AISLAMIENTO BACTERIANO EN MEDIO SÓLIDO Y POR DILUCIONES Fecha: 28/10/2014
RESUMEN En el presente práctico se sembraron y aislaron bacterias, lo cual consiste en obtener colonias, es decir, conjunto de células bacterianas ue se han ori!inado desde una sola célula" #as celulas con las ue se trabajaron $ueron E"coli, %"aureus, &"pneumoniae" #os medios a utili'ar $ueron medio a!ar nutriti(o y medio )c*on+ey" ara aislar bacterias se usaron 2 técnicas, una de ellas $ue el plaueo en medio s-lido. E"coli y %"aureus $ueron plaueadas en medio a!ar nutriti(o mediante técnicas por a!otamiento, siembra masi(a y técnica libre, ademas estas dos bacterias $ueron sembradas por a!otamiento en medio )c*on+ey" #a se!unda técnica usada $ue por diluci-n, en la cual se hicieron 8 diluciones 101, 10 2, 10 ,104,103,10,105,y 108, las cuales se !eneraron a partir de 100 6l de me'cla de las bacterias anteriormente mencionadas en 700 6l de a!ua destilada" e estas diluciones 104,103,10 $ueron sembradas en medio )c*on+ey con rastrillo de (idrio" or otro lado, las 8 diluciones $ueron sembradas por el método de la micro!ota" ado ue los medios proporcionan los nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano, las bacterias ue crecen en cada uno de ellos depende de su metabolismo" En a!ar nutriti(o crecieron todas las bacterias sembradas, mientras ue en )c*on+ey crecen s-lo bacterias ne!ati(as y las ue son capaces de $ermentar lactosa" #a siembra por diluci-n proporciona una !ran ayuda a la hora de contabili'ar bacterias" or el método de la micro!ota podemos obtener las unidades $ormadoras de colonias, en este práctico se detemin- ue el n9mero corresponda a ;;;;;;
OBJETIVOS 1" etermin eterminar ar cuál de las técnicas técnicas utili'ada utili'adas s para separar separar colonias colonias sin diluir diluir $ue más e$ecti(a" e$ecti(a" 2" etermin eterminar ar cuáles cuáles $ueron $ueron las bacteri bacterias as ue creciero crecieron n en cada uno uno de los culti( culti(os" os" " etermin eterminar ar las unidades unidades $ormad $ormadoras oras de colonias colonias a partir partir del método método de de la micro!ota micro!ota y por plaueo de diluciones 104, 103, 10"
INTRODUCCIÓN Es de !ran utilidad obtener colonias aisladas de bacterias para el estudio de estas" E
=tra $orma de tener colonias mas separadas son por el método de diluciones, el cual consiste en;;;;; El método de la micro!ota consiste en;;;;;;;;;
E
acterias de $ácil manipulaci-n pueden ser;;;;
ara la siembra masi(a se esterili'- el asa de ar!olla y se tom- una muestra de la me'cla de bacterias mencionadas" El asa se ubic- en el e
MATERIALES Y METODOLOGÍA iluci-n de culti(os %eparaci-n de colonias %e tom- una muestra de Escherichia coli ? %taphylococcus aureus con el asa circular y se reali'- sembrado por técnicas distintas en medio a!ar nutriti(o y una técnica en medio )c*on+ey" #as técnicas a utili'ar en medio a!ar $ueron: siembra por a!otamiento, siembra masi(a, y técnica libre, mientras ue para medio )c*on+ey s-lo se reali'siembra por a!otamiento" ara la siembra por a!otamiento, se tomuna muestra con el asa de ar!olla y se esterili'- lle(ándola al rojo, lue!o se puso en un área peri$érica de la placa etri y se hicieron mo(imientos circulares para homo!enei'ar el in-culo, se procedi- a reali'ar estras hori'ontales hasta la tercera parte de la placa, lue!o se procedi- a !irar la placa etri en 70o" el asa se (ol(i- a esterili'ar y se repiti- el procedimiento anterior"
