unud-1082-185877572-isi tesis wenni s. lestari - 1192261002-1.pdf

1

BAB I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang  Adiantum (Indonesia:

suplir; Inggris:

maidenhair fern)

merupakan salah satu

marga tumbuhan paku anggota suku Pteridaceae yang cukup menguntungkan secara komersial karena banyak dimanfaatkan sebagai tanaman hias dengan berbagai variasi morfologi dan hasil silangan. Jumlah jenis  Adiantum di seluruh dunia diperkirakan mencapai sekitar 280 jenis (Patil et al., 2013) dan 10-20 jenis diantaranya berada di Asia Tenggara Te nggara (Afriastini, 2003). Penelitian mengenai  Adiantum di Indonesia masih terbatas sehingga publikasi mengenai marga ini belum banyak tersedia dan jumlah jenisnya di Indonesia belum dapat dipastikan. Informasi keberadaan dan penyebaran jenis-jenis  Adiantum

di Indonesia hingga kini masih sebatas data koleksi spesimen

2

penelitian biologi lanjutan, serta penting dalam studi genetika, studi evolusi, studi perbandingan, kawin silang maupun klasifikasi ulang (Soltis and Soltis, 2000). Hubungan kekerabatan organisme dapat direkonstruksi berdasarkan karakter morfologi, namun dengan berkembangnya teknik molekuler penggunaan karakter genetik menjadi pilihan utama. Sifatnya yang obyektif dan stabil membuat karakter genetik lebih dapat diandalkan dalam studi sistematika. Penggunaan karakter genetik juga menguntungkan karena tetap dapat mendeteksi variasi walau tidak terekspresi menjadi perbedaan morfologi. Variasi genetik tersebut penting untuk meningkatkan keanekaragaman yang mampu memperbesar peluang keberhasilan bertahan hidup di tengah perubahan kondisi lingkungan. Saat ini DNA kloroplas adalah sumber data yang paling umum digunakan dalam analisis hubungan kekerabatan tumbuhan secara molekuler (Small 2004). Salah satu daerah pada DNA kloroplas yaitu pengkode yang paling banyak disimpan dalam

rbcL

GenBank.

et al.,

merupakan plastid

Gen

rbcL

dianggap

3

memenuhi kualitas yang dibutuhkan untuk membentuk barkode yang kuat bagi identifikasi jenis pada tumbuhan paku (de Groot et al., 2011).

1.2 Rumusan Masalah

Bagaimanakah keanekaragaman dan hubungan kekerabatan marga  Adiantum dari Kepulauan Sunda Kecil berdasarkan variasi sekuen pada DNA kloroplas (rbcL dan trnL-F )? )?

1.3 Tujuan Penelitian

a. Mengetahui keanekaragaman marga  Adiantum  dari Kepulauan Sunda Kecil berdasarkan variasi sekuen pada DNA kloroplas (rbcL dan trnL-F ). ). b. Merekonstruksi hubungan kekerabatan pada marga  Adiantum dari Kepulauan Sunda Kecil.

4

BAB II. KAJIAN PUSTAKA

2.1 Marga Adiantum  Adiantum  merupakan

salah satu marga tumbuhan paku yang cukup dikenal.

Bentuk daunnya beraneka ragam dan penampilannya menarik sehingga banyak  jenis  Adiantum yang digunakan sebagai tanaman hias (Gambar 2.1). Beberapa  jenis diantaranya  juga dapat dimanfaatkan sebagai sayur dan dalam bidang kesehatan karena kandungan bahan aktifnya (Afriastini, 2003; Perwati , 2009).

5

berarti “seperti rambut”. Daunnya yang tumbuh menjuntai dianggap mirip dengan helaian rambut (hair ) seorang gadis (maiden) sehingga dalam bahasa Inggris  Adiantum  disebut

sebagai

maidenhair fern  (Yeow-Chin,

1984). Pendapat yang

lain menyatakan jenis ini dinamakan demikian karena tangkai daunnya yang hitam mengkilat seperti rambut. Nama ilmiahnya yaitu  Adiantum, berasal dari bahasa Yunani  Adiantos  yang berarti “anti air”, mengacu pada

entalnya

yang

mampu meloloskan air tanpa membuatnya basah (Hoshizaki, 1970). Jenis tipe dari marga ini adalah  Adiantum

capillus-veneris

(Bouma, 2008) dan pertama kali

dideskripsikan oleh Linnaeus (1753).  Adiantum  dapat

dikenali melalui beberapa ciri, antara lain tangkai daunnya

hitam mengkilat, tulang daunnya tidak nyata dan adanya

indusium semu

yang

melindungi sporangium di permukaan bagian bawah helaian daunnya (Hoshizaki, 1970).  Indusium

semu

pada  Adiantum  merupakan pelebaran tepi daun yang

melekuk ke bawah dan bukan berupa selaput pelindung sejati seperti halnya pada

6

2.2 Klasifikasi Marga  Adiantum

Marga

 Adiantum

sempat digolongkan ke dalam beberapa suku yaitu

Adiantaceae, Parkeriaceae dan Polypodiaceae (Afriastini, 2003), sebelum akhirnya ditetapkan sebagai anggota dari suku Pteridaceae bersama marga lainnya yang juga tidak memiliki

indusium sejati

(Smith et al., 2006; Christenhusz

et al.,

2011). Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa marga ini membutuhkan revisi taksonomi yang lebih seksama karena tumbuhan paku Vittarioid ( Ananthacorus,  Anetium,  Antrophyum,  Haplopteris,  Hecistopteris,  Monogramma, Polytaenium,  Radiovittaria,  Rheopteris, Scoliosorus  Adiantum dan al.,

dan

Vittaria)

bersarang dalam marga

diperlakukan sebagai satu Subfamily Vittarioideae (Schuettpelz

2007; Schuettpelz and Pryer, 2007; Bouma, 2008; Christenhusz

Studi terkini menggunakan kombinasi tiga penanda ( atpA, penanda (atpA,  atpB,  rbcL,  trnL-F ,  rps4-trnS ) (Lu penanda (atpA

atpB rbcL atp1   nad5 gapCp)

et al., 2011).

atpB, rbcL)

et al.,

et

dan lima

2012) serta enam

(Rothfels and Schuettpelz, 2013)

7

marga  Adiantum (Lellinger and Prado, 2001; Afriastini, 2003; Korpelainen

et al.,

2005; Bouma, 2008) karena kebanyakan masih berdasar pada studi yang bersifat regional (Lu et al., 2012).

2.3 Keanekaragaman Marga  Adiantum  Adiantum

merupakan paku homospor yang tersebar luas terutama di daerah

tropis dan subtropis (Korpelainen et al., 2005). Jumlah  Adiantum di seluruh dunia diperkirakan berkisar antara 150-200 jenis (Afriastini, 2003), bahkan mungkin mencapai 280 jenis (Patil  Adiantum yang

et al.,

2013) mengingat hingga kini masih banyak

dipublikasikan sebagai jenis baru (Sundue

et al.,

2010; McCarthy

and Hickey, 2011; Prado and Hirai, 2013). Angka tersebut belum termasuk hasil silangannya yang jumlahnya diperkirakan mencapai lebih dari puluhan karena banyak jenis  Adiantum yang dibudidayakan secara luas sebagai tanaman hias dalam dan luar ruangan (Rukmana, 1997).

8

Thailand (Boonkerd and Pollawatn, 2013). Dua puluh jenis dan dua varietas ditemukan di India (Patil

et al.,

2013). Delapan jenis terdapat di Jepang, satu

diantaranya merupakan jenis endemik yaitu  A. ogasawarense Tagawa (Iwatsuki et al.,

1995). Tiga puluh empat jenis dan lima varietas ditemukan di Cina, 16 jenis

diantaranya endemik (Zhang

et al.,

2013). Jumlah jenis  Adiantum di Indonesia

sendiri belum dipastikan.  Adiantum  Adiantum

bukan merupakan tumbuhan langka, namun beberapa jenis

tercatat memiliki status konservasi khusus.  Adiantum lianxianense dari

Cina tercatat sebagai jenis yang extinct di data IUCN tahun 2013. Data yang sama menyebutkan  A. fengianum dan  A. sinicum yang juga berasal dari Cina memiliki status konservasi

endangered ,

sedangkan 

A. capillus-veneris

yang memiliki

persebaran luas dan melimpah tercatat sebagai least concern (IUCN, 2013). Beberapa jenis  Adiantum  dilaporkan sebagai jenis kompleks (Mehra and Khullar, 1977; Parris, 1980; Paris and Windham, 1988; Large and Braggins, 1993;

9

dipastikan (Primack dkk., 1998). Selain konservasi, kepastian identitas tumbuhan  juga dibutuhkan dalam upaya pemanfaatan berkelanjutan dari sumber daya genetik suatu tanaman (Arif et al., 2010). Program pemuliaan yang memanfaatkan plasma nutfah untuk memperbaiki sifat-sifat dari kultivar terpilih harus didasarkan pada determinasi yang akurat sehingga penentuan individu tanaman sebagai bahan dalam perbaikan genetik dapat dilakukan dengan tepat (Karsinah dkk., 2002). Poliploidi yang kerap terjadi pada jenis kompleks juga dialami oleh 56,596,7% marga  Adiantum (Bidin, 1983; Perwati, 2002). Tumbuhan paku memang menunjukkan frekuensi jenis poliploid yang tinggi (95%) dan berpotensi menimbulkan bentuk morfologi yang baru hingga mengakibatkan terjadinya 31% spesiasi (Quintanilla and Escudero, 2006; Peredo

et al.,

2011; Chao et al., 2012).

Poliploidi ini diperlukan untuk menurunkan tekanan akibat meningkatkan heterozigositas (Peredo et al., 2011).

inbreeding 

serta

10

Bali, Lombok, Sumbawa, Flores, Seram, Maluku, Halmahera, Sumba, Timor dan Papua (Data Spesimen Koleksi Herbarium Bogoriense, Juni 2012). Keberadaannya yang tersebar di banyak pulau membuat studi mengenai marga  Adiantum menjadi

lebih rumit dan membutuhkan waktu. Kepulauan Sunda Kecil

yang meliputi kawasan Bali dan Nusa Tenggara merupakan salah satu kawasan yang belum banyak terungkap keanekaragaman floranya, yang dikuatkan dengan belum banyaknya data-data flora dari daerah ini (Sulistiarini, 2000). Studi mengenai flora yang dilakukan di Kepulauan Sunda Kecil memang belum sebanyak yang telah dilakukan di daerah lain di kawasan Malesia (Kurniawan al.,

et

2013). Daerah dengan pulau-pulau kecil yang terletak di bagian timur ini

cukup berbeda dengan daerah lain yang ada di Indonesia, iklimnya lebih kering dan terpengaruh musim sehingga menghasilkan flora maupun fauna yang khas (de Lang, 2011). Sebagian dari kawasan Kepulauan Sunda Kecil juga masuk ke dalam kawasan Wallacea yang dikenal memiliki tipe flora yang unik dengan tingkat

11

soboliferum

Wall. dan  A.

tinctum

Moore. Spesimen herbarium dari jenis-jenis

tersebut disimpan sebagai koleksi dari Herbarium Bogoriense. Informasi mengenai keberadaan jenis-jenis  Adiantum di Kepulauan Sunda Kecil juga dapat diperoleh dari Data Registrasi Tanaman Koleksi UPT Balai Konservasi Tumbuhan Kebun Raya “Eka Karya” Bali – LIPI (Juli, 2012). Beberapa jenis

 Adiantum

asal Kepulauan Sunda Kecil yang telah dikoleksi

maupun yang masih berada dalam tahap aklimatisasi di Kebun Raya Bali antara lain  A.

caudatum

L.,  A.

concinnum

Hook.,  A.

Humb. & Bonpl. ex Willd.,  A.

Blume,  A.

edgeworthii

 philippense

L.,  A. raddianum C. Presl.,  A. silvaticum Tindale dan  A. trapeziforme

hispidulum

Sw.,  A.

diaphanum

peruvianum  Klotzsch,  A.

L. Beberapa koleksi lainnya belum teridentifikasi.

2.5 Penanda Molekuler

Penanda (marker ) merupakan suatu karakter yang digunakan untuk melacak

12

Kemiripan morfologi seperti yang terjadi pada jenis kompleks juga menjadi penyebab sulitnya membedakan satu jenis dengan jenis yang lain secara pasti karena adanya ciri-ciri yang mirip, seperti yang dialami oleh beberapa jenis  Adiantum

(Mehra and Khullar, 1977; Paris and Windham, 1988; Large and

Braggins, 1993; Rojas-Alvarado, 2008). Perbedaan antara satu jenis tumbuhan dengan jenis tumbuhan lainnya juga kadang terletak pada materi genetik tumbuhan tersebut yaitu DNA (Semagn et al., 2006). Perbedaan yang terdapat pada rangkaian DNA ini dapat digunakan untuk membedakan jenis yang secara morfologi terlihat hampir sama (Primack dkk., 1998). Variasi genetik tersebut dapat diketahui melalui analisis molekuler yang terdiri dari berbagai penanda molekuler DNA, sehingga dapat memberikan gambaran yang jelas mengenai tingkatan variasi genetik pada jenis atau populasi tanpa adanya pengaruh langsung dari faktor lingkungan (Mondini et al., 2009). Penanda molekuler merupakan fragmen sekuen DNA yang berhubungan

13

membedakan polimorfisme yang tidak menghasilkan variasi yang nampak secara fenotip dan tidak dipengaruhi langsung oleh lingkungan (Mondini et al., 2009). Penanda molekuler telah banyak ditemukan, misalnya SSRs ( Simple Sequence  Repeats)

atau mikrosatelit, AFLP ( Amplified

RAPD ( Random

Fragment Lenght Polymorphism),

Amplified Polymorphic DNA)

dan masih banyak lagi, namun

belum ada yang dapat memenuhi semua keinginan peneliti. Penanda yang dipilih biasanya tergantung pada tujuan yang ingin dicapai. Masing-masing memiliki kelebihan serta kekurangan dan hasil analisis akan dipengaruhi oleh teknik yang digunakan. Idealnya, suatu penanda molekuler harus mudah diaplikasikan pada berbagai organisme, membutuhkan sedikit sampel jaringan atau DNA serta memiliki cara kerja yang sederhana, murah dan cepat pelaksanaannya. Penilaian yang dilakukan juga tidak membingungkan ataupun mudah berubah, profil genetik yang dihasilkan harus dapat dipercaya dan dapat diulang, bersifat kodominan serta menghasilkan polimorfisme yang tinggi agar kromosom yang

14

karakter genetik ini menjadi pilihan utama dalam studi sistematika karena menghasilkan lebih sedikit

homoplasi  dibandingkan

dengan karakter morfologi,

merupakan indikator yang lebih nyata untuk filogeni serta menyediakan lebih banyak karakter yang obyektif (Pryer et al., 1995). Penanda molekuler yang telah digunakan dalam beberapa penelitian pada marga

 Adiantum

antara lain ISSR ( Inter-Simple

Sequence Repeat ).

