UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ
FACULTAD DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
COMPARACIÓN DE LOS COMPUESTOS TERPÉNICOS DEL ACEITE ESENCIAL DE MUÑA (Minthostachys mollis) EXTRAÍDOS DE LAS HOJAS FRESCAS Y SECAS
PRESENTADO POR: Bach. CASTRO MATTOS MIGUEL ANGEL
ASESORA: M.Sc. NORMA GAMARRA MENDOZA
PARA OBTENER EL TÍTULO DE INGENIERO I NGENIERO EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
HUANCAYO 2012
UNIVERSIDAD NACIONAL NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ
FACULTAD DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS JURADO EXAMINADOR
M.Sc. NORA VELIZ SEDANO PRESIDENTE
ING. SERGIO ANCHIRAICO COSQUILLO SECRETARIO
M.Sc. EDGAR ACOSTA LOPEZ JURADO
M.Sc. MARIA GUTIERREZ GONZALES JURADO
ING. JOSE LUIS SOLIS ROJAS JURADO
2
ASESORA _______________________________________ _____________________________ __________ M.Sc. NORMA GAMA G AMARRA RRA MENDOZA _______________________________________ _____________________________ __________
3
DEDICATORIA
Al Señor Jesucristo, por su muerte vicaria vicaria y su resurrección física, quien guía y sostiene mi caminar. A mis padres, cuyo sacrificio es una bendición en mi vida. A la Comunidad Bíblica Universitaria, Universitaria, por ser una Escuela de Vida. A mis amigos, “el plato fuerte en el banquete de la vida”.
4
ÍNDICE DE CONTENIDOS TEMA I.
PÁGINA
RESUMEN
10
INTRODUCCIÓN
11
II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
13
2.1. MUÑA
13
2.1.1. Descripción botánica.
13
2.1.2. Taxonomía de la muña.
14
2.1.3. Distribución y especies.
14
2.1.4. Composición de la muña.
16
ESENCIALES 2.2. ACEITES ESENCIALES
17
2.2.1. Definición.
17
2.2.2. Isoprenos y terpenos.
18
2.2.3. Composición química y clasificación.
19
2.2.4. Propiedades.
21
2.2.5. Aceite esencial de muña. muña.
21
2.3. CARACTERIZACIÓN DE LOS ACEITES ESENCIALES
29
2.4. EXTRACCIÓN DE ACEITES ESENCIALES
35
III. MATERIALES Y MÉTODOS
37
3.1. LUGAR DE EJECUCIÓN.
37
3.2. MATERIA PRIMA.
37
3.3. EQUIPOS Y MATERIALES.
37
3.3.1. Equipos e instrumentos.
37
3.3.2. Materiales varios de laboratorio.
38
3.3.3. Reactivos.
39
3.4. MÉTODOS DE ANÁLISIS.
39 5
3.4.1. Materia prima
39
3.4.2. Aceite esencial
40
3.5. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
40
secado de la materia prima 3.5.1. Acondicionamiento y secado
40
3.5.2. Destilación por arrastre de vapor de agua.
41
3.5.3. Caracterización fisicoquímica del aceite esencial
42
3.5.4. Caracterización cromatográfica.
43
3.5.5. Descripción del diagrama de flujo.
44
3.5.6. Diseño experimental.
47
3.5.7. Análisis estadístico.
47
RESULTADOS Y DISCUSIONES
48
4.1. IDENTIFICACIÓN DE LA PLANTA.
48
4.2. DESTILACIÓN.
49
4.3. ANÁLISIS ANÁLISIS ORGANOLÉPTICO. ORGANOLÉPTICO.
54
4.4. ANÁLISIS ANÁLISIS FÍSICOS.
55
4.5. CARACTERIZACIÓN CROMATOGRÁFICA.
57
CONCLUSIONES
74
VI. RECOMENDACIONES
76
VII. BIBLIOGRAFÍA
77
VIII. ANEXOS
86
IV.
V.
Anexo I Identificación de la muña.
.
86
Anexo II Resultados cromatográficos del aceite esencial de muña (fresco y seco).
88
Anexo III Resultados estadísticos.
90
6
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Distribución de todas las especies de muña.
15
Figura 2: Estructura del isopreno.
19
Figura 3: Variabilidad de la composición terpénica.
23
Figura 4: Estructura química de la mentona y el mentol.
25
Figura 5: Estructura química de la pulegona.
25
Figura 6: Terpenos principales del aceite esencial de muña.
26
Figura 7: Cromatograma de aceite esencial de muña.
27
Figura 8: Partes principales de un cromatógrafo de gases.
32
Figura 9: Tipos de Cromatogramas: (1) Diferencial, (2) Integral.
33
Figura 10: Parámetros que definen un cromatograma.
34
Figura 11: Principio para la detección de los picos.
35
Figura 12: Diagrama de flujo experimental experimental de la extracción extracción de aceite esencial 46 Figura 13: Comportamiento de la extracción de aceite esencial de muña fresca 50 Figura 14: Comportamiento total de la extracción de aceite de hojas frescas.
50
Figura 15: Comportamiento de la extracción de aceite esencial de muña seca. 52 Figura 16: Comportamiento total de la extracción de aceite de hojas secas.
52
Figura 17: Cromatograma del aceite esencial (Muña fresca).
58
Figura 18: Cromatograma del aceite esencial (Muña seca).
59
Figura 19: Porcentaje de terpenos hallados (Muña fresca).
62
Figura 20: Porcentaje de terpenos hallados (Muña seca).
62
principales componentes de ambos aceites. aceites. 66 Figura 21: Comparación % de los principales
Figura 22: Porcentaje de Pulegona en ambos aceites esenciales.
67
Figura 23: porcentaje de Mentona en ambos aceites esenciales.
68
Figura 24: Variación de la cantidad de ambos terpenos.
68
Figura 25: Determinación del color de muña fresca mediante 7
la carta colorimétrica
87
Figura 26: ANVA para los tratamientos de la mentona.
90
Figura 27: Test de Duncan para los tratamientos de la mentona.
90
Figura 28: ANVA para los tratamientos de la pulegona.
91
Figura 29: Test de Duncan para los tratamientos de la pulegona.
91
8
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1: Composición de la muña.
16
Tabla 2: Propiedades físicas del aceite esencial de muña.
22
Tabla 3: IR y densidad relativa del aceite esencial de muña.
22
Tabla 4: Datos cromatográficos del aceite esencial de muña.
27
Tabla 5: Principales terpenos en el aceite esencial de muña
28
Tabla 6: Tabulación de datos de la destilación (hojas frescas).
49
Tabla 7: Tabulación de datos de la destilación (hojas secas).
51
Tabla 8: Resultados organolépticos del aceite esencial.
54
Tabla 9: IR y densidad relativa del aceite esencial.
56
Tabla 10: Porcentaje de los terpenos encontrados en el aceite esencial.
60
Tabla 11: Tiempo de retención de los terpenos encontrados.
61
Tabla 12: Tiempo de retención y % de área de terpenos mayoritarios de Muña fresca.
65
Tabla 13: Tiempo de retención y % de área de terpenos mayoritarios de Muña seca
65
mentona. Tabla 14: ANVA para el porcentaje de mentona.
72
Tabla 15: ANVA para el porcentaje de pulegona. pulegona.
72
Tabla 16: Características botánicas de la muña.
86
Tabla 17: Resultados de la cromatografía (hojas frescas).
88
Tabla 18: Resultados de la cromatografía (hojas frescas).
89
9
RESUMEN
Se determinó el porcentaje de mentona y pulegona en aceite esencial extraído de hojas frescas y secas de muña. La extracción se llevó a cabo mediante destilación por arrastre de vapor a una temperatura de 84 °C por 90 minutos. Se utilizó como materia prima hojas frescas (11,56 % de humedad) y secas (7,81 % de humedad). Éste último valor fue obtenido luego de secar las hojas por 7 horas a una temperatura constante de 35 °C en una secadora de bandejas. Los aceites esenciales obtenidos fueron separados del agua florentina por decantación, luego de 20 horas de reposo, posteriormente se determinó el índice de refracción y la densidad relativa. Finalmente se realizó la caracterización de los compuestos terpénicos mediante cromatografía de gases. El contenido de mentona y pulegona para el aceite esencial procedente de hojas frescas fue 30,168 % y 45,036 %, mientras que para el aceite esencial de hojas secas el contenido fue 24,818 % y 52,321 %, respectivamente. Se nota el descenso de la mentona y el aumento de la pulegona en el aceite esencial proveniente de hojas secas, debido a los factores que intervinieron en el proceso, así como a la estructura química de los terpenos. El análisis estadístico realizado mostró la diferencia significativa entre la cantidad de la mentona y pulegona encontrados en el aceite esencial extraído de hojas frescas y secas.
10
I.
INTRODUCCIÓN Los aditivos sintéticos representaron la base fundamental de la industria alimentaria durante la segunda mitad del siglo XX en las ciudades importantes de Sudamérica e incluso hasta hoy en el interior del país. Es sabido que su empleo puede producir la contaminación del agro ecosistema, los alimentos pueden contener residuos, etc. Por tales razones la ciencia ha volcado su atención hacia los productos naturales (alimentos funcionales) y sus componentes, los cuales carecerían de los efectos adversos anteriormente mencionados, analizándolos, comparándolos, extrayendo sus compuestos, etc., demostrando superioridad sobre compuestos artificiales en su aplicación en diferentes áreas. En esta perspectiva la industria alimentaria ha incrementado la demanda de esencias y aromatizantes de procedencia natural, como el limoneno, la pulegona o el mentol (terpenos de los aceites esenciales), provenientes de los aceites esenciales para la utilización en confitería.
Ahora bien, se requiere investigar la composición de los aceites esenciales esenciales de las principales hierbas aromáticas y, lo que es más importante, entender cómo varía la cantidad de los componentes terpénicos mayoritarios cuando las hierbas son secadas para almacenamiento u otros fines. La presente investigación contribuirá en resolver el problema de la limitada cantidad de estudios descriptivos sobre los principales terpenos contenidos en el aceite esencial de muña. Para tal efecto se comparó la cantidad de los dos principales terpenos del aceite esencial de muña extraído por destilación por arrastre de vapor: la mentona y la pulegona de dos tipos de hojas, mediante análisis físicos y cromatográficos.
11
Los objetivos específicos fueron los siguientes:
Evaluar el comportamiento comportamiento de la destilación por por arrastre de vapor para la extracción de aceite esencial de hojas frescas y secas de muña.