En 8 tubos Eppendor$ se a!re!aron 700 6l de a!ua destilada, lue!o se tomaron 100 6l de la muestra a anali'ar, la cual contena E"coli ? %"aureus ? &"pnuemoniae y se a!re!aron al tubo 1" el tubo 1 se tomaron 100 6l de la muestra diluida y se a!re!aron al tubo 2, lue!o del tubo 2 se tomaron 100 6l de la muestra y se depositaron en el tubo , el procedimiento se reali'- sucesi(amente hasta el tubo 8" %iembra con rastrillo *on una micropipeta se tomaron 100 6l de la me'cla del tubo 4, es decir, con una diluci-n 104, y se a!re!- en el medio de una placa con medio de culti(o )c*on+ey y se esparcipor toda la placa con un rastrillo de (idrio esterili'ado anteriormente" ara esterili'ar el rastrillo se puso en etanol y lue!o se lle(- a la llama directa del mechero, se esper- a ue se en$riara y se utili'-" %iembra por micro!ota
%e tomaron dos placas con medio a!ar y se di(idieron en 8 se!mentos i!uales" En el se!mento 1 se pusieron 2 !otas de 3 6l de muestra de la diluci-n 101, en el se!mento 2 se pusieron 2 !otas de 3 6l de muestra de la diluci-n 102, este procedimiento se repitihasta poner en el se!mento 8, 2 !otas de 3 6l de muestra de la diluci-n 10 8" En la se!unda placa se reali'- una réplica de lo antes mencionado" #as placas se sellaron con para$ilm y se incubaron por 24 hrs a o*"
or otro lado, se pueden obser(ar lneas de color ca$é claro, las cuales corresponden a colonias ue no se pudieron separar lo bastante como para (erse unidades"
@odos los procedimientos anteriormente mencionados se reali'aron bajo el mechero de >unsen para ase!urar esterilidad" Figura 2: Siembra de E.coli+ S.aureus por siembra masiva
RESULTADOS #ue!o de reali'ar la separaci-n por colonias y poner las colonias en incubaci-n, los resultados $ueron los si!uientes
En la $i!ura 2 se aprecia la aparici-n de mayor cantidad de colonias ue en la $i!ura 1" #as colonias se encuentran bastante separadas a lo lar!o de la placa etri" #as colonias nue(amente son de color amarillo circulares" %e obser(an colonias un poco más !randes ue otras, pero en !eneral se parecen mucho" Aue(amente se obser(an colonias de color ca$é claro como unidades no separadas"
Figura 1: Siembra de E.coli+ S.aureus por agotamiento
En la $i!ura 1 se obser(a la aparici-n de 17 colonias apro
Figura 3: Siembra de E.coli+ S.aureus por técnica libre
En la placa se observan colonias no tan dispersas como en las fguras 1 y 2. La orma que tienen estas colonias son circulares de colores amarillos. Nuevamente observamos colonias de color caé claro muy juntas unas con otras.
Figura 5: siembra con rastrillo de 100 µl de la dilución 10-4 de bacterias E.coli+
Figura 3: Siembra de E.coli+ S.aureus por agotamiento en medio +c,on-ey.
En la fgura % observamos la aparici&n de 42' colonias rosadas con orma circular. Las colonias se encuentran bastante alejadas entre ellas. Estas colonias en general son m(s grandes que las que se pueden apreciar en agar.
En la fgura 4 observamos colonias de color rosado con un tama!o mayor que las que se pueden apreciar en las que contienen agar. Las colonias presentadas se encuentran muy cercanas en el lado derec"o y luego terminan mas dispersas en el e#tremo superior derec"o. Luego de reali$ar las diluciones podemos observar los siguientes resultados
Figura ": Siembra de dilución 10-5 de S.aureus+ En la bacterias fgura )E.coli+ se aprecian ')*
colonias las cuales son de color rosado y circulares. En general estas se encuentran bastante alejadas unas de otras.
0e aprecia que en la secci&n 1 aparecieron ' colonias en la secci&n 2 "ay 4 en la ' se observan ' colonias en la secci&n 4 y % se aprecian 2 colonias mientras que en la secci&n ) se aprecian ) colonias en la ' colonias y fnalmente en la solo apreciamos 1 colonia.
Figura #: Siembra de dilución 10-" de bacterias E.coli+ S.aureus+
En la fgura ) se aprecian 2) colonias en total las cuales presentan ormas circulares y rosadas. Estas colonias se encuentran muy alejadas unas de otras. e la técnica de microgota podemos observar los siguientes resultados/
Las colonias que se aprecian aqu3 son de color caé clara con tama!os variables las ormas que tienen son irregulares.
