Universidad nacional Jorge Basadre Grohmann Basadre Grohman
Facultad de Ciencias de la Salud Escuela de Farmacia y Bioquímica
“actividad antibacteriana del aceite esencial de eucalipto (eucaliptus globulus labill) sobre los principales patógenos del sistema urinario”
CURSO: Proyecto de Investigación DOCENTE: Q.F Juan José Changllio Roas ESTUDIANTE: Jesús Mamani Borda CODIGO: 2009 - 34257 i
Proyecto de investigación ESFB/FACS
AÑO: 4to año TACNA – PERU 2013 ÍNDICE
INTRODUCIÓN..................................................................................................... iii CAPÍTULO I.......................................................................................................... 1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA........................................................................1 CAPÍTULO II......................................................................................................... 5 MARCO TEÓRICO................................................................................................. 5 CAPÍTULO III...................................................................................................... 44 METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN..............................................................44 Referencias Bibliográficas:................................................................................46 Referencia bibliográfica.-……….………………………………………………………..…44
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Proyecto de investigación ESFB/FACS
INTRODUCIÓN
El Eucalyptus globulus Labill, usualmente conocido como eucalipto común o blanco; es la especie más frecuentemente usada de este género, a nivel mundial. Aparece de forma natural en el sur de Australia, además es cultivado en el sur de Europa y en América del sur. En el Perú, el ritmo de las plantaciones de eucalipto ha ido creciendo en los últimos años, siendo ésta una especie forestal con un enorme potencial en la actualidad (Álvarez et al., 2000). El eucalipto tiene glándulas que segregan aceites esenciales en sus hojas, los cuales producen su característico olor y poseen componentes que pueden ser diferenciados en productos químicos de valor terapéutico. (Álvarez et al., 2000) Es conocido el uso del aceite esencial para tratar enfermedades respiratorias debido a su efecto expectorante y antiinflamatorio (Gisbert 1993) sin embargo el aceite esencial de este recurso natural vegetal también posee propiedades antibióticas, antisépticas, bactericidas y bacteriostáticas sobre agentes que causan infecciones de las vías urinarias. El objetivo de la presente investigación es compilar información acerca de la actividad antibacteriana del aceite esencial de Eucalyptus globulus Labill ¨eucalipto¨ y su acción sobre los principales patógenos del sistema urinario.
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CAPÍTULO I PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
1.1 Descripción de la realidad problemática.-
La infección del tracto urinario es una de las infecciones más prevalentes en nuestro medio. Se estima que las infecciones urinarias son causa de aproximadamente 7 millones de visitas a los médicos, 1 millón de visitas al departamento de emergencia y aproximadamente 100 000 hospitalizaciones al año. Sumado a esto la prevalencia de uropatógenos resistentes a
antibióticos, en pacientes con infección urinaria ha
aumentado en los últimos años tanto en las adquiridas en la comunidad como en las nosocomiales. 1 Es así que al presente se hace necesaria la búsqueda de nuevos agentes antibacterianos y que mejor que los
recursos naturales presentes en la biodiversidad peruana, que
poseen propiedades medicinales y ya han sido utilizados por los antiguos pobladores. Tal es el caso del aceite esencial de Eucalyptus globulus Labill “Eucalipto”; que es usado para tratar enfermedades respiratorias, sin embargo es poco
conocida la actividad
antibacteriana del aceite de eucalipto sobre bacterias que colonizan las vías urinarias. Es por esta razón que la presente investigación busca indagar acerca de la actividad antibacteriana del aceite esencial de eucalipto sobre patógenos del sistema urinario.
1.2 Delimitación de la investigación.-
1.2.1 Delimitación espacial La presente investigación se llevó a cabo en la ciudad de Lima - Perú.
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Proyecto de investigación ESFB/FACS
1.2.2 Delimitación temporal
El trabajo se realizó durante el periodo comprendido entre los meses de Julio a Octubre del 2012.
1.2.3 Delimitación social
El trabajo está dirigido a toda la población peruana y mundial que se interese por conocer sobre la actividad antimicrobiana del aceite esencial de Eucalyptus globulus Labill “eucalipto” y su aplicación en enfermedades del sistema urinario.
1.3 Formulación del problema.1.3.1 Problema Principal
¿El aceite esencial de Eucalyptus
globulus Labill “eucalipto” tiene actividad
antibacteriana sobre los principales patógenos del sistema urinario?
1.4 Objetivo de la investigación.1.4.1 Objetivo general: •
Demostrar la actividad globulus Labill urinario,
antibacteriana del aceite esencial del
“eucalipto”
como son:
Eucalyptus
sobre los principales patógenos del sistema
Escherichia
coli,
Proteus
mirabilis,
Klebsiella,
y
Staphylococcus aureus.
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Proyecto de investigación ESFB/FACS 1.4.2 Objetivos específicos:
•
Definir la concentración mínima inhibitoria (CMI) y concentración mínima bactericida (CMB) del aceite esencial de Eucalyptus globulus Labill “eucalipto” sobre: Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella, y Staphylococcus aureus.
•
Establecer
una
Concentración
mínima
inhibitoria
Concentración mínima bactericida Alternativa
Alternativa
y
una
para cada microorganismo
motivo del estudio.
1.5 Hipótesis de la investigación.Hipótesis general: •
El aceite esencial de Eucalyptus globulus Labill. “eucalipto” podría tener actividad antibacteriana sobre los principales patógenos de las vías urinarias, como son: Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella, y Staphylococcus aureus.
Hipótesis específicas: •
El aceite de Eucalyptus globulus Labill. “eucalipto”
tendría
efecto
antibacteriano al presentar una concentración mínima inhibitoria (CMI) y una concentración mínima bactericida (CMB) sobre: Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella, y Staphylococcus aureus. •
Se conseguiría establecer una concentración mínima inhibitoria alternativa y una concentración mínima bactericida alternativa en base a los estudios de investigación revisados
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Proyecto de investigación ESFB/FACS 1.6 Justificación e importancia de la investigación.1.6.1 Justificación
Uno de los problemas que actualmente enfrentan los tratamientos médicos es la resistencia bacteriana ocasionada por el uso indiscriminado de antimicrobianos, para lo cual los productos de origen vegetal podrían proporcionar una alternativa eficaz frente a este problema. Además es necesario informar a la población acerca de la capacidad antimicrobiana del aceite esencial de Eucalyptus globulus Labill “eucalipto” sobre los principales agentes infecciosos de las vías urinarias, de manera que perciban a este aceite como una alternativa antimicrobiana
económica y factible
para el tratamiento de patologías
urinarias.
1.6.2 Importancia
Como futuros profesionales farmacéuticos
es nuestra obligación dar a conocer las
bondades del aceite esencial de Eucaliptus globulus L. a la población en general, de manera que estén advertidos acerca de sus propiedades antibacterianas sobre los principales patógenos de las vías urinarias, así como las precauciones que deben tener presentes en cuanto a su dosificación y puedan hacer un uso racional y adecuado de dicho aceite para tratar las afecciones urinarias.
