ANALISIS KANDUNGAN STEVIOL GLIKOSIDA DARI EKSTRAK, FRAKSI DAN BEBERAPA PRODUK DI PASARAN PASARAN MENGGUNAKAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)
SKRIPSI
Rizka Fauzia Fajri !!!"#
SEKOLA$ TINGGI FARMASI BANDUNG PROGRAM STUDI STRATA STRATA ! FARMASI
BANDUNG #!%
1
PENDA$ULUAN La&ar B'aka*
Saat ini, kebutuhan manusia akan bahan pemanis semakin meningkat seiring dengan peningkatan produksi pangan di dunia. Gula merupakan salah satu kebutuhan paling penting bagi masyarakat. Selain memberikan rasa manis, gula merupakan penyumbang kalori yang baik karena mengandung gizi yang diperlukan oleh tubuh. Pemanis merupakan senyawa kimia yang ditambahkan dan digunakan untuk keperluan produk olahan pangan, industri, serta minuman dan makanan kesehatan. Pemanis berfungsi untuk meningkatkan cita rasa dan aroma, memperbaiki sifat-sifat fisik, sebagai pengawet, memperbaiki sifat-sifat kimia, mengontrol program pemeliharaan dan penurunan berat badan, mengurangi kerusakan gigi, serta sebagai bahan subtitusi pemanis utama (Cahyadi, !!"#. Pemanis adalah bahan tambahan pangan berupa pemanis alami dan pemanis buatan yang memberikan rasa manis pada produk pangan. Pemanis buatan ( Artificial Sweetener # adalah pemanis yang diproses secara kimiawi, dan senyawa tersebut tidak terdapat di alam. $iantara berbagai %enis pemanis buatan, hanya beberapa sa%a yang diizinkan penggunannya sesuai Peraturan &enteri 'esehatan ) *omor !++ ahun !, diantaranya sakarin, aspartam, dan siklamat. Senyawa tersebut secara substansial memiliki tingkat kemanisan lebih tinggi, yaitu berkisar antara +! sampai dengan ribuan kali lebih manis dibandingkan pemanis alami. 'arena tingkat kemanisannya yang tinggi, penggunaan pemanis buatan dalam produk pangan hanya dibutuhkan dalam %umlah kecil sehingga dapat dikatakan rendah kalori atau tidak mengandung kalori. Selain itu penggunaan pemanis buatan untuk memproduksi minuman atau makanan %auh lebih murah. *amun, Pemanis buatan banyak menimbulkan bahaya bagi kesehatan manusia. ntara lain dapat menyebabkan kanker kandung kemih dan migrain. /fek samping akan muncul %ika pemanis buatan dikonsumsi dalam %umlah yang berlebihan (Cahyadi, !!"#. Pemanis alami men%adi pilihan kedua karena dapat ditemukan dalam bahan alam. Salah satunya adalah ste0iol glikosida yang berasal dari daun Stevia Rebaudiana 1ertoni.
1
Stevia rebaudiana 1ertoni merupakan tanaman herba dari keluarga steraceae. anaman ini adalah pemanis alami yang dikenal sebagai 2rumput manis3, 2daun manis3, 2herba manis3, dan 2daun madu3. anaman ini merupakan tanaman asli dari Paraguay imur dan banyak digunakan di merika 4atin. anaman ini tumbuh dengan mudah di daerah tropis dan subtropis. $ilaporkan efek terapeutik dalam tubuh manusia di beberapa *egara, termasuk merika 4atin, 'anada, Cina, 5epang, )ndonesia dan 6S, Paraguay, 1razil, &e7ico, ustralia, *orway, ussian 8ederation, *ew 9ealand and Singapore ('umari dan Chandra., !:#. $aun Stevia rebaudiana ini merupakan penghasil diterpen glikosid, ste0ioside dan rebaudioside (;oshida, "<=#. 'andungan ste0ioside dalam daun ber0ariasi dari +,> sampai ","?@ dan dalam batang dari ,:? sampai +,<:@. $alam daun ste0ia, ditemukan empat ste0iol glikosida utama yaitu :-!@ ste0ioside, -?@ rebausioside , - @ rebaudioside C dan !,: - @ dulcoside (1rahmachari et al ., !#. Ste0ioside ! A >! kali lebih manis dibandingkan dengan sukrosa, rebaudioside :! A +! kali, rebaudioside C ?! A =! kali dan dulcoside +! kali lebih manis dibandingkan dengan sukrosa (anaka, "">#. $aun ste0ia %uga mengandung banyak sekali zat alami yang membantu dalam mengatur gula darah termasuk kromium, magnesium, mangan, seng, kalium, selenium, dan 0itamin 1+ (*iasin# ('umari dan Chandra., !:#. 6ntuk mendapatkan ste0iol glikosida (ste0ioside dan rebaudioside #, pertama dilakukan ekstraksi menggunakan pelarut air kemudian ekstrak yang sudah dipekatkan direfluks selama - ? %am. efinat kemudian di ekstraksi dengan metode eksraksi cair-cair (/CC# menggunakan etil asetat. $idapatkan fraksi air dan fraksi etil asetat. 8raksi air digunakan kembali untuk direfluks aseton. efinat diekstraksi dengan metode ekstraksi cair-cair menggunakan pelarut aseton, kemudian dilakukan hal yang sama hingga didapatkan + fraksi yaitu fraksi etil asetat, fraksi aseton dan fraksi butanol. 8raksi butanol dilakukan isolasi karena kandungan ste0iol glikosida (ste0ioside dan rebaudioside paling banyak#. Selan%utnya isolasi dengan kromatografi kolom dengan fase gerak etanolkloroform-air (?B?B#, penampak bercak yang digunakan untuk ste0iol glikosida (ste0ioside dan rebaudioside # yaitu -naftol ($es hmukh dan 'edari, !?#.