Comparar los resultados organolépticos y físicos (Índice de refracción y
densidad relativa) de ambos aceites extraídos.
Identificar los componentes terpénicos mayoritarios en en el aceite esencial de hojas secas y frescas mediante cromatografía de gases.
12
II.
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA BIBLIOGRÁFICA
2.1. MUÑA 2.1.1. Descripción botánica. Es una planta arbustiva (Yapuchura, 2010), leñosa, que alcanza de 0,80 m y 1,50 m, frondosa en la parte superior, erecta y pubescente. Su tallo es ramificado desde la base. Sus flores son blancas y se encuentran reunidas en cortos racimos, situados en la parte superior de las ramas como pedúnculos cortos, teniendo 2 en cada axila, los cuales sirven para su multiplicación. Seguil (1990) menciona que las hojas son simples, opuestas, pecioladas y de bordes aserrados. Posee pelos en la cara inferior de las hojas y en los peciolos (Pezón que sostiene la hoja). Pertenece a un género de interés botánico, farmacéutico y económico debido a los aceites aromáticos encontrados en las glándulas celulares de las hojas y tallos (Schmidt-Lebuhn, 2009).
13
2.1.2. Taxonomía de la muña. La clasificación taxonómica es la siguiente (Aquino, 2007): Reino
:
Vegetal
División
:
Magnoliophyta
Clase
:
Magnoliopsida
Subclase
:
Asteridae
Orden
:
Verbenales
Familia
:
Lamiaceae
Género
:
Minthostachys (Benth.) Spach
Especie
:
Minthostachys mollis (Kunth) Grisebach
2.1.3. Distribución y especies. Crece entre los 500 a 4000 m.s.n.m., por toda Sud-América, desde Argentina (Córdoba) hasta Venezuela (Monagas y Sucre) (SchmidtLebuhn, 2009; Aquino, 2007), particularmente en Perú, Bolivia, Ecuador y Argentina, tomando distintos nombres en cada país. Crece en el campo silvestre de manera espontánea (Seguil, 1990), en bosques nublados, ambientes húmedos o en pendientes secas, arenosas y rocosas (Schmidt-Lebuhn, 2009). En la figura 1 se ven las zonas, marcadas con puntos, en las cuales crece el género Minthostachys.
14
Fuente: Schmidt-Lebuhn (2009) Figura 1: Distribución de todas las especies de muña. Actualmente, y como resultado de las investigaciones morfológicas y taxonómicas, se sabe que hay 17 especies, una con tres variedades, encontradas en Sudamérica, principalmente en los centros de diversidad, Bolivia y el sur de Perú. A continuación se presentan algunas de ellas (Schmidt-Lebuhn, 2005 y 2009):
M. mollis (Kunth) Griseb. Tiene un cáliz densamente velloso alrededor
de la base, es lobulado, dentado, herbáceo, el tubo de la corola es de 2,5 a 4 mm de largo, las hojas son vellosas al envés. Existen tres sub variedades de esta especie (Schmidt-Lebuhn, 2009), la Minthostachys mollis hybrida Schmidt-Leb., de Colombia y Venezuela, más o menos
agudas en sus bases; la Minthostachys mollis mandoniana (Briq) Schmidt-Leb., del sur de Perú y de Bolivia, posee hojas relativamente
15
largas; y la Minthostachys mollis mollis, desde Venezuela hasta el centro del Perú. Posee enorme variabilidad.
M. setosa (Briq.) Epling. De los bosques húmedos de Cochabamba.
M. spicata (Benth.) Epling. De la cordillera occidental del Perú.
Presente en condiciones secas.
M. verticillata (Griseb.) Epling. Única nativa de Argentina, pero también
la económicamente más importante.
2.1.4. Composición de la muña En la tabla 1 se presenta la composición de 100 g de muña.
Tabla 1: Composición de la muña. Componente
Cantidad (%)
Humedad
16
Proteínas
3,2
Grasas
2,8
Carbohidratos
66,3
Fibra
9,4
Ceniza
11,7
Calcio
2237 mg
Fosforo
269 mg
Hierro
22,4 mg
Retinol
306 mg
Tiamina
306 mg
Riboflavina
1,81 mg
Niacina
6,85 mg
Energía
268 kcal
Fuente: Yapuchura (2010)
16
2.2. ACEITES ACEITES ESENCIALES 2.2.1. Definición. Internacionalmente se define a los aceites esenciales como un producto obtenido por hidrodestilación, destilación por arrastre de vapor, destilación seca o algún otro proceso mecánico sin calor, de toda o alguna parte de la planta (Graça, 2010). Por su parte Camacho (2011) dice que un aceite esencial es una mezcla de componentes et al (2011) terpénicos volátiles producto del metabolismo secundario de las plantas en cuya composición interviene una proporción de hidrocarburos de la serie polimetilénica del grupo de los terpenos que responden a la fórmula (C5H8)n, junto con otros compuestos casi siempre oxigenados (sean estos alcoholes, ésteres, éteres, aldehídos y compuestos fenólicos) que son los que transmiten a los aceites el aroma que los caracteriza. Los más olorosos se encuentran en zonas tropicales, donde la energía solar es grande. Zekaria (2007) dice que tras la biosíntesis éstos compuestos se almacenan en distintos órganos de la planta. El aceite esencial es guardado como microgotas en las glándulas, aquellos necesitan difundirse hacia el exterior. Para esto el aceite esencial atraviesa las paredes de las glándulas y las microgotas llegan a la superficie, se evaporan y llenan el aire con su perfume. Mayormente son de olor agradable, aunque existen excepciones como el aceite esencial del ajo y la cebolla, esto debido a los compuestos azufrados que hay en ellos (Albarracín y Gallo, 2003; Zekaria, 2007). A nivel biológico cumplen varias funciones, según Morales (1973) y Beltrán (1983) influyen en la atracción de insectos o su repulsión;
17
también actúa como cicatrizante de lesiones sufridas en la planta, para que no se evapore el agua interior por las lesiones. Funcionan hormonalmente en la polinización, pues en la floración los aceites esenciales van a las flores. Físicamente actúan como reguladores de la conductividad de calor del agua y de la presión osmótica. Metabólicamente desciende la concentración de aceite en las plantas que crecen a la sombra. Beltrán (1983) menciona que también actúan como sustancias de reserva, es decir como dadores de hidrógeno para los procesos de oxi-reducción y funcionarían también como fuentes de energía durante interrupciones en la asimilación normal de anhídrido carbónico.
2.2.2. Isoprenos y terpenos. Morrison y Boyd (1990) los comparan con bloques de construcción desde los cuales se forman muchas sustancias, como ladrillos de una pared. Una de estas unidades es el isopreno. Casi todos los terpenos (que se hallan en los aceites esenciales) tienen esqueletos carbonados construidos con unidades de isopreno unidas entre sí de un modo muy regular, es decir, en palabras simples, de pies a cabeza. La importancia del isopreno es tal que el colesterol y la vitamina A se constituyen paso a paso, de unidades isoprénicas. En la figura 2 encontramos la estructura química del isopreno, con su característica forma de silla. Se dice que tanto la molécula como la unidad de isopreno tienen una “cabeza” (el extremo ramificado) y una “cola” (el
extremo etilo no ramificado). La fórmula condensada de los terpenos es C10H16. (Vitoria, 1948).
18
Fuente: Wade (1993) Figura 2: Estructura del isopreno. La combinación de isoprenos forma monoterpenos y sesquiterpenos. Todos ellos son líquidos (menos el canfeno), muy refringentes, incoloros, muchos de ellos ópticamente activos. Su punto de ebullición suele estar entre 160 °C y 180 °C, por lo cual al extraerlos se obtienen mezclas de ellos. Entre los terpenos (o monoterpenos) y los sesquiterpenos (C 15H24) podemos ver que los primeros son más volátiles, menos polares y su punto de ebullición es menor; los segundos son más estables a temperatura ambiente, más polares y su punto de ebullición es mayor. Fundamentalmente hay dos tipos de monoterpenos y sesquiterpenos, los oxigenados y los no oxigenados.
2.2.3. Composición química química y clasificación. Cerruti y Neumayer (2004) dicen que dentro de sus más de 100 componentes, podemos agruparlos en compuestos alifáticos de bajo peso molecular (alcanos, alcoholes, aldehídos, cetonas, ésteres y ácidos), monoterpenos, sesquiterpenos, fenilpropanos. Castañeda (2008) clasifica la composición de una manera distinta: Esencias hidrocarbonadas: monoterpenos (limoneno) y sesquiterpenos; Esencias oxigenadas: ésteres, por ejemplo éster de metilo; aldehídos terpénicos y aldehídos aromáticos (vainillina); cetonas; alcoholes monoterpénicos 19
y diterpénicos (timol, terpineol, mentol, linalol, geraniol, citronelol); fenoles
(carvacrol);
cetonas
(d-carvona);
óxidos;
compuestos
azufrados; compuestos nitrogenados; ácidos; cumarinas; éteres (eugenol, anetol). Se clasifican a los aceites esenciales de acuerdo a consistencia, origen y naturaleza química de los componentes mayoritarios (Cerruti y Neumayer, 2004). Consistencia: Se dividen en fluidas (líquidas a temperatura
ambiente), Bálsamos (espesos y poco volátiles como la copaiba) y Oleorresinas (líquidos muy viscosos o semisólidos como el caucho), según Albarracín et al (2003) (2003) y Castañeda (2008). Origen: Naturales (extraídas de las mismas plantas, sin
modificación
alguna,
con
bajo
rendimiento),
artificiales
(enriquecimiento de la esencia o mezcla con otras. Ejemplos son los aceites de rosa, geranio y jazmín) jazmín) y sintéticas, es decir sintetizados químicamente como la esencia de vainilla (Castañeda, 2008).
Por sus componentes componentes mayoritarios: Tenemos tres grupos, los monoterpenos (como el aceite de hierbabuena) con 10 átomos de carbono, derivados del Geranilpirofosfato (GPP); sesquiterpenos (como el aceite de pino o copaiba) con 15 átomos de carbono, derivados de Farnesilpirofosfato (FPP); los Fenilpropanoides, como aceite de clavo, canela, anís, contiene un anillo aromático unido a una cadena cadena de tres carbonos. (Castañeda, (Castañeda, 2008; Martínez, 2003; Albarracín y Gallo, 2003).
