Angka Lempeng Total

MENGHITUNG MIKROORGANISME DENGAN TEKNIK ANGKA LEMPENG

VERONICA RINI 2011210255 Kelas B

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS UNIVERSITAS PANCASILA JAKARTA 8 OKTOBER 2012

BAB I PENDAHULUAN Latar belakang Jumlah kematian sel pada akhirnya akan melampaui jumlah sel baru yang terbentuk dan populasi sel memasuki fase kematian atau fase penurunan. Fase ini berlanjut samapi  populasi menyusut menjadi fraksi kecil atau seluruh populasi mati. Beberapa spesies melalui seluruh rangkaian fase hanya dalam beberapa hari, tetapi spesies yang lain masih menyisakan sel yang dapat bertahan dalam jumlah yang sangat kecil. Pertumbuhan bakteri dapat diukur dengan menghitung jumlah sel dengan mengukur massa total populasi yang biasanya sebandiing dengan jumlah sel. Besarnya populasi mikroorganisme dapat menentukan kualitas suatu produk, menentukan tata guna suatu sumber daya, menentukan tingkat kesuburan suatu lahan dan lain-lain. Dan mikroorganisme merupakan salah satu makhluk hidup yang hanya dapat dilihat dengan bantuan mikroskop. Karena ukurannya yang sangat kecil, maka sukar sekali untuk menghitung mikroorganisme. Pada pengujian kali ini akan dilakukan perhitungan terhadap mikroorganisme , setelah kita mempelajari dan mempraktikkan cara-cara menanam, mengisolasi, dan mengidentifikasi mikroorganisme pada praktikum yang sebelumnya. Dari pengujian kali ini kita juga dapat mengetahui kecepatan reproduksi dari mikroba serta menentukan tingkat patogenitas maupun  pencemaran yang diakibatkan oleh cemaran mikroba dalam sampel yang dianalisis. Ada  beberapa metode menghitung bakteri, yaitu metode lempeng, metode langsung, metode turbidimetri, metode APM/angka paling mungkin (MPN/ Most proable Number ), metode kimia serta metode elektrik. Namun pada pengujian kali ini kita menghitung mikroorganisme dengan teknik angka lempeng total saja.

Tujuan Pratikum 1. Mengetahui tehnik - tehnik menghitung bakteri yang umum dilakukan dalam praktek mikrobiologi 2. Melakukan teknik  –  teknik menghitung bakteri untuk menentukan jumlah koloni  bakteri dalam suatu biakan atau sampel 3. Melakukan teknik seri pengenceran agar lempeng / angka lmpeng total untuk menghitung jumlah mikroba viabel 4. Melakukan teknik perhitungan bakteri dengan merode Most Probable Numbering 

Manfaat pratikum Dari pengujian kali ini yaitu menghitung jumlah mikroorganisme dengan teknik angka lempeng total, kita dapat mempelajari suatu jenis koloni dan sifat mikroorganisme tersebut. Dan dengan pengujian kali ini kita dapat mengetahui kecepatan reproduksi dari

suatu mikroba dan kita juga dapat mengetahui tingkat patogenitas dari mikroba tersebut. Dari teknik yang kita lakukan di pengujian kali ini,kita juga dapat menentukan banyaknya mikroba dalam suatu bahan, sehinnga kita dapat mengetahui sampai seberapa jauh bahan itu tercemar oleh mikroba. Kita juga dapat mengetahui secara spesifik kemampuan mikroorganisme untuk melakukan pertumbuhan, sehingga dapat dimanfaatkan dalam bidang farmasi dan kita dapat mengetahui dan memahami cara perhitungan kuantitas mikroorganisme pada suatu sampel tertentu.

