MAKALAH ANALIS FARMASI
VALIDASI METODE ANALISA
Oleh : 1. 2. 3. 4. %. 6. $. *. .
NURNUL SUKMA (14144) RINDA SEPTY A (14161) ULYA VINDY (142!6) FRIS"ILLA #LAUDIA (14!$4) MUAL MUALIF IFA ATUL LAILIA(14 LAILIA(1412$ 12$)) &ULI &ULIA ATI 'A 'AHYU NIN NINS SIH (14! (14!% %)) HESTY NUR ISNAINI (14!*1) TRI UTARI (141*3) FE+RIANTO (14!6!)
AKADEMI FARMASI PUTRA INDONESIA MALAN NOVEM+ER 2!16
VALIDASI METODE ANALISA 1. De,--/Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter
tertentu tertentu berdasarkan berdasarkan percobaan percobaan laboratori laboratorium, um, untuk membuktikan membuktikan bahwa parameter parameter tersebut tersebut memenuhi memenuhi persyaratan persyaratan untuk penggunaannya penggunaannya (Harmita, (Harmita, 2004). Validasi lidasi merupakan suatu proses evaluasi kecermatan dan keseksamaan yang dihasilkan oleh suatu prosedur dengan nilai yang dapat diterima. Validasi memastikan bahwa suatu prosedur tertulis memiliki detail yang yang cukup elas. !e"inisi validasi# a. $enu $enuru rutt %& $enk $enkes es ' o.4 o.4*+ *+$ $& &% %+% +%&+ &+- -/ / tent tentan ang g 13 13 adal adalah ah tindakan pembuktian dengan cara yang sesuai bahwa bahan, prosedur, kegiatan, sist sistem em,, perl perlen engka gkapan pan atau atau meka mekanis nisme me dalam dalam produ produks ksii dan dan penga pengawa wasa san n senantiasa mencapai hasil yang diinginkan. b. $enurut % (nternational %tandarts rganiation) -5026 validasi adalah kon" kon"ir irma masi si deng dengan an peme pemeri riks ksaa aan n
dan dan
peny penyed edia iaan an bukt buktii obye obyekt kti" i" bahw bahwaa
persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus yang terpenuhi. c. $enuru $enurutt 7ualit 7uality y 8ssur 8ssurance ance %tandarts %tandarts "or 9orens 9orensic ic !8 :e :esting sting ;abora ;aborator tories ies,, validasi adalah proses dimana prosedur dievaluasi untuk menentukan kemanuran dan keandalan keandalan untuk analisis, analisis, untuk menunukkan menunukkan metode tersebut tersebut cocok untuk tuuan yang dimaksudkan. d. $enu $enuru rutt <%1 <%1, vali valida dasi si meto metode de "dil "dilaku akuka kan n untu untuk k men menam amin in bahw bahwaa meto metode de analisis bersi"at akurat, spesi"ik, reprodusible dan tahan pada kisaran analitik yang akan dianalisis. stilah validasi pertama kali dicetuskan oleh !r. 3ernard :. ;o"tus, !irektur 9ood and !rug 8dministration (9!8) 8merika %erikat pada akhir tahun -50=an, sebagai bagian penting dari upaya untuk meningkatkan mutu produk industri "armasi. Hal ini dilatar belakangi oleh berbagai masalah mutu yang timbul pada saat itu yang mana mana masal masalah ah=m =masa asala lah h ters terseb ebut ut tida tidak k terd terdet eteks eksii dari dari peng pengui uian an ruti rutin n yang yang dilaksanakan oleh industri "armasi yang bersangkutan.
3iasanya validasi digunakan untuk metode analisa yang baru dibuat dan dikembangkan. %edangkan untuk metode yang memang telah tersedia dan baku (misal 88,8%:$) namun metode tersebut baru pertama kali akan digunakan di laboratorium tertentu, biasanya tidak perlu dilakukan validasi namun hanya veri"ikasi. Veri"ikasi adalah kon"irmasi ulang dengan cara mengui suatu metode dengan melengkapi bukti=bukti yang obekti" dan sudah memenuhi persyaratan. 2. Pe0- Vl-/Validasi metode sangat diperlukan karena beberapa alasan yaitu validasi metode merupakan elemen penting dari kontrol kualitas, validasi membantu memberikan aminan bahwa pengukuran akan dapat diandalkan. !alam beberapa bidang, validasi metode adalah persyaratan peraturan. 3. T55 8dapun tuuan validasi metode analisi adalah sebagai berikut# -. Validasi metode analisis bertuuan untuk memastikan dan mengon"irmasikan bahwa metode analisis tersebut sudah sesuai untuk peruntukannya. 2.