20
2.2.4. Propiedades. Son líquidos a temperatura ambiente (Beltrán, 1983; Castañeda, 2008); de aspecto oleoso, solubles en éter de petróleo (Castañeda, 2008), en tetracloruro de carbono y otros disolventes orgánicos. (Albarracín y Gallo, 2003). Se unen con facilidad a las grasas y aceites fijos. Poseen olor variable o intenso (Castañeda, 2008), así como su sabor acre, caustico e irritante y a veces aromático dulce y delicado (Albarracín y Gallo, 2003). Incoloros en estado puro. (Castañeda, 2008). Punto de ebullición entre 150 y 300 °C (Beltrán, 1983). Sensibles a la oxidación, se polimerizan, dando productos resinosos. Índice de refracción elevado (Castañeda, 2008). La luz los vuelve amarillos y oscuros modificando su perfume. La mayoría es menos densa que el agua; su densidad relativa es a 15 °C, de 0,84 a 1,2. El punto de ebullición varía entre 150°C a 300°C. (Albarracín y Gallo, 2003; Castañeda, 2008).
2.2.5. Aceite esencial esencial de muña. El olor aromático de la muña se debe al contenido de aceite esencial que posee la planta (Kumoro et al, 2010) el cual se encuentra ubicado principalmente en las hojas y tallos en más del 98%; Es un líquido incoloro y de sabor ardiente, obtenido por destilación con vapor húmedo o vapor seco. El vapor hincha la pared y por ósmosis la
21
esencia fluye al exterior, sin embargo puede hidrolizarse en el proceso generando ésteres (Seguil, 1990). En la tabla 2 se encuentran las características del aceite esencial de muña y en la tabla 3 sus parámetros físicos.
Tabla 2: Propiedades físicas del aceite esencial de muña. Cano et al
Característica
(2008)
Seguil (1990)
Ligeramente
Color
Aquino (2007)
Incoloro
Amarillento
Mentol
Agradable
Picante con
Ligeramente
frescor
picante
amarillo.
Fuertes y Munguía (2001) Ligeramente amarillo
Olor
Similar al mentol.
Sabor
Picante fresco.
Aspecto
Líquido fluido.
Líquido limpio
-
Líquido oleoso
0,9189
0,9295 (20 °C)
0,852 g/mL
0,9189
1,4727
1,5689
1,487
1,4727
Densidad relativa (25 °C), d2020
Fuerte Picante
Índice de refracción (20 °C), n2020
Otros investigadores reportan sólo los resultados físicos:
Tabla 3: IR y densidad relativa del aceite esencial de muña. Referencia IR Densidad relativa USP Menta piperita
1,45
0,899
ISO Menta piperita2
1,46
0,9
Lima
1,469
0,92
Huancayo Huancayo
1,4983
0,9868 0,9868
Fuente: 1-3Morales (1973); 4 Beltrán (1983).
22
Sobre composición del aceite esencial de muña existe mucha variabilidad en los resultados de los estudios realizados. Esta diferencia no solo se da en la presencia o ausencia de tal o cual terpeno, sino respecto a su porcentaje y a la especie, así como a su lugar de procedencia. Este concepto se condensa en la figura 3. La variabilidad se presenta en función de varios factores, como el lugar de procedencia y la sub especie (Morales, 1973). Seguil (1990) detalla varios estudios con resultados variables, por ejemplo uno presenta α pineno, β pineno y limoneno, mientras que otros no. También Fuertes y
Munguía (2001) estudió la composición de tres extractos de aceite esencial de la sierra del país obteniendo los siguientes resultados: Aceite esencial de muña (Tarma): 1-tetradeceno (23,14 %), 2s-transmentona (23 %) y pulegona (13,21 %); Aceite esencial de muña (Huaraz): 2s-trans-mentona (41,48 %) y pulegona (16, 02 %), γterpineno (7,55%); Aceite esencial de muña (Pampas): 2s-transmentona (34,51%) y pulegona (28,62 %) y nerodilol (5,08%).
Fuente: Schmidt-Lebuhn (2005) Figura 3: Variabilidad de la composición terpénica. 23
No obstante lo anterior puede asegurarse la presencia de dos terpenos mayoritarios en todos los aceites esenciales de la Minthostachys mollis: la Pulegona y la Mentona (Schmidt-Lebuhn, 2009). Tomados individualmente, las características de cada terpeno mayoritario son las siguientes: Mentona; es una cetona, de sabor áspero y amargo, más o menos
soluble en agua. Se origina por oxidación de alcohol secundario y reducción de metionina. Existe una relación con el mentol. A más mentol, menos Mentona y viceversa (Morales, 1973). Junto a la Pulegona conforman el 75% de componentes terpénicos. Es mejor conocido como constituyente de la Menta piperita. Posee un aroma muy característico por el cual es usado en perfumería. Además posee propiedades digestivas. En la figura 4a se muestra su estructura cíclica y su radical cetona. Su punto de ebullición es 206 °C; su gravedad específica 0,894; la rotación óptica, -26° y el índice de refracción 1,4995 (Morales, 1973). Mentol ; se encuentra en pequeñas cantidades. Es usado como
refrescante y contra el dolor de garganta. Posee un radical alcohol que da al aceite el sabor y olor. Es estado puro se presenta en forma de cristal hexagonal, incoloro y brillante. Es un alcohol terpénico monocíclico y saturado, posee tres átomos de carbono asimétricos. Existe en dos formas L-mentol y D-mentol, siendo de mayor interés el primero pues su olor es 3,3 a 3,5 veces mayor que el segundo, de acuerdo a Morales (1973). En la figura 4b se muestra su estructura química, unida a un radical hidroxilo. Su punto de fusión es 43-45°C;
24
Punto de ebullición 126 – 215°C; Gravedad especifica 0,881; Rotación especifica -50°. Se forma por reducción de la mentona y la pulegona (Morales, 1973).
a) b) Fuente: Merck (2012), Merck (2012) 2 Figura 4: Estructura química de la mentona y el mentol. Pulegona; uno de los más importantes terpenos de muchos aceites de Minthostachys, es altamente tóxico en grandes cantidades, incluso
induce al aborto. Su toxicidad explica probablemente el efecto del aceite contra pestes y parásitos. Esta sustancia es usada en perfumería y como saborizante. Su estructura se muestra en la figura 5. Carvacrol ; esta es la tercera sustancia en importancia del aceite. El
más importante de los terpenos de baja proporción. Se lo conoce mejor en el aceite de orégano. Es muy requerido como sazonador, pues se lo utiliza como ingrediente en la preparación de las pizzas.
Fuente: Merck (20123). Figura 5: Estructura química de la pulegona. 25
Linalol ; empleado como sazonador y como insecticida. Se le encuentra
en pequeñas cantidades. Timol ; como su nombre sugiere, este terpeno es mejor conocido en las
especies Thymus. Se usa como un antiséptico. Otros terpenos minoritarios son: limoneno, sabineno y pineno. El consolidado de las estructuras químicas se observa en la f igura 6.
Fuente: Schmidt-Lebuhn (2005). Figura 6: Terpenos principales del aceite esencial de muña. Estos compuestos fueron identificados por métodos cromatográficos, por ejemplo Cano et al (2008) identificaron los metabolitos presentes en el aceite esencial de muña para estudiar su actividad antimicótica in vitro. Sus resultados se resumen en la tabla 4. Se encontraron 2
terpenos mayoritarios (pulegona y mentona). En la misma tabla también se muestra el tiempo de retención. En la figura 7 se aprecia el cromatograma obtenido luego del análisis realizado.
26
Figura 7: Cromatograma de aceite esencial de muña. Fuente: Cano (2007).
Tabla 4: Datos cromatográficos del aceite esencial de muña. Metabolito Tiempo de retención (min) Composición (%) Pulegona
13,20
36,88
Mentona
11,09
24,24
Limoneno
5,32
0,77
Mirceno Mentol
Trazas 12,8
No detectable
(2008). Fuente: Cano et al (2008).
Otras investigaciones muestran la cantidad de cada componente terpénico mayoritario, como en la tabla 5:
27
Tabla 5: Principales terpenos en el aceite esencial de muña.
Fuente: 1, 2, 3: Fuertes y Munguía (2001); 4,5: Gûiza y Rincón (2007); 6: Cano (2007); 7: Zegarra (2010); 8: Chaquilla et al (2011); (2011); 9: Arauco (2010) y 10: Azaña (2010). et al (2010)
Se nota claramente que la pulegona y la mentona son los primeros compuestos terpénicos encontrados, seguidos, con mucha variabilidad, del mentol, el Linalol y el limoneno. Respecto a los usos del aceite esencial de muña, Schmidt-Lebuhn (2009) menciona que se utilizan sus componentes terpénicos en perfumería; por su parte Morales (1973) detalla su utilización como farmacéutico, para cremas dentales, jabones, perfumería, en confitería para elaboración de chicles, cigarros, licores, jaleas, helados, flan y queques o pueden ser destinados como esencias aromatizantes. Se utilizan los compuestos terpénicos como principios activos con fines medicinales en la producción de antibióticos que no dañen al estómago, en jarabes para la tos y soluciones antisépticas superficiales (Aquino, 2007).
28
Cano (2009) y Cano et al (2008) (2008) estudiaron uno de los usos del aceite esencial
de
muña
en
función
a
su
actividad
antimicótica,
probablemente por los m monoterpenos onoterpenos encontrados. Los terpenoides del aceite esencial de muña, según este estudio, afectan la actividad de las enzimas catalizadoras a nivel de membrana, es decir interfieren en la traslocación de protones sobre la membrana. Ellos concluyen que el aceite esencial de muña puede ser una alternativa terapéutica a la dermatomicosis; sin embargo se requeriría evaluar una formulación en crema a diferentes concentraciones de aceite esencial (25 – 50%) y en animales de experimentación, para luego poder validar su posible uso en humanos. Debe destacarse que la muña posee diferentes quimiotipos, que incluso el aceite esencial de una planta varia respecto a otra, aún perteneciendo a plantas cosechadas en el mismo lugar, esto debido a la heterogeneidad de la muña y a su condición silvestre. Para remediar este problema se debería plantear la investigación de los quimiotipos.
2.3. CARACTERIZACIÓN DE LOS ACEITES ESENCIALES. Se realiza mediante la Cromatografía de gases (CG), un proceso mediante el cual una mezcla es separada en sus componentes por medio de una fase móvil gaseosa que pasa a través de un absorbente sólido fijo (Kirk et al, 1996). Sirve tanto para identificar como para cuantificar analitos (Calle y Hernández, 2006; Acosta et al, 2003; De los Ángeles, 2008; Gonzales, 2004). Su ventaja es la cantidad de muestra necesaria para analizar, que es de 10 μg a 500μg.
