Amobilisasi Ragi Dengan Na-Alginat

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

Modul Praktikum

: Amobilisasi Sel Ragi Menggunakan Na-Alginat

Tanggal Praktikum

: 28 Mei 2018 – 2018 – 11 11 Juni 2018

Tanggal Laporan

: 18 Juli 2018

Dosen Pembimbing

: Bevi Lidya, Dra., M.Si., Apt

KELOMPOK 1 2-ANALIS KIMIA Ahya Sularasa

161431001 16143100 1

Anri Dwi Febrianto

161431002 16143100 2

Aprilia Yean Wisaka

161431005

Auliya Rahmawati

161431006 16143100 6

Bella Cika Sabila

161431007 16143100 7

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI DAN BIOPROSES JURUSAN TEKNIK KIMIA POLITEKNIK NEGERI BANDUNG 2018

A.

B.

Tujuan -

Dapat melakukan amobilisasi pada sel Saccharomyses cerevisiae

-

Dapat melakukan fermentasi alcohol dari glukosa menggunakan sel amobil

-

Membandingkan hasil fermentasi alcohol dengan sel amobil dan sel bebas

Dasar Teori Sel amobil adalah sel yang terikat secara fisik atau terlokalisasi pada suatu

tempat tertentu yang masih mempunyai aktifitas katalitik dan dapat digunakan untuk pemakaian berulang-ulang dan kontinu. Proses ini dapat dilakukan dengan cara mengikatkan sel pada suatu bahan tertentu melalui pengikatan kimiawi dengan menahannya secara fisik dalam suatu rongga/ruang bahan atau dengan cara gabungan keduanya. Teknologi amobilisasi memegang peranan penting dalam perkembangan proses biokimia dalam suatu bioreaktor. Sel yang mengalami immobilisasi (immoblized mivrobial cells) telah banyak diterapkan dalam fermentasi misalnya produksi alkohol, asam amino, antibiotik atau pada degradasi polutan limbah cair. Immobilisasi sel adalah suatu proses untuk menghentikan pergerakan dari molekul sel atau enzim dengan menahannya pada suatu matriks. Kelebihan amobilisasi sel dibandingkan dengan sel bebas (free cells) : 1. Melindungi sel dari kondisi buruk lingkungan sekitar (suhu, pH, pelarut organik, racun). 2. Proses separasi menjadi lebih mudah dan cepat. 3. Meningkatkan produktifitas sel karena dapat digunakan berulang kali 4. Memudahkan pemisahan antara sel dengan produk. 5. Dapat melakukan reaksi beruntun (sinergis) karena adanya multienzim. 6. Adanya zat pendukung , dapat menahan organism dalam bioreactor sehingga laju reaksi dapat ditingkatkan.

Bioteknologi - Amobilisasi sel ragi dengan Na-Alginat – Kelompok 1

Page 2

7. Sel mikroba mampu meregenerasi kofaktor yang penting bagi reaksi biosintesis. 8. Biaya untuk perancangan /pembuatan bioreactor dapat dikurangi. Kerugian amobilisasi sel dibandingkan dengan sel b ebas (free cells) : 1. Sel mengandung sejumlah besar enzim sehingga memungkinkan mengkatalisis reaksi samping yang tak dikehendaki 2. Amobilisasi sel yang sedang tumbuh, memungkinkan produk yang diperoleh sedikit 3. Amobilisasi sel yang sedang tumbuh memungkinkan adanya rintangan pada ruang yang kosong diantara partikel sehingga aliran substrat tertahan. Teknik amobilisasi terdiri atas beberapa prinsip, menurut Bickerstraff (1997) terdapat 5 prinsip amobilisasi sel atau enzim yaitu : 

Metoda Ikatan antar Polimer (cross-linking ). Dinding sel mikroba yang mengandung gugus amin bebas dan gugus

karboksil dapat berikatan silang dengan senyawa seperti glutaraldehid atau toluene diisosianat. Sel mikroba juga dapat diamobilisasi melalui ikatan ion dengan senyawa polielektrolit. Metoda amobilisasi dengan cara ini jarang dilakukan untuk sel. Dalam penggunaan untuk amobilisasi sel, metoda ini biasanya dikombinasikan dengan metoda penjerapan (entrapment ) untuk stabilisasi proses amobilisasi. Metoda ini diterapkan untuk amobilisasi sel mikroba, tumbuhan maupun enzim. 

