UJI
FIKSASI
KOMPLEMEN
Telah diketahui bahwa pada suatu interaksi antigen-antibodi, komplemen yang ada dalam serum dapat diikat atau dikonsumsi oleh kompleks antigen-antibodi tersebut, dan bahwa komplemen dapat diaktivasi oleh kompleks erithrosit-hemolisin, sehingga mengakibatkan eritrosit
tersebut
melisis.
Kenyataan ini dipakai untuk menggunakan komplemen sebagai salah satu bahan untuk penetapan antigen maupun antibodi. Pengujian ini didasarkan atas reaksi yang terdiri atas 2 tahap, yaitu tahap pertama dimana sejumlah tertentu komplemen oleh suatu kompleks antigen-antibodi,
dan
tahap
kedua
dimana
komplemen
yang
tersisa
(bila
ada)
menghancurkan eritrosit yang telah dilapisi hemolisin. Banyaknya komplemen yang tidak dikonsumsi pada reaksi tahap pertama, dan yang mengakibatkan hemolisis pada reaksi tahap kedua, secara tidak langsung merupakan parameter untuk antibodi atau antigen yang diperiksa. Untuk mendapatkan hasil yang bisa dipercaya, semua reaktan yang diperlukan untuk uji ini harus disesuaikan satu dengan yang lain dan berada dalam jumlah atau titer yang optimal. Oleh karena itu sebelum melaksanakan pemeriksaan pada sampel penderita, terlebih dahulu dilakukan uji pendahuluan untuk menstandarisasi titer hemolisin dan titer komplemen yang dipakai
pada
sistem
uji
ini.
Titer hemolisin ditentukan oleh pengenceran tertinggi hemolisin yang masih dapat melisiskan eritrosit berkonsentrasi 2% secara lengkap, bila ada komplemen. Titer hemolisin ini
disebut
1
unit
dan
untuk
pemeriksaan
sampel
penderita
dipakai
2
unit.
Oleh karena uji fiksasi komplemen melibatkan suatu sistem yang terdiri atas berbagai reaktan, disamping titrasi hemolisin dan komplemen diatas, setiap reaktan harus diuji terhadap ada tidaknya faktor penghambat atau faktor yang meningkatkan aktivasi komplemen (antikomplemen atau prokomplemen). Untuk keperluan ini, pada titrasi komplemen diikutsertakan antigen dan antigen kontrol, serta pada pemeriksaan sampel
selalu harus diikutsertakan kontrol serum positif maupun negatif. Suatu hasil pemeriksaan, baru bisa dipercaya apabila semua reaktan pada sistem ini terkontrol dengan baik. Uji fiksasi komplemen dipakai pertama kali oleh Wassermann, Neisser dan Bruck untuk menentukan diagnosis Sifilis (Test Wassermann), akan tetapi kemudian prinsip pengujian yang sama dipakai juga dalam diagnosis serologik berbagai penyakit lain, diantaranya penyakit-penyakit yang disebabkan oleh parasit, seperti Trypanosoma, Schistosoma, serta penyakit-penyakit yang disebabkan oleh virus, seperti virus Hepatitis B, Herpes, Rotavirus, Rubella
Uji
Fiksasi
dan
Komplemen
Peralatan
dan
1.
yang
Peralatan
untuk
bahan dipakai
penetapan yang
sama
lain-lain.
seperti
antibodi
diperlukan untuk
teknik
terhadap (cara
virus mikro)
mikrohemaglutinasi
2. Kit reagens (Behring) terdiri atas antigen virus, komplemen, eritrosit domba, hemolisin dan
larutan
Cara
penyangga.
kerja
I.
Uji
1.
Titrasi
:
Pendahuluan hemolisin
a. Sediakan 9 tabung reaksi. Masukkan kedalam tabung pertama dan seterusnya larutan penyangga
dengan
volume
seperti
pada
gambar.
b. Masukkan 1,0 ml hemolisin yang telah diencerkan 1:100 kedalam tabung pertama, lalu campur kemudian pindahkan 1 ml kedalam tabung berikutnya, demikian seterusnya hingga tabung
terakhir.
c. Sediakan 12 tabung, kemudian kedalam 9 tabung pertama dimasukkan masing-masing 0,2
selalu harus diikutsertakan kontrol serum positif maupun negatif. Suatu hasil pemeriksaan, baru bisa dipercaya apabila semua reaktan pada sistem ini terkontrol dengan baik. Uji fiksasi komplemen dipakai pertama kali oleh Wassermann, Neisser dan Bruck untuk menentukan diagnosis Sifilis (Test Wassermann), akan tetapi kemudian prinsip pengujian yang sama dipakai juga dalam diagnosis serologik berbagai penyakit lain, diantaranya penyakit-penyakit yang disebabkan oleh parasit, seperti Trypanosoma, Schistosoma, serta penyakit-penyakit yang disebabkan oleh virus, seperti virus Hepatitis B, Herpes, Rotavirus, Rubella
Uji
Fiksasi
dan
Komplemen
Peralatan
dan
1.
yang
Peralatan
untuk
bahan dipakai
penetapan yang
sama
lain-lain.
seperti
antibodi
diperlukan untuk
teknik
terhadap (cara
virus mikro)
mikrohemaglutinasi
2. Kit reagens (Behring) terdiri atas antigen virus, komplemen, eritrosit domba, hemolisin dan
larutan
Cara
penyangga.
kerja
I.
Uji
1.
Titrasi
:
Pendahuluan hemolisin
a. Sediakan 9 tabung reaksi. Masukkan kedalam tabung pertama dan seterusnya larutan penyangga
dengan
volume
seperti
pada
gambar.
b. Masukkan 1,0 ml hemolisin yang telah diencerkan 1:100 kedalam tabung pertama, lalu campur kemudian pindahkan 1 ml kedalam tabung berikutnya, demikian seterusnya hingga tabung
terakhir.
c. Sediakan 12 tabung, kemudian kedalam 9 tabung pertama dimasukkan masing-masing 0,2
ml larutan hemolisin dari tabung-tabung permulaan. Tabung 10-12 dipakai untuk kontrol erithrosit. d. Kedalam tabung 1-9 dimasukkan 0,1 ml komplemen yang sudah diencerkan 1:30, 0,2 ml suspensi
eritrosit
2%
dan
0,5
ml
larutan
penyangga.
e. Kedalam tabung 10-12 masukkan 0,2 ml suspensi eritrosit 2% dan 0,8 ml larutan penyangga. f. Campur lalu inkubasikan tabung-tabung tersebut pada suhu 37OC selama 30 menit. g. Perhatikan adanya hemolisis dan tentukan tabung dengan pengenceran hemolisis tertinggi yang menyebabkan hemolisis lengkap. Pengenceran ini disebut 1 unit dan untuk pemeriksaan
sampel
h.
Pembuatan
penderita
dipakai
2
sistem
unit. hemolitik
Campur eritrosit 2% sama banyak dengan hemolisin yang titernya 2 unit. Biarkan dalam suhu kamar
selama
minimal
2.
10
menit
sebelum
Titrasi
dipakai.
Komplemen
a. Sediakan 3 baris tabung yang jumlahnya masing-masing 8 buah. Kedalam tabung-tabung baris I masukkan larutan penyangga, komplemen dan larutan antigen, lalu campur b. Lakukan hal yang sama pada tabung baris ke II dan ke III, hanya sebagai pengganti antigen, kedalam tabung baris II dimasukkan antigen kontrol dan kedalam tabung baris ke III dimasukkan
larutan
penyangga.
c. Inkubasikan semua tabung dalam penangas air dengan suhu 37OC selama 30 menit. d. Masukkan sistem hemolitik (1h) kedalam semua tabung sebanyak 0,2 ml. Campur dan inkubasikan
lagi
pada
suhu
37OC
selama
30
menit.
e. Perhatikan hemolisis yang terjadi dan tentukan pengenceran komplemen tertinggi yang menyebabkan hemolisis lengkap. Apabila hemolisis lengkap pada ketiga baris tabung terjadi pada pengenceran komplemen yang sama, berarti semua reaktan pada sistem ini baik.
f. Pengenceran tertinggi komplemen yang dapat menyebabkan hemolisis lengkap disebut 1 unit
dan
dipakai
2
II.
unit
untuk
pengujian.
