24/05/2016
HISTOKIMIA; SITOKIMIA; MIKROKIMIA
Mikroteknik | BIP2220/BIP223 Semester Genap TA. 2015-2016 Fakultas Biologi Unsoed
Metode Pewarnaan Pewarnaan Umum
Pewarnaan Khusus
Struktur jaringan secara Umum
Struktur jaringan tertentu
Membedakan inti dan sitoplasma
Membedakan jaringan satu dengan jaringan lain
Pewarnaan Dasar :
Pewarnaan Khusus :
HaematoxylinHaematoxylin -Eosin
Histokimia Immunohisto sitokimia
Histo/Sitokimia Histoteknik atau teknik histologi ilmu atau seni mempersiapkan organ, jaringan atau bagian jaringan untuk dapat diamati dan ditelaah. Sedangkan teknik histokimia teknik untuk mendeteksi keberadaan komponenkomponen yang terdapat dalam struktur jaringan atu sel seperti protein, lemak, karbohidrat, hormon ataupun enzim.
1
24/05/2016
Histo Sitokimia •
•
Dasar pemikiran : masingmasing-masing jaringan memiliki sifat spesifik akan bereaksi dengan pewarna tertentu Histokimia dapat digunakan untuk membedakan : –
darah, sel epitel, sel pada organ/ kelenjar kelenjar Tipe sel : darah,
aringan : ikat, ikat, syaraf , tulang
–
–
Senyawa : lipid, karbohidrat, karbohidrat, enzim
–
Mineral : kalsium
Beberapa Contoh Pewarnaan Khusus Tipe Sel Sel / / aringan Metode Pewarnaan / Senyawa aringan ikat Enzim
Van Gieson Trypan blue
Senyawa
Aplikasi
Acid phosphatase Alkaline phosphatase
Best’s; Bauer’s
Herxheimer’s; Sudan Black
Sumsum tulang SGP Glikogen Lemak
Mineral
- Alizarin
Deposisi kalsium pada jaringan tulang
Sel tert tertentu
Giemza Orcein, Orcein, Carmin & Feulgen MalloryMallory-Heidenhain Azan Heidenhain Azan-Gomori
Sel darah Mitotik sel Sel alfa, beta dan D pada pankreas
2
24/05/2016
ARINGAN
Struktur Mikroskopik Endapan Logam, Mineral ( An Organik) Senyawa Organik Kimia aringan Reaksi Kimia Senyawa Berwarna Diamati dengan Mikroskop
PRINSIP DASAR Zat
yg dianalisa tidak boleh berdifusi keluar dr tempatnya semula, Hasil reaksi tersebut harus tidak dapat larut dan berwarna atau menghamburkan elektron, Metode yg dipakai harus spesifik untuk zat / golongan kimia yg sedang diselidiki, Prosedur tsb tidak boleh mengubah sifat atau menghambat gugus-gugus reaktif.