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Proyecto de investigación ESFB/FACS CAPÍTULO II MARCO TEÓRICO
2.1 Antecedentes de la investigación.-
Título: Medicina tradicional en el Perú: Actividad antimicrobiana in vitro de los aceites esenciales extraídos de algunas plantas aromáticas. Autor: Libertad Alzamora, Liliana Morales, Lourdes Armas, Gilma Fernández. Resumen: En la presente investigación se evaluó la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales de 5 plantas usadas en la medicina tradicional peruana entre ellas el Eucaliptus globulus Labilll. El aceite esencial obtenido por destilación por arrastre de vapor, se enfrentó
a Pseudomona aeruginosa,
Staphylococcus aureus y Candida
albicans. La determinación de la actividad antibacteriana se evaluó por el método de aromatograma de Durafourd,
que consiste en introducir discos
con la solución impregnada de los
aceites esenciales sobre el inóculo de las bacterias y medir el tamaño de inhibición de crecimiento bacteriano considerándose como actividad nula si el halo de inhibición era menor o igual a 8 mm. Sensibilidad límite de 9 a 14 mm, media de 15 a 19 mm y sumamente sensible si era igual o superior a 20mm. Encontrándose que el aceite de Eucalipto tiene una sensibilidad límite sobre la muestras de
Staphylococcus aureus
ya que el halo de inhibición de crecimiento del
microorganismo era de 13 mm; y en el caso de Candida albicans se encontró en 14 mm. 2 Por lo descrito en el presente estudio podemos inferir que el aceite esencial de Eucalipto puede ser usado para tratar
infecciones urinarias causados por Staphylococcus y
también causadas por hongos como es el caso de la Candida albicans.
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Proyecto de investigación ESFB/FACS Titulo: Evaluación de la Actividad Antibacteriana in vitro de los Extractos de Caesalpinia spinosa “tara” y Eucalyptus sp. “eucalipto” Autor: Liu B. Humberto; Lengua V., Luis Alberto; León M., Gladis; La Torre D., Carla; Huapaya Y., José; Chauca, José. Resumen: En el presente estudio se evaluó in vitro la actividad antibacteriana de extractos de Caesalpinia spinosa "tara" y Eucalyptus sp. "eucalipto" utilizando cepas bacterianas de Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Klebsiella sp. y Shigella flexneri. Se utilizó como solvente de extracción una mezcla de alcohol-acetona (1:1) y la actividad biológica de los extractos obtenidos se evaluó mediante la técnica de difusión en disco. Para evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos vegetales, las cepas bacterianas antes de su utilización fueron sembradas previamente en agar Tripticasa de Soya (24 horas antes). Luego se inocularon las cepas en tubos conteniendo 3mI de caldo Tripticasa de Soya, por 2 horas. La densidad bacteriana fue ajustada aproximadamente a 1.5 x 10 8 bacteria/mI usando el tubo N° 1 de la escala de Mac Farland (0,5) Usando un hisopo estéril se inocularon placas de agar Muller-Hinton con cada cepa evaluada. Simultáneamente se prepararon discos de papel de filtro (Whatman 351) estériles a los cuales se les adicionó 15mI de los extractos. Todas las pruebas se hicieron por duplicado. Después, utilizando pinzas estériles se colocaron los discos en la superficie de la placa. Las placas fueron incubadas a 37° C por 22 horas. Luego de ello fueron examinadas para determinar la formación de halos de inhibición. El extracto de Eucalyptus sp. "eucalipto" produjo un halo de inhibición de 10.5 mm sobre Staphylococcus aureus y un halo de 13mm sobre bacillus subtilis. 3 En base a la presente investigación se asume que el eucalipto presenta antimicrobiana contra Staphylococcus aureus bacteria gran positiva
actividad
que causa
enfermedades de las vías urinarias.
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Proyecto de investigación ESFB/FACS 2.2 Bases teóricas.A. Infección Urinaria.a.1 Definición: La infección urinaria, infección de orina, o infección del tracto urinario (ITU), es la existencia de gérmenes patógenos en la orina por infección de la uretra, la vejiga, el riñón o la próstata. Los síntomas que acompañan a una infección de orina son los que componen el síndrome miccional, teniendo en cuenta que las infecciones de orina también pueden ser asintomáticas. Desde el punto de vista microbiológico, cuando se detecta un crecimiento de 10.000 unidades formadoras de colonia por mililitro (ufc/ml) en una muestra de orina bien recogida, puede existir una infección urinaria. 4 La gravedad de la infección variará de acuerdo a la agresividad que ostente el microorganismo intruso y por supuesto del estado inmunológico del huésped, aunque claro también es plausible que el nivel de agresión de la especie exterior que invade sea tan importante que ni siquiera un buen sistema inmunológico pueda combatirlo. Existen una enorme cantidad de infecciones que afectarán particularmente a cada parte del organismo de un ser humano, en tanto, una de las infecciones bacterianas más comunes y por las cuales la gente más consulta y se somete a tratamiento es la infección urinaria. Gran parte de las bacterias que la ocasionan vienen del intestino grueso, ingresando en la vejiga de manera ascendente tras un paso inicial por la uretra, colonizando de este modo tanto la región uretral como la peri uretral. Si bien el aparato urinario posee determinados mecanismos propios como ser el flujo constante de orina que actúa por arrastre, para combatir la acción de las bacterias que ingresan, en algunas circunstancias, las bacterias pueden vencer estas duras barreras provocando la inflamación de la zona, la cual de acuerdo a la magnitud y localización que ostente se materializará en los siguientes casos clínicos: prostatitis, bacteriuria asintomática, cistitis aguda y pielonefritis aguda. Entre las principales causas de este tipo de infección se cuentan algún tipo de obstrucción, tales como tumores, cálculos o quistes, que dificultan el flujo normal de la
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Proyecto de investigación ESFB/FACS orina, la edad, siendo las personas mayores adultas las que más propensas se muestran a la misma, la predisposición genética y la diabetes. En tanto, para una mejor detección y diagnóstico de la misma, los médicos solicitarán al paciente que presente la sintomatología, que se someta a un examen que se denomina urocultivo y que consiste en la toma de una muestra de orina en condiciones especialmente estériles, siendo la mejor la orina de la mañana, previa higiene de los genitales. 5
a.2 Clasificación de las infecciones urinarias.Se clasifican según el nivel de compromiso clínico y anatómico en: asintomática (bacteriuria asintomático) y sintomática (cistitis y pielonefritis), siendo también denominadas como altas y bajas. 6
a.2.1 Infecciones urinarias asintomáticas.Se habla de ella cuando existe la presencia de más de 100.000 colonias de bacterias por milímetro de orina (urocultivo) en ausencia de signos y síntomas de infección urinaria. Las bacterias aisladas tienden a ser de baja patogenicidad y son fácilmente eliminadas por los antibióticos; sin embargo, su tratamiento puede condicionar un alto nivel de recurrencia y recolonización por cepas más virulentas que, al eliminar a la flora protectora, incrementarían la oportunidad de adherencias bacterianas como evento preliminar al desarrollo de la infección urinaria (IU). Al adherirse las bacterias al tracto urinario se provoca la infección. La presencia de cepas bacterianas en la vía urinaria no siempre daña el uroepitelio e incluso podrían prevenir la invasión de otros gérmenes, al funcionar como una forma de profilaxis natural.6
a.2.2 Infección urinaria sintomática.-
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Proyecto de investigación ESFB/FACS Es la presencia de más de 100.000 colonias de bacterias en 1 ml de orina asociado a síntomas de compromiso del tracto urinario bajo o alto. Es diagnosticada por cualquiera de los siguientes criterios Presencia de uno de los siguientes signos o síntomas: a) Fiebre (> 38ºC) b) Tenesmo c) Polaquiuria d) Disuria o dolor suprapúbico e) Cultivo de orina con >= 105 UFC/mL con no más de dos especies de organismos. f)
PIURIA > 10 leucocitos/mL.
g) Visualización de microorganismos en la tinción de Gram. h) Dos urocultivos con > 103 UFC/mL del mismo germen. Las infecciones sintomáticas las podemos clasificar en dos grupos: infecciones urinarias bajas (cistitis aguda) e infecciones urinarias altas (pielonefritis aguda).
a.2.3 Cistitis.Cuando la vejiga, órgano del aparato urinario en forma de globo que sirve para almacenar y eliminar la orina producida en los riñones, se inflama aparece la cistitis siendo entonces la inflamación de la vejiga urinaria, causada casi siempre por una infección producida por gérmenes procedentes del aparato digestivo (recto) cuando se ponen en contacto con el aparato urinario. La mayoría de las veces, el cuerpo puede deshacerse de estas bacterias cuando se micciona. Sin embargo, algunas veces, las bacterias pueden adherirse a la pared de la uretra o la vejiga o multiplicarse tan rápido que algunas de ellas permanecen en la vejiga.