Pemeriksaan
sampel
Pada setiap pemeriksaan selalu harus diikutsertakan kontrol antigen, kontrol sistem hemolitik,
kontrol
eritrosit
dan
kontrol
komplemen.
Serum penderita terlebih dahulu diinaktifkan dalam penangas air dengan suhu 56OC untuk menghilangkan komplemen yang ada dalam serum, sehingga satu-satunya sumber komplemen
hanya
yang
dibubuhkan
pada
pengujian
dan
diketahui
1.
titernya.
Sampel
Pakai satu baris sumur untuk sampel pertama (sampel akut) dan satu baris lain untuk sampel kedua
(konvalesen).
a. Masukkan ke dalam sumur 1 dan sumur 4-12 larutan penyangga sebanyak 25 ul. b. Masukkan ke dalam sumur 1-4 sampel yang terlebih dahulu telah diencerkan 1:5 sebanyak 25 c.
ul. Buat
pengenceran
serum
mulai
sumur
4
sampai
12
dengan
mikrodiluter.
d. Masukkan kedalam sumur 2, sebanyak 25 ul antigen kontrol dan ke dalam sumur 3-12 sebanyak
25
ul
antigen
virus
(2
unit).
e. Campur, kemudian masukkan kedalam sumur 1-2 komplemen 2 unit sebanyak 25 ul, lalu campur
lagi.
2. Pakailah
Kontrol satu
antigen baris
sumur.
a. Masukkan ke dalam sumur 1 dan 4-12 larutan penyangga sebanyak 25 ul. b. Masukkan kedalam sumur 1-4 serum kontrol positif yang telah diencerkan 1:5 sebanyak
25 ul, dan ke dalam sumur 11-12 serum kontrol negatif yang telah diencerkan 1:5 sebanyak 25 c.
ul. Buat
pengenceran
serum
mulai
sumur
10
dengan
mikrodiluter.
d. Ke dalam sumur 2-12 dimasukkan 25 ul antigen virus (2 unit) kemudian campur. e. Masukkan ke dalam sumur 1-12 komplemen (2 unit) sebanyak 25 ul, kemudian campur (kocok
dengan
3.
Kontrol
alat
pengocok).
sistem
hemolitik
Pakailah baris terakhir untuk kontrol sistem hemolitik, eritrosit dan komplemen dengan prosedur
seperti
yang
diuraikan
dibawah
ini
:
Masukkan ke dalam sumur 1 dan 2 larutan penyangga sebanyak 50 ul dan komplemen sebanyak
25
4.
ul.
Kontrol
eritrosit
Masukkan ke dalam sumur 3 dan 4 larutan penyangga sebanyak 75 ul dan sistem hemolitik sebanyak
50
5.
ul.
Kontrol
komplemen
a. Masukkan ke dalam sumur 5-12 larutan penyangga sebanyak 25 ul, ke dalam sumur 5-8 antigen virus sebanyak 25 ul dan kedalam sumur 9-12 antigen kontrol sebanyak 25 ul. b. Buat pengenceran komplemen dalam tabung terpisah sehingga memperoleh larutan komplemen
2
unit,
1,5
unit,
1,0
unit
dan
0,5
unit.
c. Masukkan ke dalam sumur 5 dan 9 komplemen 2 unit sebanyak 25 ul, ke dalam sumur 6 dan 10 komplemen 1,5 unit sebanyak 25 ul, ke dalam sumur 7 dan 11 komplemen 1,0 unit sebanyak 25 ul dan ke dalam sumur 8 dan 12 komplemen 0,5 unit sebanyak 25 ul. d.
Campurlah
reaktan
dalam
setiap
sumur.
6. Plate ditutup dengan plate lain kemudian diinkubasikan pada suhu 4-6OC selama 18 jam dalam
kotak
yang
lembab
(diberi
kain
basah).
7. Keesokkan harinya, biarkan plate dalam suhu kamar selama 15 menit, kemudian masukkan
8.
ssitem
Kocok,
lalu
hemolitik
inkubasikan
ke
pada
suhu
dalam
37OC
semua
selama
sumur.
15-30
menit.
9. Reaksi dianggap selesai bila telah timbul hemolisis lengkap dalam sumur yang berisi komplemen 2 dan 1,5 unit, hemolisis tak lengkap dalam sumur berisi komplemen 1 unit dan tidak
ada
hemolisis
dalam
sumur
berisi
komplemen
0,5
unit.
10. Perhatikan hemolisis yang terjadi pada sumur-sumur berisi sampel dan nyatakan pengenceran
tertinggi
sampel
yang
tidak
menyebabkan
hemolisis.
Penafsiran 1. Adanya reaksi positif (tidak ada hemolisis) berarti dalam serum terdapat antibodi terhadap
virus
bersangkutan.
2. Titer antibodi dalam serum tunggal belum memastikan apakah ada infeksi atau pernah divaksinasi. 3. Untuk mengetahui adanya infeksi diperlukan pemeriksaan serum ganda, yaitu 2 sampel yang diperoleh pada masa akut dan masa konvalesen dengan jarak waktu 2 minggu. Suatu kenaikan
titer
sebanyak
4
kali
merupakan
indikasi
adanya
infeksi.
4. Reaksi positif pada kontrol antigen berarti dalam serum antibodi terhadap zat-zat nonspesifik yang menyertai antigen. Untuk memastikan, titrasi terhadap serum diulang
dengan menggunakan kedua jenis antigen secara paralel. Adanya antibodi spesifik dapat dipastikan bila titernya terhadap antigen virus 4 kali titer terhadap antigen kontrol. 5. Serum kontrol yang diperoleh dari binatang, kadang-kadang mengandung antibodi terhadap antigen kontrol hingga dapat menimbulkan hemolisis.
alice athecnthe Selasa, 13 Desember 2011
UJI SEROLOGIS KHUSUS ELISA
ELISA ( Enzyme-linked immunosorbent assay) atau 'penetapan kadar imunosorben taut-
enzim' merupakan uji serologis yang umum digunakan di berbagai laboratorium imunologi. Uji ini memiliki beberapa keunggulan seperti teknik pengerjaan yang relatif sederhana, ekonomis, dan memiliki sensitivitas yang cukup tinggi. ELISA diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall untuk menganalisis adanya interaksi antigen dengan antibodi di dalam suatu sampel dengan menggunakan enzim sebagai pelapor (reporter label ).
Umumnya ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu competitive assay yang menggunakan konjugat antigen – enzim atau konjugat antobodi – enzim, dan noncompetitive assay yang menggunakan dua antibodi. Pada ELISA non-competitive assay, antibodi kedua akan dikonjugasikan dengan enzim sebagai indikator. Teknik kedua ini seringkali disebut sebagai "Sandwich" ELISA.