ISSR

merupakan suatu teknik yang melibatkan penggunaan sekuen mikrosatelit (bisa di/tri/tetra/penta-nukleotida, dengan panjang antara 16 bp – 25 bp) sebagai  primer  dalam reaksi PCR (Polymerase Chain Reaction) untuk mengamplifikasi bagian di antara sekuen mikrosatelit yang berulang tersebut. ISSR merupakan metode sederhana dan cepat yang menggabungkan kelebihan-kelebihan yang dimiliki metode SSRs (Simple Polymorphism)

Sequence Repeats),

dan RAPD ( Random

AFLP ( Amplified

Fragment Lenght

Amplified Polymorphic DNA).

ISSR

merupakan penanda dominan yang menunjukkan polimorfisme yang tinggi dan

15

Penanda molekuler lain yang juga telah diaplikasikan pada marga  Adiantum adalah RAPD ( Random

Amplified Polimorphic DNA).

menggunakan  primer   dengan panjang 10 bp pada suhu (Semagn

et al.,

2006).

Primer  

RAPD umumnya

annealing

34 - 37°C

ini mendeteksi polimorfisme dari ketiadaan

informasi sekuen nukleotida tertentu. RAPD merupakan penanda yang bersifat dominan sehingga tidak bisa membedakan segmen DNA yang diamplifikasi bersifat heterozigot atau homozigot (Arif et al., 2010). RAPD telah digunakan untuk mengetahui variasi genetik pada jenis langka  Adiantum reniforme

var. sinense yang berasal dari empat populasi di Cina. Hasil

analisis menunjukkan bahwa  A.

reniforme

var.

sinense

memiliki aliran gen yang

tinggi dan keanekaragaman genetik yang rendah sehingga keempat populasi tersebut diduga berasal dari satu populasi utuh yang mengalami perpecahan menjadi empat populasi yang berdiri sendiri dan tidak saling berhubungan akibat aktivitas manusia. Dendrogram menunjukkan individu dari populasi yang berbeda

16

DNA merupakan urutan basa nukleotida A ( Adenine), G (Guanine), C (Cytosine) dan T (Thymine) yang terdapat pada DNA molekul target. Saat ini, teknik terminator sequencing

dye-

merupakan metode standar dalam analisis sekuen DNA.

 Dye-terminator sequencing nucleotide triphosphates)

menggunakan pelabelan rantai ddNTPs (dideoxy

yang menyebabkan sekuen terjadi pada satu reaksi,

bukan pada empat reaksi seperti pada metode pelabelan  primer   sebelumnya. Keempat rantai ddNTPs pada dye-terminator sequencing dilabel dengan pewarna fluoresen, masing-masing dengan panjang gelombang pancaran yang berbeda (Arif et al., 2010). Keuntungan utama dari sekuensing DNA ini adalah kekuatan dan ketelitiannya yang mencapai lebih dari 98%, namun teknik ini juga memiliki kekurangan antara lain ketidakmampuannya untuk mengatasi rangkaian nukleotida yang panjang (lebih dari 900 nukleotida pada fragmen DNA dalam satu reaksi) (Arif

et al.,

2010). Sekuen DNA dapat digunakan dalam berbagai

17

region

(SSC) 21.392 bp dan inverted repeats (IR) 23.447 bp (Gambar 2.2) (Wolf

et al., 2003).

18

restriksi maupun analisis sekuen DNA (Small

et al.,

2004). DNA kloroplas

merupakan molekul DNA sirkular yang ditemukan pada kloroplas tanaman (Frankham

et al.,

2010), bersifat stabil secara struktur, haploid, non-rekombinan

dan pada sebagian besar tumbuhan diwariskan dari induk betina (Small

et al.,

2004). DNA kloroplas juga dapat dimanfaatkan untuk studi populasi tanaman, deteksi hibridisasi, analisis keanekaragaman genetik maupun filogeografi populasi tanaman (Mondini et al., 2009). Sekuen DNA kloroplas banyak digunakan untuk mengetahui hubungan kekerabatan antar jenis pada Angiospermae dan tumbuhan lainnya, namun lambatnya laju evolusi pada molekul ini merupakan kekurangan untuk mengetahui hubungan kekerabatan di dalam jenis (Taberlet et al., 1991). Pemanfaatan DNA kloroplas dalam analisis molekuler terbukti cukup kuat pada tingkat suku melalui penggunaan sekuen daerah pengkode misalnya

rbcL

(the rubisco large subunit ) (Arif et al., 2010). rbcL berukuran lebih dari 1.400 bp (Avise, 2001) dan merupakan gen pengkode sub unit besar dari

ribulose 1,5-

19

untuk diperoleh. Bagian dari genom kloroplas ini mengalami evolusi yang cukup cepat dibandingkan dengan gen lainnya (de Groot

et al.,

kelompok tumbuhan tertentu pemanfaatan

sebagai penanda akan

matK

2011) dan pada

membutuhkan desain sekuen primer  khusus (Soltis and Soltis, 1998). Gen

rbcL

merupakan plastid pengkode yang paling banyak disimpan dalam

GenBank . Penggunaan rbcL

dianggap telah mewakili seluruh kelompok tumbuhan

utama secara luas sehingga dapat digunakan sebagai dasar perbandingan yang baik dengan gen plastid lainnya (Newmaster

et al.,

2006). Data sekuen

rbcL

banyak digunakan untuk tingkatan taksonomi yang lebih tinggi (suku ke atas) (Soltis and Soltis, 1998), namun pada tumbuhan paku sekuen diaplikasikan hingga tingkat marga dan jenis karena

rbcL

rbcL

telah

dianggap memiliki

variasi yang cukup untuk dapat digunakan dalam membedakan antar jenis (Wolf, 1995; Newmaster

et al.,

2006). Sekuen

rbcL

 juga umum digunakan untuk

mengetahui hubungan antar marga bahkan antar jenis pada tumbuhan paku (Soltis

20

Gambar 2.3 Bagian-Bagian pada Daerah  trnL-F

Keterangan : Daerah trnL-F  yang terbentang dari trnL (UAA) 5’ ekson hingga trnF (GAA) dan dua daerah non-pengkode diantaranya (intron dan intergenic spacer ( IGS )) serta primer universal yang digunakan untuk mengamplifikasi daerah tersebut (c-f) (Taberlet et al., 1991). Daerah non-pengkode tersebut merupakan daerah yang menunjukkan frekuensi mutasi paling tinggi dan mudah diamplifikasi maupun disekuen secara

21

membentuk barkode yang kuat bagi identifikasi jenis pada tumbuhan paku (de Groot et al., 2011). Lima daerah DNA kloroplas yaitu

atpA, atpB, rbcL, trnL-F

serta

rps4-trnS 

telah digunakan dalam analisis hubungan filogenetik berbagai jenis  Adiantum yang berasal dari Cina. Penelitian ini juga memanfaatkan data sekuen jenis-jenis  Adiantum

dari kawasan lain yang diperoleh dari

GenBank .

penelitian tersebut menunjukkan bahwa

 Adiantum

mengalami evolusi konvergen pada bentuk

entalnya.

Hasil analisis pada

terbukti monofiletik dan

Dari penelitian tersebut juga

diketahui bahwa semua jenis  Adiantum dari daerah beriklim sedang (Asia, Eropa dan Amerika Utara) membentuk satu klad yang bersarang di dalam

grade

pantropikal, mengindikasikan bahwa  Adiantum  berasal dari daerah tropis (Lu al., 2012).

et

22

BAB III. KERANGKA BERPIKIR DAN KONSEP PENELITIAN

3.1 Kerangka Berpikir  Adiantum

(suplir), salah satu marga tumbuhan paku dari suku Pteridaceae

diketahui memiliki banyak potensi, namun di Indonesia belum banyak diteliti sehingga informasi mengenai marga ini masih terbatas. Kawasan Kepulauan Sunda Kecil (Bali dan Nusa Tenggara) dipilih sebagai langkah awal dalam melakukan studi mengenai marga  Adiantum di Indonesia berdasar pada publikasi Posthumus (1944) mengenai jenis-jenis  Adiantum yang ditemukan di daerah tersebut. Karakter genetik khususnya urutan basa nukleotida pada daerah gen dan

trnL-F

rbcL

yang dapat diketahui dengan cara menguraikan sekuen DNA-nya,

digunakan untuk mengungkap keanekaragaman genetik dan hubungan kekerabatannya.

23

 Adiantum (Pteridaceae)

Indonesia : penelitian terbatas, publikasi kurang, informasi belum tersedia. Langkah awal studi : Kepulauan Sunda Kecil (Bali dan Nusa Tenggara) Karakter genetik : sekuens rbcL dan trnL-F  1. Keanekaragaman 2. Hubungan kekerabatan Gambar 3.1 Kerangka Berpikir dalam Penelitian Ini

3.2 Konsep Penelitian

24

KOLEKSI SAMPEL :

Pengambilan sampel dari tanaman koleksi yang ada di UPT BKT Kebun Raya ”Eka Karya” Bali – LIPI berupa : 1. Jenis-jenis Adiantum asal : Bali, Lombok, Sumbawa, Sumba, Timor, Jawa 2. Kerabat dekat Adiantum (Vittaria dan  Antrophyum) asal Bali, Lombok, Sumbawa, Jawa, Seram Hasil : Daun muda.

ANALISIS MOLEKULER : Ekstraksi DNA Hasil : cpDNA, nDNA, mt DNA Elektroforesis 1 Hasil : Pita-pita total DNA Amplifikasi DNA (PCR) Hasil : Gen rbcL dan trnL-F Elektroforesis 2 Hasil : Pita-pita gen rbcL dan trnL-F Pemurnian Produk PCR Hasil : Gen rbcL dan trnL-F

Cycle Sequencing Hasil : A T G C Sekuensing DNA Hasil : Kromatogram Gambar 3.2 Konsep Penelitian

ANALISIS FILOGENETIK : Analisis Filogenetik Hasil : Kladogram

25

BAB IV. METODE PENELITIAN

4.1 Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan pada bulan Agustus 2012 hingga April 2013. Jenis-jenis  Adiantum

dan kerabat dekatnya yang digunakan sebagai sampel (Lampiran 1)

merupakan koleksi UPT Balai Konservasi Tumbuhan Kebun Raya ”Eka Karya” Bali – LIPI, Candikuning, Baturiti, Tabanan, Bali yang berasal dari Kepulauan Sunda Kecil (Pulau Bali, Lombok, Sumbawa, Sumba dan Timor), Jawa dan Seram (Lampiran 2). Sampel dibuat herbariumnya dan spesimen herbarium disimpan di The Hortus Botanicus Baliense (THBB), UPT Balai Konservasi Tumbuhan Kebun Raya ”Eka Karya” Bali – LIPI. Identifikasi dilakukan dengan membandingkan spesimen sampel dengan spesimen herbarium yang merupakan koleksi Herbarium Bogoriense, Pusat

26

(Pulau Bali, Lombok, Sumbawa, Sumba dan Timor) pada gen

rbcL

dan

trnL-F

(daerah dari trnL (UAA) 5’ ekson hingga trnF (GAA)).

4.3 Penentuan Sumber Data

Sampel berupa daun muda yang telah terbuka sepenuhnya. Sampel bersumber dari tanaman koleksi UPT Balai Konservasi Tumbuhan Kebun Raya ”Eka Karya” Bali – LIPI, yaitu jenis-jenis  Adiantum yang berasal dari beberapa lokasi di Kepulauan Sunda Kecil (Pulau Bali, Lombok, Sumbawa, Sumba dan Timor) dan Pulau Jawa, serta tumbuhan paku jenis lain yang masih berkerabat dekat dengan  Adiantum  yaitu Vittaria

dan  Antrophyum dari Pulau Bali, Lombok, Sumbawa,

Jawa dan Seram yang digunakan sebagai outgroup (Lampiran 3.).

4.4 Variabel Penelitian

Variabel bebas berupa jenis-jenis

 Adiantum

dan kerabat dekatnya yaitu

27

kloroform (CHCl3), isoamylalkohol (C5H12O), isopropanol ((CH3)2CHOH), TE buffer

(Lampiran 4.),

sodium acetate (NaOAc3.H2O),

agarose gel, ethidium bromide

(Wako, Osaka, Jepang),

TAE

buffer

(C21H20BrN3), 6x Loading

distilled deionized water ,

(Lampiran 4.),

Buffer Triple Dye

фX174 DNA-HaeIII Digest

(TaKaRa Bio, Shiga, Jepang), DNeasy� Plant  Mini Kit   (Qiagen, Tokyo, Jepang), PCR Kit (TaKaRa Bio, Shiga, Jepang),  primer (rbcL aF, rbcL cR, trnL-F   cF dan trnL-F   fR)

(Fasmac, Kanagawa, Jepang), ExoSAP-IT ®  PCR

Product Cleanup

(Affymetrix, Cleveland, Ohio, USA), BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit

(Applied Biosystems, Foster City, California, USA),

sodium hydroxide

(NaOH), formamide (CH3NO) dan es.

4.6 Instrumen Penelitian

Instrumen penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah perlengkapan

28

4.7 Prosedur Penelitian

Spesimen

Daun muda

Daun dewasa

Ekstraksi DNA

Herbarium

Elektroforesis 1 Amplifikasi DNA (PCR) Elektroforesis 2 Pemurnian produk PCR Cycle Sequencing

Sekuensing DNA Analisis filogenetik

29

daun bisa ditampilkan. Kertas koran ditutup dan ditumpuk menjadi satu. Bagian atas dan bawah tumpukan koran berisi spesimen diberi kertas karton, lalu dijepit pada sasak di kedua sisinya dan diikat dengan tali. Spesimen selanjutnya dikeringkan menggunakan oven bersuhu 33 °C selama 5-7 x 24  jam. Spesimen yang telah kering disusun di atas

mounting paper .