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Proyecto de investigación ESFB/FACS Se caracteriza por la presencia de síndrome miccional: micción frecuente (polaquiruria), urgente y dolorosa (disuria), sensación permanente de ganas de orinar (tenesmo) y eliminación de una pequeña cantidad de orina turbia.
a.2.4. Pielonefritis.O infección urinaria alta es una infección de las vías urinarias que ha alcanzado la pelvis renal, los cálices y el parénquima renal.
B. Principales microorganismos asociados a infección urinaria.-
Los microorganismos implicados en la infección urinaria no han cambiado de forma significativa en los últimas dos décadas, permaneciendo la E. Coli como el principal patógeno. Más del 95% de las infecciones del tracto urinario son causadas por una única especie bacteriana. Los microorganismos responsables de la infección urinaria sintomática y asintomática son los mismos. La Escherichia coli se encuentra en el 80% de los casos, seguido en frecuencia por el Proteus mirabilis (4%), Klebsiella (4%), Enterobacter (3%), Staphylococcus saprophyticus (2%) y Streptococcos del grupo B (1%). Algunas bacterias gram positivas también han sido asociadas con patología del tracto urinario, aunque de forma menos frecuente, como el Staphylococcus aureus 6
b.1 Escherichia Coli.-
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Proyecto de investigación ESFB/FACS Escherichia coli es el patógeno oportunista aislado con más frecuencia en las infecciones del tracto urinario, forma parte de la familia Enterobacteriaceae , está integrada por bacilos Gram negativos no esporulados, móviles con flagelos perítricos o inmóviles, aerobios-anaerobios facultativos, capaces de crecer en agar MacConkey y en medios simples con o sin agregado de NaCl, fermentadores y oxidativos en medios con glucosa u otros carbohidratos, catalasa positivos, oxidasa negativos, reductores de nitratos a nitritos, y poseedores de una proporción G+C de 39 a 59% en su DNA. La E. coli posee características que la hacen muy virulenta para el tracto urinario, como son la presencia de pilio fimbrias tipo I que se unen a la manosa de las células epiteliales y que favorece su adherencia al uroepitelio, antígeno K que protege a las bacterias de la fagocitosis por los leucocitos, hemolisina que favorece la invasión tisular y daña el epitelio tubular, la resistencia antimicrobiana a la actividad bactericida del suero y aerobactina que permite a la bacteria acumular hierro para su replicación.7
Figura n°1 Escherichia Coli. b.2 Proteus Mirabilis -
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Proyecto de investigación ESFB/FACS Proteus mirabilis es una bacteria Gram-negativa, facultativamente anaeróbico. Proteus mirabilis causa el 90% de todas las infecciones por Proteus. 8 Es una bacteria rodeada de flagelos en todo su cuerpo (peritrica) por lo que es extremadamente móvil y por lo tanto capaz de diseminarse rápidamente por todo el árbol urinario. Es además intensamente ureásica, forma amonio de urea a alta velocidad, en 2 horas un inoculo de 10 UFC/ml de Proteus puede elevar el pH urinario a un valor cercano a 8.0, ello ocasiona en la vía urinaria precipitación de estruvita (fosfato amónico magnésico) y de apatita (fosfato cálcico) y
de
ahí
la
pronta
aparición de litiasis, que ocurre en vejiga, próstata y riñón.Posee además, fimbrias de adherencia y tiene tendencia a adherirse mejor a las células renales . Otros factores de virulencia son la hemolisina (la mayor parte de aislados de pielonefritis son hemolíticos. La hemolisina Hpm A de Proteus
ha sido postulada como el
factor citotóxico que facilita la invasión renal de Proteus.
. Figura n°2 Proteus mirabilis Finalmente,
Proteus produce
una
metalo
proteasa que reconoce y activa la
inmunoglobulina A1 y A2. Por estos motivos Proteus mirabilis es más frecuente en infecciones
hospitalarias.
En
infecciones
comunitarias,
por
motivos
que
desconocemos pero atribuimos a su adherencia al prepucio, es más frecuente en lactantes varones.
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Proyecto de investigación ESFB/FACS Esta bacteria al ser sembrada en un agar para identificación microbiana, sus colonias toman forma de ondas, que son fáciles de identificar. 8 b.3. Klebsiella.Se la aísla frecuentemente de materias fecales del hombre y los animales, pero también de aguas, vegetales y alimentos. Son bacilos Gram negativos inmóviles, a menudo capsulados. La cápsula es de naturaleza polisacárida. Se trata de patógenos oportunistas, que pueden provocar diversos cuadros clínicos en el hombre: infecciones urinarias, bacteriemias, neumonías, infecciones hepatobiliares, etc. Un porcentaje elevado de aislamientos de Klebsiella, particularmente aquellos de infecciones nosocomiales, contienen plásmidos de resistencia a los antibióticos. Puede ser resistencia a betalactámicos, aminoglucósidos, etc. Klebsiella expresa su virulencia urinaria por sus fimbrias de tipo 1 .Se asume que hasta el 75% de Klebsiellas urinarias expresan esta propiedad . 7
Figura n°3 Klebsiella sp. La presencia de cápsula es sin embargo, el factor más importante de virulencia Presenta diferentes variantes químicos del polisacárido capsular que permiten distinguir hasta 70 serotipos . De los factores de virulencia que se le atribuyen a
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Proyecto de investigación ESFB/FACS Klebsiella , el polisacárido capsular es de los más importantes ya que impide la acción de los anticuerpos (anti-O), importante mecanismo defensivo de la infección urinaria por bacilos gram negativos.8 b.5Staphylococcus aureus.Las infecciones urinarias por Staphylococcus aureus son poco habituales en la población general y con frecuencia son secundarias a bacteriemias originadas en focos distantes (como la endocarditis). No obstante, los pacientes con sondas permanentes pueden presentar infecciones ascendentes del tracto urinario por S. aureus. 7
Figura n°
4: Staphylococcus aureus.