Uji ini dilakukan pada plate 96-well berbahan polistirena. Untuk melakukan teknik "Sandwich" ELISA ini, diperlukan beberapa tahap yang meliputi:
Well dilapisi atau ditempeli antigen. Sampel (antibodi) yang ingin diuji ditambahkan. Ditambahkan antibodi kedua yang dikonjugasikan dengan enzim tertentu seperti peroksidase alkali. Antibodi kedua ini akan menempel pada antibodi sampel sebelumnya. Dimasukkan substrat enzim yang dapat menimbulkan warna tertentu saat bereaksi. Intensitas warna campuran diukur dengan spektrofotometer yang disebut ELISA reader hingga mendapatkan hasil berupa densitas optis (OD). Dengan menghitung rata-rata kontrol negatif yang digunakan, didapatkan nilai cut-off untuk menentukan hasil positif-negatif suatu sampel. Hasil OD yang berada di bawah nilai cut-off merupakan hasil negatif, dan demikian juga sebaliknya.
Uji ini memiliki beberapa kerugian, salah satu di antaranya adalah kemungkinan yang besar terjadinya hasil false positive karena adanya reaksi silang antara antigen yang satu dengan antigen lain. Hasil berupa false negative dapat terjadi apabila uji ini dilakukan pada window period , yaitu waktu pembentukan antibodi terhadap suatu virus baru dimulai sehingga jumlah antibodi tersebut masih sedikit dan kemungkinan tidak dapat terdeteksi 1. Pengujian Secara Serologi (ELISA) 1.1 Secara langsung (baku) (Double Antibody Sandwich) (DAS ELISA)
Dalam uji ini digunakan konjugat gamma globulin murni dari antibody virus yang telah dilabel dengan enzim. Konjugat ini hanya dapat digunakan untuk virus tertentu saja. Cara kerja
Gamma globulin (pengenceran yang telah disiapkan) dimasukkan ke dalam sumur-sumur cawan elisa, masing-masing sebanyak 100-200 ul. Selanjutnya diinkubasikan selama 1 – 2 jam pada suhu 37oC, lalu buang larutannya dan cawan ELISA dibilas dengan PBST sebanyak 3 kali, masing-masing 3 menit. Contoh antigen (dilarutkan dalam PBST + PVP atau ekstrak buffer) dimasukkan ke dalam sumur-sumur cawan ELISA, masing-masing 100 – 200 ul. Inkubasikan selama 1 – 2 jam pada suhu 37oC. Lalu buang larutannya dan cawan Elisa dibilas kembali dengan PBST sebanyak 3 kali, masing-masing selama 3 menit. Enzim konjugat yang telah dlarutkan dengan konjugat buffer dengan perbandingan tertantu dimasukkan dalam lubang-lubang cawan masing-masing sebanyak 100 – 200 ul. Inkubasikan selama 1 – 2 jam pada suhu 37oC. Lalu buang larutannya dan cawan Elisa dibilas kembali dengan PBST sebanyak 3 kali, masing-masing selama 3 menit. Siapkan substrat buffer kemudian larutkan PNPP ke dalamnya dengan perbandingan 1:1 (ul/ml), masukkan larutan tadi kedalam lubang-lubang cawan Elisa sebanyak 150 – 200 ul. Inkubasikan cawan Elisa pada suhu kamar. Lihat perubahan warnanya setelah 30 – 60 menit. Pembacaan dapat dilakukan secara langsung (visual) atau dengan Elisa Reader. 1.2 Secara tidak langsung (Double Antigen Coating/DAC)
Cara pengujian tidak langsung digunakan konjugat gamma globulin dari serum darah hewan(kelinci, kambing atau mencit) yang telah dilabel dengan enzim. Konjugat ini dapat digunakan untuk mendeteksi semua virus tanaman. Cara Kerja :
Sap antigen dilarutkan dalam coating buffer dengan perbandingan 1:50 atau lebih Larutan tersebut dimasukkan ke dalam lubang-lubang cawan Elisa, masing-masing sebanyak 100 ul. inkubasikan selama 1 jam pada suhu 37oC, lalu buanglah larutannya dan cawan Elisa dibilas dengan PBS-Tween sebanyak 3 kali, masing-masing selama 3 menit. Antiserum (dilarutkan dalam konjugat buffer) dimasukkan ke dalam lubang-lubang cawan Elisa, masing-masing sebanyak 100 ul. Inkubasikan selama 1 jam pada suhu 37oC. Lalu lakukanlah tahap kerja ke-2 Konjugat (anti rabbit FC gamma globulin + alkalin phospatase) dimasukkan masingmasing sebanyak 100 ul. Inkubasikan selama 1 jam pada suhu 37oC, lalu lakukan tahap kerja ke-2. Substrat (sama seperti pada uji Elisa baku) dimasukkan ke dalam lubang-lubang cawan Elisa, masing-masing sebanyak 100 ul. inkubasikan cawan Elisa pada suhu kamar selama 15 – 30 menit. Pembacaan dapat langsung (warna kuning yang timbul) atau dengan menggunakan ELISA Reade Aplikasi ELISA
ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodI dalam suatu sampel, karenanya
merupakan
konsentrasi
antibodi
metode
yang
sangat
berguna
untuk
mendeterminasi
dalam serum (seperti dalam tes HIV), dan juga untuk
mendeteksi kehadiran antigen. Metode ini juga bisa diaplikasikan dalam indiustri makanan untuk mendeteksi allergen potensial dalam makanan seperti susu, kacang,
walnut, almond, dan telur. ELISA juga dapat digunakan dalam bidang toksikologi untuk uji pendugaan cepat pada berbagai kelas obat. Beberapa Tipe ELISA
A. Indirect ELISA Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi konsentrasi antibodi dalam serum adalah: 1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji. 2. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting , seperti bovine serum albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. Tahap ini dikenal sebagai blocking , karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate. 3. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar. 4. Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.
5. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim. 6. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak t erikat. 7. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia. 8. Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia lainnya. Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya nonspesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada permukaan lubang. Mekanisme indirect ELISA dapat dilihat pada gambar di bawah ini.
2. Sandwich ELISA Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut: Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi ‘penangkap’ Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak t erikat Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan antigen Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan dengan antibodi primer Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/ berfluoresensi/ elektrokimia Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen
Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya menguji sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi. Prinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini:
3. ELISA kompetitif Tahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah dibahas sebelumnya, yaitu: Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi antigen
Plate dicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel, semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan lubang, karena inilah disebut kompetisi Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer. Antibodi sekunder ini berpasangan dengan enzim Substrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik/ fluoresensi. Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin lemah sinyal yang dihasilkan. Prinsip kerjanya dapat dilihat pada gambar berikut ini:
Diposkan oleh yurnima sari di 20.32 Kirimkan Ini lewat EmailBlogThis!Berbagi ke TwitterBerbagi ke Facebook
Tidak ada komentar: Poskan Komentar
Posting Lebih Baru Beranda Langganan: Poskan Komentar (Atom)
Pengikut
Mengenai Saya Arsip Blog ▼
2011 (3)
▼
Desember (3)
Aku HIDUP BUKAN Hanya untuk MENUNGGU yurnima sari
Mu SEPERTI IN... dreams never come true if you don't believe in Pengenalan blog yourself,,,,, @^_ UJI SEROLOGIS KHUSUS ELISA Lihat profil lengkapku
Template Travel. Gambar template oleh rocksunderwater. Diberdayakan oleh Blogger.
PENDIDIKAN,KESEHATAN DAN BIOTEKNOLOGI KEDOKTERAN Pendidikan dan Kesehatan merupakan hal yang sangat penting, karena itu kami tampilkan beberapa hal yang berkaitan dengan pendidikan terutama di bidang Laboratorium Kesehatan. Serta hal-hal yang menyangkut masalah penyakit infeksi yang disebabkan oleh Mikroba atau parasit Senin, 20 Desember 2010 Imunodiagnostik dan Serologi Pada Infeksi Mikroba Pada laboratorium mikrobilogi klinik, pembiakan mikroorganismee dari specimen pasien masih merupakan metoda yang digunakan untuk penyakit infeksi. Pada tahun 1940 dan 1950an dikembangkan teknik serologi seperti teknik Oudin dan imunodifusi Ouchterlony. Kemudian setelah itu mulai berkembang metode lain yang didasarkan kepada konsep immunologi, seperti fiksasi komplemen, yang diperkenalkan sebagai metode yang dapat menentukan respon imun seseorang terhadap infeksi. Pemeriksaan seperti radioimmunoassay, enzyme assays dan teknik hibridoma meningkatkan peranan pemeriksaan serologis untuk penyakit infeksi.