29
a) Descripción de la técnica:
Fase móvil: La fase móvil gaseosa proporciona un rápido equilibrio entre las fases con mayor eficiencia en la obtención de los análisis. Los gases más utilizados son: nitrógeno, helio, hidrógeno y argón. La fase móvil no debe interactuar con la fase estacionaria ni con la muestra, debe tener bajo costo, ser compatible con el detector y tener alta pureza. Para dar una mayor reproducibilidad al análisis, la saturación del gas debe ser constante y debe ser controlada a través de válvulas de aguja (Rivera, 2008).
Sistemas de inyección: La inyección se realiza generalmente con microjeringas que contienen la muestra. El volumen inyectado no debe superar la capacidad de la columna y entre más pequeño sea el volumen usado de la muestra mayor será la eficiencia y la reproducibilidad del análisis. La temperatura aplicada debe ser suficiente para la volatilización de la muestra.
Columnas: La columna consiste en un tubo largo que contiene la fase estacionaria. Los materiales más usados son el cobre, el acero, el aluminio, el vidrio y el teflón. El material de la columna no debe interaccionar con la fase estacionaria ni con la muestra.
Sistema de detectores: Las sustancias presentes en la muestra pasan a través de la columna, en donde son separadas y llegan al sistema de detección. Con relación a la selectividad, los detectores pueden ser clasificados en universales y selectivos o específicos. Los detectores universales miden la variación de una propiedad del gas de arrastre que sale de la columna mientras que los detectores específicos miden
30
una propiedad característica de una determinada clase de sustancias. Con relación a la sensibilidad, los detectores cuya respuesta r espuesta varía poco por cambios en la velocidad de flujo de la fase móvil, son llamados detectores sensibles de flujo de masa. En estos detectores la sensibilidad se define como la relación del área de pico a la masa inyectada. En los detectores sensibles a la concentración, la respuesta varía en función del flujo de la fase móvil y su sensibilidad se define como el producto del área del pico por el flujo de la fase móvil dividido por la masa inyectada. La respuesta del detector debe ser lineal dentro de un amplio intervalo de concentraciones. Este intervalo de concentraciones se conoce como intervalo lineal dinámico y corresponde a la diferencia entre la concentración máxima del intervalo lineal dinámico y la mínima concentración del mismo y que debe distinguirse de la señal de fondo del detector. El análisis cuantitativo se puede llevar a cabo gracias a la relación directa que existe entre la respuesta del detector y la concentración de la muestra, siempre y cuando la respuesta obtenida para la muestra se encuentre dentro de ese intervalo (Rivera, 2008). El detector registra el cambio de presión y esto sirve para comparar los picos impresos, los cuales se dan en función a tiempos de retención. El tiempo de retención es aquel que transcurre después de la inyección de la muestra para que el pico del analito alcance el detector. Su símbolo es t R, (De los Ángeles, 2008; Zorca et al, 2006). Luego, para establecer el porcentaje de cada componente se recurre al método de normalización de área, el cual se calcula dividiendo el área de cada
31
componente entre el área total del cromatograma y multiplicándolo por 100%, es decir: % =
× 100
Respecto a la instrumentación, la figura 8 muestra un diagrama esquemático de un cromatógrafo de gases. Consiste en 5 partes principales: un suministro de gas vehículo (la fase móvil) con reguladores de presión y medidores de flujo; el sistema de inyección; la columna cromatográfica y la estufa; el detector y sus amplificadores electrónicos; el graficador y otros aditamentos para la presentación de datos (Kirk et al, 1996).
Fuente: Etxebarria y Fernández (2006). Figura 8: Partes principales de un cromatógrafo de gases. b) Cromatogramas Es la representación de la respuesta o señal del sistema de detección continuo o discontinuo en función del tiempo, volumen del eluyente o distancia en el lecho cromatográfico. El cromatograma toma la forma de un registro en la carta de un registrador o plotter o un número determinado de datos tomados por un microcomputador después de la correspondiente transformación. Según el tipo de detector continuo, el 32
cromatograma puede ser diferencial, cuando la señal solo se origina al pasar analito por el mismo, e integral, cuando la señal se acumula, como se aprecia en la figura 9.
Fuente: Rivera (2008). Figura 9: Tipos de Cromatogramas: (1) Diferencial, (2) Integral.
El cromatograma contiene la información analítica relativa a la muestra (complejidad: número de picos, detección cualitativa y/o cuantitativa de uno
o
varios
componentes).
Los
parámetros
que
comportamiento
cromatográfico
de
un
en
soluto
definen un
el
sistema
cromatográfico de elución, y que sirve de base para los cálculos analíticos se muestran en el esquema de la Figura 10, como el tiempo de retención (TR), volumen de retención (V R), tiempo muerto (T M), volumen muerto (VM), área (A), altura del pico (h) y base del pico (w).
33
Fuente: Rivera (2008). Figura 10: Parámetros que definen un cromatograma. En el ajuste de datos, el software realiza en primer lugar un ajuste de datos, con la finalidad de eliminar el ruido y permitir el correcto funcionamiento del algoritmo de integración. En la integración de los picos, el algoritmo de integración del cromatograma es capaz de distinguir diferentes casos de picos cromatográficos en los cuales la línea de base se fija de distinta manera. Para ello se tiene en cuenta el valor de la señal, su derivada (D1) y su derivada segunda (D2). Se considera detectado el comienzo del pico cuando la derivada primera de la señal supera un valor prefijado (D1 > Ls) punto 2 de la Figura 11. Cuando la derivada pasa por cero siendo la derivada segunda negativa, se detecta el máximo (D1=0, D2<0) Punto 3 de la Figura 11. El final de pico se detecta cuando la derivada segunda es positiva y la derivada primera supera el valor prefijado (D1>Li) Punto 4 de la Figura 11. Los valores de Ls y Li pueden ser variables a lo largo del cromatograma, lo cual permite compensar el efecto de ensanchamiento 34
de los picos. El tiempo de retención que identifica al componente es aquel en el cual ocurre el máximo, punto 3 de la Figura 11. La línea de base es una recta que une los puntos 2 y 4. Para calcular el área se resta el área bajo la línea de base del área bajo la curva de la señal (Rivera, 2008).
Fuente: Rivera (2008). Figura 11: Principio para la detección de los picos. Picos superpuestos: En el caso de dos o más picos fusionados o superpuestos se traza una línea de base entre el comienzo del primero y el fin del último. El criterio usual es trazar rectas verticales desde los valles hasta la línea de base común y en base a esta división se asignan las áreas.
2.4. EXTRACCIÓN DE ACEITES ESENCIALES Para extraer aceites esenciales de la muña se utiliza la destilación por arrastre de vapor (Castañeda, 2008; Cerruti y Neumayer, 2004; Martínez, 2003). La muestra es encerrada en una cámara inerte y sometida a una corriente de vapor de agua sobrecalentado (Cano et al , 2008). Por efecto de la temperatura del vapor en un cierto tiempo, el tejido vegetal se rompe
35
liberando el aceite esencial contenido y éste a su vez, debido a su alta volatilidad es arrastrado por el vapor de agua hacia el condensador para ser enfriada y separada, debido a su inmiscibilidad y a la diferencia de densidades y viscosidad con el agua (Castañeda, 2008). El principio básico de la destilación de dos líquidos heterogéneos, como el agua y un aceite esencial, es que cada uno ejerce su propia presión de vapor como si el otro componente estuviera ausente. Cuando las presiones de vapor combinadas alcanzan la presión del recinto, la mezcla hierve. Aceites esenciales con puntos de ebullición hasta 300°C, evaporarán a temperaturas cercanas al punto de ebullición más alto que el agua (100°C). La destilación por arrastre de vapor se realiza en tres etapas (Camacho, et al 2011): Calentamiento, extracción y enfriamiento. Cada una de ellas involucra diferentes fenómenos de transferencia de calor, adicionalmente en la etapa de extracción se presenta transferencia de masa. En la Etapa de calentamiento; se suministra vapor de agua desde la caldera hacia el
reactor, hasta cuando comienza a evaporarse los aceites y son entonces arrastrados hacia el condensador; es allí donde el vapor de agua transfiere calor latente al material vegetal; La Etapa de extracción se inicia en el momento en que comienza la producción de condensado de agua-aceite; aquí se determina el tiempo necesario para la extracción. La transferencia de masa en esta etapa se refiere a la cantidad de aceite que es arrastrado por el vapor. En la Etapa de enfriamiento; se condensan los vapores de aguaaceite que provienen del destilado, después se enfría para separar las fases y obtener el aceite por decantación (Castañeda, 2008).
36
III.
MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. LUGAR DE EJECUCIÓN. La investigación se desarrolló en las instalaciones del laboratorio de química de alimentos, de la Facultad de Ingeniería en Industrias Alimentarias, en la Universidad Nacional del Centro del Perú – Huancayo; y en el laboratorio de investigación fisicoquímica de la Facultad de Ciencias, en la Universidad Nacional de Ingeniería, Lima.
3.2. MATERIA PRIMA. Muña (Minthostachys mollis) en estado de prefloración, del anexo de Tulumayo, distrito de Comas, provincia de Concepción, departamento Junín.
3.3. EQUIPOS Y MATERIALES. 3.3.1. Equipos e instrumentos.
Balanza analítica, Adventurer OHAUS. Capacidad, ± 310 g. precisión ± 0,01 g.
Balanza comercial, Cavory, Capacidad, 15 kg.
Termómetros, 150°C 37
Higrómetro Digital. Digital. IN: -10°C ~ + 50°C; OUT: -50°C ~ + 70°C; Precisión: ±1°C; Humedad: 20% ~ 99% ±5%.
Secadora de bandejas, 30 – 100 °C
Computadora Samsung.
Cromatógrafo de gases, gases, Varian 450-GC. Columna Supelcowax 10, 30 mm×0,53 mm.
Mini carta colorimétrica, flower council Holland, RHS.
Refractómetro. ABBE Óptico Grados Brix 0 - 95 / IR-1700
Temporizador. Control Company , 4 tiempos.
Olla a presión Oster, Capacidad, 10 L.
Cocinilla eléctrica.
3.3.2. Materiales varios de laboratorio
Probetas, 50 y 100 mL
Matraz erlenmeyer 50 y 100 mL
Matraz kitazato, 250 mL
Vasos de precipitación 10, 50, 100 y 250 mL
Embudo de vidrio.
Pinzas metálicas.
Cápsulas.
Balones, 250 mL
Balón con vástago, 500 mL.
Balón de 3 picos, 500 mL.
Equipo refrigerante.
Campana desecadora.