C. Otros microorganismos patógenos.Los hongos son una parte de la población microbiana que puede contribuir como uropatógenos fúngicos en las ITU. En los últimos decenios las IU fúngicas por Candida levadura género ha aumentado considerablemente. La salud del tracto urinario es estéril así, la presencia de levaduras del género Candida en la orina implica una variedad de situaciones clínicas). Candiduria se puede demostrar como IU sintomáticas o asintomáticas, la incidencia de las infecciones del tracto urinario causadas por levaduras es cuatro veces más común en mujeres que en hombres. Además, los resultados de diferentes estudios han indicado que las IU en las mujeres son muy comunes 9
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Proyecto de investigación ESFB/FACS D. Eucalyptus globulus Labill.d.1 Clasificación taxonómica.- 10 El Eucalyptus globulus Labill presenta la siguiente clasificación taxonómica según Adolph Engler modificado por Soukoup J. Reino: Vegetal División: Angiospermae Clase: Dycotyledoneae Sub-clase: Archyclamideae Orden: Myrtales Familia: Myrtaceae Género: Eucalyptus Especie: Eucalyptus globulus Nombre científico: Eucalyptus globulus Labill. Nombre común: Eucalipto blanco, Eucalipto común o eucalipto azul
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Figura n° 5 Eucalyptus globulus L. d.2 Descripción botánica.d.2.1Tronco: Derecho, pero poco redondo, muy grueso, hasta más de 2m de diámetro, y con tendencia a experimentar una torsión espiral. d.2.2 Corteza: Primero de color blanquecina, plateado azulado - pruinosa, lisa, luego, de color gris o pardo grisácea, lisa, que se desprende en grandes tiras longitudinales, retorcidas y deflecadas, que se mantienen colgando algún tiempo en los árboles. d.2.3 Raíz: El sistema radical está constituido por una raíz pivotante, que en terrenos sueltos puede alcanzar los 50 cm. de profundidad, en el primer año ,creciendo después más lentamente. Las raíces laterales, que en un principio son poco desarrolladas, después
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Proyecto de investigación ESFB/FACS se extienden superficialmente, a veces a grandes distancias de su fuste. En suelos poco profundos todas las raíces, se adaptan haciéndose someras.
d.2.4 Hojas: Las hojas juveniles son opuestas, sésiles, de base cordada, de color gris-azulado, de 8-15 cm de longitud y 4-8 cm de anchura. Las adultas alternas, pecioladas, con la base cuneada, linear-lanceoladas, de 15-25 cm de longitud, con el ápice acuminado. La textura es algo coriácea y son de color verde oscuro, con la nerviación marcada 11 Las hojas adultas contiene aceite esencial en una concentración entre 1,5 - 3,5% en caso de Eucalyptus globulus. Este aceite se encuentra ubicado en los espacios o cavidades esquizógenos , los cuales se forman gracias a que las células se separan por disolución de la laminilla media y por dilatación de los espacios intercelulares. Esta secreción es merocrina.
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Figura N° 6 Espacios o cavidades esquizogenas que contienen aceite esencial de Eucalipto.
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Figura N° 7 Imagen por Micrografía de electrones de la cavidad secretora de la hoja de Eucalipto El contenido de aceite esencial tiene un pico máximo en las hojas basales de los brotes, mientras que el contenido cineol aumenta con la edad de las hojas y alcanza su máximo en las hojas adultas de tallos ya lignificados.
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d.2.5 Flores: Flores axilares, solitarias o en grupos de 2-3, de hasta 3 cm de diámetro, con numerosos estambres de color blanco. Florece en Septiembre-Octubre. d.2.6 Fruto: Fruto en cápsula campaniforme de color glauco y cubierta de un polvo blanquecino, de 1.4-2.4 cm de diámetro. Las semillas del eucalipto goma azul son relativamente grandes para un eucalipto. Hay entre 18 y 320 semillas por gramo de semillas y hollejo o alrededor de 460 semillas limpias por gramo. Las cápsulas liberan las semillas inmediatamente al alcanzar la madurez y las semillas son dispersadas por el viento. La distancia de dispersión calculada en base a una altura de 40 m con unos vientos de 10 km por hora, fue de solamente 20 m 3
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Proyecto de investigación ESFB/FACS d.3 Origen.Sus masas naturales, están limitadas, a la costa meridional de Australia: en los Estados de Nueva Gales del Sur y Victoria (en las zonas más frías, viviendo entre los 37º y los 39º de latitud), principalmente en los montes Otways y Gippsland; y costas oriental y meridional de Tasmania, entre los 41º y 43º de latitud Sur. 11 d.4 Habitad.El Eucalyptus globulus Labill viene a conformar una fuente de riqueza forestal debido a su crecimiento precoz y a su adaptación a toda clase de suelo y clima en especial a la serranía del país En el Perú actualmente se cuenta con 536,530 hectáreas de eucalipto. Se estima que existe actualmente 150,000 hectáreas de estas plantaciones que están en edad de explotación, de las cuales 51,000 se encuentran ubicadas en Cusco, 28,000 en Apurímac y 27,000 en Junín.13 Para lograr un desarrollo óptimo requiere de: •
Altitud: 500-1500 m.s.n.m
•
Régimen de lluvias: invierno o verano
•
Estación seca: 3 meses no rigurosa
•
Temperatura: Media máxima del mes más cálido: 18-23 C
°
Media minina del mes de frio: 4-12 C° •
Se desarrolla en un suelo areno- arcilloso
d.5 Metodología de colecta.-
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Proyecto de investigación ESFB/FACS El mejor momento es por la mañana, antes del mediodía y en día siempre soleado. Si lo hacemos muy temprano por la mañana el rocío puede llegar a estropear las plantas debido a la humedad, factor muy desfavorable para su conservación .Además por la mañana temprano observaremos tienen las flores caídas, en estado de letargo , no estando sus propiedades al 100 % .Tampoco es recomendable recolectarlas al medio día , especialmente con plantas aromáticas ya que a esa hora el calor es excesivo y muchos de los aceites esenciales se volatilizan. Tampoco es aconsejable recolectarlas en la tarde o a la caída del sol ya que las plantas están adormecidas quedando inhibida su actividad productora. Podemos pues resumir que la mejor hora para recolectar en general las plantas medicinales es entre las 10 y las 11 de la mañana y en día soleado, hora en que encontraremos con toda probabilidad las plantas al 100%.Si recolectamos en día nublado las propiedades son menores, tardando mas en secarse y teniendo más humedad. E.- Aceite esencial de eucalipto.e.1 Métodos de obtención del aceite esencial de eucalipto.Los aceites esenciales
pueden extraerse mediante varios métodos: expresión,
destilación con vapor de agua, extracción con solventes volátiles, enflorado y con fluidos supercríticos 14 La técnica de obtención por arrastre de vapor se utiliza a nivel industrial debido a su alto rendimiento, la pureza del aceite obtenido y porque no requiere tecnología sofisticada (Martínez, 2001).
