk batang gram positif .
Sampel Feses Kuda
Pada praktikum kali ini, salah satu sampel yang digunakan untuk mengisolasi bakteri anaerob adalah faeces kuda. Untuk menumbuhkan bakteri anaerob yang diisolasi pada praktikum kali ini digunakan media NA modifikasi dan media TSA. Media NA merupakan media nutritif bagi segala jenis bakteri. Media TSA (Trypticase Soy Agar ) merupakan media pertumbuhan bakteri. Sama seperti media NA, media TSA juga media yang menyediakan cukup nutrisi yang memungkinkan untuk berbagai macam mikroorganisme tumbuh. Umumnya bakteri anaerob yang banyak terdapat pada faeces kuda adalah bakteri Clostridium tetani. Bakteri C. tetani merupakan bakteri anaerob obligat. Bakteri ini merupakan bakteri penyebab penyakit tetanus. Tetanus yang juga dikenal dengan lockjaw, merupakan penyakit yang disebakan oleh tetanospasmin, yaitu sejenis neurotoksin yang
diproduksi oleh C. tetani yang menginfeksi sistem urat saraf dan otot sehingga saraf dan otot menjadi kaku (rigid). Pengerjaan praktikum isolasi bakteri anaerob ini dilakukan secara duplo. Setelah kedua sampel didiamkan pada anaerobik jar, pada sampel pertama menunjukkan pertumbuhan bakteri dengan bentuk puntiform, berwarna krem, elevasi konveks, dan dan tepi entire untuk media NA modifikasi. Sedangkan pada media TSA karakter makroskopis yang teramati adalah bentuk bulat, dengan warna krem, elevasi juga konveks, dan tepi entire-undulate. Bakteri yang tumbuh terdapat pada daerah permukaan, tengah, dan dasar media. Pada karakter mikroskopisnya, baik pada media NA modifikasi dan TSA sama-sama menunjukkan bakteri dengan bentuk batang berantai dan bakteri Gram negatif. Hasil yang berbeda ditunjukkan pada sampel kedua untuk media NA modifikasi dimana pada media ini sama sekali tidak terdapat adanya koloni bakteri yang tumbuh. Hal ini mungkin disebabkan karena adanya kesalahan pada proses penanaman dimana pada proses penanaman, ujung volume pipet harus menyentuh dasar dari cawan petri agar tidak ada celah udara. Pada media TSA, koloni bakteri yang tumbuh memiliki bentuk bulat, dengan warna putih, elevasi konveks, dan tepi rata. Dan pada pewarnaan Gram, terlihat koloni bakteri berbentuk batang dengan Gram negatif. Berdasarkan karakteristik makroskopik dan mikroskopik koloni bakteri yang berhasil diisolasi pada kedua sampel, tidak dapat dipastiskan bahwa bakteri yang dapat diisolasi merupakan bakteri C.tetani dikarenakan adanya perbedaan ciri-ciri koloni antara bakteri yang berhasil diisolasi dengan C. tetani memiliki ciri-ciri koloni bakteri berwarna putih seperti susu dan dapat terdapat baik di permukaan, tengah, dan dasar media. Dan untuk karakteristik mikroskopiknya, C. tetani berbentuk rod-shape (batang) seperti drum stick , merupakan bakteri Gram positif, dan membentuk endospora (spora terminal) sedangkan pada pengamatan yang dilakukan dibawah mikroskop tidak ditemukan adanya spora yang merupakan ciri khas dari bakteri genus Clostridium. Spora yang dibentuk oleh C. tetani ini sangat resisten terhadap panas dan antiseptik. Ia dapat tahan walaupun telah 0
diautoklaf (121 C, 10-15 menit) dan juga resisten terhadap fenol dan agen kimia lainnya. Bentuk sporanya ini dapat bertahan bertahun-tahun.
