Penentuan Nilai IC 50 Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH ABSTRAK
Paper ini merupakan hasil studi literatur yang bertujuan untuk mengetahui cara perhitungan aktivitas antioksidan dengan parameter IC50. Sebagai studi kasus kasus utama adalah artikel yang dipublikasikan oleh Abdul Rohman Rohman dan Sugeng Riyanto 2005, pada Jurnal Jurnal yang dipublikas dipublikasikan ikan di Majalah Farmasi Farmasi Indonesia Indonesia dengan dengan judul “Daya antioksida antioksidan n ekstrak etanol etanol Daun Kemuning Kemuning ( Murraya paniculata (L) Jack) secara in vitr vitro. o. Penentuan Nilai IC50 pada Aktivitas Antioksidan ini bertujuan untuk mengetahui cara menentukan menentukan nilai IC50 serta hubunganya dengan aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode DPPH ( 2,2 diphenyl 1-picrylhydrazil). Semakin Semakin besar besar nilai nilai IC50 makan makan semakin kecil aktivitas aktivitas antioksidan antioksidannya. nya.
DEFINISI IC50
: Konsentrasi dari antioksidan antioksidan yang dapat dapat meredam atau menghambat menghambat 50% radikal bebas. Antiok Antioksid sidan an : Seny Senyawa awa yang yang mamp mampu u mena menangk ngkal al rad radika ikall bebas bebas Radikal Radikal Bebas : Molekul-mol Molekul-molekul ekul yang yang tidak stabil karena karena muatan muatan elektronny elektronnyaa tidak berpasangan In Viv Vivo o : Bahasa hasa lati latin n ya yang arti artiny nyaa da dalam lam org orgaanisme isme hidu hidup p, men mengac gacu pa pada pene peneli liti tiaan yang dilakukan dilakukan menggunakan menggunakan subyek subyek manusia atau atau hewan suatu senyawa senyawa sebagai antioksidan atau anti radikal bebas BHT : Butilhid lhidrroksito itolue luena, Sumber an antioksidan al alami da dapat be berupa bu buah da dan sa sayur juga berupa antioksidan sintetik sintetik Larutan Blanko: Blanko: Larutan yang yang tidak berisi analit. analit. Biasanya digunakan digunakan untuk tujuan tujuan kalibrasi sebagai larutan pembanding pembanding dalam analisis fotometri fotometri
PENDAHULUAN Latar belakang Perubaha Perubahan n pola konsumsi konsumsi makana makanan n sebagai sebagai dampak dampak dari kemajua kemajuan n sains dan teknol teknolog ogii menyeba menyebabka bkan n semak semakin in mening meningkat katnya nya masy masyara arakat kat yang yang mender menderita ita penyak penyakit it degen degenera eratif tif sepert sepertii jantung jantung koron koroner, er, hipert hipertens ensi, i, kanker kanker,, diabete diabetess dan ateros ateroskle kleros rosis. is. Terjadinya penyakit tersebut didasari oleh proses biokimiawi dalam tubuh yang melibatkan peranan radikal radikal bebas. Radikal bebas bebas merupakan sekelompok sekelompok zat kimia yang sangat sangat reaktif karen karenaa memili memiliki ki satu satu atau atau lebih lebih elektr elektron on yang yang tida tidak k berpa berpasan sanga gan n luarny luarnya. a. Elekt Elektron ron tida tidak k berpasa berpasangan ngan tersebut tersebut menyebab menyebabkan kan instabilita instabilitass dan bersifat reaktif reaktif sehingga sehingga menyebab menyebabkan kan kerusakan sel,gangguan sel,gangguan fungsi sel, sel, bahkan kematian kematian sel. Molekul utama di dalam tubuh tubuh yang dirusak oleh radikal bebas dan dan produk oksidatifnya adalah adalah DNA, lemak, dan protein. Radikal Radikal bebas bebas yang dihasi dihasilkan lkan oleh oleh metabolisme metabolisme aerob aerobik, ik, radiasi radiasi dan kimiawi kimiawi cender cenderung ung menyebab menyebabkan kan peroksidas peroksidasii lipid in vivo, shingga shingga diperlukan diperlukan suatu mekanisme perlindungan antioksid antioksidan an untuk untuk menang menangkal kal radikal radikal bebas. bebas. Untuk mengetah mengetahui ui suatu suatu konsentr konsentrasi asi antioksid antioksidan an dalam hal ini digunakan parameter IC 50. Oleh karena itu kami ingin mengkaji perhitungan untuk menentukan nilai IC 50 yang diperoleh diperoleh dari uji aktivitas antioksidan antioksidan serta korelasinya. korelasinya.