e.2 Destilación por arrastre de vapor.Es una técnica que sirve fundamentalmente para separar sustancias insolubles en agua y literalmente volátiles, de otros productos no volátiles mezclados con ellas. El comportamiento de la destilación de un sistema de dos fases miscibles, donde cada líquido ejerce su propia presión de vapor y la suma de ambas es de la presión de operación, y son independientes de las cantidades relativas de la mezcla. Estos
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Proyecto de investigación ESFB/FACS hechos constituyen la base para la purificación de sustancias por el arrastre de una corriente de vapor. Existen varios compuestos orgánicos de punto de ebullición relativamente alto que con agua co-destilan en una cantidad en peso lo suficientemente grande para ser destilados con cierta rapidez por debajo del punto de ebullición del agua. Esto se debe a sus pesos moleculares relativamente elevados comparados con las del agua. 11
Figura 8. Esquema del equipo de extracción
e.2.1 Descripción del proceso: A continuación se describirá el proceso al que debe ser sometido la droga antes de colocarla en el aparato de destilación. e.2.1.1 Recolección
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Proyecto de investigación ESFB/FACS Las plantas destinadas a la obtención de aceites esenciales, se recolectan en primavera, entre las 10 y 11 de la mañana y en día soleado. e.2.1.2. Recepción e Inspección Las plantas deben ser revisadas morfológicamente, de tal modo que no se encuentre otro tipo eucalipto. e.2.1.3. Pesado Luego de la inspección se pesa el material vegetal e.2.1.4. Oreado Con la finalidad de eliminar el agua presente en las plantas cortadas y así aumentar la eficiencia de la operación de destilación; se realiza un oreado de las mismas a la sombra, sobre catres con tejido de polipropileno, preferentemente bajo techo en lugares ventilados. Las plantas no se deben dejar en arrumes por que se generan hongos, los que transfieren un olor terroso, mohoso al aceite. e.2.1.5 Pesado 2 Luego del oreado se pesa la matera prima para calcular el rendimiento de extracción y pérdida de agua con el oreado. e.2.1.6. Destilación Se introduce en el destilador la cantidad requerida de material vegetal teniendo la precaución de que el material no quede muy suelto por que aumenta el consumo de energía, ni tampoco muy apretado por que disminuye el rendimiento del aceite. Luego se hace pasar por medio de la masa vegetal vapor de agua, que va llevando con sigo los compuestos volátiles que conforman los aceites esenciales, a la salida del sistema de destilación se encuentra un serpentín refrigerante que hace que la mezcla de vapor de agua y aceite esencial pasen de estado gaseoso a líquido.
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Proyecto de investigación ESFB/FACS Luego de esto se encuentra un separador de las dos fracciones, y por medio de la diferencia de densidad, estas se separan en el hidrolato y el aceite esencial. Con este procedimiento se obtienen lo que se conoce como aceite esencial crudo.
e.2.5. Refinamiento Para limpiar el aceite de impurezas se vierte el destilado poco a poco, utilizando un embudo provisto de filtro de papel. Cuando el producto obtenido no reúne toda la finura requerida, es necesario refinar o depurar el aceite. Para ello hay que redestilar el producto al vacío utilizando álcali para eliminar aldehídos y alcohol de baja concentración para eliminar terpenos, compuestos que le otorgan olor o sabor desagradable al aceite esencial. Este proceso a la vez concentra el contenido de componentes importantes como el mentol y el cineol. Bruneton J. menciona que con el refinamiento del aceite esencial de eucalipto, el contenido de limoneno y p-cimeno pueden doblarse; y el aromadendreno, el globulol, el transpinocarveol y aldehídos desaparecen en los aceites rectificados, perdiéndose un 6% del aceite crudo. Las fracciones eliminadas pueden ser vendidas a otras industrias que consumen estos productos.
11
e.3. Métodos Fundamentales de Análisis de Aceites Esenciales 11 e.3.1. Determinaciones Físicas •
Aspecto
•
Color
•
Olor
•
Índice de refracción
•
Desviación óptica (poder rotatorio)
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Proyecto de investigación ESFB/FACS •
Solubilidad en mezclas alcohol-agua (alcoholes rebajados)
e.3.2. Determinaciones Químicas •
Índices de saponificación : 8.9 - 20
•
Índice de yodo: menor a 0,7
•
Técnicas cromatografías: cromatografía liquida TLC, cromatografía Líquida de alta resolución HPLC
•
Métodos espectroscópicos: ultravioleta UV,infrarojo IR, cromatografía de gases asociado a masas GC-MS
E.2 Composición Fisicoquímica del Aceite.•
Formula: C10H18O
•
Peso molecular: 154.24 g/mol
•
Densidad: 0.910 – 0.93 g/ml
•
Solubilidad en agua: insoluble
•
Solubilidad en etanol: 1:8 a 20ºC
•
Temperatura de ebullición aproximada: 177ºC
•
Color: amarillo claro
•
Olor: penetrante
•
Rotación óptica: +5º a -9º
•
Índice de refracción: 1.463- 1.466
24
Proyecto de investigación ESFB/FACS
E.3 Composición química.a) 1,8 cineol (eucaliptol) Es el constituyente principal del aceite esencial, con una proporción de 70 - 95%. El eucaliptol (1,8 - Cineol), es un aceite blanco, olor, alcanforado, monoterpenoide monociclico, peso molecular 154, densidad 0.921-0.923, ebulle a 176 ºC, índice de refracción 1.456, insoluble en agua, soluble en alcohol, cloroformo, éter; es irritante, expectorante, antiséptico y antibiótico contra, E. coli y S. aureus 15
Figura n° 9 Estructura del 1,8 cineol
25
Proyecto de investigación ESFB/FACS
Figura n°10 Estructura tridimensional de 1,8 cineol
b) Pineno: Es un terpeno, de dos isómeros de pineno. Se encuentra aproximadamente 7.16 % de α–pineno en el aceite esencial de la hoja de Eucalyptus globulus Labill y 1.10 % de b-pineno. El α-pineno es líquido, punto de ebullición 155ºC, densidad 0.8592, índice de refracción 1.4664, insoluble en agua, soluble en alcohol, cloroformo.15
Figura n°11 Estructura de α- Pineno:
c) Terpinenos: Los terpinenos son un grupo de isómeros de hidrocarburos que se clasifican como terpenos.El aceite de eucalipto contiene aproximadamente 0.11 % de α-Terpineno y 1.16 % de γ-Terpineno
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Proyecto de investigación ESFB/FACS
Figura n°12 Estructura de isómeros de terpineno d) α-Terpinol: Se encuentra en una concentración aproximada de 0.14%
Figura n°13 Estructura de α-Terpinol
e) Mirceno: Mirceno o β-mirceno, es un compuesto orgánico oleofínico natural. Se clasifica como un hidrocarburo, pero con más precisión como un monoterpeno .Se encuentra en una concentración de 1,25%
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Proyecto de investigación ESFB/FACS
Figura n°14 Estructura de Mirceno
f) Butiraldehido: Sustancia oxigenada 16
CH3-CH2-CH2-CHO Figura n°15 Estructura de Butiraldehido
g) Valeraldehido: Sustancia oxigenada 16
CH -CH -CH -CH -CHO 3 2 2 2 Figura n°16 Estructura de Valeraldehido
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Proyecto de investigación ESFB/FACS
Las principales exigencias en el mercado medicinal son un elevado contenido de cineol y la ausencia de cantidades apreciables de felandreno y aldehídos.9
E.4.-Propiedades atribuidas al aceite esencial. Entre las propiedades del aceite de Eucalipto se encuentran: Analgésico, antirreumático, antiinflamatorio, antiséptico, antiespasmódico, antiviral, bactericida, cicatrizante,
descongestivo,
desodorante,
depurativo,
diurético,
expectorante,
febrífugo, hipoglucémico, insecticida, rubefaciente, estimulante y vermífugo.17 Particularmente eficaz con la gripe, infecciones de garganta, tos, condiciones catarrales, sinusitis, asma y tuberculosis. El aceite esencial podría ser antiséptico respiratorio, antihelmíntico, balsámico, expectorante e hipoglicémico. Puede menguar los efectos dolorosos de las migrañas y se dice que es útil en el tratamiento de la escarlatina, la disentería, las fiebres tifoideas, la difteria y la malaria, así como con la varicela. Actúa bien en el sistema genito-urinario; útil con problemas tales como cistitis y la diarrea. Parece disolver los cálculos biliares, y se ha empleado en el tratamiento de la nefritis, la gonorrea y la diabetes. Se dice que es eficaz contra las hemorragias. Puede causar algún alivio al reumatismo, y se ha afirmado su eficiencia a este efecto en combinación con limón y junípero. Es posible que también resulte útil en trastornos y molestias musculares de carácter general y con las neuralgias (dolores nerviosos), así como con la piorrea. Aparentemente útil en erupciones cono el herpes y eficaz con las quemaduras, se dice que previene el desarrollo bacteriano y la subsiguiente formación de pus, contribuyendo a la formación de un nuevo tejido. También parece obrar bien ante cortes, heridas, ulceras y condiciones inflamatorias