%. P7e0e7 Vl-/$enurut <%1 beberapa langkah dalam validasi metode an alisis sebagai berikut# -. 8kurasi (ketepatan) 2. 1resisi *. %elekti"itas (spesi"isitas) 4. ;inearitas dan rentang 6. 3atas deteksi dan batas kuantitasi >. &etangguhan metode 5. &ekuatan metode
AKURASI 1. De,--/8kurasi adalah ukuran yang menunukkan deraat kedekatan hasil analisis
dengan kadar analit yang sebenarnya. 8kurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahakan. 8kurasi merupakan deraat ketepatan antara nilai yang diukur dengan nilai sebenarnya yang diterima (?ray, ->). 8kurasi merupakan kemampuan metode analisa untuk memperoleh nilai benar setelah dilakukan secara berulang. @ika nilai replika analisis semakin dekat dengan sampel yang sebenarnya maka semakin akurat metode tersebut (&han, ->). &esulitan utama dalam evaluasi akurasi adalah "akta bahwa kandungan sesungguhnya analit yang akan diui tidak diketahui. 8kurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. 2. Me08e ;57/8kurasi dapat ditentukan melalui beberapa cara, yaitu# a. $etode simulasi (spiked=placebo recovery) !alam metode ini, seumlah analit bahan murni (senyawa pembanding kimia '$ atau %'$) ditambahkan ke dalam plasebo (semua campuran bahan pembawa sediaan "armasi), lalu campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan dengan kadar analit yang ditambahkan (kadar yang sebenarnya). !alam metode penambahan baku, sampel dianalisis lalu seumlah tertentu analit yang diperiksa ditambahkan ke dalam sampel dicampur dan dianalisis lagi. %elisih kedua hasil dibandigkan dengan kadar yang sebenarnya (hasil yang diharapkan). !alam kedua metode tersebut, persen perolehan kembali dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang diperoleh dengan hasil yang sebenarnya. A perolehan kembali dapat ditentukan dengan cara membuat sampel placebo (eksepien obat, cairan biologis) kemudian ditambah analit dengan konsentrasi tertentu (biasanya /0A = -20A dari kadar analit yang diperkirakan), kemudian dianalisis dengan metode yang akan di validasi (Harmita, 2004). :etapi bila tidak memungkinkan membuat sampel plasebo karena matriksnya tidak diketahui seperti obat=obat an paten, atau karena analitnya berupa suatu
senyawa endogen misalnya metabolit sekunder pada kultur kalus, maka dapat dipakai metode adisi (Harmita, 2004).
b. $etode adisi ( penambahan baku ) 1ada metode penambahan baku, pengukuran blanko tidak diperlukan lagi. $etode ini tidak dapat digunakan ika penambahan analit dapat mengganggu pengukuran, misalnya analit yang ditambahkan menyebabkan kekurangan pereaksi, mengubah pH atau kapasitas dapar. &edua metode tersebut recovery dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang diperoleh dengan hasil yan sebenarnya. 3iasanya persyaratan untuk recovery adalah tidak boleh lebih dari 6A. 1erhitungan perolehan kembali dapat uga ditetapkan dengan rumus sebagai berikut#
(C 1−C 2) A perolehan kembali (recovery) B C 3 - B konsentrasi dari analit dalam campuran contoh C seumlah tertentu analit. 2 B konsentrasi dari analit dalam contoh. * B konsentrasi dari analit yang ditambahkan ke dalam contoh.