C. tetani menghasilkan dua buah eksotoksin, yaitu tetanolysin dan tetanospasmin. Fungsi dari tetanoysin tidak diketahui dengan pasti, namun juga dapat memengaruhi tetanus. Tetanospasmin merupakan toksin yang cukup kuat. Pada kotoran kuda umumnya hanya terdapat satu jenis bakteri anaerob, berbeda dengan kotoran sapi yang kemungkinan dapat ditemukan tiga jenis bakteri anaerob (Ruminococcus, Clostridium, dan Methanogenesis). Hal tersebut dapat dikarenakan saluran pencernaan pada ternak kuda tidak seefektif sapi karena proses pencernaan selulosanya terjadi satu kali pada sekum, akibatnya tekstur pada feses kuda menjadi lebih kasar dan berserat. Akibat dari pencernaan selulosa yang terjadi hanya satu kali, flora normal pada kuda lebih sedikit daripada flora normal pada sapi. Akan tetapi, substrat dalam kotoran kuda mengandung bakteri pembentuk metan yang juga terdapat dalam tubuh hewan seperti kerbau, sapi, rusa, domba, kambing dan hewan lainnya. Dengan adanya bakteri pembentuk metan, kotoran kuda juga dapat digunakan sebagai substrat untuk memproduksi biogas. Kotoran kuda mempunyai kandungan karbon dan nitrogen yang lebih tinggi daripada kandungan karbon dan nitrogen pada kotoran sapi yang merupakan sumber energi bagi mikroorganisme.
Sampel Feses Sapi
Isolasi bakteri anaerob dari feses sapi dilakukan dengan metode kualitatif, artinya sampel yang diisolasi tidak diperhitungkan massanya. Pengamatan bakteri yang tumbuh dilakukan secara makroskopis dan mikroskopis. Pada kedua sampel feses sapi yang diisolasi terdapat perbedaan yang nyata pada media TSA dan NA. Media TSA (Trypticase Soy Agar ) dan NA ( Nutrient Agar ) merupakan media umum yang dapat ditumbuhi oleh berbagai macam mikroorganisme. Perbedaannya adalah kemampuan sebagai tempat tumbuh dimana pada media TSA merupakan media semi-umum yang ditumbuhi lebih sedikit jumlah mikroorganisme dibandingkan dengan media NA. Pada TSA sampel 1 diperoleh 2 jenis bakteri, sedangkan pada NA sampel 1 diperoleh 1 jenis bakteri. Begitu pula pada TSA sampel 2 diperoleh 1 jenis bakteri, sedangkan pada NA sampel 2 juga diperoleh 1 jenis bakteri. Walaupun jenis bakteri yang tumbuh pada TSA lebih banyak daripada NA, akan tetapi pertumbuhan cepat terjadi pada media NA. Bakteri yang tumbuh pada media NA lebih homogen.
Karakterisasi bakteri yang tumbuh cenderung berbentuk basil dan kokus (walaupun ada yang berbentuk kokobasil), mayoritas bersifat Gram negatif (dapat dilihat pada tabel hasil pengamatan). Dari penelitian yang banyak dilakukan sebelumnya, bakteri yang diisolasi dari feses sapi tergolong dalam kelas Clostridia, yaitu Ruminococcus dan Clostridium perfringens. Ciri khas bakteri tersebut adalah Gram positif, dapat berbentuk coccus maupun bacil , dan khusus Clostridium memiliki endospora. Boleh jadi bakteri yang didapat dari isolasi sampel feses sapi pada praktikum ini tergolong dalam genus Clostridium karena ada isolat yang secara mikroskopis bersifat Gram positif dan berbentuk basil, akan tetapi tidak tampak adanya endospore pada sel bakteri tersebut.
VII.
KESIMPULAN
1.
Bakteri anaerob adalah bakteri yang hanya mampu hidup pada lingkungan tidak ada oksigen karena pada bakteri ini oksigen bersifat toksik (racun) yang dapat membuat bakteri mati.
2.
Pada sampel tanah spesies bakteri anaerobik yang diisolasi kemungkinan bukanlah Clostridium perfringens (atau C. welchii) dan Clostridium botulinum. Hal ini dapat terjadi karena terdapat perbedaan karakteristik yaitu bakteri yang telah diisolasi dari tanah kebanyakan mempunyai Gram negatif dengan bentuk batang-kokus sedangkan kedua spesies yang umum berada di tanah yaitu C. perfringens dan C. botulinum mempunyai bentuk batang gram positif .