Tujuan Untuk mengetahui cara menentukan nilai IC 50 serta hubunganya dengan aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode DPPH. Tinjaun Pustaka Menurut Tri Rahmawati berdasarkan studi literarur, antioksidan adalah senyawa yang mampu menangkal atau merendam dampak negatif oksidan dalam tubuh. Antioksidan bekerja dengan cara mendonorkan satu elektron kepada senyawa yang bersifat oksidan sehingga aktivitas senyawa oksidan tersebut bisa dihambat. Antioksidan sangat penting karena berkaitan dengan fungsinya sistem imunisasi tubuh. Kondisi tersebut terutama untuk menjaga intergritas dan berfungsinya membran lipid, Serta untuk melindungi sel-sel badan terhadap kerusakan yang diakibatkan oleh radikal bebas. (Damayanthi dkk, 2010)
IC50 merupakan konsentrasi dari antioksidan yang dapat meredam atau menghambat 50% radikal bebas. Antioksidan kuat memiliki senyawa alfatokoferol dengan nilai IC50 atau setara dengan angka 5,1 ppm.Antioksidan sedang memilki nilai senyawa IC 50 sebesar 48,6 ppm. . (Damayanthi dkk, 2010) Pengukuran aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan beberapa metode diantaranya CUPRAC, DPPH, dan FRAP. (Widyastuti, 2010) Metode CUPRAC menggunakan bis(neokuproin) tembaga(II) (Cu(Nc) 22+) sebagai pereaksi kromogenik. Pereaksi Cu(Nc) 22+yang berwarna biru akan mengalami reduksi menjadi Cu(Nc)2+ yang berwarna kuning dengan reaksi: n Cu(Nc)22+ + AR(OH)n
n Cu(Nc)2+ + AR(=O)n + n H+ (Widyastuti, 2010)
Metode DPPH menggunakan 2,2difenil-1-pikrilhidrazil sebagai sumber radikal bebas. Prinsipnya adalah reaksi penangkapan hidrogen oleh DPPH dari zat antioksidan dengan reaksi sebagai berikut:
(Widyastuti, 2010)
Metode FRAP (Benzie & Strain 1996) menggunakan Fe(TPTZ) 23+ kompleks besiligan 2,4,6-tripiridil-triazin sebagai pereaksi. Kompleks biru Fe(TPTZ) 23+ akan berfungsi sebagai zat pengoksidasi dan akan mengalami reduksi menjadi Fe(TPTZ) 22+ yang berwarna kuning dengan reaksi berikut: Fe(TPTZ)2 3+ + AROH Fe(TPTZ)22+ + H+ + AR=O (Widyastuti, 2010) EKSPERIMEN Prosedur Untuk Mendapatkan Data Dari setiap kelompok terdapat empat anggota yang masing-masing sudah dibagi tugas Untuk mencari artikel atau jurnal yang berhubungan dengan tema paper ini baik melalui media elektronik ataupun media cetak.
Cara Mengolah Data Pertama kami melakukan browsing untuk mencari data mentah. Data mentah untuk menentukan nilai IC50 adalah persen inbihisi dan konsentrasi sampel. Setelah itu kami membuat hubungan antara inhibisi dan konsentrasi sampel melalui grafik dimana inhibisi terletak pada sumbu Y dan konsentrasi sampel pada sumbu X. Melalui microsoft excel kami mencari persamaan regresi linear y = a(x) + b. Setelah kami mendapatkan persamaan variabel Y merupakan sebuah tetapan yang bernilai 50, dan X adalah nilai IC 50. Alat Untuk Mendapatkan Data Alat untuk mendapatkan data adalah laptop dan internet sebagai media utama untuk browsing mendapatkan data mentah dan program excel untuk membuat grafik hubungan antara persen inhibisi dan konsentrasi sampel untuk menentukan nilai IC 50.