iali persen recovery berdasarkan nilai konsentrasi sampel. :abel# Al-0 < 07-;/ /
Re=89e7 -0e7- (>)
-0 D 8 E -00 (A)
/ F -02
- D 8 E -0 (A)
5 F -0*
0,- D 8 E - (A)
6 F -06
0,00- D 8 E 0,- (A)
0 F -05
-00 ppb D 8 E - ppm
/0 F --0
-0 ppb D 8 E -00 ppb
>0 F --6
- ppb D 8 E -0 ppb
40 F -20
3 # recovery adalah persen perolehan kembali
PRESISI (KESEKSAMAAN) 1. De,--/&eseksamaan adalah ukuran yang menunukkan deraat kesesuaian antara hasil
ui individual, diukur melalu penyebaran hasil individual dari rata=rata ika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel=sampel yang diambil dari campuran yang homogeny (Harmita, 2004). &eseksamaan diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relati" (koe"isien variasi). &eseksamaan dapat dinyatakan sebagai keterulangan (repeatability) atau ketertiruan (reproducibility). 'eapitibility (keterulangan) adalah keseksamaan metode ika dilakukan berulang kali oleh analis yang sama pada kondisi sama dalam interval waktu yang pendek. 'epeatibility dinilai melalui pelaksanaan penetapan terpisah lengkap terhadap sampel=sampel identik yang terpisah lengkap terhadap sampel=sampel identik yang terpisah dari batch yang sama, adi memberikan ukuran keseksamaan pada kondisi yang normal. 'eproducibility (ketertiruan) adalah keseksamaan metode ika dikerakan pada kondisi yang berbeda. 3iasanya analisis dilakukan pada laboratorium=laboratorium yang berbeda menggunakan peralatan, pereaksi, pelarut dan analis yang berbeda pula. 8nalisis dilakukan terhadap sampel=sampel yang diduga identik yang dicuplik dari batch yang sama. 'eproducibility dapat uga dilakukan dalam laboratorium yang sama dengan menggunakan peralatan, pereaksi dan analis yang berbeda. &esesuaian dengan H, presisi harus dilakukan pada * tingkatan yang berbeda yaitu# a. &eterulangan yaitu ketepatan ( precision) pada kondisi percobaan yang sama (berulang) baik orangnya, peralatannya, tempatnya maupun waktunya. b. 1resisi antara yaitu ketepatan (precision) pada kondisi percobaan yang berbeda, baik orangnya, peralatannya, tempatnya, maupun waktunya. c. &etertiruan meruuk pada hasil=hasil dari laboratorium yang lain. (?andar dan 'ohman, 200)
1enguian
presisi
pada
saat awal
validasi
metode
seringkali
hanya
menggunakan 2 parameter pertama yaitu keterulangan dan presisi antara. 'eprodusibilitas biasanya dilakukan ketika akan melakukan u banding antar laboratorium (?andar dan 'ohman, 200). $enurut Harmita (200), keterulangan adalah keseksamaan metode ika dilakukan berulang kali oleh analis yang sama pada kondisi sama dan dalam interval waktu yang pendek. &eterulangan dinilai melalui pelaksanaan penetapan terpisah lenglap terhadap sampel=sampel identik yang terpisah dari batch yang sama, adi memberikan ukuran keseksamaan pada kondisi yang normal. %edangkan yang dimaksud ketertiruan adalah keseksamaan metode ika dikerakan pada kondisi yang berbeda. 3iasanya analisis dilakukan dalam laboratorium=laboratorium yang berbeda menggunakan peralatn, pereaksi, pelarut dan analis yang berbeda pula. 8nalis dilakukan terhadap sampel=sampel yang diduga identik yang dicuplik dari batch yang sama. &riteria seksama diberikan ika metode meberikan simpangan baku relati" atau koe"isien variasi 2A atau kurang. 8kan tetapi kriteria ini sangat "leksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, umlah sampel, dan kondisi laboratorium. !itemukan bahwa koe"isien variasi eningkat dengan menurunnya konsentrasi analit. 1ada kadar -A atau lebih, standart deviasi relati" antara laboratorium adalah sekitar 2,6A ada pada satu per seribu adalah AA. 1ada kadar satu per seuta (ppm) '%!nya adalah ->A, dan pada kadar part per billion (ppb) adalah *2A. 1ada metode yang snagat kritis, secara umum diterima bahwa '%! harus lebih dari 2A (Harmita, 2004).
untuk metode keterulangan sebagai berikut# '%! D 2 (-=0,6 log c) G 0,>5
c B konsentrasi analit sebagai "raksi desimal (contoh# 0,-A B 0,00-) (Harmita, 2004). &eseksamaan dapat dihitung dengan cara sebagai berikut# -. Hasil analisis adalah G-, G2, G*, G4,.....................Gn maka simpangan bakunya adalah#
2. *. %impangan baku relati" atau koe"isisen variasi (&V) adalah#
1ercobaan seksama dilakukan terhadap palig sedikit enam replika sample yang diambil dari campuran sampel dengan matriks yang homogen. %ebaiknya keseksamaan ditentukan terhadap sampel sebenarnya yaitu berupa campuran dengan bahan pembawa sediaan "armasi (plasebo) untuk melihat pengaruh matriks pembawa tterhadap keseksamaan ini. !emikian uga harus disiapkan sampel untuk menganalisis pengaruh pengotor dan hasil degradasi terhadap keseksamaan ini (Harmita, 2004). $enurut 8merican 1re=veterinary medical association (81V$8) (2004) tingkat presisi yang sebaiknya dipenuhi berdasarkan konsentrasi analit yang dianalisis dapat dilihat pada tabel dibawah ini# @umlah komponen terukur dalam sampel
:ingkat presisi (y)
I -0,00 A -,00A E G E -0,00 A 0,-0A E G E -,00A E 0,-0A
y E 2A y E 2A y E -0A y E 20A
2. T55 <i presisi dilakukan untuk mengetahui kedekatan atau kesesuaian antara hasil
ui yang satu dengan yang lainnya pada serangkaian penguian presisi hasil pengkuran digambarkan dalam bentuk persentase Relative Standart Deviation (A'%!).