Respon imun spesifik secara sederhana dibagi dalam 2 kategori yaitu: respon yang dimediasi oleh sel dan respon yang dimediasi oleh antibodi. Respon imun yang dimediasi oleh sel dibawakan oleh sel limfosit T. Limfosit T berproliferasi dan berdifferensiasi menjadi beragam sel efektor, termasuk sel T helper dan sel T sitotoksik. Sel T sitotoksik secara spesifik menyerang dan membunuh mikroorganismee pada sel hospes yang rusak atau karena terinfeksi pathogen. Sel T helper memproduksi sitokin, sitokin merangsang pematangan sel B sehingga sel B memproduksi antibodi yang mampu membunuh organisme yang mengifeksi. Respon imun yang dimediasi oleh antibodi adalah merupakan protein spesifik yang dihasilkan oleh limfosit B. karena protein bersifat menimbulkan reaksi fungsi imunologis dan memiliki struktur globular pada keadaan aktif maka disebut juga immunoglobulin. Antibodi disekresikan ke dalam darah atau cairan limpa (kadangkala pada cairan tubuh lainnya) oleh sel B limfosit, atau tetap melekat pada permukaan sel limfosit atau sel lain. Karena sel yang terlibat dalam kategori respon imun ini berada dalam sirkulasi darah, tipe imunitas seperti ini disebut juga imunitas humoral. Untuk keperluan penentuan antibodi pada pasien yang telah diproduksi ketika proses melawan infeksi, serum pasien (atau kadangkala plasma) diperiksa untuk mengetahui adanya antibodi. Mempelajari diagnosa suatu penyakit berdasarkan penentuan kadar antibodi dalam serum disebut serologi. Karakteristik Antibodi. Secara genetik manusia memilki kemampuan untuk memproduksi secara langsung antibodi spesifik terhadap hampir semua jenis antigen, baik melalui kontak selama hidup dan oleh pengenalan tubuh sebagai benda asing. Antigen dapat berupa bagian struktur fisik atau bahan kimia yang diproduksi dan dilepaskan oleh pathogen misalnya eksotoksin. Satu pathogen dapat mengandung atau memproduksi banyak antigen yang berbeda-beda yang dapat dikenali oleh hospes sebagai benda asing, sehingga infeksi oleh satu agent penyakit dapat menimbulkan produksi antibodi yang berbeda-beda. Sebagai tambahan, beberapa antigen memiliki sifat tidak dapat dikenali oleh sel hospes apabila antigen tersebut tidak
melalui proses perubahan fisik, sebagai contoh sebelum bakteri pathogen dicerna oleh leukosit polimormonuklear, beberapa antigen pada permukaan sel tidak dapat dikenali oleh sistem imun, sekali bakteri tersebut pecah, antigen inilah yang akan dikenali sehingga terbentuk antibodi untuk melawan antigen tersebut. Berdasarkan alasan tersebut pasien dapat memproduksi antibodi yang berbeda pada saat infeksi oleh satu jenis penyakit. Respon imun akan semakin matang dengan adanya paparan yang berulang, dan antibodi yang terbentuk akan lebih spesifik dan lebih dapat terikat dengan kuat. Antibodi bekerja dengan jalan: 1). Melekat pada permukaan pathogen dan membuat pathogen lebih dapat diterima oleh sel fagosit (opsonisasi antibodi) 2). Berikatan dan menghalangi reseptor permukaan pada sel hospes (antibodi netralisasi) 3). Melekat pada permukaan sel pathogen dan berperan dalam penghancuran dengan aktifitas lisis sistem komplemen (fiksasi komplemen antibodi). Meskipun metode diagnostik serologi rutin biasanya hanya mengukur dua kelas antibodi yaitu IgM dan IgG, terdapat lima kelas antibodi yang berbeda yaitu : IgG, IgM, IgE, IgA dan IgD. Pada struktur antibodi terdapat tempat melekatnya antigen (antigen binding site), yang bersifat spesifik pada setiap antibodi yang terbentuk. Berdasarkan spesifitas antibodi, antigen dengan beberapa kesamaan tetapi tidak identik, dapat berikatan pula dengan antibodi, disebut dengan reaksi silang. Komplemen-binding site terletak ditengah-tengah struktur molekul dan semua sama pada setiap kelas antibodi. IgM merupakan respon pertama untuk beberapa antigen, walaupun jumlahnya yang tinggi hanya bersifat sementara. Sehingga dengan adanya IgM menandakan bahwa baru terinfeksi atau permulaan infeksi aktif. Dilain pihak IgG merupakan antibodi yang dapat tetap bertahan lama sampai setelah infeksi hilang. Struktur molekul IgM terdiri dari lima monomer antigen dengan sepuluh antigen –binding site. Respon imun humoral yang bermanfaat dalam pengujian diagnostik
Sistem imun manusia mampu memproduksi baik antibodi IgM atau IgG dalam hampir semua pathogen. Pada kebanyakan kasus, IgM diproduksi oleh pasien hanya setelah interaksi pertama dengan pathogen dan tidak lagi terdeteksi setelahnya dalam waktu singkat. Untuk kepentingan diagnosa secara serologis, perbedaan yang penting dari IgM dan IgG adalah IgM tidak dapat menembus plasenta dari ibu hamil, sehingga apabila IgM terdeteksi pada serum bayi baru lahir, pasti telah dibuat oleh bayi itu sendiri. Dengan molekul yang besar dan jumlah antigen-binding site IgM dapat membantu mempercepat melenyapkan pathogen. IgG merupakan antibodi yang lebih spesifik terhadap antigen, walaupun IgG hanya memiliki dua antigen binding site, tapi dapat pula terikat pada komplemen. Ketika IgG terikat pada antigen, dasar molekul akan melekat dan terikat pada membran sel fagosit, meningkatkan kemampuan menelan dan penghancuran pathogen oleh sel hospes. Pertemuan kedua dengan antigen yang sama biasanya hanya menimbulkan respon IgG. Karena sel B limfosit menyimpan sel memori dari pathogen tersebut, sehingga dapat lebih cepat merespon dan lebih banyak dihasilkan antibodi dibandingkan dengan interaksi pertama. Respon cepat tersebut dinamakan respon anamnestik. Karena sel B memori tidak sempurna, kadangkala kelompok sel memori akan distimulasi oleh antigen yang mirip tapi tidak sama seperti antigen asal, yang menimbulkan respon anamnestik poliklonal dan tidak spesifik. Sebagai contoh infeksi ulang cytomegalovirus akan menstimulasi sel B memori untuk memproduksi antibodi terhadap virus Eipstein-Barr (family virus herpes lainnya). Interpretasi pada pemeriksaan serologi Pemahaman umum dari konsep serologi adalah terjadinya peningkatan titer. Titer antibodi sebanding dengan pengenceran tertinggi serum pasien dimana antibodi masih dapat terdeteksi. Pasien dengan jumlah antibodi yang tinggi, karena antibodi masih dapat terdeteksi pada pengenceran tertinggi, serum yang digunakan untuk penentuan titer antibodi harus diambil selama fase akut dari penyakit (ketika pertama kali diketahui atau masih tersangka) dan diulangi selama masa penyembuhan (biasanya dua minggu kemudian).