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Proyecto de investigación ESFB/FACS Parece disolver los cálculos biliares, y se ha empleado en el tratamiento de la nefritis, la gonorrea y la diabetes. Se dice que es eficaz contra las hemorragias. Puede causar algún alivio al reumatismo, y se ha afirmado su eficiencia a este efecto en combinación con limón y junípero. 17
e.5 Actividad antibacteriana.Se ha postulado que la actividad antibacteriana se debe a que en el interior de la célula microbiana, el aceite esencial oxida gradualmente el oxígeno proveniente del medio ambiente, produciéndose metabolitos tóxicos tales como el ión superóxido y el peróxido de hidrógeno los cuales desnaturalizan la membrana citoplasmática, aminoácidos y proteínas causando letalidad de los microorganismos (Villar, 1999 y Fife et al, 1998). El 1,8 cineol es capaz de inducir la producción de compuestos tóxicos de O2 actúa sobre la membrana citoplasmática, específicamente a nivel de la coenzima a, uniendo los grupos sulfidrilos libres entre coenzimas formando enlaces disulfuros, que impiden su normal funcionamiento en los procesos de óxido reducción y en la producción de energía requerida para el transporte activo de nutrientes hacia el interior de la célula (Valsecia, 1999) 18 F. Métodos para determinar la actividad antibacteriana La actividad de los antimicrobianos (antibióticos y quimioterápicos) debe ser evaluada “in vitro ” para obtener la información que permitirá decir si un microorganismo es susceptible o resistente a determinado producto.
Dos son los procedimientos empleados para conocer ésta información, el método del tubo dilución y el del disco difusión en agar, a éste último se le denomina: antibiograma.
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Proyecto de investigación ESFB/FACS La actividad antimicrobiana in vitro determina a. La potencia de un agente antibacteriano en solución b. Su concentración en los líquidos del cuerpo o en los tejidos c. La sensibilidad de un microorganismo a concentraciones conocidas del medicamento 19
F.1 Medición de la actividad antimicrobiana Esta se determina mediante los métodos de dilución o difusión, utilizando un microorganismo estándar y una cantidad conocida del antimicrobiano. Para ello se utilizan las pruebas de dilución en tubos y el método de difusión. •
Prueba de dilución: En éste ensayo se incorporan cantidades conocidas de antimicrobianos en medios líquidos, se inoculan después con las bacterias en prueba y se incuban. El punto final se toma cuando la cantidad de sustancias antimicrobiana es capaz de inhibir el crecimiento o de matar a las bacterias en prueba.
Se obtiene un resultado cuantitativo, destacando dos características importantes:▪ -
La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) que se define como la mínima concentración de antimicrobiano (en μg/mL) que inhibe el crecimiento visible de un microorganismo después de 24 horas de incubación a 37°C. La CMI se ha establecido como "gold Standard" frente a otros métodos que evalúan susceptibilidad antimicrobiana; además de confirmar resistencias inusuales, da respuestas definitivas cuando el resultado obtenido por otros métodos es indeterminado.
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Proyecto de investigación ESFB/FACS - La Concentración Mínima Bactericida (CMB), se define como la mínima concentración de antimicrobiano que elimina a más del 99,9% de los microorganismos viables después de un tiempo determinado de incubación (generalmente 24 horas) •
Método de difusión▪ Preparación del inóculo. La técnica del antibiograma sólo es aplicable a especies bacterianas en cultivo puro. Por ello previamente se procederá, si es preciso, a hacer un aislamiento en placa. 19
G. Farmacología experimental del aceite esencial de eucalipto.-
G.1 Estudio de la Universidad Católica de Santa María- 2005: 10 Un estudio llevado a cabo en la universidad Católica de Santa María, evaluó el efecto in vitro del Eucalyptus globulus Labill (eucalipto) sobre Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Shigella flexneri ,Proteus vulgaris Pseudomona aeruginosa. Para el presente estudio se utilizaron hojas de Eucalyptus globulus Labill (eucalipto), las cuales fueron recolectadas manualmente (3.600 gramos) , a las 9 am en las tierras de cultivo de la avenida paisajista Socabaya, en el departamento de Arequipa. Luego se procedió a colocarlas en una bolsa de papel para evitar su deterioro y para una mejor conservación, se les limpio adecuadamente para desechar impurezas; luego las hojas se trasladaron a una habitación con buena ventilación y temperatura ambiente sin exponerlas a la luz directa, y se procedió a colocarlas sobe un papel sin sobreponerlas, este método se desarrolla hasta la sequedad completa de la hoja. El material desecado se procedió a triturar en un mortero, seguidamente se peso las hojas, para la posterior extracción del aceite (500 gramos)
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Proyecto de investigación ESFB/FACS El material vegetal se sometió al método de destilación por arrastre de vapor, obteniéndose un rendimiento de 0,55 %. El aceite esencial obtenido se almaceno en frasco de vidrio ámbar, para el respectivo análisis físico químico. Para el análisis microbiológico las cepas estándar ATCC fueron: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 , Klebsiella pneumoniae 10031 ,Proteus vulgaris ATCC 13315 ,Shigella flexneri Pseudomona aeruginosa
ATCC
ATCC 12022
y
ATCC 27853, las cuales se obtuvieron en el Hospital
Goyeneche en la ciudad de Arequipa
Determinación de la concentración mínima inhibitoria: Se realizo por el método de dilución en caldo. En primer lugar se preparo el diluyente al 1%, para lo cual se agrego 4,950 ul de agua destilada y se les agrega 50 ul del dimetil sulfoxido (diluyente puro). A continuación se prepara la solución madre, utilizando como diluyente del aceite de eucalipto al dimetilsulfoxido al 1%. Se obtiene la solución madre en una proporción de 1:4, es decir 1 ml de aceite esencial y 4ml de diluyente al 1%, después se enrasa con agua destilada a 10 ml en una fiola y se procede a enrasar. Se toma separadamente las colonias anteriormente incubadas en placas petri , para posteriormente ser diluidas en 5ml de caldo peptonado hasta alcanzar la turbidez equivalente a 0.5 de Mac Farland, si la turbidez es mayor se le agrega mas caldo y si la turbidez es menor se le agrega mas colonias hasta que se equivalente a la escala de Mac Farland (Tubo n°5) A continuación se prepara 6 series de 12 tubos estériles , y se les agrega a todos los tubos 1ml de caldo peptona , al primer tubo de cada serie se le agrega 1,0 ml de solución madre del aceite esencial de Eucalyptus globulus Labill, se agita bien el tubo y seguidamente se extrae 1,0 ml para luego ser agregado al segundo tubo, agitar bien y así sucesivamente a los demás tubos hasta el tubo n ° 10 del que se
33
Proyecto de investigación ESFB/FACS desecha 1,0 ml, luego se agregan 0,1 ml del inoculo a cada tubo. Inóculo de cada bacteria. El tubo n°11 se tomo como control positivo y n°12 el control negativo. Todas las series se incuban a 37 °C por 24 horas .Transcurrido el tiempo de incubación se apreciara la turbidez del contenido de los tubo para así poder observar el punto de ruptura, que es el tubo lipidiado y el tubo turbio. Se considera la CIM a la cantidad que se encuentra en el tubo que no presenta turbidez. Luego de determinar la concentración mínima inhibitoria se procedió a sembrar a todos los tubos que no presentaron turbidez en Agar Muller Hilton, seguidamente se lleva a la estufa a una temperatura de 37° por 48 horas, pasado el tiempo se observará en cuál de los tubos sembrados no hubo crecimiento siendo la cantidad mínima bactericida (CMB) entre el tubo que no hubo crecimiento y en el que si hubo crecimiento.