Bagian

tangkai daun direkatkan pada kertas dengan cara diikat dan data spesimen ditempel di sebelah kanan bawah kertas (Gambar 4.1).

30

4.7.2 Identifikasi Spesimen

Spesimen diidentifikasi dengan menggunakan literatur (Holttum, 1968; Piggott, 1996; Jones, 1998; Hoshizaki and Moran, 2002; Matsumoto

et al.,

2008) dan membandingkan spesimen dengan koleksi herbarium.

4.7.3 Koleksi Sampel untuk Analisis Molekuler

Daun muda dari masing-masing sampel diambil, disimpan dalam kantong teh dan ditempatkan dalam plastik kedap udara yang telah diberi

silica gel

untuk keperluan ekstraksi DNA.

4.7.4 Ekstraksi DNA

4.7.4.1 Ekstraksi DNA dengan CTAB Ekstraksi DNA sampel dilakukan menggunakan metode CTAB (Doyle and Doyle, 1987) yang dimodifikasi. Sampel daun yang telah kering (30-50

31

dengan 800 µl campuran kloroform : isoamylalkohol (24 : 1) dan dihomogenkan menggunakan rotor pada kecepatan 80% selama 10 menit. Sampel selanjutnya disentrifugasi (13.000 rpm, 25ºC, 10 menit). Supernatan yang terbentuk diambil sebanyak 700 µl dan dipindahkan ke tabung mikro 2 ml yang baru tanpa mengenai lapisan tengah larutan sampel. Sampel ditambahkan kembali dengan 800 µl campuran kloroform : isoamylalkohol (24 : 1) dan disentrifugasi (13.000 rpm, 25ºC, 10 menit) lagi. Supernatan yang terbentuk diambil sebanyak 500 µl dan dipindahkan ke tabung mikro 2 ml yang baru, kemudian ditambah dengan isopropanol ( ⅔ volume). Sampel dibolak-balik dengan tangan dan selanjutnya diinkubasi (4ºC,

18 jam). Setelah inkubasi, sampel disentrifugasi (13.000 rpm, 4ºC, 10 menit) hingga pelet DNA dapat terlihat menempel di bagian dasar tabung mikro. Cairan pada tabung mikro dibuang dan tabung mikro dibalik di atas kertas tissue untuk membuang cairan yang tersisa.

32

ethanol  70%

dan disentrifugasi lagi (13.000 rpm, 3ºC, 10 menit). Setelah

sentrifugasi cairan dibuang dan pelet dikeringkan dengan

vaccum pump.

Sampel ditambah dengan 100 µl TE  Buffer dan diinkubasi (60ºC, 10 menit). Hasil ekstraksi selanjutnya dielektroforesis (4.7.5) untuk melihat fragmen DNA total yang diperoleh. Jika hasil ekstraksi bagus, selanjutnya dibuat template

DNA dengan cara memasukkan 90 µl TE  Buffer   ke dalam tabung

mikro 1,5 ml dan ditambah dengan 10 µl sampel DNA, kemudian diaduk perlahan dengan

micropipet .

Sisa DNA total maupun

template

DNA

selanjutnya dapat disimpan di suhu -30ºC.

4.7.4.2 Ekstraksi DNA dengan DNeasy� Plant Mini Kit Elektroforesis terhadap DNA total beberapa sampel yang diekstraksi menggunakan metode CTAB menunjukkan hasil pita yang kurang jelas �

33

TissueLyser System (Qiagen, Tokyo, Jepang) selama 2 menit pada kecepatan 25 goyangan/detik sebanyak tiga kali hingga berbentuk seperti bubuk. Sampel ditambah dengan 400 µl Buffer AP1 ( Lysis RNAse, kemudian dicampur dengan

vortex.

Buffer )

dan 4 µl

Sampel diinkubasi (65ºC, 20

menit) dan setiap 5 menit dibolak-balik. Buffer AP2 ( Precipitation

Buffer )

ditambahkan pada sampel sebanyak 130 µl, kemudian tabung dibolak-balik agar larutan tercampur dan selanjutnya sampel diinkubasi di es batu (5 menit). Sampel disentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm (25ºC, 5 menit). Cairan sampel diambil sebanyak 500 µl dan dimasukkan ke dalam QIA Shreder MiniSpin Column.

Sampel disentrifugasi kembali pada kecepatan 14.000 rpm

(25ºC, 2 menit), kemudian cairan pada sampel diambil sebanyak 450 µl dan dipindahkan ke tabung mikro 1,5 ml yang baru. Buffer AP3/E ( Binding  Buffer )

ditambahkan sebanyak 1,5 kali

volume  (kurang-lebih

tabung dibolak-balik agar cairan tercampur.

675 µl) dan

34

sampel sebanyak 500 µl dan sampel disentrifugasi pada kecepatan 8.000 rpm (25ºC, 1 menit). Semua cairan dibuang dengan cara menuang bagian bawah  Mini-Spin Column.

QIA Shreder

Buffer AW (Wash Buffer ) ditambahkan lagi sebanyak 500

µl, kemudian sampel disentrifugasi lagi di kecepatan 14.000 rpm (25ºC, 2 menit). Setelah sentrifugasi, cairan yang ada di bagian bawah  Mini-Spin Column  dibuang

dan bagian atas

QIA Shreder

QIA Shreder Mini-Spin Column

dipindahkan ke tabung mikro 2 ml. Buffer AE ( Elution

Buffer )

ditambahkan pada sampel sebanyak 100 µl

dan diinkubasi di suhu ruang selama 5 menit. Selanjutnya sampel disentrifugasi di kecepatan 8.000 rpm (25ºC, 1 menit). Setelah sentrifugasi, bagian atas

QIA Shreder Mini-Spin Column 

dibuang dan cairan yang

tertampung dalam tabung mikro 1,5 ml disimpan sebagai DNA total. Hasil ekstraksi selanjutnya dielektroforesis untuk melihat fragmen DNA

35

fragmen DNA dilakukan di bawah sinar ultraviolet menggunakan alat UV Transilluminator dan kamera CCD (charge-coupled device).

4.7.6 Amplifikasi DNA (PCR) Primer   yang

digunakan untuk amplifikasi DNA (PCR) terhadap gen

rbcL

(Hasebe et al., 1994) dan trnL-F (Taberlet et al., 1991) adalah :

Tabel 4.1

 Primer yang Digunakan Nama Primer 

aF cR cF fR

Sekuen Primer (5’ – 3’)

ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC GCAGCAGCTAGTTCCGGGCTCCA CGAAATCGGTAGACGCTACG ATTTGAACTGGTGACACGAG

Target rbcL rbcL trnL-F trnL-F

Amplifikasi DNA dilakukan menggunakan PCR Kit (TaKaRa Bio, Shiga,

36

55°C, 1 menit; dan 72 °C, 2 menit) dan reaksi akhir (72 °C, 10 menit). Hasil PCR selanjutnya dielektroforesis (Lampiran 6.) untuk melihat fragmen gen rbcL dan trnL-F  yang diperoleh.

4.7.7 Pemurnian Produk PCR

Hasil PCR dimurnikan menggunakan ExoSAP-IT® PCR Product Cleanup (Affymetrix, Cleveland, Ohio, USA). Sampel hasil PCR dipindah ke tube 

8-strip

yang baru masing-masing sebanyak 10 µl dan ditambahkan 1 µl

ExoSAP-IT. Cairan sampel dicampur dengan cara mengetuk pinggir tabung dan selanjutnya sampel diinkubasi (37ºC, 1,5 jam; 80ºC, 15 menit).

4.7.8 Cycle Sequencing dan Sekuensing DNA Cycle Sequencing dilakukan menggunakan BigDye Terminator v3.1 Cycle

Sequencing

(Applied Biosystems, Foster City, California, USA). Cycle

37

menggunakan

vortex  dan

diinkubasi di suhu ruang selama 10 menit dalam

kondisi gelap, kemudian disentrifugasi (12.500 rpm, 25ºC, 60 menit). Cairan dibuang dan sampel ditambah dengan 50 µl

ethanol 

70%,

kemudian disentrifugasi kembali (12.500 rpm, 25ºC, 45 menit). Setelah sentrifugasi, cairan dibuang dan sampel diinkubasi (95ºC, 2 menit). Masingmasing sampel selanjutnya ditambah dengan  formamide dan dicampur dengan vortex.

Sampel kemudian diinkubasi lagi (95ºC, 3 menit) dan segera

setelahnya sampel diletakkan di atas es (2-3 menit). Reaksi sekuensing selanjutnya diproses menggunakan ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, California, USA) sesuai protokol dari produsen.

4.8 Analisis Data

Fragmen-fragmen sekuen dianalisis dengan perangkat lunak  Analysis 

Sequencing

(Applied Biosystems, Foster City, California, USA) dan dirangkai

38

direkonstruksi dengan jarak genetik mengacu pada  Jukes-Cantor

Model  (Jukes

and Cantor, 1969), sedangkan pada metode MP dikalkulasi menggunakan  Neighbor-Interchange (CNI) on Random Trees .

dan MP diuji dengan metode

bootstrap

Close-

Konsistensi pohon filogenetik NJ

(Felsenstein, 1985) sebanyak 1.000 kali

ulangan. Nilai bootstrap yang lebih besar dari 85% menunjukkan bahwa susunan klad konsisten (peluang terjadinya perubahan susunan klad rendah). Semua karakter diberi bobot yang sama dimana insersi dan delesi dianggap sebagai data yang hilang. Topologi dengan panjang cabang rata-rata untuk semua ruas yang dihasilkan diperoleh dengan metode al., 2008).

50% majority-rule consensus tree

(Adjie

et

39

BAB V. HASIL PENELITIAN

5.1 Identifikasi Spesimen

Tiga puluh spesimen

 Adiantum 

digunakan dalam penelitian ini dan dua

spesimen diantaranya belum teridentifikasi yaitu  Adiantum sp. WN118 dari Bali dan AG326 asal Sumbawa. Hasil BLAST ( Basic (Tabel 5.1) menunjukkan bahwa sekuen

Local Alignment Search Tool)

trnL-F

dari

memiliki tingkat kesamaan yang tinggi dengan sekuen Bolivia (97%). Sekuen

rbcL

 Adiantum

sp. WN118

trnL-F Adiantum

sp. dari

dari spesimen ini tidak berhasil diperoleh sehingga

tidak dapat dibandingkan.

Tabel 5.1 Hasil Pencarian BLAST di GenBank

40

(98%). Sekuen

trnL-F

dari  Adiantum sp. AG326 juga menunjukkan tingkat

kesamaan yang tinggi dengan jenis yang sama (95%).

5.2 Ekstraksi, Amplifikasi dan Sekuensing DNA

Total sampel ( Adiantum,

Antrophyum

dan

Vittaria)

yang digunakan dalam

penelitian adalah sebanyak 37 spesimen. Elektroforesis terhadap DNA total dari sampel yang diekstraksi menggunakan metode CTAB secara umum menunjukkan hasil pita yang cukup jelas, kecuali pada beberapa sampel yaitu

 Adiantum

concinnum Humb. & Bonpl. ex Willd. (SH1129),  A. silvaticum Tind. (BA808 dan

Drapemmu 103),  A.

capillus-veneris

L. (WN154),  A.

tenerum

Swartz (WN113),

 Antrophyum callifolium Blume (WN146 dan DEE37), Antrophyum sp. (RS54) dan Vittaria zosterifolia Willd. (SO002). Amplifikasi terhadap sampel-sampel tersebut

 juga mengalami kegagalan. Ekstraksi terhadap sampel-sampel tersebut selanjutnya diulang menggunakan DNeasy�  Plant Mini

Kit  

(Qiagen, Tokyo,

41

5.3 Karakteristik Sekuen

Panjang sekuen

rbcL

1.062 bp ( Adiantum WN154;  A.

yang diperoleh dari sampel  Adiantum bervariasi antara

hispidulum

hispidulum

WN157) hingga 1.380 bp ( A.

BA706;  A.

raddianum

pensejajaran terhadap 40 sekuen

rbcL

sekuen diantaranya diunduh dari

GenBank )

region

dan 317 (30%)

capillus-veneris

WN111) (Lampiran 3.). Hasil

dari  Adiantum dan kerabat dekatnya (20

variable sites,

mengandung 740 (70%)

267 (25,2%) diantaranya

conserved  parsimony

informative.

Variasi genetik terlihat pada gen

rbcL

baik antar jenis maupun dalam jenis

karena beberapa nukleotida mengalami substitusi. Variasi genetik tersebut tidak menyebabkan terjadinya insersi maupun delesi pada jenis manapun dalam gen ini. Variasi genetik dalam jenis pada gen

rbcL

misalnya terjadi pada  Adiantum

hispidulum (Tabel 6.1) dan A. philippense (Tabel 6.2).

42

Tabel 6.2 Perbedaan Jenis Basa pada Urutan Nukleotida Gen  rbcL

 Adiantum philippense No.

Kode

Basa Nukleotida ke- * 107 909

Asal

1. WN153 Jawa T G 2. WN128 Bali T G 3. WN142 Lombok T G 4. SH1130 Lombok A C *Urutan basa nukleotida setelah sekuen disejajarkan dengan sampel dari jenis yang sama dalam penelitian ini. Panjang sekuen  Adiantum ( Adiantum

trnL-F

capillus-veneris

dari sampel  Adiantum  juga bervariasi, antara 814 bp WN154) hingga 966 bp ( A.

(Lampiran 3.). Hasil pensejajaran 45 sekuen

trnL-F

dekatnya (15 sekuen diantaranya diunduh dari

WN150)

dari  Adiantum dan kerabat

GenBank )

karakter. Matriks data mengandung 348 (29,59%)

concinnum

menghasilkan 1.176

conserved region

(63,6%) variable sites, 623 (53,0%) diantaranya  parsimony informative informative.

dan 748

43

Tabel 6.3 Perbedaan Jenis Basa pada Urutan Nukleotida Nukle otida  trnL-F

 Adiantum concinnum No.