2
Saat ini ste0iol glikosida sudah banyak ditambahkan pada beberapa produk makanan dan minuman seperti minuman coca-cola, alergon, dan ste0iagrow. Produksi ste0iol glikosida (ste0ioside dan rebaudioside # di industri akan memerlukan tahapan atau proses yang cukup pan%ang untuk mendapatkan ste0iol glikosida (ste0ioside dan rebaudioside # sebagai pemanis, setiap tahapan produksi akan menggunakan pelarut yang tidak sedikit. $alam prosesnya, yang digunakan untuk mendapatkan ste0iol glikosida hanya fraksi butanol sa%a, sedangkan fraksi etil dan fraksi aseton dibuang begitu sa%a. Dal ini dapat meningkatkan biaya produksi sehingga dapat menimbulkan kerugian. Eleh karena itu penelitian ini bertu%uan untuk mengetahui kadar ste0iol glikosid (ste0ioside dan rebaudioside # pada ekstrak, fraksi etil asetat, fraksi aseton, fraksi butanol sehingga bisa dimanfaatkan secara maksimal dan %uga mengetahui kadar ste0iol glikosid (ste0ioside dan rebaudioside # pada beberapa produk seperti %ingochaF, alergonF, dan ste0iagrowF menggunakan metode 'romatografi Cair 'iner%a inggi ('C'#. Ba&a+a P''i&ia
Penentuan kadar ste0iol glikosida (ste0ioside, rebaudioside # menggunakan 'C' ('romatografi Cair 'iner%a inggi# yang terkandung dalam daun ste0ia (Stevia rebaudiana 1ertoni.# dari ekstrak, fraksi dan beberapa produk yang ada di pasaran. Tujua
Penelitian ini bertu%uan untuk mengetahui kadar ste0iol glikosida (ste0ioside, rebaudioside # yang terkandung dalam daun ste0ia dari ekstrak, fraksi dan beberapa produk yang ada dipasaran. ak&u Da T'-.a& P''i&ia
aktu penelitian dilakukan pada bulan &aret sampai bulan 5uli, sedangkan untuk tempat penelitian yaitu bertempat di 4abolatorium 8itokimia Sekolah inggi 8armasi 1andung.
3
METODOLOGI PENELITIAN
&etodologi penelitian yang digunakan meliputi beberapa tahap, yaitu penyiapan bahan, karakterisasi simplisia, penapisan fitokimia, ekstraksi, fraksinasi dan penetapan kadar menggunakan 'C'. Penyiapan bahan meliputi pengumpulan bahan baku dan pengolahan. Pengolahan bahan yang dilakukan mencakup sortasi basah, pencucian, pengeringan, sortasi kering dan penggilingan hingga diperoleh serbuk simplisia. 'arakterisasi simplisia meliputi karakterisasi makroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar abu total, kadar abu tidak larut asam, kadar abu larut air, kadar sari larut air, kadar sari larut etanol dan susut pengeringan. Penapisan fitokimia meliputi pemeriksaan terhadap berbagai golongan senyawa, seperti
alkaloid,
fla0onoid,
saponin,
kuinon,
tanin,
glikosida
dan
steroidHtriterpenoid. /kstraksi dilakukan dengan cara panas refluks menggunakan pelarut air. 'emudian ekstrak dipekatkan menggunakan rotary vaporator hingga didapatkan ekstrak kental. /kstrak kental kemudian difraksinasi dengan menggunakan metode /kstraksi Cair-Cair (/CC# menggunakan pelarut etil asetat, aseton dan butanol masing-masing sebanyak + kali. Selan%utnya dilakukan pemantauan dengan menggunakan kromatografi lapis tipis ('4# dengan fase diam silika gel 8:? dengan menggunakan pengembang etil asetat-metanol-asam asetat (=B+B#. Penetapan kadar ste0iol glikosida menggunakan 'C' dengan mengatur beberapa kondisi analisis, seperti kolom yang akan digunakan yaitu C<, suhu kolom pada : IC, fase gerak menggunakan campuran asetonitril dan air (
4
ALAT DAN BA$AN Aa&
lat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat refluks, rotary vaporator , beaker glass, timbangan analitik, spatel, pipet tetes, cawan penguap, 0ial, botol, kromatografi lapis tipis ('4#, alat 'C', sonikator, dan alat-alat yang umum digunakan di laboratorium. Ba/a
1ahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain daun tanaman Stevia rebaudiana 1ertoni, metanol, asetonitril grade pro DP4C, aKua destilata pro DP4C, aKua bidestilata, etil asetat, butanol, asam asetat, aseton, etanol, asam klorida, kertas saring, toluen, amonia : @, serbuk magnesium, besi ()))# klorida, gelatin, kloralhidrat >!@, asam asetat, *aED, pereaksi $ragendorff, pereaksi &ayer, pereaksi dan penampak bercak 4iebermann-1urchard, produk (alergonF, ste0iagrowF, %ingochaF, sweet 1lack eaF, sweet Green eaF#.