3
24/05/2016
Beberapa hal penting yang harus diperhatikan dalam pelaksanaan histokimia 1. Pemilihan fiksatif • Sifat khusus yang akan diamati :
Supravital tidak perlu fiksatif Apus darah metanol Sumsum tulang Formol Zenker General formalin (NBF 10%, Bouin)
2. Pemrosesan jaringan • Metode parafin • Metode beku OCT
3. Pengirisan • Mikrotom biasa • Cryostate
4. Mounting • Organik • Aqueous
MIKROKIMIA SITOKIMIA •
•
Mengetahui zat-zat penyusun bagian-bagian sel dg pembubuhan kemikalia Preparat segar tiap kali dibuat preparat baru
Dibubuhkan pelbagai larutan kimia u/ mengetahui ada /tdknya suatu zat tertentu (kalau ada : di bagian mana? yg menyusun bagian-2 sel)
4
24/05/2016
Lokasi beberapa macam Karbohidrat, Protein, Lemak dalam aringan Karbohidrat
Dlm jaringan hewan tertimbun glikogen (dlm otot & hepar) Timbunan glikogen dpt dilihat teknik histokimia /teknik pewarnaan /metode : 1. Periodic Acid Schiff (PAS) 2. Best Carmine 3. Bauer 4. Lead tetra acetat 5. Iodine
DESKRIPSI HASIL Karbohidrat pada Hewan •
PAS + Merah Magenta /Ungu - Tidak Merah /Tidak Ungu
•
•
Best Carmine Glikogen Granula Merah ; Inti Biru Cerah Bauer Glikogen ; Mucin Ungu /Merah Magenta + Counter Stain Inti Biru - Hitam
•
•
Iodine Glikogen - Warna Spt Pohon Mahoni Lead Tetra Acetat Seperti PAS ; + Kuat MERAH
MAGENTA/UNGU Terpulas setelah Oksidasi cukup lama ± 30 – 60 menit
5
24/05/2016
DESKRIPSI HASIL Karbohidrat pada Tumbuhan
PENUNJUKKAN AMYLUM DI + JKJ (KALIUM JODIDA) KECOKLATAN
LIGNIN
terwarna BIRU HITAM ; UNGU
DI + PHLOR OGLUCIN + HCl terwarna MERAH;
UNGU
CELLULOSE
DI + JKJ + H2SO4 (75%) BENGKAK-BIRU;
DI + CHLOORZINKJOOD BIRU
Contoh pewarnaan histokimia PENDETEKSIAN KARBOHIDRAT (MUKUS) PADA JARINGAN LUNAK KARANG MASIF (Porites sp.) DI PERAIRAN KOTA BONTANG PROVINSI KALIMANTAN TIMUR | Andy Dharmaputra Noor , dkk. (2015) Fiksatif NBF 10% (24 jam) Bouin (48 jam) Dekalsifikasi Asam lemah (Asam Asetat 10%); Asam kuat (HCl 10%) Prosedur
Pewarnaan jaringan khusus : Periodic Acid Schiff (PAS) deteksi karbohidrat netral 1. Masukkan Larutan Schiff ke tempat penghangat 2. Deparafinasi dan Rehidrasi 3. Oksidasi dalam larutan Periodic Acid selama 10 - 30 menit 4. Cuci pada air mengalir dalam 3 menit 5. Rendam pada larutan Schiff selama 20 menit 6. Pindahkan pada air mengalir dan cuci selama 10 menit 7. Tambahkan counterstains sesuai selera (Hematoxilin-Eosin) 8. Dahidrasi, clearing dan mounting menggunakan bahan perekat (Entelen New; Canada Balsam)
6
24/05/2016
Contoh pewarnaan histokimia PENDETEKSIAN KARBOHIDRAT (MUKUS) PADA JARINGAN LUNAK KARANG MASIF (Porites sp.) DI PERAIRAN KOTA BONTANG PROVINSI KALIMANTAN TIMUR | Andy Dharmaputra N oor , dkk. (2015) Gambar : Fotomikrograf dinding polip karang masif . (e) jaringan sel epitel pada mesoglea. (a) Zooxanthellae pada lapisan Gastroderma pada lapisan dinding polip karang masif . (E) lapisan ektoderma, (G) Lapisan Gastroderma, (M) Mesoglea. Terlihat reaksi dari pewarnaan PAS mengandung karbohidrat netral, terlihat reaksi dari larutan Schiff bereaksi dengan Glikogen pada jaringan otot pada lapisan mesoglea menghasilkan warna merah magenta sampai keunguan.