Mangueras de goma y silicona. 38
Soportes universales con accesorios.
Peras de decantación, 500mL.
Rejilla de asbesto.
Picnómetro.
Fiola de 100 mL y 50 mL
Pipetas, 1, 5, 10 mL
Succionadores.
Varillas de vidrio.
Micro jeringa, 1 mL.
Pizetas.
Crisoles.
Papel filtro Whatman.
Tubos capilares de vidrio.
3.3.3. Reactivos
Alcohol etílico.
Hexano, grado CG
Helio, gas transportador, grado CG
Agua destilada p.a. Trifarma.
Cloruro de sodio al 10%. Lab. Sanderson S.A.
3.4. MÉTODOS DE ANÁLISIS. 3.4.1. Materia prima.
Identificación de la planta recolectada, según según el método de Jones (1988). La determinación de color de las hojas se realizó
39
comparándolas con las escala de colores de la Mini carta, Flower Council Holland, RHS (UPOV, 2012).
Determinación de humedad inicial y final de las hojas de muña, según el método gravimétrico de diferencia de peso con el extracto seco, AOAC.
3.4.2. Aceite esencial.
Análisis organoléptico de los aceites esenciales extraídos. Se utilizó utilizó el método adaptado de Dixit (2006).
Determinación del rendimiento, el el índice índice de refracción por el método método refractométrico y la densidad específica a 20 °C.
Composición de los principales terpenos de de los aceites esenciales esenciales mediante cromatografía de gases, por el método de normalización de área, según Fuertes y Munguía (2001).
3.5. METODOLOGÍA METODOLOGÍA EXPERIMENTAL 3.5.1. Acondicionamiento y secado de la materia prima. Se recolectaron 12 kg de plantas de muña fresca. Con ayuda de unos guantes se separaron las hojas medianas y grandes del tallo, para evitar el contacto directo de las manos con las hierbas. Del total de hojas, se utilizó 3 kg para la extracción de aceite esencial de hojas de muña fresca y se utilizó 9 kg para el secado posterior. En todas estas operaciones se protegió a la muña de la luz directa del sol. Se realizó la determinación de humedad inicial y final de las hojas de muña, después del secado, según el método de la estufa de aire de Hart y Fisher (1971). El secado se realizó a una temperatura media de 40
35 °C para disminuir la humedad (Morales, 1973). Esta operación se efectuó en un secador de 5 bandejas. Los parámetros de secado fueron los siguientes: T° de secado
:
35°C
Tiempo
:
7 horas
Bandejas utilizadas
:
3 (0,59 ×1,06) m2
Dimensiones de las hojas
:
Ancho, 2,1 ± 0,57 cm
:
Largo, 3,5 ± 0,67 cm
Densidad de carga
:
0,356 kg/m2.
Área (A)
:
0,6254 m2
S (cantidad de carga)
:
0,2229 kg
3.5.2. Destilación por arrastre arrastre de vapor vapor de agua. Se realizó la destilación por arrastre de vapor, de acuerdo al método de Camacho et al (2011) con modificaciones. Se hicieron ensayos preliminares de extracción de aceite esencial de muña molida utilizando un balón de tres bocas unido a un balón con vástago, ambos de 500 mL de capacidad, para hacer la primera destilación. El sistema se conectó a un equipo refrigerante de bolas, conectado a una fuente de agua potable. Se utilizó una cantidad de muña de 53,673 g. El tiempo de extracción fue 90 minutos a una temperatura de 84 °C. (Camacho et al, 2011 y Aquino, 2007). Sin embargo el rendimiento fue muy bajo por lo que se procedió a montar un sistema de destilación mediante una olla a presión de 10 litros, la cual cumplía la función de autoclave, acoplada a un sistema refrigerante. A la salida de éste se
41
colocó una probeta de 100 mL para medir la cantidad de destilado obtenido en cada extracción. Obtenidos los datos del volumen destilado, se realizó otra extracción en las mismas condiciones. En este caso al refrigerante se unía a una pera de decantación de 500 mL, para recibir la destilación. La pera contenía una solución de NaCl al 10% (Camacho et al, 2011); la cantidad de NaCl a añadir está en una proporción 1:30 (solución salina - agua/aceite). Los parámetros utilizados en ambas extracciones fueron los siguientes: Carga total (fresca)
:
0,950 kg
Carga total (seca)
:
1,010 kg
T° de entrada del agua refrigerante
:
27 °C
T° de salida del agua refrigerante
:
30 °C
Caudal refrigerante
:
10 mL H2O/s
3.5.3. Caracterización fisicoquímica fisicoquímica del aceite esencial. esencial. Para el análisis organoléptico se utilizó el método adaptado de Dixit (2006), el cual constó de una inspección visual del aceite comparado con otros resultados en términos de color, viscosidad y presencia de impurezas. Para la fragancia se colocó una tira de papel absorbente a una profundidad de 1 cm; se realizó la primera impresión llevando al olfato la tira de papel, se repitió la operación después de 4 o 5 minutos, se realizó una vez más a los 15 minutos y finalmente en 24 horas. Estos datos fueron comparados y registrados. El proceso para el sabor fue similar.
42
El rendimiento (RAE) se determinó por el método gravimétrico – volumétrico mediante la siguiente expresión (Juárez et al , 2010): %Rae = Vol.ae (mL) / Pmuestra (g) x 100 Donde: Vol.ae : Volumen del aceite esencial obtenido; en mL. Pmuestra: Peso de la muestra a destilar; en g.
Se determinó el índice de refracción y la densidad relativa (a 20 °C ambos). Se calibró el refractómetro con agua destilada hasta obtener valores constantes de 1,333, haciendo uso de las ¿ruletas? ¿ruletas? del refractómetro. Seguidamente se realizó la lectura del índice de refracción del aceite esencial. La densidad relativa se determinó utilizando jeringas de 1 mL.
3.5.4. Caracterización cromatográfica. La caracterización cromatográfica para determinar los componentes terpénicos (mentona y pulegona) y su proporción en el aceite esencial, se llevó a cabo en las instalaciones del laboratorio de fisicoquímica de la Facultad de ciencias de la Universidad Nacional de Ingeniería, en Lima, Perú. Se utilizó aceite esencial solubilizado, 0,1 mL aceite esencial / 10 mL hexano (Zegarra, 2010; Fuertes y Munguía, 2001). La caracterización se realizó por duplicado para cada tipo de aceite. Los parámetros del Cromatógrafo Varian 450-GC, fueron los siguientes:
Columna: SupelcowaxTM -10 (Poli etilenglicol); 30 m con diámetro interior = 0,53 mm ID y espesor de fases estacionaria, 1 micrometro.
43
Temperatura de columna: temperatura inicial 70 °C con rampa, 4°C/min y temperatura final a 160 °C durante 25 minutos. Tiempo total, 48 minutos.
Temperatura de inyección: 220 °C.
Temperatura del detector FID: 190 °C.
Gas vehículo: Helio
Flujo del gas: 5mL/min
Flujos al detector FID (ionización a la llama): -Make-up (helio)
:
25mL/min.
-Combustión (H2)
:
30mL/min.
-Combustión (aire) :
300mL/min.
Dilución del aceite esencial esencial de muña: 150 µL de aceite en 5 mL de hexano, grado CG.
Volumen de inyección al cromatógrafo: cromatógrafo: 2µL con split 1:20. Los cromatogramas se construyeron con el programa GALAXIE para equipo 450-GC Serie GC0907B060.
3.5.5. Descripción del diagrama de flujo.
Recepción. La muña fue recibida en un un ambiente ambiente libre de humedad y polvo, se revisó que la planta esté desarrollada, de color verde y sin signos de putrefacción y descomposición.
Limpieza. Se separó de la muña restos restos de paja, paja, pasto u otras especies, dejándola libre de impurezas (tierra) y eliminando toda planta con principios de descomposición. descomposición.
44
Selección. Se seleccionaron seleccionaron las hojas medianas y grandes, luego luego se desecharon los tallos, así como las hojas marchitas.
Pesado. Se realizó realizó al momento de la recolección, selección, selección, secado, molienda y tamizado. Se llevó a cabo en una balanza de precisión y en una balanza analítica, según fue el caso.
Secado. Se realizó en una secadora secadora de bandejas bandejas a 35 °C por 7 horas, para retirar el agua libre hasta un 8-10 %.
La extracción de los los aceites esenciales esenciales se realizó mediante mediante destilación por arrastre de vapor de agua a una temperatura de 84°C, por 90 minutos.
Para separar separar el aceite del agua florentina, se añadió una solución de cloruro de sodio al 10%. Se dejó reposar por 20 horas y luego se procedió a decantar la mezcla. La pera de decantación se cubrió con plásticos negros para evitar la acción fotolítica sobre el aceite esencial.
Envasado. En frascos ámbar herméticamente cerrados y sellados con silicona.
Almacenamiento. Finalizado el proceso, se se almacenó el aceite esencial en frascos de vidrio ámbar, a una temperatura de 4°C, para su análisis posterior. El diagrama de flujo se muestra en la figura 12.
45
Muña
Recepción
Secado
Agua refrigerante 27 °C
Extracción
Limpieza
Desperdicios
Selección
Hojas de mala calidad
Agua refrigerante 27 °C
35 °C
Agua refrigerante 30 °C
NaCl 10 % Θ=20
NaCl 10 % Θ=20
Decantación
Extracción
Agua refrigerante 30 °C
Decantación
Agua salina
h
Agua salina
h
Envasado
Almacenado
4 °C
Figura 12: Diagrama de flujo experimental de la extracción de aceite esencial.