Specimennya disebut serum akut dan serum konvalesen. Untuk beberapa infeksi, seperti
penyakit legionnaire’s dan hepatitis, titer dapat tidak meningkat sampai beberapa bulan setelah infeksi akut atau dapat tidak pernah meningkat sama sekali. Untuk kebanyakan pathogen, peningkatan titer dari pengenceran empat kalinya (yaitu dari positif pada titer 1/8 menjadi 1/32 pada serum berpasangan (akut dan konvalesen), dapat dipertimbangkan didiagnosa sebagai infeksi baru. Hasil yang akurat untuk diagnosa penyakit infeksi ini akan didapatkan hanya ketika serum akut dan konvalesen diperiksa bersama-sama dalam sistem pengujian yang sama. Prinsip-prinsip pemeriksaan metode serologis Penentuan antibodi dapat dilakukan dengan berbagai cara. Dalam beberapa kasus antibodi terhadap satu jenis antigen dapat diperiksa dengan lebih dari satu cara tetapi metode penentuan antibodi yang berbeda terhadap satu antigen boleh jadi mengukur antibodi yang berbeda. Berdasarkan alasan tersebut adanya antibodi terhadap pathogen tertentu yang dideteksi oleh satu metode mungkin saja tidak berhubungan dengan adanya antibodi terhadap antigen yang sama tapi dengan metode yang berbeda. Kemudian pula setiap metode pemeriksaan memiliki derajat sensitifitas yang bervariasi dalam mendeteksi adanya antibodi. Walaupun demikian, karena IgM biasanya diproduksi hanya pada pasien dengan infeksi pertama kali terhadap agent infeksi, penentuan IgM dapat membantu klinisi dalam penentuan diagnosa, sehingga kebanyakan metode serologis didasarkan kepada analisa IgM. Pemeriksaan IgM untuk pemeriksaan serologis Pemeriksaan IgM berguna khususnya untuk penyakit yang memiliki gejala klinik yang tidak jelas, misalnya toksoplasmosis atau untuk penyakit yang memerlukan keputusan pengobatan yang cepat contohnya infeksi rubella pada wanita hamil yang dapat berakibat tidak baik bagi janin seperti katarak, glukoma, keterbelakangan mental, dan ketulian. Sehingga untuk wanita hamil yang terinfeksi virus rubella dan mengalami sakit demam dapat dlakukan pemeriksaan
terhadap IgM antirubella. Apabila positif dapat diajukan pilihan untuk menghentikan kehamilan. Agent yang sulit dibiakan atau hanya dapat ditemui saat stadium dewasa selama siklus hidupnya seperti Treponema pallidum, cytomegalovirus, virus herpes, Toxoplasma atau Rubella, biasa digunakan pemeriksaan IgM, dan telah dikelompokkan dalam satu pemeriksaan STORCH (syphilis, Toxoplasma, Rubella, Cytomegalovirus dan Herpes). Tes ini dilakukan secara terpisah tergantung gejala klinik pada bayi baru lahir. Akan tetapi kadangkala pada bayi yang terinfeksi terlihat sehat. Demikian pula pada beberapa keadaan biasa terjadi positif palsu atau negatif palsu dalam pemeriksaan serologis, sehingga berbagai pertimbangan termasuk kondisi klinis harus disertakan pada infeksi neonatal dan teknik pembiakan pada beberapa kasus masih merupakan metode yang dipercaya untuk diagnosa penyakit. Pemisahan IgM dari IgG diperlukan untuk metode pemeriksaan yang menggunakan IgM sebagai marker yang diberi label, misalnya metode IgM capture sandwich. IgM dahulu dapat dipisahkan dengan metode sentrifugasi kecepatan tinggi. Metode lain yang digunakan untuk memisahkan IgG dan IgM didasarkan pada kenyataan bahwa protein permukaan staphylococcus (proteinA) dan streptococcus (protein G) terikat pada bagian Fc dari IgG . dengan sentrifugasi dan pemisahan partikel dan ikatan IgG dari campuran maka akan didapatkan IgM. Metode lainnya yang dapat digunakan untuk memisahkan IgM dari serum yang mengandung IgG dan IgM adalah dengan penambahan rheumatoid factor. Antibodi IgM diproduksi oleh beberapa pasien bersama-sama IgG, rheumatoid factor berikatan dengan IgG sehingga IgM dapat dipisahkan dari IgG. Metode pemeriksaan antibodi A. Metode aglutinasi Reaksi aglutinasi (direk atau pasif) banyak digunakan, sebagai contoh penentuan tipe eritrosit dalam penggolongan darah, diagnosis imunologi pada penyakit hemolitik seperti anemia
hemolitik yang diinduksi obat, tes rheumatoid faktor (IgM dan IgG), tes untuk syphilis dan aglutinasi untuk tes kehamilan. Contoh reaksi aglutinasi pada pemeriksaan Golongan darah Pada reaksi aglutinasi bakteriologis, dasar pemeriksaan penentuan antibodi adalah pengukuran antibodi yang terbentuk yang merupakan respon terhadap antigen. Antibodi spesifik melekat pada permukaan bakteri dalam suspensi yang kental sehingga menyebabkan bakteri berkumpul membentuk agregat. Antibodi yang demikian disebut dengan aglutinin dan pemeriksaannya disebut aglutinasi bakteri. Reaksi aglutinasi biasa dilakukan untuk infeksi bakteri yang sulit dilakukan pembiakan secara in vitro. Bakteri yang menggunakan teknik ini diantaranya: tetanus, yersiniosis, leptospirosis, brucellosis, dan tularemia. Demam thypoid agglutinin test (Widal test) sudah jarang digunakan karena biasa bereaksi positif pada pasien dengan infeksi bakteri lain atau reaksi silang antibodi atau karena pernah imunisasi thypoid. Pemeriksaan yang paling sesuai untuk pasien tersangka demam thypoid adalah dengan pembiakan dan identifikasi adanya bakteri Salmonella. Sel parasit Plasmodium, Leismania atau Toxoplasma gondii, juga telah menggunakan metode aglutinasi langsung untuk deteksi antibodi. Banyak pasien yang terinfeksi ricketsia memproduksi antibodi yang dapat menyebabkan aglutinasi non spesifik terhadap bakteri proteus. Tes Weil-Felix dapat digunakan untuk mendeteksi reaksi silang tersebut, tetapi telah tersedia metode pemeriksaan infeksi ricketsia yang baru yang lebih spesifik sehingga tes Weil-Felix tidak dipergunakan lagi. B. Tes Aglutinasi partikel Teknik pemeriksaan serologis yang mendeteksi antibodi melalui aglutinasi dari partikel pembawa (carrier) tiruan dimana antigen terikat pada partikel tersebut. Carrier yang biasa digunakan partikel lateks atau sel darah merah yang telah di olah, atau biologic carrier seperti sel bakteri yang dapat membawa antigen pada permukaannya dan dapat berikatan dengan antibodi yang diproduksi sebagai respon dari sel hospes. Ukuran partikel pembawa
memungkinkan reaksi aglutinasi dapat terlihat. Contohnya untuk antigen cryptococcal digunakan lateks bead yang dilekati antibodi spesifik pada metode lateks agglutination. Untuk mendeteksi streptococcus grup A dari swab tenggorok , digunakan metode pemeriksaan