Contoh pewarnaan histokimia SEBARAN KARBOHIDRAT PADA KELENJAR LUDAH BIAWAK AIR (Varanus salvator)| Idawati Nasution, dkk. (2014)
Prosedur Pewarnaan jaringan khusus : Alcian Blue (AB) pH 2,5 deteksi karbohidrat asam 1. Jaringan dideparafinasi dan rehidrasi 2. Rendam dalam lar. Alcian blue (AB) pH 2,5 selama 25 - 30 menit 3. Amati di bawah mikroskop (Reaksi positif ditandai dg terbentuknya warna biru pada jaringan) 4. Jaringan dicuci dg asam asetat 3% selama 5 menit (untuk menghilangkan sisa-sisa AB) 5. Cuci dg akuades selama 5 menit 6. Tambahkan counterstains dengan larutan Hematoxilin (pewarna inti) 7. Dahidrasi, clearing dan mounting menggunakan bahan perekat (Entelen New; Canada Balsam )
Contoh pewarnaan histokimia SEBARAN KARBOHIDRAT PADA KELENJAR LUDAH BIAWAK AIR (Varanus salvator)| Idawati Nasution, dkk. (2014)
7
24/05/2016
Prosedur Pewarnaan jaringan khusus : Periodic Acid Schiff (PAS) deteksi karbohidrat netral 1. Jaringan dideparafinasi dan rehidrasi 2. Oksidasi jaringan dlm lar. Periodic Acid 0,5% selama 5 menit 3. Bilas dengan akuades 4. Jaringan dimasukkan ke dlm lar. Schiff reagent selama 15 menit 5. Cuci dg air sulfit selama 5 menit (reaksi positif ditandai terbentuknya warna magenta / merah keung-unguan pada jaringan) 6. Bilas dengan akuades selama 5 menit 7. Tambahkan counterstains dengan larutan Hematoxilin (pewarna inti) 8. Dahidrasi, clearing dan mounting menggunakan bahan perekat (Entelen New; Canada Balsam)
Contoh pewarnaan histokimia SEBARAN KARBOHIDRAT PADA KELENJAR LUDAH BIAWAK AIR (Varanus salvator)| Idawati Nasution, dkk. (2014)
Pewarnaan : Alcian Blue (AB) pH 2,5
Gambar : Sebaran karbohidrat asam pada ketiga kelenjar saliva biawak air. Kelenjar lingualis (A dan B), Kelenjar sublingualis (C dan D), dan kelenjar mandibularis (E dan F). Reaksi Positif warna Biru pada kelenjar
8
24/05/2016
Contoh pewarnaan histokimia SEBARAN KARBOHIDRAT PADA KELENJAR LUDAH BIAWAK AIR (Varanus salvator)| Idawati Nasution, dkk. (2014)
Pewarnaan : Periodic Acid Schiff (PAS)
Gambar : Sebaran karbohidrat netral pada ketiga kelenjar saliva biawak air. Kelenjar lingualis (A dan B), Kelenjar sublingualis (C dan D), dan kelenjar mandibularis (E dan F). Reaksi Positif warna Magenta /merah keungu-unguan pada kelenjar
PROTEIN
KH, Protein & Lemak penyusun SITOPLASMA tdk semua reaksi + dg histokimiawi larut lebih dahulu (PROTEIN) waktu melalui beberapa proses karena itu hanya beberapa oleh lokalisasinya dapat ditunjukkan dg metode HISTOKIMIAWI
PROTEIN
9
24/05/2016
Tidak semua protein dapat ditunjukkan dg HISTOKIMIA tes BIOKIMIA rusak sebelumnya hanya bbrp jenis PROTEIN saja yg bisa
ARGININ metode SAKAGUCHI OXIN irisan metode BEKU Fiksastif Formalin/Alkohol Formalin JINGGA, Kolagen, Keratin & Koloid dr Thyroid bbrp hari tahan THYROSIN reaksi MILLON (modifikasi BENSLEY & GRESH) metode PARAFIN Fiksatif FORMALIN JINGGA s/d MERAH BATA
PROTEIN
Tidak semua protein dapat ditunjukkan dg HISTOKIMIA tes BIOKIMIA rusak sebelumnya hanya bbrp jenis PROTEIN saja yg bisa KERATIN a. Dilihat KORNIFIKASI Oesophagus, Ventriculus METODE IRISAN b. KORNIFIKASI pada sel VAGINA PAP SMEAR Apus Vagina Metode ASCHER, TURNER & de BOER pewarna MICHROME MF-4 INGGA s/d KUNING, KOLAGEN BIRU
PROTEIN
Metode ASCHER, TURNER & de BOER pewarna MICHROME MF-4 JINGGA s/d KUNING, KOLAGEN BIRU Metode PAPANICULAOU ceratinized cells MERAH; non ceratinized cells BIRU HIJAU Metode EDWARDS GURR & PAPANICULAOU u/ Apus Vagina u/ lihat keratin pada sel EPITEL DINDING VAGINA
10
24/05/2016
TRYPTOPHAN metode ROMIEU MERAH/ VIOLET HYALIN metode PHLOXIN, Hematoxylin (FB. Mallory HYALIN BIRU MERAH; HYALIN yang MATURE ROSE / hampir tdk berwarna.
