DESARROLLO SEGUNDA PARTE 1. De acuerdo al capítulo de crecimiento microbiano, del módulo. Cuál es la diferencia entre la constante de la velocidad de crecimiento (k) de un organismo y su tiempo de generación (g) Entendemos por crecimiento microbiano el aumento del número de microorganismos a lo largo del tiempo. Por tanto, no nos referimos al crecimiento de un único microorganismo (ciclo celular) sino al demográfico de una población. Se denomina crecimiento equilibrado a aquél en el que toda la biomasa, número de células, cantidad de proteínas, de ADN, etc., evolucionan en paralelo. El crecimiento equilibrado probablemente ocurra en muy contadas ocasiones en condiciones naturales. Por tanto, es principalmente un concepto de aplicación en el laboratorio. Sin embargo, es útil porque permite estudiar el crecimiento microorganismos. Las bacterias crecen siguiendo una progresión geométrica en la que el número de individuos se duplica al cabo de un tiempo determinado denominado tiempo de generación (g). De esta forma, podemos calcular el número de bacterias (N) al cabo de un número de generaciones (n) usando la ecuación siguiente: N = N0 2n Siendo N0 el número de células en el momento actual. El número de generaciones se puede calcular de la siguiente forma: n=t/g Donde t es el tiempo transcurrido. Concluyendo y dado dos significados más precisos y cortos para entender el tema podemos decir que la velocidad de crecimiento es el cambio en el número de células por unidad de tiempo y el tiempo requerido para que a partir de una célula se forme dos células o el tiempo requerido para duplicar una población de células se llama tiempo de generación o tiempo de duplicación. En una sola generación se duplica el número de células o masa celular, en minutos en ocasiones en horas o días. 2. De acuerdo al modelo matemático de crecimiento microbiano. Calcule el valor de g y de k en un experimento de crecimiento en el que se inoculó un medio con 5 x 106 células/ml de Escherichia colli y que después de un período de latencia de 1 hora, creció exponencialmente durante 5 horas alcanzando una población de 5,4 x 109 células/ml. Debido a que el crecimiento bacteriano es una progresión geométrica, existe una relación directa entre el número de células presente en el momento inicial y el habido en un momento determinado del crecimiento especial, de modo que: N = N0 2n n= (Log N- Log N0)/ Log 2 n= Log (5,4 x 109)- Log (5 x 106) / Log 2 n= (9,732) - (6,698) / 0,301 n=10,07 generaciones
g= t / n g= 5 / 10,07 g= 0,49 horas
k= In 2 / g k= 0,6931 / 0,49 k= 1,414
3. De acuerdo al capítulo sobre metabolismo microbiano. Compare las rutas metabólicas utilizadas por los microorganismos, diferencie de acuerdo al sustrato utilizado, mecanismo de obtención de energía y productos obtenidos. El metabolismo es la suma de transformaciones de la materia que ocurre en el interior de la célula y que da lugar a la síntesis de material celular a partir desustancias nutritivas. Los dos procesos de producción de energía son la fermentación y la respiración. FERMENTACIÓN
RESPIRACIÓN
Sustrato utilizado
Moléculas orgánicas. sustratos fermentables simple (como azúcar, por ejemplo)
Mecanismo de obtención de energía
El sustrato da lugar a una serie de compuestos, unos más oxidados y otros más reducidos; en el proceso fermentativo mantiene un estricto balance O-R. El nivel de oxidación promedio de los productos finales es muy cercano al del sustrato. De ahí que la generación de ATP asociada a la fermentación se denomina fosforilación a nivel de sustrato El proceso ocurre en ausencia de oxigeno
Electrones tanto de compuestos orgánicos como inorgánicos (oxidándose). oxigeno molecular Los electrones son transferidos a través de una cadena transportadora de electrones al final de la cual existe un aceptor exógeno oxidado (A), que se reduce. Si el aceptor final es el O2, hablamos de respiración aerobia; Si el aceptor final es distinto del O2 (nitrato, sulfato, etc.), respiración anaerobia. la transferencia se da ordenadamente, en la dirección de mayor potencial redox positivo,
Productos obtenidos
Lactato Etanol, CO2 Succinato, formiato, H2 Butilenglicol Acetona Butirato Butanol
acetato,
energía libre que se va a traducir en un potencial electroquímico de protones, cuya disipación a través de ATP-asas de membrana origina ATP, conociéndose este proceso como fosforilación oxidativa
4. Compare y señale las diferencias entre metabolitos secundarios y primarios, y dé un ejemplo de cada uno de ellos. Incluya al menos dos
explicaciones de las bases moleculares por las que algunos metabolitos son secundarios, envés de primarios.