aglutinasi partikel untuk grup β-hemolitik streptococcus. Hasil aglutinasi dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya jumlah dan afinitas konjugat antigen terhadap carrier, waktu inkubasi dengan serum penderita dan interaksi yang terjadi pada lingkungan mikro (pH dan konsentrasi protein). Tes komersial telah dikembangkan sebagai satu kesatuan lengkap dengan pelarut, kontrol dan wadah tersendiri. Untuk hasil yang akurat harus digunakan sebagai kesatuan tidak bisa dimodifikasi atau digantikan dengan reagen lain. Apabila tes digunakan untuk specimen LCS misalnya, tidak dapat digunakan untuk pemeriksaan specimen serum kecuali ada teknik prosedur yang disajikan didalamnya dan telah distandarisasi untuk digunakan. Sel darah merah binatang biasa juga digunakan sebagai carrier antigen pada tes aglutinasi, tes ini disebut dengan haemaglutinasi untuk mendeteksi adanya partikel virus berdasarkan sifat mengaglutinasikan eritrosit yang terlihat secara makroskopis dan indirect haemaglutinasi atau haemaglutinasi pasif, karena bukan merupakan antigen sel darah merah itu sendiri, tetapi sebagai sel pembawa antigen secara pasif, yang akan diikat oleh antibodi. Yang digunakan secara luas dari metode ini dan telah tersedia secara komersial adalah Mikrohaemaglutinasi untuk antibodi Treponema pallidum (MHA-TP), Haemaglutinasi treponemal untuk syphilis (HATTS), haemaglutinasi pasif untuk antibodi terhadap antigen ekstraseluler steptococcus , dan tes indirek haemaglutinasi untuk antibodi virus Rubella, eritrosit diolah dengan penambahan formaldehid-piruvat aldehid sehingga virus rubella dapat terabsorpsi pada membrane permukaan eritrosit . Pedoman laboratorium terpercaya seperti Center for Disease Control and Prevention (CDC) juga menyelenggarakan pemeriksaan indirek haemaglutinasi untuk tes antibodi terhadap beberapa clostridia,
Burkholderia psudomallei, Bacillus anthracis, Corynebacterium diphtheria, Leptospira dan beberapa agen virus dan parasit. Contoh pemeriksaan aglutinasi partikel: ASI Color Mono II test merupakan tes aglutinasi untuk pemeriksaan kualitatif dan semikunatitatif untuk mendeteksi antibodi heteropil serum yang berhubungan dengan Mononukleus infeksiosa (IM). Tidak diperlukan pengenceran sampel. Prinsip pemeriksaan: Tes didasarkan reaksi antara antibodi IM dalam sampel bereaksi dengan antigen yang dilekatkan pada eritrosit kuda dan diberi indikator warna. Apabila dalam sampel terdapat antibodi heterofil akan terjadi aglutinasi yang menunjukkan hasil positif apabila tidak ada antibodi, tidak terjadi aglutinasi (hasil tes negatif) Gambar contoh reaksi aglutinasi Positif (1) dan negatif (2) Sumber www.dshs.state.tx.us/LAB/serology_cf.shtm Tes Haemaglutinasi Digunakan untuk pemeriksaan - Virus influenza dan virus lainnya - Pemeriksaan protein : Neuramidase , Haemaglutinin ( yang secara spesifik terikat pada sel eritrosit)
Langkah-langkah
pemeriksaan:
1.
Pemipetan
2.
Tambahkan
3.
Biarkan
sel
eritrosit eritrosit
larutan
dan
aduk
tenang
secara dan
pengencer.
perlahan
amati
pola
sampai susunan
homogen. eritrosit.
4. Amati apakah sel normal mengendap atau ada aglutinasi dengan mengamati apakah terbentuk seperti kancing pada dasar mikrotiter plate atau terbentuk suspensi eritrosit yang terlarut .
Haemaglutinasi inhibisi Pada umumnya virus yang menginfeksi manusia dapat berikatan dengan sel darah merah dari spesies yang berbeda. Sebagai contoh partikel virus rubella dapat berikatan dengan sel darah manusia tipe O, angsa atau eritrosit ayam dan menyebabkan aglutinasi sel darah merah. Virus influenza dan parainfluenza dapat mengaglutinasikan eritrosit babi, ayam dan manusia tipe O, arbovirus dapat mengaglutinasikan eritrosit angsa, adenovirus dapat mengaglutinasikan eritrosit tikus atau sel rhesus kera, virus mumps berikatan dengan eritrosit kera, virus herpes dan cytomegalovirus mengaglutinasikan eritrosit domba. Tes serologi untuk mendeteksi adanya antibodi berbagai virus tersebut berdasarkan kemampuan aglutinasi virus. Serum pasien yang telah diolah dengan penambahan kaolin atau heparinmagnesium chloride (untuk menghilangkan inhibitor nonspesifik dan nonspesifik agglutinin sel eritrosit) ditambahkan ke dalam system yang mengandung virus tersangka penyebab penyakit. Apabila serum mengandung antibodi terhadap virus, akan terbentuk kompleks dan akan menghalangi binding-site permukaaan virus. Ketika sel eritrosit ditambahkan ke dalam larutan seluruh partikel virus akan terikat pada antibodi, sehingga akan mencegah virus mengaglutinasikan
eritrosit.
Sehingga
serum
pasien
dikatakan
positif
untuk
tes
haemaglutination inhibition antibodi Gambar Reaksi pada tes haemaglutinasi inhibisi C. Tes flokulasi Berbeda dengan pembentukkan agregat ketika partikel antigen berikatan dengan antibodi spesifik, interaksi antara antigen terlarut dengan antibodi akan membentuk presipitat, pemadatan partikel halus, biasanya terlihat hanya jika presipitat tetap stabil berada pada matrik. Ada dua jenis tes berdasarkan flokulasi: 1). Tes Presipitin
Metode klasik untuk mendeteksi antigen terlarut yaitu antigen dalam suatu larutan adalah Outcherlony double immunodiffusion. Pada metode ini sumur dibuat dalam suatu agar, suatu matrik berbentuk gelatin yang memungkinkan partikel berdifusi dalam cawan petri. Metode ini biasanya digunakan untuk mendeteksi eksoantigen yang diproduksi oleh jamur sistemik untuk konfirmasi keberadaannya dalam pembiakan. Akan tetapi teknik ini terlalu lambat untuk penggunaan secara umum untuk deteksi antigen secara langsung dari specimen serum pasien. Contoh hasil double immunodiffusi dan imunopresipitasi Imunodiffusi Tes imunodifusi didasarkan pada pembentukkan imunokompleks yang berdasarkan berat molekul yang tinggi, presipitat dan bentuk garis presipitasi dapat diamati secara makroskopik. Metode ini untuk mendapatkan hasil diperoleh kurang lebih satu minggu itupun hanya hasil kualitatif. Teknik imunodifusi dapat dilakukan pada cawan petri yang mengandung agar gelatin 1% dalam suasana buffer posfat atau tris buffer. Sumur-sumur dibuat menggunakan perforator, untuk menempatkan antigen di sumur dan serum-serum diletakkan mengeliligi antigen. Antigen dan antibodi dalam serum akan berdifusi dalam agar dan ketika bertemu akan membentuk garis agak kabur yang akan terlihat pada cahaya langsung dan dengan latar belakang gelap. Kontrol positif (standar serum) harus disertakan untuk panduan pembacaan hasil positif dan interpretasi. Teknik imunodifusi selain untuk serum juga dapat digunakan untuk LCS dan urine. Teknik imunodifusi biasa digunakan pula untuk deteksi antibodi terhadap jamur pathogen : Histoplasma, Blastomyces, Coccidioides, Paracoccidioides, dan beberapa jamur opportunistic yang pemeriksaannya memerlukan waktu sekurang-kurangnya 48 jam bahkan lebih untuk mengembangkan pembentukan pita . Gambar contoh hasil imunodifusi yang positif untuk paracoccidioidomycosis (a) dan hasil positif pada reaksi aglutinasi latek pada sumur atas dan hasil negatif pada sumur di bawah (b) VDRL (Veneral Disease Research Laboratory test)