Immunohisto/Sitokimia Imunohistokimia suatu metode kombinasi dari anatomi, imunologi dan biokimia untuk mengidentifikasi komponen jaringan yang memiliki ciri tertentu dengan menggunakan interaksi antara antigen target dan antibodi spesifik yang diberi label. Imunohistokimia suatu cara pemeriksaan untuk mengukur derajat imunitas atau kadar antibodi atau antigen dalam sediaan jaringan.
Immunohisto Sitokimia •
•
•
•
Identifikasi antigen pada jaringan /sel tertentu menggunakan interaksi antigen-antibodi dan menvisualisasikannya secara mikroskopis. Membutuhkan jaringan dengan jumlah dan ketebalan yang ber variasi tergantung dari tujuan pemeriksaan. Bermanfaat untuk identifikasi, lokalisasi, dan karakterisasi suatu antigen tertentu, serta menentukan diagnosis, therapi kanker. Komponen dalam immunohisto /sitokimia Antigen/epitop Antibodi: primer dan sekunder Serum Sistem deteksi Tracer/kromogen Buffer –
–
–
–
–
–
11
24/05/2016
•
Antigen/ epitop Sisi spesifik pada jaringan yang dapat dikenali oleh antibodi Antibodi Primer : –
•
–
–
Sekunder
•
–
–
Digunakan untuk menghambat reaksi non-spesifik Disarankan berasal dari spesies dari mana antibodi sekunder berasal Dapat digunakan sebagai kontrol negatif
Sistem deteksi –
–
•
Berikatan dengan kompleks antigen-antibodi primer Biasanya berlabel : HRP (horse edish peroxikase), biotin, streptavidin, fluorescent
Serum –
•
Antibody yang langsung berikatan dengan epitop Memiliki konjugat /tanpa konjugat Bila hanya mengenali epitop pada spesies tertentu monoklonal Bila dapat mengenali epitop pada beberapa spesies poliklonal
Digunakan untuk mendeteksi ikatan kompleks antigen-antibodi lengkap Ada dua tipe: ABC/HRP dan ABC/AP
Tracer/kromogen –
–
HRP: DAB (3,3’-diamino benzidine) /coklat; AEC (3-amino9ethylcarbazole)/merah
AP: Fast blue/biru; NBT/BCIP (nitro blue tetrazolium/5 -bromo-4chloro-3-indol-phosphat)
12
24/05/2016
Hubungan antar komponen pada immunohisto sitokimia
Pewarnaan Imunohistokimia Terdapat dua metode pewarnaan imunohistokimia, yaitu metode langsung (direct) dan metode tidak langsung ( indirect). 1. Metode langsung hanya menggunakan satu antibodi, yaitu antibodi primer yang telah dilabel. 2. Metode tidak langsung menggunakan dua antibodi, yaitu antibodi primer tanpa dilabel dan antibodi sekunder yang telah dilabel. - avidin-biotin methode , - peroxidase methode 100-1000 kali lebih sensitif dibandingkan metode lainnya - tyramin amplification methode
13
24/05/2016
Pewarnaan Imunohistokimia Prinsip pewarnaan imunohistokimia metode peroksidase , yaitu antigen yang ada pada jaringan diikatkan dengan antibodi primer yang spesifik. Lalu antibodi primer yang terikat antigen kemudian diikatkan pula dengan antibodi sekunder (antiantibodi primer) yang telah dilabel enzim peroksidase. Penambahan substrat yang berisi kromogen dan H 2O2 akan memunculkan endapan berwarna coklat dan H 2O. Endapan coklat hasil penguraian substrat (kromogen dan H 2O2) oleh enzim peroksidase. Warna coklat yang muncul menandakan reaksi positif (+), artinya di dalam jaringan terdapat antigen. Apabila di jaringan tersebut tidak terdapat antigen, maka tidak akan muncul warna coklat.