HASIL DAN PEMBAHASAN Mekanisme kerja antioksidan Mekanisme kerja antioksidan memiliki dua fungsi. Fungsi pertama merupakan fungsi utama dari antioksidan yaitu sebagai pemberi atom hidrogen. Antioksidan (AH) yang mempunyai fungsi utama tersebut sering disebut sebagai antioksidan primer. Senyawa ini dapat memberikan atom hidrogen secara cepat ke radikal lipida (R*, ROO*) atau mengubahnya ke bentuk lebih stabil, sementara turunan radikal antioksidan (A*) tersebut memiliki keadaan lebih stabil dibanding radikal lipida. Fungsi kedua merupakan fungsi sekunder antioksidan, yaitu memperlambat laju autooksidasi dengan berbagai mekanisme diluar mekanisme pemutusan rantai autooksidasi dengan pengubahan radikal lipida ke bentuk lebih stabil (Gordon,1990). Penambahan antioksidan (AH) primer dengan konsentrasi rendah pada lipida dapat menghambat atau mencegah reaksi autooksidasi lemak dan minyak. Penambahan tersebut dapat menghalangi reaksi oksidasi pada tahap inisiasi maupun propagasi. Radikal-radikal antioksidan (A*) yang terbentuk pada reaksi tersebut relatif stabil dan tidak mempunyai cukup energi untuk dapat bereaksi dengan molekul lipida lain membentuk radikal lipida baru (Gordon, 1990). Inisiasi :R* + AH RH + A* Propagasi : ROO* + AH ROOH + A* Uji Aktivitas Antioksidan dengan metode DPPH Menurut Falisca Amelinda berdasarkan studi literatur IC50 bisa digunakan sebagai parameter bukan hanya untuk antioksidan saja tapi untuk antikanker, antiplasmodium, antitoksikitas dan lain sebagainya. Tetapi dalam hal ini kami membahas secara spesifik IC 50 sebagai parameter antioksidan. Ada beberapa metode untuk menguji aktivitas oksidan antara lain yaitu metode DPPH (2,2-difenil-1- pikrilhidrazil), FRAP (ferric reducing antioxidant power) dan CUPRAC (cupric ion reducing antioxidant capacity dan linoeat – tiosianat. Dalam paper ini uji aktivitas antioksidan difokuskan menggunakan metode DPPH (2,2-difenil-1pikrilhidrazil). Metode uji DPPH merupakan metode pengujian aktivitas antioksidan yang paling cocok bagi komponen antioksidan yang bersifat polar, karena kristal DPPH hanya dapat larut dan memberikan absorbansi maksimum pada pelarut etanol ataupun metanol seperti yang dikemukakan oleh Amrun dan Umiyah (2005). Secara umum berikut merupakan uji aktivitas antioksidan yang menggunakan metode DPPH. Uji aktivitas antioksidan ekstrak suatu sampel dilakukan dengan metode DPPH (Blois 1985 dalam Hanani et al., 2005).