Merupakan metode yang menggunakan prinsip presipitasi dengan bentuk produk akhir presipitin berkumpul terlihat secara makroskopis dan mikroskopis. Pasien yang terinfeksi treponema, pada umumnya Treponema. pallidum, penyebab shypilis membentuk antibodi seperti protein dinamakan reagin yang akan berikatan dengan antigen cardiolipin-lecithincoated cholesterol partikel, menyebabkan partikel berflokulasi. Karena reagin bukan merupakan antibodi langsung yang spesifik terhadap antigen T. pallidum, tes ini kurang spesifik tetapi baik digunakan untuk skrining tes. VDRL merupakan satu-satunya tes yang paling berguna untuk mendeteksi cairan LCS pasien tersangka Neuroshypilis, meskipun kemungkinan terjadi positif palsu. Pelaksanaan tes VDRL memerlukan ketelitian, alat gelas yang bersih, dan harus memperhatikan rincian secara tepat, termasuk kontrol kualitas rutin. Sebagai tambahan, reagen yang akan digunakan harus disiapkan baru setiap pelaksanaan
tes, serum pasien harus diinaktivasi dengan pemanasan selama 30 menit pada 56⁰C sebelum tes, dan hasilnya dibaca menggunakan mikroskop. Untuk semua alasan tersebut banyak laboratorium klinik menggunakan tes kualitatif tandingan Rapid Plasma Reagin (RPRtest) RPR (Rapid Plasma Reagin test) RPR merupakan tes yang tersedia secara komersial lengkap dengan konrol positif dan negatif, kartu tempat reaksi, dan reagen untuk persiapan suspensi antigen. Antigen kardiolipinlecithin-coated cholesterol dengan cholin klorida dan juga mengandung partikel arang untuk memperlihatkan flokulasi makroskopis. Serum tanpa pemanasan dan reaksi terjadi pada permukaan kartu tes yang kemudian dibuang. RPR merupakan tes yang dianjurkan untuk specimen LCS. Seluruh prosedur distandarisasi dan dijelaskan terperinci dalam kit reagen dan harus diikuti dengan tepat. Secara keseluruhan RPR merupakan tes skrining yang lebih sensitif dibandingkan VDRL, dan lebih mudah dalam pengerjaannya. Beberapa modifikasi telah dibuat, misalnya penggunaan zat warna untuk mempermudah melihat hasil reaksi. Kondisi dan infeksi lain selain shypilis yang dapat menyebabkan hasil positif pada pemeriksaan VDRL atau RPR disebut biologic false positive tes. Penyakit autoimun, seperti lupus
erythematosus dan demam reumatik, mononucleosis infeksiosa, hepatitis, kehamilan dan usia tua,dapat menyebabkan positif palsu sehingga untuk hasil positif dinyatakan sebagai dugaan dan harus dikonfirmasi dengan tes spesifik treponemal. Tes RPR Contoh : BD Macro- Vue™ RPR Card Test Kits Sumber : www.cardinalhealth.com/.../images/B/B6940-9.jpg BD Macro-Vue™ RPR (rapid plasma reagin) merupakan tes nontreponemal untuk mendeteksi shypilis, terdiri dari reagen tetes, kartu tes berdiameter 18 mm dan prosedur yang tercantum dalam A Manual of Tests for Syphilis (Larsen, S., et al., editors, 1990, American Public Health Association). Gambar Rotator untuk RPR Sumber : websites.labx.com/rankin/pics/41747.JPG BD Macro-Vue Card Test Rotator model 51-II. Merupakan rotator yang digunakan pada metodeith Macro-Vue circle card tests. Rotator dengan kecepatan rotasi konstan 100 rpm dengan diameter lingkaran kartu tes 2 cm. waktu yang dibutuhkan selama 8 menit dan akan terdengar suara bel apabila telah mencukupi waktu yang telah ditentukan. 115V, 60 Hz. Gambar pengenceran serum RPR kuantitatif Sumber :student.ccbcmd.edu/.../lab18/images/rprdil.jpg 2). Counterimmunoelectrophoresis Jenis tes lain yang menggunakan prinsip presipitasi dan penggunaannya secara luas digunakan untuk mendeteksi antibodi dalam jumlah sedikit. Kelebihan tes ini menggunakan muatan listrik yang dialirkan pada antigen-antibodi yang dites pada sistem buffer tertentu. Karena antigen dan antibodi dipertemukan satu sama lainnya dengan bantuan arus listrik pada suatu
matriks
semisolid
untuk
bermigrasi
sehingga
metode
ini
disebut
Counterimmunoelectrophoresis (CIE). CIE merupakan modifikasi metode Ouchterlony yang dipercepat migrasi antigen antibodinya oleh adanya aliran listrik. Dengan pengecualian
bakteri Streptococcus pneumonia serotype 7 dan 14, antigen bakteri akan bermuatan negatif pada suasana sedikit basa, sedangkan antibodi bersifat netral. Sifat antigen bakteri inilah yang digunakan pada prinsip metode CIE, dimana larutan yang mengandung antibodi dan larutan sampel diletakkan pada lubang sumur agarosa yang diletakkan pada permukaan kaca. Kertas atau fiber bersumbu digunakan untuk menjembatani dua agarosa yang bersebrangan untuk dilalui buffer yang sedikit alkali. Ketika dialiri arus listrik maka akan terjadi migrasi dari Antigen yang bermuatan negatif akan bermigrasi ke elektoda positif. Antibodi yang bermuatan netral akan terbawa oleh elektroda negatif . pada perbatasan antara sumur akan terbentuk zona ekuivalen, dan komplek antigen-antibodi membentuk garis presipitasi yang nampak, proses migrasi ini memerlukan waktu satu jam. Banyak antigen yang dapat diperiksa oleh metode CIE, mendeteksi hampir 0,01 sampai 0,05 mg/ml antigen yang setara dengan 103 organisme/ml larutan. Perlu disertai control pada setiap pengerjaan, CIE merupakan metode yang berdasarkan reaksi presipitasi yang cukup mahal, sehingga tidak banyak digunakan lagi dalam imunodiagnostik. D. Tes Netralisasi Tes netralisasi pada kultur sel dan pengujian laboratorik menggunakan hewan coba, antibody akan mencegah atau menurunkan virulensi virus. Teknik ini sulit dan membutuhkan waktu pengerjaan yang lama dan sulit untuk dikerjakan, akan tetapi kadangkala diperlukan. . Gambar tahapan tes netralisasi virus E. Tes Fiksasi komplemen Tes fiksasi komplemen merupakan teknik imunologi yang digunakan untuk menentukan antigen spesifik atau antibody apabila ada dalam serum pasien. Metode ini sangat umum digunakan untuk membedakan dan menemukan penyebab infeksi. Pada umumnya digunakan untuk pemeriksaan mikroorganisme yang sulit di identifikasi melalui metode pembiakan. Akan tetapi metode ini telah tergantikan oleh metode serological lainnya dalam dignosa klinik
seperti ELISA dan metoda identifikasi patogen yang didasarkan pada DNA khususnya polymerase chain reaction (PCR) Pada teknik fiksasi komplemen, komplemen digunakan ketika antigen bereaksi dengan antibodi. Komplemen dapat ditemukan pada serum babi Guinea. Ketika sel darah merah ditambahkan dengan anti-red-cell-antibody, sel darah merah akan lisis ketika ditambahkan komplemen (hasil tes negatif). Apabila dalam serum mengandung antibodi maka complemen akan menfiksasi ikatan antigen dan antibodi sehingga ketika ditambahkan anti-red-cell antibodi tidak menghasilkan hemolisis sehingga tes menunjukkan hasil positif.
