AISLAMIENTO DEL DNA DE ORIGEN VEGETAL Y SU CARACTERIZACIÓN ESPECTOFOTÓMETRICA. HIDRÓLISIS DE RNA Y DNA E IDENTIFICACIÓN DE BASES PÚRICAS Y PIRIMÍDICAS POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA.
GASTALDI ARAIZA BRENDA MERCADO URIOSTEGUI ALAN JOEL
3FM2
SECCIÓN: TRES
INTRODUCCIÓN El DNA celular es el que contiene la información genética que asegura que los organismos o células puedan “duplicarse” dando lugar a otros iguales (1). La función principal del DNA es como almacenamiento de la información genética completa, la biosíntesis ordenada de los componentes de las células y los tejidos y, finalmente, en definir la individualidad de un organismo dado (2). El RNA es el resultado de la copia o transcripción del DNA genómico que sirve como molde; químicamente la estructura del RNA y DNA es la misma, ya que ambas contienen cuatro tipos de nucleótidos unidos por enlaces fosfodiéster en dirección 3´-5´ (3). Sin embargo, hay dos diferencias principales que diferencian el DNA del RNA: la primera, El azúcar constituido del DNA es la desoxirribosa, en tanto que el RNA contiene ribosa, que a su vez contiene un grupo hidroxilo (-OH) adicional; la segunda, el RNA no contiene la base nucleotídica Timina, en su lugar contiene Uracilo (3). OBJETIVOS
Obtener DNA a partir de manzana. Purificar y caracterizar DNA de manzana. Separar las bases nitrogenadas del DNA y RNA por cromatografía en capa fina.
Parte A= Aislamiento de DNA Parte B= Hidrólisis de DNA y RNA e identificación identificación por cromatografía cromatografía ANÁLISIS DE LA TÉCNICA PARTE A Aislamiento de de DNA de manzana. manzana.
de los núcleos de las células para la obtención de las fibras de cromatina. Después se adicionó amilasa con el fin de purificar el DNA de polisacáridos, se mezcló e incubó a temperatura ambiente. Se le adicionó una solución saturada de NaCl y 5mL de SDS 10% el cual es un detergente que separó las proteínas del DNA. Posteriormente se filtró y recupero en un tubo falcon, se adicionó cloroformo: alcohol isoamílico como disolventes. Se centrifugó a 4000 rpm para separar el DNA (sobrenadante) de material fibroso y proteínas. Finalmente al sobrenadante se le adicionó alcohol 96° frío para la precipitación del DNA, este último haciéndose visible como una sustancia filiforme. Posteriormente se trató de recuperar el DNA, intentando no manipularlo demasiado. Esto es con el fin de evitar romper el DNA y liberar las bases nitrogenadas al medio, reduciendo así la concentración de DNA puro obtenido. Posteriormente a esto se introdujo el DNA extraído en un tupo con una solución de citrato salina diluida, la cual empleamos para lavar el DNA debido a que es una manera de eliminar impurezas. Al final, se midió el espectro de absorción del DNA, el cual es necesario para hacer los cálculos correspondientes en el apartado de resultados. RESULTADOS Parte A Gráfica y cálculos en el anexo Parte B
Se colocaron 15g de manzana en un mortero, se le adicionó 5 mL de Tris/EDTA/NaCl en la cual el Tris es un regulador de pH ocupado para la lisis celular manteniendo el pH estable, mientras el EDTA se unió a cationes como el Ca 2+ para la desestabilización ce la membrana celular y con el NaCl se consiguió el estallido Imagen 1.- Placa Cromatografíca Revelada
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Parte B Tabla 1.- Rf del cromatograma Bases Nitrogenadas Timina Uracilo Citosina Adenina
Carril
Rf´s
1 2 3 4
0.58 0.63 0.25 0.33
Guanina ADN (Pooc) ARN (Pooc)
5 6 7
0.21 0.59 0.62
DISCUSIÓN DE RESULTADOS Parte A El espectro de absorbencia UV del DNA puro tiene un máximo de absorción a una longitud de onda de 260 nm correspondiente a los ácidos nucleicos y una baja a 230nm la cual corresponde al enlace peptídico (4), en la gráfica obtenida (ver anexo) anexo) el comportamiento es diferente ya que la absorbancia obtenida en 230nm fue de 1.148 un valor valor mayor a la de 0.623 0.623 correspondiente a 260nm lo que indica la presencia de proteínas en el DNA de manzana y se corroboró con el valor obtenido de pureza de 1.14 (ver anexo). Para el cálculo de la concentración se utilizaron tres métodos (ver anexo). El primero se basó en el uso del nomograma siendo un método no muy exacto ya que depende del trazo que se realizó y la escala del nomograma, pero es un método eficiente si se necesita un resultado rápido o un indicio de cómo se va trabajando, con este método se obtuvo la mayor concentración que fue de 0.2 mg/ml. El método dos es el resultado de muchas pruebas de concentración de DNA siendo el más exacto de los tres aunque no tan rápido como el primero, con este método se obtuvo la concentración más baja que fue 2.7615x10-4 mg/ml. El método tres es una relación en cuanto a la absorbencia de DNA puro (1) con la absorbancia obtenida experimentalmente, tomando en
En nuestro caso, nuestra placa no se revelo como se tenía previsto, ya que las manchas corrieron de una manera inadecuada como se puede apreciar en la placa de la derecha de la imagen (ver imagen 1). La placa de la izquierda corrió de mejor manera, ya que se puede apreciar las 4 manchas que son las importantes en la práctica, la de Timina, Uracilo, DNA y RNA. Al revisar la literatura, encontramos que el DNA y el RNA contienen las mismas 3 bases nitrogenadas (Adenina, citosina, Guanina) (2). Estructuralmente, la principal diferencia, en cuanto a su composición química se refiere, el DNA contiene Timina, mientras que el RNA contiene Uracilo (3), por éste motivo es que las manchas que se pueden apreciar en la placa cromatográfica de la izquierda (ver imagen 1) nos ayudan a visualizar que efectivamente el RNA contiene Uracilo y no Timina, ya que ésta última no se encuentra a la misma altura que la mancha de RNA; y, en el caso del DNA, también podemos confirmar que el DNA contiene Timina en su estructura y no Uracilo, ya que Timina fue la que corrió al mismo nivel que la mancha de DNA (3).
CONCLUSIONES
Obtuvimos DNA de origen vegetal (manzana) con una pureza de 1.14 y una concentración de 2.7615x10-4 mg/ml La Timina sólo se encuentra en el DNA y el Uracilo sólo se encuentra en el RNA.
REFERENCIAS 1. Silvia Quesada Mora (2007). Manual de experimentos de laboratorio para bioquímica.
Editorial EUNED. Páginas 50 – 56. 2. Antonio Peña (2013) Qué es el metabolismo. Editorial Fondo de cultura Económica. Páginas 230 – 235. 3. Jiménez García L.F, Merchant Larios H. (2003). Biología celular y molecular. Editorial PEARSON EDUCATION, México. Páginas 22 – 28.
