LAPORAN PRAKTIKUM PEMISAHAN DAN PENGUKURAN
PENENTUAN PENENTU AN KADAR KAD AR PARASETAMOL PARASETAMOL DAN KAFEIN DENGAN TEKNIK HPLC Diajukan untuk memenuhi mata kuliah Praktikum Pemiahan !an Pen"ukuran D#en Pen"am$u % Dra& S#ja Siti Fatimah' M&Si
Diuun #leh % Het He tii Ku Kuu uma mani nin" n"t( t(a a )*+, )*+,-, -,+* +*.. I!a Kh#erunniah )*+,/,/*. Ikhla Fathur#hman )*+,*0,1.
2uruan Pen!i!ikan Kimia Fakulta Pen!i!ikan Matematika !an Ilmu Pen"etahuan Alam
UNI3ERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA 4ANDUNG /,*5
0
Tan""al Praktikum % *- Fe6ruari /,*0 2u!ul Praktikum % Penentuan Ka!ar Para7etam#l !an Ka8ein !en"an Men""unakan Met#!e HPLC (High Performance Liquid Chromatography) Chromatography) *& Tujuan 1.1 Dapat memahami cara kerja instrumen HPLC instrumen HPLC 1.2 Dapat melakukan preparasi dengan tepat dan akurat , serta dapat mengikuti
manual pengoperasian HPLC pengoperasian HPLC . 1.3 Dapat menentukan/menghitung menentukan/menghitung kadar parasetamol dan kafein kafein dalam sampel obat. obat. /& Tinj Tinjau auan an Pu Puta taka ka
HPLC (High Performance Performance Liuid Liuid Chromatogra Chromatograph! ph!"" merupakan merupakan tipe kromatogr kromatografi afi elusi !ang paling serbaguna dan digunakan secara luas. #eknih ini digunakan oleh para kimia$an untuk memisahkan dan menentukan spesi%spesi dalam berbagai bahan atau sen! sen!a$a seper seperti ti sen! sen!a$ a$aa
orga organi nik, k, anor anorga gani nik, k, maup maupun un mate materia riall biol biolog ogis is.. Pada Pada
kromatografi cair, fasa gerak merupakan pelarut cair berisi sampel !ang berupa campuran dari bahan%bahan terlarut. &enis%jenis kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC" biasan!a dikelompokkan oleh mekanisme pemisahann!a ataupun jenis fasa diamn!a. Pengelompokkan tersebut diantaran!a' a" b" c" d" e" f"
Partisi Partisi atau romat romatogr ografi afi Cair Cair%Ca %Cair ir )dsorpsi atau kromatografi Padat%Cair Penuk Penukar ar *on *on atau atau romat romatogr ografi afi *on +ie%-clusio +ie%-clusion n Chromatog Chromatograph! raph! (romat (romatografi ografi -ksklu -ksklusi si kuran" kuran" rom romat atog ograf rafii )fin )finit itas as rom romat atog ogra rafi fi ira irall
)da dua cara pengelusian dalam kromatografi cair kinerja tinggi, !aitu elusi isokratis dan elusi gradien. -lusi !ang menggunakan pelarut tunggal dengan komposisi tetap atau campur campuran an beberap beberapaa pelaru pelarutt !nag !nag kompos komposisi isin! n!aa dibuat dibuat tetap tetap disebu disebutt elusi elusi isokra isokratik tik.. +edangkan pada elusi gradien, digunakan dua (atau kadang lebih" pelarut dalam suatu sistem !ang memiliki perbedaan kepolaran !ang besar / signifikan. Perbandingan dari kedua kedua atau lebih lebih pelaru pelarutt ini diaria diariasik sikan an melalu melaluii cara !ang !ang telah telah ditent ditentuka ukan n dengan dengan program saat pemisahan berlangsung. Pengubahan perbandingan ini kadang dilakukan secara terus%menerus dan kadang secara bertahap. -lusi gradien seringkali meningkatkan 1
efisiensi pemisahan, seperti haln!a pemrograman suhu pada 2C. *nstrumen HPLC modern biasan!a dilengkapi dengan katup !an berpotongan sehingga dapat memasukkan cairan dari dua atau lebih reseroir dengan perbandingan !ang dapat diariasikan secara terus menerus. (+koog, 3004' 567%566" Faa "erak
Di dalam kromatografi cair komposisi dari solen atau rasa gerak adalah salah satu dari ariabel !ang mempengaruhi pemisahan. #erdapat ariasi !ang sangat luas pada solen !ang digunakan untuk C#/HPLC, tetapi ada beberapa s ifat umum !ang sangat disukai, !aitu rasa gerak harus ' 1. 8urni, tidak terdapat kontaminan 3. #dak bereaksi dengan $adah (packing" 7. +esuai dengan defektor 4. 8elarutkan sampel 9. 8emiliki isikositas rendah :. ;ila diperlukan, memudahkan
8enghilangkan gas (gelembung udara" dari solen, terutama untuk C#/HPLC !ang menggunakan pompa bolak balik(reciprocating pump" sangat diperlukan terutama bila detektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi. dara !ang terlarut !ang tidak dikeluarkan akan men!ebabkan gangguan !ang besar di dalam detektor sehingga data !ang diperoleh tidak dapat digunakan (the data ma! be useless". 8enghilangkan gas (degassing" juga sangat baik bila menggunakan kolom !ang sangat sensitif terhadap udara (contoh 'kolom berikatan dengan =H3".