Kode

Basa Nukleotida ke- * 61 178

Asal

1. WN117 Bali G 2. SH1129 Lombok 3. WN150 Jawa C G *Urutan basa nukleotida setelah sekuen disejajarkan dengan sampel dari jenis yang sama dalam penelitian ini. Tabel 6.4 Perbedaan Jenis Basa pada Urutan Nukleotida Nukle otida  trnL-F

 Adiantum diaphanum No.

Kode

Asal

Basa Nukleotida ke- * 117 118 121

1. WN112 Bali G A A 2. BA754a Bali C G *Urutan basa nukleotida setelah sekuen disejajarkan dengan sampel dari jenis yang sama dalam penelitian ini.

44

5.4 Analisis Filogenetik

Analisis filogenetik dilakukan terhadap masing-masing set data menggunakan metode  Neighbor-Joining  (NJ) dan  Maximum

Parsimony

(MP). Dua metode

rekonstruksi yang digunakan ini menghasilkan topologi yang kurang-lebih sama di masing-masing set data. Analisis terhadap gen

rbcL  melibatkan

40 sekuen dalam set data. Analisis

menggunakan metode NJ menghasilkan hipotesis hubungan kekerabatan antar sampel berdasarkan jarak genetik pada gen

rbcL

(Lampiran 8). Metode MP

menghasilkan 15 pohon filogeni yang paling  parsimony dengan 653 langkah (CI = 0.550000; RI = 0.862525). Pohon filogenetik yang dihasilkan oleh metode NJ (Gambar 5.1) dan MP (salah satunya ditampilkan pada Gambar 5.2) pada gen

rbcL

dari spesimen yang

digunakan dalam penelitian ini maupun yang diunduh dari

GenBank 

45

Klad V

Klad IV

Klad III Klad II

Klad I

46

Klad V

Klad IV

Klad III Klad II

47

Klad II (100/99) atau grup  Adiantum tenerum terdiri dari  A. tenerum serta  A.  princeps  dari

Mexico dan tidak terdapat sampel dari Kepulauan Sunda Kecil

dalam kelompok ini. Klad III, yang merupakan

sister  bagi

Klad II, adalah grup  A.

 peruvianum,

terdiri dari

tetraphyllum

(cultivated ) dan spesimen lain yang belum teridentifikasi dari

 A. peruvianum

dari Kepulauan Sunda Kecil,

 A.

Malaysia. Hubungan dalam klad ini cukup kuat (100/99), begitu pula hubungan antara Klad II dan III yang juga nampak jelas di NJ, namun lemah di MP (85/74). Klad IV (100/99) atau grup  Adiantum caudatum terdiri dari A. philippense asal Kepulauan Sunda Kecil dan Jawa, spesimen yang belum teridentifikasi dari Kepulauan Sunda Kecil (AG326),  A.

soboliferum,  A. caudatum,  A. malesianum,

 A. mariesii dan A. sinicum dari Cina serta A. egdeworthii dari Sunda Kecil, Jepang

dan Cina. Klad V (grup  A.

capillus-veneris)

cukup kuat (100/97) dan merupakan

juga merupakan kelompok yang

sister   bagi

Klad IV. Klad ini terdiri dari  A.

capillus-veneris dari Jawa dan Cina,  A. jordanii dari Amerika dan A. flabellulatum

48

digunakan dalam penelitian ini maupun yang diunduh dari

GenBank   mencakup

lima klad dengan keanggotaan yang kurang-lebih sama seperti pada set data

rbcL,

dengan tambahan beberapa spesimen yang sebelumnya tidak berhasil diperoleh sekuen

rbcLnya.  Adiantum silvaticum,  A. diaphanum,  A. concinnum

dan sampel

yang belum teridentifikasi (WN118) dari Kepulauan Sunda Kecil termasuk dalam Klad I (grup A. hispidulum). Seperti halnya pada rbcL, berdasarkan sekuen trnL-F ini tidak terdapat sampel dari Kepulauan Sunda Kecil yang masuk dalam Klad II (grup  A. tenerum) dan Klad V (grup  A. capillus-veneris).  Adiantum tenerum dari Jawa termasuk dalam Klad II (grup  A. Kepulauan Sunda Kecil dan  A. (grup

 A. peruvianum),

tenerum),

polyphyllum

sedangkan  A.

bergabung dalam Klad IV (grup  A.

sementara  A.

trapeziforme

dari

dari Jawa termasuk dalam Klad III

caudatum

caudatum).

dari Kepulauan Sunda Kecil

Masing-masing kelompok utama

adalah monofiletik pada kedua analisis yang dilakukan.

49

Klad V

Klad IV

Klad III Klad II

Klad I

50

Klad V

Klad IV

Klad III Klad II

Klad I

51

BAB VI. PEMBAHASAN

6.1 Identifikasi Spesimen

Publikasi oleh Posthumus (1944) dan Data Spesimen Koleksi Herbarium Bogoriense Pusat Penelitian Biologi – LIPI (Juni, 2012) menyebutkan beberapa  jenis  Adiantum yang ditemukan di Kepulauan Sunda Kecil, yaitu capillus-veneris L., A. caudatum

 Adiantum

L., A. cuneatum Langsd. & Fisch., A. diaphanum

Blume,  A. edgeworthii Hook.,  A. flabellulatum L.,  A. hispidulum Sw., A. mettenii Kuhn,  A. philippense L.,  A. pulchellum Blume dan  A. tinctum Moore. Lima jenis diantaranya yaitu  A. caudatum,  A. diaphanum,  A. edgeworthii ,  A. hispidulum dan  A. philippense

merupakan bagian dari sampel yang digunakan dalam penelitian

ini. Penelitian ini juga menggunakan jenis  Adiantum lain yang tidak ditemukan dalam studi oleh Posthumus sebelumnya (1944) yaitu  A.

concinnum

Humb. &

52

 pinnae

yang terletak tumpang-tindih dengan bagian

rachis.  Adiantum concinnum

merupakan jenis yang umum dijumpai di kawasan tropis Amerika, bahkan kadang-kadang tumbuh sebagai gulma (Hoshizaki and Moran, 2002). Selain dari Lombok dan Bali,  A. concinnum yang digunakan sebagai sampel dalam penelitian ini juga berasal dari Pulau Jawa. Sampel Adiantum raddianum dari Kepulauan Sunda Kecil dalam penelitian ini  juga berasal dari spesimen yang tumbuh di sela-sela bebatuan dalam kawasan Kebun Raya “Eka Karya” Bali – LIPI. Jenis ini biasa dijumpai di daerah tropis Amerika dan merupakan jenis yang paling umum dibudidayakan. Jumlah kultivarnya banyak dan cukup sulit untuk dibedakan (Hoshizaki and Moran, 2002).  Adiantum trapeziforme

merupakan jenis yang berasal dari Amerika dan India

bagian barat (Hoshizaki and Moran, 2002). Sampel

 A. trapeziforme

yang

digunakan dalam penelitian ini berasal dari Sumbawa. Jenis tersebut ditemukan di

53

 Adiantum silvaticum

Australia. Sampel  A.

merupakan jenis yang juga ditemukan tumbuh di

silvaticum

dari Kepulauan Sunda Kecil yang digunakan

dalam penelitian ini berasal dari Pulau Sumba yang diduga juga merupakan daerah persebarannya. Jenis ini sangat mirip dengan  A.  fulvum

Raoul dan  A.

viridescens

cunninghamii

Hook.,  A.

Colenso yang merupakan jenis endemik dari

New Zealand (Large and Braggins, 1993; Bouma, 2008). Dua dari 30 spesimen  Adiantum yang digunakan dalam penelitian ini belum teridentifikasi yaitu  Adiantum sp. WN118 dari Bali dan AG326 asal Sumbawa.  Adiantum

sp. (WN118) dari Bali ini ditemukan tumbuh di sela-sela bebatuan

dalam kawasan Kebun Raya ”Eka Karya” Bali - LIPI bersama jenis  A. concinnum dan  A.

raddianum

di ketinggian sekitar 1.200 m dpl. Hasil BLAST sebelumnya

(Tabel 5.1) menunjukkan bahwa sekuen

trnL-F

dari  Adiantum sp. (WN118)

memiliki tingkat kesamaan yang tinggi dengan  Adiantum sp. dari Bolivia (97%). Sayangnya sekuen

rbcL

dari spesimen ini tidak diperoleh sehingga tidak bisa

54

di tebing sungai yang agak terlindung pada ketinggian 525 m dpl. Diduga  Adiantum sp. (AG326) ini merupakan jenis asli daerah tersebut.

6.2 Ekstraksi, Amplifikasi dan Sekuensing DNA

Beberapa sampel menunjukkan hasil pita DNA total yang nampak kurang  jelas saat diekstraksi dengan menggunakan metode CTAB. Amplifikasi terhadap sampel-sampel tersebut juga mengalami kegagalan. Hal tersebut diperkirakan terjadi karena adanya inhibitor dalam sampel. Inhibitor tersebut dapat berupa polisakarida atau metabolit sekunder yang tidak tercuci secara sempurna dalam proses ekstraksi DNA dan menjadi kontaminan dalam proses berikutnya. Ekstraksi terhadap sampel-sampel tersebut selanjutnya dicoba untuk diulang menggunakan DNeasy� Plant Mini Kit   (Qiagen, Tokyo, Jepang). Hasil ekstraksi ulang menggunakan DNeasy�  Plant Mini

Kit   tersebut

menunjukkan pita DNA

55

oleh banyak faktor antara lain kualitas DNA yang kurang baik atau hilangnya DNA selama proses pencucian (presipitasi ethanol).

6.3 Karakteristik Sekuen

Panjang sekuens

rbcL

yang diperoleh dari sampel  Adiantum yang digunakan

dalam penelitian ini bervariasi antara 1.062 bp ( Adiantum hingga 1.380 bp ( A. raddianum

capillus-veneris

WN154;

hispidulum

 A. hispidulum

WN157)

BA706;

 A.

WN111). rbcL merupakan gen besar yang berukuran lebih dari 1.400

bp (Avise, 2001) sehingga tidak mudah untuk mendapatkan keseluruhan sekuennya. Umumnya bagian ujung dan pangkal kromatogram dari sekuen yang panjang sulit untuk dibaca karena bagian  peak -nya yang datar. Teknik sekuensing DNA umumnya hanya mampu mengatasi kurang dari 900 nukleotida pada fragmen DNA dalam satu reaksi (Arif et al., 2010). Perbedaan pada sekuen

rbcL

nampak baik antar jenis maupun dalam jenis.

56

berakibat protein yang dihasilkan berbeda dari protein yang seharusnya disintesis (Yuwono, 2005). Panjang sekuen ( Adiantum Sekuen

trnL-F

capillus-veneris

trnL-F

dari sampel  Adiantum  juga bervariasi, antara 814 bp WN154) hingga 966 bp ( A.

concinnum

WN150).

pada kebanyakan jenis bahkan berukuran kurang dari 700 bp

sehingga memudahkan daerah tersebut diamplifikasi dan disekuen secara langsung (Tsai et al., 2006). Variasi sekuen yang terjadi pada daerah

trnL-F

lebih banyak jika

dibandingkan dengan variasi sekuen pada rbcL. Daerah trnL-F yang terbentang di antara gen plastid pengkode RNA transfer (trnL (UAA) dan mengandung daerah non-pengkode atau non-gen yaitu intron dari intergenic spacer

(IGS) dari

trnL-trnF

(GAA) (Holt

et al.,

trnF

(GAA))

trnL (UAA) dan

2005). Daerah non-

pengkode merupakan daerah yang menunjukkan frekuensi mutasi paling tinggi sehingga dimungkinkan terdapat banyak perbedaan pada daerah tersebut baik

57

Intron dari

trnL

(UAA) ini berada di antara

trnL

(UAA) 5’ ekson hingga

trnL

(UAA) 3’ ekson dan merupakan bagian gen yang awalnya ikut ditranskripsi menjadi bagian dari mRNA, namun selanjutnya mengalami proses

splicing

(dihilangkan) sehingga intron tersebut tidak terlibat dalam proses translasi RNA membentuk protein (Frankham et al., 2010). Variasi terbanyak terjadi pada  Adiantum

hispidulum.

Substitusi terjadi pada

bagian intron sekuen trnL-F dari jenis ini yaitu pada basa ke-88, 98, 155 dan 267, serta pada bagian

intergenic spacer

yaitu basa ke-663, 706 dan 722.  Intergenic

spacer adalah bagian DNA yang tidak ikut ditranskripsi.

Perubahan sekuen trnL-F beberapa jenis Adiantum tersebut hanya terjadi pada bagian intron dan

intergenic spacer .

Perubahan yang terjadi pada bagian non-

pengkode ini tidak mempengaruhi proses sintesa protein manapun. Bagian

trnL

(UAA) 3’ ekson yang mengkode RNA transfer untuk asam amino Leusin pada semua sampel  Adiantum dari penelitian ini menunjukkan urutan basa nukleotida

58

misalnya, telah digunakan sebagai dasar dalam menguji dugaan adanya species

pada jenis komplek  Asplenium

dalam sekuen

rbcLnya

(Murakami

Jenis-jenis yang tergolong

nidus

et al.,

cryptic

yang memiliki 4-5% perbedaan

1999; Yatabe and Murakami, 2003).

cryptic species  secara

morfologi memang sulit untuk

dibedakan namun secara genetik sudah mengalami perubahan. Jenis-jenis tersebut mengalami isolasi reproduktif sehingga dugaan adanya

cryptic species  umumnya

 juga dibuktikan melalui penelitian ekologi dan kawin-silang.

6.4 Analisis Filogenetik

Hubungan kekerabatan dari jenis-jenis

 Adiantum

yang ditemukan di

Kepulauan Sunda Kecil ini direkonstruksi menggunakan dua fragmen DNA kloroplas yaitu

rbcL

dan

trnL-F

(daerah dari

trnL

(UAA) 5’ ekson hingga

trnF

(GAA)). Pohon filogeni dari jenis-jenis  Adiantum dari Kepulauan Sunda Kecil maupun yang diunduh dari

GenBank  yang dibentuk menggunakan metode NJ dan

59

Klad I (grup  A. hispidulum) terdiri dari tujuh hingga sembilan jenis  Adiantum (enam jenis diantaranya berasal dari Kepulauan Sunda Kecil). Sampel-sampel  Adiantum hispidulum

pada klad ini terpisah menjadi dua sub klad karena adanya

perbedaan dalam susunan basa nukleotidanya, baik pada

rbcL

maupun

trnL-F .