5
PROSEDUR KERJA
Penelitian yang akan dilakukan terdiri dari penyiapan bahan, determinasi tanaman, pembuatan simplisia daun ste0ia, karakterisasi simplisia dan penapisan fitokimia, ekstraksi, fraksinasi dan pemantauan fraksi serta u%i kuantitatif menggunakan metode 'C'. P'0ia.a Ba/a
Penyiapan bahan meliputi pengumpulan bahan, determinasi dan pengolahan bahan hingga men%adi simplisia. P'*u-.ua Ba/a Taa-a
1ahan berupa daun Stevia rebaudiana 1ertoni rencananya diperoleh dari kebun ste0ia di daerah Ciwidey. D'&'r-ia+i Taa-a
$eterminasi tanaman Stevia rebaudiana 1ertoni rencananya akan dilakukan di Derbarium Sekolah )lmu dan eknologi Dayati )nstitut eknologi 1andung. Proses determinasi dilakukan untuk memastikan kebenaran tanaman yang akan digunakan sebagai bahan penelitian. P'*1a/a Si-.i+ia
$aun Stevia rebaudiana 1ertoni dikeringkan dengan cara di o0en dengan suhu :! IC dilakukan sampai benar-benar kering. 'emudian bahan dihaluskan dengan blender hingga men%adi serbuk dan kemudian diayak dengan mesh. Dasil pengayakan disimpan pada wadah yang tertutup. Karak&'ri+a+i Si-.i+ia
'arakterisasi
simplisia
meliputi,
pemeriksaan
mikroskopik,
pemeriksaan
makroskopik, penetapan kadar air, kadar abu total, kadar abu tidak larut asam, kadar abu larut air, kadar sari larut air, kadar sari larut etanol, dan penetapan susut pengeringan. P'-'rik+aa Makr1+k1.ik 2a Mikr1+k1.ik
6
Pemeriksaan makroskopik meliputi bentuk, warna, ukuran daun dan bunga Stevia rebaudiana 1ertoni. Pemeriksaan dilakukan pula dengan membuat foto bagian tanaman yang digunakan dalam penelitian. Sedangkan pemeriksaan mikroskopik dengan cara meletakan serbuk daun ste0ia diatas object glass yang diteteskan oleh kloralhidrat >! @ untuk melihat komponen selain pati dan air B gliserin (B# untuk melihat komponen pati dalam ste0ia. P''&a.a Ka2ar Air
Se%umlah !! m4 toluen dan m4 air dimasukkan kedalam labu destilasi. 4abu dipanaskan hingga larutan mendidih selama dua %am, kemudian didinginkan selama +! menit dan 0olume air dibaca pada skala dengan ketelitian !,!: m4. Dasil yang diperoleh disebut 0olume destilasi pertama. Se%umlah zat u%i yang diperkirakan mengandung -+ m4 air ditimbang seksama dan dimasukkan ke dalam labu destilasi, dimasukan %uga beberapa batu didih. 4abu dipanaskan perlahan selama : menit. Saat larutan mulai mendidih, penyulingan dimulai dengan kecepatan tetes per detik. Setelah air tersuling seluruhnya, bagian dalam kondensor dibilas dengan toluen %enuh air. $estilasi dilan%utkan selama kurang lebih lima menit lalu pemanasan dihentikan. abung penerima didinginkan pada suhu kamar. ir yang masih menempel pada dinding tabung penerima dilepaskan dengan mengetuk-ngetuk tabung. 4apisan air dan toluen dibiarkan memisah dan 0olume yang terbaca disebut 0olume destilasi kedua. (8D), !!<# 'adar air dinyatakan dalam persen menurut rumus B n1
'adar air (@# L !! 7
−n
w
$engan w L berat zat u%i dalam gram, n L 0olume destilasi pertama atau 0olume air setelah penyulingan dalam m4, dan nL 0olume destilasi kedua atau 0olume total air dalam m4.