Ekstrak kasar sampel dilarutkan dalam metanol. hingga diperoleh konsentrasi yang bervariasi dinyatakan dalam ppm. Antioksidan sintetik BHT (butilhidroksitoluena) digunakan sebagai pembanding dan kontrol positif dilarutkan dalam pelarut metanol dengan konsentrasi tertentu. Larutan DPPH dibuat dengan melarutkan kristal DPPH dalam pelarut metanol. dengan konsentrasi tertentu juga. Larutan ekstrak dan larutan antioksidan BHT masingmasing diambil beberapa ml dan direaksikan larutan DPPH dalam tabung reaksi yang berbeda. Reaksi berlangsung pada suhu tertentu selama beberapa menit kemudian diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV VIS pada panjang gelombang 515-517 nm. Absorbansi larutan blanko diukur untuk melakukan perhitungan persen inhibisi. Larutan blanko dibuat dengan mereaksikan pelarut metanol dengan larutan DPPH dalam tabung reaksi. Aktivitas antioksidan dinyatakan dalam persen inhibisi untuk mengetahui nilai IC 50. Perhitungan Untuk Menentukan IC 50 Menurut Mifta Fauziah berdasarkan studi literatur untuk menentukan IC50, diperlukan persamaan kurva standar dari % inhibisi sebagai sumbu y dan konsentrasi fraksi antioksidan sebagai sumbu x. IC50 dihitung dengan cara memasukkan nilai 50% ke dalam persamaan kurva standar sebagai sumbu y kemudian dihitung nilai x sebagai konsentrasi IC50. Semakin kecil nilai IC50 menunjukkan semakin tinggi aktivitas antioksidannya (Molyneux 2004). Dalam hal ini diharapkan bahwa radikal bebas dapat ditangkap oleh senyawa antioksidan hanya dengan konsentrasi yang kecil. Persen inhibisi dan IC 50 Persen inhibisi adalah perbandingan antara selisih dari absorbansi blanko dan absorbansi sampel dengan absorbansi blanko. Persen inhibisi digunakan untuk menentukan persentase hambatan dari suatu bahan yang dilakukan terhadap senyawa radikal bebas. Persen inhibisi dihitung dengan rumus berikut: Pi = [(Ab-As)/Ab] x 100% Keterangan: Pi : Persen inhibisi Ab : Absorbansi blanko As : Absorbansi sampel
Gambar. 1 (romansyah, 2011)
Berikut ini % inhibisi contoh sampel karang lunak Sarcophyton sp. alami ulangan 1 dengan pelarut metanol p.a. 200 ppm. % inhibisi = [(1,947-1,597) / 1,947] x 100% = [0,35 / 1,947] x 100% = 0,17976 x 100% = 17, 97% Nilai persen inhibisi yang telah dihitung dari setiap konsentrasi (200-800 ppm) selanjutnya digunakan untuk perhitungan IC 50. IC 50 atau inhibitor Concentration 50% adalah nilai konsentrasi suatu bahan untuk menghambat aktivitas DPPH sebesar 50%. Nilai konsentrasi dari larutan yang telah diencerkan dari ekstrak dan persen inhibisi diplotkan masing-masing pada sumbu x dan y. Kemudian nilai IC50 dihitung dengan regresi linear y = a(x) + b, dengan menyatakan nilai y sebesar 50 dan nilai x sebagai IC 50. Contoh: Tabel Pengamatan 1 Konsentrasi Sampel
Inhibisi
200
17,98
400
19,16
600
21,16
800
25,42
Grafik Persamaan Regresi Untuk menentukan nilai IC 50
inhibisi 30 25
y = 0,0122x + 14,85 R² = 0,9228
20
inhibisi
15
Linear (inhibisi)
10
Linear (inhibisi)
5 0 0
500
1000
Y =0,0122x + 14,85 50 = 0,0122x + 14,85 X
=2881, 14 X= Nilai IC50 IC50= 2881,14 ppm
KESIMPULAN DAFTAR PUSTAKA Amrun, M.H., & Umiyah. Pengujian Antiradikal Bebas Difenilpikril Hidrazil (DPPH) Ekstrak Buah Kenitu (Chrysophyllum Cainito L.) Dari Daerah Sekitar Jember . 2005. J. Ilmu Dasar , 6(2):110-114. Damayanthi, Evi, Lilik Kustiyah, Mahani Khalid, Henry Farizal, Aktivitas Antioksidan Bekatul Lebih Tinggi Dari Pada Jus Tomat Dan Penurunan Aktivitas Antioksidan Serum Setelah Intervensi Minuman Kaya Antioksidan, 2010 , 5(3), 205-210. Hanani, E., A. Mun’im, & R. Sekarini. 2005. Identifikasi Senyawa Antioksidan Dalam Spons Callyspongia Sp. Dari Kepulauan Seribu. Majalah Ilmu Kefarmasian , 2(3): 127-133. Widyastuti, Niken. Pengukuran Aktivitas Antioksidan Dengan Metode CUPRAC, DPPH, Dan FRAP Serta Korelasinnya Dengan Fenol Dan Flavonold Pada Enam Tanaman, 2010 .