Perubahan basa pada sekuen tersebut menyebabkan variasi secara genetik dan mempengaruhi hubungan kekerabatannya, namun masih berada dalam satu klad monofiletik.  Adiantum hispidulum  Adiantum hispidulum

merupakan salah satu jenis kompleks dalam marga ini.

ditemukan tumbuh di India bagian selatan, Afrika bagian

timur dan Kepulauan Pasifik (Hoshizaki and Moran, 2002) dan juga di New Zealand (Large and Braggins, 1993), Thailand (Boonkerd and Pollawatn, 2013), Indonesia (Posthumus, 1944; Lu et al., 2012) dan Cina (Lu et al., 2012).  Adiantum hispidulum sensu lato

nampaknya memiliki banyak perbedaan berdasarkan

persebarannya, setidaknya jika dilihat dari sisi genetiknya (Large, 2013

kom.

60

rambut  pinula pada  A. hispidulum dari New Zealand yang disebut sebagai tipe 3 namun tidak mendeskripsikannya secara jelas. Pengamatan terhadap sampel-sampel  Adiantum

hispidulum

dalam penelitian

ini belum menemukan karakter morfologi yang menyebabkan sampel-sampel tersebut terpisah dalam dua sub klad. Perubahan nampaknya mulai terjadi pada individu tersebut secara genetik, namun perubahan tersebut belum terekspresi menjadi perubahan dalam morfologi sehingga secara morfologi individu-individu tersebut masih terlihat sama. Sekuen trnL-F menyatakan  Adiantum silvaticum dari Kepulauan Sunda Kecil  juga termasuk ke dalam klad ini. Sekuen diperoleh dan belum terdapat di

rbcL

GenBank

dari sampel jenis ini tidak dapat

sehingga posisinya di kedua pohon

filogeni tidak dapat dibandingkan.  Adiantum silvaticum dilaporkan tumbuh alami di Australia bagian timur dan berkerabat dekat dengan  A. cuninghamii Hook.,  A.  fulvum

Raoul. dan  A. viridescens Col., tiga jenis  Adiantum yang endemik di New

61

capillus-veneris.

Analisis secara genetik menunjukkan bahwa keduanya

berkerabat jauh dengan bersama dengan  A.

 A. capillus-veneris 

jordanii.

yang membentuk klad tersendiri

Hal ini menunjukkan bahwa meskipun jenis-jenis

tersebut nampak mirip, sebenarnya secara genetik mereka berbeda.  Adiantum raddianum

di Klad I ini mengelompok bersama dengan

 A.

cuneatum. Nama A. cuneatum ternyata tercatat sebagai sinonim dari  A. raddianum

(Scamman, 1960; Hoshizaki and Moran, 2002). Sampel dari Kepulauan Sunda Kecil tidak ditemukan di Klad II, namun anggota dari kelompok ini,  Adiantum tenerum dan  A. princeps memiliki karakter morfologi yang serupa. Bagian

segmen 

dari kedua jenis tersebut berbentuk

trapesium hingga rombik-oblong dan bagian

sori

membulat hingga

short-oblong

(Scamman, 1960).  Adiantum peruvianum

berada di Klad III (grup

dan  A.

trapeziforme

 A. peruvianum)

dari Kepulauan Sunda kecil yang

mengelompok bersama dengan

 A.

62

reproduksi aseksual (vegetatif). Akar baru dapat tumbuh di bagian ujung cambuk tersebut dan jika akar semakin besar dan berat maka

ental  akan

merunduk,

membuat akar baru mampu menyentuh tanah. Jika kondisi telah memungkinkan, hubungan dengan induk melalui

ental  lama

akan terputus dan tanaman dapat

berdiri sendiri menjadi individu baru.  Adiantum edgeworthii

mengelompok dengan edgeworthii

dalam klad ini polifiletik:  A.

 A. soboliferum

dan

edgeworthii

 A. philippense,

dari Cina

sedangkan

 A.

dari Jepang dan Kepulauan Sunda Kecil mengelompok bersama  A.

sinicum. Hal ini diperkirakan terjadi karena adanya differensiasi

DNA lebih dalam

dari jenis A. edgeworthii atau karena kesalahan identifikasi. Adiantum edgeworthii ini selain ditemukan di Cina, Jepang dan Indonesia, juga ditemukan di Bhutan, bagian utara India, Malaysia, Myanmar, Nepal, Fillipina, utara Thailand dan Vietnam (Zhang et al., 2013). Klad yang terakhir yaitu Klad V mengacu pada grup

capillus-veneris

dalam

63

BAB VII. SIMPULAN DAN SARAN

7.1 Simpulan  Adiantum

yang berasal dari Kepulauan Sunda Kecil memiliki variasi genetik

antar jenis dan beberapa diantaranya memiliki variasi dalam jenis. Variasi tersebut terjadi baik pada gen

rbcL

maupun pada

trnL-F ,

khususnya pada bagian intron

dan intergenic spacer . Jenis-jenis Adiantum dari Kepulauan Sunda Kecil tidak monofiletik melainkan menjadi bagian dari tiga klad utama diantara lima klad utama yang terbentuk berdasarkan analisis sekuen  Adiantum

rbcL

dan

trnL-F .

Pengelompokan jenis-jenis

ini tidak berdasarkan asalnya dan juga tidak sesuai dengan klasifikasi

dalam jenis yang dibuat berdasarkan karakter morfologi sebelumnya. Klad I dari  jenis-jenis  Adiantum dari Kepulauan Sunda Kecil ini terdiri dari grup  Adiantum

64

diketahui memiliki variasi genetik dalam jenis yang merupakan petunjuk awal akan adanya jenis tersembunyi ( cryptic species). Untuk membuktikan hal tersebut diperlukan pengujian lebih lanjut seperti uji molekuler dengan kombinasi penanda (marker ) DNA kloroplas dan DNA inti serta uji kawin-silang.

65

DAFTAR PUSTAKA

Adjie, B., Takamiya, M., Ohta, M., Ohsawa, T. A., Watano, Y. 2008. Molecular Phylogeny of the Lady Fern Genus  Athyrium in Japan Based on Chloroplast rbcL and trnL-trnF Sequences.  Acta Phytotaxonomica et Geobotanica 59 (2):79-95. Afriastini, J. J. 2003.  Adiantum L. In: de Winter, W. P. and Amoroso, V. B., editors. Plant Resources of South-East Asia No. 15 (2) Cryptogams : Ferns and Fern Allies . Bogor: PROSEA. ISBN : 979-8316-45-2. p. 50-55. Applied Biosystems. 2009.  DNA

Sequencing by Capillary Electrophoresis – nd  Applied Biosystems Chemistry Guide. 2   edition. Applied Biosystems.

California.

Arif, I. A., Bakir, M. A., Khan, H. A., Al Farhan, A. H., Al Homaidan, A. A., Bahkali, A. H., Al Sadoon, M., Shobrak, M. 2010. A Brief Review of Molecular Techniques to Assess Plant Diversity.  International Journal of   Molecular Sciences 11 (5):2079-2096. Avise, J. C. 2001.  Molecular Markers, Natural History and Evolution. 4th printing. Massachusetts: Kluwer Academic Publishers. ISBN : 978-0-87893041-8. p. 340. Bagali, P. G., Prabhu, P. D. A. H., Raghavendra, K., Bagali, P. G., Hittalmani, S.,

66

Chao, Y., Liu, H., Chiang, Y., Chiou, W. 2012. Polyploidy and Speciation in Pteris (Pteridaceae). Journal of Botany 2012. DOI : 10.1155/2012/817920. [cited 2014 Jan. 10]. Available from: URL: http://www.hindawi.com/journals/jb/2012/817920/. Ching, R. C. 1957. On the Genus  Adiantum L. of China with Notes on Some Related Species From Neighbouring Regions.  Acta Phytotaxonomica Sinica 6:301-354. Christenhusz, M. J. M., Zhang, X., Schneider, H.. 2011. A Linear Sequence of Extant Families and Genera of Lycophytes and Ferns. Phytotaxa 19:7-54. de Groot, G. A., During, H. J., Maas, J. W., Schneider, H., Vogel, J. C., Erkens, R. H. J. 2011. Use of rbcL  and trnL-F   as a Two-Locus DNA Barcode for Identification of NW-European Ferns: an Ecological Perspective. PLoS ONE  6 (1):e16371. DOI : 10.1371/journal.pone.0016371. de Lang, R. 2011. The Snakes of the Lesser Sunda Islands (Nusa Tenggara), Indonesia.  Asian Herpetological Research  2 (1):46-54. DOI: 10.3724/SP.J.1245.2011.00046. Doyle, J. J. and J. L. Doyle. 1987. A Rapid DNA Isolation Procedure for Small Quantities of Fresh Leaf Tissue. Phytochemical Bulletin 19:11-15. Ebihara, A., Nitta, J. H., Ito, M. 2010. Molecular Species Identification with Rich Floristic Sampling: DNA Barcoding the Pteridophyte Flora of Japan. PLoS ONE 5 (12):e15136. DOI : 10.1371/journal.pone.0015136.

67

Hoshizaki, B. J. 1970. The Genus  Adiantum  in Cultivation (Polypodiaceae).  Baileya 17(3):97-144. Hoshizaki, B. J. and Moran, R. C. 2002. Fern Grower’s Manual . Revised and Expanded Edition. Portland: Timber Press Inc. ISBN : 0-88192-495-4. p. 159-176. IUCN. 2013. IUCN Red List of Threatened Species. Version 2013.2. . Downloaded on 24 March 2014. Iwatsuki, K., Yamazaki, T., Boufford, D. E., Ohba, H., editors. 1995. Flora of  Japan Vol. I: Pteridophyta and Gymnospermae. Tokyo: Kodansha Ltd. p. 82-84. Jones, D. L. 1998.  Encyclopaedia of Ferns. Melbourne: Lothian Publishing Company Pty., Ltd. ISBN : 0-85091-179-6. 433 p. Jukes, T. H. and Cantor, C. R. 1969. Evolution of Protein Molecules. In: Munro, H. N., editor.  Mammalian Protein Metabolism. New York: Academic Press. p. 21-132. Karsinah, Sudarsono, Setyobudi, L., Aswidinnoor, H. 2002. Keragaman Genetik Plasma Nutfah Jeruk Berdasarkan Analisis Penanda RAPD.  Jurnal  Bioteknologi Pertanian (7) 1:8-16. Korpelainen, H., de Britto, J., Doublet, J., Pravin, S. 2005. Four Tropical, Closely

68

Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P. A., McWilliam, H., Valentin, F., Wallace, I. M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. 2007. ClustalW and ClustalX version 2. Bioinformatics 23 (21):2947-2948. Lellinger, D. B. and Prado, J. 2001. The Group of  Adiantum gracile in Brazil and Environs. American Fern Journal 91 (1):1-8. Li, F., Tan, B. C., Buchbender, V., Moran, R. C., Rouhan, G., Wang, C., Quandt, D. 2009. Identifying A Mysterious Aquatic Fern Gametophyte. Plant Systematics and Evolution 281:77-86. DOI : 10.1007/s00606-009-0188-2. Li, F., Kuo, L., Rothfels, C. J., Ebihara, A., Chiou, W., Windham, M. D., Pryer, K. M. 2011. rbcL  and matK   Earn Two Thumbs Up as the Core DNA Barcode for Ferns. PLoS ONE  6 (10):e26597. DOI : 10.1371/journal. pone.0026597. Linnaeus, C. 1753. Species Plantarum Vol. 2. Stockholm. Salvi. Liu, X., Gituru, R. W., Chen, L. 2007. Genetic Variation in the Endangered Fern  Adiantum reniforme var. sinense (Adiantaceae) in China.  Annales Botanici Fennici 44:25-32. Lu, J., Wen, J., Lutz, S., Wang, Y., Li, D. 2012. Phylogenetic Relationships of Chinese  Adiantum based on Five Plastid Markers.  Journal of Plant  Research 125 (2):237-249.

69

Mondini, L., Noorani, A., Pagnotta, M. A. 2009. Review: Assessing Plant Genetic Diversity by Molecular Tools.  Diversity 1:19-35. DOI : 10.3390/d1010019. Murakami, N., Yokoyama, J., Yatabe, Y., Iwasaki, H., Serizawa, S. 1999. Molecular Taxonomic Study and Revision of the Three Japanese Species of Asplenium sect. Thamnopteris. Journal of Plant Research 112:15-25. Newmaster, S. G., Fazekas, A. J., Ragupathy, S.. 2006. DNA Barcoding in Land Plants: Evaluation of rbcL in a Multigene Tiered Approach. Canadian  Journal of  Botany 84:335-341. DOI : 10.1139/B06-047. Paris, C. A. and Windham, M. D. 1988. A Biosystematic Investigation of the  Adiantum pedatum Complex in Eastern North America. Systematic Botany 13 (2):240-255. Parris, B. S. 1980.  Adiantum hispidulum Swartz and  A. pubescens Schkuhr (Adiantaceae: Filicales) in New Zealand. New Zealand Journal of Botany 18:503-506. Parris, B. S. and Croxall, J. P. 1974.  Adiantum viridescens Colenso in New Zealand. New Zealand Journal of Botany 12:227-233. Patil, S., Patil, S., Dongare, M. 2013. The Genus  Adiantum L. from Maharashtra: a Note on Addition of Two Species for Maharashtra, India. Fern Gazette 19 (5):159-163.

70

Posthumus, O. 1944. Malayan Fern Studies III: The Ferns of the Lesser Sunda Islands. Annals of the Botanic Gardens 51 (1):35-113. Prado, J. and Hirai, R. Y. 2013.  Adiantum lindsaeoides (Pteridaceae), a New Fern Species from the Atlantic Rain Forest, Brazil. Systematic Botany 38 (1):28-31. Primack, R. B., Supriatna, J., Indrawan, M., Kramadibrata, P. 1998.  Biologi Konservasi. Edisi ke-1. Jakarta: Yayasan Obor Indonesia. ISBN : 979-461288-X. Pryer, K. M., Smith, A. R., Skog, J. E. 1995. Phylogenetic Relationships of Extant Ferns Based on Evidence from Morphology and rbcL Sequences.  American Fern Journal 85 (4):205-282. Qiagen. 2000.  DNeasy® Plant Mini Kit and DNeasy Plant Maxi Kit Handbook –  for DNA Isolation from Plant Tissue. Qiagen. Tokyo. Quintanilla, L. and Escudero, A. 2006. Spore Fitness Components Do Not Differ Between Diploid and Allotetraploid Species of  Dryopteris (Dryopteridaceae). Annals of Botany 98 (3):609-618. Ramel, C. 1998. Biodiversity and Intraspecific Genetic Variation.  Applied Chemistry 70 (11):2079-2084.