Los vegetales, igual que otros organismos mediante sus procesos metabólicos sintetizan dos categorías de metabolitos: primarios y secundarios, aunque esta distinción resulta totalmente arbitraria pues no hay una división precisa entre metabolismo primario y secundario. Los metabolitos primarios, muy abundantes en la naturaleza, son indispensables para el desarrollo fisiológico de la planta; se encuentran presentes en grandes cantidades, son de fácil extracción y su explotación es relativamente barata y conducen a la síntesis de los metabolitos secundarios. Entre ellos se encuentran aminoácidos proteicos, proteínas, carbohidratos, lípidos, ácidos grasos, algunos ácidos carboxílicos, etc. Los metabolitos secundarios son derivados de los primeros, pero su distribución en el reino vegetal es más limitada y para determinados compuestos queda restringida a ciertas especies e incluso a algunos grupos dentro de una misma especie, por lo tanto es improbable que desarrollen un papel fundamental en el metabolismo primario. Sin embargo, existen excepciones, entre estas están las clorofilas y los reguladores del crecimiento (hormonas vegetales), de los que sus funciones bioquímicas y fisiológicas han sido ampliamente reconocidas; además, recientemente se estableció que los flavonoides son factores que inducen la germinación del polen y la elongación del tubo polínico
Metabolitos primarios
Metabolitos secundarios
Productos del metabolismo general Ampliamente distribuí dos en plantas y microorganismos Indispensables para la vida
Productos del metabolismo especial Biosintetizados a partir del metabolismo primario Distribución restringida a ciertas plantas, microorganismos Distribución taxonómica restringida (a veces característico de un género dado o de una especie) No indispensables para la vida Alcaloides, terpenos, flavonoides, esteroides, cumarinas, etc.
Aminoácidos de proteínas, monosacáridos, lípidos, ácidos derivados del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, glúcosidos, etc
5. De acuerdo al módulo identifique la diferencia entre el término fermentación en Bioquímica y el término fermentación en la Biotecnología. La biotecnología microbiana o como se llamaba anteriormente microbiología industrial se refiere a los procesos donde participan los microorganismos para la obtención de productos o metabolitos de interés humano. La microbiología industrial comenzó con los procesos de fermentación alcohólica por ej. La
fermentación del vino y de la cerveza. Más tarde se desarrollaron los procesos microbianos para la producción de agentes farmacéuticos como los antibióticos, la producción de aditivos alimentarios como los aminos ácidos, para la producción de enzimas y sustancias químicas industriales como el butanol, el ácido cítrico, entre otros. La fermentación es el mecanismo más simple y quizás el más antiguo desde el punto de vista evolutivo, de los procesos de obtención de energía. Se suponen que en las condiciones del mundo primitivo, donde no existía oxígeno libre, ni los rayos del sol llegaban a su superficie, los primero organismos solo podían obtener la energía a partir de la contenida en los compuestos orgánicos. Se puede definir entonces, la fermentación como el proceso metabólico de generación de ATP. Desde un punto de vista bioquímico las fermentaciones se caracterizan por ser una suma de reacciones, al final de las cuales los productos poseen un contenido energético menor que el inicial. Si analizamos la fermentación a través de la energía de enlace, tendremos que en ella se producen reordenamientos moleculares en los que se pasa de funciones de mayor contenido a funciones de menor contenido energético. Así, en la mayoría de las fermentaciones se pasa de grupos carbonilo e hidroxilo a grupos carboxilo de menor contenido energético. 