46
3.5.6. Diseño experimental Para determinar cuál de los dos tipos de hojas produjo mayor contenido de pulegona se usó un Diseño Completamente Aleatorio (DCA) unifactorial. El factor evaluado fue la humedad H 1=11,56 % (hojas frescas) y H 2= 7,81 % (hojas secas). Los datos obtenidos fueron analizados mediante un Análisis de Varianza (ANVA) con un nivel de confianza de α = 0,05. Seguido de una prueba de
comparaciones múltiples de Duncan. Para la comparación entre componentes se usó el siguiente modelo aditivo lineal, en el cual la variable respuesta es la cantidad de mentona y pulegona contenida en el aceite esencial de muña, mientras que la variable independiente fue el tipo de hoja (fresca y seca):
= + + Donde:
: Variable respuesta, rendimiento de mentona y pulegona. : Media general : Variable independiente, tipo de hojas de muña (fresca y seca) : Error experimental 3.5.7. Análisis estadístico. El procesamiento de los valores de porcentaje de área de los principales compuestos terpénicos del aceite esencial de muña, fueron analizados mediante un ANVA, se realizó con el programa estadístico del software Statistical Analysis System (SAS) System (SAS) v. 8.0
47
IV.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
4.1. IDENTIFICACIÓN DE LA PLANTA. PLANTA. Las características identificadas de la planta, de acuerdo a los procedimientos de Jones (1988) y la UPOV (2012), se resumen en la tabla 16, anexo I. Estos datos fueron contrastados con los reportes de las investigaciones de Seguil (1990) y Schmidt-Lebuhn (2009). Aquino (2007) confirma los resultados presentados al afirmar que la muña es un arbusto frondoso, con tallos ramificados. Respecto a los bordes de las hojas, todos los investigadores mencionan que las hojas de muña poseen forma de sierra. Schmidt-Lebuhn (2009) menciona que la muña tiene hojas pequeñas y grandes de 2 a 5 cm. Los resultados presentados se encuentran dentro del rango establecido por los botánicos. Las fotos de estos resultados se hallan en el anexo I.
48
4.2. DESTILACIÓN. Las tablas 6 y 7 muestran los datos del comportamiento de la destilación, en función a la temperatura de extracción y el volumen destilado, para ambas extracciones, los cuales fueron graficados. El comportamiento de la destilación puede verse en las figuras 13 a la 16. En ellas se aprecia el incremento de la temperatura hasta alcanzar un valor constante.
Tabla 6: Tabulación de datos obtenidos en la destilación (hojas frescas). Lectura T° (C°) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
27 29 41 48 60 70 80 83 83 84 84 84 84 84 84 84 84 84 84 84 84 84 84 Total
Destilado (mL) 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1,2 1,1 3,6 1,2 3,8 4 6,6 6,8 8,2 7,2 6 5,5 7,2 7,8 71,2 mL
49
Destilado acumulado (mL) 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2,2 3,3 6,9 8,1 11,9 15,9 22,5 29,3 37,5 44,7 50,7 56,2 63,4 71,2
Tiempo (min) 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 27 32 37 42 47 52 57 62 67 72 77 82
Figura 13: Comportamiento de la extracción de aceite esencial de muña fresca.
Figura 14: Comportamiento total de la extracción de aceite de hojas frescas. 50
Tabla 7: Tabulación de datos obtenidos en la destilación (hojas secas). Lectura
Temperatura (C°)
Destilado (mL)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
26 30 42 48 59 71 78 83 83 84 84 84 84 84 84 84 84 84 84 84 84 84 84 84
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 5 8 6 10 12 14 18 10 11 17 18 18 18 168
Total
51
Destilado acumulado (mL) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 8 16 22 32 44 58 76 86 97 114 132 150 168
Tiempo (min) 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85
Figura 15: Comportamiento de la extracción de aceite esencial de m uña seca.
Figura 16: Comportamiento total de la extracción de aceite de hojas secas.
52
En las figuras 13 y 15 se pueden confrontar las velocidades de destilación (mL/min) y el incremento de la temperatura, mostrando el comportamiento de la destilación para ambas extracciones. Este fenómeno concuerda con las cuatro etapas de la ebullición (Geankoplis, 1995). A partir de los 83 °C, empezó a generarse las primeras gotas de destilado, luego progresivamente aumentó el volumen hasta alcanzar un tope, descender y nuevamente volver al valor anterior. Estos datos fueron comparados con los datos de extracción de Aquino (2007), los cuales confirman los resultados presentados aquí. Para plantas jóvenes hay mayor volumen de agua florentina, por ende mayor m ayor aceite esencial. El caso es inverso para plantas adultas. En ambos casos los resultados muestran un comportamiento discontinuo respecto al volumen destilado. El tiempo de extracción de 90 minutos (para ambas extracciones, hojas frescas y secas) fue adecuado para limitar los problemas técnicos, pues a menores valores no se extrae todo el aceite esencial de la muña y a valores mayores, se extraen todos los compuestos y a la vez se descompondrían los más termolábiles (Aquino, 2007). También otros investigadores evaluaron los tiempos óptimos de extracción (Morales, 1973; Arauco et al, 2010; Beltrán, 1983). Sus resultados revelan que el tiempo óptimo de extracción también se encuentra condicionado por la parte de la planta de la cual se extraerá el aceite esencial. Ambas extracciones mostraron un comportamiento ordinario en la destilación.
53
4.3. ANÁLISIS ORGANOLÉPTICO. Las principales características organolépticas de ambos aceites esenciales se muestran en la tabla 8:
Tabla 8: Resultados organolépticos del aceite esencial. Característica
Aceite esencial de hojas frescas Translúcido, ligeramente
Color
Aceite esencial de hojas secas Ligeramente translúcido
amarillo A menta, ligeramente Olor
A menta, Muy atractivo atractivo
Sabor
Picante
Picante
Aspecto
Líquido, fluido, aceitoso
Líquido fluido, aceitoso.
Estos resultados fueron comparados con los principales reportes de otras investigaciones referidas al mismo tema. Las principales diferencias encontradas en ambos tipos de aceite esencial fueron la tonalidad y el olor. El aceite esencial proveniente de las hojas secas mostró un color ligeramente más claro (esto se verá confirmado al evaluar el índice de refracción de ambos aceites). La diferencia en el olor, se explicará también al analizar la composición de ambos aceites. Beltrán (1983) reporta los siguientes resultados organolépticos: el color del aceite esencial es amarillento, el olor semejante al mentol, el sabor picante y el aspecto líquido. Estos datos coinciden con los de Aquino (2007) y Fuertes y Munguía (2001). Morales (1973) difiere en su resultado sobre el olor; El olor del aceite esencial de las hojas secas es ligeramente menos agradable que el procedente de hojas frescas lo cual se debe al tiempo de destilación, 54
pues, según Aquino (2007), el tiempo para la extracción de aceite esencial de hojas secas debe ser menor y en las extracciones se utilizaron tiempos iguales para ambas extracciones. Esto es explicado por la mayor porosidad de las hojas secas lo cual incrementa la transferencia de masa y la extracción de aceite esencial. De esta manera, un tiempo prolongado de extracción produce la descomposición de algunos compuestos o la aparición de componentes indeseables. Esto se verá comprobado al presentar los cromatogramas de cada tipo de aceite extraído. Otro factor que incide en el olor ligeramente agradable del aceite esencial proveniente de hojas secas, es la posible polimerización de algunos terpenos, ter penos, como consecuencia consecuencia directa de la deshidratación (Fellows, 1994).
4.4. ANÁLISIS FÍSICOS. Se reporta el rendimiento, índice de refracción y la densidad relativa de ambos aceites. Los rendimientos son 0,267 ± 0,128 % y 2,505 ± 0,025 % para el aceite esencial de hojas frescas y secas, respectivamente. Morales (1973) explica que humedades bajas aumentan la porosidad y facilitan la transferencia de masa en el proceso de la extracción. En el caso de la muña seca se extrajo el agua libre, lo cual genera un cuerpo poroso. Esto incrementa la difusividad del vapor de agua, arrastrando mayor cantidad de aceite esencial. Otros investigadores obtuvieron similares resultados. Para el aceite esencial proveniente de hojas frescas tenemos los siguientes rendimientos, todos ellos en una relación v/p: Fuertes y Munguía (2001): 0,27 % (Tarma), 0,21 % (Huaraz), 0,21 % (Pampas), Aquino (2007): 1,03 %. Para rendimientos de aceites esenciales provenientes de hojas
55
secas tenemos los siguientes datos: Morales (1973): 2,13 %, Aquino (2007): 2 – 2,5 % (UNCP, FIQ), Arauco et al (2010): (2010): 0,6 % (Extracción soxhlet), para Camacho et al (2011) (2011) el rendimiento del aceite esencial extraído es 0,1 a 1% del peso seco de la planta. Como se ve, los resultados obtenidos en la presente investigación concuerdan con los reportados en la literatura científica. Se determinó el índice de refracción y la densidad relativa de ambos tipos de aceites. Los resultados se incluyen en la tabla 9.
Tabla 9: IR y densidad relativa del aceite esencial. Hojas frescas
Hojas secas
IR
Densidad relativa
IR
Densidad relativa
1,4765 ± 0,0002
0,92 ± 0,01
1,4733 ± 0,0002
0,86 ± 0,01
Respecto al Índice de refracción, podemos comprobar que los resultados son muy similares a los reportados por la literatura científica. Por ejemplo Fuertes y Munguía reporta valores desde 1,4725 hasta 1,4746, por otro lado el resultado de Morales (1973) fue 1,469, finalmente el mayor valor encontrado en las investigaciones consultadas es de Beltrán (1983) con un valor de 1,4983. A mayor índice de refracción el aceite contendrá mayores terpenos bencénicos, a la inversa, mientras sea menor el aceite poseerá mayores compuestos monoterpénicos (Beltrán, 1983). Según esto el aceite esencial de las hojas frescas posee ligeramente más compuestos terpénicos. Esto comprobaría químicamente que el secado si altera la composición del aceite, incrementando la cantidad de compuestos terpénicos hidrolizados. Agrelo et al (1994) demostraron que un índice de
56
refracción cercano a 1,48 muestra que el aceite esencial presenta compuestos oxigenados. En efecto, ambos tipos de aceites poseen un valor cercano a ese, lo cual indica la presencia de compuestos terpénicos oxigenados, entre ellos compuestos cetónicos y alcohólicos. Estos resultados también se ven refrendados por los datos organolépticos presentados anteriormente.
El aceite esencial de las hojas frescas posee mayor densidad relativa. La literatura científica menciona que valores mayores a 1,00 indican la presencia de terpenos aromáticos, nitrogenados y azufrados; en cambio, valores menores, incluso cercanos a 0,840, atestiguan la presencia de hidrocarburos aromáticos (Morales, 1973). Estos datos muestran que el aceite esencial proveniente de hojas secas posee mayores terpenos oxigenados. Ambos resultados (IR y densidad relativa) comprueban la presencia de compuestos terpénicos en mayor cantidad, en el aceite esencial de hojas secas. A fin de comparar los resultados presentados en la presente investigación y compararlos con otros estudios mencionamos el trabajo de Aquino (2007) con un valor de 0,852, el más bajo de la literatura; por otro lado, los más altos valores corresponden a los estudios de Beltrán (1983) y Morales (1973) con 0,9868 y 0,92, respectivamente. Los IR de este estudio no escapan del rango permitido para aceites esenciales (1,4), ni las densidades relativas.