Pure and

Reddy, M. P., Sarla, N., Siddiq, E. A. 2002. Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) Polymorphism and Its Application in Plant Breeding. Euphytica 128:9-17.

71

Sardiwinata, J. S., Hamzah, R., Kusnadi. 2008.

Cara Pengumpulan, Pembuatan dan Pemeliharaan Koleksi Material Herbarium Pusat Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Bogor . Jakarta: LIPI Press. ISBN : 978-979-799-

308-5. 31 hal.

Scamman, E. 1960.

The Maidenhair Ferns (Adiantum) of Costa Rica – Contributions from the Gray Herbarium of Harvard University No. 187 .

Harvard University Herbaria. p. 3-22.

Schuettpelz, E., Schneider, H., Huiet, L., Windham, M. D., Pryer, K. M. 2007. A Molecular Phylogeny of the Fern Family Pteridaceae: Assessing Overall Relationships and the Affinities of Previously Unsampled Genera.  Molecular Phylogenetics and Evolution  44:1172-1185. DOI : 10.1016/j.ympev.2007.04.011. Schuettpelz, E. and Pryer, K. M. 2007. Fern Phylogeny Inferred from 400 Leptosporangiate Species and Three Plastid Genes. Taxon  56 (4):10371050. Semagn, K., Bjørnstad, Å., Ndjiondjop, M. N. 2006. An Overview of Molecular Marker Methods for Plants. African Journal of Biotechnology 5 (25):25402568. Small, R. L., Cronn, R. C., Wendel, J. F. 2004. L. A. S. Johnson Review No. 2: Use of Nuclear Genes for Phylogeny Reconstruction in Plants.  Australian Systematic Botany 17:145-170.

72

Taberlet, P., Gielly, L., Pautou, G., J. Bouvet. 1991. Universal Primers for Amplification of Three Non-coding Regions of Chloroplast DNA. Plant  Molecular Biology 17:1105-1109. Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M., Kumar, S. 2011. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods.  Molecular Biology and Evolution  28 (10):2731-2739. DOI : 10.1093/molbev/msr121. Tryon, R. M. and Tryon A. F. 1982. Ferns and Allied Plants,  Reference to Tropical America. New York: Springer-Verlag.

with Special

Tsai, L., Yu, Y., Hsieh, H., Wang, J., Linacre, A., Lee, J. C. 2006. Species Identification Using Sequences of the trnL Intron and the trnL-trnF IGS of Chloroplast Genome Among Popular Plants in Taiwan. Forensic Science  International 164:193-200. DOI : 10.1016/j.forsciint.2006.01.007. Wolf, P. G. 1995. Phylogenetic Analysis of rbcL and Nuclear Ribosomal RNA Gene Sequences in Dennstaedtiaceae. American Fern Journal 85:306-327. Wolf, P. G., Rowe, C. A., Sinclair, R. B., Hasebe, M. 2003. Complete Nucleotide Sequence of the Chloroplast Genome from a Leptosporangiate Fern,  Adiantum capillus-veneris L. DNA Research 10:59-65. Yatabe, Y. and Murakami, N. 2003. Recognition of Cryptic Species in the  Asplenium nidus  Complex using Molecular Data - a Progress Report.

73

LAMPIRAN 1. Foto Jenis-Jenis  Adiantum dan Kerabat D

ekatnya

yang Digunakan sebagai Sampel dalam Penelitian Ini

a.

b.

74

LAMPIRAN 1. Lanjutan ...

a.

d

b.

eb h

c.

75

LAMPIRAN 1. Lanjutan ...

a.

b.

c.

76

LAMPIRAN 2. Peta Distribusi Pengambilan Sampel ( Adiantum dan Kerabat Dekatnya)

Seram

Bali Jawa

Sumbawa

Lombok Sumba

Timor

77

LAMPIRAN 3. Daftar Sampel ( Adiantum dan Kerabat Dekatnya) No.

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Nama Jenis 1

9. 10. 11.

 Adiantum sp. 2  Adiantum sp.  1  A. capillus-veneris L.  1  A. capillus-veneris L.  1  A. caudatum L.  A. concinnum Humb. & Bonpl.  2 ex Willd.  A. concinnum Humb. & Bonpl.  2 ex Willd.  A. concinnum Humb. & Bonpl.  2 ex Willd. 1  A. diaphanum Blume 1  A. diaphanum Blume  1  A. edgeworthii Hook.

12. 13. 14. 15. 16.

 A. hispidulum Sw.  1  A. hispidulum Sw.  1  A. hispidulum Sw.  1  A. hispidulum Sw.  1  A. hispidulum Sw.

7. 8.

 1

Kode

Tahun Koleksi

AG326 WN118 WN114 WN154 WN140 WN117

2010 2010 2010 2012 2012 2010

Bima, Sumbawa Kebun Raya Bali Malang, Jawa Malang, Jawa Klungkung, Bali Kebun Raya Bali

SH1129

2012

Lombok Utara, Lombok

WN150

2012

WN112 BA754a BA742

2010 2011 2011

BA809 WT797 WN157 WN120 WN144

2011 2013 2013 2010 2012

Asal

Panjang Sekuen  rbcL  trnL-F (bp) (bp) 1142 924 926 1148 1380 814 898 913

-

923

Batu, Jawa

1367

966

Kebun Raya Bali Karangasem, Bali Timor Tengah Selatan, Timor Sumba Timur, Sumba Lombok Timur, Lombok Buleleng, Bali Buleleng, Bali Batu, Jawa

1182

868 949 843

1336 1062 1365 1366

901 852 858 934 906

78

LAMPIRAN 3. Lanjutan ...

No.

Nama Jenis

Kode

 1

Tahun Koleksi

Asal

17.  A. hispidulum Sw. WN158 2013 Timor Tengah Selatan, Timor  1 18.  A. hispidulum Sw. BA706 2011 Timor Tengah Selatan, Timor 3 19.  A. peruvianum Klotzsch WN119 2010 Buleleng, Bali  1 20.  A. philippense L. WN128 2011 Buleleng, Bali  1 21.  A. philippense L. WN142 2012 Lombok Barat, Lombok  1 22.  A. philippense L. SH1130 2012 Lombok Utara, Lombok  1 23.  A. philippense L. WN153 2012 Malang, Jawa 3 24.  A. polyphyllum Willd. WN116 2010 Tulungagung, Jawa  2 25.  A. raddianum C. Presl. WN111 2010 Kebun Raya Bali  2 26.  A. raddianum C. Presl. WN149 2012 Batu, Jawa 1 27.  A. silvaticum Tind. BA808 2011 Sumba Timur, Sumba  1 28.  A. silvaticum Tind. Drapemmu103 1996 Sumba Timur, Sumba  2 29.  A. tenerum Sw. WN155 2012 Malang, Jawa  2 30.  A. trapeziforme L. AG329 2010 Bima, Sumbawa 1 31.  Antrophyum sp. * RS54 2011 Seram 1 32.  Antrophyum callifolium Blume *   WN146 2012 Batu, Jawa 1 33.  Antrophyum callifolium Blume * DEE37 2009 Bali 1 34.  Antrophyum callifolium Blume * SH1163 2012 Lombok Utara, Lombok 1 35.  Antrophyum latifolium Blume * RS51 2011 Seram 1 Vittaria zosterifolia 36.  Willd. * SO002 2012 Kebun Raya Bali 1 37. Vittaria zosterifolia Willd. * SO002a 2012 Bima, Sumbawa 1 2 3 Keterangan : * Outgroup; Jenis asli; Jenis yang diintroduksi dan kemudian meliar; Jenis yang dibudidayakan. ●

Panjang Sekuen  rbcL  trnL-F (bp) (bp) 1376 910 1380 900 1373 858 1173 1221 1244 1156 909 1380 910 896 882 915 824 839 910 865 975 951 1231 851 1177 1377 -

79

LAMPIRAN 4. Cara Membuat Beberapa Larutan yang Digunakan dalam Analisis Molekuler

2xCTAB Extraction Buffer :

Konsentrasi Akhir :

1. CTAB (CH3(CH2)15N(CH3)3) 10 gr 2% 2. Sodium chloride (NaCl) 41 gr 1,4 M 3. 1 M Tris – HCl (pH 8,0) 50 ml 100 mM 4. 0,5 M EDTA2Na (pH 8,0) 20 ml 20 mM Dilarutkan dalam distilled deionized water  hingga 500 ml, autoclave. TE Buffer :

1. 1 M Tris – HCl (pH 8,0) 1 ml 2. 0,5 M EDTA2Na (pH 8,0) 200 µl Dilarutkan dalam distilled deionized water  hingga 100 ml. Stok 50xTAE Buffer :

1. Tris (C4H11NO3) 242 gr 2. 0,5 M EDTA2Na (pH 8,0) 100 ml 3.  Acetic Acid  (CH3COOH) 57,1 ml Dilarutkan dalam distilled deionized water  hingga 1.000 ml. 1xTAE Buffer :

80

LAMPIRAN 5. Hasil Elektroforesis DNA Total

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

��

��

��

��

��

��

��

ab c ed

A

�

a b

�

�

�

�

�

�

�

�

�

��

��

��

��

��

��

��

81

LAMPIRAN 6. Hasil Elektroforesis Produk PCR Gen  rbcL dan trnL-F

�

ab

�

�

�

�

�

�

�

�

�

��

��

cd e

Keterangan : Hasil amplifikasi gen rbcL : Adiantum hispidulum BA809 (1);  A. raddianum WN111 (2); A. trapeziforme AG329 (3);  A. capillus-veneris WN154 (4); A. tenerum WN155 (5); A. concinnum WN150 (6); A. hispidulum WN144 (7); A. philippense WN153 (8); A. polyphyllum WN116 (9); Antrophyum callifolium WN146 (10); Antrophyum sp. DEE37 (11). M = Marker (a : 1353 bp;

b : 1078 bp; c : 872 bp; d : 603 bp; e : 310 bp).

82

LAMPIRAN 7. Daftar Sekuen yang Diunduh dari GenBank No.

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22.

Nama Jenis  Adiantum sp.  Adiantum sp.  A. aethiopicum  A. capillus-veneris  A. caudatum  A. cuneatum  A. diaphanum  A. diaphanum  A. edgeworthii  A. edgeworthii  A. flabellulatum  A. jordanii  A. malesianum  A. mariesii  A. philippense  A. princeps  A. sinicum  A. soboliferum  A. tenerum  A. tetraphyllum  Antrophyum callifolium Vittaria sp.

No. Akses  rbcL trnL-F

Asal

Bolivia Malaysia New Zealand China China Indonesia Taiwan China Japan China China USA China China Fillipina Mexico China China Mexico Cultivated China

JF935335 JF935344 JF935350 JF935322 JF935296 JF935339 AB574797 JF935301 AB574798 JF935311 JF935315 JF935348 JF935297 JF935302 -

JF935356 JF935300 JF935299 JF935355 EF452135 EU024556

JF980679 JF980689 JF980695 JF980684 JF980647 JF980660 JF980663 JF980693 JF980642 JF980648 JF980675 JF980701 JF980646 JF980644 JF980705

83

LAMPIRAN 8. Jarak Genetik Antar Spesimen Sampel berdasarkan Sekuen rbcL No. 1

Nama Jenis

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

 Adiantum sp. AG326

2

JF935296 A. caudatum  

0.013

3

 A. edgeworthii BA742

0.035

0.029

4

AB574798 A. edgeworthii

0.034

0.028

0.001

5

JF935311 A. edgeworthii

0.031

0.031

0.032

0.031

6

 A. philippense WN128

0.038

0.036

0.033

0.032

0.020

7

 A. philippense WN142

0.038

0.036

0.033

0.032

0.020

0.000

8

 A. philippense WN153

0.038

0.036

0.033

0.032

0.020

0.000

0.000

9

 A. philippense SH1130

0.039

0.037

0.034

0.033

0.021

0.001

0.001

0.001

10

 A. hispidulum WN158

0.104

0.105

0.105

0.104

0.090

0.098

0.098

0.098

11

 A. hispidulum WN157

0.103

0.104

0.104

0.103

0.089

0.097

0.097

0.097

0.098

0.003

12

 A. hispidulum BA809

0.103

0.104

0.104

0.103

0.089

0.097

0.097

0.097

0.098

0.003

13

 A. hispidulum WN120

0.104

0.105

0.105

0.104

0.090

0.098

0.098

0.098

0.099

0.000

0.003

0.003

14

 A. hispidulum BA706

0.105

0.106

0.106

0.105

0.091

0.099

0.099

0.099

0.100

0.001

0.004

0.004

0.001

15

 A. hispidulum WN144

0.104

0.105

0.105

0.104

0.090

0.098

0.098

0.098

0.099

0.000

0.003

0.003

0.000

16

 A. raddianum WN111

0.099

0.104

0.102

0.101

0.093

0.097

0.097

0.097

0.098

0.023

0.024

0.024

0.023

17

JF935335 Adiantum sp.

0.101

0.104

0.100

0.099

0.093

0.097

0.097

0.097

0.098

0.023

0.024

0.024

0.023

18

JF935339 A. cuneatum

0.099

0.104

0.102

0.101

0.093

0.097

0.097

0.097

0.098

0.023

0.024

0.024

0.023

19

JF935355 A. tenerum

0.087

0.091

0.094

0.093

0.077

0.093

0.093

0.093

0.094

0.082

0.081

0.081

0.082

20

JF935356 A. princeps

0.083

0.085

0.088

0.087

0.075

0.087

0.087

0.087

0.088

0.083

0.082

0.082

0.083

0.099

0.000

84

LAMPIRAN 8. Lanjutan ... No. 1

Nama Jenis

14

15

16

17

18

19

 Adiantum sp. AG326

2

JF935296 A. caudatum

3

 A. edgeworthii  BA742

4

AB574798 A. edgeworthii

5

JF935311 A. edgeworthii

6

 A. philippense  WN128

7

 A. philippense  WN142

8

 A. philippense  WN153

9

 A. philippense  SH1130

10

 A. hispidulum  WN158

11

 A. hispidulum  WN157

12

 A. hispidulum  BA809

13

 A. hispidulum  WN120

14

 A. hispidulum  BA706

15

 A. hispidulum WN144

0.001

16

 A. raddianum WN111

0.024

0.023

17

JF935335 Adiantum sp.

