Prin Pr inssip im imun unol olog ogii pa pad da pe pem mer erik ikssaa aan n labora lab orator torium ium kli klinik nik
Deparment of Histology and Cell Biology Faculty of Medicine UGM
Dewi K Paramita
Prin Pr insi sip p im imun unol olog ogii pa pada da pe peme meri riks ksaa aan n labo la bora rato tori rium um kl klin inik ik 1. Prinsip pengenalan antigen oleh antibodi pada beberapa bebera pa teknik pemeriksaan imunologi 2.Berbagai macam labeling dan dete deteksi ksi pada pemeriksaan dengan teknik imunologi 3. Contoh deteksi dengan imunohistokimia dan immunofluorescence assay
Prin Pr insi sip p im imun unol olog ogii pa pada da pe peme meri riks ksaa aan n labo la bora rato tori rium um kl klin inik ik 1. Prinsip pengenalan antigen oleh antibodi pada beberapa bebera pa teknik pemeriksaan imunologi 2.Berbagai macam labeling dan dete deteksi ksi pada pemeriksaan dengan teknik imunologi 3. Contoh deteksi dengan imunohistokimia dan immunofluorescence assay
Tekn eknik ik Im Imuno unolog logii (immunoassay)
Metode deteksi Metode deteksi antigen / protein dalam protein dalam sel, jaringan atau prot pr otei ein n ter erla laru rutt ol oleh eh antibodi seba sebag gai re reag agen en sp spes esif ifik ik (int (i nter erak aksi si an anti tige genn-an anti tibo bodi di)) ya yang ng divis divisua uali lisa sasi si de deng ngan an mark ma rker er yan ang g di dila labe bell pa pada da an anti tibo bodi di,, mi misa saln lny ya pe pew war arna na fluorescent, enzim atau partikel emas, dll.
Prinsip teknik imunologi
Deteksi antigen/protein: antigen dikenali oleh antibodi (Ab) spesifik sebagai probe
Molekul antibodi tidak nampak divisualisasi dengan label
Antibodi Daerah pengenalan spesifik terhadap antigen
Species specific
Sumber antigen/protein yang akan dideteksi
Sel
Jaringan
Protein terlarut (dalam darah blood, serum, cairan tubuh)
Macam teknik pemeriksaan imunologi & sumber antigen Sumber antigen
Teknik imunodeteksi
Jaringan
Imunohistochemistry (IHC)
Protein terlarut
ELISA
Immunoblotting
immunoprecipitation
FACS
IFA
Sel
Komponen penting pada teknik imunologi
antigen
Antibodi primer
Antibodi sekunder (jika perlu)
Label : Enzim, fluorescence, dll
Larutan pewarna (kromogen) and substrat
Metode dasar pada teknik imunologi
Direct
Indirect
Sandwich
Direct method (metode langsung)
Label pada antibodi primer Keuntungan:
Cepat
Spesifik
Kerugian:
Perlu antobodi primer dalam jumlah banyak
antigen
Indirect method (metode tidak langsung)
Label pada antibodi sekunder
Keuntungan Lebih sensitif Antibodi sekunder dapat digunakan untuk bermacammacam immunoassay (jika antibodi primer dari spesies yang sama)
Kerugian: Reaksi silang antibodi sekunder dengan Ig endogenous pada spesimen
antigen
Capture atau Sandwich (ELISA)
•
•
Untuk mendeteksi substansi yang jumlahnya sangat kecil, contoh: sitokin
Antibodi primer spesifik yang mengenali antigen dilekatkan pada plate
Faktor penting pada teknik imunologi
Pengenceran antibodi (konsentrasi antibodi)
Inkubasi antibodi
Waktu
Suhu
Enzim & substrat, fluorochrom & filter
Kontrol positif
Kontrol negatif
Label pada immunoassay Label
Radioaktif Coloidal gold
Virus particle Ferritin Fluorescent Enzyme
Label pada immunoassay Immunoassay
Label
Westernblotting
Enzim (HRP atau alkaline phosphatase)
ELISA
Enzim, biotin/streptavidine
Immunofluorescence
Fluorescence dyes
Immunohistochemistry
Enzim, biotin/streptavidine
Flowcytometri
Fluorescence, dyes, tandem dyes
Pemilihan deteksi antibodi: direct atau indirect
Pemilihan deteksi antibodi: direct atau indirect Direct: label pada antibodi primer
Aplikasi : flow cytometri
Indirect :
Label pada antibodi sekunder
Keuntungan:
Lebih spesifik background staining lebih sedikit
Aplikasi : imunostaining Keuntungan:
Lebih sensitif amplifikasi sinyal signifikan
Aplikasi lebih felksibel label dapat bermacam-macam
Label dapat berupa fluorescence, biotin, atau enzim yang dikonjugasi pada antibodi sekunder.
Kerugian:
Background lebih tinggi nonspecific binding dari antibodi primer dan sekunder
Keuntungan & kerugian Direct v.s. Indirect
Bagian dari antibodi yang di label Gugus amin primer (-NH2) pada residu lisin di daerah N terminus.