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Proyecto de investigación ESFB/FACS
Figura n° 17: Determinación de la concentración mínima inhibitoria y concentración mínima bactericida para cada cepa en estudio
TABLA N°1
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Proyecto de investigación ESFB/FACS Actividad antimicrobiana del aceite esencial de E. globulus expresada como Concentración mínima inhibitoria (CMI) y concentración mínima bactericida (CMB)
ACEITE DE EUCALIPTO (mg/ml)
MICROORGANISMO CMI
CMB
E. coli ATCC 25922
5,81
6,25
Proteus mirabilis
5,81
6,25
5,81
6,25
2,91
3,13
ATCC 13315 Klebsiella pneumonia ATCC 10031 S. aureus ATCC 25923
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Proyecto de investigación ESFB/FACS Fuente: Gutierrez Valdivia Ranulfo .Mamani Romaní Wilmar. Efecto in vitro del Eucaliptus globulus Labill (eucalipto) sobre Sthapylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Shigella flexneri
y
Pseudomona
aeruginosa , Universidad Católica Santa María . Arequipa-2005
F.2 Estudio de la Universidad de Montenegro-2011: Un estudio llevado a cabo en la Universidad de Montenegro-Serbia evaluó
la
actividad antimicrobiana del aceite esencial de Eucalyptus Globulus Labil contra 17 microorganismos, incluyendo bacterias que causan intoxicación alimentaria y deterioro humano. En un principio las hojas fueron recogidas desde un punto único. Las hojas fueron secadas al aire en la sombra a temperatura ambiente y se almacenaron en bolsas de papel de doble capa en una habitación, protegido de la luz directa, hasta análisis adicional. La identidad de la planta de especímenes fue confirmada en el Departamento de Biología, de la Universidad de Montenegro El agua inicial contenido en las hojas de hierba se encontró que era de 12,7% (w / w el material vegetal se molió en un molino de café y, después permanecieron en una bolsa de polipropileno con cierre hermético y se almacenó
a 8 ° C durante un
máximo de 3 días antes de utilizarse, con el fin de evitar las pérdidas de los compuestos volátiles. Luego el material vegetal (20 g) se sometió a hidrodestilación en un aparato Clevenger durante 2 h según la Farmacopea IV Yugoslava. El aceite obtenido se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se midió y se vertió en recipientes herméticamente cerrados de vidrio oscuro, luego se almacenó en un
37
Proyecto de investigación ESFB/FACS congelador a -4 ° C hasta que se analizaron por Cromatografía de gases-acoplada a espectroscopia de masas (GC-MS) Con el fin de evaluar la actividad antimicrobiana del aceite esencial de E. globulus, se
utilizaron:
como
cepas
de
referencia
Staphylococcus
aureus ATCC
5923, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC , y Candida albicans ATCC ; además el aislado de, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Streptococcus pyogenes, Morganella morganii, Providencia stuartii, Enterobacter cloacae, Acinetobacter baumannii, Citrobacter freundii,y Salmonella infantis
Determinación de la CMI y CMB.Para determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) y la mínima bactericida concentración (CMB) se utilizó el método de micro dilución en caldo Yu et al. (2004). Todas las pruebas se realizaron en caldo Mueller Hinton suplementado con Tween 80 a una concentración final de 0,5% (v / v). Brevemente, diluciones dobles seriadas del aceite se prepararon en una placa de microtitulación de 96 pocillos que osciló entre 0,09 mg / ml a 25,00 mg / ml. Se añadieron para cada pocillo10 uL de solución indicadora resazurina (preparada por disolución de un comprimido de 270-mg en 40 ml de agua destilada estéril) y 30 uL de caldo Mueller Hinton Finalmente, 10 uL de suspensión bacteriana (10 6UFC / ml) se añadió a cada pocillo para lograr una concentración de 10 4 CFU / ml. Dos columnas en cada placa se utilizaron como controles: una columna con un antibiótico de amplio espectro como control positivo (amykacine), y una columna que contiene metanol como un control negativo.
38
Proyecto de investigación ESFB/FACS Las placas fueron envueltas sin apretar con papel film para que las bacterias no se deshidraten. El plateado se prepararon por triplicado, y luego fueron colocados en una incubadora a 37 ° C durante 18-24 horas. El cambio de color se evaluó entonces visualmente. La concentración más baja a la que el cambio de color ocurrió fue tomada como el valor CMI. El promedio de 3 valores se calculó para proporcionar el CMI y CMB.
La CMI se define como la concentración más baja del aceite esencial en que el microorganismo
no
demuestra
el
crecimiento
visible. El
crecimiento
microorganismos se indica mediante turbidez. La CMB se definió
de
como la
concentración más baja del aceite esencial en que el microorganismo se incubó completamente muerto. Para evaluar la actividad antimicrobiana de Candida Albicans, se prepararon soluciones madre en agua para nistatina y en metanol para aceite. La dilución final fue
preparado
en
medio
RPMI
1640,
ajustado
a
pH
7,0
con
0.165M
morpholenepropane-tampón de ácido sulfónico, en el intervalo de 0,09 mg / ml a 25 mg / ml y el tamaño del inóculo de 10
3
CFU / ml. La Bandejas de microdilución se
incubaron en el aire ambiente a 35 ° C. La CMI se determino
visualmente después de 48 h de incubación, como la
concentración más baja del medicamento que no causó ningún crecimiento detectable. Finalmente se hallo el promedio de 3 valores y se logro calcular el CMI y la CMB para el aceite de prueba.