0.024

0.023

0.010

18

JF935339 A. cuneatum

0.024

0.023

0.000

0.010

19

JF935355 A. tenerum

0.083

0.082

0.082

0.088

0.082

20

JF935356 A. princeps

0.084

0.083

0.082

0.084

0.082

0.029

20

21

22

23

24

25

26

27

85

LAMPIRAN 8. Lanjutan ... No. 1

Nama Jenis  Adiantum sp. AG326

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

0.010

0.011

0.010

0.010

0.010

0.010

0.010

0.009

0.003

0.013

0.012

39 0.013

40 0.012

2

JF935296 A. caudatum

0.010

0.011

0.010

0.009

0.009

0.009

0.009

0.009

0.000

0.013

0.012

0.013

0.012

3

 A. edgeworthii BA742

0.010

0.011

0.010

0.009

0.009

0.009

0.009

0.009

0.005

0.013

0.012

0.013

0.013

4

AB574798 A. edgeworthii

0.010

0.011

0.010

0.009

0.009

0.009

0.009

0.009

0.005

0.013

0.012

0.013

0.013

5

JF935311 A. edgeworthii

0.010

0.010

0.010

0.009

0.009

0.009

0.009

0.008

0.006

0.012

0.011

0.012

0.012

6

 A. philippense WN128

0.010

0.011

0.010

0.010

0.010

0.010

0.010

0.009

0.006

0.012

0.012

0.013

0.013

7

 A. philippense WN142

0.010

0.011

0.010

0.010

0.010

0.010

0.010

0.009

0.006

0.012

0.012

0.013

0.013

8

 A. philippense WN153

0.010

0.011

0.010

0.010

0.010

0.010

0.010

0.009

0.006

0.012

0.012

0.013

0.013

9

 A. philippense SH1130

0.010

0.011

0.010

0.010

0.010

0.010

0.010

0.009

0.006

0.012

0.012

0.013

0.013

10

 A. hispidulum WN158

0.004

0.011

0.004

0.010

0.010

0.010

0.010

0.010

0.010

0.013

0.012

0.012

0.012

11

 A. hispidulum WN157

0.004

0.011

0.004

0.010

0.010

0.010

0.010

0.010

0.010

0.013

0.012

0.012

0.012

12

 A. hispidulum BA809

0.004

0.011

0.004

0.010

0.010

0.010

0.010

0.010

0.010

0.013

0.012

0.012

0.012

13

 A. hispidulum WN120

0.004

0.011

0.004

0.010

0.010

0.010

0.010

0.010

0.010

0.013

0.012

0.012

0.012

14

 A. hispidulum BA706

0.005

0.011

0.004

0.010

0.010

0.010

0.010

0.010

0.010

0.013

0.012

0.012

0.012

15

 A. hispidulum WN144

0.004

0.011

0.004

0.010

0.010

0.010

0.010

0.010

0.010

0.013

0.012

0.012

0.012

16

 A. raddianum WN111

0.005

0.010

0.004

0.009

0.009

0.009

0.009

0.010

0.010

0.012

0.012

0.012

0.012

17

JF935335 Adiantum sp.

0.005

0.010

0.004

0.009

0.009

0.009

0.009

0.010

0.010

0.012

0.012

0.012

0.012

18

JF935339 A. cuneatum

0.005

0.010

0.004

0.009

0.009

0.009

0.009

0.010

0.010

0.012

0.012

0.012

0.012

19

JF935355 A. tenerum

0.009

0.009

0.009

0.008

0.008

0.008

0.008

0.010

0.009

0.012

0.012

0.012

0.012

20

JF935356 A. princeps

0.009

0.008

0.009

0.008

0.008

0.008

0.008

0.009

0.009

0.012

0.012

0.012

0.011

86

LAMPIRAN 8. Lanjutan ... No.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

12

13

21

AB574797 A. diaphanum

Nama Jenis

0.108

0.106

0.104

0.103

0.100

0.105

0.105

0.105

0.106

0.027

10

0.028

11

0.028

0.027

22

JF935301 A. diaphanum

0.108

0.106

0.104

0.103

0.100

0.105

0.105

0.105

0.106

0.027

0.028

0.028

0.027

23

JF935299 A. soboliferum

0.036

0.034

0.033

0.032

0.018

0.003

0.003

0.003

0.004

0.096

0.094

0.094

0.096

24

JF935300 A. sinicum

0.036

0.032

0.028

0.027

0.029

0.031

0.031

0.031

0.032

0.098

0.097

0.097

0.098

25

JF935302 A. mariesii

0.031

0.029

0.038

0.037

0.035

0.044

0.044

0.044

0.045

0.102

0.102

0.102

0.102

26

 A. peruvianum WN119

0.097

0.092

0.096

0.094

0.081

0.093

0.093

0.093

0.094

0.086

0.085

0.085

0.086

27

EF452135 A. tetraphyllum

0.106

0.103

0.109

0.108

0.096

0.104

0.104

0.104

0.105

0.100

0.099

0.099

0.100

28

 A. concinnum WN150

0.101

0.100

0.100

0.099

0.089

0.094

0.094

0.094

0.096

0.020

0.019

0.019

0.020

29

JF935344 Adiantum sp.

0.112

0.113

0.118

0.116

0.103

0.114

0.114

0.114

0.115

0.110

0.109

0.109

0.110

30

JF935350 A. aethiopicum

0.100

0.099

0.099

0.098

0.090

0.096

0.096

0.096

0.097

0.013

0.014

0.014

0.013

31

 A. capillus-veneris WN114

0.097

0.093

0.087

0.086

0.079

0.091

0.091

0.091

0.092

0.090

0.091

0.091

0.090

32

 A. capillus-veneris WN154

0.097

0.093

0.087

0.086

0.079

0.091

0.091

0.091

0.092

0.090

0.091

0.091

0.090

33

JF935322 A. capillus-veneris

0.097

0.093

0.087

0.086

0.079

0.091

0.091

0.091

0.092

0.090

0.091

0.091

0.090

34

JF935348 A. jordanii

0.097

0.093

0.087

0.086

0.079

0.091

0.091

0.091

0.092

0.090

0.091

0.091

0.090

35

JF935315 A. flabellulatum

0.092

0.092

0.082

0.081

0.074

0.083

0.083

0.083

0.084

0.096

0.094

0.094

0.096

36

JF935297 A. malesianum

0.013

0.000

0.029

0.028

0.031

0.036

0.036

0.036

0.037

0.105

0.104

0.104

0.105

37

EU024556 Antrophyum callifolium

0.146

0.146

0.141

0.140

0.133

0.141

0.141

0.141

0.142

0.133

0.136

0.136

0.133

38

 Antrophyum latifolium RS51

0.144

0.142

0.140

0.139

0.130

0.142

0.142

0.142

0.144

0.133

0.136

0.136

0.133

39

Vittaria zosterifolia SO002

0.148

0.151

0.151

0.149

0.144

0.151

0.151

0.151

0.152

0.139

0.139

0.139

0.139

40

Vittaria zosterifolia SO002a

0.142

0.145

0.145

0.144

0.137

0.147

0.147

0.147

0.148

0.140

0.140

0.140

0.140

87

LAMPIRAN 8. Lanjutan ... No.

14

15

16

17

18

19

20

21

AB574797 A. diaphanum

Nama Jenis

0.028

0.027

0.029

0.027

0.029

0.092

0.090

21

22

23

24

25

26

27

22

JF935301 A. diaphanum

0.028

0.027

0.029

0.027

0.029

0.092

0.090

0.000

23

JF935299 A. soboliferum

0.097

0.096

0.094

0.094

0.094

0.091

0.085

0.103

0.103

24

JF935300 A. sinicum

0.099

0.098

0.097

0.099

0.097

0.088

0.088

0.101

0.101

0.031

25

JF935302 A. mariesii

0.103

0.102

0.105

0.105

0.105

0.087

0.087

0.105

0.105

0.042

0.038

26

 A. peruvianum WN119

0.087

0.086

0.086

0.088

0.086

0.061

0.061

0.094

0.094

0.091

0.097

0.098

27

EF452135 A. tetraphyllum

0.101

0.100

0.100

0.104

0.100

0.076

0.077

0.108

0.108

0.104

0.108

0.110

0.039

28

 A. concinnum WN150

0.021

0.020

0.018

0.020

0.018

0.081

0.081

0.030

0.030

0.092

0.094

0.101

0.081

0.097

29

JF935344 Adiantum sp.

0.111

0.110

0.108

0.112

0.108

0.085

0.086

0.116

0.116

0.114

0.118

0.121

0.044

0.028

30

JF935350 A. aethiopicum

0.014

0.013

0.017

0.017

0.017

0.082

0.082

0.021

0.021

0.093

0.096

0.102

0.082

0.098

31

 A. capillus-veneris WN114

0.091

0.090

0.094

0.090

0.094

0.083

0.081

0.097

0.097

0.091

0.087

0.092

0.076

0.091

32

 A. capillus-veneris WN154

0.091

0.090

0.094

0.090

0.094

0.083

0.081

0.097

0.097

0.091

0.087

0.092

0.076

0.091

33

JF935322 A. capillus-veneris

0.091

0.090

0.094

0.090

0.094

0.083

0.081

0.097

0.097

0.091

0.087

0.092

0.076

0.091

34

JF935348 A. jordanii

0.091

0.090

0.094

0.090

0.094

0.083

0.081

0.097

0.097

0.091

0.087

0.092

0.076

0.091

35

JF935315 A. flabellulatum

0.097

0.096

0.098

0.098

0.098

0.086

0.083

0.100

0.100

0.083

0.084

0.099

0.081

0.093

36

JF935297 A. malesianum

0.106

0.105

0.104

0.104

0.104

0.091

0.085

0.106

0.106

0.034

0.032

0.029

0.092

0.103

37

EU024556 Antrophyum callifolium

0.134

0.133

0.132

0.128

0.132

0.132

0.134

0.133

0.133

0.139

0.142

0.137

0.133

0.146

38

 Antrophyum latifolium RS51

0.134

0.133

0.137

0.132

0.137

0.127

0.129

0.137

0.137

0.140

0.144

0.132

0.128

0.142

39

Vittaria zosterifolia SO002

0.140

0.139

0.140

0.137

0.140

0.131

0.136

0.139

0.139

0.148

0.154

0.151

0.141

0.151

40

Vittaria zosterifolia SO002a

0.141

0.140

0.140

0.137

0.140

0.124

0.129

0.142

0.142

0.145

0.148

0.145

0.134

0.146

88

LAMPIRAN 8. Lanjutan ... No.

Nama Jenis

21

AB574797 A. diaphanum diaphanum

22

JF935301 A. diaphanum diaphanum

23

JF935299 A. soboliferum soboliferum

24

JF935300 A. sinicum

25

JF935302 A. mariesii mariesii

26

 A. peruvianum peruvianum  WN119

27

EF452135 A. tetraphyllum tetraphyllum

28

 A. concinnum concinnum  WN150

29

JF935344 Adiantum sp.

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

0.104

30

JF935350 A. aethiopicum aethiopicum

0.013

0.105

31

 A. capillus-veneris capillus-veneris WN114

0.090

0.098

0.086

32

 A. capillus-veneris capillus-veneris WN154

0.090

0.098

0.086

0.000

33

JF935322 A. capillus-veneris capillus-veneris

0.090

0.098

0.086

0.000

0.000

34

JF935348 A. jordanii jordanii

0.090

0.098

0.086

0.000

0.000

0.000

35

JF935315 A. flabellulatum flabellulatum

0.093

0.103

0.091

0.043

0.043

0.043

0.043

36

JF935297 A. malesianum malesianum

0.100

0.113

0.099

0.093

0.093

0.093

0.093

0.092

37

EU024556 Antrophyum  Antrophyum callifolium callifolium

0.134

0.155

0.133

0.129

0.129

0.129

0.129

0.128

0.146

38

 Antrophyum latifolium latifolium RS51

0.137

0.147

0.138

0.130

0.130

0.130

0.130

0.125

0.142

39

Vittaria zosterifolia SO002

0.140

0.152

0.144

0.138

0.138

0.138

0.138

0.136

0.151

0.106

0.104

40

Vittaria zosterifolia SO002a

0.140

0.149

0.144

0.131

0.131

0.131

0.131

0.131

0.145

0.102

0.097

0.032

0.011

40

89

LAMPIRAN 9. Jarak Genetik Antar Spesimen Sampel berdasarkan Sekuen Sek uen trnL-F No.

Nama Jenis

1

2

3

4

5

6

7

8

1

JF980660 A. edgeworthii edgeworthii

2

 A. caudatum WN140

0.067

3

 Adiantum sp. AG326

0.065

0.042

4

JF980648 A. mariesii mariesii

0.087

0.089

0.079

5

JF980642 A. malesianum malesianum

0.065

0.009

0.040

0.091

6

JF980646 A. sinicum

0.040

0.040

0.042

0.069

0.038

7

JF980644 A. soboliferum soboliferum

0.038

0.053

0.063

0.085

0.055

0.040

8

JF980675 A. philippense philippense

0.036

0.059

0.065

0.087

0.061

0.042

0.005

9

JF980689 Adiantum sp.

0.224

0.244

0.234

0.246

0.239

0.217

0.229

0.227

10

JF980663 A. flabellulatum flabellulatum

0.234

0.239

0.234

0.217

0.237

0.210

0.227

0.224

9

10

11

12

13

14

0.234

11

JF980693 A. jordanii jordanii

0.224

0.239

0.229

0.232

0.237

0.208

0.215

0.215

0.234

0.119

12

 A. capillus-veneris capillus-veneris WN154

0.222

0.237

0.227

0.229

0.234

0.205

0.213

0.213

0.232

0.117

0.002

13

 Adiantum sp. WN118

0.264

0.277

0.251

0.284

0.279

0.264

0.264

0.266

0.259

0.319

0.313

0.311

14

 A. raddianum raddianum WN111

0.274

0.290

0.266

0.290

0.292

0.274

0.277

0.279

0.261

0.319

0.322

0.319

0.022

15

 A. raddianum raddianum WN149

0.274

0.290

0.266

0.290

0.292

0.274

0.277

0.279

0.261

0.319

0.322

0.319

0.022

0.000

15

90

LAMPIRAN 9. Lanjutan ... No.