3
(-ffend! De Lu Putra, 3004' 6%>"
omponen%komponen alat dalam HPLC diantaran!a ialah' • • • •
• •
?eseroir ($adah pelarut / cairan" Pompa +istem injeksi sampel olom, terdiri dari 1. olom )nalitik / olom tama 3. olom 2uard 7. #ermostat Detektor omputer (Pengolah data"
?eseroir merupakan $adah !ang menampung cairan%cairan !ang akan digunakan dalam pemisahan. Cairan%cairan tersebut berupa pelarut. 8asing%masing reseroir dihubungkan kepada katup berpotongan, dimana katup ini berfungsi untuk mengatur cairan%cairan !ang masuk / dipompa kedalam kolom.
Pelarut dimasukkan ke kolom melalui pipa atau selang menggunakan pompa. Pelarut dipompa dari reseroir sehingga dapat memba$a sampel menuju kolom. Pompa !ang digunkan dalam HPLC hatus memenuhi kriteria sebagai berikut' 1" Harus memiliki aliran terkontrol !ang @reproducibleA
7
3" Harus menghasilkan aliran !ang @pulse%freeA (bebas pulsa, tidak menghasilkan gelembung" 7" Hold%up olume (olume tampungan" kecil (?.P. ;udhiraja, 3004' 163" arena HPLC menggunakan tekanan !ang cukup tinggi, mustahil sampel dapat diinjeksikan dengan cara !ang sama seperti pada kromatografi gas. 8aka dari itu, sampel dimasukkan melalui loop injector. +ampling loop dapat diganti dan tersedia pada olume 0,9 mikroliter sampai 3 mililiter. Pada posisi terisi, sampling loop terisolasi dari fasa gerak dan terbuka terhadap atmosfer. +ebuah s!ringe dengan kapasitas beberapa kali dari loop sampling digunakan untuk menempatkan sampel kedalam loop.
olom !ang paling umum digunakan untuk HPLC dibuat dari stainless steel dengan diameter internal antara 3,1 mm dan 4,: mm dengan panjang mulai dari sekitar 70 mm sampai 700 mm. kolom%kolom ini dipak dengan 7%10 mikrometer partikel%partikel silika berpori !ang dapat berbentuk irregular atau spherical. olom ini berfungsi sebagai tempat pemisahan berlangsung. #erdapat dua masalah !ang men!ebabkan kolom analitik berkurang masa hidupn!a. Pertama, at terlarut !ang mengikat fasa diam secara irreersibel menurunkan performa kolom karena fasa diam !ang tersedia menjadi berkurang. edua, material partikulat !ang diinjeksikan bersama sampel dapat men!umbat kolom analitik. 8aka dari itu, kolom guard ditempatkan sebelum kolom analitik untuk meminimalisasi masalah% masalah tersebut. olom guard biasan!a berisi material partikulat packing dan fasa diam !ang sama dengan kolom analitik, namun jauh lebih pendek dan murah. Panjangn!a 6,9 mm dan hargan!a satu persepuluh dari kolom analitik. Hal ini dikarenakan kolom guard digunakan sebagai Btumbal dan diganti secara berkala.
+elanjutn!a sampel !ang telah terpisahkan diba$a menuju detektor. Detektor ini berfungsi untuk memberikan sin!al sehingga data dapat diolah dan ditampilkan. Detektor% detektor !ang dapat digunakan dalam HPLC diantaran!a' • •
Detektor +pektroskopi (adsorpsi sinar " Detektor elektrokimia
4
+elain itu, ada juga detektor !ang menggunakan pengukuran pada perubahan inde refraksi dari fasa gerak, namun kurang berguna untuk elusi gradien kecuali komponen% komponen fasa gerak memiliki inde refraksi !ang mirip. (Hare! Daid, 3000' 96>%9>9"
Keuntun"an KCKT9HPLC
C# dapat dipandang sebagai pelengkap romatografi 2as (2". Dalam ban!ak hal kedua teknik ini dapat digunakan untuk memperoleh efek pemisahan !ang sama membaikn!a. ;ila deriatisasi diperlukan pada 2, namun pada C# at%at !ang tidak dideriatisasi dapat dianalisis. ntuk at%at !ang labil pada pemanasan atau tidak menguap, C# adalah pilihan utama. =amun demikian bukan berarti C# menggantikan 2, tetapi akan memainkan peranan !ang lebih besar bagi para analis laboratorium. Deriatisasi juga menjadi populer pada C# karena teknik ini dapat digunakan untuk menambah sensitiitas detektor isibel !ang umumn!a digunakan. C# mena$arkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair klasik, antara lain'
Ce$at' Eaktu analisis umumn!a kurang dari1 jam. ;an!ak analisis !ang dapat
diselesaikan sekitar 19%70 menit. ntuk analisis !ang tidak rumit (uncomplicated", $aktu analisis kurang dari 9 menit bisa dicapai Re#lui ' ;erbeda dengan 2, romatografi Cair mempun!ai dua rasa dimana interaksi
selektif dapat terjadi. Pada 2, gas !ang mengalir sedikit berinteraksi dengan at padatF pemisahan terutama dicapai han!a dengan rasa diam. emampuan at padat berinteraksi secara selektif dengan fasa diam dan fasa gerak pada C# memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan !ang diinginkan. Seniti:ita !etekt#r ' Detektor absorbsi !ang biasa digunakan dalam C# dapat
mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10%5 gram" dari bermacam%
macam at.