39
Proyecto de investigación ESFB/FACS
TABLA N°2 Actividad antimicrobiana del aceite esencial de E. globulus expresada como Concentración mínima inhibitoria (CMI) y concentración mínima bactericida (CMB)
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Proyecto de investigación ESFB/FACS
|
ACEITE DE EUCALIPTO (mg/ml)
MICROORGANISMO CMI
CMB
E. coli ATCC 25922
0.09
0.09
Proteus mirabilis
0.36
1.57
klebsiella pneumoniae
1.57
6.25
Staphylococcus aureus
0.09
0.18
C. albicans ATCC 10231
0.36
0.36
Enterobacteria
0.72
0.72
ATCC 25923
41
Proyecto de investigación ESFB/FACS Fuente: Damjanovic-Vratnica, B. Efecto antimicrobiano de los aceites esenciales aislados de Eucalyptus globulus Labill. desde Montenegro. En: Revista Checa de Ciencias de la Alimentación – UZEI. República Checa. Biblioteca Agrícola y Alimentaria, Instituto de Economía Agrícola y de la Información. Volumen 28 (3)
Podemos apreciar que la concentración mínima inhibitoria CMI osciló entre 0,09 mg / ml y 1,57 mg / ml, con la menor actividad para klebsiella pneumoniae (1,57 mg / ml), mientras que la
actividad más alta se observó contra S. aureus, E.
coli, y S. pyogenes (0,09 mg / ml). El CBM más bajo fue de 0,09 mg / ml para E. coli y S. pyogenes, mientras k. pneumoniae tuvo el mayor MBC de 6,25 mg / ml. Estos resultados confirman el uso potencial del aceite esencial del Eucalyptus globulus L. en la
industria
farmacéutica, el cual puede ser útil como agente
antimicrobiano natural para el tratamiento de numerosas las enfermedades infecciosas.
20
G. Toxicología del aceite esencial de eucalipto.El aceite esencial no es tóxico. Sin embargo, altas dosis del aceite son irritantes producen convulsión, delirio, dificultad respiratoria, gastroenteritis y hematuria Los datos sobre las muertes causadas por el consumo de aceite de eucalipto en los seres humanos no son compatibles, se ha producido casos de muerte después de el consumo de tan sólo 4-5 ml, mientras que otras personas se han enfermado y se han recuperado después de consumir 120-220 ml de aceite. Basado en estudios con roedores, la administración oral DL50 (la dosis por vía oral consumida que es letal para el 50% de los animales) para el aceite de eucalipto es muy alta 4.44g/kg por kilogramo de peso (BW) para ratas y la DL50 es menor cuando sólo se utiliza 1,8-cineol 2.48g/kg (BW) para las ratas. La DL50 por vía cutánea para los conejos es mayor que 5g/kg BW.
42
Proyecto de investigación ESFB/FACS El aceite por vía subcutánea en ratones hembras gestantes (135 mg/kg) durante la organogénesis (6-15 días) no provoca embriotoxicidad ni fetotoxicidad.
21
El aceite de eucalipto no se cree que es teratogénico o que pueda a contaminar la leche. Sin embargo, algunos estudios han indicado que el citronelal y felandreno, que se puede encontrar en algunos Eucalyptus spp. , son débiles mutagenicos . La. Food and Drug Administration de los EE.UU ha aprobado el uso de aceite de eucalipto y 1,8-cineol (eucaliptol) para el consumo humano. El Consejo de Europa también ha aprobado el uso del aceite como aditivo para la alimentación humana (a un nivel de 15 ppm). En Francia, las infusiones de E. globulus hojas pueden ser registrados como productos para el tratamiento de afecciones bronquiales benignas humanos sin estudios toxicológicos.22 2.3 Definición de términos básicos •
Inoculación: La inoculación o siembra es poner en contacto los microorganismos o la muestra Bacteriológica con los medios de cultivo.
•
Urocultivo: Siembra de un medio de cultivo con una pequeña cantidad de orina extraída asépticamente.
•
Tenesmo: deseo continuo, doloroso e ineficaz de orinar
•
Polaquiuria: Frecuencia exagerada de las micciones que no coincide necesariamente con el aumento del volumen total de orina
•
Disuria: Expulsión difícil, dolorosa e incompleta de la orina.
•
Fimbrias: Conjunto de filamentos o apéndices filiformes cortos que rodean algunas bacterias gramnegativas.
•
Actividad ureásica: Capacidad de aumentar el PH
43
Proyecto de investigación ESFB/FACS •
Citotóxico: Que posee la capacidad de destruir células, como la que poseen los macrófagos o los linfocitos K.
•
Febrífugo: Propiedad de una sustancia o planta medicinal que sirve para hacer bajar la fiebre.
•
Rubefaciente: Que provoca el enrojecimiento de la piel o de las mucosas con las que entra en contacto, en especial a través de la dilatación de los capilares.
•
Antihelmíntico: Dícese del fármaco que es capaz de expulsar o matar los gusanos intestinales. También se denomina vermífugo.
CAPÍTULO III METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN
3.1 Diseño de la investigación.-
3.1.1 Tipo de investigación: Este trabajo
es una investigación Pura ya que parte de un marco teórico y
permanece en él, su finalidad es formular nuevas teorías mediante la recolección de información. Es del tipo esencial
Descriptiva, porque está orientada a evaluar los efectos del aceite
sobre un determinado grupo de bacterias y describir la concentración
inhibitoria y bactericida.
3.1.2 Método: Inductivo, recolección de información
44
Proyecto de investigación ESFB/FACS 3.2 Población y muestreo de la investigación.Marco poblacional: Planta de Eucalyptus globulus Labill “Eucalipto”
3.3 Variables e indicadores.Variable independiente: •
Variable n° 1: Concentración mínima inhibitoria (CMI)
•
Variable n° 2: Concentración mínima bactericida (CMB)
Indicadores: mg/ml
3.4 Técnicas e instrumentos de recolección de datos.3.4.1 Técnicas: Recopilación de datos. 3.4.2 Instrumentos: Compilación y revisión de fuentes primarias de información: tesis, monografías; para establecer posteriores conclusiones.
45
Proyecto de investigación ESFB/FACS
Referencias Bibliográficas:
1.- Carranza Marco A. R., Rodríguez H Diana., Díaz F Jesús. Etiología y resistencia bacteriana de las infecciones urinarias. Revista Sociedad Peruana Medicina Interna 2003.Volumen 16(04) .Pág. 6 - 10 2.- Libertad Alzamora, Liliana Morales, Lourdes Armas, Gilma Fernández .Medicina tradicional en el Perú: Actividad antimicrobiana in vitro de los aceites esenciales extraídos de algunas plantas aromáticas. Revista: Anales de la facultad de Medicina. Universidad Mayor de San Marcos. Volumen 62(02) Pág. 156-161 3.-Valdevenito S. Juan Pablo. Infección urinaria recurrente en la mujer. Rev. Chilena Infectologia. 2008; Volumen 25(4): Pag.268-276. 4.- Muder RR, Brennen C, Rihs JD et al. Isolation of Staphylococcus Aureus from the Urinary Tract: Association of Isolation with Symptomatic Urinary Tract Infection and Subsequent Staphylococcal Bacteremia. Clinical Infectious Diseases 2006 Volumen 42(1).Pag.46-50. 5.- Gutierrez Valdivia Ranulfo .Mamani Romaní Wilmar. Efecto in vitro del Eucaliptus globulus Labill (eucalipto) sobre Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Shigella flexneri y Pseudomona aeruginosa, Universidad Católica Santa María. Arequipa-2005
46
Proyecto de investigación ESFB/FACS 6.- CIDEU .Centro de investigación y documentación del eucalipto. Universidad de Huelva .2006 7.- Rolando Quert Álvarez. Aceites Esenciales De Eucalipto. Revista Cubana Farmacia Volumen 35 (1)2009. Pag.29-35. 8.- Damjanovic-Vratnica, B. Efecto antimicrobiano de los aceites esenciales aislados de Eucalyptus globulus Labill. desde Montenegro. En: Revista Checa de Ciencias de la Alimentación – UZEI. República Checa. Biblioteca Agrícola y Alimentaria, Instituto de Economía Agrícola y de la Información. Volumen 28 (3) Pag. 277-284.
47