4.5. CARACTERIZACIÓN CARACTERIZACIÓN CROMATOGRÁFICA. CROMATOGRÁFICA. Los cromatogramas del aceite esencial de la muña proveniente de hojas frescas y secas, se muestran en las figuras f iguras 17 y 18, respectivamente. respectivamente.
57
Figura 17: Cromatograma del aceite esencial (Muña fresca). 58
Figura 18: Cromatograma del aceite esencial (Muña seca).
59
Respecto a los terpenos mayoritarios totales, es decir aquellos cuya área supera el 1 %. Cano (2007), Zegarra (2010), Azaña (2010) y Chaquilla et al (2011) encontraron que el principal terpeno del aceite esencial de muña fue la pulegona, en cambio Gûiza y Rincón (2007); menciona en un estudio que la mentona es el principal terpeno del aceite esencial.
La tabla 10 muestra la cantidad de otros terpenos mayoritarios encontrados en ambos aceites esenciales obtenidos y la tabla 11 el tiempo de retención encontrado. Según los reportes de Fuertes y Munguía (2001), podemos afirmar que el terpeno 8 es un epóxido (3-oxatriciclo [4.1.1.O-2,4] octano, 2, 7, 7-trimetil), por el tiempo de retención similar. Este grupo es muy inestable, tiene mucha tensión angular y puede abrirse con facilidad frente a muchos reactivos, incluso frente a proteínas, ácidos nucleicos y otros metabolitos del organismo humano. Todas estas características le confieren propiedades mutagénicas.
Tabla 10: Porcentaje de los terpenos encontrados en el aceite esencial. N°
% Área Fresco
Seco
1
1,032
1,164
2
1,285
3
2,373
2,483
4
5,327
5,551
5
2,671
2,653
6
3,785
3,73
7
1,026
8
1,869
60
Tabla 11: Tiempo de retención de los terpenos encontrados en el aceite esencial.
Tiempo N°
Fresco
Seco
1
5,785
5,75
2
12,96
3
14,27
14,25
4
15,71
15,7
5
18,735
18,72
6
19,395
19,38
7
20,97
8
22,51
En la figura 19 y 20 se puede ver la variación de los terpenos en ambos aceites, exceptuando a la mentona y la pulegona. En la figura 21, se distingue la variación de los terpenos mayoritarios.
61
f resca). Figura 19: Porcentaje de terpenos hallados (Muña fresca).
Figura 20: Porcentaje de terpenos hallados (Muña seca). 62
Los cromatogramas tabulados se hallan en el anexo II. En ambos cromatogramas presentados se distingue un pico que supera a todos, el cual pertenece al solvente (hexano grado GC) y no a un componente específico. El aceite esencial proveniente de hojas frescas contiene 46 componentes, en un intervalo de 24 minutos, y de hojas secas contiene 55 componentes, en un intervalo de 33 minutos, aunque los cromatogramas realizados por duplicado muestren una ligera variación. Estos resultados fueron comparados con los datos reportados por Fuertes y Munguía (2001), Gûiza y Rincón (2007), Cano et al (2008), Cano (2007), Azaña (2010), Zegarra (2010), Maquera et al
(2009), Carhuapoma et al (2009), (2009), Chaquilla et al (2011) (2011) y Calixto (2006) y se comprueba
similitud
entre
los
principales
componentes
terpénicos
encontrados.
En la literatura científica referida al aceite esencial de muña, los principales componentes encontrados son la pulegona, la mentona, el mentol, el limoneno y otros. Alkire et al (1994) (1994) encontraron 19 componentes, entre los cuales se hallan la mentona, la pulegona y el limoneno. Fuertes y Munguía (2001) utilizaron el mismo tipo de columna y similares parámetros de análisis a los realizados en la presente investigación (muestra, 0,1 mL en 10 mL de etanol; Columna: Supelcowax 10, 30 mm × 0,53 mm 0,5 m m; Temperatura del inyector: 190 °C; Temperatura del horno: 70 °C – 160°C (4°/min); Gas transportador: helio; Temperatura del detector: 230°C) y obtuvieron los siguientes compuestos: 1-tetradeceno (24,13 %), 2S-trans-Mentona (23 y 41 %), Pulegona (16 y 28 %). La diferencia entre la cantidad de compuestos terpénicos hallados y los reportados por Fuertes y Munguía (2001) se explica
63
por el origen distinto de la muña, también por la diferencia en la temperatura del detector FID (40°C de diferencia) y en la temperatura del inyector (30 °C de diferencia). Aún así es posible comparar los tiempos de retención en ambos análisis. La 2S-trans-mentona posee un tiempo de retención promedio de 15,95 min., mientras que la pulegona tiene un tiempo de retención de 21,59 min. En la presente investigación los tiempos son 12,2 y 17,19 min, respectivamente, por tanto se aprecia similitud en los tiempos de retención de la mentona y la pulegona. Cano (2007) también utiliza el mismo tipo de columna para elucidar el aceite esencial de muña. En su investigación la temperatura de inyección y del detector FID también varía 30°C respecto de nuestros parámetros. Sus resultados muestran valores menores que los presentados aquí. Para la pulegona y la mentona tenemos: 13 min y 11 min, respectivamente. Resultado similar al reportado por Calle et al (1994), según los cuales la cantidad de pulegona y mentona es, 30,2 % y 29,2 % respectivamente. Los compuestos mayoritarios identificados por el cromatógrafo en el presente estudio son la Pulegona y la 2S-Trans-Mentona o mentona, (Chemicalize, 2012) para ambos tipos de aceite. Los estudios de Rojas y Usubillaga (1995) reportan 28 componentes en el aceite esencial de Minthostachys mollis, en el cual la cantidad de pulegona ascendía a 75,2 – 79,3 %. El más alto componente es la pulegona, según el reporte de Fournet et al (1996). El mismo resultado dio Marriotta et al (2001). (2001). Se encuentra mayor pulegona en plantas jóvenes (Osorio, 2009). Emin et al (2004) (2004) informa que en las Labiatae el componentes mayoritario es la pulegona (66,55 %) y la mentona (9,59%). Esto se debe al hecho de que la mayoría de las labiadas poseen pulegona en
64
mayor proporción que los demás componentes (Perry, 1921). En general, las plantas labiadas, poseen más cantidad de pulegona, respecto a la mentona.
Los resultados de tiempo de retención y área de la pulegona y mentona se muestran en las tablas 12 y 13. Otros investigadores encuentran resultados similares, como González et al (2011) (2011) que, utilizando la misma columna, pero diferentes parámetros cromatográficos encontraron tiempos de retención de 25,73 min y 18,68 min, para la pulegona y la mentona, respectivamente. Estos valores, difieren poco de los presentados, pero muestran el mismo orden de aparición en el cromatograma. ter penos mayoritarios de Muña Tabla 12: Tiempo de retención y % de área de terpenos fresca.
Parámetros
Pulegona
Mentona
Tiempo de retención (min)
17,19
12,215
% Área
45,036 ± 0,557 30,168 ± 0,732
ter penos mayoritarios de Muña Tabla 13: Tiempo de retención y % de área de terpenos seca.
Parámetros
Pulegona
Mentona
Tiempo de retención (min)
17,19 ± 0,01
12,2 ± 0,01
% Área
52,321 ± 0,042 24,818 ± 0,181
Otros investigadores utilizando diferentes tipos de columna presentan resultados similares. Gûiza y Rincón (2007) tiene para la pulegona y la 2Strans-mentona, 21,61 min y 19,20 min, respectivamente. Para Zegarra (2010) los tiempos son: pulegona, 23,4 min; mentona, 18,2 min. Finalmente, para
65
Chaquilla et al (2011), (2011), los tiempos de retención para estos dos componentes mayoritarios son mucho menores: pulegona, 8 min y mentona, 6,6 min.
Figura 21: Comparación porcentual de los principales terpenos de ambos aceites esenciales.
Se relacionaron y representaron gráficamente los resultados de la pulegona y la mentona. En la figura 22 se aprecia el contenido promedio de la pulegona en ambos aceites. Es notorio que la cantidad de este componente se incrementa en la muestra seca en un 16 %.
66
Figura 22: Porcentaje de pulegona en ambos aceites esenciales. Mientras que la cantidad de mentona es 21 % menor en el aceite extraído de hojas frescas (figura 23). Así mismo podemos ver en la figura 24 la variación total de ambos componentes en los dos tipos de aceite esencial de muña. El aumento global de terpenos es mínimo, un 2% respecto al aceite proveniente de hojas frescas. Esto se debe a la disminución de la mentona en las hojas secas, a la aparición de nuevos componentes y a la síntesis e interacción química de todos los terpenos. En general, ambos constituyen más del 70 % de los componentes del aceite esencial.
67
Figura 23: Porcentaje de Mentona en ambos aceites esenciales.