Metoda Kopolimerisasi (copolymerization). Metoda ini merupakan metoda pengembangan dari metoda ikatan antar

polimer (cross-linking ). Pada saat proses amobilisasi biasanya ditambahkan senyawa yang berfungsi sebagai “ spacer ” seperti gelatin, albumin, polietilenimin ke dalam suspensi sel yang akan diamobilisasi. Selanjutnya suspensi sel ini diamobilisasi dengan metoda ikatan antar polimer. Prosedur ini akan membuat sel terperangkap pada suatu jaring kovalen. Metoda ini banyak menyebabkan kematian sel, akan tetapi pada beberapa aplikasi metoda ini dapat digunakan


Page 3

(Brodelius, 1987). Sama halnya dengan metoda ikatan antar polimer, metoda ini juga banyak digunakan dalam amobilisasi sel tumbuhan, sel mikroba dan enzim. 

Metoda Ikatan Kovalen.

Metoda ini dilakukan dengan cara menggunakan sistem dimana sel dapat terikat secara kovalen dengan gugus reaktif dari suatu matrik, atau sel terikat pada suatu senyawa perantara yang menghubungkan sel dengan matriknya. Contohnya matrik selulosa dapat dikombinasi dengan glutaraldehid sebagai senyawa perantara. Senyawa perantara ini sebagian besar bersifat toksik sehingga dapat merusak sel (Brodelius, 1987). Digunakan untuk amobilisasi semua jenis sel (tumbuhan, mikroba) dan enzim. 

Metoda Adsorpsi Metoda ini didasarkan kepada afinitas mikroba terhadap suatu permukaan

padat. Fenomena ini dapat terjadi secara alami. Misalnya, mikroba yang terikat pada butiran pasir, partikel tanah, permukaan gigi, permukaan logam dan permukaan senyawa polivinilklorida. Kekuatan afinitas mikroba terhadap suatu permukaan padat tergantung pada jenis mikroba. Reaksi yang terjadi antara permukaan padat dengan sel adalah interaksi elektrostatik. Beberapa jenis bahan yang telah digunakan untuk amobilisasi sel dengan cara ini adalah selulosa, lektin, polivinilklorida (Brodelius, 1987). Metoda ini banyak diaplikasikan untuk amobilisasi sel mikroba. 

Metoda Penjerapan (entrapment ). Pada metode entrapping, imobilisasi, enzim/sel didasarkan pada penempatan

enzim di dalam kisi dari suatu polimer atau di dalam membran yang bersifat semi permiabel. Bila enzim ditempatkan dalam kisi, maka metode yang digolongkan adalah jenis kisi, sedang bila ditempatkan dalam membran yang bersifat semipermiabel, maka metodenya digolongkan ke dalam jenis mikrokapsul (Chibata, 1978).


Page 4

C.

Alat dan Bahan

Alat

Bahan

-

Cawan petri

- Na-alginat

-

Pipet tetes

-

CaCl2 0,1 M

-

Pipet ukur 1 ml, 5 ml

-

Stock culture

-

Gelas ukur 100 ml

-

Gelas kimia 50 ml, 100 ml

-

GYEA

-

Erlenmeyer 250 ml, 500 ml

-

GYEB

-

Spirtus

-

0,1% Tween 80

-

Jarum ose

- NaCl 0,9% (b/v)

-

Shaker incubator

-

Alkohol

-

Fermentor

-

Aquadest

-

Sentifuge

-

Syringe

Saccharomyses cerevisiae

- Neraca Analitik -

Spatula

-

Kertas timbang

-

Hot Plate

-

Magnetik Stirrer

-

Autoklaf

-

Batang pengaduk

-

Labu takar 50 ml/100 ml

** Catatan : Alat dan bahan yang digunakan dalam keadaan steril begitupun dengan lingkungan tempat bekerja.


Page 5

D.