Detektor%detektor Gluoresensi dan -lektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai
9
picogram(10%13 gram". Detektor%detektor seperti +pektrofotometer 8assa, *ndeks ?efraksi, ?adiometri, dll dapat juga digunakan dalam C# K#l#m (an" !a$at !i"unakan kem6ali ' ;erbeda dengan kolom kromatografi klasik,
kolom C# dapat digunakan kembali (reusable" . ;an!ak analisis !ang bisa dilakukan dengan kolom !ang sma sebelum darijenis sampel !ang diinjeksi, kebersihan dari solen dan jenis solen !ang digunakan *deal untuk at bermolekul besar dan berionik 'at at !ang tidak bisa dianalisis dengan 2 karena olatilitas rendah , biasan!a dideriatisasi untuk menganalisi spsesies ionik. C# dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis at at tersebut. Mu!ah rek#:eri am$el' mumn!a setektor !ang digunakan dalam C# tidak
men!ebabkan destruktif(kerusakan" pada komponen sampel !ang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah
mele$ati
detector.+olenn!a dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukarion memerlukan prosedur khusus. (-ffend! De Lu Putra, 3004' >" #eknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair%cair, !ang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. )nalisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas/area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas/area standar. Pada praktekn!a, pembandingan
kurang
menghasilkan data !ang akurat bila han!a melibatkan satu standar. Ileh karena itu, maka pembandingaan dilakukan dengan menggunakan teknik kura kalibrasi. Parasetamol dan kafein pada umumn!a terdapat bersama sama dalam satu tablet obat
!ang memiliki sifat kepolaran berbeda. 2ugus kromofor !ang dimilikin!a
men!ebabkan sen!a$a ini dapat men!erap sinar . araktersitik sen!a$a ini memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti C%1> dan fasa gerak polar campuran beberapa pelarut. (#im Dosen Praktikum Pemisahan dan Pengukuran, 3019' 1" Paracetamol
:
Paracetamol secara luas digunakan untuk obat !ang diperuntukan sebagai pena$ar rasa sakit, demam(mengurangi temperature". #indakan ini dikenal sebagai analgesik dan antipiretik. Paracetamol murni berbentuk kristal padat !ang meleleh pada suhu 1:6%161 . Da!a larut dalam air dingin adalah 1,47 g/100 cm7, tetapi jauh lebih larut dalam air panas !akni 9 g/100 cm7 dan dalam etanol kelarutann!a 14 g/100 cm 7. (Grank -llis dkk, 3003' 1" afein
)lkaloid !ang mempun!ai lingkar purin (lingkar sen !a$a heterosiklik !ang majemuk, !ang merupakan kondensasi antara lingkar imidaol dan lingkar pirimidin". Dengan rumus molekul C9H10 =4I3 !ang terdapat dalam biji%biji kopi dan daun teh. ristal kafein berbentuk jarum%jarum ber$arna putih, tidak berbau, dan berasa pahit. afein !ang tidak mengandung kristal mencair pada suhu 37>
. afein larut dalam larutan
pirol dan tetrahidrofuran. elarutan kafein dalam air berkurang degan adan!a asam% asam organik. (Damin +umardjo, 3005' 446" )setonitril 8etil +ianida CH7C=, at cair toksik, disediakan dari asetilena dan amonia atau oleh dihidrasi asetamida, digunakan untuk melarutkan sen!a$a organik ataupun anorganik. (Had!ana Pudjaatmaka, 3003' 6:" *sopropil )lkohol 6
Propil )lkohol mempun!ai rumus CH7CH3CH3IH . *sopropil alkohol merupakan isomer propil alkohol dengan rumus (CH7"3CHIH. ;an!ak digunakan untuk membuat min!ak $angi, pelitur dan sebagai pelarut. (Hadiat 8oejadi,dkk, 3004' 165"
>