SELEKTIFITAS (SPESIFISITAS) 1. De,--/%elektivitas adalah kemampuan yang hanya mengukur at tertentu saa secara
cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. %elektivitas sering kali dapat dinyatakan sebagai deraat penyimpangan (degree o" bias) metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa seenis, senyawa asing lainnya dan dibandingkan terhadap hasil analis yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan (Harmita, 2004). $etode selektivitas ditentukan dengan membandingkan hasil analisis sampel yang mengandung cemaran, hasil urai, senyawa seenis, senyawa asing lainnya atau pembawa plasebo dengan hasil analisis sampel tanpa penambahan bahan=bahan tadi. 1enyimpangan hasil ika ada merupakan selisih dari hasil ui keduanya (Harmit, 2004). @ika cemaran dan hasil urai tidak dapat diidenti"ikasi atau tidak dapat diperoleh, maka selekti"itas dapat dituukan dengan cara menganalisis sampel yang mengandung cemaran atau hasil ui urai dengan metode yang hendak diui lalu dibandingkan dengan metode lain untuk penguian kemurnian seperti kromatogra"i, analisa kelarutan "ase, dan Differential Scanning Colorimetry. !eraat kesesuaian kedua hasil analisis tersebut merupakan ukuran selekti"itas. 1ada metode analisis yang melibatkan
kromatogra"i,
selektivitas
ditentukan
melalui
perhitungan
daya
resolusinya ('s) (Harmita, 2004). H membagi spesi"isitas dalam 2 kategori, yaitu ui identi"ikasi dan ui spesi"itas ditunukkan dengan kemurnian atau pengkuran.
ditunukkan
dengan
kemampuan
suatu
metode
analisis
untuk
membedakan antar senyawa yang mempunyai struktur molekul hampir sama.
senyawa tersebut biasanya adalah komponen utama atau komponen akti" dan suatu pengotor. @ika dalam suatu ui terdapat suatu oengotor (impurities) maka metode ui harus tidak terpengaruh dengan adanya pengotor ini (?inandar dan 'ohman, 200). 1enentuan spesi"isitas metode dapat diperoleh dengan 2 alan. Pertama (paling diharapkan) adalah dengan melalukan optimasi sehingga diperoleh senyawa yang dituu terpisah secara sempurna dari senyawa=senyawa lain (resolusi senyawa yang dituu I 2). ara kedua, untuk memperoleh spesi"isitas adalah dengan menggunakan detekstor selekti", terutama untuk senyawa=senyawa yang terelusi secara bersama= sama. %ebagai contoh, detektor elektrokimia atau detektor "luoresen hanya akan mendeteksi
senyawa
tertentu, sementara
senyawa
lainnya
tidak
terdeteksi.
1enggunaan detektor
LINEARITAS DAN RENTAN
1. De,--/;inearitas adalah kemampuan metode analisis yang meberikan respon yang
secara langsung atau dengan bantuan trans"ormasi yang baik, prporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. 'entang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima (Harmita,2004). ;inearitas biasanya dinyatakan dalam istilah variansi arah garis regresi yang dihitung berdasarkan persamaan matematik data yang diperolh dari hasil ui analit dalam sampel dengan berbagai konsentrasi analit. 1erlakukan matematik dalam penguian linearitas adalah melalui persamaan garis lurus dengan metode kuadrat terkecil antara hasil analisis terhadap konsentrasi analit. !alam beberapa kasusu, untuk memperoleh hubungan proporsional antara hasil pengukuran dengan konsentrasi analit, data yang diperoleh diolah melalui trans"ormasi matematik dulu sebelum dibuat analisis regresinya (Harmita, 2004). !alam praktek, digunakansatu seri larutan yang berbeda konsentrasiya antara 60 F -60A kadar analit dan sampel. !i dalam pustaka, sering ditemukan rentang konsentrasi yang digunakan antara 0 F 200A. @umlah sampel yang dianalisis sekurang=kurangnya delapan buah sampel blanko. %ebagai parameter adanya hubungan linear digunakan koe"isien korelasi r pada analisis regresi J B a C b. Hubungan linear yang ideal dicapai ika nilai b C 0 dan r B C- atau =- bernatung pada arah garis. %edangkan nilai a menunukkan kepekaan analisis terutama instrumen yang digunakan. 1arameter lain yang harus dihitung adalah simpangan baku residul (%y) (Harmita, 2004).