BAB II STUDI PUSTAKA A. STUDI PUSTAKA Di alam terdapat banyak mikroorganisme yang hidup. Mikroorganisme yang terdapat di alam tersebut terdapat dalam bentuk kumpulan massa sel/ koloni. Untuk mempelajari suatu jenis koloni dan sifat mikroorganisme tersebut, kita memerlukan teknik pembiakan mikroorganisme terlebih dahulu. Setelah di biakan, kita perlu menghitung atau menentukan banyaknya mikroba untuk mengetahui seberapa jauh sampel itu tercemar oleh mikroba. Menghitung jumlah total tanpa merinci kelompok atau  jenis disebut Enumerasi. Metoda yang digunakan untuk menghitung jumlah mikroorganisme bermacam-macam dengan tingkat ketelitian dan peruntukan yang  berbeda. Metoda pengenceran  –   lempeng tuang, digunakan untuk mengetahui perkiraan  jumlah sel dengan anggapan satu koloni berasal dari satu sel. Enumerasi dengan metoda ini memerlukan keterampilan dan kecerdasan yang sungguh-sungguh (Nurhayati dan Pingkan, 1993). Pada metoda pengenceran cawan tuang, cawan yang dipilih untuk menghitungkan koloni adalah yang mengandung 30-300 koloni. Kuantitasi mikroba menunjukan jumlah koloni yang mampu di bentuk oleh mikroba tertentu. Beberapa koloni bakteri ini, bagi tubuh manusia akan menyebabkan penyakit. Seteril dari bakteri untuk maknan terutama minuman, sangat perlu di ketahui demi menjaga kesehatan. Air minum dari berbagai tempat mempunyai jenis-jenis bakteri yang tidak sama untuk air minum hasil penyulingan diharapkan sudah terbebas dari bakteri (Dwidjoseputro, 1994). Pertumbuhan sering kali dinyatakan secara singkat sebagai kemampuan untuk menghasilkan 2 sel baru dan hidup. Sel dikatakan hidup bila dapat menghasilkan sel baru. Bila tidak mempunyai kemampuan ini lagi, Maka sel dinyatakan tidak hidup lagi atau mati. Analisis pertumbuhan bakteri dapat dilakukan dengan  beberapa cara yaitu, membandingkan jumlah sel, berat kering, konsentrasi protein atau nitrogen dan kekeruhan (Dwidjoseputro, 1994). Perhitungan jumlah mikroba dapat dilakukan dengan perhitungan langsung maupun tidak langsung. Perhitungan secara langsung dapat mengetahui beberapa jumlah mikroorganisme pada suatu bahan, pada suatu saat tertentu tanpa memberikan  perlakuann terlebih dahulu, sedangkan jumlah mikroorganisme yang diketahui dari cara tidak langsung terlebih dahulu harus memberikan perlakuan tertentu sebelum dilakukan  perhitungan. Perhitungan secara langsung dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain adalah memebuat preparat dari suatu bahan (preparat sederhana di warnai atau tidak di warnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber), sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme dalam suatu bahan yang masih hidup saja. (Dwidjoseputro, 1994). Perhitungan secara tidak langsung didasarkan pada kekeruhan,aktivitas metabolik, atau bobot kering. Menghitung jumlah mikoroorganisme dengan mengukur aktivitas metabolik populasi bakteri, jumlah hasil metabolisme diasumsikan tertentu,seperti asam atau karbon dioksida, menunjukan proporsi keberadaan bakteri. Untuk bakteri berfilamen dan kapang, metode pengukuran biasa tidak memuaskan. Metode lempeng hitung sulit untuk mengukur peningkatan jumlah bakteri berfilamen. Pada penghitungan  Actinomycetes dan kapang menggunakan lempeng hitung, justru jumlah spora aseksual yang terhitung. Salah satu cara penghitungan yang lebih baik adalah penentua bobot