Cara Kerja 1. Produksi miselia ragi Saccharomyses cerevisiae

Menumbuhkan ragi dalam cawan petri yang berisi GYEA

Inkubasi pada suhu dan waktu optimumnya

Memasukkan spora ke dalam 50 ml air steril yang mengandung 0,1 % Tween 80

Aduk hingga membentuk suspensi

Ambil 1 ml suspensi ke dalam erlenmeyer 500 ml yang berisi 49 ml medium cair

Inkubasi pada suhu dan waktu optimumnya (150 rpm)

Sentifuge selama 10 menit (10000 rpm)

Cuci dengan larutan NaCl 0,9%

Sel siap untuk diamobilisasi


Page 6

2. Pembuatan larutan Na-alginat 2 % (w/w)

Menimbang 2,00 gram Na-alginat

Larutkan dengan 100 ml aquadest

Panaskan pada suhu 70oC selama 15 menit hingga membentuk gel

Dinginkan hingga mencapai suhu 40oC

3. Pembuatan larutan standar glukosa dan etanol

Membuat larutan standar glukosa dan etanol 2%, 4%, 6%, 8% dan 10%

Ukur % brix (untuk glukosa) dan indeks bias (untuk etanol)

Membuat kurva kalibrasi glukosa dan etanol


Page 7

4. Amobilisasi sel dalam Na-alginat

Memasukkan 1,5 gram miselium ke dalam gelas kimia 100 ml yang telah berisi 3 ml Na-alginat 2%

Aduk perlahan hingga homogen

Masukkan campuran ke dalam syringe

Teteskan ke dalam labu erlenmeyer yang berisi 100 m l CaCl2 0,1 M pada suhu ruang

Terbentuk butiran-butiran (beads)

Biarkan beads semalam pada suhu 4oC

Cuci dengan NaCl 0,9%


Page 8

5. Fermentasi alcohol dari glukosa

Melakukan fermentasi alkohol dari glukosa dengan sel ragi teramobil

Ukur % brix dan indeks bias selama 10 menit sekali

Melakukan fermentasi alkohol dari glukosa dengan sel ragi bebas

Ukur % brix dan indeks bias selama 10 menit sekali

Hitung kenaikan jumlah produk dan penurunan jumlah substrat berdasarkan kurva kalibrasi glukosa dan etanol yang telah dibuat

Membandingkan hasil fermentasi dengan sel amobil dan sel bebas

E.

Keselamatan Kerja Mengingat bahaya serta sifat bahan biologis yang digunakan , maka untuk

keselamatan kerja perlu diperhatikan hal-hal berikut : -

Praktikan wajib mengenakan alat keselamatan kerja

(lab-jas, masker,

penutup kepala, dan sarung tangan. Hal ini dilakukan agar mikroba yang akan dibiakkan tidak terhirup.


Page 9

-

Memperlakukan kultur mikroba dengan hati-hati. Teknik aseptic harus dilakukan dengan benar sehingga tidak terjadi kontaminasi, khususnya jika mikroba yang digunakan bersifat pathogen.

-

Menggunakan alat pembakar spirtus dengan hati-hati untuk menghindari terjadinya kebakaran.

-

Sebelum praktikum dimulai, praktikan sangat disarankan sarapan dan minum susu terlebih dahulu.

F.

Data Pengamatan a. Pembuatan kurva standar glukosa dan etanol Standar glukosa : Konsentrasi Glukosa

% Brix

2%

1,6 %

4%

3,1 %

6%

4,1 %

8%

5,8 %

10 %

6,9 %

Konsentrasi Etanol

Indeks Bias

2%

1,3332

4%

1,3345

6%

1,3353

8%

1,3360

10 %

1,3364

Standar etanol :


Page 10

b. Pengukuran hasil fermentasi Dengan sel amobil : Waktu

Indeks Bias

% Brix

T1

1,3365

2,4

T2

1,3357

2,0

T3

1,3360

2,1

T4

1,3356

1,7

T5

1,3348

1,3

T6

1,3351

1,4

T7

1,3348

1,3

T8

1,3356

1,7

T9

1,3356

1,7

T10

1,3355

1,8

Waktu

Indeks Bias

% Brix

T1

1,3360

2,3

T2

1,3365

2,4

T3

1,3364

2,3

T4

1,3363

2,2

T5

1,3357

2,0

T6

1,3353

1,7

T7

1,3351

1,6

T8

1,3355

1,7

T9

1,3358

2,1

T10

1,3362

2,2

Dengan sel bebas :


Page 11

G.