3.
Pada sampel feses kuda berdasarkan karakteristik makroskopik dan mikroskopik, tidak dapat dipastiskan bahwa bakteri yang diisolasi merupakan bakteri C.tetani dikarenakan adanya perbedaan ciri-ciri koloni antara bakteri yang berhasil diisolasi dengan C. tetani memiliki ciri-ciri koloni bakteri berwarna putih seperti susu dan dapat terdapat baik di permukaan, tengah, dan dasar media.
4.
Pada sampel feses sapi karakterisasi bakteri yang tumbuh cenderung berbentuk basil dan kokus (walaupun ada yang berbentuk kokobasil), mayoritas bersifat Gram negatif. Boleh jadi bakteri yang didapat dari isolasi sampel feses sapi pada praktikum ini tergolong dalam genus Clostridium karena ada isolat yang secara mikroskopis bersifat Gram positif dan berbentuk basil, akan tetapi tidak tampak ad anya endospore pada sel bakteri tersebut.
DAFTAR PUSTAKA
Black J,G. 1999. Microbiology: Principles and Exp lorations. New Jersey: Prentice Hall. Darmanto, A.; Soeparman, S.; dan Widhiyanuriawan, D. 2012. Pengaruh Kondisi Temperatur Mesophilic (35ºC) Dan Thermophilic (55ºC) Anaerob Digester Kotoran Kuda Terhadap Produksi Biogas. Jurnal Rekayasa Mesin Vol.3, No. 2 Tahun 2012: 317-326 Kim, Byung Hong and Geoffrey Michael Gadd. 2008. Bacteri al Ph ysiol ogy and . Cambridge University Press. Cambridge. UK. M etabolism Meryandini Anja et al . 2009. Isolasi bakteri dan karakterisasi enzimnya. Makara Sains 2009; 13: 33-38. Ni’matuzahroh, dkk. Petunjuk Praktikum Bakteriologi. Surabaya: Airlangga University Press. Purwoko T. 2009. Fisiologi Mikroba. Jakarta : Bumi Aksara. Suriawiria U. 2005. Mikrobiologi Dasar . Jakarta : Papas Sinar Sinanti. “Clostridium tetani” diakses dari http://en.wikipedia.org/wiki/Clostridium_tetani pada tanggal 25 Mei 2013 “Clostridium botulinum” diakses dari http://en.wikipedia.org/wiki/Clostridium_botulinum pada tanggal 25 Mei 2013. “Clostridium perfringens” diakses dari http://en.wikipedia.org/wiki/Clostridium_perfringens pada tanggal 25 Mei 2013. “Organisme Anerobik” diakses dari http://id.wikipedia.org/wiki/Organisme_anaerobik tanggal 25 Mei 2013 “Tetanus” diakses dari http://id.wikipedia.org/wiki/Tetanus tanggal 25 Mei 2013.
“Tinjauan pustaka” diakses dari http://repository.ipb.ac.id/bitstream/handle/123456789/51144/D11lpa_BAB%20II%2 0Tinjauan%20Pustaka.pdf?sequence=6 tanggal 25 Mei 2013. “Trypticase Soy Agar” diakses dari http://en.wikipedia.org/wiki/Trypticase_soy_agar tanggal 25 Mei 2013.
LAMPIRAN
Gambar
Keterangan
Gambar 1. Anaerobic Jar
Gambar 2. Gas pack
Gambar 3. Pengambilan sampel feses sapi ke dalam 90 ml aquades, kemudian vortex dan diamkan hingga mengendap
Gambar 4. Pengambilan suspensi sebanyak 1ml
Gambar 5. Proses pipetting ke dalam cawan petri steril (ujung pipet dikenai dasar cawan petri)
Gambar 6. Penuangan media (NA atau TSA) ke dalam cawan petri
Gambar 7. Homogenisasi manual selanjutnya media didiamkan hingga padat
Gambar 8. Cawan petri diletakkan dengan posisi terbalik dalam Anaerobic Jar
Inkubasi selama 72 jam dalam suhu ruang, kemudian identifikasi dan karakterisasi secara makroskopis dan mikroskopis