kering. Pada metode ini, bakteri atau kapang dipindahkan dari media pertumbuhan, disaring untuk menghilangkan materi pengganggu lain, dikeringkan, kemudian ditimbang. Berikut beberapa metode yang dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroorganisme adalah metode lempeng, metode langsung, metode turbidimetri, metode APM/angka paling nungkin,metode kimia serta metode elektrik. 1. Metode lempeng Pada metode ini dibuat seri pengenceran suspensi bakteri ataupun sampel yang kemudian ditanamkan pada media pertumbuhan padat yang sesuai. Prosedur  pengenceran yang benar sangat berpengaruh pada keseluruhan proses perhitungan. Suspensi bakteri ditanamkan dengan cara disebar pada permukaan media lempeng dalam cawan petri (cara sebar) ataupun dengan cara dicampurkan dengan agar cair bersuhu ± 45- C dan dibiarkan hingga memadat (cara tuang). Lempeng kemudian diinkubasikan selama 16-24 jam pada suhu 35-  C sehingga bakteri tumbuh menjadi koloni-koloni. Kemudian jumlah koloni bakteri tiap lempeng dihitung dan dikalikan dengan faktor  pengencerannya. Jumlah koloni yang dinyatakan dengan angka adalah yang berkisar antara 30-300. Jika lebih dari 300 koloni,dinyatakan dengan TNTC ( too numerous to count), dan jika kurang dari 30 dinyatakan dengan TFTC ( too few to count). Jumlah koloni dinyatakan dengan satuan cfu ( colony forming unit ). Metode ini memiliki beberapa keuntungan yaitu hanya sel hidup saja yang terhitung serta dapat memudahkan proses isolasi untuk mendapatkan isolat murni. Kelemahan metode ini adalah membutuhkan waktu yang lama karena adanya proses inkubasi, mengunakan peralatan gelas yang banyak seta adanya faktor-faktor kesalahan yang sangat mumgkin terjadi seperti kesalahan dalam pengenceran dan proses transfer. 2. Metode langsung Dengan metode ini, perhitungan bakteri dpat dilakukan secara langsung tanpa harus menumbuhkan bakteri terlebih dahulu dalam media pertumbuhan . sejumlah volume tertentu pengenceran sampel diamati secara langsung di bawah mikroskop dan dihitung jumlah sel-sel bakterinya (konsentrasi bakteri dalam sampel). Digunakan chamber  hitung khusus seperti hemositometer atau chamber  Petroff-Hausser. Kelemahan metode ini adalah sel-sel yang hidp dan mati terhitung semua. 3. Metode turbidimetri (Turbidometric Procedure) Jika serbekas cahaya dilewatkan melalui suatu suspensi bakteri, maka jumlah cahaya yang ditransmisikan/diteruskan akan berkurang yang berkaitan dengan tingkat kekeruhan suspensi tersebut. Pengukuran jumlah cahaya yang ditransmisikan oleh suspensi mikroorganisme menggunakan alat spektrofotometer ataupun alat optik yang lain dapat digunakan untuk memperkirakan massa sel karena jumlah cahaya yang diabsorpsi leh suspensi mikroorganisme tersebut sebanding dengan kepadatan sel. Metode spektrofotometer memberikan perkiraan hasil yang akurat dan proses yang cepat untuk menghitung berat kering atau massa bakteri per unit volume biakan. 4. Matode Angka Paling Mungkin/ APM (Most  Proable Number Procedure/MPN ) Metode angka paling mungkin adalah suatu metode stastik berbasis teori kemungkinan/probabilitas. Dibuat seri pengenceran suspensi bakteri bertingkat dalam sejumlah tabung berisi media cair (biasanya digunakan 9 tabung atau 15 tabung dalam 3 kelompok tingkat pengenceran), kemudian dilihat terbentuknya turbiditas/kekeruhan yang terjadi setelah seluruh media diinkubasi yang menunjukan adanya pertumbuhan

mikroba. Pola positif/negatif dari hasil uji digunakan untuk memperkirakan konsentrasi  bakteri dalam sampel dengan cara membandingkan pola tersebut dengan suatu tabel statistik probabilitas jumlah paling mungkin untuk hasil tersebut. 5. Metode Kimia Pada metode ini, jumlah sel dihitung secara tidak langsung dengan perbandingan korelasi dari parameter-parameter yang ada seperti hasil metabolik tertentu, jumlah konsumsi oksigen, produksi karbon dioksida, produksi DNA, konsentrasi protein, dll. 6. Penghitung sel elektronik Coulter counter adalah salah satu contoh alat yang dapat dengan cepat menghitung jumlah sel-sel tersuspensi dalam cairan penghantar yang melewati sebuah ruang di mana terdapat aliran arus listrik. Sel-sel bersifat non-konduktor, akan meningkatkan hambatan listrik dari cairan penghantar. Hambatan listrik yang dihasilkan akan direkam yang berkolerasi dengan jumlah organisme yang terdapat dalam cairan  penghantar tersebut. Kelemahan metode ini adalah tidak dapat membedakan partikel yang bersifat inert  di dalam komponen selular.

BAB III METODE PENELITIAN

A. Alat dan bahan Untuk praktikum kali ini alat-alat yang digunakan adalah tabung-tabung reaksi steril, cawan-cawan petri steril, pipet-pipet volume steril, rak tabung reaksi, pembakar  bunsen. Dan pada pengujian kali ini digunakan suspensi bakteri  Bacillus subtillis dalam nutrient broth , nutrient agar dan aquadest. B. Cara Kerja Dalam pratikum mikrobiologi ini haruslah bersifat aseptik dengan nyala api disekitar pembakar Bunsen. Isikan suatu tabung dengan suspensi bakteri dan beri nomor 1 kemudian disiapkan 4 buah tabung steril dn diberi nomor 2-7. Semua tabung diisi oleh 9 mL aquadest. Kemudian secara aseptik, pindahkan 1 mL suspensi bakteri ke dalam tabung nomor 2, homogenkan. Maka dalam tabung no.2 terdapat  pengenceran suspensi bakteri 1/10 untuk bahan berupa sampel yang akan dianalisis dan telah dibuat homogenat 10 -1 , langsung dipindahkan 1 mL suspensi bakteri dari tabung no.2 ke taabung no.3. homogenkan. Maka dalam tabung no.3 terdapat  pengenceran suspensi bakteri 1/100. Demikian seterusnya sampai tabung no.7 sehingga dalam tabung no. 8 terdapat pengeceran bakteri 1/10 6. Lalu siapkan 3 cawan petri setril beri nomor 1 sampai 3 dan tuliskan konsentrasi masing-masing suspensi bakteri atau sampel mulai 10 -4 sampai dengan 10-7. Dengan pipet steril secara aseptik pindahkan 1 mL pengenceran 10 -5 ke dalam cawan petri no.1. lakukan hal yang sama untuk pengenceran selanjutnya. Kemudian tuangkan Nutrient agar steril bersuhu 45oC sebanyak 20mL kedalam setiap ccawan  petri. Goyongkan cawan pada permukaan meja kerja searah atau berlawanan arah  jrum jam untuk menghomogenkan campuran pengenceran bakteri dan Nutrient Agar. Biar kan hingga memadat. Lalu inkubasi semua cawan petri dalam inkubator bersuhu 35-37oC selam 18-24 jam dengan posisi terbalik. Amati perubahan koloni dan hitung  jumlah koloni yang tumbuh di masing-masing perbenihan agar lempeng.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