6. Estudie la ova sobre fermentación, que se encuentra en el entorno de conocimiento de la unidad uno y describa los problemas que se presentan en el escalado desde el punto de vista de la aireación, la esterilización y el control del proceso de fermentación. Por qué están importante la estabilidad en un fermentador industrial? El mantenimiento de un ambiente aséptico y unas condiciones aeróbicas son, probablemente, los dos puntos de mayor relevancia que hay que considerar. Los fermentadores más ampliamente utilizados a nivel industrial están provistos de mecanismos de agitación, dispersión y aireación así como de sistemas para el control de la temperatura, pH y formación de espuma. En los reactores de tipo "air lift“, el mismo aire inyectado promueve la agitación. Básicamente consiste en dos cilindros concéntricos y por la base de uno de ellos, por ejemplo el interior, se inyecta aire. De este modo se genera una circulación de líquido ascendente en el compartimento interno y descendiente en el externo, lo que favorece el mezclado. Factores fisicoquímicos que afectan al rendimiento de las fermentaciones industriales 1.- Oxígeno 2.-Temperatura 3.- pH Una adecuada agitación de un cultivo microbiano es esencial para la fermentación ya que produce los siguientes efectos en las tres fases a. Incrementar la velocidad de transferencia de oxígeno desde las burbujas de aire al medio líquido; los microorganismos no pueden
utilizar oxígeno gaseoso, sino solamente el que se encuentra en disolución. b. Aumentar la velocidad de transferencia de oxígeno y nutrientes desde el medio a las células. Debido al movimiento se evita que las células creen áreas estancadas con bajos niveles de oxígeno y nutrientes.3 Impedir la formación de agregados celulares. c. Aumentar la velocidad de transferencia de productos metabólicos de las células al medio. d. Aumentar la tasa o la eficiencia de la transferencia de calor entre el medio y las superficies de refrigeración del fermentador 7. De acuerdo a la ova sobre fermentación. Determine por medio de un esquema las etapas de un proceso fermentativo a nivel industrial y explique cada uno de los pasos. 1) Experimentos en el matraz de laboratorio que son generalmente la primera indicación que es posible un proceso de interés industrial. 2) El fermentador de laboratorio, un fermentador a escala pequeña, generalmente de vidrio y de 5 a 10 litros de capacidad. En el fermentador de laboratorio es posible ensayar variaciones en el medio de crecimiento temperatura, pH, etc., ya que los costos son bajos tanto en el equipo como en los medios de cultivo. 3) La etapa en planta piloto, que se suele llevar a cabo en equipos de 300 a 3000 litros. Aquí las condiciones se acercan más a la escala industrial, pero el costo no es aún un factor de importancia. En el fermentador de una planta piloto es deseable una cuidadosa instrumentación y un control con computadora, de modo que las condiciones que se obtengan sean lo más similares a las del fermentador industrial. 8. De acuerdo a la ova sobre fermentación Realice un cuadro comparativo donde diferencie los tipos de fermentación industrial y los mecanismos de obtención de productos fermentativo. En función de los flujos de entrada y salida, la operación de un biorreactor puede ser de tres modos distintos BATCH O DISCOTINUA Sistema cerrado A lo largo de toda la fermentación no se añade nada, excepto oxígeno (en forma de aire), una gente antiespumante y ácidos o bases para controlar el pH. Cuando se ha alcanzado el nivel deseado de reacción, se vacía el
ALIMENTADO O FED-BATCH Una mejora del proceso cerrado discontinuo es la fermentación alimentada En los procesos alimentados, los sustratos se añaden escalonadamente a medida que progresa la fermentación a formación de muchos metabolitos secundarios está
COTINUO O QUIMIOSTATO sistema abierto La solución nutritiva estéril se añade continuamente al biorreactor y una cantidad equivalente de solución utilizada de los nutrientes, con los microorganismos Opera por periodos largos; tiempos muertos bajos.
reactor, se limpia y el proceso se repite En los procesos comerciales la fermentación frecuentemente se interrumpe al final de la fase logarítmica (metabolitos primarios) o antes de que comience la fase de muerte (metabolitos secundarios) Dificultad de controlar la velocidad de crecimiento, excepto variando la composición del medio o las condiciones de proceso Alta demanda de oxígeno puede generar una limitación debido a una insuficiente capacidad del reactor para transferir O2 al medio Inconvenientes para remover calor.