DISCUSIÓN ado ue el a!ar nutriti(o $a(orece el crecimiento de todas las bacterias, es un medio no selecti(o, podemos in$erir ue las bacterias ue están creciendo en las placas para separar colonias son tanto la E"coli como la %"aureus, pues, aunue la e"coli sea Bram ne!ati(a y la %"aureus sea positi(a, ambas tienen los nutrientes necesarios para crecer" or otro lado (emos ue hay colonias ue son de color amarillo oscuro, las cuales son de %"aureus, y las de ca$é claro son entonces E"coli" el método de plaueo también tenemos un medio selecti(o, el cual es el a!ar )c*on+ey" Este a!ar es selecti(o, dado ue en él s-lo crecen bacterias Bram ne!ati(as y bacterias ue $ermentan lactosa" ebido a lo anteriormente mencionado, podemos in$erir ue s-lo la E"coli es la ue está produciendo colonias en este a!ar, dado ue es una bacteria Bram ne!ati(a, capa' de $ermentar lactosa" el método de diluci-n, las me'clas d e bacterias E"coli? %"aureus ? &"pneumoniae $ueron puestas en medio a!ar )c*on+ey" ado ue este medio es selecti(o, podemos in$erir ue las bacterias ue crecieron en este medio $ueron E"coli? &"pneumoniae ya ue
ambas son Bram ne!ati(as y capaces de $ermentar la alctosa, mientras ue la %"aureus es una bacteria Bram positi(a incapa' de (i(ir en este medio selecti(o" En el método de la micro!ota tenemos una me'cla de bacterias nue(amente, ya ue las diluciones usadas en el método de la diluci-n también $ueron usadas au, por ende las bacterias ue tenemos son las de la me'cla anterior, es decir, E"coli? %"aureus y &"pneumoniae" En cuanto a las técnicas de separaci-n, podemos apreciar ue todos los métodos $ueron e$iciente ya ue en todos obser(amos separaci-n de colonias, se aprecia sin embra!o ue en la técnica por siembra masi(a se obser(a una mayor cantidad de colonias nacientes en contraste con la técnica por a!otamiento" e la siembra por técnica libre se aprecia ue hay una !ran cantidad de bacterias, pero no muy separadas unas de otras" e la técnica por diluci-n, se aprecia ue a mayor diluci-n, menor es la cantidad de colonias, es decir, son in(ersamente proporcionales" Esto se debe a ue mayor diluci-n debemos tener menor unidades $ormadoras de colonias, ya ue tenemos menor cantidad de bacterias cuando estamos en un medio muy diluido" Csi, de las diluciones 104, 103 ,10 tenemos 42, 0 y 2 colonias apro
*olonias
F
0,1
Dolumen a!re!ado 6l 10
1
2
F*
00
4
0,01
10
4000
0,001
10
0000
4
2
0,0001
10
200000
3
2
0,00001
10
2000000
0,000001
10
0000000
5
0,0000001
10
00000000
8
1
0,0000000 1
10
100000000 0
#os datos encontrados no concuerdan con lo ue debera obser(arse, ya ue a menor diluci-n deberamos tener mayor cantidad de colonias, es decir, a medida ue aumentamos el $actor de diluci-n deberan disminuir las colonias en la placa" Esto puede radicar en ue las colonias ue se obser(an en un principio son colonias muy !randes, lo cual lle(a a pensar ue son muchas colonias ue no se alcan'aron a separar, de ser asi, tomaremos las ultimas secciones para sacar un promedio de las F*, dándonos como resultado 43"" F*, lo cual es bastante racional dada la turbide' de la muestra inicial"
CONCLUSIÓN En este e
mientras ue las Bran ne!ati(o resultaron ser bacilos" Gesulta de !ran ayuda la tinci-n Bram, ya ue nos $acilita el reconocimiento de las bacterias presente en nuestra muestra" Cl aduirir color podemos obser(ar
su $orma y determinar el tipo de bacteria con la ue estamos tratando de acuerdo a su pared bacteriana"
Bibliografía 1 2 4 3
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