Pengolahan Data

Kurva Kalibrasi Glukosa 8.0%

y = 0.665x + 0.0031 R² = 0.9949

7.0% 6.0% 5.0%

x i r B 4.0% %

3.0% 2.0% 1.0% 0.0% 0%

2%

4%

6%

8%

10%

12%

Konsentrasi Glukosa

Kurva Kalibrasi Etanol 13.3700

y = 0.395x + 13.327 R² = 0.959

13.3650 13.3600 s a i 13.3550 B s k 13.3500 e d 13.3450 n I

13.3400 13.3350 13.3300 0%

2%

4%

6%

8%

10%

12%

Konsentrasi Etanol

a. Perhitungan kadar glukosa selama proses fermentasi : Persamaan kurva : y = 0,665x + 0,003 % brix pada t tertentu

= sebagai y

Konsentrasi glukosa pada t tertentu

= sebagai x, maka :


Page 12

X=

y – 0,003 0,665

b. Perhitungan kadar etanol selama proses fermentasi : Persamaan kurva : y = 0,395x + 13,32 Indeks bias pada t tertentu

= sebagai y

Konsentrasi etanol pada t tertentu

= sebagai x, maka :

X=

y – 13,32 0,395

c. Konsentrasi glukosa dan etanol selama proses fermentasi Dengan sel amobil : Waktu

Konsentrasi Glukosa

Konsentrasi Etanol

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10

3.6045 3.0030 3.1534 2.5519 1.9504 2.1008 1.9504 2.5519 2.5519 2.7023

0.1139 0.0937 0.1013 0.0911 0.0709 0.0785 0.0709 0.0911 0.0911 0.0886


Page 13

Konsentrasi Glukosa dan Etanol selama proses fermentasi (Sel Amobil) 3.5000 ) 3.0000 % ( i 2.5000 s a r 2.0000 t n e 1.5000 s n o 1.0000 K

C Glukosa (%) C Etanol (%)

0.5000 0.0000 0

2

4

6

8

10

12

Waktu

Dengan sel bebas : Waktu

Konsentrasi Glukosa

Konsentrasi Etanol

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10

3.4541 3.6045 3.4541 3.3038 3.0030 2.5519 2.4015 2.5519 3.1534 3.3038

0.1013 0.1139 0.1114 0.1089 0.0937 0.0835 0.0785 0.0886 0.0962 0.1063


Page 14

Konsentrasi Glukosa dan Etanol selama proses fermentasi (Sel Bebas) 3.5000 ) 3.0000 % ( i 2.5000 s a r 2.0000 t n e 1.5000 s n o 1.0000 K

C Glukosa (%) C Etanol (%)

0.5000 0.0000 0

2

4

6

8

10

12

Waktu

H.

Pembahasan Pada praktikum ini, dilakukan fermentasi glukosa menjadi alkohol menggunakan

ragi Saccharomyces cerevisae. Adapun sel ragi yang digunakan dalam proses fermentasi adalah sel amobil dan sel bebas. Hal ini dilakukan agar dapat membandingkan hasil fermentasi dengan sel amobil dan sel bebas sehingga dapat memutuskan metode mana yang lebih baik. Sel ragi yang akan diamobilisasi ditumbuhkan dahulu pada cawan petri berisi media GYEA yang disimpan dalam inkubator sampai menghasilkan spora yang cukup banyak (pada waktu dan suhu optimumnya). Kemudian ditumbuhkan dalam media cair GYEB yang ditambah 0.1% tween 80 dalam inkubator shaker sehingga membentuk miselia. Proses amobilisasi dilakukan dengan metode penjeratan secara fisik dalam membran semi permeable. Matriks pendukung yang bisa digunakan salah satunya yaitu jenis polimer porous yaitu alginate, dan yang digunakan dalam praktikum ini adalah Naalginat. Proses amobilisasi ini dilakukan denganmencampurkan suspensi ragi dengan