7
P''&a.a Ka2ar A3u T1&a
Sebanyak tiga gram sampel ditimbang seksama dan dimasukkan ke dalam krus platina atau krus silikat yang telah dipi%ar dan ditara, kemudian diratakan. 'emudian dipi%arkan perlahan-lahan hingga arang habis, kemudian dipi%arkan dalam o0en hingga bobot tetap, dan ditimbang. 'adar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara. (8armakope Derbal )ndonesia, !!<# P''&a.a Ka2ar A3u Ti2ak Laru& A+a-
bu yang diperoleh pada penetapan abu total dididihkan dengan : m4 asam klorida encer selama : menit. 1agian yang tidak larut asam dikumpulkan, disaring menggunakan kertas saring bebas abu, dicuci dengan air panas, dipi%arkan pada suhu ?:!IC hingga bobot tetap kemudian ditimbang. 'adar abu tidak larut asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (8armakope Derbal )ndonesia, !!<#. P''&a.a Ka2ar A3u Laru& Air
bu yang diperoleh pada penetapan abu total dididihkan dengan : m4 air sela ma : menit, bagian yang tidak larut dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu, lalu dicuci air panas dan dipi%arkan pada suhu ?:! oC hingga bobot tetap kemudian ditimbang. 'adar abu larut air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (&&), "<"#. P''&a.a Ka2ar Sari Laru& Air
Se%umlah lima gram serbuk yang sudah dikeringkan di udara, dimaserasi selama ? %am dengan !! m4 air-kloroform menggunakan labu bersumbat sambil sekalikali dikocok pada = %am pertama kemudian dibiarkan selama < %am. 'emudian disaring dan ! m4 filtrat diuapkan hingga kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara kemudian sisanya dipanaskan pada suhu !: oC hingga bobot tetap. 'adar sari yang larut air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (8armakope Derbal )ndonesia, !!<#. P''&a.a Ka2ar Sari Laru& E&a1
8
Se%umlah lima gram serbuk yang sudah dikeringkan di udara, dimaserasi selama ? %am dengan !! m4 etanol (":@# menggunakan labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama = %am pertama kemudian dibiarkan selama < %am. 'emudian disaring dengan cepat untuk menghindari penguapan etanol (":@# dan sebanyak ! m4 filtrate diuapkan hingga kering dalam cawan dangkal yang berdasar rata yang telah ditara kemudian sisanya dipanaskan pada suhu !: oC hingga bobot tetap. 'adar sari yang larut etanol (":@# dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (8armakope Derbal )ndonesia, !!<#. P''&a.a Su+u& P'*'ri*a
$igunakan alat moistur balance, dimasukkan gram serbuk dalam pinggan berlapis aluminium foil yang telah ditara terlebih dahulu kemudian diukur kadar susut pengeringannya pada suhu !: oC hingga diperoleh bobot tetap ditandai dengan munculnya angka @ &C ( Moisture Contens# pada display (goes., !#. P'a.i+a Fi&1ki-ia
Penapisan fitokimia meliputi pemeriksaan terhadap golongan senyawa alkaloid, fla0onoid, saponin, kuinon, tanin, glikosida, dan steroidHtriterpenoid. P'-'rik+aa Aka1i2
Sebanyak gram sampel ditambahkan amonia : @ 0H0 dan ditambahkan ! m4 kloroform, lalu digerus. Campuran disaring dan filtrat yang terdiri dari larutan organik digunakan untuk percobaan selan%utnya dan disebut larutan . 4arutan diekstraksi dua kali dengan asam klorida ! @ 0H0 dan ekstrak yang diperoleh disebut larutan 1. 4arutan diteteskan pada kertas saring kemudian disemprotkan dengan
pereaksi
$ragendorff.
Pengamatan
untuk
reaksi
positif
adalah
terbentuknya warna merah atau %ingga pada kertas saring. 'edalam masingmasing : m4 larutan 1 dalam tabung reaksi ditambahkan beberapa tetes pereaksi $ragendorff dan pereaksi &ayer pada tabung yang lain. eaksi positif %ika penambahan $ragendorff terbentuk endapan merah bata atau endapan putih pada penambahan pereaksi &ayer (8arnsworth., "==#. P'-'rik+aa Fa411i2
9
Sebanyak gram sampel dalam !! m4 air panas dididihkan selama : menit dan disaring. 8iltrat yang diperoleh digunakan untuk penapisan senyawa golongan saponin, kuinon dan tanin, selan%utnya disebut larutan C. 'edalam : m4 larutan C ditambahkan serbuk magnesium dan m4 asam klorida-etanol (B#, kemudian dikocok dengan ! m4 amil alkohol. eaksi positif ditun%ukkan dengan terbentuknya warna %ingga, kuning, atau merah pada lapisan amil alkohol (8arnsworth., "==#. P'-'rik+aa Sa.1i