Alat !an 4ahan Praktikum 2.1 Alat Praktikum Perangkat HPLC • +patula • Labu ukur 90 mL • Labu ukur 10 mL • =eraca analitik terkalibrasi • Corong pendek • Pipet tetes • 2elas kimia 90 mL • ltrasonic ibrator • Pipet kur 1 ml • Pipet kur 3 ml • Pipet kur 7 ml • Pipet kur 4 ml • Pipet kur 9 ml • Pipet kur : ml • ;all Giller • Gilter 8embran +elulosa =itrat • ;otol ial •
1 set 1 buah 1 buah : buah 1 set 1 buah 3 buah 7 buah 1 set 1 buah 1 buah 1 buah 1 buah 1 buah 1 buah 1 buah 1 set 3 buah
2.2 4ahan Praktikum Parasetamol p.a • afein • )setonitril • H3PI4 • *so propil alkohol • 8etanol • +ampel obat ;odre • )uades • )uabides • 8embran P#G-/selulosa nitrat • ertas saring •
39 mg 13,9 mg 70 ml 430 ml 70 ml secukupn!a 4,1 mg secukupn!a secukupn!a buah 1 buah
+& Pr#e!ur Kerja Praktikum 3.1 Pem6uatan 8aa "erak )Pelarut. . +eban!ak 430 mL H 3PI4% 0,01 8, ditambahkan metanol 30 mL, ditambahkan
asetonitril 70 mL, ditambahkan isopropil alkohol 70 mL, disaring menggunakan
5
membran $hatman filter P#G- 0,3 Jm, disonikasi selama 70 menit. (Larutan Gasa 2erak sudah tersedia" 3.2 Pem6uatan larutan in!uk $araetam#l Ditimbang seksama sejumlah 39 mg Parasetamol p.a dan 13,9 mg kafein •
•
•
p.a dimasukkan kedalam labu 90 mL #ambahkan pelarut seban!ak 30 mL, disonikasi selama 19 menit, diencerkan dengan pelarut hingga garis tanda batas.. Hitunglah konsentrasi larutan induk untuk parasetamol dan kafein
3.3 Pem6uatan !eret larutan tan!ar $araetam#l ; ka8ein •
Pipet larutan induk parasetamol dan kafein masing%masing seban!ak 1 F 3 F 7 F 4 F9 dan : mL, masukkan ke dalam labu ukur 10 mL.
•
#ambahkan pelarut(fasa gerak !ang tersedia"hingga tanda batas
•
Lakukan sonikasi selama 9 menit.
•
Dilakukan degassing apabila masih terdapat gelembung dalam larutan
•
*njeksikan ke sistem HPLC dengan olume pen!untikan 30 Jl
•
+elanjutn!a dibuat kura kalibrasi
3.4 Pem6uatan larutan am$el #6at 6#!re< #entukan berat rerata tablet(10 tablet" • 8enimbang 4,1 mg, dimasukkan kedalam labu ukur 10 mL, ditambahkan •
pelarut(auabides" hingga setengah olume labu ukur", disonikasi selama 9 •
• •
menit, -ncerkan dengan pelarut(auabides" hingga garis tanda, dikocok lalu disaring menggunakan kertas saring Dipindahkan ke dalam botol ial emudian proses melakukan pen!aringan kedua menggunakan membran $hatman P#G- 0,3 Jm (filtrat pertama dibuang(digunaakan untuk membilas
•
filter/injektor, kemudian ditampung filtrat selanjutn!a". *njeksikan sampel obat ke dalam HPLC.
3.5 Pen(ia$an Intrumen HPLC K#n!ii Analii $araetam#l !an ka8ein Faa "erak % KH/PO5 ,',* M 5/,mL' /, ml metan#l' +, aet#nitril +, mL i#$r#$il alk#h#l
10
K#l#m )8aa !iam. % C=*1 )*0 7m. Panjan" "el#m6an" % /*0 nm Laju alir % * mL9menit 3#lume injeki % /, >L Pastikan kabel penghubung listrik telah tersambung dengan benar. • #ekan tombol BI= pada sakelar listrik. • *si botol fasa gerak dengan olume !ang memadai dan kosongkan botol •
•
penampung. #ekan tombol BI= pada alat, berturut%turut untuk po$er, detektor dan
•
pompa. Lakukan pemrograman alat dengan computer.*kuti langkahn!a sesuai instruksi
•
dalam komputer. Pilihlah mode !ang akan digunakan sesuai dengan parameter kondisi
•
instrumen. )lirkan fasa gerak. )pabila respon kromatogram tidak muncul lagi, artin!a alat telah
•
menunjukkan base line !ang mendatar, maka instrumen siap digunakan. *njeksikan berturut%turut larutan standar (mulai dari konsentrasi terendah", dan
•
• •
• •
terakhir larutan sampel Cetak hasil pengukuran, catat kondisi percobaann!a. +etelah selesai digunakan, matikan pompa dengan men!oroti tanda pompa dalam computer. #utup file sesuai petunjuk, lalu matikan computer. ntuk mematikan, tekan tombol BIff pada pompa, detector dan po$er secara berurutan. Putuskan sambungan listrik.