Gugus sulfuhydril (-SH) pada residu sistein terbentuk secara selektif pada ikatan bisulfid di daerah hinge region
Residu karbohidrat yang mengandung cisdiol dapat dioksidasi (-CHO) menjadialdehid aktif terlokalisasi pada daerah Fc banyak ditemukan pada antibodi poliklonal
Pemilihan tipe sinyal untuk deteksi: substrat kolorimetrik atau fluorescence
Labeling dengan enzim
Keuntungan : shelf life yang panjang Sensitivitas tinggi Visualisasi langsung tidak membutuhkan alat yang canggih (contoh alat: spektrofotometer) Dibanding label radioaktif tidak berbahaya Label enzim yang kecil dapat melewati membran memungkinkan untuk deteksi intraseluler Visualisasi enzim dengan substrat dapat bertahan lama hingga bertahuntahun Kerugian : Melibatkan multiple assay steps Kadang menggunakan sustrat yang berbahaya Memungkinakan adanya gangguan dari enzim endogenus Enzim memberikan resolusi yang buruk pada Rekomendasi aplikasi : imunohistokimia, imunoblot dan immunoassay kuantitatif dan
Labeling dengan enzim
Labeling dengan enzim: HRP v.s AP Horseradish peroxidase (HRP) v.s Alkaline phosphatase (AP) HRP
AP
Ukuran
40 kDa
140 kDa
Harga
Relatif murah
Relatif mahal
Stabilitas (penyimpanan)
Stabil pada suhu < 0°C
Tidak stabil pada suhu < 0°C
Macam substrat
Banyak
Sedikit/terbatas
Kinetika
Cepat
lambat
pH
5-7
8-10
Labeling dengan biotin
Biotin adalah vitamin dengan berat 244 dalton
Banyak ditemukan di jaringan dan darah
Mempunyai afinitas yang besar dengan protein avidin, streptavidin ikatan terjadi cepat dan tidak terganggu dengan perubahan pH extrem, pelarut organik dan agen denaturasi lain.
Molekul kecil dapat dikonjugasi dengan banyak protein tanpa mengganggu aktivitas protein tersebut
Labeling dengan biotin: IHC Avidin-biotin method ABC method
LSAB method
Labeling dengan fluorescent
Molekul antibodi dapat dilabel dengan berbagai macam probe flourecent
Setiap probe fluorescent mempunyai spektrum sinyal eksitasi dan emisi
Contoh labeling dengan fluorescein isothiocyanate (FITC)
Fluorescenct probes
The maximum excitation and emission wavelength of commonly used fluorescent probes
Contoh metode imunohistokimia dan immunofluorescence assay
EBNA1-IHC (OT1x Mab)
LMP1-IHC (OT21C Mab)
VCA-p18-IHC (OT15E Mab)
Contoh Prosedur imunohistokimia LABELED STREPTAVIDIN-BIOTIN Method I. Deparafinisation
V. IHC staining proper
Xylene (2 x 10 mins)
Primary Antibody (variable)
Ethanol absolute (2 x 5 mins)
Tris buffer wash (2 x 10 mins)
95% ethanol (2 x 5 mins)
Biotinylated Link Antibody (30 mins)
II. H2O2/ methanol (15 mins)
Tris buffer wash (2 x 10 mins)
RINSE with DISTILLED WATER
Streptavidine-Peroxidase (30 mins)
Tris buffer wash (2 x 10 mins)
Tris buffer wash (2 x 10 mins)
III. Antigen Retrieval Tris buffer wash (2 x 10 mins)
DAB/AEC - Chromogens (5-10 mins) Rinse with water
Hematoxyline IV. Blocking solution (10 min) (Normal non-immune serum)
Rinse with water (dan/ atau dehidrasi)
Tris buffer wash (2 x 10 mins)
Mounting
Meminimalisir background staining Bloking
aktivitas endogenous peroxidase
peroxidase dan pseudo-peroxidase pada jaringan normal dan tumor
Contoh Prosedur imunohistokimia LABELED STREPTAVIDIN-BIOTIN Method I. Deparafinisation
V. IHC staining proper
Xylene (2 x 10 mins)
Primary Antibody (variable)
Ethanol absolute (2 x 5 mins)
Tris buffer wash (2 x 10 mins)
95% ethanol (2 x 5 mins)
Biotinylated Link Antibody (30 mins)
II. H2O2/ methanol (15 mins)
Tris buffer wash (2 x 10 mins)
RINSE with DISTILLED WATER
Streptavidine-Peroxidase (30 mins)
Tris buffer wash (2 x 10 mins)
Tris buffer wash (2 x 10 mins)
III. Antigen Retrieval Tris buffer wash (2 x 10 mins)
DAB/AEC - Chromogens (5-10 mins) Rinse with water
Hematoxyline IV. Blocking solution (10 min) (Normal non-immune serum)
Rinse with water (dan/ atau dehidrasi)
Tris buffer wash (2 x 10 mins)
Mounting
Meminimalisir background staining
Bloking non-specific background staining
Paling sering terjadi: Protein melekat pada kolagen & jaringan ikat diatasi denga pemberian non-immune serum Sebab lain : pengenceran antibodi yang tidak tepat (terlalu pekat), langkah pencucian yang tidak tepat, langkah deparafinisasi yang tidak tepat.
U
Immunoassay with fluorescence labeled
Immunofluorescence assay (IFA): teknik imunostaining dengan label fluorescence pengamatan dengan mikroskop fluorescence
Floocytometri
Immunofluorescence Assay
Labeled antibody with a fluorescence visible marker:
i.e. Fluorescein isothianate (FITC)
Disadvantage:
Limited to frozen sections
Requires special microscopy
Poor morphologic resolution
Fluorescence is ephemeral, result have to be photographed