Sebanyak ! m4 larutan C dalam tabung reaksi dikocok secara 0ertikal selama ! detik dan didiamkan. Pengamatan dilakukan terhadap busa yang terbentuk. danya saponin ditun%ukkan dengan terbentuknya busa yang stabil, ketika ditambahkan tetes asam klorida * (8arnsworth., "==#. P'-'rik+aa Kui1
Sebanyak : m4 larutan C ditambahkan beberapa tetes larutan natrium hidroksida *. erbentuknya warna merah menun%ukkan adanya kuinon. *amun dapat ter%adi reaksi positif palsu dengan tanin. &aka pemeriksaan dilan%utkan dengan penambahan gelatin kemudian endapannya disaring dan filtratnya ditambahkan natrium hidroksida *. 1ila tetap terbentuk warna merah maka menun%ukkan adanya kuinon (8arnsworth., "==#. P'-'rik+aa Tai
Sebanyak : m4 larutan C direaksikan dengan larutan besi ()))# klorida @. 5ika terbentuk warna biru kehitaman menun%ukkan adanya tanin. 'emudian : m4 larutan C ditambahkan larutan gelatin, %ika terbentuk endapan putih menun%ukkan adanya tanin. Selan%utnya : m4 larutan C ditambahkan pereaksi Steas ny ( bagian formaldehid B bagian asam klorida# dan dipanaskan dalam tangas air, %ika terbenuk endapan merah muda menun%ukkan adanya tanin katekat. /ndapan disaring, lalu filtrat di%enuhkan dengan natrium asetat dan ditambahkan besi ()))# klorida. 5ika terbentuk warna biru hitam menun%ukkan adanya tanin galat (8arnsworth.,"==#. P'-'rik+aa S&'r1i25Tri&'r.'1i2 10
Sebanyak gram sampel dimaserasi dengan ! m4 eter selama %am, lalu disaring. 8iltrat sebanyak : m4 diuapkan dalam cawan penguap. 'edalam residu ditambahkan pereaksi 4iebermann-1uchard, yaitu tetes asam asetat anhidrat dan tetes asam sulfat pekat. 5ika terbentuk warna merah-ungu menun%ukkan adanya triterpenoid dan terbentuk warna hi%au-biru menun%ukkan adanya steroid (8arnsworth., "==#. P'-'rik+aa Gik1+i2a
&etode 4iebermannMs B ekstrak dicampurkan dengan m4 kloroform dan m4 asam asetat dalam penangas es. 'edalam campuran ditambahkan D SE? pekat. 5ika terbentuk warna dari ungu men%adi hi%au menandakan adanya senyawa glikosida. &etode SalwoskiMs B ekstrak dicampur dengan m4 kloroform dan ditambahkan DSE? pekat. 5ika terbentuk warna coklat kemerahan menandakan adanya senyawa glikosida ($hawale., !:#. Ek+&rak+i 2a Frak+ia+i
&etode ekstraksi yang digunakan adalah refluks menggunakan pelarut air. 'emudian ekstrak tersebut dipekatkan dengan menggunakan rotary vaporator hingga diperoleh ekstrak kental. /kstrak kental di fraksinasi menggunakan + pelarut dengan urutan yang berbeda berturut-turut adalah etil asetat, aseton, dan butanol masing A masing + kali. 'emudian dilakukan pemantauan dengan menggunakan kromatografi lapis tipis ('4# dengan fase diam silika gel 8 :? menggunakan pengembang etil asetat-metanol-asam asetat dengan perbandingan =B+B. Penampak bercak yang digunakan adalah 4iebermann-1urchard. Pr'.ara+i Sa-.'
Pembuatan 4arutan )nduk $itimbang dengan seksama standar ste0iosid sebanyak !,!! g, masukkan kedalam labu ukur : m4, dilarutkan dengan metanol-air (
11
erlebih dahulu sampel di preparasi, : mg sampel yang telah dihaluskan ditambahkan dengan ! m4 aKuabidest, kemudian di sonikasi selama ! menit. Saring dengan saringan Millipore. Uji K'+'+uaia Si+&'-
6%i kesesuaian sistem dilakukan dengan cara mencari pelarut yang tepat, fase gerak dengan konsentrasi yang tepat, dan pan%ang gelombang yang tepat. Kur4a Kai3ra+i
Pembuatan kur0a kalibrasi dengan membuat larutan dengan seri konsentrasi yang digunakan adalah ppm, ? ppm, = ppm, < ppm, ! ppm, ppm. 'emudian dilihat linearitas, batas deteksi dan batas kuantisasi. Vai2a+i M'&12'
Jalidasi metode dilakukan dengan metode adhisi, yaitu untuk membuktikan bahwa metode 'C' merupakan teknik yang tepat untuk analisis ste0iol glikosida. P''&a.a Ka2ar S&'4i1 Gik1+i2a
Penentuan kadar ste0iol glikosida dilakukan dengan menggunakan kromatografi cair kiner%a tinggi ('C'#. Sampel dan standar dilarutkan dalam methanol-air dengan perbandingan 0olume < B dan diin%eksikan sebanyak : N4 larutan sampel dan
larutan
standar
dengan
mengikuti
kondisi
analisis
seperti
kolom
menggunakan C<, fase gerak menggunakan campuran asetonitril dan air (
12
$ASIL DAN PEMBA$ASAN P'0ia.a Ba/a