3.6 Perhitun"an hail analii Dari hasil operasi instrumen akan diperoleh kura kalibrasi. ;ila kura kalibrasi
diperoleh dengan koefisien regresi K 0,556 anda boleh melanjutkan perhitungan kadar parasetamol dalam sampel. Hitunglah kadarn!a dalam satuan b/b. ;ila tidak diperoleh kura !ang linier, maka lakukan diskusi untuk mencari pen!ebabn!a.
11
Hail !an Analii Data
Ta6el Penim6an"an * Ta6let O6at 4#!re<
=o
;erat +etiap 1 #ablet Ibat ;odre 1. 0,>731 g 3. 0,>970 g 7. 0,>406 g 4. 0,>73: g 9. 0,>790 g :. 0,>719 g 6. 0,>41> g >. 0,>9:> g 5. 0,>731 g 10. 0,>436 g
?ata% 0,>401: g rata
Sam$el O6at
Diduga zat yang
Waktu Retensi 13
Luas
terkandung
(menit)
Area 11!"2
Paracetamol
2.38
88 21%&12
#a$ein
3.%2
8
Deret Stan!ar Para7etam#l
Luas #onsentrasi (''m)
Area 22"21!
Waktu Retensi (menit)
"!
% &23!8
2.38
1!!
" %2!82"
2.38
1"!
3 !
2.38
2!!
2 1!!3!
2.38
2"!
8% 122%1"
2.3
3!!
"!
2.38
;erdasarkan data hasil percobaan, luas area kandungan sampel !ang diduga paracetamol (116093>>", berada pada rentang deret standar paracetamol (100570>:% 133:1990". +ehingga kadar paracetamol dapat dihitung menggunakan persamaan garis ! M 75:4: N 3741>> +ehingga, ! M 75:4: N 3741>> 116093>> M 75:4: N 3741>> 17
116093>> % 3741>>
M
M 3>5,77>1 ppm
75:4:
mg paracetamol M ppm
(L"
M 3>5,77>1 ppm
0,01 L
M 3,>574 mg ;obot sampel
M 4,1 mg
;erat ?ata% rata penimbangan obat bodre M >40,1: mg
adar mg Paracetamol dalam Hasil percobaan 3,>574 mg 4,1 mg l
mg =
>40,1:mg 3,>574 mg >40,1: mg
=
Paracetamol
=
4,1mg 953, 5060 mg/tablet
Deret Stan!ar Ka8ein
#onsentrasi
Luas
(''m)
Area 21%&&1
Waktu Retensi (menit)
2"
% &2"2&!
3.%&
"!
! %2&21
3.%2
"
% 8&8
3.%
1!!
& 1!!33"
3."8
12"
&8 12!
3."
1"!
!
3."%
14
;erdasarkan data hasil percobaan luas area kandungan sampel !ang diduga kafein (31:413>" berada di luar rentang deret standar kafein ( O 31:441:", sehingga kadar kafein dalam sampel dihitung menggunakan perbandingan standar dengan sampel, !aitu konsentrasi dan luas arean!a.
M
Luas )rea +ampel Luas )rea +tandar
+tandarQ. Luas )rea +ampel
+ampelQ
M
+ampelQ
M
+ampelQ
M
34,55:6 ppm
8g kafein
M
ppm
M
34,55:6 ppm
M
0,3900 mg
Luas )rea +tandar 39 ppm. 31:413 31:41:
(L" 0,01 L
adar mg afein dalam Hasil percobaan
19
0,3900 mg
. mg =
4,1 mg l .
>40,1:mg 0,3900 mg . >40,1: mg
=
4,1mg
(afein 91,3357 mg/tablet =
Percobaan kali ini bertujuan untuk menentukan kadar paracetamol dan kafein dalam sampel obat menggunakan instrumen HPLC (High Performance Liuid Chromatograph!". Prinsip dasar HPLC !aitu berdasarkan perbedaan distribusi komponen% komponen dalam sampel di antara dua fase, fase gerak dan fase diam. Gase gerak !ang digunakan berupa campuran sen!a$a H3PI4, methanol, asetonitril, dan isoprop!l alkohol dengan perbandingan 43 ' 3 ' 3 ' 7. +edangkan fase diam !ang digunakan adalah kolom C%1> !ang bersifat non polar. Ileh karena itu percobaan kali ini menggunakan metode HPLC fase terbalik, karena fase gerak !ang digunakan bersifat polar sedangkan fase diamn!a bersifat non polar, dengan sistem elusi isokratik, artin!a selama analisis digunakan fase gerak dengan perbandingan pelarut !ang tetap. Dalam preparasi sampel, sampel ditimbang kemudian dilarutkan menggunakan auabidest. Digunakan auabidest karena dalam analisis menggunakan HPLC diperlukan pelarut dengan kemurnian !ang tinggi, sebab larutan sampel !ang akan dianalisis jumlahn!a sangat sedikit (sekitar 30Rl" sehingga apabila digunakan pelarut dengan kemurnian kurang akan dapat mengganggu hasil pemisahan. +ebelum pengenceran sampel sampai 10 ml, dilakukan sonikasi terlebih dahulu agar semua komponen dalam sampel larut dan homogen. +etelah diencerkan sampai 10 ml secara kuantitatif, larutan sampel