Page 15

Na-alginat yang telah dibuat. Campuran yang telah dihomogenkan ini dimasukkan ke dalam syringe untuk dibentuk menjadi butiran-butiran (beads). Pembentukan beads ini akan terjadi saat campuran dijatuhkan atau terkena kontak dengan larutan CaCl2. Reaksi yang terjadi saat pembentukan beads adalah : 2Na-alginat + CaCl2  Ca-alginat + 2NaCl Ketika natrium alginat dilarutkan dalam kalsium klorida, maka akan terbentuk gel kalsium alginat yang tidak larut dalam air. Ikatan antara kalsium dengan alginat adalah ikatan khelat (antara kalsium dengan rantai L-guluronat dari alginat). Karena ikatan inilah beads akan terbentuk dengan sendirinya. Hasil beads diharapkan berbentuk bulat sempurna dengan ukuran yang sama tiap beadsnya. Maka dari itu, diperlukan ketilitian dan ketelatenan saat membuat beads menggunakan syringe ini. Hasil beads ini disimpan selama satu malam pada suhu 4oC dalam keadaan masih terendam dalam larutan CaCl2. Setelah beads dibilas menggunakan larutan NaCl 0.9 %, beads ini siap digunakan untuk fermentasi alkohol. Setiap proses atau langkah dilakukan secara aseptik dan juga menggunakan alat yang steril untuk menghindari masuknya kontaminan. Fermentasi alkohol dari glukosa dilakukan dengan bantuan fermentor. Setiap 10 menit sekali, hasil fermentasi disampling untuk diukur % brix dan indeks biasnya. Hal ini dilakukan untuk mengetahui seberapa banyak kenaikan jumlah produk dan penurunan jumlah substrat. Nilai ini bisa diperoleh dengan menginterpolasikannya ke dalam kurva kalibrasi. Maka dari itu dibuatlah deret standar glukosa dan etanol dengan konsentrasi 2%, 4%, 6%, 8%, dan 10%. Deret standar ini diukur % brix nya (untuk glukosa) dan indeks biasnya (untuk alkohol). Fermentasi dengan sel bebas dilakukan persis seperti fermentasi sebelumnya dengan sel amobil, hanya saja sel yang digunakan untuk memfermentasi alcohol tidak melalui tahap amobilisasi terlebih dahulu. Persamaan kurva kalibrasi glukosa yaitu y =


Page 16

0,665x + 0,003 (R 2 = 0,994) sedangkan persamaan kurva kalibrasi etanol yaitu y = 0,395x + 13,32 (R 2 = 0,959). Hasil percobaan menunjukkan bahwa baik fermentasi menggunakan sel amobil dan sel bebas menunjukkan penurunan konsentrasi substrat (glukosa) seiring dengan berjalannya waktu. Sebaliknya, konsentrasi etanol yang dihasilkan dari proses fermentasi meningkat seiring dengan berjalannya waktu. Namun, kenaikan jumlah produk dan penurunan jumlah substrat ini tak stabil, karena diakhir pengukuran justru menunjukkan hasil yang sebaliknya. Kondisi ini cenderung sama antara fermentasi dengan sel amobil dan sel bebas. Tapi, hasil produk alcohol menggunakan sel bebas menunjukkan nilai yang lebih tinggi (pada T10) yaitu 0,1063 daripada fermentasi dengan sel amobil yaitu 0,0886. Meski begitu, fermentasi dengan sel amobil memiliki kelebihan yang tidak dimiliki oleh fermentasi dengan sel bebas, yaitu sel dapat digunakan berulang-ulang.

I.

Kesimpulan Proses fermentasi alcohol dari glukosa menggunakan sel bebas Saccharomyses

cerevisiae selama 100 menit menghasilkan etanol dengan konsentrasi yang lebih tinggi yaitu 0.1063 % daripada sel amobil yaitu 0.0886 %.


Page 17

Daftar Pustaka

Chibata, I. 1978. Immobilized Enzymes. Research and Development, Kodansha Ltd., Tokyo Kennedy, J.F., 1995. Principles of Immobilization of Enzymes. London, UK : Elis Hardwood Kierstan MPJ, Cough D MP. 1985. Immobilisation of Cells and Enzymes by Gel Entrapment. Oxford : IRL Press.


Page 18

Amobilisasi Ragi Dengan Na-Alginat

Recommend Documents