Pada penyiapan bahan dilakukan dengan pengumpulan bahan baku simplisia untuk melakukan tahapan proses lebih lan%ut. anaman ste0ia diperoleh dari kebun ste0ia di daerah Cibodas 'ecamatan Pasir%ambu Ciwidey 'abupaten 1andung. 'ebenaran %enis spesies telah dibuktikan dengan adanya surat keterangan mutu benih dari $inas Perkebunan 6P$ A 1alai Pengawasan dan Pengu%ian &utu 1enih (1P&1# anaman Perkebunan 5awa 1arat. Dasil dari sertifikasi benih membenarkan bahwa tanaman yang diteliti merupakan ste0ia dengan %enis Stevia rebaudiana 1ertoni 0arietas C&+ . $aun ste0ia yang diperoleh dibersihkan dari kotoran-kotoran dan kemudian dikeringkan di dalam o0en pada suhu :! IC hingga didapat simplisia kering dan selan%utnya diblender dengan tu%uan untuk memperbesar luas permukaan sampel yang akan mempermudah pengeluaran senyawa saat diekstraksi. Serbuk tanaman ste0ia kemudian disimpan dalam wadah tertutup rapat untuk mencegah masuknya pengotor lain dan men%aga agar tidak lembab. Karak&'ri+a+i +i-.i+ia
'arakterisasi merupakan salah satu parameter untuk standarisasi simplisia yang dilakukan dengan tu%uan untuk mengetahui kualitas dan mutu simplisia yang digunakan. abel J. &akroskopik anaman Ste0ia Karak&'ri+&ik B'&uk
D'+kri.+i $aun B lon%ong bergerigi halus pan%ang + cm
ara Bau Ra+a
1atang B bulat lon%ong Di%au agak tua 1au khas &anis agak pahit diu%ung
1erdasarkan tabel J. dapat dilihat bahwa dari hasil karakterisasi, kadar air yang terkandung dalam simplisia daun ste0ia adalah sebesar + @. *ilai kadar air berkaitan dengan penurunan mutu simplisia dimana syarat untuk kadar air
13
simplisia yang baik adalah kurang dari ! @, dengan kadar tersebut pertumbuhan mikroba dari reaksi enzimatis dapat dicegah sehingga akan berpengaruh pada daya simpan simplisia (&&)., "<"#. abel J. Dasil Pemeriksaan 'arakterisasi Simplisia Para-'&'r A3u &1&a A3u &i2ak aru&
$a+i ( 6 353 ) !,>: !,=
a+aA3u aru& air Sari aru& air Sari aru& '&a1 Ka2ar air Su+u& .'*'ri*a 'et B Q(@ 0H b#
,"< +=,!! <,!! +Q !,>
Pada pemeriksaan kadar abu total didapatkan hasil sebesar !,>: @. Pemeriksaan ini bertu%uan untuk memberikan gambaran adanya kandungan mineral baik internal maupun eksternal dari suatu bahan. Selain pemeriksaan kadar abu total, ditentukan %uga kadar abu larut air dan kadar abu tidak larut asam. $ari hasil yang didapat menun%ukkan bahwa nilai kadar abu larut air lebih besar dari nilai kadar abu tidak larut asam, sehingga dari hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa kandungan mineral internal lebih besar daripada kandungan eksternalnya. $engan demikian simplisia daun ste0ia memiliki kualitas yang baik dengan %umlah pengotor yang sedikit. ingginya kadar abu yang didapat menun%ukkan tingginya kandungan senyawa anorganik atau mineral dalam simplisia. Pemeriksaan kadar sari bertu%uan untuk mengetahui %umlah kandungan senyawa dalam simplisia yang dapat tersari dalam pelarut tertentu. *ilai kadar sari larut air yang didapat yaitu +=,!! @. *ilai tersebut ternyata lebih tinggi dibanding kadar sari larut etanol yang didapat yaitu <,!! @. Dal tersebut menun%ukkan tingginya kandungan senyawa yang larut dalam air dibanding senyawa yang larut dalam etanol dari daun ste0ia. Pada susut pengeringan didapat nilai sebesar ,"> @. *ilai tersebut lebih besar daripada kadar air yang menun%ukkan bahwa adanya komponen yang menguap
14
selain air pada saat proses pengukuran yaitu pada suhu !:IC seperti minyak atsiri. P'a.i+a Fi&1ki-ia
Penapisan fitokimia dilakukan dengan tu%uan untuk mengetahui golongan besar senyawa kimia yang terkandung di dalam simplisia daun ste0ia. Dasil yang diperoleh dapat digunakan sebagai informasi awal untuk mengetahui senyawa kimia apa sa%a yang terkandung dalam simplisia tanaman ste0ia. abel J.+ Dasil Penapisan 8itokimia G11*a
$a+i
+'0a7a Aka1i2 Fa411i2 Sa.1i Tai Kui1 S&'r1i25
.'*a-a&a R R R R
R
Tri&'r.'1i2 Gik1+i2a
'et B
R
R L mengandung senyawa yang diu%i L tidak mengandung senyawa yang diu%i
Dasil penapisan fitokimia menun%ukkan simplisia daun ste0ia mengandung fla0onoid, saponin, tanin, kuinon, steroidHtriterpen, dan glikosida. Sedangkan untuk penapisan golongan alkaloid menun%ukkan hasil yang negatif. P'-3ua&a Ek+&rak 2a Frak+ia+i
Proses ekstraksi simplisia daun ste0ia dilakukan dengan metode refluks menggunakan pelarut air. 1anyak pustaka menggunakan metode refluks untuk ekstraksi karena sifat tanaman ste0ia sendiri tahan akan pemanasan sehingga cocok menggunakan cara panas, selain itu dengan pemanasan diharapkan proses ekstraksi senyawa dapat men%adi lebih optimal.