Beberapa contoh pewarnaan immunohistokimia
AMH-immunihistokimiakontrol negatif
AMH-immunihistokimiapositif
(Wijayanti, 2003)
14
24/05/2016
Beberapa contoh pewarnaan immunohistokimia Sangkot Sayuti Nasution, dkk (2015) : DETEKSI IMUNOHISTOKIMIA ANTIGEN Coxiella burnetii SEBAGAI PENYEBAB Q FEVER PADA SAPI
Menggunakan kit Imunohistokimia (LSAB Kit DAKO) Pewarnaan Imunohistokimia : 1. Irisan jaringan (5 µm) deparafinasi rehidrasi 2. Jaringan dipanaskan dalam bufer sitrat (menggunakan microwave) ± 5 menit 3. Cuci dengan phospate beffered saline tween 20 (PBST) 3 X ± 5 menit 4. Blocking endogenouse peroxidase menggunakan H2O2 3% selama 30 menit 5. Cuci dengan phospate beffered saline tween 20 (PBST) 3 X ± 5 menit 6. Blocking ikatan nonspesifik tetesi jaringan dg fetal bovine serum (FBS) 1% selama 30 menit 7. Cuci dengan phospate beffered saline tween 20 (PBST) 3 X ± 5 menit 8. Tetesi antibodi primer (antibodi poliklonal, rabbit anti-Coxiella burnetii FKH-IPB) inkubasi selama 1 malam pada suhu 4 oC
Beberapa contoh pewarnaan immunohistokimia Sangkot Sayuti Nasution, dkk (2015) : DETEKSI IMUNOHISTOKIMIA ANTIGEN Coxiella burnetii SEBAGAI PENYEBAB Q FEVER PADA SAPI
Menggunakan kit Imunohistokimia (LSAB Kit DAKO) Pewarnaan Imunohistokimia : 9. Cuci dengan phospate beffered saline tween 20 (PBST) 3 X ± 5 menit 10. Jaringan ditetesi antibodi sekunder (biotinilated ling universal ) selama 30 menit setelah pencucian. 11. Cuci dengan phospate beffered saline tween 20 (PBST) 3 X ± 5 menit 12. Jaringan tetesi streptavidin HRP selama 30 menit 13. Cuci dengan phospate beffered saline tween 20 (PBST) 3 X ± 5 menit 14. Tetesi Chromogen 3,3’-diaminobenzidine (DAB) selama 15 detik 15. Rendam pada akuades, rendam/tetesi counterstain menggunakan Mayer’s hematoksilin selama 25 detik 16. Jaringan kemudian dicuci dengan akuades dehidrasi (alkohol bertingkat) clearing (xilol) mounting 17. Pengamatan
15
24/05/2016
Beberapa contoh pewarnaan immunohistokimia
Gambar : Hasil pewarnaan imunohistokimia. Warna coklat menunjukkan hasil imunoreaktif pada sel-sel makrofag. A= Limpa, B= Paruparu, C= Hati. 400x. Menggunakan kit Imunohistokimia (LSAB Kit DAKO) Sangkot Sayuti Nasution, dkk (2015) DETEKSI IMUNOHISTOKIMIA ANTIGEN Coxiella burnetii SEBAGAI PENYEBAB Q FEVER PADA SAPI
Beberapa contoh pewarnaan immunohistokimia Pengecatan preparat Imunohistokimia (IHC) p53 pada penelitian laboratorium CCRC (Cancer Chemoprevention Research Center ) Fakultas Farmasi UGM Prosedur Kerja : 1. Lakukan deparafinasi preparat (blok parafin) dengan xylene sebanyak 3 kali masingmasing 3 menit. 2. Rehidrasi preparat dengan menggunakan etanol 100%, etanol 95 % dan etanol 70% masingmasing selama 2 menit, 2 menit, 1 menit dan terakhir dengan air selama 1 menit. 3. Rendam dalam peroxidase blocking solution pada suhu kamar selama 10 menit. 4. Inkubasi preparat dalam prediluted blocking serum 25°C selama 10 menit. 5. Rendam preparat di dalam antibodi monoklonal anti-p53 25°C selama 10 menit. 6. Cuci preparat dengan Phospate Buffer Saline (PBS) selama 5 menit.