disaring seban!ak dua kali. Pen!aringan pertama dilakukan menggunakan kertas saring kasar. Hal tersebut dilakukan karena dalam obat tidak han!a mengandung paracetamol dan kafein, namun terdapat at pen!usun lain !ang belum larut seluruhn!a !ang masih berupa partikel%partikel padat dalam larutan. +elanjutn!a filtrate disaring kembali menggunakan membran selulosa nitrat agar diperoleh larutan sampel murni tanpa ada partikel%partikel pengganggu /pengotor !ang dapat mempengaruhi hasil pemisahan. )pabila langsung dilakukan pen!aringan menggunakan membran selulosa nitrat, dikha$atirkan partikel%partikel !ang tidak larut dalam larutan sampel akan men!umbat pori%pori membran sehingga pen!aringan akan membutuhkan $aktu !ang lama. +ebelum 1:
ditampung, sebagian filtrat dibuang terlebih dahulu !ang dimaksudkan untuk membilas membran agar dapat dipastikan tidak ada at kontaminan dari membran !ang dapat ikut tertampung. )nalisis pada percobaan kali ini adalah analisis kualitatif dan kuantitatif. )nalisis kualitatif dilakukan dengan membandingkan $aktu retensi komponen dalam sampel dengan $aktu reteensi standar. Puncak !ang akan muncul pada kromatogram adalah puncak komponen paracetamol terlebih dahulu. Hal tersebut dapat ditentukan berdasarkan struktur kimia dari masing%masing komponen.
2ambar +truktur Paracetamol
2ambar +truktur afein
Dapat dilihat bah$a paracetamol memiliki gugus hidroksi (%IH" !ang dapat membentuk ikatan hidrogen dengan air sehingga lebih mudah larut dalam air atau sen!a$a polar
16
lainn!a sedangkan kafein memiliki struktur !ang relatif lebih non polar dibandingkan dengan paracetamol sehingga akan tertahan lebih lama di kolom !ang sifatn!a non polar. Pada analisis kuantitatif, dilakukan perhitungan kadar paracetamol dan kafein dalam sampel berdasarkan luas area puncak menggunakan metode kura kalibrasi larutan derat standar !ang dibuat dari pengenceran 1%: ml larutan induk paracetamol 900 ppm dan kafein 390 ppm dalam 10 ml larutan. adar analit dapat ditentukan dengan menghitung konsentrasi analit menggunakan persamaan garis ! M m N b !ang diperoleh dari kura kalibrasi deret standar. =amun, apabila luas area puncak analit tidak masuk dalam area deret standar maka digunakan perbandingan konsentrasi dan luas area deret standar dengan sampel. +ebelum dilakukan pemisahan, instrument HPLC harus dikondisikan pada keadaan optimal agar hasil pemisahan !ang didapatkan baik. emudian baik sampel maupun deret standar, sebelum diinjeksikan ke dalam HPLC perlu dilakukan degassing untuk menghilangkan gelembung udara karena gelembung udara dapat terkumpul di kepala pompa ataupun detektor sehingga akan mengganggu kondisi HPLC. ;erdasarkan data pengamatan, diperoleh kadar paracetamol dan kafein dalam sampel obat masing%masing sebesar 953,5060 mg/tablet dan 91,3357 mg/tablet. Hasil tersebut mendekati data kadar !ang tercantum pada kemasan obat !aitu paracetamol seban!ak :00 mg/tablet dan kafein seban!ak 90 mg/tablet. esalahan%kesalahan !ang mungkin terjadi selama analisis pada percobaan ini di antaran!a, masih terdapat sisa sampel !ang telah ditimbang !ang tidak ikut dilarutkan sehingga kadar !ang diperoleh kurang akurat, masih terdapat gelembung setelah dilakukan penginjeksian, atau pengoperasian instrument !ang kurang tepat sehingga mempengaruhi hasil kromatogram !ang akan didapat.
Keim$ulan
;erdasarkan hasil percobaan !ang telah dilakukan, diperoleh kadar paracetamol dan kafein dalam sampel obat masing%masing sebesar 953,5060 mg/tablet dan 91,3357 mg/tablet. Hasil tersebut mendekati kadar !ang tercantum pada kemasan obat !aitu paracetamol seban!ak :00 mg/tablet dan kafein seban!ak 90 mg/tablet.