Figura 24: Variación de la cantidad de ambos terpenos. La diferencia entre la cantidad de estos dos componentes en ambos aceites tiene una relación inversa. En el aceite esencial de muña fresca la cantidad de pulegona es 45,036%, y la de mentona es 30,168%; en cambio el porcentaje 68
de los componentes en el aceite esencial de la muña seca es: pulegona y mentona, 52,321% y 24,818% respectivamente. Esta diferencia debe explicarse en función al secado de las hojas de muña. En el aceite esencial extraído de la planta fresca encontramos los componentes naturales del aceite esencial. El secado, según Fellows (1994), produce pérdida de algunos componentes, debido a varios factores como la solubilidad en agua de algunos componentes del aceite esencial. La pulegona es insoluble en agua y no se perdería al eliminarse el agua libre de las hojas de muña, a diferencia de otros componentes, como el limoneno (solubilidad en agua, 0,02 g/L; presión de vapor 2,1 hPa) y el Linalol (solubilidad en agua, 1,45 g/L; 0,10 hPa). El hecho de que el aceite de hojas secas sea de olor poco agradable, muestra la disminución de los componentes alcohólicos, como el mentol, pues estos son los responsables de proveer el olor característico. Esto explica el aumento de la pulegona, pues los monoterpenos alcohólicos son los precursores de los compuestos cetónicos, al oxidarse aquellos. Al respecto Barbosa y Vega (2000) mencionan que uno de los efectos químicos de la deshidratación es la oxidación de los compuestos del alimento a causa de la deformación de la estructura física del alimento y de la oxidación debida a la porosidad alta del alimento deshidratado. De esta manera los componentes como el mentol y otros monoterpenos con radicales OH, se oxidan, dando compuestos como la pulegona. Es debido a esto que el contenido de pulegona aumenta en el aceite esencial. La disminución de la mentona, en comparación de la pulegona, se debe a sus puntos de ebullición diferentes, 208 y 224 °C, respectivamente. Esto revela que se requiere mayor energía para romper los enlaces de la pulegona que
69
de la mentona. Por otra parte, siendo el limoneno el principal precursor del mentol, y éste de la mentona, su disminución afectaría indirectamente el contenido de ésta. El limoneno es un monoterpeno hidrocarbonado con un doble enlace en el ciclo hexano en su estructura. Esto confiere al limoneno baja estabilidad y sensibilidad a la deshidratación. Además su bajo punto de ebullición, comparado con el de los otros componentes del aceite esencial, 177°C, demuestra su sensibilidad a factores externos (UPOV, 2009). La diferencia en la cantidad de cada componente (más pulegona en ambos tipos de aceite y menos mentona en el aceite de hojas secas) se debe también a lo que Banchio et al (2005) denominan como daño mecánico. Según esta teoría, las hojas al ser cortadas del tallo o al ser cortada la planta, ésta eleva su cantidad de pulegona, como un mecanismo de defensa. La disminución del contenido de mentona se debe a su reducción química a mentol (Primo, 2007). Esta es una respuesta sistémica a diferentes tipos de daño (Banchio et al , 20052). La disminución de la mentona y el 1,8 cineol se debe a la degradación de la mentona y el mentol, precursor de ésta, a diferentes temperaturas. Para la mentona, cuyo pico inicial era de 0,89, que almacenado a 4 °C descendió a 0,73 y a 25 °C, descendió a 0,67, una razón de 25 %. Esta disminución es natural. Wainberg (1983) refiere que el mentol se convierte en acetato de mentilo. La variación en el contenido de componentes fue estudiada por Wainberg (1983), según el cual dependen de causas medioambientales. Las plantas jóvenes poseen más pulegona y menos mentona. En las plantas viejas, la mentona es predominante. Por su parte Burzaco et al (1996) dicen que la
70
composición cambia a lo largo de la fenología de la planta; de la misma opinión es Cláudio (2003).
En función a su estructura química (véase figura 5), Phenomenex (2012) y R.A.M. (1912) mencionan que la mentona tiene la capacidad de girar enantioméricamente, debido al enlace simple que posee. Las características estructurales de la mentona y la pulegona muestran porque desciende aquella y esta aumenta (ChemSpider, 2010). El volumen molar, la tensión superficial, la capacidad de aceptar átomos de Hidrógeno, la refractividad molar y la polarizabilidad son relativamente similares. Las diferencias se encuentran en la libre rotación de la mentona, imposible para la pulegona, el punto de ebullición y de inflamación para la pulegona es mayor (92,548 °C y 223,999 °C, frente a 72,778 °C y 204,999 °C para la mentona), lo cual indica mayor estabilidad química para la pulegona. La densidad para la pulegona también es mayor (0,924 frente a 0,881 g/cm 3). Finalmente la entalpía de vaporización para la pulegona (46,049 frente a 44,123 kJ/mol), nuevamente es mayor. De todos estos datos se deduce la estabilidad mayor de la pulegona, frente a la mentona, en el aceite esencial de la muña proveniente de hojas secas (Ventos, 2012). Las características organolépticas discutidas anteriormente, respecto a la fragancia del aceite esencial proveniente de hojas frescas, se confirman aquí pues la mentona provee un olor refrescante y le da un color amarillo pálido al aceite (Lluche, 2011y Food-info, 2012). En este mismo sentido al principio, el aceite esencial es rico en mentol, luego disminuye su cantidad pues se
71
esterifica generando ácidos, modificando su fragancia (Jardín Botánico, 2012).
Se realizó el análisis estadístico con el software SAS, Versión 8, para evaluar la significación de las medias de ambos componentes. Así mismo se realizó la prueba de Duncan para evaluar la eficiencia de ambos tratamientos. Los datos completos de estos análisis se encuentran en el anexo III. A continuación se muestra el ANVA para evaluar la diferencia significativa entre la cantidad de mentona de la extracción de hojas frescas y secas; se realizó el mismo análisis para la pulegona. Se compararon estadísticamente los resultados de mentona y pulegona obtenidos de hojas frescas y secas obteniendo diferencia significativa en ambos casos. En las tablas 14 y 15 se muestran los resultados.
Tabla 14: ANVA para el porcentaje de mentona. Fuente de variación Tratamiento Error Total
G.L. 1 2 3
S.C. 28.617 1.139 29.856
S.M. 28.617 0.569
Fc 50.27
Ft 0.0193
Tabla 15: ANVA para el porcentaje de pulegona. Fuente de variación Tratamiento Error Total
G.L. 1 2 3
S.C. 53.071 0.624 53.695
S.M. 53.071 0.312
Fc Ft 170.09 0.0058
De los resultados presentados se infiere que existe diferencia significativa entre los rendimientos de cada terpeno encatrado en ambos aceites En las figuras 26 y 28 del anexo III se muestra el resultado obtenido del programa; en la primera columna el tratamiento ( Model ), ), el error (Error ) y el 72
total (Corrected total ). ). En seguida se muestran los valores de grados de libertad (DF, degree free), suma de cuadrados ( Sum of squares), cuadrados medios (Mean square), F calculado (F value) y F tabulado ( F ). ). Estos análisis muestran diferencias significativas (P <0,05) entre las medias de ambos tratamientos, como se observa en los valores F. El coeficiente de variabilidad indica la variación que de un experimento, para investigaciones de laboratorio y agronómicas este valor no debe superar el 20 y 30 %. En esta investigación los coeficientes son 2,744 y 1,147 % para ambas componentes respectivamente, esto significa que la cantidad de mentona y pulegona expresados en porcentaje de área son reproducibles. Finalmente obtenemos la conclusión estadística que los promedios de contenido de cada componentes son diferentes. Se realizó un análisis posterior por el método del Rango múltiple de Duncan para determinar cuál es el mejor tratamiento. Las figuras 27 y 29 del anexo III muestran los resultados de la comparación de promedios con un α = 0,05 para la mentona y la pulegona. Observamos que por la aplicación del Método de Duncan se forman 2 grupos de tratamientos (A y B) en ambos casos. El promedio poblacional dentro de un grupo es diferente del promedio poblacional del tratamiento de cualquier otro grupo. La aplicación del método del Rango múltiple de Duncan revela que el mejor tratamiento para la mentona y la pulegona es el uso de muña fresca y seca, respectivamente. El rendimiento para la mentona y la pulegona fue 30,1625 y 52,321 %, para hojas frescas y secas, respectivamente.
73
V.
CONCLUSIONES.
La destilación destilación por arrastre de vapor mostró un comportamiento regular en el proceso de extracción de aceite esencial de hojas de muña fr esca y seca. Existió diferencias fisicoquímicas y organolépticas entre los dos aceites extraídos. El aceite proveniente de hojas frescas presentó un color más opaco y un olor más fragante que el aceite extraído de hojas secas; el índice de refracción y la densidad relativa para el aceite de hojas frescas fue de 1,4765 y 0,92 y para las secas fue 1,4733 y 0,86 respectivamente. Estos resultados muestran componentes terpénicos diferentes. El análisis cromatográfico del aceite esencial de hojas frescas reportó un total de 46 componentes. De los cuales los principales fueron la pulegona (45,036 %) y la mentona (30,168 %). Los componentes mayoritarios totales sumaron 10. Mientras que en hojas secas se encontró 55 componentes, siendo los principales la pulegona (52,321 %) y la mentona (24,818 %) y los componentes mayoritarios totales fueron 7.
74
El ANVA de las cantidades de mentona y pulegona de hojas frescas y secas revelaron diferencias significativas (P<0,05). el análisis de Duncan revela que el mejor tratamiento para la obtención de mentona fue el uso de muña fresca, con un rendimiento de 30,167% y para la pulegona fue el uso de muña seca, con un rendimiento de 52,321 %.
75
VI.
RECOMENDACIONES
Se sugiere evaluar la influencia de diferentes tiempos de secado sobre los principales componentes del aceite esencial de la muña. Se recomienda realizar un estudio que analice la composición de mentona y pulegona a diferentes temperaturas de extracción, para ver cómo afecta la destilación a la composición terpénica del aceite esencial de muña. Se sugiere realizar modelización matemática para la extracción del aceite mediante la destilación por arrastre de vapor. Se recomienda comparar los rendimientos y composición del aceite esencial extraídos por mediante fluidos supercríticos y destilación por arrastre de vapor. Se recomienda realizar estudios químicos sobre los aceites esenciales que no sólo muestren sus componentes aprovechables, sino también su toxicidad, para evaluar los potenciales riesgos del consumidor.
76
VII.
BIBLIOGRAFÍA
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85
ANEXOS ANEXO I. Identificación de la muña Tabla 16: Características botánicas identificadas de la muña. Características Color
Verde amarronado. Escala RHS-UPOV: Green 42, RHS 137c
Forma de la hoja
Posee vellosidad en el haz y el envés, así como ramificaciones pronunciadas.
Dimensiones
Largo, 3,5 ± 0,67 cm; Ancho Ancho 2,1 ± 0,57 0,57 cm
-
Tipo
Lanceolada
-
Ápice
Acuminado
-
Base de la lámina
Redondeada
-
Bordes
Serrado
Tallo
Semileñoso, erecto. Consistencia blanda, hojas dispersas regularmente en toda su longitud. Hueco y cilíndricorectangular, con vellosidad exterior.
La figura 28 muestra la escala de colores en la cual se encuentran las hojas de muña. Desde b) hasta f) son colores cercanos a la muestra estudiada. La figura f igura 28a, es el color más cercano, Green 42, código internacional RHS 137C.
86
a)
d)
c)
e)
b)
f)
Figura 25: Determinación del color de muña fresca mediante la carta colorimétrica RHS.
87
ANEXO II. Resultados cromatográficos del aceite esencial de muña (fresco y seco).
Tabla 17: Valores cromatográficos (hojas frescas). 88
Tabla 18: Valores cromatográficos (hojas secas).
89
ANEXO III. Resultados estadísticos. Procesamiento de los valores de porcentaje de área de los principales compuestos del aceite esencial de muña. Se utilizó el paquete estadístico del software SAS v. 8.0
Figura 26: ANVA para los tratamientos de la mentona.
Figura 27: Test de Duncan para los tratamientos de la mentona. 90
t ratamientos de la pulegona. Figura 28: ANVA para los tratamientos
Figura 29: Test de Duncan para los tratamientos de la pulegona.
91