kelompok

B8

B7

B3

Cawan ke

1 2 3 1 2 3 1 2 3

pengenceran 



































Jumlah koloni

Jumlah mikroba per ml sampel

285 8 3 156 6 4 123 21 3

Dari data yang dihasillkan, setiap hasil koloni di tiap cawan harus berbanding 1 : 10 dengan hasil cawan sebelumnya. Dalam kelompok B8 untuk ketiga cawan yaitu cawan 1,2, dan 3 menghasilkan jumlah koloni yaitu 285, 8, dan 3. Data ketiga data tersebut di lakukan  pengenceran tiap cawan dibagi 1/10 dari data yang dihasilkan. Cawan pertama 285/10 = 28,5 ; cawan kedua 8/10 = 0.8 ; cawan ketiga 3/10 = 0,3. Dapat kita lihat perbandingan setiap cawan tidak sesuai dengan perbandingan 1 : 10.Oleh karena data kelompok B8 tidak didapat digunakan. Kemudian pada kelompok B7 untuk ketiga cawan 1,2, dan 3 menghasilkan jumlah koloni yaitu 156, 6, dan 4. Dari ketiga data tersebut dilakukan pengenceran tiap cawan dibagi 1/10 dari data yang dihasilkan. Cawan pertama 156/10 = 15,6 ; cawan kedua 6/10 = 0,6 ; cawan ketiga 4/10 = 0,4. Dapat kita lihat perbandingan setiap cawan tidak sesuai dengan  perbandingan 1 : 10. Oleh karena data kelompok B7 tidak didapat digunakan. Lalu pada kelompok B3 untuk ketiga cawan 1,2, dan 3 menghasilkan jumlah koloni yaitu 123, 21, dan 3. Dari ketiga data tersebut diakukan pengenceran tiap cawan dibagi 1/10 dari data yang dihasilkan. Cawan pertama 123/10 = 12,3 ; cawan kedua 21/10 = 2,1 dan cawan ketiga 3/10 = 0,3. Dari ketiga data tersebut dapat disimpulkan bahwa ketiga data tersebut menghasilkan rentang yang jauh. Oleh karena itu data kelompok B2dapat digunakan sebagai  perkembangan mikroba. Pada data kelompok B3 menghasilkan rata-rata sebanya 123 x 10 5. Terdapat gambar dari masing-masing cawan untuk membuktikan koloni mikroba yang hidup. (LAMPIRAN)

BAB V KESIMPULAN Dari hasil pengamatan dapat dilakukan perhitungan untuk koloni mikroba. Data yang didapat akan diambil nilai yang mendekati rata-rata. Dengan hasil perhitungan data yang ada dapat disimpulkan bahwa menghitung jumlah bakteri atau mikroorganisme diperlukan untuk mengetahui kecepatan reproduksi mikroba se rta menentukan tingkat  patogenitas maupun pencemaran yang diakibatkan oleh cemaran mikroba dalam sampel yang dianalisis.

BAB VI DAFTAR PUSTAKA Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar  Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta. Pelczar, J Michael.1986.Dasar-Dasar Mikrobiologi.Universits Indonesia.Jakarta

LAMPIRAN

Gambar B8 cawan 1

Gambar B8 cawan 2

Gambar B8 cawan 3

Gambar B7 cawan 1

Gambar B7 cawan 2

Gambar B7 cawan 3

Gambar B3 cawan 1

Gambar B3 cawan 2

Gambar B3 cawan 3