15
Pemilihan air sebagai pelarut dikarenakan air merupakan pelarut polar yang murah serta mudah didapatkan. Selain itu ste0ioside merupakan senyawa yang mudah larut dalam air. Dal tersebut didasarkan pada sifat dari komponen senyawa manis terutama ste0ioside dalam tanaman ste0ia yang merupakan senyawa alami golongan terpen yang pada umumnya memiliki sifat larut dalam pelarut nonpolar, akan tetapi ste0ioside dan komponen ste0iol glikoside lainnya memiliki sifat larut dalam pelarut polar karena senyawa diterpen pada ste0ioside merupakan aglikon yang berikatan dengan -glukosa sebagai glikonnya. Sehingga kelarutannya dalam pelarut polar meningkat bahkan memiliki kelarutan yang hampir sama dengan sukrosa (Chatsudthipong., !!"#. /kstrak yang diperoleh selan%utnya disaring dan dipekatkan dengan alat penguap berputar hampa udara (rotary vaporator # sehingga didapatkan ekstrak kental sebanyak =:,>+ g dengan rendemen =,+ @. Selan%utnya dilakukan fraksinasi mengunaan metode /CC dengan tiga pelarut yaitu etil asetat, aseton, dan butanol hingga didapatkan dua fase. 8raksinasi dilakukan untuk memisahkan komponen senyawa yang ada dalam ekstrak berdasarkan perbedaan kepolarannya. P'-a&aua
Pemantauan '4 dilakukan terhadap ekstrak kental, fraksi etil asetat, fraksi aseton T endapannya, fraksi butanol, sediaan ste0ia seperti alergonF, ste0igrowF, dan %inkochaF dengan menggunakan fase diam silika gel 8 :? dan dengan pengembang etil asetat A metanol A asam asetat (=B+B#. Pemantauan ini bertu%uan untuk menganalisa secara kualitatif adanya suatu senyawa tertentu. Senyawa yang dimaksud yaitu ste0iol glikosida (ste0ioside dan rebaudioside #.
16
(a#
(b#
(c#
(#
(a#
(b#
(c#
(1#
(a#
(b# (C#
17
(c#
(a#
(b#
(c#
($# Gambar J). B
'romatografi lapis tipis ekstrak air daun ste0ia (Stevia rebaudiana #, fraksi etil asetat, fraksi aseton, endapan aseton, fraksi butanol, ste0ioside, alergonF, ste0igrowF dan %inkochaF, fase diam silika gel 8:? dan pengembang etil asetat-metanol-asam asetat (=B+B#. (# . ekstrak air daun ste0ia, . fraksi etil asetat, +. fraksi aseton, ?. endapan aseton, :. ste0ioside, =. fraksi butanol, dengan penampak bercak DSE? !@ (1# . ekstrak air daun ste0ia, . fraksi etil asetat, +. fraksi aseton, ?. endapan aseton, :. ste0ioside, =. fraksi butanol, dengan penampak bercak 41 (C# . alergonF :!@ bH0, . ste0igrowF :!@ bH0, +. %inkochaF :!@ bH0, ?. ste0ioside, :. fraksi butanol, dengan penampak bercak DSE? !@ ($# . alergonF :!@ bH0, . ste0igrowF :!@ bH0, +. %inkochaF :!@ bH0, ?. ste0ioside, :. fraksi butanol, dengan penampak bercak 41 (a# sebelum disemprot penampak bercak dilihat pada O :?nm, (b# sebelum disemprot penampak bercak dilihat pada O +=:nm, (c# setelah menggunakan penampak bercak.
Pengu%ian kualitatif senyawa ste0ioside dilihat dengan menggunakan penampak bercak 4iebermann-1urchard akan terlihat spot berwarna merah kecoklatan setelah disemprotkan dan dibakar. /kstrak air daun ste0ia, fraksi aseton, endapan aseton,
fraksi
butanol
positif
mengandung
senyawa
ste0ioside
karena
menun%ukkan spot yang se%a%ar dengan pembanding yang digunakan, sedangkan pada etil asetat sebenarnya terdapat spot yang se%a%ar hanya sa%a kurang terlihat. Pengu%ian kualitatif dilakukan terhadap beberapa sediaan yaitu (lergonF, Ste0igrowF, 5inkochaF, Sweet 1lack eaF, Sweet Green eaF# dengan menggunakan beberapa konsentrasi yaitu ! @ bH0, ! @ bH0 , +! @ bH0 , ?! @ bH0 , :! @ bH0.