Tiempos muertos entre procesos disminuye la productividad
sometida a represión catabólica (efecto glucosa) Los elementos críticos de la solución de nutrientes se añaden en pequeñas concentraciones al principio de la fermentación y continúan añadiéndose a pequeñas dosis durante la fase de producción. útil en procesos en los que el crecimiento celular y/o la formación de producto son sensibles a la concentración del sustrato limitante Se emplea cuando se quieren evitar fenómenos de inhibición por sustrato y se requiere alcanzar una alta concentración de biomasa. Limitar la demanda de O2 del cultivo
Obtener altas concentraciones de sustrato evitando el efecto osmótico y tóxico de nutrientes Maximizar el crecimiento celular (efectoCrabtree en levaduras)
El medio nutriente es inoculado con el cultivo microbiano al entrar al reactor y los organismos llevan a cabo su actividad a medida que el líquido fluye a través del sistema y salen del sistema junto con el medio. Los organismos pueden separarse de la corriente que lleva al producto y reciclarse para inocular el líquido de alimentación Alto costo por alta calidad de equipos y accesorios.-Requiere gran reservorio para almacenamiento de medio o suministro continuado de sustrato El cultivo se mantiene con coeficientes de crecimiento constante, crecimiento balanceado, composición celular constante. Generación de biomasa constante como productividad y conversión.Volumen de reactor reducido en comparación a la productividad similar en proceso por lotes Se incrementa el riesgo de contaminación debido a la amplia operación Posibilidad de mutación, incremento de fagos por los cambios genéticos debido a la presencia de plasmidios e incremento de estos
9. En la ova sobre fermentación. Identifique los factores que pueden alterar la producción de enzimas de interés económico a partir de microorganismos en un proceso industrial, explique a través de un ejemplo cada uno de ellos. Existen varios problemas en el control de la temperatura, de la aireación y de la humedad, por ello se prefieren los cultivos sumergidos a los cultivos en superficie. Los cultivos en medio líquido, profundos, agitados, son mejor adaptados a los diferentes controles mediante métodos modernos y reducen los riesgos de contaminación. Además se prestan mejor a las operaciones de extrapolación y de optimización necesarias para el paso del fermentador piloto de laboratorio al fermentador industrial. Los factores que pueden afectar la producción de enzimas a partir de un proceso industrial son:
- La baja especificidad: Aunque en la industria las enzimas sean utilizadas para la hidrólisis de macromoléculas complejas en las cuales los sitios de acoplamiento con, frecuencia se desconocen, el efecto global que se busca involucra, generalmente, la utilización de un tipo preciso de enzima. - El valor de pH: Este factor tiene una influencia variable según las enzimas; algunas de ellas, como la proteasa alcalina aún son activas a pH = 10, en tanto que las enzimas fúngicas funcionan aún a pH = 3. - El valor de la temperatura: Generalmente, quienes utilizan enzimas se interesan en poder disponer de enzimas que soporten temperaturas elevadas, ya que estas temperaturas conservan en parte la esterilidad del medio de fermentación.
SEGUNDA PARTE
Realice una ponencia científica: Estudie la Ova sobre enzimas, en dónde además de una breve contextualización del tema encontrará un problema, en el que se han planteado tres hipótesis que podrían explicar el fenómeno. A partir de esto construya un texto científico. Para ello.
A. Plantee la Hipótesis. De acuerdo a lo leído escoja una de las tres hipótesis que se plantean para explicar el fenómeno. (Recuerde que debe tener en cuenta los datos que se le dan en el problema) Ecuación de Michaelis-Menten: La ecuación de Michaelis-Menten describe la velocidad de reacción de muchas reacciones enzimáticas. Recibe este nombre en honor a Leonor Michaelis y Maude Menten. Este modelo sólo es válido cuando la concentración del sustrato es mayor que la concentración de la enzima, y para condiciones de estado estacionario, es decir, cuando la concentración del complejo enzima-sustrato es constante
B. Establezca la garantía: Respalde su hipótesis con la ley o teoría científica que corresponda y explique la hipótesis planteada. La ecuación de Michaelis-Menten se basa en tres postulados: 1) El complejo que se forma de enzima-sustrato se encuentra en estado estacionario, significa que la concentración del complejo es se va a mantener constante a pesar de que se esté produciendo trasformaciones de sustrato a producto, siendo así la variación que se produce en la concentración del complejo ES con respecto al tiempo es igual a 0.