1>
Da8tar Putaka
;udhiraja, ?.P. (3004". +eparation Chemistr!. =e$ Delhi' =e$ )ge *nternational (p" Ltd. Daid, Haere!. (3000". 8odern )nal!tical Chemistr!. =e$ Sork' 8c2ra$%Hill De Lu Putra, -ffend!. (3004". romatografi Cair inerja #inggi Dalam ;idang Garmasi &urnal, hlm. 9%>. -llis, Grank dkk. (3003". Paracetamol%a curicullum resource. nited ingdom ' ?o!al +ociet! of Chemistr! 8oejadi, Hadiat. (3004". amus + ains . &akarta ' ;alai Pustaka Pudjaatmaka, Had!ana. (3003". amus imia. &akarta ' ;alai Pustaka +koog, dkk. (3004". Gundamentals of )nal!tical Chemistr!. +)' #homson ;rooks/Cole +umardjo, Damin. (3005". Pengantar imia ;uku Panduan uliah 8ahasis$a edokteran. &akarta ' -2C #im Dosen Praktikum Pemisahan dan Pengukuran. (3019". *nstruksi erja Penentuan adar Parasetamol dan afein dengan #eknik HPLC. ;andung' P*
15
Lam$iran
=o 1.
Lan"kah Kerja ? Ta6el Pen"amatan
Langkah erja
Data Pengamatan %Gasa 2erak +udah
Pembuatan Gasa 2erak Pelarut %diambil 430 mL H3PI4 0,01 8 pada gelas kimia % ditambahkan 8etanol 30 mL % ditambahkan )setonitril 70 mL % ditambahkan *sopropil )lkohol 70 8l % disaring menggunakan membran $hatman filter
disediakan
P#G- 0,3 m % disonifikasi selama 70 menit
Gasa 2erak Pelarut 3.
%Gasa 2erak ' Cairan #idak ;er$arna
Pembuatan Larutan *nduk Paracetamol T afein Paracetamol %Paracetamol ' +erbuk ber$arna putih keruh
% ditimbang seban!ak 39 mg afein
%afein ' +erbuk ber$arna putih keruh
% ditimbang seban!ak 13,9 mg
afein N Paracetamol % keduan!a dimasukkan ke dalam labu ukur 90 mL % ditambahkan pelarut (fasa gerak" % disonifikasi selama N/% 9 menit % diencerkan dengan pelarut (fasa gerak" hingga tanda batas
Larutan *nduk afein N Paracetamol % disonifikasi selama 9 menit % dihitung konsentrasi larutan induk paracetamol T kafein
%Gasa 2erak ' Cairan tidak ber$arna %Disonifikasi agar larutan menjadi homogen %Larutan *nduk Paracetamol N kafein ' #idak ber$arna % onsentrasi Paracetamol ' 900 ppm % onsentrasi afein ' 390 ppm
onsentrasi Larutan *nduk
30
7.
Pembuatan Deret Larutan +tandar afein T Paracetamol Larutan *nduk afein N Paracetamol % dipipet seban!ak 1mlF3mlF7mlF4mlF9mlF:ml % dimasukkan masing%masing ke dalam labu ukur 10 ml % ditambahkan pelarut (fasa gerak" hingga tanda batas % disonifikasi selama 9 menit % didegasing
Deret Larutan +tandar % diinjeksikan larutan sebna!ak 30 % dibuat kura kalibrasi
L
ura alibrasi
31
%disonifikasi agar homogen % didegasing dengan membuka tutup labu ukur,agar gelembung !g ada dapat hilang % deret larutan standar M tidak ber$arna
4.
Pembuatan Larutan +ampel +erbuk #ablet Ibat % ditentukan berat rata%rata tablet obat % ditimbang seban!ak 4 mg % dimasukkan ke dalam ukur 10 mL Labu kur 10 ml % ditambahkan pelarut hingga setengah olume labu ukur % disonifikasi selama 9 menit % ditambahkan pelarut hingga tanda batas % dikocok % disaring menggunakan kertas saring Hasil Giltrat % ditampung dalam botol ial % disaring menggunakan membran selulosa nitrat % dimasukkan ke dalam ukur 10 mL
Hasil Giltrat ke%3 % 1ml filtrat dibuang (digunakan untuk membilas injeksi, botol ial" % 1 ml berikutn!a ditampung % dimasukkan ke dalam ukur 10 mL % siap untuk diinjeksikan
%Ibat ;odre ' +erbuk ;er$arna jingga % Data +ampel Ibat pada kemasan mengandung paracetamol >00 mg dan kafein 90 mg %?ata%rata berat penimbangan sampel obat M 0,>401: g %;erat ertas #imbang M 0,1315 g % Hasil penimbangan ertas #imbang N +ampel Ibat M 0,13:0 g % 8assa Ibat M 0,0041 g/ 0,41 mg % Pelarut M )uabides % Larutan sampel saat penambahan hingga setengah olume labu ukur M ber$arna jingga % Larutan sampel saat ditanda bataskan M tidak ber$arna
%ertas +aring M ;er$arna Putih
+ampel +iap untuk Diinjeksikan %8embran +elulosa =itrat M ;er$arna Putih % olume !g diinjeksikan M 30
33
L
9.