Reaksi pada teknik fiksasi komplemen Contoh pemeriksaan dengan metode fiksasi komplemen Adenovirus Jamur (Blastomyces, Coccicioides, & Histoplasma) Virus Influenza A & B Parainfluenza 1, 2, & 3 Poliovirus 1, 2, & 3 Respiratory Syncitial Virus (RSV) F. ELISA (Enzyme Linked Immunoassays)/EIA (Enzym Immunoassays) ELISA digunakan untuk pengukuran konsentrasi antibody terhadap suatu antigen, biasanya digunakan antibody monoclonal. Persiapan tes: - Antigen dilekatkan pada fase padat misalnya pada permukaan dasar mikroplate - Persiapan anti-human antibody dilabel enzim (contohnya β-galaktosida) yang berfungsi sebagai indicator warna dari substrat yang jernih. Prinsip ELISA Cara kerja :
- Specimen yang akan diperiksa dimasukkan ke dalam sumur biasanya mikroplate, molekul antibody akan berikatan dengan antigen yang dilekatkan pada fase padat - Anti-human antibody yang diberi label ditambahkan pada campuran. Antibody berlabel akan terikat pada ikatan molekul antigen-antibodi yang pertama sehingga terjadi ikatan sandwich antibody-antigen-antibody berlabel - Setelah proses pencucian molekul yang tidak berikatan, ditambahkan substrat - Setelah beberapa waktu sesuai dengan standar prosedur, ditambahkan reagen untuk menghentikan reaksi (penambahan NaOH 1N). intensitas warna yang terbentuk proporsional/ sebanding dengan konsentrasi antigen yang terikat. Contoh teknik ELISA dan imunoblot G. Indirect Flourescent Antibodi Test (IFA) Pemeriksaan yang berdasarkan IFA ke dalam analisis serologi dan molekular : Ehrlichia antibody Fluorescent Treponemal antibody (FTA) Legionnella antibody Mumps IgM antibody Q Fever antibody Rocky Mountain Spotted Fever antibody Toxoplasma IgG antibody Typhus antibody Teknik Fluorescent-antibody (FA) masih digunakan untuk mendeteksi antigen dan antibodi walaupun tidak sebanyak EIA. Teknik fluorescent terdiri dari direct dan indirect, metode indirek biasanya digunakan untuk mendeteksi antibodi (IFA) seperti pada EIA, sedangkan untuk pemeriksaan antigen digunakan metode direk. Indirect Fluorescent Antibody Test (IFA)
1. Antigen mikroba diletakkan dalam kaca objek dan diberi bahan fiksatif 2. Serum pasien yang telah diencerkan diinkubasi bersama antigen pada kaca objek, kemudian dicuci 3. Antibodi berlabel flouresen (konjugat) ditambahkan 4. Kaca objek dicuci hemudian dikeringkan, kemudian dibaca dibawah mikroskop flouresen Preparat diamati adanya area terang berfloresensi warna hijau dan dibandingkan dengan control positif dan negatif. Adanya floresensi hijau menandakan adanya antibodi terhadap antigen Contoh teknik IFA untuk antibodi toxoplasma. Pada lapang pandang kiri hasil positif, sedangkan kanan hasil negatif Contoh tes IFA untuk antibodi ehrlichia . Ehrlichiae
adalah
obligat
intraseluler
rickettsiae, penyebab penyakit seperti Rocky Mountain Spotted Fever. H.
Immunoprecipitasi Imunopresipitasi merupakan metode dimana protein antigen dipresipitasikan dalam larutan menggunakan antibodi spesifik yang berikatan dengan protein antigen tersebut. Metode ini dapat digunakan ketika isolasi dan pemadatan protein spesifik pada bahan pemeriksaan terdiri dari berbagai macam protein dan tidak sejenis. Antibodi harus dilekatkan pada fase padat pada saat yang sama pada teknik pemeriksaan.
J. Immunoblot Immunoblot disebut juga dengan Western Blot adalah suatu metoda analisa. Mendeteksi protein tertentu yang terdapat pada sampel ekstrak atau jaringan. Pada teknik imunoblot, protein didenaturasi, rantai panjang polipeptida atau struktrur tiga dimensi protein dengan elektroforesis. Setelah protein dipindahkan ke dalam membrane nitroselulosa, protein
dideteksi dengan penambahan antibodi. Setiap protein akan berikatan dengan antibodi yang digunakan untuk mendeteksi adanya antigen. Sebuah indicator spesifik digunakan untuk melabel antibodi yang akan menimbulkan warna setelah bereaksi dengan streptavidin.
K. Pemeriksaan biologi molecular Misalnya : PAGE atau SDS PAGE (sodium dodecyl sulfate poliacrylamide gel electrophoresis) adalah metode yang biasanya digunakan untuk biokimia, forensik, genetik dan biologi molekular. Metode ini menggunakan teknik pemisahan protein berdasarkan kemampuan pergerakan molekul dalam elektroforesis L.
Teknik
pemeriksaan
lainnya
Protein sequencing dan X-ray crystallography digunakan untuk analisis protein virus. Sedangkan teknik Agarose gels, restriction analysis, sequencing, southern blot, northern blot, PCR atau RT-PCR biasanya digunakan untuk analisa genom virus. Diposkan oleh Mursalim Achmad di 20.27 Kirimkan Ini lewat EmailBlogThis!Berbagi ke TwitterBerbagi ke Facebook Reaksi: Tidak ada komentar: Poskan Komentar Link ke posting ini Buat sebuah Link Posting Lebih Baru Posting Lama Beranda Langganan: Poskan Komentar (Atom) Iklan berlangganan Apple Google Microsoft didukung oleh
Pengikut
Arsip Blog ►
2013 (41)
►
April (6)
►
Apr 26 (1)
►
Apr 15 (1)
►
Apr 02 (4)
►
Maret (8)
►
Mar 28 (4)
►
Mar 26 (1)
►
Mar 25 (1)
►
Mar 24 (2)
►
Februari (22)
►
Feb 25 (2)
►
Feb 22 (2)
►
Feb 17 (16)
►
Feb 10 (2)
►
Januari (5)
►
Jan 28 (3)
►
Jan 24 (1)
►
Jan 20 (1)
►
2012 (22)
►
November (5)
►
Nov 13 (5)
►
Oktober (1)
►
Okt 06 (1)
►
September (7)
►
Sep 29 (3)
►
Sep 22 (4)
►
Agustus (1)
►
Agu 25 (1)
►
Juni (2)
►
Jun 03 (2)
►
Mei (2)
►
Mei 27 (2)
►
Februari (4)
►
Feb 13 (2)
►
Feb 12 (2)
►
2011 (10)
►
Desember (1)
►
Des 11 (1)
►
Juni (3)
►
Jun 11 (3)
►
Februari (1)
►
Feb 16 (1)
►
Januari (5)
►
Jan 26 (3)
►
Jan 05 (2)
▼
2010 (9)
▼
Desember (6)
▼
Des 20 (6)
PETUNJUK PENULISAN ARTIKEL ILMIAH UNTUK JURNAL Isolasi dan identifikasi bakteri Imunodiagnostik dan Serologi Pada Infeksi Mikroba Pewarnaan Bakteri Penuntun Pemeriksaaan Bakteriologis ISK (urogenita... bakteriologi ►
Agustus (1)
►
Agu 04 (1)
►
Juli (2)
►
Jul 21 (2)
►
2009 (20)
►
Juli (2)
►
Jul 25 (1)
►
Jul 08 (1)
►
Juni (18)
►
Jun 27 (1)
►
Jun 22 (1)
►
Jun 21 (16)
Mengenai Saya
Mursalim Achmad Sungguminasa, Sulawesi Selatan, Indonesia