2) Las condiciones de saturación cuando el sistema está saturado (enzima) lo hace en la formación del complejo ES, cuando existe una saturación enzimática, toda la enzima debe encontrarse en la forma de ES, es decir en el momento en que se está produciendo la máxima actividad la concentración de enzima libre es prácticamente 0 o mínima porque toda debe encontrarse como complejo ES 3) Cuando toda la enzima se encuentra como complejo ES la velocidad de la reacción tiene que ser máxima
E la gráfica se puede ver como la formación del complejo ES se mantiene en estabilidad hasta que empieza e cierto mometo empieza a disminuir pues aumenta la concetracion de producto El aumento de concentración de producto es inversamente proporcional a la concentración de complejo ES.
C. Analice la evidencia. Para ello, realice los laboratorios virtuales 2 y 3, en ese orden y tome los resultados obtenidos, lea detenidamente los documentos, los artículos científicos relacionados y escoja de ellos los datos empíricos (experimentales) y teóricos que le puedan servir como evidencia. D. Respalde la Garantía. Una vez analizados los datos de los laboratorios y los artículos científicos, relaciónelos con la garantía (teoría científica) y construya la evidencia científica. Ecuación de Michaelis-Menten: Cuando la concentración en substrato cambia al infimito; la velocidad inicial tiende hacia k3 [Er], o sea hacia la velocidad máxima V m; toda la enzima se encuentra entonces bajo la forma ES. La ecuación es en su forma más simple:
Esta es la ecuación de Michaelis-Menten, según la cual la velocidad de la reacción enzimática es una función hiperbólica de la concentración del substrato. Los resultados experimentales en el caso de las enzimas michaelianas con un solo substrato corroboran la validez de esta ecuación. Significación de Km Y de Vm: Vm representa la velocidad máxima que puede alcanzar la reacción: toda la enzima se encuentra bajo la forma compleja ES. Cuando la velocidad de la reacción alcanza la mitad de la velocidad máxima, v= 1/2 Vm, Km es entonces igual a (S]. Si kz > k3, Km = kz/k1 que es la hipótesis de Michaelis-Menten : [E] + [S] y [ES] están en equilibrio y la formación del producto representa una ligera fuga. En este caso, Km puede ser asimilada a la inversa de la afinidad de las enzimas por el substrato. Mientras más pequeña sea Km, mayor será la afinidad y viceversa. Si kz < k3, la hipótesis de Michaelis-Menten no tiene validez y Km ya no tiene relación con la afinidad de la enzima por el substrato. También es preferible considerar Km como una constante empírica igual a la concentración del
substrato para la cual la velocidad inicial es igual a V m/2en las condiciones experimentales definidas. Reversibilidad y relación de Haldane: En distintos puntos de la curva las reacciones enzimáticas son reversibles, es de ecir las enzimas pueden catalizar la reacción inversa:
E. Encuentre las posibles excepciones, que se puedan presentar sobre la hipótesis escogida, adelántese a las posibles refutaciones que pueda recibir sus argumentos. Hay enzimas que no obedecen la ecuación de Michaelis-Menten. Se dice que su cinética no es Michaeliana. Esto ocurre con los enzimas alostéricos, cuya gráfica v frente a [S] no es una hipérbola, sino una sigmoide. En la cinética sigmoidea, pequeñas variaciones en la [S] en una zona crítica (cercana a la KM) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de reacción.
F. Concluya. Ratifique la Hipótesis escogida utilizando un calificador modal. Aunque es imposible medir exactamente la concentración de sustrato que da Vmax, las enzimas pueden caracterizarse mediante la concentración de sustrato a la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. Para enzimas que exhiben una cinética de Michaelis-Menten simple esta constante representa la constante de disociación del complejo enzima-sustrato (ES) (o la
inversa de la afinidad entre enzima y sustrato). Valores bajos indican que el complejo ES está unido muy fuertemente y raramente se disocia sin que el sustrato reaccione para dar producto. En estos casos se obtendrá una KM diferente según el sustrato específico sobre el que actúe la enzima (como sucede en el caso de enzimas que actúan sobre sustratos análogos) y según las condiciones de reacción en que se realicen las mediciones. La derivación de Michaelis y Menten está descrita por Briggs y Haldane. Se supone que la reacción enzimática es irreversible, y que el producto no se liga con la enzima después de la reacción.