&eterangan# !imana
K-
B a C bG Sy b
%G0
B
%G0
B standart deviasi dari "ungsi Sx 0 x
VG0
B
V G0
B koe"isien variasi dari "ungsi (Harmita, 2004).
+ATAS DETEKSI DAN +ATAS KUANTITASI
1. De,--/3atas deteksi adalah umlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi
yang masih memberikan respon signi"ikan dibandingkan dengan blanko. 3atas deteksi merupakan parameter ui batas. 3atas kuantitasi merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan eksama (harmita, 2004). 1enentuan batas deteksi suatu metode berbeda=beda tergantung pada metode analisis itu menggunakan instrumen atau tidak. 1ada analisis yang tidak menggunakan instrumen batas tersebut ditsentukan dengan mendeteksi analit dalam sampel pada pengenceran bertingkat. 1ada analisis intrumen batas deteksi dapat dihitung dengan mengukur respon blanko beberapa kali lalu dihitung simpangan baku respon blanko dan "ormula di bawah ini dapat digunakan untuk perhitungan (Harmita, 2004). ara menentukan ;! dan ;7 ada * cara, yaitu# -. %ignal=to=noise 2. 1enentuan blangko *. &urva kalibrasi
!imana# 7 B ;! (batas deteksi) atau ;7 (batas kuantitasi) k B * untuk batas deteksi atau -0 untuk batas kuantitasi %b B simpangan baku respon analitik dari blanko %l B arah garis linear (kepekaan arah) dari kurva antara respon terhadap konsentrasi B slope (b pada persamaan garis yB aG C bG). ( Harmita,2004). 3atas deteksi dan kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui regresi linear dari kurva kalibrasi. ilai pengukuran akan sama dengan nilai b pada persamaan garis
linear y B a CbG, sedangkan simpangan baku blanko sama dengan simpangan baku residual (%y+G). -) 3atas deteksi (7) &arena k B * atau -0 %impangan baku (%b) B %y+G, maka 3 Sy / x 7B S1 2) 3atas kuantitasi (7) 310 Sy / x 7B S1 (Harmita, 2004).
KETANUHAN METODE 1. De,--/&etangguhan metode adalah deraat ketertiruan hasil ui yang diperoleh dari
analisis sampel yang sama dlam berbagai kondisi ui normal, seperti laboratorium, analisis, instrumen, bahan pereaksi, suhu, hari yang berbeda, dll. &etangguhan biasanya dinyatakan sebagai tidak adanya pengaruh perbedaan operasi atau lingkungan kera pada hasil ui. &etangguhan metode merupakan ukuran ketertiruan pada kondisi operasi normal antara lab dan antar analis (Harmita, 2004). &etangguhan metode ditentukan dengan menganalisis beningan suatu lot sampel yang homogen dalam lab yang berbeda oleh analis yang berbeda menggunakan kondisi operasi yang berbeda, dan lingkungan yang berbeda tetapi menggunakan prosedur dan parameter ui yang sama. !eraat ketertiruan hasil ui kemudian ditentukan sebagai "ungsi dari variabel penentuan. &etertiruan dapat dibandingkan terhadap keseksamaan penentuan di bawah kondisi normal utuk mendapatkan ukuran ketangguhan metode. 1erhitungannya dilakukan secara statistik 8V8 (Harmita, 2004).
KEKUATAN METODE 1. De,--/
yang kecil dan terus menerus dan mengevaluasi respon analitik dan e"ek presisi dan akurasi. %ebagai contoh, perubahan yang dibutuhkan untuk menunukkan kekuatan prosedur H1; dapat mencakup (tapi tidak dibatasi) perubahan komposisi organik "ase gerak (-A), pH "ase gerak (L 0,2 unit), dan perubahan temperatur kolom (L2= *o). 1erubahan lainnya dapat dilakukan bila sesuai dengan laboratorium (Harmita, 2004).
PENDEKATAN METODE VALIDASI
8da beberapa pendektan untuk melakukan metode validasi, yaitu # a. $etode speaking buta nol 1endekatan metode speaking buta nol melibatkan analisis tunggal menggunakan suatu metode yang akan divalidasi untuk melakukan analisis suatu sampel yang mengandung level analit tertentu yang sudah diketahui
DAFTAR PUSTAKA h00<:??,7/--5/07-.=8?@< =80e0?52!PAK>2!RI?2.>2!+5;5>2!Vl-/>2!Me08e>2!8;.<,