18
(#:?nm
(#+=:nm
(1#:? nm
(1#+=:nm 19
Gambar J). B
'romatografi lapis tipis ste0ioside, alergonF, ste0igrowF, %inkochaF, sweet blackteaF, dan sweet greenteaF, fase diam silika gel 8:? dan pengembang etil asetat-metanol-asam asetat (=B+B#. (# $engan penampak bercak DSE? !@ .lergon konsentrasi !@, .lergon konsentrasi !@ , +. lergon konsentrasi +!@, ?. lergon konsentasi ?!@, :. lergon konsentrasi :!@, =. Ste0ioside, >. 8raksi butanol, 1. Ste0igrow konsentrasi !@, 1. Ste0igrow konsentrasi !@ , 1+. Ste0igrow konsentrasi +!@, 1?. Ste0igrow konsentasi ?!@, 1:. Ste0igrow konsentrasi :!@, =. ste0ioside, >. 8raksi butanol, C. 5inkochaF konsentrasi !@, C. 5inkochaF konsentrasi !@, C+. 5inkochaF konsentrasi +!@, C?. 5inkochaF konsentasi ?!@, C:. 5inkochaF konsentrasi :!@, =. ste0ioside, >. 8raksi butanol, $. Sweet blackteaF konsentrasi !@, $. Sweet blackteaF konsentrasi !@ , $+. Sweet blackteaF konsentrasi +!@, $?. Sweet blackteaF konsentasi ?!@, $:. Sweet blackteaF konsentrasi :!@, =. ste0ioside, >. 8raksi butanol, /. Sweet greenteaF konsentrasi !@, /. Sweet greenteaF konsentrasi !@ , /+. Sweet greenteaF konsentrasi +!@, /?. Sweet greenteaF konsentasi ?!@, /:. Sweet greenteaF konsentrasi :!@, =. ste0ioside, >. 8raksi butanol. (1# dengan penampak bercak 41, (# $engan penampak bercak DSE? !@ .lergon konsentrasi !@, .lergon konsentrasi !@ , +. lergon konsentrasi +!@, ?. lergon konsentasi ?!@, :. lergon konsentrasi :!@, =. Ste0ioside, >. 8raksi butanol, 1. Ste0igrow konsentrasi !@, 1. Ste0igrow konsentrasi !@ , 1+. Ste0igrow konsentrasi +!@, 1?. Ste0igrow konsentasi ?!@, 1:. Ste0igrow konsentrasi :!@, =. ste0ioside, >. 8raksi butanol, C. 5inkochaF konsentrasi !@, C. 5inkochaF konsentrasi !@, C+. 5inkochaF konsentrasi +!@, C?. 5inkochaF
konsentasi ?!@, C:. 5inkochaF
konsentrasi :!@, =. ste0ioside, >. 8raksi butanol, $. Sweet blackteaF konsentrasi !@, $. Sweet blackteaF konsentrasi !@ , $+. Sweet blackteaF konsentrasi +!@, $?. Sweet blackteaF konsentasi ?!@, $:. Sweet blackteaF konsentrasi :!@, =. ste0ioside, >. 8raksi butanol, /. Sweet greenteaF konsentrasi !@, /. Sweet greenteaF konsentrasi !@ , /+. Sweet greenteaF konsentrasi +!@, /?. Sweet greenteaF konsentasi ?!@, /:. Sweet greenteaF konsentrasi :!@, =. ste0ioside, >. 8raksi butanol.
P''&a.a Ka2ar S&'4i1 Gik1+i2a
Penetapan kadar dilakukan terhadap ekstrak air daun ste0ia, fraksi etil asetat, fraksi aseton, endapan aseton, fraksi butanol, alergonF, ste0igrowF, %inkochaF, sweet greenteaF, dan sweet blackteaF menggunakan 'romatografi Cair 'iner%a
20
inggi ('C'# dengan metode
analisis yang sudah
ditentukan
yaitu
digunakannya kolom C<, fase gerak metanol-air (
Ug
Hm4#. 6ntuk preparasi
sampel hal yang dilakukan adalah sampel ditimbang sebanyak : mg. kemudian sampel dilarutkan ke dalam labu takar ! m4 dengan pelarut air p.i hingga tanda batas ('adar sampel men%adi :!! ppm atau :!! UgHm4#.
Pada saat akan melakukan u%i kesesuaian sistem dilakukan tes terlebih dahulu untuk mengecek apakah standar terbaca atau tidak. ernyata seelah di tes standar tidak terbaca, hal ini bisa sa%a ter%adi kemungkinan karena adanya kesalahan pada saat pembacaan kromatogram yang berasal dari instrumennya.
21
KESIMPULAN
$ari hasil penelitian yang telah dilakukan, kesimpulan yang didapat adalah B !8 6%i kualitatif yang dilakukan menun%ukkan adanya ste0iosid dilihat dari f
masing-masing. 8 'adar yang didapat dari ekstrak, fraksi, dan produk belum bisa ditun%ukkan SARAN
Perlu adanya pengulangan DP4C untuk diketahui kadar dari masing- masing sampel
22
23