16
24/05/2016
Beberapa contoh pewarnaan immunohistokimia Pengecatan preparat Imunohistokimia (IHC) p53 pada penelitian laboratorium CCRC (Cancer Chemoprevention Research Center ) Fakultas Farmasi UGM Prosedur Kerja : 7. Inkubasi preparat dengan antibodi sekunder ( conjugated to horse radish peroxidase) 25°C selama 10 menit. 8. Cuci preparat dengan PBS selama 5 menit. 9. Inkubasi preparat dengan peroksidase 25°C selama 10 menit. 10. Cuci preparat dengan PBS selama 5 menit. 11. Inkubasi preparat dengan kromogen DAB ( Diaminobenzinidine) 25°C selama 10 menit. 12. Inkubasi preparat dengan Hematoxylin-Eosin selama 3 menit. 13. Cuci preparat dengan air mengalir 14. Bersihkan preparat dan tetesi dengan mounting media, tutup preparat dengan coverslip 15. Amati ekspresi p53 (warna coklat) pada sel menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 1000 x.
Beberapa contoh pewarnaan immunohistokimia Pengecatan preparat Imunohistokimia (IHC) p53 pada penelitian laboratorium CCRC (Cancer Chemoprevention Research Center) Fakultas Farmasi UGM Gambar : Ekstrak etanolik kulit Citrus eticulata 750 mg/kg BB menginduksi ekspresi p53 pada sel epitel kelenjar payudara tikus yang diinduksi DMBA. Pengecatan dengan imunohistokimia (indirect method ) menunjukkan sel yang mengekspresikan protein p53. Sel yang mengekspresikan p53 ditunjukkan dengan sel yang berwarna coklat (mikroskop perbesaran 1000x ) Preparat diligasikan antibodi monoklonal p53, antibodi sekunder terlabel peroksidase, kemudian dikarakterisasi dengan double staining menggunakan DAB dan hematoxylineosin.
17
24/05/2016
Beberapa contoh pewarnaan immunohistokimia
SSEA-1 immunohistokimia pada fetus Tammar wallaby
Beberapa contoh pewarnaan immunohistokimia
Immunohistokimia pada colon carcinoma dengan antibodi anti-cytokeratin dan p53 (Dako)
18
24/05/2016
Beberapa hal penting yang harus diperhatikan dalam pelaksanaan immunohistokimia 1. Pemilihan iksatif • Paraformaldehyde 4 % • Bouin • Fiksatif khusus
2. Pemrosesan jaringan • Metode parafin • Metode beku
. Pengirisan • Mikrotom biasa • Cryosrate fluorescent; jaringan tertentu
4. Penggunaan pelapisan gelas objek • Gelas objek sebaiknya menggunakan pelapis: Gelatin kering (minimal), superfrost, polylisin
Beberapa hal penting yang harus diperhatikan dalam pelaksanaan immunohistokimia 4. Mounting • Organik HRP • Aqueous AP
5. Pada setiap kali pelaksanaan immuno-histo/ sitokimia harus selalu tersedia kontrol positif dan kontrol negatif . • Kontrol positif digunakan untuk mengetahui apakah antibodi yang digunakan bekerja dengan baik atau tidak • Kontrol negatif digunakan untuk mengetahui spesifisitas reaksi warna yang muncul.
6. Pada beberapa antibodi memerlukan tahapan antigen retrieval/ antigen unmasking • Dilakukan dalam microwave atau menggunakan enzim tertentu pronase, proteinase K
trypsin,
7. Pada setiap tahap pencucian perlu dilakukan agitasi
19
24/05/2016
20