Nama Jenis

16

 A. concinnum concinnum WN150

17

 A. concinnum concinnum WN117

18

 A. concinnum concinnum SH1129

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0.261

0.274

0.249

0.282

0.277

0.261

0.261

0.264

0.256

10

0.261

0.274

0.249

0.282

0.277

0.261

0.261

0.264

0.256

0.316

0.311

0.308

0.002

0.023

0.023

0.261

0.274

0.249

0.282

0.277

0.261

0.261

0.264

0.256

0.316

0.311

0.308

0.002

0.023

0.023

0.316

11 0.311

12

13

14

15

0.308

0.002

0.023

0.023

19

JF980684 A. cuneatum

0.274

0.290

0.266

0.290

0.292

0.274

0.277

0.279

0.261

0.319

0.322

0.319

0.022

0.000

0.000

20

 A. tenerum WN155

0.215

0.244

0.246

0.239

0.241

0.224

0.215

0.213

0.185

0.251

0.259

0.256

0.256

0.266

0.266

21

JF980695 A. aethiopicum aethiopicum

0.269

0.297

0.279

0.300

0.300

0.274

0.274

0.277

0.259

0.327

0.324

0.322

0.036

0.044

0.044

22

JF980701 A. princeps princeps

0.187

0.215

0.208

0.217

0.215

0.187

0.187

0.185

0.151

0.224

0.227

0.224

0.215

0.227

0.227

23

JF980647 A. diaphanum diaphanum

0.274

0.292

0.269

0.297

0.295

0.277

0.274

0.277

0.264

0.319

0.319

0.316

0.040

0.046

0.046

24

 A. diaphanum diaphanum BA754a

0.274

0.292

0.269

0.297

0.295

0.277

0.274

0.277

0.264

0.319

0.319

0.316

0.040

0.046

0.046

25

 A. diaphanum diaphanum WN112

0.274

0.292

0.269

0.297

0.295

0.277

0.274

0.277

0.264

0.319

0.319

0.316

0.040

0.046

0.046

26

 A. edgeworthii edgeworthii BA742

0.061

0.065

0.067

0.087

0.063

0.038

0.065

0.067

0.237

0.222

0.222

0.220

0.274

0.284

0.284

27

JF980679 Adiantum sp.

0.269

0.284 0. 284

0.261

0.290

0.287

0.269

0.271

0.274

0.266

0.319

0.327

0.324

0.022

0.011

0.011

28

 A. hispidulum hispidulum BA706

0.269

0.292

0.269

0.292

0.295

0.274

0.274

0.277

0.254

0.324

0.316

0.313

0.025

0.033

0.033

29

 A. hispidulum hispidulum BA809

0.274

0.297

0.274

0.297

0.300

0.279

0.279

0.282

0.259

0.324

0.322

0.319

0.022

0.029

0.029

30

 A. hispidulum hispidulum WN144

0.271

0.295

0.271

0.295

0.297

0.277

0.277

0.279

0.256

0.322

0.319

0.316

0.023

0.031

0.031

91

LAMPIRAN 9. Lanjutan ... No.

Nama Jenis

16

17

18

19

20

21

22

23

24

16

 A. concinnum  WN150

17

 A. concinnum WN117

0.000

18

 A. concinnum SH1129

0.000

0.000

19

JF980684 A. cuneatum

0.023

0.023

0.023

20

 A. tenerum WN155

0.254

0.254

0.254

0.266

21

JF980695 A. aethiopicum

0.038

0.038

0.038

0.044

0.266

22

JF980701 A. princeps

0.213

0.213

0.213

0.227

0.075

0.224

23

JF980647 A. diaphanum

0.042

0.042

0.042

0.046

0.277

0.042

0.234

24

 A. diaphanum BA754a

0.042

0.042

0.042

0.046

0.277

0.042

0.234

25

 A. diaphanum WN112

0.042

0.042

0.042

0.046

0.277

0.042

0.234

0.000

0.000

26

 A. edgeworthii BA742

0.271

0.271

0.271

0.284

0.246

0.284

0.203

0.284

0.284

25

26

27

28

29

0.000

0.284

27

JF980679 Adiantum sp.

0.023

0.023

0.023

0.011

0.266

0.044

0.224

0.048

0.048

0.048

0.279

28

 A. hispidulum BA706

0.027

0.027

0.027

0.033

0.256

0.035

0.208

0.038

0.038

0.038

0.284

0.033

29

 A. hispidulum BA809

0.023

0.023

0.023

0.029

0.261

0.035

0.213

0.038

0.038

0.038

0.290

0.029

0.005

30

 A. hispidulum WN144

0.025

0.025

0.025

0.031

0.259

0.036

0.213

0.040

0.040

0.040

0.287

0.031

0.005

0.004

30

92

LAMPIRAN 9. Lanjutan ... No.

Nama Jenis

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

31

 A. hispidulum WN120

0.271

0.295

0.271

0.295

0.297

0.277

0.277

0.279

0.256

0.322

0.319

0.316

0.023

0.031

0.031

32

 A. hispidulum WN158

0.271

0.295

0.271

0.295

0.297

0.277

0.277

0.279

0.256

0.322

0.319

0.316

0.023

0.031

0.031

33

 A. hispidulum WN157

0.274

0.297

0.274

0.297

0.300

0.279

0.279

0.282

0.259

0.324

0.322

0.319

0.022

0.029

0.029

34

 A. hispidulum WT797

0.274

0.297

0.274

0.297

0.300

0.279

0.279

0.282

0.259

0.324

0.322

0.319

0.022

0.029

0.029

35

 A. silvaticum BA808

0.266

0.290

0.266

0.295

0.292

0.274

0.271

0.274

0.269

0.316

0.303

0.300

0.038

0.044

0.044

36

 A. silvaticum Drapemmu103

0.266

0.290

0.266

0.295

0.292

0.274

0.271

0.274

0.269

0.316

0.303

0.300

0.038

0.044

0.044

37

 A. polyphyllum WN116

0.220

0.237

0.232

0.244

0.232

0.215

0.229

0.227

0.081

0.246

0.239

0.237

0.234

0.241

0.241

38

 A. trapeziforme AG329

0.237

0.251

0.246

0.259

0.246

0.229

0.241

0.239

0.089

0.259

0.249

0.246

0.246

0.254

0.254

39

 A. peruvianum WN119

0.227

0.244

0.239

0.251

0.239

0.222

0.237

0.234

0.083

0.254

0.241

0.239

0.234

0.241

0.241

40

 Antrophyum latifolium RS51

0.644

0.624

0.628

0.632

0.628

0.636

0.636

0.628

0.596

0.600

0.608

0.612

0.620

0.608

0.608

41

 Antrophyum callifolium DEE37

0.649

0.624

0.628

0.624

0.628

0.632

0.640

0.632

0.604

0.616

0.616

0.620

0.600

0.588

0.588

42

 Antrophyum callifolium SH1163

0.649

0.624

0.628

0.624

0.628

0.632

0.640

0.632

0.604

0.616

0.616

0.620

0.600

0.588

0.588

43

 Antrophyum callifolium WN146

0.653

0.632

0.624

0.616

0.636

0.636

0.644

0.636

0.620

0.620

0.608

0.612

0.616

0.608

0.608

44

 Antrophyum sp. RS54

0.666

0.632

0.636

0.636

0.636

0.644

0.649

0.640

0.616

0.612

0.604

0.608

0.620

0.616

0.616

45

JF980705 Vittaria sp.

0.624

0.596

0.592

0.588

0.600

0.596

0.624

0.616

0.565

0.592

0.596

0.592

0.572

0.584

0.584

93

LAMPIRAN 9. Lanjutan ... No.

Nama Jenis

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

 A. hispidulum WN120

0.025

0.025

0.025

0.031

0.259

0.036

0.213

0.040

0.040

0.040

0.287

0.031

0.005

0.004

0.000

32

 A. hispidulum WN158

0.025

0.025

0.025

0.031

0.259

0.036

0.213

0.040

0.040

0.040

0.287

0.031

0.005

0.004

0.000

33

 A. hispidulum WN157

0.023

0.023

0.023

0.029

0.261

0.035

0.213

0.038

0.038

0.038

0.290

0.029

0.005

0.000

0.004

34

 A. hispidulum WT797

0.023

0.023

0.023

0.029

0.261

0.035

0.213

0.038

0.038

0.038

0.290

0.029

0.005

0.000

0.004

35

 A. silvaticum BA808

0.040

0.040

0.040

0.044

0.269

0.042

0.227

0.033

0.033

0.033

0.279

0.046

0.036

0.036

0.038

36

 A. silvaticum Drapemmu103

0.040

0.040

0.040

0.044

0.269

0.042

0.227

0.033

0.033

0.033

0.279

0.046

0.036

0.036

0.038

37

 A. polyphyllum WN116

0.232

0.232

0.232

0.241

0.187

0.244

0.147

0.246

0.246

0.246

0.227

0.237

0.241

0.237

0.234

38

 A. trapeziforme AG329

0.244

0.244

0.244

0.254

0.192

0.256

0.156

0.259

0.259

0.259

0.239

0.254

0.254

0.249

0.246

39

 A. peruvianum WN119

0.232

0.232

0.232

0.241

0.189

0.244

0.153

0.246

0.246

0.246

0.234

0.241

0.241

0.237

0.234

40

 Antrophyum latifolium RS51

0.624

0.624

0.624

0.608

0.584

0.624

0.565

0.608

0.608

0.608

0.632

0.608

0.616

0.612

0.608

41

 Antrophyum callifolium DEE37

0.604

0.604

0.604

0.588

0.576

0.596

0.557

0.604

0.604

0.604

0.624

0.588

0.596

0.592

0.588

42

 Antrophyum callifolium SH1163

0.604

0.604

0.604

0.588

0.576

0.596

0.557

0.604

0.604

0.604

0.624

0.588

0.596

0.592

0.588

43

 Antrophyum callifolium WN146

0.620

0.620

0.620

0.608

0.580

0.624

0.569

0.624

0.624

0.624

0.624

0.608

0.616

0.612

0.608

44

 Antrophyum sp. RS54

0.624

0.624

0.624

0.616

0.576

0.632

0.572

0.636

0.636

0.636

0.632

0.616

0.624

0.620

0.616

45

JF980705 Vittaria sp.

0.576

0.576

0.576

0.584

0.539

0.596

0.521

0.588

0.588

0.588

0.604

0.584

0.580

0.580

0.580

94

LAMPIRAN 9. Lanjutan ... No.

Nama Jenis

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

31

 A. hispidulum  WN120

32

 A. hispidulum WN158

33

 A. hispidulum WN157

0.004

0.004

34

 A. hispidulum WT797

0.004

0.004

35

 A. silvaticum BA808

0.038

0.038

0.036

0.036

36

 A. silvaticum Drapemmu103

0.038

0.038

0.036

0.036

0.000

37

 A. polyphyllum WN116

0.234

0.234

0.237

0.237

0.249

0.249

38

 A. trapeziforme AG329

0.246

0.246

0.249

0.249

0.259

0.259

0.018

39

 A. peruvianum WN119

0.234

0.234

0.237

0.237

0.249

0.249

0.009

0.009

40

 Antrophyum latifolium RS51

0.608

0.608

0.612

0.612

0.620

0.620

0.580

0.584

0.576

41

 Antrophyum callifolium DEE37

0.588

0.588

0.592

0.592

0.600

0.600

0.576

0.580

0.572

0.057

42

 Antrophyum callifolium SH1163

0.588

0.588

0.592

0.592

0.600

0.600

0.576

0.580

0.572

0.057

0.000

43

 Antrophyum callifolium WN146

0.608

0.608

0.612

0.612

0.620

0.620

0.588

0.592

0.584

0.059

0.044

0.044

44

 Antrophyum sp. RS54

0.616

0.616

0.620

0.620

0.628

0.628

0.596

0.600

0.592

0.063

0.055

0.055

0.038

45

JF980705 Vittaria sp.

0.580

0.580

0.580

0.580

0.600

0.600

0.546

0.550

0.546

0.259

0.277

0.277

0.264

44

0.000

0.000

0.277

45

95

LAMPIRAN 10. Susunan Sekuen trnL-F pada Masing-Masing Sampel Adiantum No.

Nama Jenis

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22.

 Adiantum sp.  Adiantum sp.  A. capillus-veneris  A. capillus-veneris  A. caudatum  A. concinnum  A. concinnum  A. concinnum  A. diaphanum  A. diaphanum  A. edgeworthii  A. hispidulum  A. hispidulum  A. hispidulum  A. hispidulum  A. hispidulum  A. hispidulum  A. hispidulum  A. peruvianum  A. philippense  A. philippense  A. philippense

Kode

WN 118 AG 326 WN 114 WN 154 WN 140 WN 117 SH 1129 WN150 WN 112 BA 754a BA 742 BA 809 WT 797 WN 157 WN 120 WN144 WN 158 BA 706 WN 119 WN 128 WN 142 SH 1130

 trnL-F 1 - 926 1 - 924 1 - 814 1 - 898 1 - 913 1 - 923 1 - 966 1 - 868 1 - 949 1 - 843 1 - 901 1 - 852 1 - 858 1 - 934 1 - 906 1 - 910 1 - 900 1 - 858 -

Intron trnL

1 - 574 1 - 562 1 - 494 1 - 550 1 - 550 1 - 549 1 - 595 1 - 489 1 – 580 1 - 487 1 - 525 1 - 499 1 - 505 1 - 562 1 - 526 1 - 530 1 - 524 1 - 514 -

 trnL 3’ ekson Basa Nukleotida ke575 - 621 563 - 609 495 - 541 551 - 597 551 - 597 550 - 596 596 - 642 490 - 536 581 - 627 488 - 534 526 - 572 500 - 546 506 - 552 563 - 609 527 - 573 531 - 577 525 - 571 515 - 561 -

 trnL-F IGS 622 - 926 610 - 924 542 - 814 598 - 898 598 - 913 597 - 923 643 - 966 537 - 868 628 - 949 535 - 843 573 - 901 547 - 852 552 - 858 610 - 934 574 - 906 577 - 910 572 - 900 562 - 858 -