Pen!iapan *nstrumen HPLC ondisi )nalisis Paracetamol T afein Gasa 2erak % H3PI4 0,01 8 430ml % 30 ml metanol % 70 ml asetonitril % 70 ml *so Propil )lkohol olom Gasa Diam % panjang 19 cm % C%1> % panjang gelombang 319 nm % laju alir 1 ml/menit %olume injeksi 30
L
Pre arasi +istem HPLC % dipastikan kabel penghubung listrik telah tersambung dengan benar % ditekan tombol Bon pada sakelar listrik % diisi botol fasa gerak dengan olume !ang memadai dan kosongkan botol penampung % ditekan tombol on pada alat, berturut%turut untuk po$er, detektor dan pompa %dilakukan pemrograman alat dengan komputer, ikuti langkahn!a sesuai instruksi dalam komputer %dipilih mode !g akan digunakan sesuai dengan parameter kondisi instrumen % dialirkan fasa gerak % apabila respon kromatogram tidak muncul lagi, artin!a alat telah menunjukkan base line !ang mendatar, maka instrumen siap digunakan % injeksikan berturut%turut larutan standar (mulai dari konsentrasi rendah" dan terakhir larutan sampel % dicetak hasil pengukuran, catat kondisi percobaann!a % setelah selesai digunakan, dimatikan pompa dengan men!oroti tanda pompa dalam komputer % tutup file sesuai petunjuk, lalu matikan komputer % untuk mematikan, tekan tombol off pada pompa, detector dan po$er secara berurutan %putuskan sambungan listrik
37
)nalisis dilakukan oleh operator dan praktikan
Perhitun"an
Pembuatan Larutan *nduk •
Larutan *nduk
[ Paracetamo l ] [ Kafein ] •
=
=
39 mg 0,09 L
13,9mg 0,09 L
=
=
900 ppm
390 ppm
Larutan Deret +tandar Paracetamol a. 1 ml larutan induk 1 ml . 900 ppm 10 ml . =
1 ml . 900 ppm =
10 ml
=
90 ppm
=
100 ppm
b. 3 ml larutan induk 3 ml . 900 ppm 10 ml . =
=
3 ml . 900 ppm 10 ml
c. 7 ml larutan induk 7 ml . 900 ppm 10 ml . =
7 ml . 900 ppm =
10 ml
=
190 ppm
=
300 ppm
=
390 ppm
=
700 ppm
d. 4 ml larutan induk 4 ml . 900 ppm 10 ml . =
=
4 ml . 900 ppm 10 ml
e. 9 ml larutan induk 9 ml . 900 ppm 10 ml . =
9 ml . 900 ppm =
10 ml
f. : ml larutan induk : ml . 900 ppm 10 ml . =
•
=
: ml . 900 ppm 10 ml
Larutan Deret +tandar afein a. 1 ml larutan induk
34
1 ml . 390 ppm 10 ml . =
=
1 ml . 390 ppm 10 ml
=
39 ppm
b. 3 ml larutan induk 3 ml . 390 ppm 10 ml . =
3 ml . 390 ppm =
10 ml
=
90 ppm
=
69 ppm
c. 7 ml larutan induk 7 ml . 390 ppm 10 ml . =
7 ml . 390 ppm =
10 ml
d. 4 ml larutan induk 4 ml . 390 ppm 10 ml . =
4 ml . 390 ppm =
10 ml
=
100 ppm
=
139 ppm
=
190 ppm
e. 9 ml larutan induk 9 ml . 390 ppm 10 ml . =
=
9 ml . 390 ppm 10 ml
f. : ml larutan induk : ml . 390 ppm 10 ml . =
: ml . 390 ppm =
10 ml
39
Lampiran Goto +elana Praktikum
1. )lat !ang dibutuhkan selama praktikum
9. *nstrumen HPLC tampak samping
3. Pelarut/ Gasa 2erak
:. Penimbangan +ampel untuk membuat larutan *nduk dan Larutan sampel
6. +ampel Ibat ;odre
7. Pelarut/ )uabides
>. Data pnimbangan 10 tablet obat bodre 4. *nstrumen HPLC 3:
13. Proses +onifikasi pada ltrasonic ibrator
5. Penambahan pelarut(auabides/ fasa gerak"untuk membuat larutan induk, larutan sampel
10. Hasil pembuatan deret larutan standar 1 mLF3 mLF 7 mLF4 mL F 9 mL F : mL
17. Larutan +ampel Ibat
11. Hail penambahan pelarut (auabides" pada sampel obat, hingga setengah olume ukuran labu ukur 14. Pen!aringan +ampel Ibat menggunakan kertas saring
36
1>. Penginkjeksian Deret larutan standar/ Larutan sampel
15. Deret Larutan +tandar/ Larutan sampel siap diinjeksikan, sudah tidak terdapat gelembung dalam s!ringe.
19. Hasil Pen!aringan menggunakan kertas saring
1:. Pen!aringan kedua menggunakan membran selulosa nitrat
30. Proses Penginjeksian
16. Hasil pen!aringan menggunakan membran selusosa nitrat
31. Hasil Pemisahan ditunjukan dalam bentuk kromatogram dalam komputer
3>
